CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD FUNGICIDA DE MATERIAL ELICITADO Y NO ELICITADO DE Solanum tuberosum (PAPA) Y SU
CORRELACIÓN CON LA RESPUESTA FITOALEXINA
Trabajo de Grado para Optar al Título de Químico
Por: SINAR DAVID GRANADA GARCÍA Asesor: Walter Murillo (candidato Ph.D.) Coasesores: Antoni Rueda (candidato Ph.D.) Carlos Peláez (Ph.D.)
Universidad de Antioquia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Instituto de Química Medellín, Ant. 2009 1
CONTENIDO
Página INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………… 5 1. MARCO CONCEPTUAL ……………………………………………………….. 6 1.1 MECANISMOS DE DEFENSA EN PLANTAS ……………………………….9 1.2 GRANDES RUTAS METABÓLICAS Y LA BIOSÍNTESIS DE METABOLITOS DE ESTRÉS ……………………………………………..11 1.2.1 Alcaloides……………………………………………………………………… 13 1.2.2 Fenilpropanoides………………………………………………………………. 14 1.2.3 Terpenoides……………………………………………………………………. 15 1.3 METABOLITOS SECUNDARIOS Y EL HOMBRE …………………………..17 1.4 FITOALEXINAS Y METABOLITOS DE ESTRÉS …………………………...20 2. OBJETIVOS……………………………………………………………………..28 2.1 OBJETIVO GENERAL …………………………………………………………28 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS …………………………………………………...28 3. MATERIALES Y METODOLOGÍA …………………………………………...29 3.1 TRATAMIENTO Y EXTRACCIÓN DEL MATERIAL ELICITADO Y NO ELICITADO ………………………………………………. 29 3.1.1 Materiales …………………………………………………………………….. 29 3.1.2 Metodología……………………………………………………………………29 3.1.2.1 Tratamiento del material elicitado y no elicitado……………………………. 29 3.1.2.2 Extracción de metabolitos secundarios……………………………………… 29
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Página 3.2 EVALUACIÓN in vitro DE LA ACTIVIDAD FUNGICIDA Y FRACCIONAMIENTO BIOGUIADO DE LOS EXTRACTOS ………………………………………………………….30 3.2.1 Materiales …………………………………………………………………….. 30 3.2.2 Metodología……………………………………………………………………30 3.2.2.1 Evaluación in vitro de la actividad fungicida de los extractos………………………………………………………………. 31 3.2.2.2 Fraccionamiento del extracto crudo elicitado……………………………….. 32 3.2.2.3 Evaluación in vitro de la actividad fungicida de las fracciones Fr1, Fr2 y Fr3……………………………………………... 32 3.2.2.4 Fraccionamiento del extracto Fr2…………………………………………… 32 3.2.2.5 Fraccionamiento del extracto Fr3…………………………………………… 33 3.3 CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA DEL EXTRACTO ELICITADO ………………………………………………………33 3.3.1 Materiales …………………………………………………………………….. 33 3.3.2 Metodología……………………………………………………………………33 3.3.2.1 Prueba de Flavonoides ………………………………………………………. 34 3.3.2.2 Prueba de Leucocianidinas …………………………………………………... 34 3.3.2.3 Prueba de compuestos Fenólicos …………………………………………….. 34 3.3.2.4 Prueba de Taninos …………………………………………………………… 34 3.3.2.5 Prueba de Cardiotónicos ……………………………………………………... 35 3.3.2.6 Prueba de Quinonas …………………………………………………………. 35 3.3.2.7 Prueba de Terpenoides ………………………………………………………. 35 3.3.2.8 Prueba de Alcaloides………………………………………………………… 35 3.4 MÉTODO DE BIOAUTOGRAFÍA PARA LA FRACCIÓN FR 2 ……………………………………………………………35 3.4.1 Materiales …………………………………………………………………….. 36 3.4.2 Metodología……………………………………………………………………36 3.4.2.1 Cromatografía en capa delgada……………………………………………… 36 3.4.2.2 Inoculación y revelado de la placa ………………………………………….. 37 4. RESULTADOS Y ANÁLISIS ……………………………………………………38 4.1 TRATAMIENTO Y EXTRACCIÓN DEL MATERIAL ELICITADO Y NO ELICITADO ……………………………………………….38
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Página 4.2 EVALUACIÓN in vitro DE LA ACTIVIDAD FUNGICIDA Y FRACCIONAMIENTO BIOGUIADO DE LOS EXTRACTOS ………………………………………………………….38 4.2.1 Evaluación in vitro de la actividad fungicida de los extractos ……………………………………………………... 38 4.2.2 Fraccionamiento del extracto Fr2 ……………………………………………... 45 4.2.3 Fraccionamiento del extracto Fr3 ……………………………………………... 46 4.3 CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA DEL EXTRACTO ELICITADO ………………………………………………...47 4.4 MÉTODO DE BIOAUTOGRAFÍA PARA LA FRACCIÓN FR2 …………………………………………………………….48 5. CONCLUSIONES………………………………………………………………... 52 REFERENCIAS ANEXOS
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INTRODUCCIÓN
Las fitoalexinas son metabolitos secundarios sintetizados de novo, los cuales cuentan con actividad antibiótica y se acumulan en plantas bajo la influencia de un estrés, ya sea por microorganismos o factores del ambiente. Su expresión puede generarse mediante dos tipos de elicitores: bióticos y abióticos. La elicitación biótica consiste en generar esta respuesta mediante la acción de microorganismos como hongos o bacterias, mientras que la abiótica implica el uso de agentes químicos (metales pesados) y físicos (luz UV). Aun cuando la hipótesis de las fitoalexinas se encuentra en su séptima década, mucha de la información al respecto es desconocida o debatible, lo que ha generado nuevas alternativas en la forma de estudiar el fenómeno y ha reenfocado la atención en la explotación potencial de los mecanismos de resistencia endógena para la protección de un cultivo. El objetivo biotecnológico se centra en el uso de extractos elicitados, los cuales poseen una carga considerable de metabolitos con actividad antibiótica, en el control biológico de un cultivo. Otra de las alternativas consiste en diseñar una resistencia multimecanística contra plagas, lo que implica el uso de herramientas interdisciplinarias con las que se posibiliten aplicaciones de alto impacto. Sin embargo, este objetivo solo puede lograrse a través de un entendimiento completo de la respuesta fitoalexina. Es posible facilitar la correlación de la actividad con la biosíntesis de metabolitos que cumplen con las características necesarias para ser llamados fitoalexinas, a través de fraccionamientos bioguiados y el diseño de herramientas como la bioautografía en la cual se observa, directamente, cuáles compuestos están implicados en la actividad biocida hacia microorganismos fitopatógenos.
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1. MARCO CONCEPTUAL. Biodiversidad es un término comúnmente usado para denotar la variedad de especies y la multiplicidad de formas de vida. Sin embargo este concepto es más profundo de lo que generalmente imaginamos, por lo que se hace necesario abordarlo a partir de conceptos mucho más generales. El Metabolismo es uno de los aspectos generales o comunes a todos los seres vivos que forman parte de esa biodiversidad. El metabolismo es definido como el conjunto de reacciones químicas que tienen lugar en las células y que conforman la base de la vida. Estos procesos permiten a la célula realizar funciones vitales como crecer y reproducirse, mantener el sistema alejado del equilibrio químico y generar respuestas de adaptación hacia el entorno las cuales son de gran importancia para la supervivencia del organismo del que estas forman parte. Es así como todos los organismos necesitan proveerse a sí mismos con energía en forma de ATP para obtener los bloques con los que construyen sus propios tejidos [1]. Existen dos tipos principales de metabolismo: primario y secundario [2]. En el primario se incluyen todas las rutas y productos que son esenciales para la célula. Además, algunas de ellas son comunes en todos los organismos. Es decir, son procesos que involucran esencialmente la misma química a través de los grandes reinos de la vida, hecho que prueba que había ya un grado de evolución enorme antes de que se diera la diversificación en los diferentes tipos de células y organismos [1]. Por otra parte, el metabolismo secundario comprende los procesos químicos que no son universales o que son únicos para un sistema dado. El metabolismo secundario representa el conjunto de las reacciones químicas que da lugar a la formación de un
metabolito secundario , también llamado producto natural . Estos generalmente se encuentran en cantidades relativamente pequeñas y su producción usualmente está confinada a un grupo particular de organismos o a una única especie (aun a una misma cepa cultivada bajo ciertas condiciones). Es decir, la biosíntesis de ciertos metabolitos secundarios puede ser extendida o restringida a familias, géneros, o especies
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particulares, pero el resultado obtenido generalmente difiere de una especie a otra. Es así como precursores químicos comunes pueden producir resultados diferentes [2]. La definición estricta para los metabolitos secundarios es que éstos no forman parte de la estructura molecular básica de la célula, se encuentran presentes sólo en órganos o tejidos particulares, o en etapas definidas del desarrollo. La definición más moderna que puede encontrarse es en la que se los considera como compuestos orgánicos que no tienen ningún rol en la asimilación o en el crecimiento y desarrollo del organismo. Sin embargo, aunque en la mayoría de los casos los metabolitos secundarios no parecen ser necesarios para la supervivencia de la planta, pueden conferirle una ventaja competitiva. A pesar de no ser bien conocido el rol biológico que juega determinado compuesto, en muchos casos consigue convertirse en un tesoro químico. Es decir, adquiere un interés particular o es de beneficio para el hombre [2]. El apelativo de “producto natural” resulta algo inapropiado ya que, estrictamente hablando, cualquier molécula biológica es un producto natural. Sin embargo el término está reservado para los metabolitos secundarios, es decir, moléculas pequeñas (peso molecular menor a 1500 Da) producidas por un organismo, pero que no es indispensable para la supervivencia del mismo, como sí lo son algunas macromoléculas tales como proteínas, ácidos nucléicos y polisacáridos, los cuales conforman la maquinaria básica de los procesos fundamentales para la vida [5]. Como se mencionó con anterioridad, los niveles de los metabolitos secundarios están estrechamente relacionados con el estado nutricional y de desarrollo del organismo. Más crítico aún es el hecho de que su producción o biosíntesis se vea fuertemente afectada por varios tipos de estrés que se encuentran presentes en el ambiente en el cual se desarrolla el organismo [2]. A través de los años se han considerado varias hipótesis para la existencia de los metabolitos secundarios. Una de ellas los considera como productos de exceso en el metabolismo, como respuesta a niveles de sustrato superiores a los requeridos para el
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metabolismo primario, o como resultado a una limitación en la cantidad de nutrientes que pueden ser absorbidos. Otra de las hipótesis afirma que son productos de desviación de rutas menores, que involucran, en un primer paso, la formación de una enzima de bifurcación, la cual dirige una cierta cantidad del sustrato destinado al metabolismo primario, hacia el secundario [3]. También podrían representar productos [2,4]. de secreción o detoxificación [2,4]
Probablemente la explicación más convincente para la existencia del metabolismo secundario fue la propuesta por Zähner [1], quien lo describió como un “comodín evolutivo”.
El esclarecimiento de este hecho se encuentra estrechamente ligado al
mecanismo mediante el cual un compuesto es fijado en la expresión génica del metabolismo secundario en un organismo. Este proceso evolutivo incluye, en primer lugar, el hecho de que el compuesto no tenga efectos adversos en el mismo metabolismo que lo produce, en ninguno de sus niveles de diferenciación, morfogénesis, transporte, regulación o en el metabolismo intermediario. A partir de ese punto, el compuesto puede seguir expresándose por un largo periodo de tiempo durante el cual consigue encontrar un rol que le confiere una ventaja selectiva al organismo que lo produce [2]. Esta es la explicación al hecho de que la biosíntesis de ciertos metabolitos secundarios esté restringida a un grupo de organismos o incluso a una especie en particular. Sin embargo, como se había citado antes, mientras muchos actúan como antialimentarios, atrayentes sexuales o agentes antibióticos; muchos otros parecen no tener un rol biológico obvio. Una de las principales funciones de los metabolitos secundarios en las plantas es la de disuadir o repeler a los organismos que se alimentan de ellas. No obstante, debido al continuo proceso de evolución y a la especialización de las plantas en la implementación de nuevas rutas biosintéticas, los herbívoros y microorganismos se volvieron tolerantes a sus efectos y desarrollaron la capacidad de utilizarlos para sus propios fines [5].
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Cabe agregar que, curiosamente, muchos metabolitos secundarios parecen ser dañinos para la planta que los produce [4], es por ello que a menudo los terpenos, por ejemplo, deben ser almacenados en glándulas o en compartimentos celulares especializados para evitar que la misma planta sufra los l os efectos citotóxicos del compuesto [5].
1.1 Mecanismos de defensa en las plantas. Existe una gran cantidad de trabajos, realizados a partir de extractos de plantas, en donde se hace alusión a la importancia de los metabolitos secundarios en el control de patógenos [4, 5]. En ellos se ha evidenciado actividad antifúngica, antibacteriana, además de otras propiedades como la estimulación en el desarrollo fisiológico de la planta, activación de mecanismos de defensa contra plagas y enfermedades, respuesta hipersensible directa contra patógenos, control de especies reactivas de oxígeno (ERO) generadas en la respuesta de defensa [5], entre otras. Cuando en una planta se produce un estrés, ya sea por una interacción con agentes bióticos (microorganismos), agentes abióticos (como luz UV) o daños mecánicos (heridas de insecto), todas estas condiciones se traducen en una respuesta de defensa de la planta la cual involucra la activación transcripcional de diversos genes de proteínas necesarias para la cicatrización de la herida y/o la prevención de la invasión de microorganismos patógenos. Estos genes codifican para proteínas involucradas en: a) fortificación de la pared celular como son la formación de calosa, lignina y proteínas ricas en hidroxiprolina. b) la producción de inhibidores de proteasa y de enzimas líticas tales como las quitinasas y glucanasas, y c) la síntesis de metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana y antioxidante [6]. La respuesta de defensa contra el ataque de microorganismos patógenos está coordinada, tanto espacial como temporalmente, para una contención rápida de la infección, por lo que puede ser local o en sitios lejanos al daño. Esta es conocida como
respuesta sistémica. Por otra parte, la respuesta local está asociada a una respuesta
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hipersensible caracterizada por una muerte rápida de las primeras células infectadas y la restricción de la expansión del patógeno, aislándolo del resto de la planta [7]. Entre los eventos tempranos que se desencadenan en la respuesta hipersensible están: a) la producción de especies reactivas de oxígeno tales como: super óxido (O 2-), hidroxilo (OH-) y el peróxido (H 2O2), b) la apertura de canales iónicos, y c) los eventos de fosforilación y desfosforilación de proteínas. Posteriormente se da un aumento en los niveles de ácido jasmónico, ácido salicílico y etileno, la acumulación de proteínas relacionadas a la patogénesis (RP), un aumento de la producción de metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana o antioxidante y el fortalecimiento fortalecimie nto de la pared celular. Estos eventos conducen al establecimiento de la respuesta local, mientras que en la respuesta sistémica se induce la producción de proteínas RP similares a las de la respuesta local y de otras proteínas RP. En la figura puede apreciarse un diagrama general de la respuesta de defensa en plantas (figura 1) [5]. En general, la expresión de los genes de defensa se regula por moléculas tales como el ácido salicílico, etileno, ácido jasmónico y las ERO. En particular, el ácido jasmónico modula la síntesis de las proteínas de la pared celular, como son las proteínas ricas en prolina, y activa la expresión de los genes de las enzimas involucradas en la síntesis de metabolitos secundarios tales como la acetil-CoA carboxilasa, la chalcona sintasa, la fenilalanina amonio liasa, la hidroximetil-glutaril-CoA reductasa, y las polifenol oxidasas, entre otras [8]. Por su parte, las ERO pueden tener dos funciones. En la primera, pueden aumentar el daño producido por el estrés debido a su toxicidad, mientras que en la segunda, pueden actuar como una señal para la activación de las respuestas de defensa. En la respuesta hipersensible, las ERO pueden limitar la expansión del microorganismo patógeno causando la muerte de la célula vegetal huésped y/o actuando directamente sobre el microorganismo [9].
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De igual manera, los metabolitos secundarios están involucrados en la respuesta de defensa de las plantas mediante la restricción de la invasión y/o matando directamente al microorganismo patógeno, o bien, por su capacidad antioxidante, contribuyen al mantenimiento del estado de oxido-reducción de la célula vegetal [10].
Figura 1. Representación esquemática de las respuestas de defensa, tanto locales como sistémicas, desde el inicio de la invasión de un microorganismo patógeno.
1.2 Grandes Rutas Metabólicas y la biosíntesis de metabolitos de estrés. Se había mencionado con anterioridad que las rutas para la modificación y síntesis de carbohidratos, proteínas, grasas y ácidos nucléicos son iguales en todos los organismos vivos, excepto por algunas variaciones menores. Del mismo modo, la biosíntesis de la mayoría de los metabolitos secundarios se da a partir de un grupo de precursores relativamente pequeño, los cuales se han modificado para formar un incontable número de compuestos a través de varias rutas sintéticas. Las rutas de mayor importancia son: la acetil coenzima A (acetil-CoA), ácido shikímico y ácido mevalónico; más conocidas como la ruta del acetato, shikimato y mevalonato respectivamente. Estos intermediarios se forman como subproductos de rutas como la glicólisis e intermediarios de la misma 11
(figura 2.) [11].
Por otra parte, una amplia variedad de antibióticos, péptidos, proteínas y
alcaloides son modificaciones de aminoácidos derivados de la acetil-CoA vía ciclo de Krebs [12] o por medio de la ruta del shikimato.
Figura 2. Esquema general de la biosíntesis de los diferentes grupos de metabolitos secundarios.
A partir de estas rutas se derivan varios grupos de metabolitos secundarios de los cuales tres son los más importantes y extensamente estudiados: los terpenoides, los alcaloides, y fenilpropanoides, todos ellos implicados, mediante infinidad de mecanismos, en la respuesta de defensa de los organismos que las producen.
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1.2.1 Los alcaloides Los alcaloides son compuestos heterocíclicos que generalmente se sintetizan a partir de aminoácidos tales como triptofano, tirosina, fenilalanina, lisina, arginina y ornitina, solos o combinados con terpenoides. También se pueden derivar de purinas y de policétidos del acetato. Los alcaloides pueden dividirse en varios grupos tales como: alcaloides isoquinoléicos, quinolizidínicos, pirrolizidínicos, tropánicos e indólicos [13]. Por su similitud química a moléculas que participan en la transmisión de las señales del sistema nervioso, el efecto toxico de los alcaloides radica en su capacidad de bloquear neurorreceptores intermediarios de la transducción de la señal neuronal y canales iónicos de vertebrados e insectos. Por otra parte, sus efectos inhibitorios del crecimiento de microorganismos patógenos están dados por su capacidad de intercalarse con el DNA, de detener la síntesis de proteínas, inducir la apoptosis e inhibir las enzimas del metabolismo de carbohidratos [14]. En general, la síntesis constitutiva de alcaloides se incrementa en respuesta a la herida producida por insectos depredadores; sin embargo otros alcaloides son sintetizados de novo, es decir, en el momento en que se produce la herida. Estos reaccionan con grupos
aniónicos y grupos nucleofílicos de aminoácidos o de otras moléculas como receptores y enzimas, inhibiendo su función. Los receptores adrenérgicos, nicotinérgicos, muscarinérgicos y de la serotonina son blancos de unión de estos compuestos. Así mismo, inhiben a las enzimas necesarias para la síntesis y el rompimiento del neurotransmisor acetilcolina, impidiendo la transducción de la señal neuronal de insectos y vertebrados. La interacción de estos alcaloides con el DNA, las proteínas y enzimas de transcripción; contribuye a los efectos aleloquímicos y tóxicos contra bacterias, hongos, virus, insectos, vertebrados y otras plantas [15]. Como se mencionó anteriormente, algunos alcaloides se sintetizan como parte de una respuesta general de defensa de las plantas. Sin embargo, se conocen insectos parásitos que evitan esta respuesta de defensa asimilando, transportando y almacenando estos compuestos para su propio beneficio. Estos insectos se especializan en utilizar los 13
alcaloides de la planta en la síntesis de sus ferohormonas o de compuestos que tienen actividad contra sus propios depredadores [16].
1.2.2 Los Fenilpropanoides Fenilpropanoides Estos compuestos se caracterizan por tener en su estructura un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilo y se sintetiza a partir de un precursor común, el ácido cinámico, derivado de la fenilalanina por la actividad de la enzima fenilalanina amonio liasa. Debido a su fitotoxicidad, por lo común son almacenados en su forma glicosilada en las vacuolas o bien pueden conjugarse con otros componentes componentes de la pared celular [17]. En la respuesta hipersensible, los fenilpropanoides simples pueden contribuir a limitar el desarrollo de la infección. Algunas formas insolubles de fenilpropanoides aunados a otros compuestos como la cutina, suberina, lignina y polisacáridos refuerzan la pared celular como respuesta de las plantas a la herida y al ataque de microorganismos patógenos. Estos compuestos, además, reducen la digestibilidad de la pared celular por las enzimas digestivas del microorganismo patógeno [18]. Los flavonoides, tales como la naringenina y el kaempferol del arroz, inhiben el crecimiento de Xanthomonas oryzae y la germinación de las esporas de Pyricularia oryzae, que son importantes microorganismos patógenos de este cereal [19].
Otro aspecto de relevancia en los flavonoides es que pueden limitar la invasión del microorganismo en respuesta a la infección. Estos pueden acumularse en forma de inclusiones en las primeras células epidérmicas que fueron atacadas por el patógeno. En el momento en que se penetra el tejido micelar, estas inclusiones viajan hasta el lugar liberando su contenido y matando, tanto al patógeno, como a las células infectadas que sintetizaron estos flavonoides para finalmente detener la infección [20]. Por otra parte, los fenilpropanoides simples y los flavonoides tienen una actividad amplia dependiendo del sustituyente del hidroxilo de su anillo fenólico. Estos compuestos pueden actuar como agentes quelantes de los iones hierro y cobre, como 14
cosechadores de radicales, como es el radical hidroxilo, o reaccionar con moléculas como el ácido hipocloroso o nitroso y producir compuestos con una menor capacidad oxidativa. Algunos fenilpropanoides simples son poderosos antioxidantes capaces de consumir el H2O2 y contribuir con el ajuste del estado de oxido-reducción celular desencadenado durante el estrés [21].
1.2.3 Los terpenoides Los terpenos (terpenoides) son un grupo de compuestos lipídicos diverso y numeroso de los cuales se estima que existen alrededor de 30,000. Son inmiscibles o parcialmente miscibles en agua. Su biosíntesis se realiza a partir del acetil-CoA o intermediarios de la glicólisis [22] y se derivan de la unión de unidades isopreno de 5-carbonos (C 5H9). Los terpenos se conocen también como isoprenos o isoprenoides. La gran disponibilidad de estos compuestos, en conjunto con sus aplicaciones, erigió un incentivo para ser investigados por los químicos, quienes dilucidaron la estructura de muchos de los más simples de ellos durante el siglo pasado. Los terpenos se clasifican por el número de unidades isopreno (figura 5), además existen dos posibles rutas para su biosíntesis. Una de ellas es la ruta del ácido mevalónico donde tres moléculas de acetil-CoA se unen para formar ácido mevalónico [23] la cual es llevada a cabo en el citosol. El intermediario de seis carbonos allí producido es fosforilado con 2 grupos fosfato (pirofosfato) para luego sufrir una descarboxilación y posterior deshidratación generándose el isopentenil pirofosfato (isopentenil difosfato – IPP), al cual se le denomina “building block”. La ot ra ruta, independiente del mevalonato, utiliza intermediarios de la glicólisis para sintetizar IPP (figura 4) [31] y se se da en los plastidios (figura 3) [24]. Entre los terpenos pueden encontrase gran cantidad de compuestos con actividad biológica potencial que intervienen en la respuesta de defensa de las plantas que los producen. Algunos de ellos poseen actividad bactericida, otros son repelentes de insectos. Sesquiterpenos tales como la rishitina y lubimina de la papa son compuestos con actividad antimicrobiana [39].
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Metabolismo Primario
Metabolismo Secundario
OPP
Sesquiterpenos C15
Triterpenos C30 FDP 2X
Citoplasma
OPP
OPP
IPP
DMAPP
Plastidios OPP
OPP
IPP
DMAPP OPP
1X
Monoterpenos C10
3X GDP
OPP
Tetraterpenos C40
Diterpenos C20
GGDP
Figura 3. Biosíntesis de terpenos: rutas biosintéticas posibles en plantas.
CH3
CH3 Isomerización
H2C
H3C
OPP
OPP Dimetilalil PP
Isopentenil PP
(DMAPP)
(IPP)
Figura 4. Equilibrio de interconversión entre isopentenil pirofosfato y dimetilalil pirofosfato.
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CAROTENOIDES DITERPENOS OAc O Ph
Ph
O
OH
O
NH
β - caroteno O
MONOTERPENOS
CH3
O OH
Taxol
H OBz
AcO
- Pineno SESQUITERPENOS
ESTEROIDES
Colesterol
HO
Humuleno
Isopreno
POLIMEROS H
n
OH
O
POLIPROPENOIDES
MeO
Caucho
MeO O
Ubiquinona Coenzima Q
Figura 5. Diversidad en terpenos.
Por su parte, los terpenos en combinación con otros compuestos como las oxilipinas y los indoles, forman mezclas volátiles que funcionan como señales químicas para atraer a los enemigos naturales de insectos herbívoros. Estudios sobre la respuesta de la planta a esta interacción, demostraron que hay inductores (elicitores) en la saliva de los insectos herbívoros, que estimulan la síntesis de tales terpenos volátiles [25]. De otro lado, por su capacidad antioxidante, los terpenoides son de vital importancia para las plantas [26]. Los carotenoides no solo son componentes estructurales esenciales de los sistemas fotosintéticos, sino que también son protectores del daño causado por la fotooxidación [27].
1.3 Metabolitos secundarios y el hombre A través de la historia, los productos naturales, y particularmente los de origen vegetal, han sido los principales recursos para la obtención de sustancias medicinales, proveyendo a la industria farmacéutica de una importante variabilidad química con
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distintas aplicaciones específicas. Con el avance de las ciencias involucradas se han ido perfeccionando las técnicas de estudio lográndose, no sólo mejorar la utilización de los productos nativos obtenidos de los recursos naturales, sino también utilizarlos como puntos de partida para la síntesis de nuevas sustancias con mejores propiedades que las que les dieron origen. Hasta el presente, los principales agentes farmacéuticos han sido descubiertos a través del “screening” de productos naturales obtenidos a partir de material vegetal, organismos marinos, animales y microorganismos. Un ejemplo concreto lo constituye el hecho de que más del 50 % de todos los principios activos utilizados y con eficacia comprobada clínicamente en el tratamiento de distintos tipos de cáncer son productos naturales o sus derivados. Esto llevó a que, a partir de estudios puramente químicos y biológicos, se avanzara progresivamente y que en la actualidad se focalice particularmente en la potencial aplicación de aquellos recursos, especialmente en el tratamiento de enfermedades. Cabe agregar, que en los últimos años se ha incrementado la utilización de estos recursos naturales en el saneamiento agroindustrial y/o fitorremediación, y en la descontaminación de aguas y suelos. A lo largo de la historia, los metabolitos secundarios de las plantas han sido utilizados por la humanidad debido a sus importantes aplicaciones como productos medicinales, colorantes, esencias, alimentos, materia prima para la industria, etc. A partir de este hecho se creó la necesidad de aislar aquellos compuestos de interés, con el fin de estudiar su estructura y actividad. Sin embargo, una de las complicaciones más grandes que acarrea consigo el estudio y aislamiento de los productos naturales es que, a diferencia de las macromoléculas que prevalecen a través de los seres vivos, los primeros son mucho más pequeños y químicamente más diversos que las macromoléculas como proteínas, ácidos nucléicos y polisacáridos; las cuales son relativamente más homogéneas. Por tanto estos procesos no están ajustados a un manual práctico en el cual se encuentra detalladamente la receta o el protocolo, son simplemente el resultado de un uso adecuado del criterio químico y las herramientas con las que se cuenta [1]. 18
La cromatografía es probablemente la técnica más poderosa y versátil para la separación de una mezcla en sus componentes individuales. Aunque en la actualidad es empleada en su mayoría como una herramienta de análisis químico, esta resulta útil en la separación de cantidades relativamente pequeñas de materiales que poseen un valor intrínseco apreciable [28]. El método fue desarrollado por el botánico ruso Mikhail Tswett en 1906. Tswett llevó a cabo la extracción de una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando éter de petróleo, un solvente no polar, y descubrió que era capaz de separar los pigmentos al hacer pasar el extracto a través de un sistema que consistía un tubo de vidrio relleno con carbonato de calcio (tiza). Debido a que los compuestos que separó tenían color, Tswett observó bandas o zonas de composición distintas en la columna, demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos presentes en las plantas. A pesar de que el método cromatográfico prometía simplificar la separación de sustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la década de los 30 y principio de los 40 cuando se empezó a desarrollar la técnica teniendo este método diversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografía se emplea principalmente para separar compuestos incoloros pero el nombre permanece para describir cualquier técnica que se base en los mismos principios [28]. En la cromatografía, los componentes de las mezclas se separan a medida que son transportados por una fase fluida móvil a través de una fase estacionaria sólida o líquida, la separación de las moléculas se logra debido a que la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria. Esta separación se puede realizar en función de tamaños moleculares, relación carga/masa, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc [29]. Entre las técnicas más comúnmente usadas para el aislamiento y purificación de metabolitos secundarios se encuentran: cromatografía de columna, cromatografía de
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capa delgada (TLC) y cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en fase preparativa.
1.4 Fitoalexinas y metabolitos de estrés. Cuando la espora de un hongo entra en contacto con la superficie de una planta, el microclima (temperatura, exposición a la luz, humedad, etc.) debe ser apropiado para que pueda darse la germinación. A partir de allí, el hongo debe superar una gran cantidad de barreras de defensa antes de acceder a una célula de la planta. Estas barreras pueden ser mecánicas, como cutículas delgadas; o químicas, como compuestos que se liberan para inhibir el crecimiento de esporas y microorganismos. Estos constituyentes de la planta hacen parte del arsenal de defensa contra hongos y son llamados metabolitos de preinfección, prohibitinas o fitoanticipinas [30]. Sin embargo, dado el caso en el que todas estas armas constitutivas no sean suficientes para detener la germinación de la espora del hongo y la posterior penetración de la hifa en la epidermis, la planta usualmente responde bloqueando o retardando el avance del invasor. Para esto se generan señales de alerta que se traducen en varios tipos de reacciones como: refuerzos estructurales de las paredes celulares, respuestas hipersensibles (muerte celular programada), desarrollo de resistencia sistemática adquirida y la acumulación de sustancias químicas producidas de novo las cuales cuentan con actividad biocida llamadas fitoalexinas [31, 32, 33, 34, 35, 36] . El termino fitoalexina está restringido a compuestos con actividad antibiótica que requieren expresiones de novo de los enzimas involucrados en su ruta biosintética. Energéticamente hablando, este mecanismo resulta ser una económica forma para neutralizar agentes patógenos, ya que los recursos energéticos de la planta se desvían para la síntesis de las fitoalexinas únicamente en los instantes recientes a la infección y en el sitio de la misma. En 1911, Noel Bernard, botánico francés, descubrió que las plantas podían producir sustancias que eran específicamente formadas cuando se daba un estrés generado por el
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ataque de un hongo. Bernard encontró que los tubérculos de dos especies de orquídeas se volvían resistentes a ataques posteriores de un hongo luego de haber sido infectados con Rhizoctonia repens. Mediante el cultivo de tejidos de tubérculo infectados y la introducción del hongo en el medio (agar), él demostró que este tejido producía un inhibidor del crecimiento del hongo. No obstante, los compuestos involucrados fueron identificados décadas después [36]. Más tarde, Müller y Börger (1940) observaron el mismo fenómeno en tubérculos de papa infectados con Phytophthora infestans, a estas sustancias inducidas las llamaron “fitoalexinas” [37]
(del griego futon=planta; alexein= defensa). Müller y Börger
definieron las fitoalexinas como “compuestos químicos producidos como resultado de la invasión de células vivientes por un parásito”. La definición dada por Müller y Börger exigía que, para que un compuesto con actividad antimicrobiana fuera considerado una fitoalexina, no podría ser ni prefabricado en el tejido, ni liberado a partir de constituyentes preexistentes en la planta [38]. Es decir, estos antibióticos debían producirse en respuesta a un elicitor microbiano, y su producción exigía un gasto energético de la planta, generalmente debido a la necesidad de una nueva actividad transcripcional y/o traduccional. Otro de los requerimientos de la definición original de Müller, era que el compuesto en cuestión debía ser base de un mecanismo de resistencia a la enfermedad. Aunque la resistencia a una enfermedad se asume como función de todos los antibióticos de la planta, es difícil verificar esta función experimentalmente para cualquier constituyente de la planta con una determinación de actividad in vitro, debido al sinergismo que puede presentarse entre ellos. Por este motivo, la definición de Müller y Börger ha sido modificada a medida que se han ido encontrando nuevas evidencias y revisado conceptos. Ejemplos de ello fue la detección de fitoalexinas luego de la aplicación de otros tipos de estrés no biológico, como la irradiación con luz del rango del UV, o el tratamiento con iones metálicos pesados como sales de cobre y mercurio. A estos factores que pueden generar respuestas tanto fisiológicas como morfológicas y la acumulación de fitoalexinas, en un sentido amplio, se les denomina elicitores. Estos 21
pueden provenir de diferentes fuentes y entre ellos se encuentran los elicitores abióticos como son algunos iones metálicos, radiación U.V., y elicitores bióticos como hongos, bacterias, virus y herbívoros, etc. Se sabe que el tratamiento de plantas con elicitores, o el ataque de patógenos incompatibles, desencadena una serie de reacciones de defensa, incluyendo la acumulación de metabolitos secundarios de defensa como son las fitoalexinas, tanto en plantas intactas como en cultivos celulares [35, 39]. Muchos elicitores como la quitina, xiloglucanos, quitosan, h-glucanos y oligogalacturónidos exhiben actividad elicitora entre las diferentes especies de plantas e inducen la producción de fitoalexinas, sugiriendo que diferentes plantas poseen algunos receptores comunes para ese tipo de señales [40]. Debido a la existencia de estas nuevas evidencias, Ingham (1973) redefinió las fitoalexinas como “antibióticos producidos por las
plantas mediante rutas metabólicas
inducidas tanto por factores biológicos como químicos y del ambiente”. Ade más,
el
término fitoalexina está, en general, limitado a metabolitos secundarios de bajo peso molecular, usualmente menor a 1000 g/mol, por tanto no aplica a péptidos y proteínas con actividad biocida producidos por las plantas [14]. [14]. A menudo es difícil determinar si una sustancia es constitutiva o inducida, ya que podría presentarse en cantidades difícilmente detectables pero que se incrementan dramáticamente luego de una infección. Estrictamente este tipo de sustancias no se consideran como fitoalexinas debido que no son sintetizadas de novo. Por este motivo, Stoessl (1980) propuso una definición más p ragmática: “Productos del metabolismo superior de las plantas, ausente en tejidos sanos o presente solo en trazas despreciables, los cuales se acumulan en cantidades significativas en respuesta a un estrés por hongos o bacterias”.
La importancia de esta definición radica en que se evita asignar al
compuesto un rol en la resistencia de la planta, y que además se excluyen aquellos compuestos con actividad antibiótica que están presentes en el tejido de la planta antes de una infección por microorganismos, o que son producidos a partir de constituyentes preformados y que aparecen durante la infección.
22
De las muchas defensas potenciales en las plantas que se activan después de la infección (postinfeccionales), ninguna otra ha sido estudiada tan a fondo y generado tanta controversia a través de los años como la elicitación y la acumulación de fitoalexinas [41]. Esto se debe a que el mecanismo que emplean las fitoalexinas para detener el desarrollo del patógeno en el tejido hospedero, se encuentra aún muy nublado para muchas de las interacciones planta-patógeno conocidas. Se ha obtenido resultados importantes en sistemas donde ha sido posible cuantificar la fitoalexina en el sitio de la infección, sin embargo existen pocos trabajos tr abajos al respecto [41]. La producción de mutaciones biosintéticas en plantas podrían representar la mejor herramienta para estudiar el rol de estos compuestos, pero existen una gran cantidad de limitaciones ya que, hasta ahora, solo ha sido posible llevarse a cabo en el modelo Arabidopsis. Por medio de esta se ha evidenciado que la acumulación de camalexina es
importante en la resistencia de Arabidopsis a Alternaria brassicicola pero no a Bortrytis cinerea [42].
Otra de las aproximaciones que pueden resultar útiles para evaluar el rol de las fitoalexinas, consiste en buscar variaciones naturales en la habilidad de una planta para producir fitoalexinas y luego determinar si esta capacidad está relacionada a la producción de fitoalexinas. En el sorgo, la resistencia a Colletotrichum sublineolum no solo está relacionada a la producción de altas concentraciones de fitoalexinas en interacciones no compatibles, sino también a la acumulación compuestos más tóxicos por parte de genotipos específicos [43]. Es decir, esta variabilidad genotípica puede proveer una herramienta para estudiar el rol de las fitoalexinas si se comparan las diferencias en la resistencia y se correlacionan con la producción de fitoalexinas [44]. En 1994, en el simposio celebrado en honor al 50 aniversario del concepto de fitoalexina (“Phytoalexin Hypothesis and Beyond” el término “fitoanticipina” “Compuestos
Dannenfels, Alemania), se propone
(nombrado por J.W. Mansfield) definiéndose como:
de bajo peso molecular con actividad antimicrobiana, los cuales se
encuentran presentes en plantas antes de un estrés por microorganismos o que son 23
producidos luego de la infección, únicamente a partir de constituyentes preexistentes”. De esta manera se quiso reemplazar e incluir todo tipo de metabolitos biocidas de bajo peso molecular, además de las fitoalexinas, a los cuales no es posible correlacionárseles como parte de un mecanismo de defensa o que, en efecto, aparentan jugar un rol en la resistencia de las plantas [45]. Vale la pena aclarar que la diferenciación entre fitoalexina y fitoanticipina no está basada en su estructura química sino en el evento y la forma como se producen. Sin embargo, ha surgido otro tipo de confusiones acerca de compuestos constitutivos e inducidos. Esta va dirigida a que, una misma sustancia puede ser preformada en una especie de planta, es decir tener las características de una fitoanticipina, y ser una fitoalexina en otra. Aún más complejo es el hecho de que, algunos compuestos, pueden ser fitoalexinas en un órgano de una planta determinada y constitutivos en otras partes de la misma. Ejemplo de ello es el trébol rojo (Trifolium pratense), cuyas raíces contienen un derivado de flavonoide (maackiain) con actividad antimicrobiana, presente como la aglicona de un glicósido preformado, el cual se s e libera del tejido herido de la planta por acción de una glucosidasa durante la desfragmentación del mismo [46]. En este caso, el compuesto puede ser considerado como fitoanticipina. Sin embargo, este flavonoide también puede ser sintetizado de novo en esta planta en respuesta a una infección microbiana, u otro tipo de elicitores, tomando el papel, en este caso, de una fitoalexina [47]. Distinguir los antibióticos de las plantas con base a cómo son producidos puede parecer un poco arbitrario. No obstante, esta distinción se basa en diferencias fundamentales en las respuestas de las plantas en la interacción planta patógeno [45]. Es decir, para que una fitoalexina funcione como base del mecanismo de resistencia a una enfermedad, debe ser una respuesta activa en un tejido determinado de la planta, en el cual la interacción de la planta con el microorganismo, genere un cambio en la actividad metabólica de la planta. Mientras que, en el caso de una fitoanticipina, para que estos funcionen como base del mecanismo de resistencia, la planta debe “confiar” en estos compuestos preformados los cuales pueden jugar un papel pasivo en su interacción con 24
patógenos potenciales [45]. Es importante agregar que, en la mayoría de los casos, no es posible conocer si el compuesto producido de novo es sintetizado únicamente en el sitio de infección, si se acumula en todo el tejido de la planta o en un tejido en particular, e incluso se desconoce si su producción está íntimamente relacionada a un fenómeno específico que ocurre en una etapa particular de la enfermedad [48]. Como se mencionó con anterioridad, las fitoalexinas han sido consideradas como parte de los mecanismos con los que las plantas responden al ataque de parásitos. Sin embargo, algunos patógenos poseen una tolerancia, que puede ser moderada o alta, a estos compuestos tóxicos (fitoalexinas), mientras otros son sensibles a ellos. Ha sido posible demostrar, en unas pocas enfermedades, que los microorganismos que resultan ser patógenos para la planta, logran metabolizar estos compuestos tóxicos mediante mecanismos propios de detoxificación [34]. El estudio de tales mecanismos resulta ser de gran interés debido a que: 1.) la patogenicidad de un organismo puede depender de su habilidad para detoxificar los compuestos producidos por el hospedero y 2.) el control de los mecanismos de detoxificación puede ayudar a mejorar la resistencia a la enfermedad [37]. Las fitoalexinas se pueden encontrar tanto en Angiosperma como en Gimnosperma y, tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Aunque existe una gran diversidad estructural en estos compuestos, muchas familias de plantas producen fitoalexinas que pueden agruparse en una misma clase química. Es por esto que las fitoalexinas se han usado para examinar relaciones quimiotaxonómicas. Se ha reportado fitoalexinas pertenecientes a la familia de los sesquiterpenoides, que son obtenidas a partir de plantas de papa, tabaco y tomate, tanto en tejidos infectados como en cultivos celulares en suspensión [39]. En tomate, la Rishitina (figura 6-1) es la principal fitoalexina identificada en frutos infectados y fragmentos de tallo, aunque no ha sido detectada en hojas. Sin embargo, la respuesta en células de tomate tratadas con extractos de levadura, los cuales han demostrado actividad elicitora, se incrementa linealmente con
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el aumento de la concentración de levaduras. No obstante es posible detectar trazas de rishitina en cultivos no elicitados [39].
HO
HO
CHO
CH3
HO CH3
CH3
CH2
(1)
O
CH2
(2)
H3C
H3C
CH3 O
CH3
H3C
CH3
O
CH3
H3C
(3) H2C
OAc
(4) OH
CH3 (5)
HO CH3 CH3
CH2
Figura 6. Algunas fitoalexinas sesquiterpenoides de la papa. Rishitina (1), lubimina (2), solavetivon (3), fituberina (4) y capsidiol (5).
De esta forma, es posible demostrar la relación quimiotaxonómica que existe entre estas especies pertenecientes a la familia de las Solanáceas (papa (Solanum tuberosum), tabaco ( Nicotiana tabacum), tomate ( Lycopersicon esculentum), ya que los reportes de fitoalexinas producidas convergen a compuestos sesquiterpenoides en su mayoría. La papa tiene un especial interés en la historia ya que, como se mencionó anteriormente, a partir de esta se iniciaron los experimentos que dieron las bases de la
26
hipótesis de las fitoalexinas [32]. Para esta se reportan metabolitos de estrés como la rishitina (1), lubimina (2), solavetivon (3), fituberina (4), capsidiol (5) (figura 6) y otras 15 estructuras más [49]. Se puede encontrar una excepción en el tomate debido a que entre sus fitoalexinas se detecta un compuesto acetilénico (cis-pentadeca-6-eno-1,3-diin-5,15-diol (figura 7)), sin embargo éste no afecta la uniformidad de la respuesta fitoalexina en esta familia, ya que el compuesto se produce en menor cuantía con relación a los demás.
OH H
C
C
C
CH
CH
CH2
CH2OH
Figura 7. Cis-pentadeca-6-eno-1,3-diin-5,15-diol.
Aun cuando la hipótesis de las fitoalexinas se encuentra en su séptima década, mucha de la información al respecto es desconocida o debatible [50] lo que ha cambiado la forma de estudiar el fenómeno y ha reenfocado la atención en la explotación potencial de los mecanismos de resistencia endógena para la protección de un cultivo. El objetivo biotecnológico se centra en el uso de extractos elicitados, los cuales poseen una carga considerable de metabolitos con actividad antibiótica, en el control biológico de cultivos. Otra de las alternativas consiste en diseñar una resistencia multimecanística contra plagas, lo que implica el uso de herramientas interdisciplinarias con las que se posibiliten aplicaciones de alto impacto. Sin embargo, este objetivo solo puede lograrse a través de un entendimiento completo de la respuesta fitoalexina.
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2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GENERAL Caracterizar la producción de metabolitos secundarios de estrés, obtenidos a partir de Solanum
tuberosum
bajo elicitación abiótica, y evaluar su actividad contra
microorganismos fitopatógenos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Obtener metabolitos secundarios de estrés a partir de Solanum tuberosum (papa) mediante inducción abiótica con CuCl2. Realizar una evaluación preliminar del perfil fitoquímico de los extractos elicitados y no elicitados, con respecto a su actividad contra microorganismos fitopatógenos. Obtener fracciones a partir del extracto elicitado y evaluar el efecto en la actividad hacia microorganismos patógenos. Desarrollar un método de bioautografía y correlacionarlo con metabolitos posiblemente asociados en la respuesta de estrés.
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3. MATERIALES Y METODOLOGÍA. 3.1 Tratamiento y extracción del material Elicitado y No elicitado. 3.1.1 Materiales Se utilizó papa (Solanum tuberosum) variedad capira, proveniente de la Plaza Minorista de Medellín. El cloruro de cobre pentahidratado (CuCl 2.5H2O) usado fue grado analítico proveniente de Sigma ®. El metanol y el diclorometano usados fueron grado comercial proveniente de Protoquímica, los cuales se sometieron a redestilación. Para la molienda se utilizó un molino eléctrico de discos y la extracción se realizó en un shaker.
3.1.2 Metodología. 3.1.2.1 Tratamiento del material Elicitado y No elicitado. Se tomaron 15 kg de papa ( Solanum tuberosum) variedad capira, los cuales se cortaron en rodajas entre 0.6 y 1 cm de espesor. Estos se dispusieron en canastas plásticas en porciones de dos kilogramos aproximadamente y se asperjaron con una solución de cloruro de cobre a una concentración de 10 mM cada 24 horas durante 48 horas. Las rodajas fueron secadas en estufa a 45ºC por 48 horas, para más tarde ser sometidas a molienda en un molino de discos. En el tratamiento del material No elicitado, se tomaron 15 kg de papa de la misma variedad y se les realizó el procedimiento anteriormente descrito, omitiendo esta vez la aspersión con solución de cloruro de cobre 10 mM.
3.1.2.2 Extracción de metabolitos secundarios. A una cantidad aproximada de 0.5 kg del material seco y molido se le agregó un litro de metanol y se dejó en agitación con shaker por 24 horas, al cabo de las cuales se
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filtró en algodón. El filtrado se recogió y el residuo se sometió nuevamente al mismo proceso por dos ocasiones más. La solución metanólica obtenida se filtró nuevamente con papel de filtro y se sometió a evaporación con vacío hasta eliminar por completo el solvente. A la suspensión acuosa resultante se le realizó una partición líquidolíquido con tres porciones de 30 mL de diclorometano por cada 100 mL de la misma. Se recogió la fase orgánica y se sometió a evaporación hasta sequedad.
3.2 Evaluación
in vitro
de la actividad fungicida y fraccionamiento
bioguiado de los extractos. 3.2.1 Materiales. Los ensayos de actividad fungicida in vitro se llevaron a cabo con una cepa de Fusarium oxysporum
proporcionada por la línea de microbiología del laboratorio
GIEM. Los cultivos se realizaron en cajas de Petri de 5.3 cm de diámetro, se usó agar malta marca OXOID®, aceite de Neem proporcionado por Biotropical, Tween 20 y un saca bocados. La emulsificación se realizó con la ayuda de un sistema de dos jeringas conectadas una llave de triple paso y la homogeneización se realizó con vortex. Se usó autoclave para la esterilización de los instrumentos y los volúmenes fueron medidos con pipetas volumétricas y micropipetas. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en una cámara de flujo laminar vertical Engelab. Para las cromatografías se utilizó sílica gel 60 Merck® (0.063-0.200 mm), Sephadex ® G-10 medium, sílica H 60F marca Merck® y sílica fase reversa C-18. El acetato de etilo y el hexano marca Merck ® grado análisis, metanol destilado y una solución reveladora de vainillina marca Sigma®. Se empleó una columna de 5.5 cm de diámetro por 70.0 cm de largo, rotavapor Büchi, liofilizador, cromatofolios AL TLC de sílica gel 60 F 254 Merck®, lámpara UV 254/366 y pistola de calentamiento.
3.2.2 Metodología.
30
3.2.2.1 Evaluación
in vitro
de la actividad fungicida de los
extractos. El agar fue preparado según las especificaciones del fabricante agregando 50 g de agar malta en un litro de agua destilada y calentando luego hasta su completa disolución. Posteriormente se sometió a esterilización en autoclave por 15 minutos a 121ºC. Se prepararon emulsiones de los extractos crudos, tanto elicitado como no elicitado, mezclando 720 mg de extracto, 2 mL de aceite de Neem, 0.2 mL (4 gotas) de Tween 20. La mezcla se llevó a un volumen total de 10,0 mL y se emulsificó haciendo pasar la mezcla entre dos jeringas conectadas por una llave de tres pasos, para finalmente obtener una emulsión madre con una concentración de extracto de 72000 ppm. Todos los procedimientos se llevaron a cabo al interior de una cámara de flujo laminar y todos los materiales usados fueron esterilizados en autoclave o bajo radiación UV. Para cada emulsión se realizaron diluciones a 9000, 6000 y 3000 ppm, tomando 1000, 666 y 333 333 µL, respectivamente, de las emulsiones madre, 7.0 mL de agar malta y se completó cada una de ellas, a un volumen total de 8,0 mL con agua estéril. Posteriormente la mezcla se homogenizó con vortex, para luego ser vertida en una caja de Petri estéril de 5.3 cm de diámetro. diámetr o. Con la ayuda de un saca bocados se cortó un trozo de agar de una cepa de Fusarium oxysporum,
el cual se ubicó en el centro de la caja una vez solidificado el medio de
cultivo. Las cajas se sellaron con vinilpel y se incubaron a temperatura ambiente. Se realizaron tres repeticiones de cada una de las concentraciones y se midió el radio del halo de crecimiento del hongo cada 24 horas. La emulsión empleada en el control se preparó como se describió anteriormente, esta vez sin agregar extracto alguno. Para el control de la emulsión se tomó 1000 µL de esta emulsión, se mezcló con 7,0 mL de agar malta y se homogenizó en vortex. Para el control absoluto, a 7,0 mL de agar se le agregó 1000 µL de agua estéril para completar el mismo volumen total. Ambos controles se realizaron por triplicado y de igual manera se midió el radio del halo de crecimiento creci miento cada 24 horas. Inicialmente se evaluó únicamente la actividad de los extractos crudos Elicitado y No elicitado.
31
3.2.2.2 Fraccionamiento Fraccionamiento del extracto crudo elicitado. Se tomaron 11.30 g de extracto crudo elicitado y se preparó una cabeza de columna mezclando 70 g de sílica gel y 150 mL de diclorometano con el extracto. El solvente se evaporó con la ayuda de una pistola de calentamiento. Se pesaron 400 g de sílica gel y se empacaron en una columna de dimensiones 5.5 cm de diámetro por 50.0 cm de largo. La fase móvil empleada fue un sistema isocrático hexano:acetato de etilo en proporción 1:1, la cual se determinó como la más conveniente mediante inspecciones previas por cromatografía en capa delgada (TLC). Se recogieron 113 fracciones de aproximadamente 100 mL y se realizó un monitoreo mediante TLC. Se reunieron las fracciones con perfil cromatográfico similar, obteniéndose 3 grandes fracciones denominadas Fr1, Fr2 y Fr3.
3.2.2.3 Evaluación
in vitro
de la actividad fungicida de las
fracciones Fr1, Fr2 y Fr3. A los extractos obtenidos en el fraccionamiento del extracto crudo Elicitado se les evaluó su actividad fungicida usando la metodología descrita anteriormente. Con base a los resultados obtenidos se continuó con el fraccionamiento de los extractos extract os Fr2 y Fr3.
3.2.2.4 Fraccionamiento Fraccionamiento del extracto Fr2. Se llevó a cabo una cromatografía de columna con sílica gel usando un gradiente de 4:1, 3:1, 2:1 y 1:1 del sistema hexano:acetato de etilo. Se recogieron 83 fracciones de 2 mL aproximadamente. Luego de observar su perfil por TLC se reunieron 8 fracciones totales, las cuales se denominaron como A, B, C hasta H, respectivamente. Con base a los reportes de la literatura se seleccionó la fracción B y se le realizó una cromatografía de columna usando sílica fase reversa con soporte C-18 como material de empaque y un gradiente de isopropanol:agua como fase móvil, el cual se varió desde una proporción 20:80 hasta 70:30, agregando 10 mL de fase móvil cada vez que se cambiaba de una proporción de solventes a otra. Se recogieron 20 fracciones de las cuales se tomaron las número 16 y 17, debido a que se observó como una sola banda en
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la placa cromatográfica cuando se corrían por TLC. Se eliminó el solvente orgánico mediante evaporación con vacío, el agua restante mediante liofilización y se corrió el respectivo espectro 1HRMN. Se unieron las fracciones F y G, y se les aplicó una cromatografía en fase reversa siguiendo un procedimiento similar al descrito recientemente. En este caso la composición de la fase móvil se varió desde una proporción inicial 10:90 isopropanol:agua, hasta 60:40. De igual manera se colectaron 20 fracciones, escogiéndose la 12 y 13 debido que se observaron como una sola banda que mostró fluorescencia al irradiarse con luz UV de onda larga. Esta muestra fue secada mediante evaporación con vacío y liofilización, y enviada para la toma de su respectivo espectro 1
HRMN.
3.2.2.5 Fraccionamiento Fraccionamiento del extracto Fr3. Se le realizó una cromatografía de exclusión por tamaño al extracto Fr3 usando una fase estacionaria de Sephadex® y un sistema triple de solventes compuesto por hexano:acetato de etilo:metanol como eluente, en proporciones 3:2:1. Se recogieron 16 fracciones de 5 mL cada una y a partir de monitoreo por TLC se determinó reunir las fracciones 1-5. Posteriormente se realizó una cromatografía de columna con sílica H, cuyas dimensiones fueron de 2 cm de diámetro por 11cm de largo, en un sistema de hexano:acetato de etilo (2:1). De las 15 fracciones obtenidas se decidió unir las número 10 y 11. Posteriormente, el solvente fue evaporado y la muestra fue dispuesta para la toma del espectro 1HRMN.
3.3 Caracterización Caracterización fitoquímica del extracto Elicitado. 3.3.1 Materiales. Todos los reactivos y materiales empleados para la marcha fitoquímica provinieron del laboratorio de fitoquímica de la Universidad de Antioquia.
3.3.2 Metodología.
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La metodología seguida en la marcha fitoquímica fue tomada del manual de laboratorio de fitoquímica de la Universidad de Antioquia. El esquema general se muestra en la figura 1 del anexo No1. Las pruebas para los diferentes grupos de metabolitos se realizaron como sigue:
3.3.2.1 Prueba de Flavonoides. A un mililitro de extracto, dispuesto en un tubo de ensayo, se le agrega una limadura de magnesio y una o dos gotas de HCl al 37% por la pared del tubo. La aparición de coloraciones naranja, violeta, magenta indican que la prueba fue positiva.
3.3.2.2 Prueba de Leucocianidinas. A un mililitro de extracto en un tubo de ensayo se la agregan 0,5 mL de HCl al 37% y se calienta por 10 minutos a 100ºC. Luego de que alcanza la temperatura ambiente se le agregan 0,5 mL de alcohol amílico y se agita suavemente. La reacción es positiva cuando aparecen coloraciones magenta a carmesí.
3.3.2.3 Prueba de compuestos Fenólicos. En un tubo de ensayo que contiene un mililitro de extracto se agrega una gota de FeCl 3 al 1% y se agita suavemente. La prueba se considera positiva con la aparición de coloraciones violeta, verde, azul y negro.
3.3.2.4 Prueba de Taninos. En un tubo de ensayo se dispone un mililitro del extracto y se agrega un mililitro de solución gelatina:sal. Se centrifuga a 2500 rpm por cinco minutos, se toma el precipitado y se redisuelve en dos mililitros de urea 10 M. Se agregan dos o tres gotas de FeCl3 al 10% y se agita suavemente. La aparición de coloraciones azul, verde o violeta indican que la prueba fue positiva.
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3.3.2.5 Prueba de Cardiotónicos. En un tubo de ensayo se adiciona un mililitro de solución etanólica del extracto, 0.5 mL de Kedde A y 0.5 mL de Kedde B. La prueba es considerada positiva cuando aparecen coloraciones violeta o púrpura.
3.3.2.6 Prueba de Quinonas. A cinco mililitros de solución de extracto en etanol se le agrega un mililitro de agua oxigenada, un mililitro de H2SO4 concentrado y se calienta por 15 minutos en baño maría. Luego de que se alcanza la temperatura ambiente se le agregan cinco mililitros de tolueno y se retira la fase de orgánica. A esta fase se le agrega un mililitro de NaOH/NH4OH (5%:2%). La aparición de coloraciones magenta en la fase alcalina indica la presencia de quinonas.
3.3.2.7 Prueba de Terpenoides. A 0.5 mL de solución diclorometanólica de extracto dispuestos en un tubo de ensayo, se le agregan 0.5 mL de anhídrido acético y una gota de H 2SO4 concentrado por la pared del tubo. La prueba es positiva cuando aparecen coloraciones azul, verde o violeta.
3.3.2.8 Prueba de Alcaloides. Prueba de Mayer: a 0.5 mL de extracto en HCl al 5% se le agrega una gota de reactivo de Mayer.
Prueba de Dragendorff: a 0.5 mL de extracto en HCl al 5% se le agregan dos gotas de reactivo de Dragendorff. La aparición de un precipitado amarillo indica la presencia pr esencia de alcaloides en la muestra.
3.4 Método de bioautografía para la fracción Fr 2.
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3.4.1 Materiales. La suspensión de levaduras fue proporcionada por la línea de microbiología del laboratorio GIEM. El acetato de etilo y el hexano usados fueron grado análisis marca Merck®. Se utilizó medio para levaduras cuyos componentes fueron Merck ®, con excepción del extracto de levadura el cual era marca OXOID ® y la fuente de carbono fue azúcar comercial. Los reveladores vainillina y MTT (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-
2,5-difenil tetrazolio) , al igual que el tritón X-100, fueron Sigma ®. Se emplearon cromatofolios AL TLC de sílica gel 60 F 254 Merck®, micropipetas, lámpara UV 254/366, estufa de incubación y autoclave. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en una cámara de flujo laminar vertical Engelab.
3.4.2 Metodología 3.4.2.1 Cromatografía en capa delgada Se tomaron 115,1 mg de extracto Fr2 y se diluyeron con 220 µL de acetato de etilo y 220 µL de hexano para una concentración de 0,26 mg/µL. Se cortaron placas cromatográficas de 4 x 7.5 cm las cuales fueron activadas a 105ºC por 2 horas. Se sembraron 20 µL de solución de extracto (5 mg/placa) a 1 cm de altura de la placa, distribuidos a lo ancho de la misma, evitando alcanzar los bordes laterales. Se llevó a cabo el corrido en un sistema de solventes hexano:acetato de etilo 1:1 hasta que el frente del solvente estuvo a una distancia aproximada de 1 cm del borde superior. Luego se dejó secar el solvente y se observó la placa bajo la lámpara UV para garantizar un desarrollo apropiado del corrido. Además, se realizó un revelado con vainillina para posteriores comparaciones.
3.4.2.2 Inoculación y revelado de la placa Se preparó medio para levaduras usando una fuente de carbono (azúcar comercial) a una concentración de 100 g/L, KH 2PO4 2.0 g/L, (NH 4)2SO4 3.0 g/L, MgSO 4.7H2O 1.0 g/L, extracto de levadura 4.0 g/L, peptona 3.6 g/L y agua destilada. Luego se sometió a esterilización en autoclave por 15 minutos a 121ºC. El revelador se preparó mezclando 36
una solución de 0.8 g/L de MTT (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio) y tritón X-100 al 0.1% en agua. a gua. Se tomaron 20,0 mL de medio para levaduras y se le agregaron 5,0 mL de suspensión de levaduras a una concentración de 6.4x10 7células/mL. La mezcla se homogeneizó en vortex y se vertió en una caja de Petri estéril. Luego se tomó la placa desarrollada por TLC y se sumergió en el medio inoculado por 20 segundos. Seguidamente se dispuso en una caja de Petri de 9.1 cm de diámetro, se selló con vinilpel y se incubó a 37ºC por 4 horas. Transcurrido este tiempo, se sumergieron las placas en el revelador MTT por 10 segundos para nuevamente ser introducidas en la caja de Petri e incubarse a las mismas condiciones iniciales por 12 horas más. Se realizaron controles de solvente y absoluto. En el primero se realizó el corrido de las placas de TLC a las mismas condiciones pero sin sembrar extracto alguno, mientras que en el control absoluto el único proceso previo realizado a la placa fue la activación a 105ºC. Cada procedimiento se llevó a cabo por triplicado.
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4. RESULTADOS Y ANÁLISIS. 4.1 Tratamiento y extracción del material Elicitado y No elicitado. Con el fin de mantener las condiciones lo más homogéneas posible entre el material Elicitado y No elicitado, se optó por asperjar cada 24 horas por 48 horas antes de someter el material a secado en estufa. De esta manera se pudo evitar la podredumbre del material por acción bacteriana, que pudiera afectar la eficiencia de la extracción mediante la degradación de los metabolitos de estrés usando mecanismos de detoxificación. La porción No elicitada no corría el riesgo de sufrir podredumbre, ya que en este caso, luego de ser rebanado el material se sometía a secado de forma inmediata. Las masas de papa usadas en cada porción a ser extraída, tanto de la parte Elicitada como la No elicitada, y la respectiva masa del material seco y molido se muestran en la tabla 1 del anexo No1. Luego de realizárseles la partición líquido-líquido con diclorometano a los extractos, y someterlos de nuevo a evaporación con vació, se obtuvieron 18.215 g y 18.850 g de extracto crudo Elicitado y No elicitado, respectivamente, para un rendimiento del 0.71% en el Elicitado y 0.62% en el No elicitado, ambos con base a la masa del material seco.
4.2 Evaluación in vitro de la actividad fungicida y fraccionamiento fraccionamiento bioguiado de los extractos. 4.2.1 Evaluación in vitro de la actividad fungicida de los extractos. En la realización de los ensayos comparativos de actividad fungicida, la colonización completa del hongo en la caja de Petri se logró a las 144 horas para los controles, tanto de la emulsión como absoluto, observándose una pigmentación violácea en el micelio para ambos casos (ver figura 8) .
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Figura 8. Ensayo de actividad fungicida para el extracto No elicitado a las 120 horas, donde se muestran los controles absoluto y de emulsión, y las diferentes concentraciones evaluadas C1, C2 y C3 las cuales corresponden a 3000, 6000 y 9000 ppm respectivamente.
Se realizó una prueba ANOVA para comparar las medias del halo de crecimiento de los controles mediante el paquete estadístico estadístic o STAT GRAPHICS, encontrándose que no hay diferencias significativas en la rata de crecimiento del hongo (P = 0.373901). Esto sugiere que el aceite, el cuya concentración final máxima en el medio es de 2.5%, no tiene ningún efecto en el desarrollo normal del hongo. Sin embargo, a pesar de este hecho, y de contar con emulsiones estables en el tiempo, se siguió evaluando el control de la emulsión en los experimentos subsiguientes para controlar cualquier posible variable. Para el extracto No elicitado, aunque visualmente hay diferencias sutiles en la pigmentación del micelio, con respecto a el control, estas solo se observan en la concentración más alta de extracto. De la misma manera que en los controles, por medio de la prueba ANOVA no se encontraron diferencias significativas con respecto al control para ninguna de las concentraciones (P > 0.05) (ver figura 8). En todos los casos se observó una rata de crecimiento similar entre si y una coloración coloración violácea con apariencia algodonosa en el halo del hongo. Por otro lado, el extracto Elicitado sí presentó diferencias apreciables con respecto a los controles, mostrando además efectos sobre el hongo que se incrementaban a medida que se aumentaba la concentración del mismo. El efecto del extracto Elicitado en el desarrollo del hongo se manifestó en un decoloramiento del micelio y una disminución,
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aunque sutil, en la rata de crecimiento. Estos datos se encuentran consignados en la tabla 3 del anexo No 1. Los datos del radio de crecimiento a las diferentes concentraciones de extracto Elicitado fueron sometidos a una prueba ANOVA mostrando diferencias significativas con respecto al control para todas las concentraciones (P=0.00067 entre Elicitado C1 y el control). Los datos adquiridos a partir de los controles se encuentran consignados en las tablas 4 y 5 del anexo No1. A partir de estos ensayos pudo demostrarse que hubo un efecto evidente del extracto Elicitado en el hongo, lo cual puede atribuirse a la presencia de metabolitos con actividad que estaban ausentes en el extracto No elicitado, indicando que, en efecto, hubo una elicitación en el tejido del tubérculo causada por el cloruro de cobre (ver figura 9).
Figura 9. Ensayo de actividad fungicida para el extracto Elicitado a las 144 horas, donde se muestran los c ontroles absoluto y de emulsión, y las diferentes concentraciones evaluadas C1, C2 y C3 las cuales corresponden a 3000, 6000 y 9000 ppm respectivamente.
Otro hecho importante es que, bajo las mismas condiciones de extracción, se obtuvo un rendimiento ligeramente mayor para el extracto Elicitado, lo cual puede indicar que el estrés generado en el tejido aumentó la producción del metabolismo secundario. Sin embargo, aun no puede atribuirse este aumento de metabolitos a la síntesis de compuestos activos por parte de las células de papa. Para ello es necesario un soporte estadístico en el cual se comparen las medias de varias extracciones a materiales
40
Elicitados y No elicitados para demostrar que, en efecto, la elicitación induce una mayor producción de metabolitos en el material. La evidencia de metabolitos con actividad presentes en el extracto Elicitado y ausentes, o presentes en muy baja concentración, en el extracto No elicitado, generó la necesidad de realizar un fraccionamiento del extracto Elicitado para evaluar la actividad de fracciones obtenidas y, de igual manera, observar el carácter de polaridad de los metabolitos más activos en una partición donde se obtuviesen tres fracciones, una de baja polaridad, otra de polaridad intermedia y otra de mayor ma yor polaridad. La masa de las 3 fracciones obtenidas y sus respectivos rendimientos se encuentran consignados en la tabla 6 del anexo No1. Los criterios para conformar estas fracciones fueron los resultados arrojados por TLC, al igual que la obtención de una cantidad suficiente del extracto para la realización de los respectivos ensayos de actividad fungicida y los subsecuentes particionamientos. Se realizaron los ensayos de actividad de los extractos Fr1, Fr2 y Fr3 obtenidos en el fraccionamiento del Elicitado. En la evaluación de la fracción Fr1 la apariencia del micelio del hongo, al igual que el radio del halo de crecimiento, fue similar a la del control, sugiriendo que no hubo ningún efecto de este extracto en el desarrollo normal del hongo. Este hecho se demostró posteriormente comparando, mediante un análisis ANOVA, la rata de crecimiento radial del hongo en el control y en el extracto Fr1 (ver anexo No1, tabla 7)
concluyéndose que no hubo diferencias significativas entre ellos (P =
0.4918). De igual manera se realizó la comparación del extracto Fr1 con el No elicitado obteniéndose en el mismo resultado. Esta se convierte en una evidencia de que el extracto No elicitado está compuesto, en su gran mayoría, de metabolitos poco polares los cuales no presentan efectos notorios sobre el hongo a las, relativamente, altas concentraciones evaluadas. Se confirma además el resultado obtenido en el ensayo comparativo de actividad entre el extracto Elicitado y No elicitado, en el cual puede concluirse que, efectivamente, hubo elicitación. Por otra parte, para los extractos Fr2 y Fr3 se observó un efecto inhibitorio del crecimiento del hongo, además de cambios evidentes en la apariencia del micelio (ver figura 10).
Estos cambios en la apariencia se manifestaron como un decoloramiento del 41
micelio, el cual era más pronunciado para el Fr2 que para el Fr3. Esto demuestra que, en su mayoría, los metabolitos implicados en la actividad se concentraron en las fracciones Fr2 y Fr3, lo cual da indicios de un carácter polar importante en estos compuestos, debido a que los sistemas de solventes usados para su elusión (Fr2 y Fr3) son de carácter polar.
Figura 10. Ensayo de actividad fungicida para los extractos Fr2 y Fr3 a las 144 horas, donde se muestran las diferentes concentraciones evaluadas para ambos extractos C1, C2 y C3 las cuales corresponden a 3000, 6000 y 9000 ppm respectivamente.
Aunque la inhibición fue mucho más marcada para la Fr2 que para la Fr3, el hecho más importante se observó para la concentración de 9000 ppm de la primera (Fr2), en la cual se inhibe por completo el crecimiento del hongo. Es decir, a diferencia del extracto Fr3 y las demás concentraciones evaluadas del Fr2 donde el efecto es fungistático, para la concentración más alta del Fr2 se observa un efecto fungicida. Teniendo en cuenta este hecho, se plantea la posibilidad de desarrollar una formulación de un agente fungicida preparado a partir de este extracto, ya que los agentes fungicidas comerciales son preparados en concentraciones entre el 1-2%. Para el caso del extracto Fr2 se tiene una inhibición total con una concentración cercana al 1%, sin embargo, sería necesario analizar factores como la estabilidad, biodegradabilidad, fitotoxicidad y costos, entre otros, para evaluar la viabilidad del proceso.
42
Los datos del halo de crecimiento del hongo con respecto al tiempo para los extractos Fr2 y Fr3 se encuentran en las tablas 8 y 9 del anexo No1. Los datos de los controles para este experimento se encuentran en las tablas 10 y 11 de esta misma sección. se cción. Se realizaron gráficos del radio del halo de crecimiento promedio del hongo con respecto al tiempo y se observó que, tanto para los controles como para los extractos en las tres concentraciones evaluadas, las curvas obtenidas se ajustaron de forma satisfactoria a un modelo lineal (P<0.05 y R>0.92) (VER ANEXO 3) usando el paquete estadístico STAT GRAPHICS. De esta manera se pudo probar que cada una de las pendientes tenía una relación de proporcionalidad directa con la rata de crecimiento del hongo en un medio determinado. Estos valores se pueden encontrar en la tabla 12 del anexo No1. 0,018
Fracción 2 0,016
2
R = 0,3659 2
) h 0,014 / m c 0,012 ( o t n e 0,01 i m i c 0,008 e r c e d 0,006 a t a R0,004
R = 0,6877 Fracción 3
2
R = 0,7295 2
R = 0,9942 No elicitada
Elicitada
0,002 2
R = 0,9208 Fracción 1
0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Concetración (ppm)
Figura 11. Gráfico de la rata de crecimiento, representada por la pendiente, para cada uno de los extractos a las diferentes concentraciones evaluadas.
Se quiso comparar la inhibición entre los diferentes extractos evaluados para lo cual se graficaron los valores de las pendientes de las curvas de crecimiento con respecto a la concentración del extracto (figura 11). En este gráfico se puede observar que luego del fraccionamiento del extracto Elicitado la actividad de la fracción Fr2 se incrementa, ya que presenta la menor rata de crecimiento para todas las concentraciones. Sin embargo, un detalle importante es el incremento en la actividad de los extractos Elicitado y Fr3 43
con el aumento de la concentración. Es decir, a pesar de que el extracto Elicitado presenta un efecto inhibitorio mayor que el Fr3 para las concentraciones de 3000 y 6000 ppm, mientras que para la concentración de 9000 ppm la tendencia se invierte, demostrando que el incremento en la concentración para el extracto Fr3 genera un aumento más dramático en la actividad. Suponiendo que la tendencia se conserva a medida que se aumenta la concentración, a partir de las ecuaciones de las rectas, mediante extrapolación, podría calcularse de forma aproximada el valor de la concentración de estos extractos para que el efecto observado sea fungicida y no fungistático. De esta manera se encuentra que son necesarias concentraciones de 48300 y 21100 ppm para el extracto Elicitado y el Fr3, respectivamente. No obstante, el efecto más dramático en el aumento de la concentración lo muestra el extracto Fr2, para el cual se observó experimentalmente que se necesitaba, como máximo, una concentración de 9000 ppm para observar un efecto fungicida en Fusarium oxysporum. En términos comparativos, la inhibición generada por el extracto Fr2 es un poco más del doble que la del Fr3, y esta a su vez, es tres veces mayor que la del extracto crudo Elicitado (ver figura 11) . Ahora, analizando los extractos No elicitado y Fr1, se observa una gran similitud en la forma de sus curvas (figura 11) lo cual se había demostrado estadísticamente mediante el análisis ANOVA. Sin embargo, otro hecho para resaltar es que, debido a que se presentan pendientes positivas al aumentar la concentración de extracto, se puede afirmar que hay un efecto benéfico en el crecimiento del hongo, expresado en un aumento en la rata de crecimiento al incrementar la concentración de extracto. A pesar de ello, el efecto positivo mostrado es bastante bajo debido a que, como se había mencionado, no hay una diferencia estadísticamente significativa con respecto al control. En la figura 12. se comparan gráficamente el efecto inhibitorio total de los diferentes extractos evaluados, a partir de las pendientes obtenidas en el gráfico de rata de crecimiento vs. concentración de extracto (figura 11).
44
4.2.2 Fraccionamiento Fraccionamiento del extracto Fr2. A partir de los resultados obtenidos en los ensayos, en los que el extracto Fr2 mostró una mayor actividad que las demás fracciones, se decidió continuar con su fraccionamiento. Se le aplicó cromatografía de columna usando sílica H, como se describió en la metodología, ya que se requería una mayor resolución que la proporcionada por la sílica gel. Se obtuvieron ocho fracciones de acuerdo a los perfiles de TLC (A, B, C hasta H respectivamente). Se continuó con el fraccionamiento de B al cual se le aplicó cromatografía en fase reversa, debido a que no era posible separar más esta fracción usando cromatografía en fase normal. Además, se contaba con poca cantidad de muestra para lo cual la cromatografía en fase normal ofrece la ventaja de que la gran mayoría de la muestra sembrada en la columna sea eluida. De las 20 fracciones recogidas se eligieron las fracciones 16 y 17, y se sometieron a evaporación con vacío y liofilización para secar por completo la muestra. Luego de revelar por varios métodos entre los que se incluían luz UV y revelador vainillina, se observo una sola banda por TLC, la cual se presumía como un compuesto puro. Se obtuvieron 5 mg de una sustancia con apariencia de cristales blancos. A esta muestra se le nombró MB y se envió para obtener su espectro 1
HRMN. Los resultados obtenidos no fueron satisfactorios lo cual se atribuyó a la poca
cantidad de muestra. El espectro se muestra muestr a en el anexo No2, figura3. Debido a la poca cantidad de muestra, se reunieron las fracciones E, F y G y se les aplicó un procedimiento similar al de la fracción B. Se eligieron las fracciones 12 y 13, las cuales revelaban como una sola banda que emitía una coloración azul fluorescente bajo la luz UV de onda larga. Se evaporó el solvente y se obtuvieron tan solo 3 mg de compuesto, motivo por el cual los resultados no fueron legibles en el espectro 1HRMN (ver anexo No2, figura 4)
y de la misma forma no se pudo obtener otro tipo de evidencias
espectroscópicas como
13
CRMN que permitieran la elucidación completa de la
estructura. Además, dado el caso de que se hubiese podido llevar a cabo la elucidación, y esto aplica para cualquier compuesto con actividad fungicida que se hubiese podido aislar a partir de un extracto elicitado, si esta estructura obtenida mediante
45
espectroscopía no estuviese reportada en la literatura como un compuesto que está de hecho implicado en la base de la defensa de una planta, la conclusión de si es o no una fitoalexina hubiese estado pobremente sustentada. -2,20E-06
-1,70E-06
e -1,20E-06 t n e i d n e P
-7,00E-07
-2,00E-07
3,00E-07 ta d o a c i t l i c N o e
ta d o a c i i t E l i
n 1 o n 2 a c c i o F r a a c c i F r a
n 3 a c c i o F r a
Extractos evaluados
Figura 12. Gráfico de la pendiente obtenida en la figura 5 para cada uno de los extractos evaluados.
4.2.3 Fraccionamiento Fraccionamiento del extracto Fr3. Se decidió someter esta fracción a una cromatografía de exclusión por tamaño usando Sephadex® debido la poca resolución lograda por cromatografía en fase normal, la cual se evidenció por TLC. Las cinco primeras fracciones eluidas se reunieron ya que aparecían como una sola banda con un Rf de aproximadamente 0.2 en TLC. El hecho de que eluyeran primero indicaba que se trataba de la molécula, o mezcla de moléculas, de mayor tamaño en la mezcla. Se le realizó una purificación usando una columna de sílica H con la cual se obtuvo un compuesto (MA) que se presumía puro gracias a su perfil de TLC. No obstante, la información arrojada por el espectro 1HRMN no fue lo suficientemente concluyente, hecho que se atribuye a la cantidad de muestra “pura”
46
obtenida (8 mg) la cual impide obtener un espectro 13CRMN confiable. El espectro se encuentra adjunto en el anexo No 2, figura 2.
4.3 Caracterización Caracterización fitoquímica del extracto Elicitado. Se realizó una partición del extracto crudo Elicitado usando agua caliente y filtrando de igual manera sobre papel de filtro para remover material insoluble. El filtrado acuoso resultante mostró los siguientes resultados: CONCENTRACIÓN APARENTE (+)
COLORACIÓN
Leucocianidinas
(++)
Magenta
Fenólicos
(+)
Negro
Taninos
(-)
NA
PRUEBA Flavonoides
Naranja
Donde: (-) negativo, (+) concentración baja, (++) media, (+++) alta, (NA) No aplica.
Se tomó nuevamente el extracto crudo Elicitado, se le agregó HCl al 5%, se calentó a 60ºC por 15 minutos y se filtró de la misma manera. El sólido recogido en el papel fue redisuelto en diclorometano y filtrado nuevamente sobre Na 2SO4. En esta fracción se encontró lo siguiente: CONCENTRACIÓN APARENTE (-)
COLORACIÓN
Cardiotónicos
(+)
Violeta
Quinonas
(-)
NA
(+++)
Violeta oscuro
PRUEBA Flavonoides
Terpenoides
NA
Donde: (-) negativo, (+) concentración baja, (++) media, (+++) alta, (NA) No aplica.
El filtrado acuoso ácido se alcalinizó (pH 10-11) y se particionó con diclorometano. En la fase orgánica filtrada sobre Na2SO4 se obtuvo:
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PRUEBA Terpenoides Cardiotónicos Alcaloides
CONCENTRACIÓN APARENTE (++)
COLORACIÓN
(+)
Magenta
(+++)
Amarillo
Verde
Donde: (-) negativo, (+) concentración baja, (++) media, (+++) alta, (NA) No aplica.
En la fase acuosa, luego de neutralizar con HCl al 5% se encontró lo siguiente: CONCENTRACIÓN APARENTE (-)
COLORACIÓN
Flavonoides
(-)
NA
Leucocianidinas
(-)
NA
Fenólicos
(++)
Negro
Taninos
(-)
NA
PRUEBA Alcaloides
NA
Donde: (-) negativo, (+) concentración baja, (++) media, (+++) alta, (NA) No aplica.
4.4 Método de bioautografía para la fracción Fr2. Se desarrolló un método de bioautografía para el extracto Fr2, el cual resultó ser el de mayor actividad entre todos los que fueron evaluados. Se contó con una buena reproducibilidad en los corridos de las placas cromatográficas, además se obtuvo una resolución que permite la correlación aproximada entre factores de retención (Rf) y bandas en diferentes placas corridas a las mismas condiciones, bandas que pueden representar compuestos puros o mezcla de compuestos. En la figura 13a se muestra una placa de TLC del extracto Fr2 revelada con vainillina. Se logró una saturación parcial de la sílica con el fin de garantizar que los metabolitos adsorbidos en esta, estuvieran disponibles para interactuar con el microorganismo y no se enmascarara la actividad. Igualmente en las figuras 13b y 13c se observan placas, corridas a las mismas condiciones, reveladas bajo la lámpara UV a longitudes de onda corta y larga respectivamente. De nuevo se destacan las bandas lo suficientemente resueltas para los fines requeridos sin sacrificar la saturación de la sílica.
48
a)
b)
c)
Figura 13. Placas de TLC para el extracto Fr2 donde a) corresponde a la placa revelada con vainillina, b) bajo luz UV de onda corta y c) luz UV de onda larga.
En la figura 14 se muestra la placa de la bioautografía luego del revelado con MTT, además de los controles absoluto y de solvente, donde puede apreciarse que no hay una diferencia notable entre estos. Es decir, en ambos se tiene una coloración violeta pálida en la sílica acompañada de puntos con una tonalidad un poco más oscura y que proliferan más en el control absoluto. Esto indica que no hubo ningún efecto evidente del solvente en el desarrollo de las levaduras ni en el revelado de las placas. Por otra parte, en la placa de la bioautografía (figura 14, ensayo Fr2) pueden observarse varios detalles importantes: 1) una banda oscura en el lugar de siembra lo cual podría indicar que había uno, o varios compuestos de la muestra de carácter altamente polar, los cuales se adsorbieron fuertemente a la sílica. Sin embargo, la intensa coloración que presenta esta zona podría indicar que se trataba de compuestos no solo no tóxicos a las levaduras, sino que al parecer le ofrecían una afinidad al microorganismo para alojarse y desarrollarse en este sitio específico de la placa. 2) Próxima a la banda en el lugar de siembra se haya una zona con una coloración similar a la del control, en la cual parece no haber ningún tipo de inhibición. Mediante comparaciones con la placa revelada con
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vainillina y la revelada con luz UV de onda corta, podría atribuirse esta inhibición a una baja concentración de compuestos en esta área de la placa.
Figura 14. Resultados de la bioautografía luego del revelado con DTT, donde se muestra la bioautografía para el extracto Fr2 y los controles de solvente y absoluto.
3) A un Rf de 0.21 se encuentra una primera zona de inhibición cuya coloración, en comparación con el control, parece indicar una delgada y marcada banda inhibición. La placa revelada con vainillina, a este mismo Rf muestra una banda delgada de color violeta que no se observa en las placas reveladas bajo luz UV. 4) A partir de un Rf de 0.24 hasta aproximadamente 0.48 se encuentra una zona de poca claridad en donde aparenta darse una inhibición, sin embargo se observan unas manchas de color intenso en la base de esta área que podrían indicar proliferación del microorganismo. Realizando comparaciones de esta misma zona en la placa revelada con vainillina se aprecia una concentración importante de compuestos que no aparecen bajo la luz UV, lo que podría indicar que sí hay inhibición y que además puede deberse a compuestos terpénicos debido a la coloración violácea que adquieren al ser reveladas con vainillina. 5) A partir de un Rf de 0.66 se observa nuevamente una clara zona de inhibición que llega hasta un Rf de 0.8, de nuevo esto se establece comparando cualitativamente la tonalidad de la coloración de esta zona con la del control. Esta gruesa banda es seguida 50
por una serie de bandas coloreadas de tonalidades verdes a amarillas en donde podría haber inhibición. El sustento de esta hipótesis es que, debido a la poca proliferación de levaduras y la reactividad de los compuestos implicados, posiblemente se dio una reacción entre el revelador (MTT) y los compuestos allí presentes, evidenciándose con la aparición de estas bandas coloreadas que van hasta donde se alcanza el frente del solvente.
51
5. CONCLUSIONES La aspersión de tubérculos de papa con solución de CuCl 2 a una concentración de 10 mM genera una respuesta en los tejidos de papa, que se manifiesta en un aumento de la biosíntesis de metabolitos de estrés los cuales cuentan con actividad fungicida. El extracto elicitado muestra un efecto fungistático contra el hongo Fusarium oxysporum que no se observa en un extracto
sin elicitación.
Los resultados de los ensayos de actividad aplicados a las fracciones obtenidas a partir del extracto elicitado, indican que los extractos de mediana y alta polaridad proporcionan una mayor inhibición, lo que a su vez da idea de un carácter polar importante en los metabolitos implicados en la actividad, ya fuera fungicida o fungistática. A una concentración del 1% es posible observar un efecto fungicida para una fracción de polaridad intermedia, obtenida a partir de un extracto elicitado de papa. Sin embargo, antes de buscar aplicaciones en fitorremediación, es necesario analizar factores como la fitotoxicidad, estabilidad, entre otros. Mediante la caracterización fitoquímica se evidencia una gran diversidad de metabolitos presentes en el extracto elicitado, entre los cuales se resalta una importante presencia de alcaloides y terpenoides. La alta concentración de estos metabolitos puede deberse a la biosíntesis de fitoalexinas de tipo terpénico, grupo al que pertenecen los compuestos de estrés reportados en Solanum tuberosum, y fitoalexinas tipo alcaloides, reportadas en la cáscara de estos tubérculos.
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El método bioautográfico posibilita la correlación directa de bandas de inhibición con la actividad mostrada en las fracciones evaluadas. Además, de este modo se facilita la separación y aislamiento de compuestos activos en el extracto, a partir del factor de retención de las bandas de inhibición observadas en la bioautografía. Estos compuestos pueden ser de interés para su elucidación estructural y, eventualmente, su correlación como compuestos que cumplen las características necesarias para ser llamados fitoalexinas.
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ANEXO No1. Tablas. Tabla 1. Cantidad en masa del material Elicitado y No elicitado empleado en cada porción a ser extraída.
Material No elicitado Masa Masa Porción material material húmedo (g) seco (g) 1 2 3 4 5 6 7
2002 2021 2024 2029 2027 2003 2044
391 420 435 454 431 444 456
Material Elicitado Masa Masa material material húmedo (g) seco (g) 2007 2004 2051 2055 2049 2015
415 454 417 443 408 436
Tabla 2. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de extracto No elicitado. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio. RADIO (cm) Tiempo (h) 0 48 120 144
C11
C12
C13
0,2 0,6 1,8 2,3
0,2 0,6 1,9 2,3
0,2 0,6 1,9 2,2
Prom C1 0,20 0,60 1,87 2,27
C21
C22
C23
0,2 0,4 1,9 2,2
0,2 0,4 1,9 2,2
0,2 0,3 1,8 2,2
Prom C2 0,20 0,37 1,87 2,20
C31
C32
C33
0,2 0,3 1,8 2,2
0,2 0,2 1,8 2,2
0,2 0,2 1,7 2,2
Prom C3 0,20 0,23 1,77 2,20
Tabla 3. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de extracto Elicitado. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio. RADIO (cm) Tiempo C11 (h) 0 0,2 48 0,6 72 1,0 144 ------
C12
C13
0,2 0,7 1,1 1,9
0,2 0,6 1,0 1,8
Prom C1 0,20 0,63 1,03 1,85
C21
C22
C23
0,2 0,5 0,9 1,6
0,2 0,5 0,9 1,6
0,2 0,5 0,9 1,6
54
Prom C2 0,20 0,50 0,90 1,60
C31
C32
C33
0,2 0,5 0,9 1,5
0,2 0,4 0,9 1,7
0,2 0,4 0,8 1,6
Prom C3 0,20 0,43 0,87 1,60
Tabla 4. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control absoluto del primer ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio. RADIO (cm) Tiempo CtrlA1 CtrlA2 CtrlA3 (h) 0 0,2 0,2 0,2 48 1 0,8 0,8 72 1,4 1,3 1,4 144 2,4 2,4 2,4
Prom CtrlA 0,2 0,867 1,367 2,4
Tabla 5. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control d e la emulsión del primer ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio. RADIO (cm) Tiempo CtrlE1 CtrlE2 CtrlE3 (h) 0 0,2 0,2 0,2 48 0,6 0,6 0,7 72 1,2 1,1 1,1 144 2,3 2,3 2,2
Prom CtrlE 0,20 0,63 1,13 2,27
Tabla 6. Masas y rendimientos de las fracciones obtenidas del extracto Elicitado. El rendimiento se calculó con base a la cantidad de extracto crudo Elicitado empleado (11.30 g) Fracciones Fr 1 Fr 2 Fr 3
Masa (g) 5,726 2,825 1,652
Rendimiento (%) 50,67 25,00 14,62
Tabla 7. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de extracto Fr1. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio. RADIO (cm) Tiempo (h) 0 48 120 144
C11
C12
C13
0,2 0,6 1,8 2,3
0,2 0,5 1,8 2,1
0,2 0,6 1,9 2,3
Prom C1 0,20 0,57 1,83 2,23
C21
C22
C23
0,2 0,4 1,9 2,3
0,2 0,4 1,8 2,3
0,2 0,3 1,8 2,2
55
Prom C2 0,20 0,37 1,83 2,27
C31
C32
C33
0,2 0,3 1,8 2,2
0,2 0,2 1,8 2,2
0,2 0,2 1,7 2,2
Prom C3 0,20 0,23 1,77 2,20
Tabla 8. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de extracto Fr2. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio. RADIO (cm) Tiempo (h) 0 48 72 96 120 144
C11
C12
C13
0,2 0,4 0,7 1,2 1,7 1,8
0,2 0,4 0,8 1,0 1,6 1,8
0,2 0,5 0,9 1,2 1,7 1,9
Prom C1 0,20 0,43 0,80 1,13 1,67 1,83
C21
C22
C23
0,2 0,2 0,4 0,8 1,1 1,4
0,2 0,2 0,4 0,8 1,1 1,5
0,2 0,2 0,4 0,8 1,1 1,5
Prom C2 0,20 0,20 0,40 0,80 1,10 1,47
C31
C32
C33
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Prom C3 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Tabla 9. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de extracto Fr3. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio. RADIO (cm) Tiempo C11 (h) 0 0,2 48 0,6 72 1,0 96 -----120 -----144 ------
C12
C13
0,2 0,7 1,1 1,7 2,1 2,4
0,2 0,6 1,0 1,5 2,0 2,4
Prom C1 0,20 0,63 1,03 1,60 2,05 2,40
C21
C22
C23
0,2 0,5 0,8 1,3 1,7 2,1
0,2 0,4 0,7 1,2 1,7 2,1
0,2 0,4 0,8 1,2 1,7 2,0
Prom C2 0,20 0,43 0,77 1,23 1,70 2,07
C31
C32
C33
0,2 0,3 0,5 0,9 1,2 1,7
0,2 0,3 0,5 0,9 1,4 1,6
0,2 0,3 0,5 0,9 1,3 1,6
Prom C3 0,20 0,30 0,50 0,90 1,30 1,63
Tabla 10. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control absoluto en el segundo ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio. RADIO (cm) Tiempo CtrlA1 CtrlA2 CtrlA3 (h) 0 0,2 0,2 0,2 48 1,2 1,2 1,0 120 2,0 2,0 2,1 144 2,3 2,2 2,4
Prom CtrlA 0,20 1,13 2,03 2,30
Tabla 11. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control de la emulsión en el segundo ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio. RADIO (cm) Tiempo Prom CtrlE1 CtrlE2 CtrlE3 (h) CtrlE 0 0,2 0,2 0,2 0,20 48 0,6 0,6 0,4 0,53 120 2,0 1,9 2,0 1,97 144 2,4 2,3 2,4 2,37
56
Tabla 12. Datos de la pendiente obtenidos a partir del análisis estadístico para cada uno de los extractos a las diferentes concentraciones evaluadas.
Concentración (ppm)
No elicitado
Elicitado Fracción 1 Fracción 2 Fracción 3
3000 6000 9000
0,0148352 0,0150336 0,0150183
0,0138622 0,0118590 0,0119124
57
0,0146368 0,0152625 0,0150183
0,01234130 0,00930556 0
0,0161210 0,0136905 0,0105159
ANEXO No2 Figura 1. Esquema general de la marcha fitoquímica.
58
Figura 2. Espectro 1HRMN para la muestra MA.
Figura 3. Espectro 1HRMN para la muestra MB.
59
Figura 4. Espectro 1HRMN para la muestra MC.
60
ANEXO No3. Curvas de crecimiento del hongo Fusarium oxysporum en los diferentes medios. Plot of Fitted Model Rata de crecimiento del hongo para el control absoluto 1 CA_1 = 0.171429 + 0.0132937*CONTROL ABS.Tiempo 2.4 2
) m c 11.6 ( _ o A i d C 1.2 a m R o
Pvalor = 0.045 R = 0.947
r P
0.8 0.4 0 0
30
60
90
12 0
15 0
CONTROL ABS.Tiempo _h_1
Plot of Fitted Model
Rata de crecimiento del hongo para el control absoluto 2
CA_2 = 0.320513 + 0.0182692*CON 0.0182692*CONTROL TROL ABS.Tiempo 2.4 2 ) 21.6 m _ c A ( o C1.2 i d m o a r R P
Pvalor = 0.0416 R = 0.958
0.8 0.4 0 0
20
40
60
80
10 0 12 0
CONTROL ABS.Tiempo _h_2
61
Plotdel ofhongo Fitted Model Rata de crecimiento para el control emulsión emuls ión 1 CE_1 = 0.0333333 + 0.015812*CONTROL EMUL.Tiempo 2.4 2 ) 11.6 m _ c E ( C 1.2 o i d m o a r R P
Pvalor = 0.0148 R = 0.985
0.8 0.4 0 0
30
60
90
1 20
150
CONTROL EMUL.Tiempo EMUL.Tiempo _h_1
Plotdel ofhongo Fitted Model Rata de crecimiento para el control emulsión emuls ión 2 CE_2 = 0.0782051 + 0.0152244*CONTROL EMUL.Tiempo 2 1.6 ) m 2 _ c ( E1.2 o C i d m a o R r 0.8
Pvalor = 0.0159 R = 0.984
P
0.4 0 0
20
40
60
80
1 00 12 0
CONTROL EMUL.Tiempo EMUL.Tiempo _h_2
62
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto No Plot of Fitted Model elicitado citado.PROM citado.PROM C1 = 0.0761905 0.076 1905 + 0.01483 52*Ext No No Elicitad 2.4 1 2 C M O 1.6 ) R P . m o c d ( 1.2 a t o i i c d i a l E R o0.8 N t x E0.4
Pvalor = 0.0092 R = 0.991
0 0
30
60
90
1 20
150
Ext No Elicitado.Tiempo_h_
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto No Plot of F itted itted Model elicitado citado.PROM citado.PROM C2 = -0.0142857 + 0.0150 336*Ext No No E licitad licitad 2.4 2 2 C ) M O m R1.6 c ( P . o o d i 1.2 a d i t a c l R i E 0.8 o N t x E0.4
Pvalor = 0.0276 R = 0.972
0 0
30
60
90
1 20
150
Ext No Elicitado.Tiempo_h_
63
Rata de crecimiento del hongo para la concentración concentraci ón de 9000 ppm de extracto No Plot of Fitted Model elicitado citado.PROM C3 = -0.0714286 + 0.0150183*Ext No Elicitad 2.4 3 2 C M O ) R1.6 . m P o c ( d1.2 a t o i i c d i l a E R o0.8 N t x E0.4
Pvalor = 0.0413 R = 0.958
0 0
30
60
90
1 20
1 50
Ext No Elicitado.Tiemp Elicitado.Tiemp o_h_
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto Plot of Fitted Model Elicitado icitado.PROM icitado.PROM C1 = 0.0974359 0.09743 59 + 0.013 8622*Ex 8622 *Extt Elicitado.Ti Elicitado.Ti 2 11.6 C M ) O R 1.2 m P c . ( o o d i a t d i a i c0.8 R l E t x E0.4
Pvalor = 0.0133 R = 0.986
0 0
20
40
60
80
10 0 1 20
Ext Elicitado.Tiempo_h_
64
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto Plot of Fitted Model Elicitado licitado.PROM licitado.PROM C2 = 0.088 4615 + 0.011859*Ext 0.0118 59*Ext Elicita Elicitado.Ti do.Ti 1.6
2 C 1.2 M ) O m c R P ( . o o i d0.8 d a t a i c R i l E t x0.4 E
Pvalor = 0.0216 R = 0.978
0 0
20
40
60
80
10 0
Ext Elicitado.Tiempo
_h_
1 20
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 9000 ppm de extracto Plot of Fitted Model Elicitado icitado.PROM icitado.PROM C3 = 0.060 2564 + 0.0119 124*Ext Elicita Elicitado.Ti do.Ti 1.6
3 C 1.2 M ) O m R c P . ( o0.8 o d i a d i t a i c l R E t x0.4 E
Pvalor = 0.0330 R = 0.967
0 0
20
40
60
80
1 00
Ext Elicitado.Tiempo_h_
65
12 0
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto Fr 1 Plot of Fitted Model
N 1 Prom C1 = 0.0666667 0.066666 7 + 0.0146368*FRACCION 0.014636 8*FRACCION 1 Tie 2.4 1 2 C m ) o 1.6 r m P c ( 1 o i N1.2 d I a O R C0.8 C A R F
Pvalor = 0.0109 R = 0.989
0.4 0 0
30
60
90
1 20
1 50
FRACCION FRACCI ON 1 Tiempo _h_ _ h_
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto Fr 1 Plot of Fitted Model N 1 PROM C2 = -0.0238095 + 0.0152625*FRACCION 1 Ti 2.4 2 2 C M 1.6 ) O m R c P ( o 11.2 i d N a O R I C 0.8 C A R F0.4
Pvalor = 0.0277 R = 0.972
0 0
30
60
90
1 20
FRACCION 1 Tiempo _h_
66
1 50
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 9000 ppm de extracto Fr 1 Plot of Fitted Fitted Model
CCION 1 PROM C3 = -0.0714286 + 0.0150183*FRACCION 1 Tiempo 2.4 3 C
2
M O1.6 ) R m P c ( 1 1.2 o i N d a O I R C0.8 C A R0.4 F
Pvalor = 0.0413 R = 0.958
0 0
30 60 90 120 FRACCION 1 Tiempo _h_
150
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto Fr 2 Plot of Fitted Model
ION 2.PROM C1 = 0.023809 5 + 0.0123413*FRACCION 0.012341 3*FRACCION 2. 2 11.6 C M O ) R 1.2 m P . c ( 2 o N i d I O 0.8 a C R C A R F0.4
Pvalor = 0.0010 R = 0.974
0 0
30
60
90
12 0
FRACCION 2.Tiempo_h_
67
15 0
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto Fr 2 Plot of Fitt F itted ed Model
CION 2.PROM C2 = -0.05 + 0.00930556*FRACCI 0.009305 56*FRACCION ON 2.Ti 2.Ti 1.5 21.2 C M ) O R m P0.9 . c ( 2 o N i d I 0.6 a O R C C A R F0.3
Pvalor = 0.0073 R = 0.929
0 0
30
60
90
1 20
1 50
FRACCION 2.Tiempo_h_
Rata de crecimiento del hongo para la concentración concentraci ón de 3000 ppm de extracto Fr 3 Plot of Fitted Model ION 3.PROM C1 = 0.0297619 + 0.016121*FRACCION 3. 2.4 ) 1 2 C m c ( M 1.6 o O i d R a P . R 3
Pvalor = 0.0003 R = 0.986
1.2
N O I C 0.8 C A R F0.4
0 0
30
60
90
12 0
FRACCION 3.Tiempo_h_
68
15 0
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto Fr 3 Plot of Fitted Model
ION 3.PROM C2 = -0.0285714 + 0.0136905 *FRACCION 3. 2.4 2 C
2
M
1.6 ) O R m c P . ( 3 o N1.2 i d O a I R C0.8
Pvalor = 0.0012 R = 0.971
C A R F
0.4 0 0
30
60
90
12 0
15 0
FRACCION 3.Tiempo_h_
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 9000 ppm de extracto Fr 3 Plot of Fitted Model
ION 3.PROM C3 = -0.0357143 + 0.0105 159*FRACCI ON 3. 1.8 31.5 C M 1.2 ) O m R c P . ( 3 o i N0.9 d O a I R C0.6 C A R F0.3
Pvalor = 0.0040 R = 0.947
0 0
30
60
90
1 20
FRACCION 3.Tiempo _h_
69
1 50
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