Capitulo 3 Microorganismos de Interes Industrial

Universidad de los Lago Departamento Ciencias y Tecnología Alimentos

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL CAPITULO 3: MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

Profesor: Héctor Mancilla Chávez

Osorno- 2007

C a p i t u l o 3 M I C RO R O O R GA G A N I S M O S D E I N T E RE RE S I N D U S T R I A L

CAPITULO 3 MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL 1. 2. 3. 4.

Microorganismos utilizados a nivel industrial. Actividades y características de interés. Principales tipos. Fisiología del crecimiento Metabolismo microbiano.

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Microorganismos utilizados a nivel industrial No todos los microorganismos tienen un uso industrial. Mientras que los microorganismos aislados de la naturaleza muestran el crecimiento celular como su principal propiedad fisiológica, los microorganismos industriales son organismos que se han seleccionado cuidadosamente para que produzcan uno o más productos específicos. Incluso cuando el microorganismo industrial es uno que se ha aislado por las técnicas tradicionales, se convierte en un organismo altamente "modificado" antes de entrar en las industrias a gran escala. En gran parte, los microorganismos industriales son especialistas metabólicos capaces de producir específicamente determinados metabolitos y con gran rendimiento. Con el fin de lograr esta elevada especialización, las cepas industriales están alteradas genéticamente, por mutación o por recombinación. Habitualmente se reprimen o se eliminan las vías metabólicas menores y frecuentemente existe en ellas un desequilibrio metabólico. Los microorganismos industriales pueden presentar muchas propiedades celulares y bioquímicas alteradas. Aunque las cepas industriales pueden crecer satisfactoriamente bajo las condiciones altamente especializadas de un fermentador, pueden mostrar un crecimiento pobre en ambientes naturales competitivos.

1.1

Origen de las cepas industriales La fuente última de todas las cepas de microorganismos industriales es el ambiente natural. Pero a través de los años, a medida que los procesos microbianos a gran escala se han ido perfeccionando, un cierto número de cepas industriales se han ido depositando en las

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CAPITULO 3 MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL 1. 2. 3. 4.

Microorganismos utilizados a nivel industrial. Actividades y características de interés. Principales tipos. Fisiología del crecimiento Metabolismo microbiano.

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Microorganismos utilizados a nivel industrial No todos los microorganismos tienen un uso industrial. Mientras que los microorganismos aislados de la naturaleza muestran el crecimiento celular como su principal propiedad fisiológica, los microorganismos industriales son organismos que se han seleccionado cuidadosamente para que produzcan uno o más productos específicos. Incluso cuando el microorganismo industrial es uno que se ha aislado por las técnicas tradicionales, se convierte en un organismo altamente "modificado" antes de entrar en las industrias a gran escala. En gran parte, los microorganismos industriales son especialistas metabólicos capaces de producir específicamente determinados metabolitos y con gran rendimiento. Con el fin de lograr esta elevada especialización, las cepas industriales están alteradas genéticamente, por mutación o por recombinación. Habitualmente se reprimen o se eliminan las vías metabólicas menores y frecuentemente existe en ellas un desequilibrio metabólico. Los microorganismos industriales pueden presentar muchas propiedades celulares y bioquímicas alteradas. Aunque las cepas industriales pueden crecer satisfactoriamente bajo las condiciones altamente especializadas de un fermentador, pueden mostrar un crecimiento pobre en ambientes naturales competitivos.

1.1

Origen de las cepas industriales La fuente última de todas las cepas de microorganismos industriales es el ambiente natural. Pero a través de los años, a medida que los procesos microbianos a gran escala se han ido perfeccionando, un cierto número de cepas industriales se han ido depositando en las

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colecciones de cultivos. Cuando se patenta un nuevo proceso industrial, al solicitante de la patente se le requiere para que deposite una cepa capaz de llevar a cabo el proceso, en una colección de cultivos reconocida. Hay varias colecciones de cultivos que actúan de depositarias y suministradoras de cultivos microbianos. Aunque estas colecciones pueden ser una fuente rápida y fácil de cultivos, es comprensible que la mayoría de las compañías industriales se sientan poco dispuestas a depositar sus mejores cultivos en las colecciones de cultivos. Además de cultivos de microorganismos, muchas colecciones de cultivos tienen también colecciones de varios plásmidos, de genes clonados y de vectores para su uso en ingeniería genética, de líneas celulares animales para el cultivo de virus animales, y de hibridomas para producir anticuerpos monoclonales.

ORIGEN DE LOS MICROORGANISMOS INDUSTRIALES 1. Alimentos fermentados a) Selección involuntaria según las características del proceso b) Selección in vitro de aquellas cepas que presentaran unas características más interesantes 2. Producción de aditivos y enzimas de uso alimentario a) Selección a partir de cualquier fuente natural b) Colecciones de cultivo públicas y privadas

1.2

Mejora de cepas Corno hemos indicado, la fuente inicial de un microorganismo industrial es el ambiente natural, pero el aislamiento original se modifica en gran medida en el laboratorio. Como resultado de esta modificación, es posible anticipar una mejora progresiva en el rendimiento de un producto. El ejemplo más espectacular de tal mejora progresiva es el de la penicilina, el antibiótico producido por el hongo Penicillium chrysogenum. Cuando se produjo por primera vez la penicilina a gran escala, se obtuvieron rendimientos de 1- 10 µg/ml. A lo largo de los años, como resultado de la mejora de las cepas acoplada a cambios en el medio y en las condiciones de cultivo, el rendimiento de penicilina aumentó hasta 50.000 µg/ml. Es interesante decir que todo este incremento de 50.000 veces el rendimiento, se obtuvo por mutación y selección; no estuvo implicada ninguna manipulación genética. La introducción de nuevas

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técnicas genéticas ha conducido a posteriores, aunque mucho más modestos, incrementos del rendimiento. 2

Actividades y características de interés. Principales tipos.

2.1

Propiedades de un microorganismo industrial Un microorganismo adecuado para su utilización industrial debe producir la sustancia de interés, pero hay muchos otros aspectos a considerar. Es preciso disponer del organismo en cultivo axénico (puro), debe ser genéticamente estable, y debe crecer en cultivo a gran escala. Además, debe ser posible mantener cultivos del organismo durante un período de tiempo largo en el laboratorio y en la planta industrial. El cultivo debe producir preferentemente esporas o alguna otra forma celular reproductora, para que los organismos se puedan inocular fácilmente en los grandes fermentadores. Una característica importante es que el organismo. industrial crezca rápidamente y produzca el compuesto deseado en un período de tiempo relativamente corto. El organismo, además, debe ser capaz de crecer en un medio de cultivo líquido y relativamente barato, que se pueda obtener en grandes cantidades. Muchos procesos microbiológicos industriales utilizan fuentes carbonadas de desecho de otras industrias, como principal ingrediente o como suplemento para los medios de cultivo a escala industrial. Algunas de estas fuentes son, por ejemplo, el licor de maceración de maíz (un producto rico en nitrógeno y factores de crecimiento), el suero (un producto líquido de desecho de la industria lechera, que contiene lactosa y sales minerales) y otros materiales de desecho industriales, que tienen elevado contenido de carbono orgánico. (La utilización de estos materiales carbonados de desecho ayuda también a resolver los problemas de eliminación de residuos, creados por la elevada demanda biológica de oxígeno (BOD) de los residuos orgánicos de desecho). Además, un microorganismo industrial debería no ser dañino para las personas ni para los animales y plantas económicamente importantes. Debido al gran tamaño de la población dentro del fermentador y a la imposibilidad práctica de evitar la contaminación del ambiente fuera del fermentador, un patógeno podría plantear problemas potenciales desastrosos. Otro requisito importante de un microorganismo industrial es que sea posible eliminar las células microbianas del medio de cultivo con relativa facilidad. En el laboratorio, las células se retiran principalmente por centrifugación, pero la centrifugación a gran escala puede ser difícil o cara. Los organismos industriales más favorables son aquellos que tienen un tamaño de célula grande,

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porque las células más grandes se depositan rápidamente en un cultivo o pueden filtrarse fácilmente con materiales de filtro relativamente baratos. Los preferidos son los hongos, las levaduras y las bacterias filamentosas. Las bacterias unicelulares, debido a su pequeño tamaño, son difíciles de separar del fluido de cultivo. Finalmente, un microorganismo industrial debería ser susceptible de manipulación genética. En microbiología industrial, el incremento del rendimiento se ha obtenido primordialmente por medio de la mutación y selección. También es deseable que el organismo industrial sea capaz de sufrir recombinación genética, bien por un proceso sexual o por algún tipo de proceso parasexual1. La recombinación genética permite incorporar en un solo genoma, características genéticas de más de un organismo. Sin embargo, muchas cepas industriales se han mejorado enormemente por mutación y selección, sin el uso de la recombinación genética. REQUISITOS DE LAS CEPAS INDUSTRIALES             



Posibilidad de obtener cultivos puros Genéticamente estables Fácil de mantener por largos períodos de tiempo Tasa rápida de producción de formas de propagación Tasa rápida de crecimiento en preinóculo y en fermentador Ausencia de problemas tecnológicos durante el escalado Nutricionalmente poco exigentes Autoprotección (bajada de pH, temperatura óptima extrema, producción de agentes antagonistas, etc). Producción rápida de los metabolitos de interés Fácil separación entre el producto y el microorganismo Producción mayoritaria del metabolito de interés Falta de producción de sustancias tóxicas Susceptible de mejora genética

Existen una serie de características que comparten todos los microorganismos y que suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. la más fundamental, el pequeño tamaño de la célula 1

Ciclo que implica cambios en el número cromosómico, pero que difiere en lugar y tiempo del ciclo sexual; tiene lugar en los hongos cuyo ciclo normal está suprimido o aparentemente ausente. Cuando es Homocariótico los núcleos presentes en una hifa son del mismo tipo genético. Para el caso Heterocariótico dos o más núcleos son genéticamente distintos. En la Heterocariosis se produce la fusión de micelios genéticamente distintos, el par formado sufre mitosis o, puede suceder en la mutación de un micelio Homocariótico. La Parasexualidad consiste en los siguientes procesos: Heterocariosis, cariogamia, recombinación, segregación mediante entrecruzamiento mitótico y haploidización. Los procesos parasexuales se asemejan a la reproducción sexual, pero estos pueden tener lugar cuando el micelio está en desarrollo, mientras que la fase sexual (sí la hay) depende de las condiciones nutritivas y del hábitat

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microbiana y su correspondiente alta relación de superficie a volumen. Esto facilita el rápido transporte de nutrientes al interior de la célula y permite, por consiguiente, una elevada tasa metabólica. Así, la tasa de producción de proteína en las levaduras es varios órdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que, a su vez, es 10 veces más alta que en el ganado. Esta velocidad de biosíntesis microbiana extremadamente alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo 20 minutos (Escherichia coli ). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación del agua y el punto de ebullición, en agua salada y dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas permanecen inactivos durante años hasta que el medio ambiente, más favorable, permita el desarrollo de las células. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes de nutrición. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen en nutrientes baratos. Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de tiempo. El microorganismo debe también crecer en un relativamente barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser patógeno para el hombre o para los animales o plantas. Otro requisito importante es la facilidad de separar las células microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para esto son aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias filamentosas) ya que estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar.

2.2

Diferentes tipos de microorganismos industriales Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre representan, como máximo, unos pocos centenares de especies de entre las más de 100000 descritas en la Naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fácil o barata por otros métodos.

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2.2.1

Levaduras

Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de años para la fabricación de pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fue la primera y aún hoy en día sigue siendo la más utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Trichosporum cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas de digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidación de compuestos orgánicos, incluídos algunos que son tóxicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenólicos.

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2.2.2

Hongos filamentosos

Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por su utilidad, sino también por el daño que pueden causar. Los hongos son responsables de la degradación de gran parte de la materia orgánica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre. Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su utilización industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la combinación de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico, láctico), antibióticos (penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas.

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2.2.3

Bacterias

Entre las especies bacterianas de interés industrial están las bacterias del ácido acético, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en ácido acético. El género Bacillus es productor de antibióticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas. Del género Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azúcares originando acetona y butanol. Las bacterias del ácido láctico incluyen, entre otras, las especies de los géneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial de lisina. El olor característico a tierra mojada se debe a compuestos volátiles (geosmina) producidos por Streptomyces aunque su principal importancia radica en la producción de antibióticos como anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc

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3

Fisiología del crecimiento Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es un aumento de la población. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista:  

A escala individual A escala poblacional

Los eventos de crecimiento en el ámbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de éste podemos abordar los siguientes temas:  inicio y transcurso de la replicación cromosómica y de plásmidos );  segregación de cromosoma y plásmidos a las células hijas;  síntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular  señales que coordinan la replicación genómica con la división celular.

El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tópicos:   

3.1

cinética del crecimiento; factores que afectan al tiempo de generación (g); factores ambientales que limitan el crecimiento.

Ciclo celular Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una serie de eventos identificables que se van produciendo en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos hace falta que se complete el anterior.

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Ciclo eucariótico Los eventos clave son la fase S, de síntesis de ADN, y la fase M (mitosis y división celular). Las fases S y G 2 son relativamente constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duración del ciclo total (por modificación de la velocidad de crecimiento), lo que cambia es el tiempo de la fase G1 y, en menor medida, de la fase M. Ciclo eucariótico Los eventos clave son la fase S, de síntesis de ADN, y la fase M (mitosis y división celular). Las fases S y G2 son relativamente constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duración del ciclo total (por modificación de la velocidad de crecimiento), lo que cambia es el tiempo de la fase G1 y, en menor medida, de la fase M.

Los eventos clave son la fase S, de síntesis de ADN, y la fase M (mitosis y división celular). Las fases S y G2 son relativamente constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duración del ciclo total (por modificación de la velocidad de crecimiento), lo que cambia es el tiempo de la fase G1 y, en menor medida, de la fase M. Ciclo procariótico Hasta hace unos 20 años se pensaba que los ciclos bacterianos carecían de eventos clave. Ello se debía a que en bacterias no existe mitosis y porque en los medios de cultivo ricos empleados entonces la síntesis de ADN parecía continua durante todo el ciclo. Pero hoy sabemos que sí existen fenómenos clave, que se pueden poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en medios menos ricos que permiten sólo crecimientos lentos. Los periodos del ciclo procariótico son:

Ciclo procariótico Hasta hace unos 20 años se pensaba que los ciclos bacterianos carecían de eventos clave. Ello se debía a que en bacterias no existe mitosis y porque en los medios de cultivo ricos empleados entonces la síntesis de ADN parecía continua durante todo el ciclo. Pero hoy sabemos que sí existen fenómenos clave, que se pueden poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en

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medios menos ricos que permiten sólo crecimientos lentos. Los periodos del ciclo procariótico son:   

fase C (equivalente a la S eucariótica): replicación del ADN cromosómico; fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminación coincide con el final de división celular; fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminación coincide con el final de división celular;

Lo característico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generación (g), lo hace a expensas de la fase "G1". Por ejemplo, en Escherichia coli , C = unos 40 min, y D = unos 20 min.

3.1.1

Ciclo celular en función del tiempo de generación Vamos a estudiar con el ejemplo de E. coli qué ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generación.

Cuando g>C+D

existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicación). En estas condiciones podemos observar nítidamente periodos diferenciados entre sí (de síntesis de ADN y de división celular).

Cuando g=C+D

ya no existe G1, y cada ronda de replicación comienza inmediatamente tras la precedente división celular (es decir, cada célula hija recién nacida se embarca inmediatamente en replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de replicarlo, la célula inicia la división celular).

Cuando g
las rondas de replicación de un ciclo se inician antes de que haya terminado la división celular del anterior (superposición parcial entre fases C y D).

Cuando g
ya no se puede detectar fase D como tal. La síntesis de ADN es continua durante todo el ciclo. Se inician rondas de replicación cromosómica antes de que haya terminado la anterior. Esto se traduce en que los cromosomas muestran un típico patrón de replicación dicotómica y en que dichos cromosomas pasan a cada célula hija ya embarcados en una nueva ronda de replicación.

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Una característica del ciclo es que, cuanto más rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generación (g), mayor es el tamaño medio de las células. Es decir, los individuos de una cepa bacteriana que esté en un medio rico son más grandes que los individuos de esa misma cepa creciendo en un medio pobre. 3.1.2

Control de la replicación del ADN 2 cromósomico

De lo anterior se deduce que debe de existir algún tipo de acoplamiento entre las ondas de replicación y la división celular. Nosotros, sobre el esquema que hemos comentado, podemos inferir cuándo se debe de iniciar una nueva ronda siempre que sepamos los valores de g, C y D: Contamos C+D minutos a partir de g, y entonces podemos prever que la ronda de replicación tendrá lugar g--(C+D) minutos antes de la próxima división celular (o bien, G 1-g minutos si existe periodo G 1). Pero, por supuesto, la célula no es tan "lista" (no sabe contar hacia atrás en el tiempo) ni tiene el don de la predicción (los humanos tampoco, para la mayor parte de las cosas importantes). La bacteria tampoco sabe "contar hacia adelante", ya que el tiempo de inicio de una ronda de replicación no guarda una relación sencilla con la división celular previa. Entonces, ¿cómo se acoplan división celular y replicación cromosómica? Una clave hacia la respuesta a esta pregunta es que la razón (proporción) entre orígenes de replicación y masa celular en el inicio (inmediatamente antes de la replicación) es igual para todas las tasas de crecimiento. Hé aquí un modelo hipotético sobre el mecanismo de coordinación entre ambos eventos del ciclo celular: ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA: Deoxyribonucleic Acid ). Constituye el principal componente del material genético de la inmensa mayoría de los 2

organismos, junto con el ARN. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material en el que los genes están codificados. En las bacterias, el ADN se encuentra en el citoplasma mientras que en organismos más complejos, tales como plantas, animales y otros organismos multicelulares, la mayoría del ADN reside en el núcleo celular. Se conoce desde hace más de cien años. El ADN fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, biólogo suizo, en los núcleos de las células del pus obtenidas de los vendajes quirúrgicos desechados y en el esperma del salmón. Él llamó a la sustancia nucleína, aunque no fue reconocida hasta 1943 gracias al experimento realizado por Oswald Avery.

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El sistema de coordinación detecta la concentración de orígenes de replicación; conforme la bacteria crece, esta concentración va descendiendo, hasta que se alcanza un valor umbral crítico que desencadena una nueva onda de replicación. Ello hace que se doble el número de orígenes. Una ulterior ronda no se pone en marcha hasta que el crecimiento haga de nuevo descender la concentración de orígenes. Se trataría, pues, de una especie de reloj biológico y "oscilador" que usaría como medida del tiempo el pararámetro de masa celular, volumen, u otro equivalente, de tal modo que la concentración crítica de un factor iniciador o la dilución de un represor servirían para disparar la replicación a una concentración determinada. 3.1.3

Relaciones entre velocidad de crecimiento y tamaño celular Es fácil comprobar en los cultivos bacterianos que cuanto más rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generación (g), mayor es el tamaño medio de las células. 1. 2.

a. bacterias i creciendo en un medio relativamente o pobre (supongamos que en este medio g=60 min, . C+D=g); si transplantamos una célula recién dividida procedente del cultivo anterior a un medio más rico (por ejemplo, que permite un tiempo de generación g=35 min) podemos observar que: a. la primera división ocurre C+D (60 minutos) después; es decir, con un tiempo idéntico al que tenía en el medio anterior; b. pero como en este medio g=35 min, la iniciación de una nueva ronda de replicación ocurre antes de dicha replicación celular (es decir, C y D se superponen); c. se observa que se alcanza un nuevo equilibrio, con un tamaño celular mayor que en el medio pobre, y una masa de inicio (tras la división celular) mayor, alterándose igualmente el tiempo de inic

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3.1.4

Segregación de cromosomas y plásmidos Existe un mecanismo eficiente que asegura la segregación de los cromosomas bacterianos a las células hijas. Como se recordará, el cromosoma se encuentra unido a la membrana citoplásmica, al parecer a través de un mesosoma. Existen indicios de que durante la replicación, el vértice de la horquilla de replicación va pasando por ese punto de anclaje. La replicación cromosómica se inicia en una región especial denominada oriC , a partir de la cual se efectúa una replicación bidireccional, hasta que ambas horquillas se encuentran en un punto situado a 180o respecto de oriC . Cuando el mesosoma llega a ese término de replicación se escinde en dos mesosomas, cada uno de los cuales constituye el punto de anclaje de cada copia del cromosoma. Cuando se forme el septo transversal, cada mesosoma va a parar a cada célula hija, de modo que las copias de los cromosomas quedan segregadas. Parece ser que algunos plásmidos se segregan por este mismo mecanismo. Así pues, el mesosoma parece actuar como un análogo primitivo del aparato mitótico.

3.1.5

Productos anómalos de la división celular Existen diversos tipos de mutantes cuyos fenotipos implican serias alteraciones del proceso de división celular y de replicación o segregación del material genético a las células hijas. Algunos de estos mutantes han encontrado útiles aplicaciones en estudios genéticos y moleculares. Cé lula s sin cue rp os n u clear es ( = m ax icé lu las)

Determinados mutantes termosensibles son incapaces de iniciar la replicación a temperaturas elevadas, de modo que siguen creciendo en tamaño y se dividen mucho después de que se haya completado la última replicación cromosómica (iniciada a una temperatura más baja, permisiva). El resultado de la división celular a la temperatura no permisiva es que se producen células de tamaño normal, pero sin cromosoma, aunque poseen los demás componentes celulares, incluyendo copias de plásmidos. Por estos mutantes se puede deducir que no existe una relación directa entre la septación (o sea, la fase D de división celular) y la replicación cromosómica anterior (fase C).

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Minicélulas Se producen en ciertos mutantes que forman septos anómalos acéntricos (asimétricos, cerca de un extremo y no en el centro). En las minicélulas tampoco se segrega cromosoma, pero pueden "heredar" copias de plásmidos. De estos mutantes se deduce otro rasgo del ciclo celular: el lugar habitual donde se produce la septación está programado genéticamente, y esta programación se puede alterar por mutaciones. Uso de maxicélulas y minicélulas en estudios moleculares y genéticos: Un empleo habitual de estas "células" anómalas en el laboratorio se deriva del hecho de que durante cierto tiempo pueden sintetizar proteínas codificadas por los únicos genes que poseen: los del plásmido o plásmidos que alberguen. Por marcaje radiactivo y electroforesis en gel de proteínas, se detectan unas pocas bandas, correspondientes sólo a las proteínas de los pocos genes existentes, con la ventaja de que no hay interferencia de los cientos o miles de proteínas de la célula normal.

3.2

Métodos para el estudio y medición del crecimiento a escala individual

3.2.1

Por microscopía Se basan en la observación microscópica de microcultivos a temperatura constante.  

seguimiento de células individuales por microfotografía secuencial por inmunofluorescencia: se observa en microscopio de fluorescencia la incorporación de materiales de P.C. o de membrana marcados con algún colorante fluorescente.

3.2.2 Por obtención de cultivos sincrónicos Como veremos en el próximo capítulo, en un cultivo bacteriano habitual, las distintas células se encuentran en fases distintas del ciclo celular, es decir, no están sincronizadas. Por lo tanto, del

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estudio de la población no es posible sacar conclusiones sobre eventos del ciclo celular. Sin embargo, por una serie de procedimientos, es factible producir cultivos sincrónicos, sincrónicos , en los que durante cierto tiempo (casi) todas las células están en la misma fase, de modo que tienen la misma edad, el mismo tamaño, y se dividen y replican el cromosoma al mismo tiempo. Entonces, el comportamiento de la población (más fácil de estudiar que el de un solo individuo) es una "imagen ampliada" del individual. Los principales métodos de obtención de cultivos sincrónicos se basan en seleccionar, a partir de un cultivo estándar no sincrónico, aquellas células que o bien son del mismo tamaño, o bien son de la misma edad. Las técnicas principales son: 



selección por tamaños: tamaños : se suele recurrir a gradientes de densidad, densidad , sobre todo los formados por mezclas de agua normal y agua deuterada (H 2O/D2O). selección por edades: edades : el método más empleado es la selección por filtración filtración (técnica de HelmstetterCummings), aunque sólo se puede aplicar a ciertas cepas (en E. coli funciona funciona con la cepa B/r, pero no con la K12).

Procedimiento

Se filtra un cultivo asincrónico que esté en fase exponencial a través de una membrana de nitrocelulosa: las células se adhieren al filtro. Se invierte el filtro.  Se va pasando medio fresco (=nuevo) precalentado. Cada  célula unida al filtro se nutre y crece, y finalmente se divide: una de las células hijas queda unida al filtro y la otra pasa al eluato, que se recoge. En cada momento concreto de esta operación, las células hijas eluidas y recogidas corresponden a células "recién nacidas". Las células eluidas en cada momento concreto (y por lo tanto, de la misma edad) sirven como "fundadoras" de un cultivo sincrónico. 

Obsérvese la cinética de un cultivo "sincrónico" expresada como número de individuos en función del tiempo:  

durante unas pocas generaciones el cultivo es más o menos sincrónico; las mesetas indican las fases en que el número de células no varía, porque todas están creciendo en tamaño antes de dividirse;

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

las subidas bruscas (casi verticales) en el número de individuos nos indican que todas las células del cultivo se están dividiendo a (casi) el mismo tiempo.

Pero la sincronía se va perdiendo paulatinamente, de modo que al cabo de unas generaciones la gráfica se convierte en una recta con pendiente. La explicación estriba en que el tiempo exacto de división, o más concretamente C y D no duran exactamente lo mismo en los distintos individuos. Estas pequeñas variaciones estadísticas se van acumulando, generando desfases cada vez mayores entre células, hasta que la sincronía se pierde irreversiblemente. 3.3

Medida del crecimiento El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologías. Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las células individuales, ésto es iniciar y completar una división celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el número total de partículas bacterianas. Existen dos formas para determinar el número total de microorganismos en una muestra: • •

Recuento microscópico de partículas Recuento electrónico de partículas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido a que sólo se tiene en cuenta el número de microorganismos viables, esto es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son: • •

Recuento de colonias Método del número más probable

Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la síntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la síntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la división celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimático para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

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• • • •

Determinación de peso húmedo Determinación de peso seco Determinación de nitrógeno total Determinación química de un ácido nucleico

Un último grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los microorganismos en los cambios químicos de su entorno como consecuencia del incremento de la biomasa.

Recuentos Directos Recuento microscopico: microscopico: Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teñidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina). La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproductibilidad en el llenado de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o medios mínimos sin fuente de carbono). Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley Hawksley y la de PetroffHausser. Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados.

Camara de recuento de Petroff-Hausser

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Tipo de cuadro

Area [cm2]

Volumen [ml]

Factor [1/Volumen]

Cuadrado total

1.00 x 10-2

2.00 x 10-5

5.00 x 104

Cuadrado grande

4.00 x 10-4

8.00 x 10-7

1.25 x 106

Cuadrado pequeño 2.50 x 10-5

5.00 x 10-8

2.00 x 107

•

•

•

1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la cámara de recuento. Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara que se utilizaron para contar un el número de bacterias. Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cámara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realizó el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeño tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50 µm x 20 µm = 5 x 104 3 µm = 5 x 10-8 ml).

Recuento electronico: Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan básicamente de dos compartimientos comunicados a través de un pequeño conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuación. Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de éste se incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios en la resistencia que son

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comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse células que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de más de una célula en un breve período de tiempo va a ser tomado como una célula más grande. Es común la obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes. Medida de la Biomasa La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad metabólica, o de un constituyente metabólico o químico. Algunos de los métodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca la exactitud. Peso húmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas. Peso seco: El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

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Determinación de acidos nucleicos: Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la población. Determinacion de nitrógeno: Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Existen distintas técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno que contiene una muestra en relación al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrógeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrógeno proteico mediante absorción en UV, Reacción de Biuret, Reacción de Lowry, o el nitrógeno total mediante la Digestión de Kjeldahl. Incorporación de precursores radiactivos: Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. En esta técnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la célula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la población. Dispersión de la Luz Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución. En relación a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión. Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o

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por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Optica) con el número de microorganismos totales o con UFC.

Absorbancia en función del Peso Seco Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0). Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/ml-mg/ml). La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción.

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Absorbancia en función del Peso Seco

Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales

En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo número de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta. Lectura complementaria Anexo 1

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4

Metabolismo microbiano.

4.1

Introducción al metabolismo. El metabolismo es el conjunto de reacciones bioquímicas que permiten el crecimiento de un organismo (por lo tanto, en bacterias, que conduce a la creación de nuevas células). El metabolismo de la célula comprende dos grandes tipos de reacciones: 1)

reacciones de mantenimiento, que suministran a)

energía

b)

poder reductor

c)

precursores metabólicos

2) reacciones del anabolismo (biosíntesis), que usan energía y poder reductor procedente de las reacciones de mantenimiento. El término metabolismo se utiliza cuando nos referimos a todos los procesos químicos que tienen lugar dentro de una célula. Los elementos químicos básicos que utiliza una célula provienen del medio ambiente y estos elementos químicos son transformados por la célula en los constituyentes característicos que componen dicha célula. Estos compuestos químicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una célula transforma estos nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía. Esta energía se obtiene del medio ambiente. Las células pueden utilizar 3 tipos distintos de fuente de energía: luz, compuestos orgánicos y compuestos inorgánicos. Aunque algunos organismos obtienen su energía de la luz, la mayor parte lo hacen a través de compuestos químicos. Cuando estos compuestos químicos se rompen originando compuestos más simples se libera energía. Este proceso se denomina catabolismo. Las células también necesitan energía para otras funciones celulares como es la motilidad (movimiento celular) y transporte de nutrientes. Como hemos visto existen dos procesos básicos de transformaciones químicas en las células: anabolismo y catabolismo. El resultado colectivo de las reacciones anabólicas y catabólicas es el metabolismo.

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CLASIFICACION DE LOS ORGANISMOS SEGUN SU FUENTE DE CARBONO Y ENERGIA FUENTE DE ENERGI A FOTOTROFOS QUI MI OTROFOS AUTOTROFOS HETEROTROFOS

FUENTE DE CARBONO

LUZ QUI MI CA CO2 COMPUESTOS ORGANI COS FUENTE DE ENERGI A

FOTOAUTOTROFOS FOTOHETEROTROFOS QUI MI OAUTOTROFOS QUI MI OHETEROTROFOS

LUZ LUZ QUI MI CA QUI MI CA

FUENTE DE CARBONO CO2 COMPUESTOS ORGANI COS CO2 COMPUESTOS ORGANI COS

Fotoautotrofos:Vegetales, algas, bacterias foto sint éticas. Fotoheterotrofos: Bacterias Quimioautotrofos: Bacterias. Quimioheterotrofos: Animales, Proto zoos, bact erias. NUTRICION

MICROBIANA Dr. Pedro F. Mateos Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia. Universidad de Salamanca

I.- NUTRICION DE LOS MICROORGANISMOS II.- NUTRIENTES 1.- MACRONUTRIENTES 2.- MICRONUTRIENTES 3.- VITAMINAS Y HORMONAS 4.- ELEMENTOS TRAZA III.- PERMEABILIDAD Y TRANSPORTE

I.- NUTRICION DE LOS MICROORGANISMOS La gran meta que tiene un microorganismo es crecer y dividirse; para ello necesita duplicar el material que posee. Las células utilizan elementos químicos que provienen del medio

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ambiente para transformarlos en los constituyentes característicos que componen dicha célula. Estos compuestos químicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una célula transforma estos nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requ iere energía. Esta energía se obtiene del medio ambiente. Las células pueden utilizar tres tipos distintos de fuentes de energía: luz, compuestos orgánicos o compuestos inorgánicos. Aunque algunos organismos obtienen su energía de la luz, la mayor parte lo hacen a través de compuestos químicos. Cuando estos compuestos químicos se rompen originando compuestos más simples se libera energía y a este proceso se le denomina catabolismo. El resultado colectivo de las reacciones anabólicas y catabólicas es el metabolismo. Cuando los microorganismos se separan de su hábitat (donde adquieren los nutrientes) y se cultivan en laboratorios o industrias se deben usar medios de cultivo que contengan los elementos químicos necesarios para su crecimiento.

II.- NUTRIENTES Los nutrientes que requiere una célula para su crecimiento se pueden clasificar en los siguientes grupos: 1.- Macronutrientes: carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. 2.- Micronutrientes: fósforo, potasio, azufre, magnesio. 3.- Vitaminas y hormonas 4.- Elementos traza: zinc, cobre, manganeso, molibdeno, cobalto.

1.- MACRONUTRIENTES Carbono. Todos los organismos necesitan carbono en alguna de sus formas. El carbono forma el esqueleto de los tres más importantes nutrientes (carbohidratos, lípidos y proteínas) que se utilizan para la obtención de energía así como material celular. Los microorganismos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono se llaman heterotrofos y aquellos que utilizan el CO2 como fuente de carbono se llaman autotrofos. Hidrógeno y Oxígeno. El hidrógeno y oxígeno forman parte de muchos compuestos orgánicos. Se encuentran en el H2O, como componentes de nutrientes y en la atmósfera. Además el O2 se utiliza en la respiración aeróbica como aceptor terminal de electrones. Nitrógeno. Todos los organismos requieren nitrógeno. El nitrógeno es metabolizado y entra a formar parte de las proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Las fuentes de nitrógeno que pueden ser utilizadas por diferentes organismos incluyen el N2 atmosférico en algunos procariotas, otros utilizan compuestos inorgánicos como nitratos, nitritos o sales de amonio, mientras que otros requieren compuestos nitrogenados orgánicos como son los aminoácidos o péptidos.

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2.- MICRONUTRIENTES (c.a. 0,2 g / l) Fósforo. El fósforo es esencial para la síntesis de ácidos nucleicos y ATP; también forma parte de los fosfolípidos y polímeros de la pared celular. El fósforo se suministra normalmente como fosfato inorgánico; alternativamente se puede utilizar fosfato orgánico como son los glicerofosfatos y fosfolípidos. Potasio. El ión potasio actúa como coenzima y probablemente como catión en la estructura de RNA y otras estructuras aniónicas celulares. Azufre. El azufre es necesario para la biosíntesis de los aminoácidos cisteina, cistina y metionina. También forma parte de coenzimas como biotina, coenzima A y ferredoxina. El azufre se suministra en forma inorgánica como sulfato u orgánica como cistina, cisteina y metionina. Magnesio. Se utiliza como cofactor de reacciones enzimáticas donde actúa el ATP.

3.- VITAMINAS Y HORMONAS Las vitaminas se clasifican en dos grupos, hidrosolubles y liposolubles. Dentro de éstas últimas la vitamina A, D y E no son necesarias para el crecimiento de las bacterias. Todas las vitaminas hidrosolubles, excepto el ácido ascórbico, son necesarias para el crecimiento de bacterias. La mayor parte de las vitaminas hidrosolubles son componentes de coenzimas. En los medios indefinidos se utiliza como fuente de vitaminas el extracto de levaduras.

4.- ELEMENTOS TRAZA (c.a. 25 mg / l) En general los requerimientos de elementos traza se conocen sólo cualitativamente ya que es difícil demostrar su requerimiento debido a que las cantidades necesarias se suelen encontrar a menudo como contaminantes en otros constituyentes del medio. Son necesarios para activar algunos enzimas; por ejemplo, el Mo6+ se necesita en la nitrogenasa que es el enzima que cataliza la conversión del nitrógeno atmosférico en amoníaco en la fijación biológica de nitrógeno.

III.- PERMEABILIDAD Y TRANSPORTE La membrana citoplásmica controla el paso de los nutrientes dentro de la célula, así como hacia fuera de la célula. Existen 4 mecanismos que regulan el transporte de nutrientes:

1.- DIFUSION PASIVA

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Las moléculas de H2O y algunos nutrientes liposolubles pasan libremente a través de la membrana hasta equilibrar concentraciones. No hay consumo de energía.

2.- DIFUSION FACILITADA Los nutrientes se unen a una proteína transportadora para atravesar la membrana pasando de mayor a menor concentración. No hay consumo de energía.

3.- TRANSPORTE ACTIVO La mayor parte de los nutrientes son transportados mediante este mecanismo. Este proceso permite concentrar altos niveles de nutrientes necesarios para las actividades metabólicas dentro de la célula. Hay consumo de energía. El ATP distorsiona el sitio de unión de la proteína transportadora dificultando a la molécula salir de la célula.

4.- TRANSPORTE POR TRANSLOCACION DE GRUPO En este tipo la proteína transportadora es un enzima que añade un grupo fosfato del ácido fosfoenolpirúvico al nutriente durante el transporte. Este nutriente alterado ya no es capaz de unirse a la proteína transportadora por lo que se acumula dentro de la célula.

La energía y el poder reductor en el metabolismo microbiano: papel del ATP y de los piridin nucleotidos La energía química es la energía liberada cuando un compuesto orgánico o inorgánico es oxidado. En biología las unidades de energía más usadas son la kilocaloría (Kcal) y el kilojulio (KJ). 1 Kcal = 4.184 KJ. La utilización de energía química en los organismos vivos está implicada con las reacciones de oxidación-reducción, llamadas REDOX ya que por cada oxidación que ocurre tiene que haber una reducción. Una oxidación se define como la eliminación de electrones de una sustancia y una reducción se define como la adición de electrones a una sustancia. En bioquímica, las oxidaciones y reducciones frecuentemente conllevan no sólo la transferencia de electrones, sino de átomos enteros de hidrógeno. La energía liberada como resultado de las reacciones redox debe de conservarse para ser utilizada por la célula. En los organismos vivos, la energía química liberada en las reacciones redox se transfiere normalmente a una variedad de compuestos fosfato en la forma de enlaces fosfato de alta energía. El compuesto más importante en los organismos vivos que contiene enlaces fosfato de alta energía es el adenosín trifosfato (ATP). El ATP contiene 2 enlaces fosfato de alta

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energía. Se puede considerar que el ATP tiene por objeto "atrapar" una parte de la energía libre que queda disponible en las reacciones catabólicas e impulsar reacciones biosintéticas al activar ciertos metabolitos intermediarios de la biosíntesis. Además del ATP, existen otros compuestos de alta energía que activan intermediarios metabólicos y así impulsan ciertas reacciones de biosíntesis: Compuestos de alta energía Guanina, Uridina Citidina Desoxitimidina Acetil coenzima A

Causa activación en la biosíntesis de: Proteínas, Peptidoglicano, Glucógeno Fosfolípidos Lipopolisacáridos Acidos grasos

Ya hemos dicho que cuando ocurre una oxidación tiene que haber una reducción, es decir una sustancia que acepte los electrones eliminados. En la mayor parte de los casos, cada etapa de oxidación de un metabolito implica la eliminación de dos electrones y, por ello, la pérdida simultánea de dos protones; esto equivale a la eliminación de dos átomos de hidrógeno y se denomina deshidrogenación. Inversamente, la reducción de un metabolito implica la adicción de dos electrones y de dos protones y se considera una hidrogenación. Los compuestos que con más frecuencia llevan a cabo oxidaciones y reducciones biológicas (es decir, que sirven como aceptores de átomos de hidrógeno liberados en las reacciones de deshidrogenación y como donadores de átomos de hidrógeno requeridos para las reacciones de hidrogenación) son dos piridín nucleótidos: nicotinamida adenín dinucleótido (NAD) y nicotinamida adenín dinucleótido fosfato (NADP). Estos dos piridín nucleótidos pueden fácilmente sufrir oxidaciones y reducciones reversibles en el grupo nicotinamida. La oxidación-reducción reversible del NAD y del NADP puede simbolizarse así: NAD+ + 2H -----> NADH + H+ oxidado

reducido

NADP+ + 2H -----> NADPH + H+

Mecanismos de obtencion de ATP

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En el metabolismo, el ATP se genera por dos mecanismos bioquímicos fundamentalmente diferentes: Fosforilación a nivel de sustrato y fosforilación oxidativa. 1.- Fosforilación a nivel de sustrato : Mediante la fosforilación a nivel de sustrato, el ATP se forma a partir de ADP por transferencia de un grupo fosfato de alta energía de un intermediario de una ruta catabólica. La siguiente reacción sirve de ejemplo:

Acido 2 fosfoglicérico -----> Acido fosfoenolpirúvico + ADP -----> Acido pirúvico + ATP

Como consecuencia de la pérdida de una molécula de H2O, el enlace éster de baja energía del fosfato del ácido 2-fosfoglicérico se convierte en un enlace enólico de alta energía en el ácido fosfoenolpirúvico. Este fosfato de alta energía puede luego ser transferido al ADP con lo que se produce una molécula de ATP. 2.- Fosforilación oxidativa (Transporte de electrones) : En los diferentes modos de metabolismo microbiano, incluyendo la respiración y la fotosíntesis, el ATP se genera por transporte de electrones a través de una cadena de moléculas transportadoras que tienen una orientación fijada en la membrana celular. Los componentes de la cadena son moléculas transportadoras capaces de sufrir oxidaciones y reducciones de modo reversible de tal manera que cada miembro de la cadena es capaz de ser reducido por la molécula transportadora que le precede y oxidado por la que le sigue. En la cadena de transporte de electrones algunos miembros transportan átomos de hidrógeno (un electrón más un protón), mientras que otros transportan sólamente un electrón. La orientación de los transportadores en la membrana celular es tal que los transportadores de átomos de hidrógeno realizan el transporte hacia fuera de la célula y los transportadores de electrones lo realizan hacia el interior con lo que en cada confluencia se transporta fuera de la célula un protón. La membrana celular es impermeable a los protones; como resultado, el transporte de electrones retiene una porción de energía química liberada por la reacción global de la cadena (oxidación del donador primario de electrones por el aceptor terminal de electrones). Esta energía se utiliza en los sistemas de permeasas, movilidad celular por flagelos y en la síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. Esta síntesis de ATP está catalizada por un enzima complejo unido a la membrana la ATP fosfohidrolasa (ATPasa). La fosforilación oxidativa se puede explicar

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aplicando el símil de la generación de energía eléctrica a través de agua embalsada. La membrana actúa como una presa que retiene el agua (en este caso los protones que se transportan fuera de la célula a través de la cadena transportadora de electrones); en el momento que se abren las compuertas (ATPasa) este agua liberada (protones) mueve la turbina (ATPasa) que genera energía eléctrica (síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico).

4.2

Metabolismo primario Suma de los procesos esenciales para las funciones básicas de la célula, como la glucólisis. Un proceso microbiano típico, en el que el producto se forma durante la fase primaria del crecimiento, es el alcohol (etanol) obtenido por fermentación3. El etanol es un producto del metabolismo anóxico de la levadura y de algunas bacterias y se forma como parte del metabolismo de la energía. Debido a que el crecimiento sólo puede tener lugar si puede producirse energía, la formación de etanol tiene lugar en paralelo con el crecimiento. En la imagen inferior, se muestra una típica fermentación alcohólica indicando la formación de células, de etanol, y la utilización del azúcar.

Sustrato de crecimiento

Células

Metabolito Primario

Las células y el metabolito se producen más o menos simultáneamente

3

En microbiología industrial, el término fermentación se refiere a cualquier proceso microbiano a gran escala, sea o no sea bioquímicamente una fermentación. De hecho, la mayoría de las fermentaciones industriales son aeróbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentación industrial se denomina fermentador y el microorganismo implicado es el agente de la fermentación

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34


4.3

Metabolismo secundario Suma de los procesos no esenciales para las funciones metabólicas básicas de la célula. Estos procesos están asociados a ciertas ventajas adaptativas, como los mecanismos de defensa (antibióticos, toxinas, etc.).

Un tipo más complejo de productos industriales es aquel en el que el producto deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos más comunes y más importantes de interés industrial. Los más conocidos y más ampliamente estudiados son los antibióticos y en la imagen inferior puede verse la cinética del proceso de obtención de la penicilina. Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas las células, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y otro. Las características reconocidas del metabolismo secundario son: 1. Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos organismos. 2. Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el crecimiento y la reproducción. 3. La formación de metabolitos secundarios es extremadamente dependiente de las condiciones de crecimiento, especialmente de la composición del medio. Con frecuencia, se produce la represión de la formación del metabolito secundario. 4. Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo de estructuras estrechamente relacionadas. Por ejemplo, se ha visto que una sola cepa de una especia del Streptomyces produce 32 antibióticos distintos pero relacionados, del tipo antraciclina. 5. Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproducción de metabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados como están al metabolismo primario, usualmente no se pueden superproducir de una manera tan espectacular. Trofofase e idiofase. En el metabolismo secundario, las dos fases distintas del metabolismo se denominan trofofase e idiofase. La trofofase es la fase de crecimiento (el prefijo trofos, significa "crecimiento" ) mientras que la fase de producción de metabolitos es la idiofase. Si estamos tratando con un metabolito secundario debemos asegurar que durante la trofofase se proporcionen las condiciones apropiadas para un excelente crecimiento y que

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las condiciones se alteren adecuadamente y en el momento oportuno para que la formación del producto sea excelente. En el metabolismo secundario, la producción en cuestión puede no derivarse del sustrato primario del crecimiento, sino a partir de un producto que él mismo formó a partir del sustrato primario del crecimiento. Por tanto, el metabolito secundario se produce, generalmente, a partir de varios productos intermedios que se acumulan, bien en el medio de cultivo o bien en las células, durante el metabolismo primario. Una característica de los metabolitos secundarios es que las enzimas implicadas en la producción del metabolito secundario están regulados separadamente de las enzimas del metabolismo primario. En algunos casos se han identificado inductores específicos de la producción de metabolitos secundarios. Por ejemplo, se ha identificado un inductor específico de la producción de estreptomicina, un compuesto denominado Factor A.


Células

Metabolito Primario

Metabolito Secundario Después de producidas las células y el metabolito primario, las células convierten el metabolito primario en uno secundario

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Células

Metabolito Primario

Metabolito Secundario Después de producidas las células el sustrato se convierte en un metabolito secundario durante un posterior crecimiento

Características de los metabolitos secundarios • • • • 

•

Específicos de un grupo de organismos No esenciales para el crecimiento Dependiente de las condiciones de crecimiento Producidos como grupo de estructuras relacionadas: Una cepa de S t r e p t o m y c e s produce 32 antibióticos distintos del tipo antraciclina Puede obtenerse una superproducción espectacular

Relación entre el metabolismo primario y el secundario. La mayoría de los metabolitos secundarios son moléculas orgánicas complejas que para su formación requieren un gran número de reacciones enzimáticas específicas. Se sabe, por ejemplo, que en la síntesis del antibiótico tetraciclina están implicados al menos 72 pasos enzimáticos separados y más de 25 en la síntesis de la eritromicina, y que ninguna de estas reacciones tiene lugar durante el metabolismo primario. Sin embargo, las vías metabólicas de estos metabolitos secundarios arrancan del metabolismo primario porque los materiales de partida para el metabolismo secundario vienen de las vías biosintéticas principales. Muchos metabolitos secundarios estructuralmente complejos, se originan a partir de precursores estructuralmente muy similares.

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4.4

Mecanismos de obtención de energía por microorganismos quimioheterotrofos Como ya hemos dicho, los organismos quimioheterotrofos son aquellos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía. Estos organismos son los animales, protozoos, hongos y casi todas las bacterias. Las vías utilizadas por los quimioheterotrofos para la oxidación de compuestos orgánicos y la conservación de la energía en ATP se pueden dividir en dos grupos: 1.- Fermentación: cuando las reacciones redox ocurren en ausencia de cualquier aceptor terminal de electrones. 2.- Respiración: cuando se utiliza el oxígeno molecular o algún otro agente oxidante como aceptor terminal de electrones. Aeróbica: oxígeno; Anaeróbica: Nitrato, Sulfato, Fumarato, Oxido de Trimetilamina.

Fermentación Existen muchos tipos de fermentaciones pero en todas ellas sólo ocurre una oxidación parcial de los átomos de carbono del compuesto orgánico y por lo tanto sólo se produce una pequeña parte de la energía disponible. La oxidación en una fermentación está acoplada a la reducción de un compuesto orgánico generado a partir del catabolismo del sustrato inicial, por lo que no son necesarios aceptores externos de electrones. El ATP en la fermentación se produce a partir de la fosforilación a nivel de sustrato. Como consecuencia de la no participación de un aceptor externo de electrones, el sustrato orgánico experimenta una serie de reacciones oxidativas y reductoras equilibradas; los piridín nucleótidos reducidos en un paso del proceso son oxidados en otro. Este principio general se ilustra en dos fermentaciones: la fermentación alcohólica (típica del metabolismo anaeróbico de la glucosa por levaduras) y la fermentación homoláctica (típica del metabolismo de algunas bacterias lácticas). Ambos procesos fermentativos utilizan la ruta Embden-Meyerhof: las dos moléculas de NAD reducidas por esta ruta se reoxidan en reacciones que implican un ulterior metabolismo del piruvato. En el caso de la fermentación homoláctica, esta oxidación ocurre como consecuencia directa de la reducción del ácido pirúvico a ácido

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láctico. En el caso de la fermentación alcohólica, el ácido pirúvico se descarboxila primero para formar acetaldehído y la reoxidación del NADH ocurre en paralelo con la reducción del acetaldehído para formar etanol. Las bacterias pueden producir productos fermentativos finales distintos al ácido láctico y al etanol debido a las diferencias en el metabolismo del ácido pirúvico. Estos productos finales pueden ser ácido fórmico, 2,3 butanodiol, isopropanol, ácido butírico, butanol. La mayor parte de las fermentaciones bacterianas pueden originar varios productos finales, pero ninguna fermentación da lugar a todos los productos finales. R esultados de la fermentación de la glucosa . El resultado final de la glicolisis es el consumo de glucosa, la síntesis de 2 ATP y la producción de productos de fermentación. Para el organismo el producto más importante es el ATP y los productos de la fermentación son productos de desecho. Sin embargo, estos productos son muy importantes para el cervecero, panadero, quesero. La fermentación anaeróbica de glucosa por levaduras produce etanol que es el producto principal de las bebidas alcohólicas, y la producción de ácido láctico es el paso inicial en la producción de productos lácteos fermentados incluyendo el queso. Para los panaderos, la producción de CO2 por la fermentación de levaduras es el paso esencial en el esponjamiento del pan. El efecto Pasteur se produce en microorganismos capaces de realizar metabolismo fermentador y respiración aerobia (anaerobios facultativos). En presencia de O2 utilizan la respiración aeróbica, pero pueden emplear la fermentación si no hay O2 libre en su medio ambiente. Pasteur fué el primero en observar que el azúcar es convertido en alcohol y CO2 por levaduras en ausencia de aire, y que en presencia de aire se forma muy poco o nada de alcohol, siendo el CO2 el principal producto final de esta reacción aeróbica. Este efecto indica el mayor rendimiento energético de la respiración sobre la fermentación. Respiración aeróbica (Rutas de utilización del piruvato por aerobios) La glucosa, tanto en el metabolismo respiratorio como en el fermentativo, se transforma en ácido pirúvico por una de las siguientes rutas: 

Embden-Meyerhof (eucariotas y procariotas)

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

Pentosa fosfato (eucariotas y procariotas)



Entner Doudoroff (sólo en ciertos procariotas como alternativa a la ruta Embden-Meyerhof)

Embden-Meyerhof

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En t n e r D o u d o r o f f

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En la mayor parte de los aerobios, el piruvato sufre una descarboxilación oxidativa catalizada por un sistema enzimático llamado complejo piruvato deshidrogenasa que produce acetilcoenzima A (acetil-CoA). El acetil-CoA es un metabolito precursor que puede entrar en rutas biosintéticas; alternativamente, puede ser oxidado completamente a CO2 a través de una ruta conocida como ciclo de Krebs o ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). Este ciclo es la principal vía de generación de ATP en los heterotrofos aeróbicos (por paso de electrones a través de una cadena transportadora de electrones desde los piridín nucleótidos reducidos). El ciclo TCA genera además tres metabolitos precursores, a-cetoglutarato, succinil-CoA y oxalacetato. El ciclo TCA efectúa la oxidación completa de una molécula de ácido acético a CO2, produce tres moléculas de piridín nucleótidos reducidos, una molécula de ATP y una molécula de FAD reducido (flavoproteína que cede electrones a una cadena de transporte independiente de piridín nucleótidos). Reacciones anapleróticas. El ciclo TCA, además de oxidar el acetil CoA (dentro del ciclo) genera metabolitos precursores que son utilizados en la biosíntesis (fuera del ciclo), por lo que requiere un aporte de ácido oxalacético que reponga el utilizado en la síntesis de los metabolitos precursores. Estas reacciones de síntesis de oxalacético se denominan anapleróticas y fundamentalmente consisten en reacciones que carboxilan el piruvato o el fosfoenolpiruvato para obtener oxalacetato. Como resultado, el carbono procedente del piruvato entra en el ciclo por dos rutas: vía acetil-CoA y vía piruvato o fosfoenolpiruvato. Ciclo del glioxilato. Durante la oxidación de ácido acético o ácidos grasos que se convierten en acetil-CoA sin la formación intermedia de piruvato, ocurre una modificación especial del ciclo TCA conocida como ciclo del glioxilato. Bajo estas circunstancias no puede generarse oxalacetato a partir de piruvato o fosfoenolpiruvato (anapleróticas) ya que en los microorganismos aeróbicos no existe un mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetato. El oxalacetato requerido para la oxidación del acetato se repone mediante la oxidación de succinato y malato, que se produce por una secuencia de dos reacciones. En la primera reacción el isocitrato, que es un intermediario normal del ciclo TCA, se rompe para dar succinato y glioxilato. En la segunda reacción el acetil-CoA se condensa con el glioxilato para formar malato, el precursor inmediato del oxalacetato. Así, el ciclo del glioxilato actúa como una secuencia anaplerótica que permite el funcionamiento normal del ciclo TCA. Balance energético de la respiración aeróbica . El TCA produce la

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completa oxidación del ácido pirúvico en 3 moléculas de CO2 con la producción de 4 moléculas de NADH y una molécula de FADH. El NADH y FADH pueden ser reoxidados a través del sistema de transporte de electrones originando 3 moléculas de ATP por NADH y 2 moléculas de ATP por FADH. También se produce una molécula de ATP por fosforilación a nivel de sustrato en la oxidación de acetoglutarato a succinato. En total suman 15 moléculas de ATP por ciclo. Como por cada molécula de glucosa se originan 2 moléculas de ácido pirúvico, en total serían 30 moléculas de ATP. A estos hay que añadir las 2 moléculas de ATP formadas en la glicolisis y los 2 NADH que en presencia de O2 pueden ser reoxidados en el transporte de electrones originando 6 moléculas de ATP. En total son 38 ATP por cada molécula de glucosa que contrastan con los 2 ATP producidos en la fermentación. 4.5

Mecanismos de obtención de energía por microorganismos autótrofos A diferencia de lo que ocurre en los heterotrofos las reacciones de mantenimiento de los autotrofos, que obtienen su carbono celular del CO2, tienen lugar en dos fases bioquímicas distintas: 1.- Síntesis de metabolitos precursores 2.- Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos

Síntesis de metabolitos precursores: Ciclo de Calvin-Benson Este ciclo es compartido por la mayoría de los fotoautotrofos y los quimioautotrofos. La mayor parte de los autotrofos (aunque hay excepciones) fijan el CO2 mediante una reacción catalizada por el enzima ribulosa difosfato carboxilasa que convierte la ribulosa 1,5difosfato en ácido 3-fosfoglicérico, a partir del cual se sintetizan todos los metabolitos precursores. Sin embargo, la fijación de CO2 depende de la disponibilidad de ribulosa difosfato. Por consiguiente, parte del ácido fosfoglicérico debe de utilizarse para regenerar este aceptor de CO2 (Ribulosa difosfato). El ciclo de Calvin-Benson puede dividirse en 3 fases: 1.- Fijación de CO2 2.- Reducción del CO2 fijado 3.- Regeneración del aceptor de CO2 El ciclo de Calvin-Benson, en lugar de producir ATP y reducir piridín

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nucleótidos, los consume. En los autotrofos tales compuestos se sintetizan por otros mecanismos. Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos A.- Quimioautotrofos Los quimioautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la oxidación de compuestos inorgánicos. Los substratos que pueden servir como fuente de energía son H2, CO, H3N, NO2-, Fe2+ y compuestos reducidos de azufre (H2S, S, S2O3-). En este tipo de metabolismo respiratorio, los electrones de estos compuestos pasan a través de una cadena de transporte de electrones que genera ATP por el modo que opera en los heterotrofos (fosforilación oxidativa). El aceptor terminal de electrones de la cadena de los quimioautotrofos es normalmente el O2. Algunos de estos substratos inorgánicos (H2 y CO) son agentes reductores suficientemente potentes como para reducir directamente a los piridín nucleótidos, pero otros no lo son. Estos agentes reductores débiles (NO2- y Fe2+) reducen los piridín nucleótidos por un proceso llamado transporte inverso de electrones; en el cual parte de la fuerza motora de protones generada en el funcionamiento de la cadena normal de transporte de electrones se utiliza para impulsar electrones en una dirección inversa, que de otro modo sería termodinámicamente desfavorable, a través de otra cadena que une el sustrato inorgánico con los piridín nucleótidos oxidados que resultan por ello reducidos. B.- Fotoautotrofos Los fotoautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la fotofosforilación, proceso por el que los organismos fototrofos convierten la energía radiante de la luz en energía metabólica y poder reductor. Existen dos tipos de fotosíntesis, la oxigénica y la anoxigénica. Fotosíntesis oxigénica: La generación de ATP y poder reductor se lleva a cabo en dos centros de reacción fotoquímica diferentes llamados fotosistema I (PSI) y fotosistema II (PSII), los cuales contienen clorofila y se localizan en las membranas de los tilacoides. Estos dos fotosistemas actúan de una manera conjunta en cianobacterias, algas y plantas. i) Cuando la luz es absorbida por las moléculas de clorofila existentes en el PSI, éstas moléculas de clorofila se fotoactivan lo que les permite oxidarse. Los electrones eliminados de las moléculas de clorofila del PSI son aceptados por el NADP reduciéndose a NADPH2. Todo esto deja a las moléculas de clorofila del PSI temporalmente deficientes en electrones lo que les confiere una carga positiva. ii) De la misma manera, la luz absorbida

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por las moléculas de clorofila existentes en el PSII provoca que un electrón sea eliminado de cada molécula. Estos electrones pasan a través de un sistema transportador de electrones hasta que llegan al PSI donde son aceptados por las moléculas de clorofila deficientes en electrones que se reducen. Este sistema transportador de electrones es parecido al descrito en la fosforilación oxidativa, utilizándose la energía liberada para la síntesis de ATP. La diferencia radica en que el donador primario de electrones es la clorofila del PSII y el aceptor terminal de electrones es la clorofila del PSI (NADH2 y O2 respectivamente en la fosforilación oxidativa). iii) En este punto la clorofila del PSII es deficiente en electrones. Sin embargo, esta clorofila es un fuerte agente oxidante que obtiene los electrones necesarios para reducirse de las moléculas de H2O. Esta oxidación del H2O genera oxígeno gaseoso. Las cianobacterias, algas y plantas son organismos que generan oxígeno mediante la fotosíntesis oxigénica, siendo los responsables de la producción mayoritaria del oxígeno que existe en la atmósfera terrestre. La atmósfera de la primitiva Tierra no contenía oxígeno hasta que se desarrollaron las cianobacterias hace entre 1000 y 3000 millones de años. El desarrollo de los organismos aerobios sólo fué posible después de que se acumularan en la atmósfera apreciables cantidades de O2 (generado mediante la fotosíntesis oxigénica de las cianobacterias). Fotosíntesis anoxigénica: Los fototrofos anoxigénicos convierten la energía de la luz en energía química necesaria para el crecimiento; sin embargo, y al contrario que las plantas, algas y cianobacterias en este proceso de transformación de la energía no se produce oxígeno y por ello se le llama fotosíntesis anoxigénica. Otra diferencia es que los fototrofos anoxigénicos contienen un tipo de clrofila, bacterioclorofila, diferente a la clorofila de las plantas. Estas bacterias contienen además carotenoides, pigmentos encargados de la absorción de la energía de la luz y posterior transmisión a la bacterioclorofila. El color de estos pigmentos son los que le dan el nombre a estas bacterias: bacterias rojas y bacterias verdes. En las cianobacterias estos pigmentos captadores de luz son las ficobilinas, de ahí su nombre: bacterias azules (cianobacterias). En las bacterias rojas y bacterias verdes sólo existe un fotosistema, de tal manera que la energía absorbida de la luz se utiliza para transportar un electrón desde la clorofila a la cadena de transporte de electrones que finalmente cede el electrón a la misma clorofila. En esta cadena de transporte de electrones se genera la energía necesaria para sintetizar ATP. Sin embargo, el transporte de electrones es cíclico (el donador primario de electrones y el aceptor terminal de electrones es la misma clorofila) no existiendo por lo tanto reducción de NADP a NADPH. Esta reducción se lleva a cabo mediante transporte inverso de electrones gracias a los electrones donados por el hidrógeno

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gaseoso (H2) o el sulfuro de hidrógeno (H2S). En cualquier caso nunca se produce O2.

4.6

Biosíntesis La célula es una excelente "industria química" encargada de ensamblar las intrincadas moléculas de la vida. Muchas de estas sustancias químicas "fabricadas" por las células son tan complejas que todavía no han podido ser sintetizadas artificialmente por los químicos en el laboratorio. Sin embargo, las bacterias pueden sintetizarlas a partir de los nutrientes y a temperatura ambiente. Estas sustancias son: 1.- Sustancias nitrogenadas, incluyendo proteínas (como son los enzimas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA). 2.- Carbohidratos, donde se incluyen polisacáridos complejos como es la parte correspondiente del peptidoglucano de la pared celular. 3.- Fosfolípidos, los cuales son componentes importantes de la membrana citoplásmica.

4.6.1

Sustancias nitrogenadas A.-

Proteínas

El ácido glutámico es el aminoácido más importante a partir del cual las bacterias sintetizan otros aminoácidos. En Escherichia coli el ácido glutámico se obtiene por reducción aminada del ácido acetoglutárico. Este ácido glutámico se puede transformar en otros aminoácidos por dos mecanismos:

Transaminación: el grupo amino del ácido glutámico se intercambia por un átomo de oxígeno de diversos ácidos orgánicos convirtiéndolos en aminoácidos. Por ejemplo, la síntesis de alanina a partir de la transaminación del ácido pirúvico: Acido glutámico (-NH2) + Acido pirúvico (=O) --------> Acido a-cetoglutárico

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(=O) + Alanina (-NH2)

Alteración de la estructura molecular : la otra vía por la cual el ácido glutámico se utiliza para sintetizar otros aminoácidos es alterando su estructura molecular. Estos cambios estructurales requieren energía en forma de ATP. Un ejemplo es la síntesis de prolina:

Acido glutámico + ATP + NADH2 --------> Semialdehido del ácido glutámico + ADP + P + NAD --------> H2O + Pirrolina-5-ácido carboxílico + NADPH2 -------> Prolina + NAD

Una vez sintetizados, estos aminoácidos deben activarse para así poder ser utilizados en la síntesis de proteínas. Las células activan los aminoácidos usando la energía del ATP de la siguiente manera: Aminoácido + ATP --------> Aminoácido-AMP + Pirofosfato

La síntesis de proteínas se verá en capítulos posteriores. B.- Acidos nucleicos Los aminoácidos son utilizados también por las células para sintetizar nucleótidos (bloques constituyentes de los ácidos nucleicos). Existen dos tipos de nucleótidos según el azúcar que contengan:  

Ribonucleótidos: ribosa; síntesis de RNA Deoxiribonucleótidos: deoxiribosa; síntesis de DNA

Estos nucleótidos también se clasifican en dos grupos según la base nitrogenada que contengan: Purinas: adenina o guanina Pirimidinas: citosina, timina o uracilo En la biosíntesis de las purinas se requieren los aminoácidos glicina, aspártico y glutamina además de energía en forma de ATP y GTP (guanosina trifosfato). En la biosíntesis de las pirimidinas se requieren los aminoácidos glutamina y ácido aspártico así como

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energía en forma de ATP. En ambos casos la ribosa fosfato se obtiene a partir de glucosa. Una vez que se han sintetizado los nucleótidos, éstos se activan por ATP. En este proceso el nucleótido, que ya contiene un grupo fosfato, adquiere otros dos grupos fosfato. Por ejemplo, la guanosina monofosfato se activa a guanosina trifosfato: GMP + 2 ATP --------> GTP + 2 ADP

El ATP, además de ser una molécula que intercambia energía, es la forma activa de un nucleótido, la adenosina monofosfato (AMP), que se utiliza para sintetizar ácidos nucleicos. La biosíntesis de DNA y RNA a partir de los nucleótidos activados la veremos en capítulos posteriores Carbohidratos Los microorganismos sintetizan carbohidratos mediante diferentes mecanismos según sean autotrofos (CO2) o heterotrofos (compuestos orgánicos como la glucosa) a partir de los cuales obtienen los diferentes monosacáridos. Estos monosacáridos deben ser activados para poder ser ensamblados en los polisacáridos correspondientes. Por ejemplo, la forma activada de la glucosa es uridin difosfato glucosa (UDP-Glucosa) y la fuente de energía usada es ATP y UTP: Glucosa + ATP + UTP --------> UDP-Glucosa + ADP + Pirofosfato

Biosíntesis del peptidoglucano de la pared celular : La síntesis de los polisacáridos bacterianos se puede ilustrar mediante la biosíntesis del peptidoglucano. Si bien este peptidoglucano está localizado en la pared celular, la mayoría de la energía utilizada en este proceso biosintético se consume dentro de la célula. Los distintos pasos involucrados en este proceso se sumarizan en: (i)

A partir de glucosa y utilizando ATP y UTP se obtiene Nacetilglucosamina-UDP (NAG-UDP).

(ii)

Algunas de estas moléculas de NAG-UDP se utilizan para obtener N-acetilmurámico-UDP (NAM-UDP). La energía requerida en este paso se obtiene a partir del fosfoenolpirúvico.

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(iii)

A cada molécula de NAM-UDP se le unen 5 aminoácidos para formar una cadena pentapeptídica. La adición de cada aminoácido requiere energía en forma de ATP.

(iv)

El grupo UDP del NAM-pentapéptido-UDP se reemplaza por un lípido llamado lípido transportador.

(v)

A este NAM-pentapéptido-lípido transportador se le une una molécula de NAG-UDP para formar una unidad completa activada que se insertará en la cadena de peptidoglucano.

(vi)

Esta unidad completa activada se transporta, con la ayuda del lípido transportador, a través de la membrana hacia la pared celular.

(vii)

Una vez en la pared celular, esta unidad completa activada se une a una cadena de peptidoglucano alargándose esta cadena en una unidad.

(viii)

El último paso es la unión de esta cadena a otras cadenas para formar la malla del peptidoglucano que constituye la estructura de la pared celular. Esta unión se inicia con la eliminación del quinto aminoácido de la cadena pentapeptídica, reacción catalizada por el enzima transpeptidasa. La rotura de este enlace libera energía que es utilizada por la transpeptidasa para unir los tetrapéptidos de dos cadenas distintas (el tercer aminoácido de una con el cuarto aminoácido de otra).

Lípidos Los lípidos más importantes de las células bacterianas son los fosfolípidos que, junto con las proteínas, forman la estructura de la membrana citoplásmica. La vía general por la cual los microorganismos sintetizan fosfolípidos comienza a partir de glucosa (6C) que a través de la glucolisis se oxida originando dos moléculas de ácido pirúvico (3C) que a su vez se descarboxila a acetil-CoA (2C); este acetil-CoA puede carboxilarse para formar malonil-CoA (3C). Esta última reacción consume energía en forma de ATP: Acetil-CoA + CO2 + ATP --------> Malonil-CoA + ADP + P

El acetil-CoA y malonil-CoA son las formas activas del ácido acético y malónico respectivamente las cuales se utilizan para sintetizar ácidos grasos de cadena larga:

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(2C) Acetil-CoA + (3C) Malonil-CoA --------> Acetil-proteína + Malonil proteína --------> (4C) Butiril-proteína + CO2 --------> + Malonil-proteína -------> (6C)-proteína + CO2 --------> + Malonil-proteína --------> --------> --------> -------> --------> (16C ó 18C)-proteína + CO2

Una vez formados los ácidos grasos de cadena larga, éstos se utilizan para sintetizar los fosfolípidos. Para ello se necesita además glicerol fosfato, compuesto que se obtiene por reducción de la dihidroxiacetona fosfato que es un intermediario en la glucolisis. A cada molécula de glicerol fosfato se le unen dos moléculas de ácidos grasos de cadena larga para formar una molécula de ácido fosfatídico que es un fosfolípido sencillo a partir del cual se sintetizan otros fosfolípidos mediante la unión de otros grupos químicos al grupo fosfato. Por ejemplo, el aminoácido serina se puede adiccionar al ácido fosfatídico para formar fosfatidilserina. La energía que se requiere en esta reacción se obtiene a partir de la citidina trifosfato (CTP):

Acido fosfatídico + CTP + Serina --------> Fosfatidilserina + CMP + Pirofosfato

4.7

Mecanismos de obtención de energía por microorganismos quimioheterotrofos Como ya hemos dicho, los organismos quimioheterotrofos son aquellos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía. Estos organismos son los animales, protozoos, hongos y casi todas las bacterias. Las vías utilizadas por los quimioheterotrofos para la oxidación de compuestos orgánicos y la conservación de la energía en ATP se pueden dividir en dos grupos:

1.- Fermentación: cuando las reacciones redox ocurren en ausencia de cualquier aceptor terminal de electrones. 2.- Respiración: cuando se utiliza el oxígeno molecular o algún otro agente oxidante como aceptor terminal de electrones. Aeróbica:

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oxígeno; Anaeróbica: Trimetilamina.

Nitrato,

Sulfato,

Fumarato,

Oxido

de

Fermentación Existen muchos tipos de fermentaciones pero en todas ellas sólo ocurre una oxidación parcial de los átomos de carbono del compuesto orgánico y por lo tanto sólo se produce una pequeña parte de la energía disponible. La oxidación en una fermentación está acoplada a la reducción de un compuesto orgánico generado a partir del catabolismo del sustrato inicial, por lo que no son necesarios aceptores externos de electrones. El ATP en la fermentación se produce a partir de la fosforilación a nivel de sustrato. Como consecuencia de la no participación de un aceptor externo de electrones, el sustrato orgánico experimenta una serie de reacciones oxidativas y reductoras equilibradas; los piridín nucleótidos reducidos en un paso del proceso son oxidados en otro. Este principio general se ilustra en dos fermentaciones: la fermentación alcohólica (típica del metabolismo anaeróbico de la glucosa por levaduras) y la fermentación homoláctica (típica del metabolismo de algunas bacterias lácticas). Ambos procesos fermentativos utilizan la ruta Embden-Meyerhof: las dos moléculas de NAD reducidas por esta ruta se reoxidan en reacciones que implican un ulterior metabolismo del piruvato. En el caso de la fermentación homoláctica, esta oxidación ocurre como consecuencia directa de la reducción del ácido pirúvico a ácido láctico. En el caso de la fermentación alcohólica, el ácido pirúvico se descarboxila primero para formar acetaldehído y la reoxidación del NADH ocurre en paralelo con la reducción del acetaldehído para formar etanol. Las bacterias pueden producir productos fermentativos finales distintos al ácido láctico y al etanol debido a las diferencias en el metabolismo del ácido pirúvico. Estos productos finales pueden ser ácido fórmico, 2,3 butanodiol, isopropanol, ácido butírico, butanol. La mayor parte de las fermentaciones bacterianas pueden originar varios productos finales, pero ninguna fermentación da lugar a todos los productos finales. Resultados de la fermentación de la glucosa . El resultado final de la glicolisis es el consumo de glucosa, la síntesis de 2 ATP y la producción de productos de fermentación. Para el organismo el producto más importante es el ATP y los productos de la fermentación son productos de desecho. Sin embargo, estos productos son muy importantes para el cervecero, panadero, quesero. La fermentación anaeróbica de glucosa por levaduras

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produce etanol que es el producto principal de las bebidas alcohólicas, y la producción de ácido láctico es el paso inicial en la producción de productos lácteos fermentados incluyendo el queso. Para los panaderos, la producción de CO2 por la fermentación de levaduras es el paso esencial en el esponjamiento del pan. El efecto Pasteur se produce en microorganismos capaces de realizar metabolismo fermentador y respiración aerobia (anaerobios facultativos). En presencia de O2 utilizan la respiración aeróbica, pero pueden emplear la fermentación si no hay O2 libre en su medio ambiente. Pasteur fué el primero en observar que el azúcar es convertido en alcohol y CO2 por levaduras en ausencia de aire, y que en presencia de aire se forma muy poco o nada de alcohol, siendo el CO2 el principal producto final de esta reacción aeróbica. Este efecto indica el mayor rendimiento energético de la respiración sobre la fermentación. Respiracion aerobica (Rutas de utilización del piruvato por aerobios) La glucosa, tanto en el metabolismo respiratorio como en el fermentativo, se transforma en ácido pirúvico por una de las siguientes rutas: a) Embden-Meyerhof (eucariotas y procariotas) b) Pentosa fosfato (eucariotas y procariotas) c) Entner Doudoroff (sólo en ciertos procariotas como alternativa a la ruta Embden-Meyerhof)

En la mayor parte de los aerobios, el piruvato sufre una descarboxilación oxidativa catalizada por un sistema enzimático llamado complejo piruvato deshidrogenasa que produce acetilcoenzima A (acetil-CoA). El acetil-CoA es un metabolito precursor que puede entrar en rutas biosintéticas; alternativamente, puede ser oxidado completamente a CO2 a través de una ruta conocida como ciclo de Krebs o ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). Este ciclo es la principal vía de generación de ATP en los heterotrofos aeróbicos (por paso de electrones a través de una cadena transportadora de electrones desde los piridín nucleótidos reducidos). El ciclo TCA genera además tres metabolitos precursores, a-cetoglutarato, succinil-CoA y oxalacetato. El ciclo TCA efectúa la oxidación completa de una molécula de ácido acético a CO2, produce tres moléculas de piridín nucleótidos reducidos, una molécula de ATP y una molécula de

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FAD reducido (flavoproteína que cede electrones a una cadena de transporte independiente de piridín nucleótidos). Reacciones anapleróticas. El ciclo TCA, además de oxidar el acetil CoA (dentro del ciclo) genera metabolitos precursores que son utilizados en la biosíntesis (fuera del ciclo), por lo que requiere un aporte de ácido oxalacético que reponga el utilizado en la síntesis de los metabolitos precursores. Estas reacciones de síntesis de oxalacético se denominan anapleróticas y fundamentalmente consisten en reacciones que carboxilan el piruvato o el fosfoenolpiruvato para obtener oxalacetato. Como resultado, el carbono procedente del piruvato entra en el ciclo por dos rutas: vía acetil-CoA y vía piruvato o fosfoenolpiruvato. Ciclo del glioxilato. Durante la oxidación de ácido acético o ácidos grasos que se convierten en acetil-CoA sin la formación intermedia de piruvato, ocurre una modificación especial del ciclo TCA conocida como ciclo del glioxilato. Bajo estas circunstancias no puede generarse oxalacetato a partir de piruvato o fosfoenolpiruvato (anapleróticas) ya que en los microorganismos aeróbicos no existe un mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetato. El oxalacetato requerido para la oxidación del acetato se repone mediante la oxidación de succinato y malato, que se produce por una secuencia de dos reacciones. En la primera reacción el isocitrato, que es un intermediario normal del ciclo TCA, se rompe para dar succinato y glioxilato. En la segunda reacción el acetil-CoA se condensa con el glioxilato para formar malato, el precursor inmediato del oxalacetato. Así, el ciclo del glioxilato actúa como una secuencia anaplerótica que permite el funcionamiento normal del ciclo TCA. Balance energético de la respiración aeróbica. El TCA produce la completa oxidación del ácido pirúvico en 3 moléculas de CO2 con la producción de 4 moléculas de NADH y una molécula de FADH. El NADH y FADH pueden ser reoxidados a través del sistema de transporte de electrones originando 3 moléculas de ATP por NADH y 2 moléculas de ATP por FADH. También se produce una molécula de ATP por fosforilación a nivel de sustrato en la oxidación de acetoglutarato a succinato. En total suman 15 moléculas de ATP por ciclo. Como por cada molécula de glucosa se originan 2 moléculas de ácido pirúvico, en total serían 30 moléculas de ATP. A estos hay que añadir las 2 moléculas de ATP formadas en la glicolisis y los 2 NADH que en presencia de O2 pueden ser reoxidados en el transporte de electrones originando 6 moléculas de ATP. En total son 38 ATP por cada molécula de glucosa que contrastan con los 2 ATP producidos en la fermentación

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4.8

Mecanismos de obtencion de energia por microorganismos autotrofos A diferencia de lo que ocurre en los heterotrofos las reacciones de mantenimiento de los autotrofos, que obtienen su carbono celular del CO2, tienen lugar en dos fases bioquímicas distintas: 1.- Síntesis de metabolitos precursores 2.- Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos

Síntesis de metabolitos precursores: Ciclo de Calvin-Benson Este ciclo es compartido por la mayoría de los fotoautotrofos y los quimioautotrofos. La mayor parte de los autotrofos (aunque hay excepciones) fijan el CO2 mediante una reacción catalizada por el enzima ribulosa difosfato carboxilasa que convierte la ribulosa 1,5difosfato en ácido 3-fosfoglicérico, a partir del cual se sintetizan todos los metabolitos precursores. Sin embargo, la fijación de CO2 depende de la disponibilidad de ribulosa difosfato. Por consiguiente, parte del ácido fosfoglicérico debe de utilizarse para regenerar este aceptor de CO2 (Ribulosa difosfato). El ciclo de Calvin-Benson puede dividirse en 3 fases: 1.- Fijación de CO2 2.- Reducción del CO2 fijado 3.- Regeneración del aceptor de CO2

El ciclo de Calvin-Benson, en lugar de producir ATP y reducir piridín nucleótidos, los consume. En los autotrofos tales compuestos se sintetizan por otros mecanismos.

Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos Los quimioautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la oxidación de compuestos inorgánicos. Los substratos que pueden servir como fuente de energía son H2, CO, H3N, NO2-, Fe2+ y compuestos reducidos de azufre (H2S, S, S2O3-). En este tipo de metabolismo respiratorio, los electrones de estos compuestos pasan a través de una cadena de transporte de electrones que genera ATP por el modo que opera en los heterotrofos (fosforilación oxidativa). El

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aceptor terminal de electrones de la cadena de los quimioautotrofos es normalmente el O2. Algunos de estos substratos inorgánicos (H2 y CO) son agentes reductores suficientemente potentes como para reducir directamente a los piridín nucleótidos, pero otros no lo son. Estos agentes reductores débiles (NO2- y Fe2+) reducen los piridín nucleótidos por un proceso llamado transporte inverso de electrones; en el cual parte de la fuerza motora de protones generada en el funcionamiento de la cadena normal de transporte de electrones se utiliza para impulsar electrones en una dirección inversa, que de otro modo sería termodinámicamente desfavorable, a través de otra cadena que une el sustrato inorgánico con los piridín nucleótidos oxidados que resultan por ello reducidos.

4.9

Relaciones de las bacterias con el oxígeno Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos, que acabamos de estudiar. Veamos los tipos de bacterias según sus relaciones con el oxígeno: Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química. Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como microaerófilas. 

Algunas microaerófilas lo son permanentemente (microaerófilas estrictas).



Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando crecen usando determinadas fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas condicionales).

Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia

de oxígeno, debido a que pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno, o porque poseen metabolismo estrictamente fermentativo. Anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa, peroxidasa y SOD, y por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes del oxígeno.(Por ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueobacterias metanogénicas). Anaerobias aerotolerantes (= aerodúricas ): Al igual que las anteriores, presentan un metabolismo energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores. Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como

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Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama

anaerobios indiferentes. Lectura completaría Anexo 1

CRECIMIENTO MICROBIANO Dr. Pedro F. Mateos Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia. Universidad de Salamanca

I.- TIEMPO DE GENERACION II.- CURVA DE CRECIMIENTO III.- CRECIMIENTO SINCRONICO IV.- CULTIVO CONTINUO V.- DETERMINACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO VI.- EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO • • • •

Temperatura pH Agua Oxígeno

I.- TIEMPO DE GENERACION Las principales reacciones de la síntesis celular son reacciones de polimerización, proceso por el cual los polímeros (macromoléculas) se sintetizan a partir de monómeros: síntesis de DNA, RNA y proteínas; que una vez sintetizadas se ensamblan formando las estructuras celulares tales como la envuelta celular, flagelos, ribosomas, cuerpos de inclusión, etc. En la mayor parte de los microorganismos este crecimiento continúa hasta que las células se dividen en dos nuevas células. El tiempo que requiere una célula para completar su ciclo es muy variable y depende de factores nutricionales y genéticos. El intervalo que transcurre en la formación de dos células a partir de una célula se llama generación y el tiempo requerido para esto es el tiempo de generación.

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Cálculo del tiempo de generación Tiempo de generación (G) es el tiempo requerido para que una célula se divida o una población se duplique. t G = ----n

Si partimos de una célula al cabo de una generación habrá duplicado su número y así sucesivamente en cada generación. Como se puede comprobar el crecimiento se produce en progresión geométrica: 1 generación -------------> 2 células = 21 2 generaciones -------------> 4 células = 22 3 generaciones -------------> 8 células = 23 4 generaciones -------------> 16 células = 24 5 generaciones -------------> 32 células = 25 Si partimos de N células (en microbiología los estudios se realizan con poblaciones), a un tiempo determinado (Ta) tenemos un número de células determinadas (Na). En la primera generación se duplicará el número de células (2Na) y así sucesivamente de tal manera que al cabo de un tiempo determinado Tb el número de células determinadas será Nb (Nb = 2n Na) donde n es el número de generaciones transcurridas de sde Ta hasta Tb. En esta fórmula (Nb = 2n Na) conocemos todos los parámetros excepto el número n de generaciones transcurridas por lo que aplicando logaritmos será posible calcularlo. Una vez obtenido el número de generaciones n transcurridas en un tiempo t podremos calcular el tiempo de generación G para ese microorganismo. Ta -------------> Na 1 generación -------------> 2Na = 21 Na 2 generaciones -------------> 4Na = 22 Na 3 generaciones -------------> 8Na = 23 Na 4 generaciones -------------> 16Na = 24 Na 5 generaciones -------------> 32Na = 25 Na n generaciones (Tb) -------------> Nb = 2n Na

Nb = 2n Na

lg Nb = n lg 2 + lg Na l g Nb - l g Na n = --- --- --- --- --- --- --- --lg 2 l g Nb / Na n = -- -- -- -- -- -- -- --

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lg 2 Nb n = 3, 3 l g - - - - - - - Na t G = -- -- -- -- -- -- -- -- -- -3, 3 l g Nb / Na

El tiempo de generación de la levadura Saccharomyces cerevisiae es de 90 minutos y el de la bacteria Escherichia coli es 20 minutos. Esta bacteria tiene un crecimiento muy rápido de tal manera que a partir de una sóla célula se obtienen al cabo de 8 horas (8 x 60 = 480 minutos; 480 : 20 = 24 generaciones; 224 = 2 x 106 células) 2 millones de células. Esta misma bacteria al cabo de dos días se habría multiplicado hasta 2,2 x 1043 células. Una bacteria pesa aproximadamente 10-15 - 10-11 gramos por lo que el peso de todas estas células es de aproximadamente 2,2 x 1030 gramos que equivalen a 8 veces el peso de la Tierra.

II.- CURVA DE CRECIMIENTO Es la representación gráfica del logaritmo del número de células frente al tiempo. La curva teórica sería una recta pues los microorganismos estarían creciendo constantemente pero en la práctica la curva presenta distintas fases: •

•

•

•

Fase de latencia: período de adaptación de un microorganismo a un nuevo medio de cultivo. Fase exponencial o logarítmica: aumento regular de la población que se duplica a intervalos regulares de tiempo (G). Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por acumulación de productos tóxicos, etc. Fase de declinación o muerte: el número de células que mueren es mayor que el número de células que se dividen.

Las propiedades de un microorganismo dependerán de la fase de la curva en que se encuentren (la producción de antibióticos se lleva a cabo en la fase estacionaria).

III.- CRECIMIENTO SINCRONICO Hasta ahora se ha descrito el modelo de crecimiento de poblaciones bacterianas. Estos estudios no permiten concluir nada sobre el tipo de crecimiento de las distintas células ya que en la mayoría de los cultivos bacterianos el tamaño celular está distribuido al azar. Para

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obtener información sobre el tipo de crecimiento de las distintas bacterias debe recurrirse a los cultivos sincrónicos, es decir, cultivos en los que todos los individuos de una población están en la misma etapa del ciclo celular. Esto se puede conseguir por diversas técnicas:

Inducción: cambios repetitivos de temperatura o suministrando nutrientes. Selección: filtración o centrifugación diferencial. Una curva de crecimiento sincrónico es del siguiente tipo: el número de células del cultivo permanece aproximadamente constante durante el tiempo en el que las células recién formadas aumentan de tamaño; luego, el número de células se duplica de manera brusca.

IV.- CULTIVO CONTINUO Consiste en mantener la población microbiana en fase exponencial de crecimiento. Se utiliza en fermentaciones industriales que requieren actividad metabólica máxima. Los sistemas de cultivo contínuo pueden hacerse funcionar como quimiostatos o como turbidostatos. En un quimiostato la velocidad de flujo de entrada y salida de nutrientes se mantiene a un valor determinado de tal manera que la velocidad de crecimiento del cultivo queda ajustada a esa velocidad de flujo. En un turbidostato el sistema incluye un dispositivo óptico que regula la turbidez controlando la velocidad de flujo.

V.- DETERMINACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular (grado de actividad bioquímica en relación al tamaño de la población). Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos indirectos. •

Métodos directos: o o o o

•

Recuento del número de células en una cámara Thoma Peso seco celular Determinación de nitrógeno o de proteínas totales Determinación de DNA

Métodos indirectos: o o o o o

Recuento de colonias en placa Recuento sobre filtro de membrana Consumo de oxígeno Liberación de dióxido de carbono Concentración de un enzima constitutivo

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o o o

Decoloración de un colorante Incorporación de precursores radiactivos Medida de la turbidez

VI.- EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO No todos los microorganismos responden de la misma manera a los factores ambientales, lo que para unos puede ser beneficioso para otros es perjudicial.

Temperatura Es de los factores ambientales que más influye en el crecimiento de los microorganismos. Al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de las reacciones enzimáticas hasta una cierta temperatura a la cual las proteínas, DNA y otras macromoléculas son sensibles y se desnaturalizan. Cada microorganismo tiene una temperatura mínima, óptima y máxima de crecimiento. La temperatura óptima siempre está más cerca de la temperatura máxima que de la mínima.

Psicrófilos: temperatura óptima baja (Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes) Mesófilos: temperatura óptima normal (la mayor parte de los organismos) Termófilos: temperatura óptima alta (microorganismos aislados de áreas volcánicas) Termófilos extremos: temperatura óptima muy alta (Thermococcus celer 103° C) pH Debido a que los microorganismos cambian el pH del medio cuando crecen se debe añadir un tampón en el medio para mantener el pH constante. Estos tampones funcionan en un rango de pH por lo que se deben utilizar diferentes tampones dependiendo del pH que se quiera en el medio. Para pH neutros se utiliza el tampón fosfato. Los ambientes naturales tienen un rango de pH que oscila entre 5 y 9. Los microorganismos que crecen a pH inferiores a 5 se denominan acidófilos (Thiobacillus pH: 0,5). Los microorganismos que crecen a pH superiores a 9 se denominan alcalinófilos ( Bacillus pH: 11).

Agua Todos los organismos requieren H2O para vivir. Las sustancias absorben en mayor o menor medida moléculas de H2O que no están disponibles para los organismos. Esta disponibilidad del H2O es lo que se llama potencial de agua (aw) cuyos valores van de 0 a 1. El aw del H2O pura es 1; el aw de los frutos secos es 0,7; el aw de los campos de cultivo se sitúa entre 0,9 y 1,0. Halófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de sales. Osmófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de azúcares.

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Xerófilos: microorganismos que viven en ambientes secos. Oxígeno •

Aerobios o o

Obligados Requieren O2 para crecer (21 %) Facultativos No requieren pero crecen mejor en presencia de O2

•

Micraerófilos Requieren pero a niveles más bajos que los atmosféricos (1 - 15 %)

•

Anaerobios o o

Aerotolerantes No requieren y crecen peor cuando el O2 está presente Obligados La presencia de O2 es letal

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La importancia de ser pequeño  



Relación superficie/volumen favorece a células de menor radio Permite a los procariotas alcanzar mayores tamaños poblacionales en la mayoría de los habitats microbianos, debido a mayor tasa de crecimiento La mayor tasa de crecimiento y el mayor tamaño poblacional permites a estos m.o. causar importantes cambios en los parámetros físicoquímicos de un ecosistema en un tiempo relativamente corto

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Anexo 1 Metabolismo microbiano

Llamamos metabolismo al conjunto de reacciones de un organismo. Para los microorganismos con los que vamos a trabajar, normalmente quimiohetero-(organo)-trofos, podemos hacer el siguiente esquema general del metabolismo:

Los microorganismos son sistemas que necesitan una gran cantidad de energía para mantenerse ordenados. Esta energía se obtiene de la oxidación de compuestos orgánicos reducidos. Los nutrientes proporcionan esos compuestos reducidos y, en el curso de la oxidación, se libera energía (que se acumula en forma de moléculas almacenadoras de energía, especialmente el ATP) y se producen elementos estructurales que servirán para la construcción de nuevas células (crecimiento y diferenciación). Al proceso por el que se obtiene energía y elementos estructurales básicos a partir de nutrientes se le denomina catabolismo y al que utiliza la energía obtenida en el catabolismo para sintetizar nuevos componentes celulares se le denomina anabolismo. Es importante tener en cuenta que aunque se estudie de forma separada el anabolismo y el catabolismo, ambos tipos de procesos ocurren simultáneamente de forma que conforme se van produciendo elementos estructurales y energía en el catabolismo, esos elementos se usan para formar nuevos componentes celulares en procesos anabólicos. A los productos metabólicos generados durante el catabolismo y el anabolismo que tiene lugar durante el crecimiento (trofofase) se les

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denomina metabolitos primarios y su producción es paralela al crecimiento celular. Por el contrario, los productos metabólicos que se acumulan cuando no hay crecimiento sino diferenciación celular (idiofase), se les denomina metabolitos secundarios. En general, puede decirse que los metabolitos secundarios se producen después de que se han producido los primarios; aunque en ciertas condiciones (como en cultivo continuo) se pueden producir simultáneamente. Es conveniente considerar el metabolismo como un flujo de materia reducida que puede oxidarse para la producción de energía o utilizarse para la biosíntesis de nuevos elementos estructurales. No todo el carbono presente en los nutrientes va a oxidarse completamente ya que parte se utilizará para sintetizar nueva biomasa. Por otra parte, no todo el carbono de los nutrientes se utiliza para la producción de biomasa y, por consiguiente, el rendimiento (medido tal y como se describió en otro apartado de estas notas >>>) es siempre inferior a la unidad (en torno al 50% en muchos casos). La oxidación de los nutrientes consiste en la capitación de electrones de un compuesto reducido por parte de un agente oxidante que llamaremos aceptor final de electrones. Este aceptor final puede ser inorgánico: oxígeno (con DG0`= -237 kJ) o NO3- con DG0`= -163 kJ; o compuestos orgánicos tales como el fumarato con DG0`= -86 kJ. Cuanto más negativo sea el valor de DG0`, mayor cantidad de energía se podrá obtener de la oxidación y más eficiente será el proceso. Por esto, puede verse que la oxidación en la que el aceptor final de electrones es el O2 es la que más rendimiento de producción de energía permite. En las páginas siguientes vamos a seguir el proceso de oxidación biológica de una molécula reducida señalando los pasos en los que se produce la liberación de energía. El esquema general del metabolismo se construye en torno al proceso de oxidación de la glucosa. La ecuación general de oxidación de la glucosa es la siguiente: C6H12O6 + 6 O2 ® 6 CO2 + 6 H2O

DG0`= -1330 kJ/mol

En el proceso de oxidación biológica de la glucosa, los productos finales (CO2, H2O y la energía) se producen en sitios diferentes en la célula: el CO2 se produce en reacciones de descarboxilación, mientras que el H2O y la energía se producen principamente en la membrana celualr como resultado de la cadena transportadora de electrones y de la actividad de la ATPasa de membrana. 2.- Catabolismo de la glucosa (glucolisis)

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El catabolismo de la glucosa (compuesto de seis carbonos al que nos referiremos como C6) puede ocurrir por cuatro vías diferentes: (1) Ruta de Embden-Meyerhof (EM). Es la más común en todo tipo de organisos incluyendo hongos filamentosos, levaduras y muchos tipos de bacterias. Esta ruta puede funcionar tanto en condiciones aerobias como en anaerobias y se lleva a cabo por una serie de 10 enzimas citoplásmicas. La mayoría de los pasos de la ruta son reversibles, aunque hay tres (los catalizados por las enzimas hexoquinasa, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa) que son irreversibles. En los procesos anabólicos hay unos desvíos metabólicos para evitar estos pasos irreversibles. El resultado de la ruta EM es el siguiente: Glucosa (C6) + 2ADP + 2NAD+ ® 2 piruvato (C3) + 2ATP + 2NADH + 2H+ Como resultado de esta ruta se obtiene una pequeña cantidad de energía (dos moles de ATP por mol de glucosa) por procesos de fosforilación a nivel de substrato, se obtienen dos moles de NAD reducido (NADH+ H+) y se ha logrado una oxidación parcial del carbono de la glucosa para producir como metabolito final dos moles de piruvato por mol de glucosa catabolizada. (2) Ruta de las Pentosas Fosfato (PF). Esta ruta está presente en muchas bacterias y en la mayoría de los eucariontes. En muchos casos se lleva a cabo simultáneamente a la tura EM descrita antes. Por ejemplo: en levaduras, entre el 10 y el 20% de la glucosa se metaboliza porla ruta PF (el porcentaje puede ser aún mayor en condiciones de crecimiento rápido) y el resto por la EM. La ruta PF funciona en condiciones aerobias y anaerobias y tiene importancia en procesos catabólicos y en anabólicos tales como en la síntesis de nucleótidos y de aminoácidos aromáticos. La ecuación general de la ruta PF es la siguiente: 3 Glucosa-6-fosfato (C6) + 6NADP+ + 3H2O ® 2 fructosa-6-fosfato (C6) + gliceraldehido-3-fosfato (C3) + 3CO2 + 6NADPH + 6H+ Como resultado, no se produce energía, aunque sí ocurre una descarboxilación.La fructosa-6-fosfato y el gliceraldehido-3-fosfato son intermediarios comunes de las rutas EM y PF. Por último, los seis moles de NADPH+ H+ producidos en la ecuación se usan como "poder reductor" en procesos anabólicos. (3) Ruta de Etner-Doudoroff (ED). Es una ruta usada por un número reducido de microorganismos carentes de la ruta EM. La mayoría son bacterias Gramnegativas tales como Pseudomonas, Rhizobium, Xhantomonas, Azotobacter y Zymomonas. La ruta ED es muy rara en hongos. El resultado general de la ruta ED es el siguiente: Glucosa (C6) + ADP + NAD+ + NADP+ ® 2 piruvato (C3) + ATP + NADH + NADPH + 2H+

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Como puede verse, el rendimiento energético es menor que en la ruta EM. (4) Ruta de la Fosfocetolasa o de Warburg-Dickens (WD).Es la ruta que siguen ciertas bacterias lácticas (especialmente Lactobacillus y Leuconostoc ). Se puede considerar una variante de la ruta de las PF puesto que se forma un azucar C5 y, por consiguiente, tiene lugar una descarboxilación. sin emabrgo, en la ruta WD, la enzima fosfocetolasa rompe el azucar C 5 y da lugar a dos ramas que condicen a la formación de lactato y etanol en un proceso de feremntación heteroláctica. El metabolito final más relevante de esta primera fase del catabolismo de la glucosa es el ácido pirúvico (piruvato) que se forma en las rutas EM, ED y PF (en esta ruta, tal y como se ha descrito, se forman intermediarios que pueden conducir a la formación de piruvato). El metabolismo central continúa, pues, con el catabolismo del piruvato Procesos metabólicos fermentativos I

1.- Concepto de fermentación La palabra «fermentación» es confusa en Microbiología porque con ella se hace referencia a cuatro tipos de procesos diferentes: el metabolismo microbiano en ausencia de oxígeno, la producción de metabolitos secundarios, la modificación de compuestos químicos por microorganismos en crecimiento y el crecimiento bacteriano en sí cuando el interés del cultivo es la producción de biomasa. El sentido en que vamos a utilizarla en la clase de hoy es el primero: fermentación es el proceso por el que las células pueden obtener energía sin llevar a cabo un proceso de fosforilación oxidativa. Esto es: en la fermentación, la energía se obtiene mediante un proceso químico de fosforilación a nivel de substrato sin que se produzca una variación neta del poder reductor de la célula. Los primeros estudios científicos serios sobre procesos de fermentación se llevaron a cabo por Pasteur en el análisis de los procesos de producción y alteración del alcohol durante la fabricación del vino. Los procesos de fermentación son universales; esto es: se encuentran en todo tipo de organismos y, por consiguiente, probablemente represente una de las formas más antiguas de conservación de la energía. 1.1.- Diferencias entre fermentación y respiración : en los procesos de fermentación la energía química también deriva de la oxidación de compuestos reducidos. En cualquier proceso de oxidación se produce una transferencia de electrones desde el compuesto reducido que se oxida hasta el compuesto oxidado que se reduce, y en esa transferencia de electrones se produce la

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liberación de energía. En los procesos oxidativos el aceptor final de los electrones de la oxidación es el oxígeno o, de una manera más general, cualquier compuesto inorgánico oxidado. Sin embargo, en los procesos fermentativos, la transferencia de electrones se produce hasta llegar a un aceptor final que es un compuesto orgánico oxidado. Por consiguiente, en un proceso de fermentación tanto el donador de electrones como el aceptor son compuestos orgánicos, mientras que en un proceso de respiración el donador de los electrones es orgánico y el aceptor inorgánico. Otra manera de plantear el mismo proceso es considerar que en un proceso de respiración el aceptor final de electrones es siempre externo mientras que en un proceso de fermentación el aceptor final es interno. La respiración es mucho más efectiva energéticamente que la fermentación porque en aquélla la oxidación del compuesto orgánico es más completa que en esta y, como resultado de ello, se liberan 688 kcal/mol (DGo) en la respiración de glucosa y sólo 58 kcal/mol en la fermentación. (Estos valores hay que considerarlos a la luz de la necesidad de 7.3 kcal/mol para la síntesis de ATP). Las rutas fermentativas son anaerobias porque no requieren oxígeno como aceptor final de los electrones. Esto no quiere decir que en ausencia de oxígeno sólo se pueda producir fermentación: el aceptor final de los electrones puede ser un compuesto inorgánico oxidado que los reciba al final de la cadena respiratoria produciéndose un proceso de fosforilación oxidativa en ausencia de oxígeno. En estos procesos decimos que los microorganismos son capaces de respirar otras moléculas diferentes al oxigeno como son los nitratos (NO 3--) los sulfatos (SO4=). 2.- Rutas fermentativas para la utilización del piruvato En la oxidación de un mol de glucosa a piruvato se producen en total 2 moles de ATP como rendimiento neto (se producen 4 moles de ATP y se consumen dos) y se genera también un mol de NADH+H+. Cuando se produce la entrada en el ciclo de Krebs del piruvato se va a generar una gran cantidad de NADH+H+ que se reoxida principalmente mediante la fosforilación oxidativa. Cuando una célula carece de cadena respiratoria, el NADH+H+ no puede reoxidarse a NAD+ y, por consiguiente, no se puede regenerar el agente aceptor de hidrógeno necesario para las primeras fases de la glicolisis. Los procesos fermentativos reducen el piruvato regenerando el NAD+ necesario para los procesos metabólicos iniciales del catabolismo de la glucosa. Diferentes tipos de bacterias reducen el piruvato de maneras diversas dando lugar a distintos procesos de fermentación que se conocen por sus productos finales.

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2.1.- Fermentación etanólica o alcohólica : el piruvato se reduce para formar etanol y CO2: Glucosa + 2 ADP + 2 Pi ® 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP este es el proceso de fermentación que lleva a cabo Saccharomyces cerevisiae y algunas (pocas) bacterias. Su importancia industrial es evidente: la fermentación alcohólica produce el alcohol presente en las bebidas fermentadas (vino cerveza, etc.) y el CO2 que se libera en esta fermentación es el causante del esponjamiento de la masa de pan durante su fermentación. En este último caso el proceso de cocción posterior durante la fabricación permite eliminar todo el alcohol de manera que no queda presente en el producto final. 2.2.- Fermentación homoláctica : se denomina así la fermentación cuyo único producto final es el ácido láctico. Su ecuación global es: Glucosa + 2 ADP + 2 Pi ® 2 ácido láctico + 2 ATP Estas bacterias producen el piruvato por catabolismo de la glucosa siguiendo la ruta de Embden-Meyerhof (vía glucolítica clásica). Es un proceso de fermentación presente en muchas bacterias del grupo láctico: Streptococcus (grupo de enterococos), Pediococcus y varios grupos de Lactobacillus . Su importancia industrial estriba en la bajada del pH de los productos donde se encuentran estas bacterias: esta bajada del pH como consecuencia de la liberación de ácido láctico es suficiente para producir unos cambios químicos en el producto (precipitación de proteínas durante el cuajado de la leche), cambios microbiológico (protección del deterioro microbiano de alimentos como consecuencia de la eliminación de la flora competidora) y organolépticos (los ácidos orgánicos de cadena corta, y entre ellos el ácido láctico tienen características de producción de sabor) que hacen de esta fermentación un proceso muy relevante en la producción de alimentos. La fermentación homoláctica es la causante de las agujetas producidas en los músculos después de un esfuerzo intenso en el que la cantidad de oxígeno aportada a las fibras musculares no es suficiente para asegurar toda la reoxidación del NADH+H+. Las agujetas se producen por los depósitos de ácido láctico entre las fibras musculares. Asimismo, la fermentación homoláctica es responsable de la alteración del esmalte dental en la boca causado por bacterias láctica flora habitual. 2.3.- Fermentación heteroláctica : denominada así porque su producto final no es exclusivamente ácido láctico. El proceso tiene un rendimiento menor al de la fermentación homoláctica como se desprende de la producción de sólo un

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mol de ATP por mol de glucosa fermentada. La obtención del piruvato en estas bacterias se logra mediante el catabolismo de la glucosa por la ruta de las pentosas. La reacción global es: Glucosa + ADP + Pi ® Ac. láctico + etanol + CO 2 + ATP Este proceso lo llevan a cabo bacterias del grupo láctico pertenecientes a los géneros Leuconostoc y Lactobacillus. Industrialmente el proceso es relevante en la producción de alimentos fermentados (por ejemplo el sauerkraut). Otra bacteria productora de este tipo de fermentación es Lactobacillus acidophilus que facilita el metabolismo de la leche. 2.4.- Fermentación del ácido propiónico : las bacterias que presentan este tipo de fermentación se pueden utilizar tanto azúcares como lactato como puntos de partida para el proceso. La ruta es un proceso complejo en el que se genera acetato, CO2 y ácido propiónico como productos finales. Esta ruta fermentativa la presentan las bacterias del tipo Propionibacterium y otras anaerobias estrictas presentes en el rumen de herbívoros donde llevan a cabo una fermentación secundaria de los productos de las fermentaciones lácticas primarias. Industrialmente Propionibacterium es importante en la fermentación del queso para producir el tipo suizo: la fermentación propiónica utiliza en este caso el lactato producido en las fermentaciones lácticas primarias produciendo CO 2 responsable de los «ojos» del queso suizo y acumulación de ácidos orgánicos de cadena corta responsables de características organolépticas. 2.5.- Fermentación ácido-mixta: La fermentación ácido mixta produce ácido acético, etanol, H2 ,CO2 y proporciones diferentes de ácido láctico o propiónico (fórmico) según las especies. Es un tipo de fermentación que llevan a cabo las enterobacterias. En esta ruta de fermentación se produce ATP además de la reoxidación del NADH+H+. La producción de formiato o CO2 + H2 depende de la presencia en la bacteria de una enzima denominada formiato-liasa responsable del paso. No todas las bacterias la tienen y su actividad es detectable por la producción de grandes cantidades de gas (el H2 es insoluble) como consecuencia de la fermentación del azúcar. 2.6.- Fermentación butanodiólica : es una variante de la anterior presente en algunas enterobacterias como Klebsiella, Serratia y Erwinia, especie en la que se da una fermentación ácida mixta butanodiólica. En esta ruta se desprende CO2 y se logra como producto final el 2.3-butanodiol. Como paso

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Capitulo 3 Microorganismos de Interes Industrial

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