Control Respiratorio - Curvas de consumo de Oxígeno

Departamento de Bioquímica Humana Facultad de Medicina Medicina – Universidad de Buenos Aires Aires

Agosto 2004

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CONTROL RESPIRATORIO CURVAS DE CONSUMO DE OXIGENO Prof. Dra. Silvia González-Calvar Prof. Dr. Héctor Coirini En condiciones fisiológicas, el transporte de electrones en la cadena respiratoria mitocondrial está acoplado a la fosforilación de ATP. Recordemos que, desde el punto de vista termodinámico, termodinámico, dos procesos están acoplados cuando la energía libre liberada por uno de ellos (proceso exergónico) es utilizada por el otro (proceso endergónico), el cual, de otra manera, no podría ocurrir espontáneamente. Esto se pone en evidencia cuando observamos que en la cadena respiratoria (proceso exergónico), los electrones pueden fluir sólo si el ADP es simultáneamente fosforilado a ATP (proceso endergónico). Así, el consumo de oxígeno mitocondrial está regulado no sólo por el aporte de NADH, sino también por los niveles de ADP y Pi. La regulación de la velocidad de fosforilación oxidativa por los niveles de ADP se denomina CONTROL RESPIRATORIO. Este mecanismo regulatorio permite que, cuando los niveles de ADP se incrementan como consecuencia de un gasto de ATP, paralelamente aumenta la velocidad de fosforilación oxidativa para reponer el ATP consumido. Debido a que la fosforilación oxidativa está acoplada a la cadena de transporte de electrones, el incremento en la velocidad de la fosforilación oxidativa se refleja por un aumento en el flujo de electrones a través de la cadena respiratoria y, por lo tanto, del consumo de oxígeno (o bien por una

disminución de la concentración del oxígeno del entorno). En condiciones experimentales, el control respiratorio puede evaluarse en suspensiones mitocondriales de un dado tejido en presencia de oxígeno. Las mitocondrias deben estar intactas y ser incubadas con un medio con sustratos oxidables que permitan la generación de coenzimas reducidas. Las variaciones en el consumo de oxígeno son evaluadas por un dispositivo que tiene un electrodo sensible a las concentraciones de oxígeno (polarógrafo). Observar que un aumento en el consumo de oxígeno se traduce en una disminución en la concentración de oxígeno. Los cambios en la velocidad de consumo de oxígeno (consumo de oxígeno en la unidad de tiempo) de la suspensión mitocondrial puede comprobarse agregando ADP al medio: esto provoca un rápido aumento en el consumo de oxígeno. Cuando las mitocondrias son suspendidas en un medio en el cual existe una alta concentración de sustratos, fosfatos y oxígeno, se encuentran en un estado metabólico llamado “Estado 4” y la respiración es lenta. Cuando se añade ADP se estimula la síntesis de ATP y se incrementa la velocidad del transporte de electrones, y por lo tanto, del consumo de oxígeno: este estado metabólico se lo llama “Estado 3” , y permanece así hasta que se consume el ADP añadido.

Profesores Adjuntos Dra. Silvia González-Calvar González-Calvar y Dr. Héctor Coirini

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GRAFICO 1 Mitocondrias de hígado en suspensión

o n e í x O e d

Estado4

ADP + + P Pi

n ó i c a r t n e c n o C

Estado3

TIEMPO

Se denomina CONTROL RESPIRATORIO a la relación entre la respiración en el Estado 3 y la correspondiente al Estado 4. Otro índice útil para evaluar la actividad mitocondrial es la relación P:O, es decir, la relación entre el fosfato incorporado al ATP y el oxígeno consumido al oxidar el

sustrato. Tanto el control respiratorio como la relación P:O, son utilizados para expresar el grado de acoplamiento entre los procesos de oxidación y de fosforilación. Valores bajos de control respiratorio o de índice P:O indican mitocondrias dañadas o desacopladas.

Profesores Adjuntos Dra. Silvia González-Calvar y Dr. Héctor Coirini


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ESTADOS METABÓLICOS MITOCONDRIALES

Estado Metabólico

O2

Nivel de ADP

1

Disponible

Bajo

Nivel de Factor sustrato de la Velocidad de determinante de cadena respiración la actividad respiratoria respiratoria Bajo

Lenta

ADP

2

Disponible

Alto

Muy bajo

Lenta

Sustrato de la cadena respiratoria

3

Disponible

Alto

Alto

Rápida

Cadena respiratoria

4

Disponible

Bajo

Alto

Lenta

ADP

5

No disponible (anaerobiosis)

Alto

Alto

Nula

Oxígeno

La evolución de la concentración de oxígeno en una suspensión mitocondrial en función de los niveles de ADP y sustrato se puede ver en el GRAFICO 2

Inicialmente, las mitocondrias están suspendidas en un medio con bajo nivel de sustrato y de ADP, en presencia de oxígeno.

A.- Las mitocondrias no consumen oxígeno porque al carecer de sustrato oxidable no generan coenzimas reducidas y por lo tanto no requieren oxígeno para su reoxidación.

B.- El agregado de malato no modifica marcadamente el consumo de oxígeno por falta de ADP, por lo tanto no se observa variación en la concentración de oxígeno.



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El bajo nivel de ADP sólo produce una ligera disminución de la concentración de oxígeno (o bien, un ligero incremento en el consumo de oxígeno.

refleja con el cambio de pendiente que se observa al final de esta fase. D.- El agregado de ADP no modifica los niveles de oxígeno presentes. Esta situación se debe al agotamiento del sustrato.

C.- El agregado de ADP exógeno permite que ocurra la fosforilación oxidativa y, por lo tanto, hay una disminución en la concentración de oxígeno (aumento en el consumo de oxígeno). El ADP agregado se va agotando a medida que la fosforilación oxidativa ocurre. Esto se

E.- El agregado de más sustrato restablece el sistema y la suspensión mitocondrial respira activamente.

GRAFICO 2 Mitocondrias de hígado en suspensión

o n e g í x O e d n ó i c a r t n e c n o C

Malato

A

B

ADP + + P Pi Malato

C D

E

TIEMPO



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ALGUNOS COMPUESTOS QUE INTERFIEREN EN LA CADENA RESPIRATORIA Y LA FOSFORILACION OXIDATIVA Tipo de interferencia: Inhibición de la transferencia de electrones -

Cianuro (CN ) ; Monóxido de carbono (CO) ; Azida sódica (Na 3N) Inhiben la citocromo oxidasa (Complejo IV) Antimicina A Bloquea la transferencia de electrones desde el citocromo b al citocromo c1. Rotenona ; Amital ; Piercidina A Inhiben la transferencia de electrones desde un centro Fe-S de la NADH deshidrogenasa (Complejo I) a la ubiquinona (CoQ). Malonato Inhibe la transferencia de electrones a nivel de la succinato deshidrogenasa (Complejo II).

Tipo de interferencia: Inhibición de la ATPsintasa Oligomicina ; Venturicidina Bloquea el flujo de protones a través de Fo.

Tipo de interferencia: Inhibición del intercambio ATP-ADP Atractilósido Inhibe la adenina nucleótido translocasa.

Tipo de interferencia: Desacoplamiento de la fosforilación oxidativa y el transporte de electrones Dinitrofenol ; Carbonil-cianuro ; fenil hidrazona Actúan como ácidos débiles, disminuyendo la concentración de protones en el espacio intermembrana.

Valinomicina Ionóforo del K+, disminuyendo el gradiente eléctrico. Proteína desacopladota (termogenina) Forma poros conductores de protones en la membrana interna de la mitocondria del tejido adiposo marrón.



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ESTRUCTURAS DE ALGUNOS COMPUESTOS QUE INTERFIEREN EN LA CADENA RESPIRATORIA Y LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA Inhibidores de la transferencia de electrones desde un centro Fe-S de la NADH deshidrogenasa (Complejo I) a la ubiquinona (CoQ)

Rotenona

Amital



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Bloqueante de la transferencia de electrones desde el citocromo b al citocromo c1

Antimicina A Bloqueante de la fracción Fo de la ATP sintasa , detiene el flujo de protones a través de esta proteína e inhibe la síntesis de ATP

Oligomicina A



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Agentes desacopantes : Actúan como ácidos débiles, disminuyendo la concentración de protones en el espacio intermembrana,

2,4 - Dinitro-fenol +

o bien en el caso de un ionóforo que transporta K hacia la matriz mitocondrial, disminuyendo el gradiente eléctrico.

Valinomicina



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Inhibidor de la translocasa de nucleótidos de adenina. Disminuye la disponibilidad de ADP en la matriz mitocondrial, inhibiendo la síntesis de ATP por falta de sustrato y aumento de ATP intramitocondrial.

Atractilósido



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EJEMPLOS DE CURVAS DE CONSUMO DE OXÍGENO CON EL AGREGADO DE COMPUESTOS QUE INTERFIEREN EN LA CADENA RESPIRATORIA Y LA FOSFORILACION OXIDATIVA

EJEMPLO 1 Mitocondrias de hígado en suspensión

o n e í x O e d n ó i c a r t n e c n o C

Succinato A

ADP + + P Pi CN-

B C

DNF E D

TIEMPO

A.- La suspensión mitocondrial en un entorno aeróbico y sustratos oxidables consume oxígeno. B.- Al agregar un sustrato oxidable se aumenta la velocidad de consumo de oxígeno y por lo tanto la concentración de oxígeno disminuye y también la del ADP endógeno, por lo tanto este compuesto comienza a ser limitante. C.- Al agregarle ADP + Pi, la velocidad de consumo de oxígeno aumenta significativamente y entonces, la concentración de oxígeno disminuye en forma abrupta.

D.- Al agregar cianuro, que es un inhibidor del complejo IV (citocromo oxidasa) se bloquea el transporte de electrones y, por lo tanto, no hay consumo de oxígeno. La concentración de oxígeno no se modifica. E.- Al agregar 2,4 dinitro-fenol que es un desacoplante de la fosforilación oxidativa, sigue sin variar la concentración de oxígeno, es decir no se reanuda el consumo de oxígeno porque la cadena respiratoria continúa bloqueada por el cianuro que se agregó en los pasos anteriores.



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EJEMPLO 2 Mitocondrias de hígado en suspensión Succinato A o n e í x O e d n ó i c a r t n e c n o C

D.- Al agregar oligomicina, que es un inhibidor de la fracción Fo de la ATP sintasa, se bloquea la síntesis de ATP y por lo tanto, también se bloquea el transporte de electrones porque ambos procesos están acoplados. Así, no hay consumo de oxígeno y la concentración del mismo se mantiene constante.

ADP + + P Pi OLIG

B C

DNF D E

E.- Al agregar 2,4 dinitro-fenol que es un desacoplante de la fosforilación oxidativa, se reanuda el consumo de oxígeno (disminuye la concentración del mismo) porque la cadena respiratoria puede funcionar normalmente a pesar de que no hay síntesis de ATP.

[O2] = = 0 0 TIEMPO

A.- La suspensión mitocondrial en un entorno aeróbico y sustratos oxidables consume oxígeno. B.- Al agregar un sustrato oxidable se aumenta la velocidad de consumo de oxígeno y por lo tanto la concentración de oxígeno disminuye y también la del ADP endógeno, por lo tanto este compuesto comienza a ser limitante. C.- Al agregarle ADP + Pi , la velocidad de consumo de oxígeno aumenta significativamente y entonces, la concentración de oxígeno disminuye en forma abrupta.



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Bibliografía Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. T.M. Devlin (ed). Wiley Liss, New York, 1997. Principios de Bioquímica. A.L. Lehninger, D.L. Nelson, M.M. Cox. Ediciones Omega, Barcelona, 1995. Alvarez S, Novoa Bermúdez MJ, Boveris A. La mitochondria: estructura, función y especies reactivas del Oxígeno. Antioxidantes y calidad de vida. 2 (5): 14-22, 1995.


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