ESTEQUIOMETRÍA Y CINÉTICA MICROBIANA Cinética del crecimiento microbiano y de la formación de producto
Ing. Sergio Duarte Ing. Pedro Medina 1
Temario
3.0 Cinética del crecimiento microbiano y de la formación de producto 3.1 Requi Requisitos sitos para el creci crecimient miento o micr microbiano obiano 3.2 Cuantificación del crecimiento 3.33 Pa 3. Pará ráme metr tros os ci ciné néti tico coss 3.3.1 Velocidades volumétricas 3.3.2 Velocidades específicas 3.3.3 Tiempo de duplicación 3.3.4 Grado de duplicac duplicación ión 3.3.5 Productividad volumétrica 3.3.5 Edad del cultivo cultivo 3.4 Fases de crec crecimient imiento o en cultiv cultivo o por lotes (bat (batch) ch) 3.5 Cinética de la utilización de substrato y de la formación de producto 3.6 Modelos cinéticos 3.6.1 Modelos cinéticos para el crecimiento 3.6.2 Modelos cinéticos para la formación de producto 3.7 Modela Modelado do de un cultiv cultivo o por lotes (batc (batch) h) simple 3.8 Cinética del decaimiento microbiano 3.9 Relación entre el ambiente y el crecimiento microbiano 2
Temario
3.0 Cinética del crecimiento microbiano y de la formación de producto 3.1 Requi Requisitos sitos para el creci crecimient miento o micr microbiano obiano 3.2 Cuantificación del crecimiento 3.33 Pa 3. Pará ráme metr tros os ci ciné néti tico coss 3.3.1 Velocidades volumétricas 3.3.2 Velocidades específicas 3.3.3 Tiempo de duplicación 3.3.4 Grado de duplicac duplicación ión 3.3.5 Productividad volumétrica 3.3.5 Edad del cultivo cultivo 3.4 Fases de crec crecimient imiento o en cultiv cultivo o por lotes (bat (batch) ch) 3.5 Cinética de la utilización de substrato y de la formación de producto 3.6 Modelos cinéticos 3.6.1 Modelos cinéticos para el crecimiento 3.6.2 Modelos cinéticos para la formación de producto 3.7 Modela Modelado do de un cultiv cultivo o por lotes (batc (batch) h) simple 3.8 Cinética del decaimiento microbiano 3.9 Relación entre el ambiente y el crecimiento microbiano 2
3.1 3. 1
Requ Re quis isit itos os pa para ra el cr crec ecim imie ient nto o mi micr crob obia iano no
Los requisitos para el crecimiento microbiano son: Inóculo viable Fuente de energía Medio de cultivo con los nutrientes necesarios Ausencia de inhibidores Condiciones ambientales apropiadas. apropiadas.
3
3.2 3. 2
Cuan Cu anti tifi fica caci ción ón de dell cr crec ecim imie ient nto o
El estudio cuantitativo de la cinética microbiana requiere contar con métodos confiables y sencillos para medir el crecimiento de poblaciones. Las medidas más usadas de la cantidad de microorganismos son el número de células y la masa celular en base seca (biomasa). Esta última es la más usada desde el punto de vista “ingenieril”. No existe necesariamente una relación proporcional entre la biomasa y el número de células. Esta relación es más compleja para los microorganismos que crecen formando agregados o ramificaciones (cultivos miceliales). En el caso de cultivos miceliales (hongos, actinomicetos), los microorganismos pueden desarrollarse desarrollarse en forma difusa en toda la masa de líquido o en forma discreta adoptando la forma esférica (pellets). 4
La biomasa y el número de células que interesan determinar son los correspondientes a los microorganismos activos, aquellos que realmente participan en el bioproceso. No todos los microorganismos vivos o medidos como viables están realmente activos. La actividad microbiana se mide por la velocidad para realizar la transformación de interés por cantidad de microorganismos presentes en el sistema considerado (velocidades específicas). La biomasa que debiera usarse en las ecuaciones que describen y cuantifican procesos microbianos es la “biomasa activa”. En la práctica, se mide la masa celular total y paralelamente se hacen de medidas de viabilidad o actividad celular. 5
Lista parcial métodos para cuantificar el crecimiento de poblaciones microbianas
Recuento directo de células en celda Recuento de colonias crecidas en placa NMP Medida de peso seco por gravimetría Nefelometría Turbidimetría Correlación entre microorganismos y el nivel de un componente celular (nitrógeno, proteína, ADN, ATP, etc.) Correlación entre microorganismos y una actividad metabólica (consumo de substrato, formación de producto, emisión de luz, etc.) 6
3.3
Parámetros cinéticos
Los parámetros definidos en esta sección se refieren básicamente a cultivos en medio líquido “homogéneneos”. 3.3.1 Velocidades volumétricas
Se define como el cambio de un componente por unidad de volumen y de tiempo. ri
=
cambioen componente i tiempox volumen
(17)
En términos de concentraciones, se pueden expresar: r S
=
− d S d t
(18)
r P
=
dP d t
(19)
r X
=
dX
(20)
d t
r S: velocidad volumétrica de consumo de substrato r X: velocidad volumétrica de crecimiento microbiano r P: velocidad volumétrica de formación de producto 7
3.3.2
Velocidades específicas
Se denominan también actividades o cocientes metabólicos Velocidad específica
=
cambio en el componente biomasa x tiempo
En términos de concentraciones : Velocidad específica de consumo de substrato:
qS
=
Velocidad específica de formación de producto:
qP
=
Velocidad específica de crecimiento:
μ=
A partir de la ecuación 23, como: d lnX μ =
− d S X d t
(21)
d P
Xd t
d X
(22) (23)
X d t
se puede expresar también (24)
d t
8
La pendiente de la curva ln X vs t es
.
Para cultivos microbianos sin limitaciones en la disponibilidad de substrato, es generalmente constante y corresponde al valor máximo ( m) para las condiciones existentes. El cultivo bajo dichas condiciones sigue una cinética de primer orden. Sigue el comportamiento cinético de una reacción autocatalítica. El período durante en el cual el crecimiento tiene lugar con constante se denomina fase exponencial o logarítmica, según se describa el crecimiento en base a X o al ln X. Si es constante, a partir de la ecuación 23 se tiene: ln
X X0
=μt
(25)
X = X0 e
μt
(26) 9
10
3.3.3
Tiempo de duplicación
Se denomina tiempo de duplicación (td ) el intervalo de tiempo que insume duplicar la biomasa. A partir de la ecuación 25 o 26 con X = 2X0 y t = td, se tiene: td
=
ln 2 μ
3.3.4
(27) Grado de duplicación
Es el número de veces n que se duplica una población microbiana en un tiempo dado. Se denomina también número de generaciones. X X0
=
2n
(28) 11
Tabla 4. Valores típicos de tiempo de duplicación (td)
Tipo de organismo
td (h)
Bacterias
0,3 – 2,0
Levaduras
1,0 – 4,0
Hongos filamentosos
2,0 – 4,0
Microalgas
18 – 35
Células animales (in vitro)
20 - 40 12
3.3.5
Productividad volumétrica
Es un parámetro cinético que se utiliza para evaluar un proceso desde el punto de vista industrial. Productividad volumétrica
=
masa producida tiempo x volumen
(29)
QX: productividad volumétrica de biomasa QP: productividad volumétrica de producto QX
=
ΔX Δt
3.3.6
(30)
QP
=
ΔP Δt
(31)
Edad del cultivo
Intervalo de tiempo que transcurre entre la inoculación y un tiempo dado, generalmente cuando el cultivo se interrumpe para usarlo como inóculo u otra aplicación. 13
3.4
Fases de crecimiento en cultivo por lotes (batch)
Fase I Lag o de retardo II Aceleración III Exponencial (logarítmica), de producción IV Desaceleración V Estacionaria VI Decaimiento o muerte
14
ln X Variaciones de X, ln X, y rX con el tiempo
X
r X
15
Crecimiento por lotes (batch) usando dos substratos como fuente de carbono (crecimiento diaúxico)
16
3.5 Cinética de la utilización de substrato y de la formación de producto
La formación de producto y el crecimiento están relacionados con la utilización (consumo) de nutrientes. En esta sección se establecerán las relaciones entre ellos, mediante ecuaciones de balance de materiales. En base a la ecuación 4, se tiene:
−
d S d t
=−
d SG d t
−
d SM d t
−
d SP
(32)
d t
Se define velocidad específica de consumo de substrato para mantenimiento celular “m” como: m
=
consumo de substrato para mantenimie nto
(33)
biomasa x tiempo
En términos de concentraciones se expresa:
m=
− d SM X d t 17
(34)
Tabla 5. Valores típicos de velocidad específica de consumo de substrato para mantenimiento (m)
Organismo Lactobacillus casei Aerobacter cloacae Saccharomyces cerevisiae Penicillium chrysogenum Candida utilis Azobacter vinelandii Klebsiella aerogenes
m (g/gh) 0,135 0,094 0,036 0,022 0,170 0,15 0,04 18
Introduciendo los parámetros cinéticos y los coeficientes de rendimiento en la ecuación 32, se tiene: − −
d S d t d S d t
qS
=
qS
=
1 YX/S
μX
=
(35)
YX/S μX
=
YG
μ YG
+
+ m
+
mX
+
qP X
(36)
YP
qP
(38)
YP
μ
(37)
YX/S
=
1 YG
+
m μ
+
YP/S 1 YX/S YP
(39)
Definiendo YP/X como el coeficiente de rendimiento de producto por cantidad de biomasa producida, se tiene: YP/X
=
d P d X
=
YP/S YX/S
1
(40)
YX/S
=
1 YG
+
m μ
+
YP/X YP
(41) 19
Para la formación de producto: d P
=
d t
qP X
=
Y P/S qS X
=
YP/S YX/S
μX
= YP/X μ X
(42)
qP
=
Y P/S qS
(43)
qP
=
YP/X μ
(44)
Cuando no hay formación de producto, q p = 0 y las ecuaciones 36, 38 y 39 se pueden expresar: −
d S d t
qS
=
1 YX/S
=
μX YG
+
+
m
μ YG
=
1 YG
+
mX
(45) (46)
m μ
(47)
Si los consumos de substrato para mantenimiento celular y formación de producto son despreciables, m 0, qP 0, entonces YX/S YG . 20
La relación cinética entre crecimiento y formación de producto depende del papel del producto en el metabolismo microbiano. Según lo expresado en el numeral 2.5 se tiene: a) Formación de producto asociada al crecimiento (clase 1) b) Formación de producto parcialmente asociada al crecimiento, cinética mixta (clase 2, situación intermedia entre 1 y 3) c) Formación de producto no asociada al crecimiento (clase 3).
21
s a ci fí
c ol e V
s e s e d a di
c e p
µ qS qP
22
Wang et al . p. 79 23
Bailey & Ollis, 2nd. Ed. pp. 422 – 423. 24
25
3.6
Modelos cinéticos
Permiten predecir comportamientos y simular el efecto de variar las condiciones de operación dentro de su rango de validez. La formulación de un modelo puede ser experimental, teórica o mixta. Modelos más simples idealizan a la población celular como: No estructurada No segregada Estado de crecimiento balanceado: la composición celular media no se afecta por la proliferación Representan comportamiento promedio de las poblaciones de células a través de la cuantificación de propiedades del cultivo (tales como X, S, P, , qS, qP). 26
3.6.1
Modelos cinéticos para el crecimiento
El modelo cinético más difundido es el propuesto por Monod (1942). Establece una relación funcional entre y la concentración de un único nutriente esencial “limitante”. Es un modelo sencillo de dos parámetros. Se aplica básicamente para el cultivo de un microorganismo que crece formando células aisladas (separadas) sobre un substrato simple y cuando no hay inhibidores del crecimiento. Modelo flexible, ha mostrado predecir adecuadamente el crecimiento de cultivos que no cumplen totalmente los requisitos anteriores. Si bien se basa en la forma de las isotermas de adsorción de Langmuir y en la cinética enzimática de Michaelis & Menten, es un modelo de base esencialmente empírica. 27
Existen modificaciones del modelo de Monod para extender su aplicación a otros casos: inhibición, crecimiento diáuxico (varios substratos), substrato complejos no definidos, cultivos mixtos, etc.
=
μ
μ S m
S+K
(48) S
: es la velocidad específica de crecimiento máxima.
m
KS: constante de saturación, también llamada constante del modelo de Monod. =
/2 para S = KS
m
Generalmente S >> KS y
,(
m
es constante).
El modelo de Monod se aplica básicamente para la fase de crecimiento exponencial. 28
29
30
Tabla 5. Valores típicos de la constante de saturación (K S) del modelo cinético de Monod Substrato Organismo (género) KS (mg/L) Glucosa 0,07 – 2,0 Escherichia Glucosa 5,0 Aspergillus Glucosa 25 Saccharomyces Lactosa 20 Escherichia Glicerol 4,5 Candida Oxígeno 0,04 – 0,5 Candida Metanol 0.7 Pseudomonas Fosfato 1,6 Escherichia Mg2+ 0,6 Klebsiella Triptofano Escherichia 0,0005 – 0,001 Arginina 0,5 Aspergillus 31
Modelos cinéticos para inhibición por substrato o producto
Modelo para inhibición del crecimiento por alta concentración de substrato (Modelo de Andrews o Haldane). μ
μ S
=
m
K
+ S
S
+S
(49)
2
K
I
Modelo para inhibición del crecimiento por alta concentración de producto. μ
=
μ S m
S+K
f
(50)
P
S
puede tener diferentes expresiones y puede usarse también para corregir la ecuación 49 cuando existen ambos tipos de inhibiciones. a KP − KP P P = f e = f f P = 1 − P (53) (51) P KP + P (52) P m f P
32
1 -
) h ( 0.7 l a i c r e m m o c x a m
µ
µ
0.6
=
0.70 S
2
(R = 0.90)
S + 207
0.5 0.4 0.3
1 -
) 0.2 h ( e v it a n x a m
µ
µ
0.1
0.68 S
=
2
(R = 0.97) 2
S + 215 + S /608
0 0
200
400
600
800
1000
1200
Initial fat concentration (mg/l) 33
3.6.2
Modelos cinéticos para la formación de producto
Formación de producto asociado al crecimiento (fermentaciones de clase 1, metabolitos primarios). qP
= αμ
(54)
α es un coeficiente cinético y en particular se demuestra que α = YP/X (ver ecuaciones 40 y 44). Formación de producto parcialmente asociada al crecimiento (fermentaciones de clase 2, cinética mixta). Modelo de Leudeking & Piret (1959) de dos parámetros, α y β. qP
= αμ + β
(55)
Formación de producto no asociada al crecimiento (fermentaciones de clase 3, metabolitos secundarios) qP
=
β
(56) 34
3.7 Modelado de un cultivo por lotes (batch) simple
Suponemos el cultivo por lotes simple limitado solamente por un substrato y que sigue el modelo cinético de Monod. d X d t
=
(57)
μX
De la ecuación 3 se tiene:
S
=
S0
−
X − X0 YX / S
(58)
Introduciendo en la ecuación 57, las ecuaciones 48 y 58: d X d t
X
∫ X
0
=
+ X 0 − X) X + S0 YX/S + X 0 − X)
μm (S0 YX/S (K S YX/S
+ S0 YX/S + X 0 − X) d X = (S0 YX/S + X 0 − X) X
(K S YX/S
(59)
μm
t
∫
(60)
d t
0
35
+ S0 YX/S + X 0 ) X K S YX/S S0 YX/S + X 0 − X = − ln ln S0 YX/S + X 0 S0 YX/S X 0 S0 YX/S + X 0
(K S YX/S
μm t
(61)
La ecuación 61 da una curva X vs t tipo s para el cultivo microbiano por lotes donde para t , X YX/S S0 + X0 . Para condiciones en las que K S << S, la ecuación 61 se puede simplificar y aproximar por la ecuación 25, ln(X/X0) =
t, donde
=
.
m
Las ecuaciones 25 y 61 permiten estimar el tiempo de fermentación.
36
3.8
Cinética del decaimiento microbiano
El decaimiento microbiano generalmente es significativo al fin de la fase exponencial, cuando existe agotamiento de nutrientes. Sin embargo puede darse también cuando existen condiciones adversas (cambios en las condiciones operativas, acumulación de sustancias inhibidoras, etc.) El decaimiento microbiano expresado en términos de biomasa puede presentar dos aspectos: Muerte y lisis celular Las células consumen su propio material celular de reserva (autoconsumo) y se denomina metabolismo endógeno. Ambos se describen usualmente como ecuaciones cinéticas de primer orden. 37
d X d t
=
μX − k d X
(62)
kd se denomina velocidad específica de decaimiento microbiano. Si el proceso es la muerte celular, kd se denomina velocidad específica de muerte. Si el proceso es el consumo endógeno de biomasa kd se denomina coeficiente endógeno y se denota usualmente ke . Generalmente, bajo condiciones activas crecimiento celular, kd es despreciable, kd << .
de
38
3.8 Relación entre el ambiente y el crecimiento microbiano
El resultado exitoso de un bioproceso implica optimizar el “binomio” microorganismo ambiente. Los factores ambientales inciden en la cinética y por lo tanto en los parámetros cinéticos. Los principales factores ambientales son: Formulación del medio de cultivo Tipo de nutrientes (simples, complejos, naturaleza química) Solubilidad de los nutrientes, Concentración de nutrientes y otros componentes Tipo de medio (complejo, definido, mínimo) pH Temperatura Concentración de oxígeno disuelto
39
Velocidad específica de crecimiento de Escherichia coli sobre diferentes tipos de medios de cultivo
Medio de cultivo
(h-1 )
Glucosa y caldo nutriente
1,2
Glucosa y sales minerales
0,82
Acetato y sales minerales
0,52
Succinato y sales minerales
0,14
Wang et al . p. 85.
40
