Citopreparación e Histoquímica

Procesado de tejidos y citopreparación

Citopreparación

PROCESOS BÁSICOS EN CITOLOGÍA- CITOPREPARACIÓN

1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 2 2. CITOLOGÍA EXFOLIATIVA ................................................................................................. 2 3. GENERALIDADES SOBRE LA OBTENCIÓN DE MUESTRAS CITOLÓGICAS........... 3 4. CARACTERÍSTICAS DE UNA BUENA PREPARACIÓN CITOLÓGICA .......................... 3 5. FIJACIÓN Y ENVÍO DE LAS MUESTRAS ........................................................................ 3 5.1.

MÉTODOS DE FIJACIÓN................................................................................................................... 4

5.2.

HOJA DE INFORMACIÓN CLÍNICA .............................................................................................. 5

5.3.

PROCESADO GENERAL DEL MATERIAL CITOPATOLÓGICO ............................................... 6

5.4.

COLORANTES PARA ESTUDIOS CITOLÓGICOS ................................................................... 10 A. TINCIÓN DE PAPANICOLAU (PAP O PP) ............................................................................................. 10 B. COLORACIÓN DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA ....................................................................................... 11 C. DIFF-QUIK (DQ) ......................................................................................................................................... 12 D.TINCIÓN DE SHORR .................................................................................................................................. 12 E. GIEMSA ....................................................................................................................................................... 12

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1.

Citopreparación

INTRODUCCIÓN

La Citopatología es la parte de la A.P que, mediante distintos procedimientos, estudia las alteraciones morfológicas de las células desprendidas libremente de los epitelios de revestimiento o extraídas de distintas zonas del cuerpo humano mediante punción. 2.

CITOLOGÍA EXFOLIATIVA

La citología exfoliativa tiene como objeto identificar las células del cuerpo humano desprendidas de la epidermis, los epitelios que revisten estructuras orgánicas abiertas al exterior y el mesotelio que tapiza las cavidades corporales (pleura, peritoneo, articulaciones.....). De forma genérica las células pueden obtenerse:

a) Por exfoliación forzada mediante frotamiento o raspado con diversos

instrumentos en la epidermis y los epitelios que son continuación de la misma.

b) Aprovechando líquidos que transportan elementos descamados de forma

espontánea (esputos, orina...).

c) Mediante instrumentos de exploración o punción, que extraen el componente

líquido con células en suspensión procedente de zonas orgánicas (tracto respiratorio, gastrointestinal, cavidades serosas).

De esta manera los territorios orgánicos que con mayor frecuencia estudiamos son:  Aparato genital femenino  Árbol respiratorio  Aparato digestivo  Vías urinarias y próstata  Piel  Cavidades orgánicas: peritoneal, pleural, pericárdica, raquídea y articular

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3.

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GENERALIDADES SOBRE LA OBTENCIÓN DE MUESTRAS CITOLÓGICAS

La calidad de una preparación citológica depende, tanto del proceder clínico acerca de la obtención y realización del extendido (dependiendo del tipo de muestra), de la prefijación, como del envío de las muestras y su posterior procesamiento en el laboratorio. Para una correcta obtención de las muestras se requiere habilidad y experiencia, además hay que tener un instrumental adecuado. Los instrumentos utilizados en citopatología para la toma de muetra suelen ser sencillos y consisten en hisopos de algodón, escobillones, pipetas, espátulas de madera.... El material obtenido puede extenderse directamente en el porta, aunque en otras ocasiones se requieren útiles algo más complejos como placas Petri o envases especiales para recoger esputos. También se pueden utilizar frascos estériles y sondas para la recogida de orina. Los endoscopios suelen ir provistos de un mecanismo de lavado, inyección y aspiración de líquidos. La extensión de la muestra sobre el porta la realiza el personal que extrae la muestra en el caso de la citología por cepillado. Si se trata de orina, esputos, L.C.R, o un líquido de punción la extensión la realiza el técnico especialista en el laboratorio de citología. 4.

CARACTERÍSTICAS DE UNA BUENA PREPARACIÓN CITOLÓGICA Existen una serie de características cualitativas y cuantitativas a tener en cuenta: a) Las características cuantitativas son: la muestra debe ser representativa del conjunto y, muy importante, la distribución debe ser uniforme, ausencia de agrupamiento celular y que resulte en una monocapa. b) Las características cualitativas son: células intactas sin evidencia de distorsión, que las células estén individualmente aplanadas y que estén bien fijadas, que no haya evidencia de desecación.

5.

FIJACIÓN Y ENVÍO DE LAS MUESTRAS

Un fijador celular adecuado debe tener las siguientes características: Página 3 de 12


-

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Penetrar rápidamente en las células Minimizar la retracción celular Mantener la integridad morfológica Inactivar las enzimas autolíticas Permitir la permeabilidad de los colorantes Permitir la adhesión celular a una superficie de cristal Ser compatible con los medios de tinción empleados posteriormente Ser bactericida Permitir un archivo celular permanente

5.1.

MÉTODOS DE FIJACIÓN

Las citologías ginecológicas y las muestras obtenidas por cepillado se envían extendidas, mientras que las restantes muestras se suelen transportar en forma de suspensiones celulares más o menos densas. En ambos casos es preciso realizar una rápida fijación para evitar el deterioro celular. Generalmente la confección de las extensiones citológicas la realiza en la consulta el propio especialista o el personal de enfermería, se suele emplear un citospray. La disposición del material en el porta no se realiza al azar. El porta está marcado en uno de los extremos con el fin de colocar allí una etiqueta informadora de la muestra, esta se dispone de forma que el exudado vaginal sea el más próximo a la etiqueta, a continuación se extiende la muestra del exocervix y por último y en el extremo más alejado la del endocérvix. Hay veces que se pueden encontrar otras disposiciones dependiendo del laboratorio que procesa la muestra o del especialista clínico que solicita el estudio. Se recomienda que cada laboratorio decida con sus especialistas clínicos que es lo que prefiere. Tras la fijación teñiremos con Papanicolau (PP) o bien de dejaremos secar al aire para teñirlas con un May-Grünwald-Giemsa o un Diff-Quick. También se puede teñir con la tinción de Shorr (variante de PP)

Los materiales líquidos (orina, esputos...) deberán enviarse en fresco y ser procesadas en pocas horas, si no es posible se usan líquidos fijadores, generalmente etanol al 50% contenido en frascos de boca ancha con tapa de rosca. El volumen del fijador debe ser igual o ligeramente superior al del líquido objeto de estudio. (Con unos 100ml de líquido hay material suficiente para realizar citodiagnósticos, los frascos de 250ml son los más recomendados).

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Las muestras procesadas por punción deben fijarse en etanol al 96% para su posterior tinción con Papanicolaou, o bien dejarse secar al aire para teñirlas con MayGrünwald- Giemsa o Diff-Quick. Como excepciones tenemos:

a) El fijador Saccomanno (alcohol al 50% y Carbowax 1540, aproximadamente al 2%). Especialmente se usa en citología de esputo. b) Los cepillados orofaringeos y bronquiales se fijan en etanol al 96% enviándose de

forma parecida a las citologías.

c) Los tubos o jeringas con muestras de punciones de derrames procedentes de

cavidades orgánicas pueden enviarse sin sustancia pre fijadora siempre que el procesado se realice con rapidez. Y para ello se heparinizan los tubos con dos gotas de heparina para evitar la coagulación (actualmente los tubos suelen ir heparinizados). 5.2. HOJA DE INFORMACIÓN CLÍNICA Todo el material que es enviado para estudio citopatológico debe ir acompañado de información clínica sobre el paciente y la enfermedad que se estudia mediante un proceso de petición citológica. En la hoja hay que incluir los siguientes datos:

 

Centro y servicio de procedencia Médico que solicita el estudio

       

Personal auxiliar responsable del envío y que posteriormente recibe el informe. Nombre, dirección, sexo y edad de la paciente. Origen del material. Método de obtención. Resumen de la historia clínica. Sugerencias diagnósticas. Tratamientos realizados. Estudios citológicos o anatomopatológicos previos.



También hay que comprobar que el nombre del paciente que viene en la hoja de petición coincide con el que viene en la muestra. Si hay discordancia se devolverá la muestra, con una nota explicativa.

  

Se leerán los datos clínicos para ver qué tinciones serán necesarias hacer. Se pondrá la fecha en la que se recibe la muestra en el laboratorio (fecha de recepción) Se hará, cuando sea necesario, una descripción macroscópica de las muestras, según el Página 5 de 12


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protocolo de procesado de cada tipo de muestra. 5.3. PROCESADO GENERAL DEL MATERIAL CITOPATOLÓGICO El procesado o preparación de la muestra para el examen microscópico, comprende tres fases: -

Extensión

-

Fijación

-

Tinción

EXTENSIÓN En el laboratorio de citopatología la realiza el técnico especialista cuando no ha sido realizada por el clínico. MODO DE OPERAR (en el laboratorio) 1- ORINA Existe una hoja para recogida de orina que el paciente debe conocer. En el laboratorio, en caso de muestras con escasa celularidad, como es el caso de la orina, se ha utilizado durante mucho tiempo, la técnica del Nucleopore: - Instalar una jeringa sobre el soporte del nucleopore - Añadir sobre él unas gotas de suero salino o fisiológico - Después colocar una jeringa de 20 mL y añadir por orden: - 20 mL de orina - 20 mL de suero - 20 mL de OH al 50 % PRECAUCIÓN: se debe quitar la jeringa completa y extraer fuera el émbolo, para evitar aspirar células Desmontar el soporte y colocar el filtro, dándole la vuelta, sobre un porta, impregnado en polilisina, secándolo suavemente con papel - Introducir el porta en: - OH 96º 5 minutos - Cloroformo (triclorometano) 40 minutos, para que se disuelva el filtro - OH 96º 30 minutos - Tinción PP -

El resultado final, es la obtención de la extensión de células presentes en orina sobre el porta. Página 6 de 12


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En muchos laboratorios de Anatomía Patológica, se está dejando de usar la técnica del nucleopore. Otra forma de procesarla sería; utilizar una centrífuga convencional para obtener un concentrado celular (sedimento) y a continuación usar la citocentrífuga para obtener la extensión de células y por último teñir. 2- ESPUTO - Existe una hoja de instrucciones para la recogida del esputo - Recoger tres esputos de tres días consecutivos, en frascos separados, indicando 1º, 2º y 3º esputo - Guardar en frigorífico y llevar al laboratorio el tercer día - Descripción macroscópica - Interesante observar la presencia y tomar muestras - Áreas hemorrágicas - Fragmentos de tejido - Áreas decoloradas - Se extiende el material seleccionado con otro portaobjetos - Fijar inmediatamente en OH 96º - Lavar después con agua destilada durante 20 min - Secar al aire antes de teñir - Teñir con PP

En caso de esputos muy espesos, se utiliza la técnica del Saccomano para la fluidificación de esputos. -

Se utiliza una solución de Carbowax (PEG). Se hace a partes iguales (esputo y carbowax), se deja fijándose al menos 1 hora. Se quita el fijador sobrenadante, dejando una mínima cantidad. Se ponen los tres esputos en el vaso del homgeneizador (se bate la mezcla). El material aparece homogeneizado en un grumo fino. Centrifugando en centrífuga convencional y recogiendo el sedimento que se extiende en un porta ( se hacen tres extensiones) Fijar en OH 95º 1 hora Sumergir en agua 15 minutos Secar al aire Teñir con PP

3- ASPIRADO BRONQUIAL O BRONCOASPIRADO (BAL) a) Si el material es mucoide-compacto se procede en su manejo igual que con un esputo. b) En caso de que el material se más líquido: centrifugación. A continuación se realiza la extensión del material precipitado. Página 7 de 12


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4- LAVADO BRONCOALVEOLAR (BAL) - Se reciben aproximadamente 20 mL de muestra - Centrifugar todo el líquido y decantar el sobrenadante - Citocentrifugar el precipitado o sedimento 5- LÍQUIDOS -

-

-

-

Descripción macroscópica de todos los líquidos Método de lisar hematíes: para líquidos muy hemorrágicos - Fijar en OH 96º 15-20 minutos - Introducir en fijador de Carnoy - OH 96º de nuevo Técnica del bloque celular - Incluir en parafina cualquier coágulo o material sólido presente en la muestra y hacer estudio histológico posterior LCR - Citocentrífuga durante 20 minutos Otros líquidos - Citocentrífuga

6- CEPILLADOS Y EXUDADOS Se reciben como extensiones fijadas en OH 96º o con spray, especificando el nº de ellas Se procesan como las extensiones húmedas de esputo a. Alcohol de 96º b. Agua destilada 15 – 20’ c. Secar al aire (teñir PP) 7- CITOLOGÍA CERVICO-VAGINAL -

Se reciben como extensiones, habitualmente fijadas con spray especial (citospray) Antes de teñir, se dejan sumergidas en OH 96º, al menos 1 hora Tinción PP

FIJACIÓN Después de la prefijación propiamente dicho.

hay

que

continuar

con

el

proceso

de

Podemos fijar en:



Solución éter/alcohol al 96% a partes iguales Página 8 de 12

fijación


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Es un proceso que se utiliza desde los tiempos de Papanicolaou por sus excelentes resultados, sobre todo tipo de materiales. En la actualidad está en desuso por las peligrosas características químicas del éter.



Alcohol etílico al 96%

Es el más empleado en los laboratorios de citopatología, ya que, en general, produce excelentes resultados. El proceso de fijación es similar al del éter/alcohol y consiste en sumergir la extensión en un baño de una sustancia, como mínimo durante 15-20 minutos. El tiempo máximo de permanencia no está definido, ya que las células no se alteran aunque se prolongue durante días o semanas, en caso de periodos superiores, conviene que los baños con las extensiones permanezcan cerrados y en el interior del frigorífico.



Otros alcoholes

Pueden utilizarse recomendados son:



otros

alcoholes de

diferente

graduación,

los

más

Metanol al 100% Isopropanol al 80%

Fijación mediante citospray

Es un fijador en forma de aerosol, que se aplica al material a fijar inmediatamente después de extendido sobre el porta. Es muy utilizado por su simplicidad y buenos resultados. Se aplica directamente sobre la extensión colocando el aerosol a 25-30 cm de distancia y dejando secar al aire libre. Antes de proceder a la tinción debe extraerse el aerosol sumergiendo el porta en etanol al 96%. A veces, si el líquido del aerosol es soluble en agua la extensión puede ser teñida inmediatamente, con lo que los tiempos del procesado se acortan.



Otros fijadores de efecto análogo al citospray

a) Laca del pelo que tenga elevado contenido en alcohol y escaso contenido en lanolinas o aceites. Sin embargo este tipo de lacas tiene una serie de desventajas ya que suele tener otros componentes que pueden interferir en la captación del colorante.

b) Fijadores que pueden ser preparados en el propio laboratorio. ( por ejemplo soluciones Página 9 de 12


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de polietilenglicol 2% en alcohol de 95º). TINCIÓN Consiste en aplicar diversas combinaciones de sustancias colorantes a las extensiones previamente fijadas. En citología exfoliativa el método más recomendado es el de Papanicolaou, el cual contiene un colorante que pone de manifiesto la cromatina nuclear y otras sustancias que tienen afinidad tintorial por los componentes citoplasmáticos. 5.4.

COLORANTES PARA ESTUDIOS CITOLÓGICOS

Dentro de la amplia gama de colorantes citológicos que existen, actualmente se prefiere como tinciones de rutina las de carácter policromático, que permiten diferenciar diversos matices en la estructura celular a teñir. La citología exfoliativa, y en especial la ginecológica, recomiendan como método el Papanicolaou.

A. TINCIÓN DE PAPANICOLAU (PAP O PP) Fue introducida en 1925, utiliza hematoxilina (Hx) como colorante nuclear y diversas mezclas de colorantes citoplamáticos como el naranja G, la eosina, el verde luz SF y el pardo Bismark. Esto le proporciona una gran cromaticidad y transparencia, permitiendo la diferenciación de los detalles citológicos en los que se basa el diagnóstico. Hay muchas modificaciones en relación al protocolo de tinción, depende de cada laboratorio. HEMATOXILINA La más utilizada es la Hx de Harris sin acidificar con ácido acético. Es el colorante de la estructura nuclear proporcionando color azul oscuro. NARANJA G Junto con la EA, constituye el colorante citoplasmático. Aunque la preparación de la solución puede realizarse en el laboratorio, se encuentra comercializado bajo el nombre de OG-6. Los eritrocitos también se tiñen de naranja intenso. Página 10 de 12


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SOLUCIÓN DE EOSINA ALCOHÓLICA (EA) Además de este colorante, contienen cantidades variables de verde luz SF y pardo Bismark. Se encuentra ya diluido constituyendo las mezclas EA-36, EA-50, EA-65. Técnica de PP, según protocolo de tinción. Resultado de la tinción: Núcleos: entre azul y morado Dependiendo del tipo de células. Citoplasmas eosinófilos: rosas y Citoplasmas basófilos: azul Hematíes: naranjas Actualmente existen sistemas automáticos de tinción que simplifican el método, aunque los resultados son algo inferiores a los manuales. Pero dado el volumen de trabajo en los laboratorios este sistema se está imponiendo progresivamente.

B. COLORACIÓN DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA La utilizan la mayor parte de los citólogos que estudian preparaciones de citología por punción-aspiración (PAAF). Consiste en la combinación de dos coloraciones sucesivas, la de May- Grünwald y la de Giemsa. Esta técnica presenta algunas ventajas con respecto a los métodos clásicos de PAP y Hx-eosina para la percepción de los finos detalles citológicos sobre los que se sustentan el diagnóstico de la malignidad (Esta tinción resalta detalles del citoplasma como la mucina y los distintos componentes del fondo, como el colágeno) Técnica de May-Grinwald-Giemsa , según protocolo de tinción. Resultados de la tinción: Gránulos neutrófilos: rosa Gránulos eosinófilos : Marrón rojizo Gránulos basófilos: prúrpura Nucleolos: rosas Eritrocitos maduros: naranja, rosado Núcleos celulares: azul violáceo Citoplasma: azul claro a rosa. Página 11 de 12


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C. DIFF-QUIK (DQ) Se trata de una tinción rápida cuyos reactivos están comercializados, lo que facilita su empleo. Secar al aire (El fijador está incluido en kit de tinción). Técnica de DQ, según protocolo de tinción. Resultados: Se obtienen las mismas tonalidades cromáticas que con la técnica de May- GrünwaldGiemsa. D. TINCIÓN DE SHORR Es una tinción útil para la evaluación hormonal de la citología vaginal. Para la fijación se prefiere alcohol 96º. Técnica de Shorr, según protocolo de tinción. Resultados de la tinción: Citoplasmas: de naranja brillante a azul verdoso Núcleos: de azul a violeta oscuro Bacterias: azul oscuro Núcleos de hongos: violeta E. GIEMSA También para la fijación se prefiere alcohol 96º. El colorante Giemsa es una mezcla de derivados tiacínicos destinados a teñir núcleos celulares y de eosina para colorantes citoplasmáticos. El fundamento de la técnica es igual que el Giemsa que se utiliza en tinciones histológica, siendo los resultados los mismos. Técnica de Giemsa, según protocolo de tinción. Resultados de la tinción: Núcleos: azul violáceos Citoplasmas y conjuntivo: tonos rosas Eritrocitos: salmón Ruickettsias: Violeta Gránulos de eosinófilos: rojo anaranjado

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Histoquímica

HISTOQUÍMICA

1.

INTRODUCCIÓN ...............................................................................................................1 1.1.

2.

ASPECTOS TÉCNICOS ............................................................................................. 2

HISTOQUÍMICA DE HIDRATOS DE CARBONO ...................................................... 3 2.1.

TINCIONES PARA HIDRATOS DE CARBONO. ................................................... 5

2.1.1.

TINCIÓN DE PAS .............................................................................................. 5

2.1.2.

PLATA METENAMINA ...................................................................................... 6

2.1.3.

LA TÉCNICA DE GOMORI MODIFICADO .................................................... 6

2.1.4.

TINCIONES PARA MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS ( MPSA ). ............. 6

2.1.5.

TINCIONES PARA MPSA, MPSN ( NEUTROS ) Y GLUCOPROTEÍNAS. . 7

3.

HISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS. .................................. 7

4.

MÉTODOS DE TINCIÓN PARA PIGMENTOS E IONES METÁLICOS .................. 7 4.1.

TINCIONES PARA PIGMENTOS HEMOGLOBINÓBENOS ............................... 8

4.2.

TINCIONES PARA PIGMENTOS NO HEMOGLOBINÓBENOS ...................... 9

1. INTRODUCCIÓN

Las técnicas histoquímicas comprenden el conjunto de métodos empleados para la demostración de la naturaleza química de los componentes tisulares y celulares. Se recurre al empleo de estas tinciones histoquímicas cuando se pretende visualizar específicamente una sustancia determinada. Los métodos histoquímicos se basan, en hacer reaccionar químicamente determinados reactivos con los componentes celulares o tisulares que queremos demostrar para obtener un producto final que es coloreado y puede verse con el microscopio

El objetivo de la histoquímica es - poner de manifiesto una molécula o familia de moléculas presentes en una sección histológica - y estudiar su distribución tisular "in situ” Pá gina 1 de 10


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Estas moléculas son difícilmente discernibles con colorantes generales Existen tinciones o métodos histoquímicos específicos para la demostración de: – Aminoácidos – Proteínas – Carbohidratos: glucógeno, mucopolisacáridos – Lípidos – Pigmentos y minerales... Cuando el objeto de estudio es una enzima, se habla de técnicas histoenzimáticas En este caso en la incubación ha de emplearse el sustrato sobre el cual actúa el enzima. Durante el procesado del tejido previo a la reacción histoquímica, hay que evitar dañar a la molécula que queremos detectar, porque de otra manera obtendíamos falsos negativos, es decir, no obtener tinción cuando en realidad la molécula de interés sí está presente en el tejido, aunque deteriorada. Para llevar a cabo cualquier técnica histoquímica y en particular las técnicas histoenzimáticas se requieren una serie de precauciones: – Utilizar material de vidrio extremadamente limpio – Utilizar soluciones frescas (recién preparadas) a menos que se indique lo contrario 1.1. – –

–

–

–

ASPECTOS TÉCNICOS La aplicación de técnicas histoquímicas sobre biopsias no ofrece generalmente problemas No es así sobre material procedente de necropsias, sobre todo las técnicas histoenzimáticas que a veces no funcionan correctamente, por haber comenzado los procesos de degradación de los tejidos Hay que tener en cuenta la fijación que se ha llevado a cabo, algunos fijadores pueden interferir e impedir que se produzca la reacción histoquímica que se pretende Los tejidos se procesan preferentemente - por congelación - con una fijación química ligera - o incluso sin fijación química alguna La inclusión también puede presentar problemas, algunas técnicas histoquímicas y en particular las histoenzimáticas no funcionan sobre cortes en parafina Pá gina 2 de 10


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Para las reacciones histoenzimáticas es importante además prestar especial atención - al pH y - a los tampones utilizados, algunos pueden inhibir la actividad enzimática mientras que otros pueden favorecerla

2. HISTOQUÍMICA DE HIDRATOS DE CARBONO Los hidratos de carbono ( H d C ) son polialcoholes oxidados entre los que se encuentran grupos aldehídos y cetonas (polihidroxialdehídos y polihidroxiacetonas) compuestos por C, H y O.

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En Anatomía Patológica nos interesan los polisacáridos: Los polisacáridos son glúcidos de molécula muy voluminosa, formada por la condensación de muchas moléculas de monosacáridos (más de diez), con la correspondiente pérdida de moléculas de agua Entre ellos, y además de los polisacáridos simples como el glucógeno, destacan los polisacáridos complejos: -

Mucoproteinas Mucolípidos Mucopolisacáridos

MUCOPROTEÍNAS Son complejos de proteínas y polisacáridos en los que predomina el primer componente Son similares a las glucoproteínas, pero se diferencian en su mayor contenido de hexosaminas, amino azúcares formados por la adición de un grupo amina a una hexosa (superior al 4%) Son PAS + No experimentan metacromasia frente al azul de toluidina Pueden encontrarse en: – Células beta de la hipófisis – Membranas basales de los epitelios – Reticulina y fibras colágenas

MUCOPOLISACÁRIDOS Se distinguen en : - NEUTROS: Son PAS+. Tienen un comportamiento similar a las mucoproteínas - ÁCIDOS (MPSA):  SULFATADOS O SULFOMUCOPOLISACÁRIDOS - EPITELIALES: Son PAS- y Azul Alcián + a pH 1. Se encuentran en las células caliciformes del colon y en glándulas salivares submaxilares. -

DE TEJIDO CONJUNTIVO: Son PAS- y Azul Alcián + a pH=0.5. Aparecen en cartílago de válvulas cardiacas, aorta y también en piel.Los Pá gina 4 de 10


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compuestos de este tipo se llaman: condroitinsulfato, heparinsulfato, queratinsulfato y ácido glucurónico sulfatado. 

NO SULFATADOS O CARBOXIPOLISACÁRIDOS - EPITELIALES: Son PAS+ y Azul Alcián +. ( Ácido siálico o sialomucinas ). -

DE TEJIDO CONJUNTIVO: Son PAS- y Azul Alcián + a pH 2.5. El compuesto que está en mayor proporción es el ácido hialurónico.

Todos los MPSA presentan metacromasia con el AZUL DE TOLUIDINA.

MUCOLÍPIDOS Formados por polisacáridos y ácidos grasos complejos. Se pueden teñir también en las tinciones de grasas. Se encuentran en Sistema Nervioso ( gangliósidos o cerebrósidos)

2.1.

TINCIONES PARA HIDRATOS DE CARBONO.

El fundamento es la demostración de grupos carbonilo (aldehído y cetona) formados sobre los grupos alcohol de los hidratos de carbono (HdC) por oxidación previa. 2.1.1.TINCIÓN DE PAS Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido periódico, para obtener grupos carbonilo, que posteriormente se van a demostrar porque se tiñen con el reactivo de Schiff. Se dice que es una reacción estequiométrica porque a mayor cantidad de HC mayor formación de grupos carbonilo y mayor intensidad de color. Los reactivos que se utilizan en esta tinción son el ácido peryódico (0.5%), reactivo de Schiff cuya composición es fucsina básica (1 g) + agua destilada (200 mL) y baño sulfuroso (H Cl + metabisulfito sodico + agua destilada). La técnica general será según protocolo y los resultados se verán los núcleos en azul y todo lo que sea PAS+ se verá de color rojo oscuro, magenta. COMPUESTOS QUE SON PAS+: - Polisacáridos simples (glucógeno, celulosa) - Mucopolisacáridos neutros (en glándulas Brunner del duodeno, epitelio gástrico y cápsulas bacterianas)

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Mucoproteínas (mucinas del tubo digestivo, del árbol respiratorio y bronquial, tiroglobulina, TSH, gonadotrofinas, cuerpos de Russel de las células plasmáticas, megacariocitos). Glucoproteínas del suero, membrana basal, reticulina. Glucolípidos (gangliósidos, cerebrósidos). Pigmentos (ceroide y lipofucsina).

Compuestos PAS - que, sin embargo, son hidratos de carbono: - Mucopolisacáridos ácidos: que tienen bloqueados los grupos carbonilos y no pueden ser oxidados por el ácido periódico 2.1.2.PLATA METENAMINA El fundamento de esta técnica es la oxidación de los H d C mediante el ácido crómico y el ácido peryódico. Estos H d C oxidados reducen las sales de Ag que contiene el reactivo, haciendo precipitar la plata metálica sobre la estructura a teñir. La sal de plata empleada es el complejo metenamina argéntica – – – –

Es inestable y sólo se mantiene como tal a pH alcalino entre 8.3 y 9.2, fuera de éste se disocia en sus dos componentes La técnica debe realizarse con un control continuo de pH, de modo que la precipitación de la plata métalica no ocurra anticipadamente Por sus características especiales, esta técnica se emplea para visualizar membranas basales sobre todo en el riñón (glomerulonefritis), compuestas en gran medida por hidratos de carbono del tipo glicoproteínas y que, por tanto, son además PAS + 2.1.3. LA TÉCNICA DE GOMORI MODIFICADO

Es una variante de la plata metenamina. Lo que correspondería a PAS+ se teñirá de negro: glucógeno, mucina, hongos, membranas basales, reticulina y elastina. 2.1.4.TINCIONES PARA MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS ( MPSA ). La tinción que más se utiliza es el AZUL ALCIAN. Este es la tinción más especifica para MPSA y en ella se utilizan colorantes de carácter básico que se unen a los grupos ácidos de los MPSA dando lugar a la formación de un compuesto salino, sobre todo cuando el pH del medio es ácido. En general, a pH=2.4 ó 2.6 el azul alcián Pá gina 6 de 10


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colorea todos los MPS. Si el pH disminuye, por ejemplo pH=1, se colorean los MPS sulfatados y si se desciende hasta pH=0.5 se incrementa la selectividad de la tinción y se tiñen solamente los MPSA más sulfatados. El procedimiento se hace según protocolo del kit y, en general, obtenemos con esta tinción el color azúl dependiendo del pH: -

pH 2.5 casi todos los MPSA……Azul pH 1, los MPSA sulfatados …… Azul pH 0.5, los MPSA fuertemente sulfatados…Azul

La otra tinción empleada para los MPSA es la METACROMÁTICA. El colorante más usado para esta tinción es el AZUL DE TOLUIDINA, con él los resultados se verán los núcleos y el fondo azul y todas las estructuras de carácter metacromático en distintas tonalidades de rojo. 2.1.5.TINCIONES PARA MPSA, MPSN ( NEUTROS ) Y GLUCOPROTEÍNAS Se utiliza la tinción combinada de AZUL ALCIAN-PAS. Una vez teñídos, los MPSA de azul, ya que se tiñen con el azul alcián y los MPSN y glucoproteinas se tiñen de rojo, pues se tiñen con el PAS.

3. HISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS. Actualmente se hace por técnicas inmunohistoquímicas (IHQ) y solo queda vigente la técnica de FEULGEN para ADN. Técnica que se realiza en 2 fases: 1º) consiste en una hidrólisis ácida que rompe la estructura del ADN 2º) demostración de los grupos carbonilo que se hace mediante reacción de Schiff de forma similar a lo que ocurre en la técnica de PAS. Los resultados se ven el ADN en rojo púrpura y los citoplasmas en verde. Es una reacción estequiométrica y cuantitativa, es decir, a mayor cantidad de ADN mayor intensidad de color y esta intensidad se puede medir o cuantificar, mediante un programa informático. Es una técnica que se utiliza para técnicas de análisis digital de imágenes por densitometría. 4. MÉTODOS DE TINCIÓN PARA PIGMENTOS E IONES METÁLICOS Los pigmentos son sustancias coloreadas que existen de forma natural, es decir, que por sí mismas tienen color. Pá gina 7 de 10


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A veces es necesario realizar técnicas específicas para identificar un determinado pigmento detectado en una preparación histológica rutinaria. El problema que plantean la mayor parte de los pigmentos, a excepción de la hemoglobina, es la similitud de su color, normalmente pardo. Esto hace importante su identificación mediante diferenciación histoquímica. Tipos de pigmentos: – Artefactuales (provocan la aparición de artefactos en las tinciones) – Pigmentos exógenos – Pigmentos endógenos ARTEFACTOS: se consideran como tal aquellos que son debidos a sustancias procedentes de los fijadores que se utilizan en el proceso, sobre todo el pigmento formólico, aunque también pueden aparecer restos de Hg, Ag o plomo pertenecientes a otros fijadores. Son ajenos a la muestra. Los pigmentos EXÓGENOS son aquellos de externo debido a tatuajes, inhalación del humo del tabaco, polvo de carbón o sílice y que aparecen en la muestra procedente del propio pacientes, del ambiente o del técnico. Los ENDÓGENOS son los procedentes del interior del organismo. Pueden ser – hemoglobinógenos (procedentes de la hemoglobina) – no hemoglobinógenos 4.1.

TINCIONES PARA PIGMENTOS HEMOGLOBINÓBENOS

TINCIÓN BENCIDINA: resultados núcleos en azul y la hemoglobina (Hb) y los eritrocitos en verde. Se trata de una reacción “tipo peroxidasa”. La hemoglobina actúa sobre el H2O2 liberando O2; éste, oxida a la bencidina (incolora) produciendo pigmentación verdosa TINCIÓN PERLS: es una pigmentación para depósitos de hierro, iones férricos, también conocidos estos depósitos como hemosiderina. Resultados: Fe en azul y los núcleos en rojo TINCION DE GMELIN para hematoidina (Hb sin Fe) y bilirrubina. – Técnica: - Desparafinar e hidratar - Colocar un cubre sobre el porta sin montar con medio de montaje - Poner unas gotas de ácido nítrico diluido en el limite entre el cubre y el porta Pá gina 8 de 10


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Histoquímica

Por acción del nítrico, la bilirrubina y la hematoidina se van transformando y cambian de color, de amarillo pardusco a verde, azul y finalmente, rojo púrpura Todo el proceso se debe observar inmediatamente al microscopio nada más añadir el ácido nítrico.

TECNICA DE HALL para la detección de bilirrubina: En esta técnica, entre otros, se emplea la picrofucsina de Van Gieson, por lo que se obtienes tonos muy variados Resultados: – Bilirrubina: verde – Colágena: rojo – Músculo, células epiteliales y eritrocitos: amarillo

4.2. – – – – –

TINCIONES PARA PIGMENTOS NO HEMOGLOBINÓBENOS

Melanina Lipofucsina Pigmento ceroide Determinación de Ca Determinación de Cu

MELANINA: – MASSON FONTANA: grisáceo-negruzco. – DECOLORACIÓN DE LA MELANINA: se hace con permanganato potásico o H2O2. – FLUORESCENCIA: que se produce al tratar los tejidos que contienen depósitos de melanina con paraformaldheído Esto da lugar a una autofluorescencia amarilla típica. Observar con microscopio de fluorescencia. LIPOFUCSINA Y PIGMENTO CEROIDE: La lipofucsina es un pigmento amarillo pardo que aparece en las células viejas del Sistema Nervioso, músculo cardíaco, hígado y glándulas suprarrenales. El pigmento ceroide es un producto anterior a la lipofucsina. Métodos no específicos que permiten diferenciar ambos pigmentos: – Técnicas para lípidos, como el Sudán negro: la lipofucsina es + por su alto contenido en lípidos. – PAS: la lipofucsina es PAS+ debido a que tiene restos de hidratos de carbono – Técnica de Schmorl: además de la lipofucsina, tiñe melanina, pigmento biliar…. Pá gina 9 de 10


Histoquímica

DETERMINACIÓN DE CALCIO: Las sales de calcio están presentes normalmente en huesos y dientes, pero en ocasiones aparecen áreas calcificadas en tejidos que en principio no están calcificados. –

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ROJO ALIZARINA S: específica para determinar Ca. Es muy importante que el pH del colorante esté entre 4.1-4.3. Para ello se le incorpora un tampón acetato. TINCION DE VON KOSSA - Resultados: - Hueso y calcificaciones: negro - Osteoide y núcleos: rojo

DETERMINACIÓN DE COBRE: El cobre se encuentra casi exclusivamente en hígado y córnea. Suele unirse al ácido rubeánico por lo que se emplea para detectarlo. –

TINCIÓN. ÁCIDO RUBEÁNICO: específica para hacer un diagnóstico de la enfermedad de Wilson, donde se acumula cobre, sobre todo en hígado y córnea. Los depósitos de cobre se ven como granulaciones de verdes a negras.

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Citopreparación e Histoquímica

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