Cinética enzimática (partes b y c)

Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Química Química Biológica Lic. Ciencias mención Química

Laboratorio Nº5

“Cinética enzimática” Parte b y c.

Integrantes: Álvaro Etcheverry Matías Leal. Profesora: Mª Cecilia Rojas Fecha del Entrega: Jueves 19 de Mayo de 2011

INTRODUCCIÓN

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El objetivo de este laboratorio fue el de determinar la actividad catalítica de la fosfatasa ácida de gérmen de trigo a distintos tiempos de incubación, y finalmente realizar una curva de progreso de la reacción enzimática. Se realizaron distintos ensayos enzimáticos y se consideraron distintos controles para poder confirmar que la reacción fuera catalizada por la enzima en cuestión. MÉTODOS En primer lugar se confeccionó una curva de calibración con una solución de pnitrof nit rofeno enoll 60 μM (que (que es el produc producto to final final de la reacci reacción) ón),, uti utili liza zando ndo para para ello, ello, volúmenes entre 1 y 5 mL y luego se llevó a un volumen de 6 mL con una solución de NaOH NaOH 0.1 M. Las Las disti distint ntas as soluci solucione oness fueron fueron medida medidass en un espec espectro trofot fotóme ómetro tro utilizando utilizando como blanco la solución de NaOH 0.1 M utilizada utilizada anteriormente, esto debido a que el p-nitrofenol absorbe a 405 nm. Los datos obtenidos están en la siguiente tabla: Tabla N°1: N°1: Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de p-nitrofenol. Volumen de pnitrofenol 60 μM (mL)

Volumen de NaOH 0,1 M (mL) 1 2 3 4 5

5 4 3 2 1

O

HO

Volumen total (mL)

O

O2 N

OH

6 6 6 6 6

-

P O 2N

Concentració Absorba n pncia nitrofenol (μM) 10 20 30 40 50

f o

O

+

N

a

O

s

f a

t a

s

O 2N

H2O

H O 2N

O

a OH

+

HPO 4

-2

-

FiguraN°1: FiguraN°1: Reacción catalizada por fosfatasa ácida, además se muestra la estructura del p-nitrofenol en su forma coloreada que absorbe a 405 nm. Luego Luego se defini definióó un vol volum umen en de incub incubac ación ión adecu adecuado ado para para distr distribu ibuir ir con con exactitud los componentes del medio de reacción, según se muestra en la Tabla N°2, se confeccionaron los 5 tubos sin agregarles el extracto enzimático y se incubaron en un baño termorregulado por 3 minutos a 37°C. Una vez transcurridos los 3 minutos de incubación se le agregó la enzima y se dejó que transcurriera la reacción por el tiempo



agregar los 5.5 mL de NaOH 0.1 M; para el caso de los controles blanco de sustrato y sin enzima se detuvieron las reacciones una vez transcurridos 10 minutos de incubación. Tabla N°2: N°2: Volúmenes utilizados para distribuir los componentes del medio de reacción y las absorbancias respectivas para los distintos ensayos enzimáticos.

Incubación a 5 minutos Incubación a 10 minutos Control sin enzima Control blanco de sustrato Control tiempo cero

Volumenes (mL) H2 pCitrato de sodio Enzima Tot Absorba O nitrofenilfosfat 0,1 M pH 5,0 0,4 al ncia o 25 mM mg/mL 0 .1 0 .1 0 .2 0.1 0. 0.5 0 .1

0 .1

0 .2

0.1

0. 0.5

0 .2

0 .1

0 .2

0

0.5

--

0 .2

0

0 .2

0.1

0.5

--

0 .1

0 .1

0 .2

0.1

0. 0.5

--

Finalmente se realizó una curva de progreso de reacción utilizando para ello un tubo de ensayo que contenía 2 mL de citrato 0.1 M pH 5.0, 2 mL de p-nitrofenilfosfato 25 mM, y se incubó por 3 minutos en un baño termorregulado a 37°C. Pasado ese tiempo se agregó 1 mL de enzima y se continuó la incubación. Cada ciertos intervalos de tiempo se extrajeron 0.5 mL del medio de reacción y se le agregaron 5.5 mL de NaOH 0.1 M. Luego de haber tomado varias porciones a distintos intervalos de tiempo, se analizaron las absorbancias respectivas respectivas para poder determinar la cantidad de producto formado a mediad que avanzaba la reacción, según la tabla N°3. Luego se repitió este experimento con el doble de la concentración de enzima(¿????????). Tabla N°3: N°3: Absorbancias medidas a distintos intervalos de tiempo. Concentración normal de enzima

Tubo 1 2 3 4 5

Doble de concentración de enzima Tiempo Absorban Tiempo Absorban (min) cia (min) cia 10 10 15 15 20 20 25 30 30 40

RESULTADOS Y DISCUSIÓN



REFERENCIAS • •

•

Guía de trabajos prácticos Bioquímica 2011. ALBERTS, B. “et al”; 2005; Introducción a la Biología Celular; 1° Edición; Editorial Médica Panamericana; México. STRYER, L. “et al”; 2001; Bioquímica; 6° Edición; Editorial Reverté; España.

Cinética enzimática (partes b y c)

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