Biologie Celulara Si Moleculara2011pdf

MARIA PRISECARU

TINA OANA CRISTEA

ROXANA VOICU

BIOLOGIE CELULARĂ ŞI MOLECULARĂ Curs universitar

Editura „ ALMA MATER ” Bacău 2011

Referenţi ştiinţifici: Š Prof.univ.dr. BARABAŞ NECULAI Š Prof.univ.dr. BATTES KLAUS WERNER

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României PRISECARU, MARIA Biologie celulară şi moleculară / Prisecaru Maria, Cristea Oana Tina, Voicu Roxana. Bacău : Alma Mater, 2011 Bibliogr. ISBN 978-606-527-116-6 I. Cristea, Oana Tina II. Voicu, Roxana Elena 576.3 577.2

Tipar executat la:

UNIVERSITATEA „VASILE ALECSANDRI” DIN BACĂU Calea Mărăşeşti, Nr. 157, 600115 Tel. ++40-234-542411, tel./ fax ++40-234-516345 e-mai: www.ub.ro; [email protected]

ISBN 978-606-527-116-6

Prezenta lucrare se adresează în primul rând studenţilor şi cercetărilor din diferite domenii ale ştiinţelor biologice, oferind cunoştinţele de bază în domeniul biologiei celulare şi moleculare, făcându-se însă frecvente referiri la cele mai recente descoperiri şi interpretări, cunoscut fiind faptul că Biologia este o ştiinţă dinamică, care se bazează în principal pe teorii susţinute de rezultate experimentale obţinute din cercetare şi experimentare.

CUPRINS

Introducere 1. Consideraţii generale privind domeniul de studiu al biologiei celulare şi moleculare 1.1. Definiţie şi caracteristici 1.2. Scurt istoric 1.3. Contribuţii româneşti în studiul celulei 1.4. Principalele teorii care au condus la modul actual de gândire despre natura materiei vii 1.4.1. Teoria celulară 1.4.2. Teoria cromozomială a eredităţii 1.4.3. Teoria moleculară a materiei vii 1.4.4. Teoria biostructurală a materiei vii 1.4.5. Teoria evoluţionistă, originea vieţii şi a omului 2. Membranele celulare 2.1. Definiţia şi clasificarea membranelor celulare 2.2. Organizarea membranelor celulare 2.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare 2.2.2. Componenta proteică a membranelor celulare 2.2.3. Mobilitatea lipidelor şi proteinelor de membrană 2.2.4. Componenta glucidică membranară 2.2.5. Glicocalixul. 2.2.6. Apa. 2.2.7. Asimetria distribuţiei componentelor membranare 2.3. Mecanismele de transport prin membranele celulare 2.3.1. Procesul calitativ al traversării membranelor 2.3.2. Transportul ionilor şi moleculelor mici prin membranele celulare 2.3.2.1. Transportul pasiv 2.3.2.2. Transportul activ 2.3.3. Transportul macromoleculelor şi particulelor prin membrana plasmatică 2.4. Receptorii din membrană 2.4.1. Tipuri de receptori 2.4.2. Modalităţi de comunicare intercelulară. 2.4.2.1. Comunicarea intercelulară la distanţă 2.4.2.2. Contactul intracelular direct 2.4.3. Receptorii celulelor nervoase. 2.4.4. Receptorii care controlează permeabilitatea ionică 2.4.5. Cuplajul celular metabolic şi electric 2.5. Schimburile energetice în celula vie 2.5.1. Noţiuni generale de termodinamică 2.5.2. Transformări de energie în celula vie (energetica celulară) 2.5.2.1. Molecula ATP şi proprietăţile sale 2.5.2.2. Alţi compuşi fosforilaţi 2.6. Membrane care cuplează energie

11 12 13 14 15 17 17 18 22 22 24 26 26 27 28 30 30 31 31 32 32 33 33 34 34 36 41 44 45 46 46 46 46 48 50 51 51 53 54 56 56

2.6.1. Cloroplastele 2.6.1.1. Procesul general al fotosintezei 2.6.1.2. Reacţiile de lumină 2.6.1.3. Reacţiile de întuneric 2.6.2. Mitocondriile 2.6.2.1. Degradarea glucozei de către mitocondrii 2.6.2.2. Ciclul glioxalatului 2.6.2.3. β oxidarea acizilor graşi 2.6.2.4. Sistemul transportor de electroni (lanţul respirator) 2.6.2.5. Fosforilarea oxidativă 2.6.2.6. Fermentaţiile 2.6.3. Comparaţie între fotosinteză şi respiraţie 3. Adeziunea celulară. Joncţiunile celulare şi matricea extracelulară 3.1. Molecule implicate în aderarea celulă-celulă 3.1.1. Selectinele 3.2.2. Domenii imunoglobulinice 3.2.3. Caderinele 3.2. Joncţiunea celulară 3.2.1. Joncţiunile de ocluzie 3.2.2. Joncţiunile de ancorare 3.2.2.1. Joncţiunile de adeziune intercelulară 3.2.2.2. Joncţiunile de adeziune celulă-matrice extracelulară 3.2.2.3. Desmozomii 3.2.2.4. Hemidesmozomii 3.2.3. Joncţiunile de comunicare 3.2.3.1. Structura joncţiunilor de comunicare 3.2.3.2. Reglarea permeabilităţii joncţiunilor de comunicare 3.2.4. Joncţiunile sinaptice 3.3. Matricea extracelulară 3.3.1. Componentele matricei extracelulare 3.3.1.1. Glicozaminoglicanii 3.3.1.2. Proteoglicanii 3.3.1.3. Colagenul 3.3.1.4. Elastina 3.3.1.5. Fibronectinele 3.3.2. Lamina bazală 3.3.2.1. Structura laminei bazale 3.3.2.2. Funcţiile lamnei bazale 4. Citoscheletul 4.1. Microtubulii 4.1.1. Microtubulii – semnificaţia biologică 4.1.2. Structura microtubulilor 4.1.3. Polaritatea şi dinamica microtubulilor. 4.1.4. Bazele diversităţii structurilor microtubulilor 4.1.5. Centrii organizatorici ai microtubulilor 4.1.5.1. Centriolii şi corpusculii bazali 4.1.5.2. Ultrastructura centriolilor şi a corpusculilor bazali. 4.1.5.3. Replicarea centriolilor şi a corpusculilor bazali. 4.1.6. Mişcările cililor şi flagelilor 4.1.6.1. Structura cililor şi a flagelilor 4.1.6.2. Mecanismul molecular al mişcări cililor şi flagelilor. 4.1.7. Implicarea microtubulilor în diviziunea celulară

56 57 59 63 67 67 70 70 71 72 73 73 75 75 75 76 76 76 77 78 78 79 79 80 80 81 81 82 82 83 83 84 86 88 89 91 91 92 93 93 93 94 95 96 96 97 97 98 99 100 101 101

4.1.7.1. Formarea fusului de diviziune 4.1.7.2. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorială a celulei şi alinierea lor în placa metafazică 4.1.7.3. Translocarea cromozomilor anafazici. 4.1.8. Transportul intracelular mediat de microtubuli. 4.2. Microfilamentele 4.2.1. Microfilamentele de actină 4.2.2.Miozina 4.2.3. Rolul actinei şi miozinei în contracţia musculară 4.2.4. Actina şi miozina în celule nemusculare 4.2.4.1.Microvilii 4.2.4.2. Rolul actinei şi miozinei în citokineza 4.2.4.3. Mişcarea ameboidala. 4.2.4.4. Fibrele de stress 4.3. Filamente intermediare 4.3.1. Proteine ce alcătuiesc filamentele intermediare 4.3.2. Tipuri de filamente intermediare şi semnificatia lor funcţională 4.4. Reţeaua microtrabeculară 4.5. Proteinele asociate citoscheletului 5. Organizarea nucleului şi expresia activităţii genelor 5.1. Morfologia şi structura nucleului 5.1.1. Învelişul nuclear 5.1.2. Matricea nucleului 5.1.3. Proteinele contractile nucleare 5.1.4. Cromatina 5.1.5. Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina. Nucleozomii 5.2. Replicarea ADN la eucariote 5.2.1. Complexul de enzime polimerazice implicate în replicare 5.2.2. Iniţierea replicării 5.2.3. Primarea replicării 5.2.4. Alungirea lanţului de ADN nou - sintetizat şi terminarea replicării 5.2.5. Corectarea erorilor de replicare 5.2.6. Unităţile de replicare 5.3. Transcripţia ADN sau sinteza ARN 5.3.1. Mecanismul general 5.3.2. Elemente implicate în transcripţie 5.3.3. Aparatul enzimatic de transcripţie 5.3.4. Factorii de transcripţie 5.3.5. Elemente de control în expresia genetică 5.4. Mecanismul transcripţiei 5.5. ARN splicing 5.6. Asigurarea necesarului de ARNm 6. Transportul intracelular 6.1. Sistemul vacuolar intracitoplasmatic 6.2. Rolul citomembranelor granulare în sinteza proteică 6.3. Biosinteza proteinelor sau translaţia ARNm 6.3.1. Decodificarea informaţiilor genetice 6.3.2. Iniţierea catenei polipeptidice 6.3.3. Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice 6.3.4. Terminarea sintezei catenei polipeptidice 6.3.5. Particularităţile decodificării la procariote şi eurocariote 6.4. Mecanismul compartimentării celulare a proteinelor nou-sintetizate

101 103 103 104 105 106 107 108 108 109 110 111 112 112 112 114 114 114 115 115 116 118 119 119 121 123 125 126 127 127 128 129 130 130 131 132 133 133 134 136 137 138 138 139 139 140 143 146 146 149 149

6.5. Corelaţia particularităţilor structurale şi funcţionale ale reticulului 151 endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcţională a celulelor 6.6. Segregarea şi concentrarea proteinelor 153 6.7. Sinteza şi secreţia polizaharidelor 154 6.8. Lizozomii 155 6.8.1. Funcţiile lizozomilor 155 6.9. Peroxizomii 158 6.10. Proteinele chaperone 158 7. Reproducerea celulară 161 7.1. Ciclul celular 161 7.1.1. Ciclul celular la plante 161 7.1.2. Ciclul celular la animale 161 7.1.3. Ciclinelor şi protein - kinazele dependente de cicline 164 7.1.3.1. Protein - kinazele dependente de cicline (cdk) 165 7.1.3.2. Ciclinele 165 7.1.4. Interacţiunea cicline- proteina Rb - mecanism de reglare pozitivă a 168 ciclului celular 7.1.5. Reglarea ciclului celular prin mecanisme feed-back 168 7.1.6. Alţi factori responsabili de controlul proliferării celulare în 170 organismele pluricelulare 7.1.7. Ciclul cromozomial şi creşterea celulară 170 7.1.8. Implicarea factorilor de creştere în reglarea diviziunii celulare 171 7.1.8.1. Competiţia celulelor pentru factorii de creştere 173 7.1.9. Influenţa adeziunii celulare asupra proliferării 173 7.2. Diviziunea celulară 175 7.2.1. Mitoza (diviziunea mitotică) 175 7.2.2. Meioza (diviziunea meiotică) 181 8. Apoptoza 187 8.1. Mecanismele de producere a apoptozei 187 8.2. Necroza. 188 8.3. Frecvenţa procesului de apoptoză 188 8.4. Gene implicate în procesul apoptotic 189 8.4.1. Gene letale 189 8.4.2. Genele supravieţuirii (gene antiapoptotice) 189 8.5. Rolul apoptozei în embriogeneză şi dezvoltare 190 8.6. Aspecte de reglare a apoptozei 190 8.6.1. Factori implicaţi în reglarea apoptozei 190 8.7. Apoptoză – îmbătrânire – senescenţă 192 8.8. Apoptoza şi starea de boală. 193 9. Procesul de îmbatrînire-senescenţa 195 9.1. Gene implicate în controlul senescenţei 195 9.2. Principalele mecanisme (ipotetice) implicate în senescenţă 196 10. Răspunsul imunitar 201 10.1. Noţiuni generale despre imunitate şi sistem imunitar 201 10.2. Organizarea sistemului imunitar 202 10.3. Molecule cu rol esenţial în cadrul sistemului imunitar 203 10.3.1. Antigenii 203 10.3.2. Anticorpii. 204 10.3.3. Celule T 205 10.3.4. Antigeni de histocompatibilitate 205 10.3.5. Citokinele 205 10.4. Relaţii de cooperare între componentele sistemului imun 210

10.5. Baza umorală a răspunsului imun 10.5.1. Prezentarea antigenilor 10.5.2. Producerea de anticorpi 10.6. Răspunsul imunitar mediat de celule 10.7. Interacţiuni celulare în răspunsul imun 10.7.1. Unele mecanisme de apărare imună în infecţiile bacteriene 10.7.1.1. Mijloace de apărare imună mediate umoral 10.7.1.2. Mijloace de apărare imună mediată celular 10.8. Reglarea imunologică 10.8.1. Reglarea normală. 10.8.2. Reglarea alterată 10.9. Intensificarea răspunsului imun 10.9.1. Sistemul complement 10.9.2. Alte categorii celulare implicate în imunitate 10.10. Finalitatea răspunsurilor imune 10.10.1. Funcţia directă a anticorpilor 10.10.2. Funcţia indirectă a anticorpilor 10.10.3. Uciderea celulelor ţintă 10.10.4. Procesul inflamator 10.10.5. Controlul prin reacţie inversă 10.11. Genetica sistemului imunitar 10.11.1. Imunodeficienţa dobandită 10.11.2. Grupele sanguine 10.12. Interacţiunea între peptidele sistemului imun şi peptidele sistemului nervos şi endocrin 10.13. Relaţiile virusuri-celule gazdă. Relaţiile virusuri-membrane celulare 10.13.1. Receptorii virali 10.13.2. Penetrarea virusului în celulă 10.13.3. Tipuri de efect citopatic 10.13.4. Leziuni cromozomale determinate de virusuri 10.13.5. Natura şi funcţia unor structuri virus-like: prionii 10.14. Relaţiile bacterii-celulele gazdei 11. Biotehnologia 11.1. Ingineria genetică 11.1.1. Tipuri de transfer de gene 11.1.2. Terapie cu gene ţintă (Gene Targeting) 11.1.3. Aplicarea metodelor de biotehnologie în agricultură în vederea obţinerii de organisme transgenice 11.1.4. Ingineria genetică utilizată în prepararea de noi conservanţi alimentari 11.1.5. Ingineria genetică şi rezolvarea unor probleme de ecologie 11.2. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne şi perspectivele secolului XXI 12. Metode şi tehnici moderne molecular - biologice şi aplicaţiile lor 12.1. Recombinarea ADN - ului 12.1.1. Principiul recombinării 12.1.2. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering) 12.1.3. Elemente de lucru utilizate în tehnologia ADN recombinat 12.1.3.1. Enzimele de restricţie 12.1.3.2. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele) 12.1.3.3. Vectorii 12.2. Hibridarea 12.2.1. Principiu 12.2.2. Denaturarea

213 214 214 215 216 218 218 218 219 219 219 219 220 220 221 221 221 222 222 222 222 223 224 225 227 227 228 229 229 230 233 235 235 235 238 241 245 245 245 252 252 252 253 254 254 255 256 266 266 266

12.2.3. Renaturarea (annealing/reannealing) 12.2.4. Factorul stringent 12.2.5. Tipuri de hibridări 12.2.6. Hibridizare in situ 12.2.7. Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi biologie 12.3. Sonde genetice 12.4. Clonarea ADN – ului 12. 5. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) 12. 6. Secvenţierea ADN- ului 12.7. Fingerprinting genomic (amprente de ADN) 13. Biosenzorii 13.1. Biosenzorii – sisteme de coantificare a informaţiilor viului 13.2. Impactul informaţional al biosenzorilor 13.3. Metodologia de cercetare a proprietăţilor senzorilor biologici 13.4. Aparatura de măsurare 13.5. Posibilităţi de folosire a biosenzorilor în biotehnologie Bibliografia

267 267 267 272 273 274 279 282 285 286 288 288 289 290 291 292 296

INTRODUCERE

Informaţia a fost întotdeauna preţioasă în orice domeniu de activitate, ea devenind cu atât mai necesară în domeniul ştiinţelor biologice, astăzi când trăim o adevărată explozie a cunoştinţelor ştiinţifice cunoscut unei revoluţii ştiinţifice. Biologia celulară a evoluat în ultimii zece ani datorită progreselor realizate în cercetări de biochimie, genetică şi biologie moleculară, care au folosit metode şi tehnici diferite, pentru investigarea unui substrat comun,celula. Tehnicile avansate de microscopie electonică, folosirea culturilor celulare, realizarea anticorpilor monoclinali, tehnologia ADNului recombinat, manipularea genetică, sunt numai cateva din aceste tehnici care şi-au dovedit puterea analitică şi au permis unificarea experimentului biologic, a substratului molecular şi a terminologiei în biologia celulară. Viaţa se manifestă numai în cadrul organizării celulare a materiei vii, astfel că biologia celulară, care studiază fenomenele vieţii la acest nivel de organizare, este o ştiinţă fundamentală. În acelaşi timp, face parte dintre ştiinţele „nerestrictive” deoarece nici un fenomen biologic nu poate fi studiat separat, fără a se lua în consideraţie complexitatea lui, interacţiunile cu alte structuri precum şi diversitatea sistemelor de ordin superior, cu proprietăţile lor emergente. Cercetările de biologie celulară şi moleculară au acumulat deja un bagaj de date care au permis progrese uriaşe în medicină, ştiinţele ecologice, agricultură, industrie alimentară, lăsând să se întrevadă pentru viitor noi perspective fascinante de cercetare în diferite alte ramuri. Progresele ultrarapide ale biologiei celulare şi moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei moderne care se anunţă a devenii marea forţă industrială a secolului al XXI-lea şi în care se pune speranţa că va reuşi să rezolve problemele cele mai spinoase ale societăţii omeneşti (alimentaţia, starea de sănătate, sursele de energie, poluarea ) la nivelul Terrei. La ora actuală, cercetările de biologie moleculară se află în faza clasificării mecanismelor care stau la baza formării şi asamblării structurilor din organismele vii, atenţia fiind concentrată asupra momentului când se produce tranziţia informaţiei de la nivelul molecular către nivelul diferitelor sisteme şi structuri intermediare ale acestor organisme; este vorba de o etapă de analiză a funcţiilor celulare la nivel molecular (de ex. procesul respiraţiei celulare, al producerii de substanţe energetice celulare, al transportului intracelular la nivelul organitelor, al proceselor de reînnoire celulară, al fenomenelor de adaptabilitate). În contextul revoluţiei ştiinţelor biologice pe care o trăim astăzi, se impune tot mai mult o reconsiderare a concepţiei şi comportării cercetătorului ştiinţific în raport cu poziţia omului în ciclul evolutiv al naturii. După cum arată Lederberg (de două ori laureat al premiului Nobel pentru descoperiri fundamentale în domeniul geneticii bacteriene), greşeala cea mai mare a oamenilor este aceea de a se supraestima şi de a se considera exceptaţi de la legile generale ale evoluţiei, când de fapt ei nu reprezintă decât un element în circuitul evolutiv al vieţii în natură. Tocmai din cauza acestei mari erori comise de oameni, cuceririle ştiinţei şi civilizaţiei umane s-au întors de foarte multe ori, până astăzi, împotriva omului, periclitând viaţa pe Terra. Într-adevăr, istoria societăţii omeneşti a demonstrat deja că impactul noilor tehnologii şi cel al dezvoltării ştiinţelor în general nu a fost totdeauna benefic pentru războaiele atomice şi bacteriologice, accidentele de laborator soldate cu moartea experimentatorilor, microorganisme scăpate de sub control etc. Alte consecinţe nefaste ale tehnologiilor moderne asupra ecosistemelor în general şi stării de sănătate a oamenilor în particular sunt: creşterea radioactivităţii mediului înconjurător (în urma accidentelor de la termocentralele nucleare), îngustarea stratului de ozon atmosferic 11

(prin folosirea în exces a freonilor), care a favorizat creşterea cantităţilor de radiaţii ultraviolete în atmosfera terestră şi implicit a frecvenţei cancerelor (de piele, ochi, pulmon), creşterea riscului de răspândire ultrarapidă a unor boli infecţioase (holera, meningita meningococică, difteria) prin creşterea aglomeraţiei în centrele urbane şi prin deplasările rapide şi masive de populaţie datorită mijloacelor ultrarapide de transport. De asemenea, defrişarea unor zone de pe glob (păduri tropicale) în scopul creării de mari aşezări umane şi centre industriale a determinat, pe lângă dezechilibrele grave (prin scăderea spaţiului verde), expunerea concomitentă a populaţiei la noi agenţi patogeni; au apărut astfel şi sau răspândit pe glob: virusul febrei galbene, virusul imunodeficienţei umane (HIV – transmis la om foarte probabil de la primatele junglei africane), virusul Ebola (agentul febrei hemoragice), adus pentru întâia oară din Africa în Europa (la Marburg în 1967). Omul de ştiinţă trebuie să ţină cont de faptul că, în natură, diversitatea foarte mare de specii este tributară în mare măsură condiţiilor de mediu extern; modificări majore ale acestor condiţii de mediu pot declanşa potenţiale nebănuite ale ecosistemelor cu influenţe posibil nocive, neintuite încă astăzi, asupra echilibrului vieţii pe Terra. Conştient de toate aceste posibilităţi,un adevărat om de ştiinţă, trebuie să militeze ca în viitor cuceririle ştiinţifice să fie folosite cu mai mult discernământ, doar în slujba binelui, pentru un grad tot mai înalt de civilizaţie în societatea umană.

12

Capitolul 1 CONSIDERAŢII GENERALE PRIVIND DOMENIUL DE STUDIU AL BIOLOGIEI CELULARE ŞI MOLECULARE 1.1.

Definiţie şi caracteristici

BIOLOGIA CELULARĂ este o ramură a ştiinţelor biologice care studiază structurile funcţionale şi fenomenele biologice generale comune tuturor celulelor. Se mai poate spune că biologia celulară are ca obiect studiul legilor generale de desfăşurare a proceselor vitale la nivelul de organizare celulară. Celula poate fi definită şi ca unitate elementară a lumii vii, cu o ordine internă complexă, ce-i conferă capacitatea de creştere, dezvoltare şi reproducere, precum şi cu organizare dinamică, aflată în relaţii de echilibru cu mediul înconjurător (Diculescu şi colab., 1983). În ierarhia nivelurilor de organizare a materiei vii, celula este considerată primul sistem biologic, deoarece nivelurile inferioare (atomi, molecule etc) nu sunt considerate „vii”. Orice manifestare vitală are loc pe fundamentul organizării celulare. Viaţa începe de la celulă. Din punct de vedere termodinamic, celula este un sistem deschis, adică un sistem care schimbă atât energie cât şi substanţă cu mediul înconjurător. Ca oricărui alt sistem biologic, sistemul celular i se pot descrie mai multe caracteristici : caracterul informaţional, programul, echilibrul dinamic, autoreglarea şi integralitate. Caracterul informaţional constă în aceea că în orice moment celulele recepţionează, acumulează, prelucrează şi transmit informaţii de tot felul. Programul este o trăsătură legată de capacităţile structurale şi funcţionale ale sistemului. În orice sistem (deci şi cel celular) putem distinge trei categorii de programe: a) programe “pentru sine”, care asigură autoconservare sistemului dat; b) programe inferioare, adică programele subsistemelor componente; în cazul celulei acestea sunt programele organitelor, ale complexelor moleculare; c) programe superioare, care asigură existenţa sistemului superior, în care este integrat sistemul considerat (ţesuturi, organe, individ pluricelular). O ilustrare a ierarhiei programelor o constituie modificările celulelor scoase dintr-un ţesut (sistem superior) şi cultivate în mod izolat, care se diferenţiază devenind asemănătoare indiferent de sursa din care provin (piele, os, ficat,rinichi etc). În cultură se menţin programele “pentru sine”, care asigură persistenţa celulelor, în schimb dispare programul superior ce reflectă specificul celulei în cadrul ţesutului şi al organismului. Echilibrul dinamic sau starea staţionară este caracteristică sistemelor biologice, deci şi celulei; aceasta nu este niciodată într-un adevărat echilibru, ci într-un schimb continuu de materie şi energie cu mediul exterior, tinzând mereu spre un regim constant de activitate numit stare staţionară sau echilibru dinamic. În timp ce sistemele nebiologice evoluează întotdeauna în sensul creşterii entropiei , deci în sensul creşterii dezordinii lor şi al realizării echilibrului termodinamic, sistemele biologice au capacitatea de a compensa creşterea entropiei şi de a o depăşi pe seama surselor de energie exterioare sistemului, deci au un comportament antientropic. Organismele vii evită creşterea entropiei prin preluarea din mediu a unei entropii negative, negentropia. Autoreglarea este caracteristica sistemelor biologice prin care acestea îşi controlează procesele interne în funcţie de relaţiile cu mediul. Influenţele mediului tind permanent să dezechilibreze sistemul, care contracarează acţiunile mediului reglându-şi permanent procesele interne într-un sens favorabil persistenţei sale în timp şi spaţii. 13

Celula, ca orice sistem biologic, posedă mecanisme de autoreglare de tipul celor descrise în cibernetică. Autoreglarea presupune existenţa a minimum două elemente: unul care comandă (centrul de comandă) şi unul efector, precum şi legăturilor de comunicare dintre ele. Pentru ca răspunsul să fie corespunzător cu necesităţile sistemului, valoarea răspunsului trebuie comparată cu comanda. Răspunsul dat de efector trebuie comunicat receptorului pe o cale inversă conexiunea inversă (feed-back), pentru a avea loc compararea cu comanda primită de efector, spre deosebire de legătura de la receptor la efector care poartă numele de conexiune directă. Conexiunea inversă este obligatorie pentru orice sistem de autoreglare şi oferă posibilitatea sistemului să fie informat despre valoarea răspunsului. Dacă răspunsul nu corespunde necesităţilor sistemului, se dă o nouă comandă, un nou răspuns, o nouă comparaţie. Integralitatea constă în faptul că un sistem nu se reduce la suma însuşirilor părţilor sale componente; sistemul privit ca un întreg, prezintă însuşiri structurale şi funcţionale noi, pe care nu le au părţile lui componente luate izolat. Nucleul sau citoplasma nu trăiesc izolate, celula nu poate supravieţui după distrugerea mitocondriilor etc. Datorită integralităţii sunt posibile funcţiile biologice fundamentale: metabolismul, reproducerea, adaptarea, menţinerea stabilităţii stării diferenţiate. Autonomia celulelor ce compun organismele pluricelulare nu este absolută şi se poate spune că sănătatea organismului depinde în mare măsură de sistemele de comunicaţie şi de mecanismele de coordonare dintre celule. Biologia celulară s-a conturat ca o disciplină nouă mai cu seamă în ultimii 50 de ani ca urmare a progreselor revoluţionare înregistrate în studiul celulei, pe plan metodologic şi conceptual, când s-a produs fuziunea dintre citologie, biochimie celulară, fiziologie celulară şi genetică moleculară. În ultimii 20 de ani s-a accentuat tendinţa de interpretare a tuturor proceselor celulare la nivel molecular, ceea ce justifică denumirea actuală de biologie celulară şi moleculară, care a devenit una dintre cele mai noi şi de perspectivă ramuri ale biologiei. Ea concepe celula ca un adevărat microcosmos ,în care structurile şi funcţiile se îmbină armonios; activitatea acestui microcosmos este determinată şi reglată genetic, astfel că funcţionarea sa se realizează cu o mare eficienţă.

1.2. Scurt istoric Începând cu secolul XX, se înregistrează progrese însemnate în studiul celulei, atât sub raport metodologic, cât şi sub raport conceptual. Printre progresele metodologice sunt de menţionat: introducerea tehnicii culturilor de ţesuturi “ în vitro “ (Harrison, 1909), ulterior a culturilor de celule, care permit studierea comportării celulelor prin microscopia cu contrast de fază; coloraţie vitală şi microvitală şi microcinematografie; microchirurgia (Kite,1911), prin care se introduc micropipete fine în interiorul celulelor şi se studiază la microscopul optic proprietăţile fizico-chimice ale citoplasmei; introducerea microscopul electronic (inventat în 1937, dar utilizat în biologie după 1954) a dus la descoperirea unei noi lumi a organizării celulare, descifrarea ultrastructurii celulei, a detaliilor fine de organizare submicroscopică. Aceasta a marcat şi trecerea de la citologia clasică la citologia modernă. Dezvoltarea impetuoasă a biochimiei, la începutul secolului XX, aduce descoperirea şi descifrarea oxidărilor celulare (Wieland, 1903; Warburg, 1908) şi se fac primele încercări de a le localiza în particule citoplasmatice. Punctul de convergenţă între citologie şi biochimie îl constituie dezvoltarea tehnicilor biochimice de fracţionare a celulei prin centrifugare diferenţială. Această linie de cercetare a fost iniţiată în 1934 de Bensley şi Hoerr şi apoi dezvoltată cu succes de Claude, Hogeboom şi alţii în deceniul al V-lea. Prin centrifugare diferenţială s-a realizat separarea componentelor citoplasmatice, urmată de studiul ultrastructurii şi a proprietăţilor metabolice ale acestora. În acest fel s-au putut localiza precis anumite căi metasolice în celulă (de pildă ciclul Krebs, 14

oxidările celulare şi sinteza de ATP în mitocondtii) şi s-au descoperit şi caracterizat noi organite celulare (lizozomii şi peroxizomii de către Christian de Dure). Introducerea microscopiei electronice şi a fracţionării celulei prin centrifugare sunt cele două tehnici majore care au revoluţionat studiul celulei, ducând la apariţia unei noi ramuri a ştiinţelor biologice şi anume biologia celulară. Studiul celulei a progresat şi în măsura perfecţionării tehnicilor de citochimie şi histochimie, prin care se decelează anumite componente ale celulei (acizii nucleici, proteine, glucide, lipide) se localizează enzime în celulă sau în organite. Aceste metode se pot utiliza la microscopul optic sau la microscopul electronic. Un punct de referinţă la constituit citofotometria acizilor nucleici (Caspersson, 1938). De asemenea, s-au aprofundat aspectele funcţionale ca urmare a progreselor înregistrate în fiziologia celulară. Pe de altă parte, pornind de la structurile nucleare s-a ajuns la interpretarea şi explicarea fenomenelor eredităţii. Sub raport conceptual biologia celulară a rezultat din fuziunea disciplinelor de citologie, biochimie celulară, fiziologie celulară, genetică moleculară. Prin anii ’60 exista deja o disciplină formată, cu metodologie complexă de cercetare, ilustrată de savanţi de renume mondial dintre care Albert Claude, George Palade, Christian de Duve, laureaţi ai Premiului Nobel în 1974, Keith Porter şi alţii. Dar progresele spectaculare în studiul celulei au continuat cu repeziciune şi în scurta vreme s-a înregistrat o nouă schimbare radicală. Odată cu realizările excepţionale înregistrate în descifrarea structurii proteinelor şi acizilor nucleici prin folosirea în special a difracţiei cu raze X, a elucidării mecanismului replicării ADN, a biosintezei proteinelor, deci a transmiterii informaţiei genetice şi a expresiei genei s-a născut biologia moleculară, al cărui scop este interpretarea fenomenelor biologice la nivel molecular. Cercetările de biologie moleculară au acumulat deja un bagaj de care au permis progrese uriaşe în diferite domenii, lăsând să se întrevadă, pentru viitor, noi perspective fascinante de cercetare (medicină, industrie alimentară, agricultură, ecologie etc). Progresele ultrarapide ale biologiei moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei moderne care se anunţă a deveni marea forţă industrială a secolului al XX -lea şi în care se pune speranţa că va reuşi să rezolve problemele cele mai spinoase ale societăţii omeneşti (alimentaţia şi starea de sănătate). După cum se ştie, majoritatea cercetărilor şi descoperirilor epocale din biologia moleculară au fost făcute în SUA, Japonia şi Germania; tot în aceste ţări s-a dezvoltat şi biotehnologia modernă. La ora actuală, în SUA există 1000 de firme specializate în probleme de biotehnologie, care lucrează produse pentru laboratoarele de genetică şi biologie moleculară din întreaga lume; în Japonia există 300 de firme, iar în Germania 36.

1.3. Contribuţii româneşti în studiul celulei În secolul al XIX-lea s-a impus şcoala de microscopie de la Facultatea de medicină din Bucureşti (Diculescu şi colab., 1983). Încă din 1839 Nicolae Kretzulescu publică la Paris rezultatele cercetărilor sale asupra structurii microscopice a dinţilor şi a mediilor transparente ale globului ocular. Învăţământul disciplinelor microscopice apare la şcoala de medicină din Bucureşti în anul 1859, reprezentat succesiv de Ludovic Fiala, Gh. Polizu şi Mihail Obedenaru, care predau histologia şi citologia până în anul 1897, când ia fiinţă o catedră independentă de histologie, citologie şi tehnică microscopică. La această catedră, printre primele de acest fel din Europa, după acela din Franţa, se succed, în curs de circa 100 de ani, reprezentanţi de seamă ca: Mihail Petrini-Galaţi, Alexandru Obredja, Ion Bruckner, Ştefan Besnea, I. T. Niculescu. Pe plan internaţional se impun în mod cu totul deosebit, Gheorghe Marinescu ( 18631939), Victor Babeş (1854-1926) şi Ion Cantacuzino (1863-1934). Contribuţiile lui Gheorghe Marinescu în neurocitologie sunt sintetizate în cartea “Celulă nervoasă” (publicată la Paris în 15

1909) care a rămas mai multe decenii o carte de bază a domeniului. Victor Babeş (coautor împreună cu francezul A. V. Cornil al primului tratat de microbiologie din lume, publicat la Paris în 1886) a descoperit peste 40 de microorganisme, unele constituind clasa Babesia (Babesiozele sunt cele mai răspândite parazite ale animalelor). Victor Babeş a mai descoperit corpii Babeş-Negri în neuron în turbare, corpusculii Babeş-Erust în bacilul difteric. Încă din 1885 a prevăzut că între microorganisme se pot stabili relaţii antagoniste, cu posibilităţi de aplicare a fenomenului în terapie, concepţie confirmată ulterior prin antibiotice. Ion Cantacuzino, pe lângă contribuţiile sale de imunologie comparată, de microbiologie şi de medicină experimentală, a descoperit factorul stimulator al secreţiei celulare în diferite lichide biologice (de exemplu, lacrimile). Şcoala de citofiziologie a lui Ioan Athanasiu şi Ion Drăgoi de la facultăţile de ştiinţe naturale şi medicină veterinară din Bucureşti aduc valoroase contribuţii de citofiziologie musculară, dintre care se remarcă descoperirea tubilor transverşi din celulele musculare cardiace şi cele striate, lucrări publicate încă înainte de primul război mondial. În perioada dintre cele două războaie mondiale şcoala de citologie de la Facultatea de Ştiinţe naturale din Bucureşti este reprezentată strălucit de Dimitrie Voinov (şi continuată de Theodor Dornescu şi I. Steopoe), iar cea de la Cluj de către I. Scriban, care s-au impus prin descoperiri legate de aparatul Golgi şi lucrări de citologie animală (Ionescu-Varo şi colab., 1981). În aceeaşi perioadă Ion Drăgoi, conducând şcoala de histologie şi citologie de la Facultatea de medicină din Cluj a efectuat cercetări deosebit de valoroase privind rolul presiunii osmotice asupra diviziunii celulare, precum şi asupra respiraţiei ovicitelor de mamifere. Învăţământul superior şi cercetarea ştiinţifică din România au depus eforturi de reorganizare în concordanţă cu evoluţia biologiei celulare în ultimele decenii. Începând cu anul 1969 M. Ionescu – Varo iniţiază la Facultatea de biologie din Bucureşti primele cursuri şi lucrări practice de biologie celulară, publicând totodată şi primul manual de profil din ţară. I. Diculescu şi colaboratorii de la catedra de histologie şi citologie a Facultăţii de medicină din Bucureşti publică prima monografie de biologie celulară din literatura română (Diculescu şi colab., 1971). Începând cu anul universitar 1978-1979 se introduce biologia celulară ca materie obligatorie în planul de învăţământ la facultăţile de medicină, disciplinele de profil fiind conduse de I. Diculescu la Bucureşti, O. Chita la Craiova, G. Cotrutz la Iaşi, Silvia Andreicuţ la Tg. Mureş, N. Frăsinel la Timişoara şi Gh. Benga la Cluj-Napoca. Se redactează cursuri litografiate pentru studenţii de la medicină (Benga, 1980; Diculescu şi colab., 1981; Andreicuţ, 1982) şi un manual unic ( Diculescu şi colab, 1983 ). Sunt, de asemenea, de menţionat laboratoarele de microscopie electronică şi biologie celulară şi moleculară din cadrul unor institute de învăţământ superior (Universitatea din ClujNapoca – dr. C. Crăciun, laboratorul de microscopie electronică ) şi de cercetare: Institutul “ Dr. I. Cantacuzino “ (microscopie electronică – dr. A. Petrovici, biologie celulară – dr. Gh. Gancevici), Institutul “ Dr. V. Babeş ” (biologie celulară – dr. C. Dragomir), Institutul “L. Pasteur” (microscopie electronică cu baleiaj – dr. N. Manolescu), Institutul “Ştefan S. Nicolau” (biologie moleculară – dr. L. Popa, dr. S. Antohi), Institutul Oncologic Bucureşti ( biologie moleculară – dr. I. Voiculeţ), Institutul de ştiinţe biologice, Bucureşti ( microscopie electronică – dr. H. Tiţu şi colab.) şi altele. Din 1979 a luat fiinţă “Institutul de Biologie şi Patologie Celulară” din Bucureşti, aflat în legătură permanentă cu secţia de biologie celulară a Facultăţii de medicină din Yale, S.U.A (profesor George Emil Palade). Merită subliniat în acest context, descoperirile de o valoare inestimabilă a lui G. E. Palade, primul român laureat al Premiului Nobel. Aprecierile de “principal cartograf al celulei” sau “cel mai mare biolog al secolului XX” (Blobel, 1980) sunt justificate nu numai de multiplele sale descoperiri, ci şi de orizonturile noi deschise în biologia celulară. Palade este 16

unul din pionierii elaborării tehnicilor de microscopie electronică (a pus la punct metoda de fixare şi secţionare ultrafină, ce i-a permis observarea pentru prima dată a multor structuri celulare) şi de centrifugare diferenţială ( a introdus zaharoza ca mediu de fracţionare). A descoperit ribozomii (numiţi şi “granulele lui Palade”) şi a precizat rolul lor în sinteza proteinelor, a elucidat calea secţiei celulare, a descoperit transportul pe calea veziculelor prin endoteliul capilar şi reciclarea membranelor celulare; a studiat biogeneza membranelor, şi aici fiind un deschizător de drumuri. Biologia celulară şi moleculară reprezintă nu numai unul din cele mai dinamice domenii în care avansează frontierele cunoaşterii umane, ci şi pilonul fundamental ce stă la baza revoluţiei ştiinţifice, pe care o trăim în prezent, cu implicaţii de maximă importanţă economică, medicală, ecologică şi în ultimă analiză, filozofică. 1.4. Principalele teorii care au condus la modul actual de gândire despre

natura materiei vii Secolul al XIX-lea a reprezentat un salt în cunoaşterea organizării materiei vii. Acumularea de date şi cunoştinţe a permis şi fundamentarea unor teorii care au condus la modul actual de gândire despre natura materiei vii, printre care: Teoria celulară, care a stabilit că la baza structurii ţesuturilor, organelor şi a întregului organism, vegetal şi animal, stă celula; Teoria cromozomială a eredităţii, care consideră că la baza controlului şi transmiterii caracterelor ereditare stau cromozomii (şi în ultimul timp ADN); Teoria moleculară, care consideră că viul este constituit din materia moleculară (ca şi neviul); Teoria biostructurală, de dată mai recentă (sec XX-lea) ce aparţine academicianului E. Macovschi şi care consideră viul materie biostructurată, superior organizată (biostructura), formă cu totul specială a materiei, purtătoarea însuşirilor biologice pe care le imprimă viului şi care include materia moleculară. Teoria evoluţionistă, ipoteză care afirmă că toate speciile de animale s-au transformat unele în altele, de la primele vietăţi unicelulare, până la maimuţă şi om, în miliarde de ani, mai afirmă că speciile de plante auevoluat de la forme unicelulare până la plantele cu flori şi că acest proces evolutiv s-a desfăşurat pe cale naturală, prin factori întâmplători.

1.4.1. Teoria celulară La sfârşitul secolului al XVIII-lea, epoca de invenţie a primelor microscoape, R. Hooke (1665) observă că pluta este alcătuită din numeroase „cămăruţe”, asemănătoare unor faguri de albine, pe care le-a denumit „celule” (de la lat. cellula – cameră mică). În aceeaşi perioadă Leuwenhoeck (1674), descoperă celulele libere şi identifică şi nucleul în eritrocite. Importanţa acestor noţiuni nu a fost înţeleasă decât mai târziu. La începutul secolului al XIX-lea, dispunând de microscoape mai perfecţionate, numeroşi cercetători descriu celulele în diferite organisme vii. Puţin câte puţin, se desprinde ideea că toate fiinţele sunt alcătuite din celule şi din substanţe ce provin din activitatea lor. Schleiden (1838) şi apoi Schwann (1839), exprimă această concepţie, care reprezintă o sinteză fundamentală a cunoştinţelor despre celulă până la acea dată şi care este încă una dintre concepţiile de bază ale biologiei actuale. Observarea şi studiul diviziunii celulare de către mulţi autori, conduc pe Virchow (1855) să enunţe o nouă idee: omnis cellula e cellula (toate celulele provin dintr-o celulă preexistentă). 17

Fiecare celulă posedă un nucleu (Brown, 1831), care derivă tot dintr-un nucleu preexistent (Strasburger, 1876). Celula conţine o substanţă „gelatinoasă, diafană, insolubilă în apă, care se contractă într-o masă globuloasă, se ataşează de suprafaţa de secţiune şi se lasă întinsă asemănător unui mucus” (Dujardin, 1835). Această substanţă reprezintă protoplasma (Purkinje; Von Mohl, 1840). Schneider (1873), apoi Strasburger (1876) descoperă diviziunea indirectă în celulele vegetale; Fleming (1880)o observă în celulele animale şi o numeşte mitoza,; Schneider (1878) adaugă termenul de cariochineză, în timpul căreia cromozomii se repartizează în mod egal între celulele-fiice. În cursul fecundării ovulului de către spermatozoid cei doi pronuclei fuzionează în oul fecundat (Hertwig, 1875). Oul (celula-ou) dă naştere unui nou organism. De la o generaţie la alta, viaţa se caracterizează printr-o succesiune neîntreruptă de celule. Studiul creşterii şi dezvoltării organismului, a maladiilor sale, a reproducerii şi a fenomenelor de transmitere ereditară, sunt în raport cu structura şi funcţia celulelor sale. Descoperirile recente pot provoca unele dificultăţi, referitoare la generalizarea teoriei celulare. Este cazul virusurilor care au o organizare foarte particulară. Totuşi, teoria celulară se evidenţiază ca fiind extrem de aplicabilă. Nu numai celulele, dar şi organitele, cum sunt cromozomii, sau moleculele ca cele de ADN (acid dezoxiribonucleic) preced structuri preexistente analoge; ele au o continuitate genetică. După A Lwoff (1962), teoria celulară implică o unitate de plan de organizare, dar de asemenea o unitate de funcţionare şi o unitate de compoziţie. Celulele sunt organizate după un plan foarte general comun, ele funcţionează după aceleaşi legi şi sunt constituite din molecule, care cu toată marea lor diversitate, sunt constituite dintr-un număr foarte limitat de materiale.

1.4.2. Teoria cromozomială a eredităţii Caracterul esenţial al unei celule vii constă în capacitatea de a transmite în mod ereditar trăsăturile sale de la o generaţie la alta. Deşi fenomenul a fost remarcat cu foarte mult timp în urmă, el nu a putut fi descifrat decât spre sfârşitul secolului XIX-lea şi începutul secolului al XX-lea. Meritul îi revine naturalistului ceh Gregor Mendel care elaborează (1866) două importante legi ale geneticii, cunoscute sub numele de legile lui Mendel. În scopul de a descifra mecanismele ce determină exprimarea anumitor caractere, cât şi transmiterea lor de-a lungul generaţiilor, Mendel utilizează metoda analizei genetice (hibridologică). Principiul acestei metode constă în încrucişarea unor indivizi ai aceleaşi specii care se deosebesc între ei prin una sau mai multe caractere (trăsături) individuale, bine conturate şi analiza descendenţilor obţinuţi. Cel mai important factor ce poate influenţa rezultatele furnizate prin metoda analizei genetice îl constituie puritatea genetică a genitorilor. Indivizii folosiţi în încrucişări trebuie să manifeste o mare constanţă a caracterelor ereditare. Un material biologic adecvat acestui scop este mazărea (Pisum sativum), plantă folosită în experimentele efectuate de Mendel. Prima lege mendeliană este legea purităţii gameţilor. Sub denumirea de „legea purităţii gameţilor ” sunt unite de fapt două legi sau două principii: a uniformităţii hibrizilor din prima generaţie şi cea a segregării. Această lege se bazează pe rezultatele unui experiment de monohibridare (indivizii încrucişaţi se deosebesc printr-o singură pereche de caractere ereditare) Mendel a încrucişat un soi de mazăre cu boabe de culoare galbenă (G) cu un alt soi ale cărui boabe erau verzi (v). În urma acestei încrucişări s-a obţinut prima generaţie hibridă F1. Toţi hibrizii din F1 prezentau boabe de culoare galbenă, moştenind caracterul ereditar al unui singur genitor. Caracterul alternativ (culoare verde) nu a fost exprimat de nici unul din indivizii primei generaţii.

18

Mendel introduce termenul de dominanţă pentru a definii fenomenul de exprimare, la hibrizii din F1, numai a unuia dintre caracterele parentale alternative. Caracterul ce se manifestă la descendenţii din prima generaţie a fost numit dominant, în timp ce caracterul alternativ, nemanifestat i s-a atribuit termenul de recesiv. În urma autopolenizării (sau încrucişării) hibrizilor din F1 s-a obţinut a doua generaţie de descendenţi , F2. Unii dintre aceştia prezentau caracterul dominant, în timp ce alţii manifestau caracterul recesiv. Diferenţiere caracterelor parentale la indivizii din a doua generaţie a fost numită segregare. În urma unui studiu statistic al segregării, Mendel a obţinut raportul de 3:1 între caracterul dominant şi cel recesiv (fig. 1). Mendel şi-a extins cercetările şi asupra generaţiilor următoare. El a remarcat faptul că plantele cu boabe verzi au descendenţi identici. Din plantele cu boabe galbene doar o treime exprimă constant caracterul ereditar, restul de două treimi manifestând o segregare similară generaţiei F2 (3 dominant : 1 recesiv)

Gameţi F1

♂ G

g

G

GG

Gg

G

gG

gg

♀

Fig.1. – Schema care reprezintă prima lege a lui Mendel ( legea purităţii gameţilor ). Se poate observa că în generaţie F2 raportul fenotipului dominant şi cel recesiv este de 3/1. G = gena dominantă; g = gena recesivă. Mendel explică rezultatele obţinute lansând ipoteza factorială care are drept suport presupunerea existenţei unor factori interni materiali ce stau la baza exprimării caracterelor ereditare. Aceşti factori, intuiţi de Mendel, sunt cunoscuţi azi sun numele de gene (termen introdus în 1909 de către Wolhelm Johanerson). În toate organismele, factorii se găsesc în pereche, fiecare conţinând un factor dominant şi altul recesiv. Astfel de cupluri au primit ulterior numele de perechi alele. Factorii sunt transmişi descendenţilor prin intermediul gameţilor parentali (matern şi patern) ce conţin câte unul din factorii ce alcătuiesc cuplul(sunt puri din punct de vedere genetic). În urma fecundării, gameţii se combină în moduri diferite ceea ce explică fenomenul de segregare manifestat în F2. În cazul experimentului de monohibridare se constată existenţa unei duble segregări, atât fenotipică, cât şi genotipică. Din punct de vedere fenotipic (al aspectului exterior al individului), raportul de segregare este de 3:1 (dominant/recesiv). Segregarea genotipică constă în redistribuirea factorilor în cupluri diferite, în generaţia F2. Analizând diagrama lui Punnett, se constată formarea, în a doua generaţie, a două cupluri identice cu cele ale genitorilor şi altor două similare hibrizilor din F1, stabilit fiind de 1:2:1 (fig. 2).

19

Fig. 2. Diagrama factorilor ereditari aleloformi în experimentul de monohibridare. P = generaţie parentală; F1, F2 , F3 = generaţiile filiale (hibrizii); = genitorul parental femel; = genitorul parental masculin; G = caracterul dominant (culoarea galbenă); g = caracterul recesiv (culoarea verde). Studiul posibilităţilor de combinare a factorilor ereditari în cupluri stă la baza unei noi clasificări a organismelor. Se disting, astfel, două tipuri de organisme: homozigote (la care factorii ce alcătuiesc cuplul sunt identici) şi heterozigoze sau hibride (la care factorii ereditari pereche sunt diferiţi). Legea segregării (disjuncţiei) independente a perechilor de factori ereditari respectiv a perechilor de caractere este a doua lege elaborată de Mendel. Ea este fundamentată pe un experiment de dihibridare (genitorii se deosebesc între ei prin două perechi de caractere constante). Mendel a încrucişat un soi de mazăre cu boabe galbene şi netede (GN) cu un alt soi cu boabe verzi şi zbârcite (vr) Experienţele preliminare au demonstrat că atât culoarea galbenă, cât şi aspectul neted al boabelor sunt dominante asupra caracterelor alternative. În urma încrucişării celor doi genitori s-a obţinut prima generaţie de descendenţi F1, în care manifestate erau doar caracterele dominante.

20

Cei 16 descendenţi din a doua generaţie F2 rezultaţi prin autopolenizarea (sau încrucişarea) hibrizilor din F1, se pot încadra în patru clase genotipice, raportul de segregare fiind de 9:3:3:1 astfel: Š 9 plante prezentau ambele caractere dominante (boabe galbene şi netede); Š 3 plante manifestau primul caracter dominant (boabe galbene şi zbârcite); Š 3 plante exprimau al doilea caracter dominant (boabe verzi şi netede); Š 1 plantă nu prezenta nici unul din caracterele dominate (boabe verzi şi zbârcite). Cei şase (3+3) indivizi ce exprimă genotipuri noi, diferite de cele ale genotipurilor, sunt numiţi recombinanţi. Din modul de segregare a fiecărui caracter în parte, se constată că fiecare pereche de caractere, segregă independent într-un raport de 3:1. Atât raportul se segregare fenotipică, cât şi exprimarea fenotipurilor noi se explică admiţând prezenţa în genomul hibrizilor din F1 a tuturor genelor parentale (fig.3)

Fig. 3. Schema dihibridării şi a segregării factorilor în F1, reprezentând cea de-a doua lege a lui Mendel. Un părinte este homozigot pentru două gene dominante: GG care determină culoarea şi RR care determină forma. Cel de-al doilea părinte este homozigot pentru alelele recesive gg şi rr. Generaţia F1 este uniformă pentru caracterele dominante. Fecundarea produce un număr egal de 4 x 4 = 16 combinaţii prezentate în pătratele figurii (generaţia F2 ). Aceste 16 combinaţii se găsesc în 4 clase de genitori. 21

Anterior experimentelor mendeliene, studiile citologice subliniau implicarea cromozomilor în procesul transmiterii ereditare a caracterelor. Corelând datele genetice cu cele furnizate de citologie, W.S.Sutton (1903)şi T. Boveri (1904) ajung la concluzia că factorii ereditari (genele) sunt localizaţi în cromozomi, segregarea perechilor alele, într-un heterozigot, explicându-se prin segregarea cromozomilor ce conţin genele în procesul de formare a celulelor sexuale (gametogeneza). Orice tip de celulă diploidă conţine cromozomi de provenienţă maternă şi paternă ce formează cupluri de cromozomi omologi. În timpul meiozei atât ataşarea cromozomilor de fibrele fusului de diviziune, cât şi deplasarea lor spre polii celulei sunt fenomene ce se desfăşoară la întâmplare. Acest lucru explică de ce gameţii rezultaţi în urma meiozei pot conţine orice combinaţie a factorilor ereditari parentali. Punerea în discuţie, din perspectiva citologică, a universalităţii legilor mendeliene a condus la concluzia că libera combinare a factorilor ereditari are loc numai când factorii ce determină exprimarea perechilor de caractere sunt localizaţi în perechi de cromozomi omologi diferiţi. Deci numărul factorilor ce segregă, independent între ei, poate fi cel mult egal cu numărul de perechi de cromozomi omologi prezenţi într-un organism dat. Corelaţia rezultatelor cercetării fenomenului ereditar s-a finalizat prin elaborarea, în 1920, a Teoriei cromozomiale a eredităţii, teorie preluată şi dusă la apogeu de Thomas Morgan (Drosophila melanogaster, analiza genetică, hărţi genetice) teorie susţinută azi de informaţiile furnizate de biologia moleculară.

1.4.3. Teoria moleculară a materiei vii Conform modului actual de gândire despre natura viului, oglindit în cercetare şi în programul de învăţământ, viul este constituit din materie moleculară; (Bauley, 1970; Orten, Neuhaus, 1975; Tamaş ,1975); însuşirile biologice sunt condiţionate de metabolism (Oparin, 1960; Watson 1974); moartea este consecinţa încetării metabolismului; natura materiei vii şi natura materiei moarte sunt calitativ identice (Haas; 1964). S-a ajuns la convingerea că acest mod de gândire reflectă natura vie aşa cum este ea, deci întru-totul realităţii. Se mai consideră ca numeroasele descoperiri de mare importanţă pentru biologie, făcute la nivel molecular ca şi cele ce privesc codul genetic, mecanismul de biosinteză a proteinelor, autoreglarea şi coordonarea reacţiilor enzimatice, sinteza genelor şi altele, vin în sprijinul actualului mod de gândire despre natura materiei vii, demonstrând valabilitatea lui. Datorită acestei situaţii cercetarea viului se orientează tot mai mult spre aspecte legate de structura chimică a substanţelor din organisme şi de interrelaţiile chimice şi fizice dintre moleculele acestor substanţe. De aici abordarea tot mai frecventă a fenomenelor biologice în termeni moleculari, tendinţă de „chimizare” a diferitelor ramuri ale biologiei şi apariţia disciplinelor biologice noi, numite moleculare, cum sunt biologia moleculară, genetica moleculară, patologia moleculară şi chiar biochimia moleculară. Astfel asistăm la un adevărat triumf al „molecularismului” în biologie. Deci, conform modului actual de gândire, materia vie, în totalitatea ei, are natură moleculară, iar descifrarea fenomenelor biologice, la nivel molecular va permite cunoaşterea vieţii, cunoaşterea sistemelor vii (Karlson, 1967; Manta, 1968; Watson, 1974).

1.4.4. Teoria biostructurală a materiei vii Plecând de la unele deficienţe de ordin teoretic, experimental şi filosofic ale teoriei moleculare acad. român Eugen Macovschi elaborează o nouă teorie despre natura şi structura viului, teorie publicată în diverse articole şi cărţi, între anii 1958-1976.

22

Conform concepţiei lui Macovschi, principalele idei deficiente ale teoriei moleculare sunt următoarele: - Materia vie şi materia moartă sunt calitativ identice, dar nu se explică de ce cele două forme ale materiei, vie şi moartă, au totuşi însuşiri atât de diferite; se ştie doar că formele materiei identice calitativ trebuie să aibă şi însuşiri de aceeaşi natură. - În materia vie toate reacţiile chimice sunt coordonate şi constituie metabolismul, viaţa, fiind forma chimică de mişcare a materiei, dar nu se arată cum anume se realizează această coordonare a reacţiilor chimice şi nu se indică modul cum, de la chimismul obişnuit coordonat, se ajunge la manifestările vieţii. Afirmaţia că fenomenele biologice, manifestările însuşirilor biologice ale materiei vii se reduc la chimismul obişnuit este greu de înţeles. Se ştie doar că însuşirile sunt ale materiei şi depind de natura, de calitatea ei şi nu sunt ale reacţiilor chimice care se desfăşoară în materie, indiferent dacă sunt sau nu coordonate. - Moartea este consecinţa încetării metabolismului adică a încetării coordonării reacţiilor chimice, dar nu se precizează cum se ajunge la încetarea metabolismului. Părerea că odată cu moartea manifestarea însuşirilor biologice ale materiei vii încetează datorită încetării metabolismului este greu de înţeles. Se ştie doar că încetarea manifestării unor însuşiri este condiţionată de transformarea materiei purtătoare a însuşirilor respective şi nicidecum de încetarea desfăşurării sau coordonării unor reacţii chimice. - Fenomenele şi legile biologice derivă, se reduc şi se deduc din fenomene şi legi chimice şi fizice, dar nu explică în ce constă şi cum se realizează (Macovschi, 1969). Conform teoriei biostructurale, materia vie (viul) constă din materie biostructurală şi din materie moleculară coexistentă. Materia biostructurală este o formă cu totul specială a materiei, prin alcătuirea sa specifică, ea se deosebeşte de materia moleculară obişnuită, iar, prin structură, este purtătoarea însuşirilor biologice pe care le imprimă viului din care face parte. - Materia biostructurală este alcătuită din componente. Acestea provin din molecule normale, obişnuite, ale combinaţiilor chimice adecvate, care printr-un schimb de energie, realizabil numai în condiţiile viului, se încarcă cu energie şi trec într-o stare specială, specifică viului, integrându-se în biostructură. Datorită stării speciale, componentele materiei biostructurale nu se mai comportă ca molecule, iar datorită surplusului de energie ele exercită în cadrul materiei biostructurate anumite funcţii elementare (biologice, bioritmice, cibernetice, genetice, informaţionale etc.) pe care nu le pot exercita atunci când se află în afara acestei materii, ca simple molecule. Exercitarea funcţiilor duce la manifestarea anumitor microfenomene, din a căror însumare derivă fenomenele biologice, manifestarea vieţii. Prin acumulări, cedări, şi consumuri de energie, componentele pot suferi modificări care nu implică obligatoriu, dar nici nu exclud, manifestarea structurii chimice a componentelor respective. Modificările componentelor se deosebesc profund de transformările chimice obişnuite, nu pot fi înţelese şi cercetate de pe poziţiile chimice şi reprezintă modificări sau reacţii biostructurale, totalitatea cărora constituie biostructurismul materiei vii. Componentele materiei biostructurale se leagă prin anumite forţe corelative, biovalenţele, care acţionează numai în viul. Datorită acestor forţe şi stării speciale a componentelor, materia biostructurală se prezintă ca un întreg continuu în care o modificare provocată în starea unei componente se transmite şi se repercutează asupra stării celorlalte. Prin alcătuirea, natura şi funcţiile sale speciale, materia biostructurală reprezintă o structură biologică dinamică, în continuă dezvoltare, care reflectă stadiul superior de dezvoltare şi organizare a materiei, prezintă particularităţi dependente de specie, individ, organ, ţesut, vârstă etc., are însuşiri de semiconductor şi de corp solid şi se comportă ca un sistem informaţional, cibernetic, cuantificabil, cvadridimensional, purtător al bioplasmei şi programului genetic, ce depăşeşte posibilităţile de înţelegere şi de investigaţie de pe poziţiile moleculare. 23

Odată cu moartea, biostructura se destramă, ceea ce duce nu numai la eliberarea unora din componentele ei sub formă de molecule, dar şi la apariţia unor fragmente polinucleare mai mari sau mai mici, care includ enzime şi alţi compuşi chimici. Aceste fragmente, cu aspect de membrane, nu preexistă ca atare în biostructură ci se formează ca artefacte pe măsura destrămării acesteia. Materia moleculară coexistă, formează materia nevie şi ca atare nu este purtătoarea însuşirilor biologice, dar participă la manifestarea acesteia în carul coexistenţei cu materia biostructurală. Biochimismul care se desfăşoară în materia moleculară coexistentă furnizează energia necesară atât schimbării moleculelor în componente, cât şi menţinerea integrităţii şi stării funcţionale normale a materiei biostructurale. La rândul ei, materia biostructurală, prin fenomenele care se desfăşoară la nivelul ei, contribuie atât la coordonarea biochimismului din materia moleculară coexistentă, cât şi la asigurarea compoziţiei chimice normale a acesteia. Astfel, cele două forme ale materiei, biostructurată şi moleculară coexistă şi formează acea unitate morfo-funcţională care constituie însăşi materia vie. Teoria biostructurală reprezintă un mod de gândire despre natura materiei vii care prezintă o serie de aspecte ipotetice, dar care deschide noi căi de cercetare ce vor confirma, modifica sau chiar abandona unele dintre aceste aspecte.

1.4.5. Teoria evoluţionistă, originea vieţii şi a omului Pentru omul de cultură, evoluţionismul a devenit o certitudine. Nimeni nu îşi pune problema originii omului decât din această unică perspectivă, cea a lui Darwin. În anul 1859 cercetătorul britanic, Charles Darwin lansa o teorie care încerca să explice originea speciilor de plante şi animale altfel decât prin creaţie. Conform acestei teorii, speciile ar evolua în mod naural unele din altele, de la forme simple la forme mai complexe şi astfel ar fi luat naştere toate vieţuitoarele existente astăzi, inclusiv omu, despre care se afirmă că ar fi provenit dintr-o specie de maimuţă. Acestă teorie, nu a fost demonstrată niciodată şi au existat numeroase dicuţii chiar în timpul lui Darwin, dar unele partide politice, fiind interesate mai ales de aspectul moral al problemei (dacă omul se trage din maimuţă, atunci suntem liberi să ne purtăm ca animalele ), au preluat ideea şi au reuşit să o impună ca teorie oficială. Astfel s-a ajuns ca în toate ţările guvernate de asemenea partide să se înveţe că omul se trage din maimuţă.Şi în şcolile din România, la toate nivele continuă să se predea teoria evoluţionistă, deşi au trecut 18 ani de la căderea comunismului. Din nefericire, subiectul evoluţionismului este încă încărcat de reacţii emoţionale, ceea ce face ca o mulţime de oameni să nu dorească să-l discute. Iată care sunt în prezent concepţiile cu privire la originea vieţii şi a omului: Š Evoluţionismul ateist este ipoteza care afirmă că speciile de animale s-au transformat unele în altele, de la primele vietăţi unicelulare până la maimuţă şi om, în mai multe miliarde de ani, mai afirmă că speciile de plante au evoluat de la forma unicelulară până la plantele cu flori şi că acest proces evolutiv s-a desfăşurat pe cale naturală, prin factori întâmplători. Dar, până în prezent, nu există nici o dovadă a evoluţiei speciilor, mai mult, raţionamentele evoluţioniste conţin erori de logică şi ştiinţa actuală respinge ipoteza evoluţiei. Š Evoluţionismul teist este ipoteza care afirmă că evoluţia speciilor este un fapt real, că ea a parcurs etapele prezenate de evoluţionismul ateist, dar că este rezultatul lucrarii directe a lui Dumnezeu. Aici sunt de facut două precizări, mai întâi, cât rămâne în domeniul ştiinţie, ipoteza evoluţiei rămâca o simplă ipoteză, însă, în momentul în care este inclusă în învăţătura de credinţă, ipoteza devine o erezie.Teoria susţine că Dumnezeu a creat doar două vietăţi unicelulare pe care le-a ajutat apoi să evolueze până la maimuţă şi om, în miliarde de ani.

24

Š Creaţionismul fixist, este doctrina conform căreia speciile nu suferă nici o schimbare, ci rămân exact cum au fost create. Realitatea arată că în cadrul speciilor pot apărea rase sau soiuri, fără a depăşi graniţile speciei. Š Creaţionismul ştiinţific este teoria ştiinţifică(bazată pe genetică, pe teoria probabilităţilor şi pe teoria informaţiei) ce demonstrează că este imposibil ca speciile să apară spontan (din întâmplare) şi să evolueze, transformându-se una în alta. Din această imposibilitate rezultă că speciile au fost create de un Creator. Referitor la fenomenul „evoluţiei” se acceptă un proces evolutiv numit microvoluţie, prin care, pornind de la populaţii, rase şi soiuri, prin mutaţii genetice pot să apară populaţii, rase şi soiuri noi de plante şi animale în cadrul aceleiaşi specii (indivizii deci, se pot încrucişa între ei dând naştere la urmaşi fertili). Prin extensia acestui fenomen evolutiv – microevoluţie – desfăşurat la nivelul speciilor (care se pot încrucişa între ele) s-a ajuns la macroevoluţie, fenomen ipotetic care încearcă să explice originea speciilor de plante şi animale conform teoriei lui Darwin, teorie aflată în contradicţie cu creaţionismul, care afirmă că speciile de plante şi animale, inclusiv omul, au fost create de Dumnezeu. Unul dintre cei mai mari biologi, Piere P. Grassé, fost preşedinte al Academiei Franceze de Ştiinţe, îşi încheie cartea sa Ľ Évolution du vivant (Evoluţia organismelor vii,1973) cu acest nimicitor rechizitoriu al evoluţiei darwiniste: „ Prin uzul şi abuzul unor postulate ascunse, al unor îndrăzneţe şi adesea neîntemeiate extrapolări, s-a creat o pseudo – ştiinţă. Ea prinde rădăcini în chiar miezul biologiei, făcând să rătăcească numeroşi biochimişti şi biologi, ce cred în mod sincer că acurateţea conceptelor fundamentale a fost demonstrată, ceea ce este departe de realitate.” Începând cu anii optzeci, tot mai mulţi savanţi necreaţionişti au făcut cunoscut că teoria neodarwinistă (modelul evoluţionist actual), nu poate explica noile date din domeniul geologiei, paleontologiei, astronomiei, geneticii, fizicii, biochimiei şi a altor ştiinţe. Astfel, în anul 1985 a apărut cartea lui Michael Denton, cercetător australian în domeniul biologiei moleculare, Evolution: A Theory in Crisis (Evoluţia: criza unei teorii), ce oferă o critică sistematică a modelului evoluţionist actual din perspectiva mai multor discipline ştiinţifice.Din punctul de vedere al propriei discipline, Denton arată că descoperirile specialiştilor în biologie moleculară aruncă din ce în ce mai multe îndoieli asupra pretenţiilor darwiniste. În anul 1996 apare cartea renumitului profesor de biochimie de la Berkeley University din California, Michael Behe, Darwin's Black Box (Cutia neagră a lui Darwin), în care se arată că uimitoarele descoperiri ale biochimiei nu se împacă deloc cu nici un fel de darwinism. În 1997 o altă carte ce dădea de gândit a constituit o puternică lovitură împotriva darwinismului: Not By Chance !( Nu întâmplător !) de Dr.Lee Spetner. Biofizician evreu, specializat în codul genetic, Spetner şi-a petrecut 30 de ani cercetând posibilitatea evoluţiei la nivel genetic. El arată nu numai de ce mutaţiile întâmplătoare nu vor produce niciodată schimbările pretinse de evoluţionişti, ci oferă şi noi căi ştiinţifice de investigare a felului cum are loc variaţia în limitele genetice ale fiecărui fel de organism. În ultimii ani, savanţi reputaţi au început să ridice serioase îndoieli asupra evoluţiei, darwiniste, astfel că până în prezent a apărut o mare cantitate de literatură ştiinţifică extrem de critică la adresa teoriei evoluţioniste. Unii caută un nou model, deşi nu prea ştiu unde să-l găsească. Ar fi desigur prea mult să socotim că toţi aceştia se vor întoarce către „modelul creaţionist”, întrucât, nici creaţia, nici evoluţia nu pot fi dovedite în chip definitiv: de fapt, amândouă ţin de credinţă şi filozofie, de o alegere iniţială.

25

Capitolul 2 MEMBRANELE CELULARE O ramură aparte a biologiei moleculare – biomembranologia - a fost oficializată în anul 1977, cu ocazia unui simpozion desfăşurat în Germania, la Karlsruhe. Această nouă ramură a biologiei, care se ocupă cu studiul membranelor celulare, a reuşit să se contureze prin colaborarea interdisciplinară a unui număr foarte mare de specialişti în domeniul biologiei, medicinii, biofizicii, biochimiei. În 1950 erau descrise doar două membrane: cea plasmatică şi cea nucleară. În cursul anilor 60, datorită posibilităţilor de investigaţie oferite de microscopia electronică, au putut fi evidenţiate şi studiate în detaliu un număr tot mai mare de structuri membranare (tip organite permanente celulare: reticul endoplasmatic, mitocondrii, complex Golgi, cât şi structuri cu viaţă limitată, tip vezicule de condensare şi lipozomi). Orice pătrundere din mediul exterior în interiorul organismului implică un schimb transmembranar. Prin urmare, substanţele exogene trebuie să traverseze una sau mai multe membrane biologice înainte de a ajunge la centrii activi. Traversarea membranelor este condiţionată de: natura chimică şi organizarea moleculelor constitutive ale membranei; proprietăţile fizico-chimice ale substanţei, structura fizico-chimică a moleculelor mediului de o parte şi de cealaltă a membranei.

2.1. Definiţia şi clasificarea membranelor celulare Membranele celulare reprezintă structuri complexe ce delimitează şi compartimentează conţinutul celular. Arhitectura tuturor membranelor celulare (membrana plasmatică şi membranele organitelor) prezintă drept caracteristică comună asamblarea prin legături necovalente a biomoleculelor componente (lipide şi proteine) într-o structură dinamică şi fluidă. Elementul structural fundamental al membranelor celulare, dublul strat lipidic, defineşte modul de organizare al lipidelor şi se comportă ca o barieră impenetrabilă pentru majoritatea moleculelor hidrofile (aqua-solubile). Proteinele membranare, asociate dublului strat lipidic, asigură funcţionalitatea membranelor, ele fiind implicate în multiple procese: Š transportul molecular şi ionic transmembranar; Š realizarea conexiunilor intercelulare şi a ancorării celulelor în matricea extracelulară; Š desfăşurarea reacţiilor enzimatice asociate structurilor membranare; Š controlul fluxului de informaţie dintre celulă şi mediul înconjurător prin recunoaşterea, legarea şi transmiterea moleculelor-semnal; Š imunitatea celulară. Grefarea seturilor distincte de proteine în dublul strat lipidic, cât şi stabilirea unui anumit raport între principalele molecule componente conduc la clasificarea membranelor celulare în trei tipuri: Membrana citoplasmatică (membrana plasmatică, plasmalema) este o structură bidimensională continuă (grosimea 6-10 nm), cu proprietăţi caracteristice de permeabilitate selectivă, ce conferă individualitate celulei, separând-o de mediul înconjurător. Membranele interne ale celulelor eucariote – endomembranele - (grosimea 6 nm) compartimentează spaţiul intracelular, delimitează organitele celulare (nucleu, reticul endoplasmatic, aparat Golgi, mitocondrii, lizozomi, peroxizomi), creând astfel spaţii adecvate reacţiilor enzimatice celulare. Membranele speciale prezintă particularităţi structurale, în această categorie încadrându-se: teaca de mielină, o structură multimembranară derivată din membrana

26

plasmatică a celulelor Schwann ce înconjoară şi izolează axonul celulelor nervoase; discurile suprapuse localizate în regiunea externă a celulelor fotoreceptoare din retină.

Fig. 4. Structura inframicroscopică a celulei 1-membrana celulară; 2endoplasma (hialoplasma); 3ergastoplasmă; a-reţea endoplasmatică (membrane cu dublu contur); b-granulaţii fine (microzomi); 4-filamente intracelulare (descoperite în celule epiteliale, fibroblaşti, în celule nervoase); 5-vacuolă; 6-granule lipidice; 7-centrul celular; 8centrosferă; 9-nucleu; c-membrana nucleului; d-pori în membrana nucleului; 10-nucleol; 11-aparatul Golgi; 12-mitocondrii

2. 2. Organizarea membranelor celulare În prezent se bucură de acceptare unanimă modelul în „mozaic fluid” lipido-proteic elaborat în 1971-1972 de către Singer şi Nicolson care satisface condiţiile de stabilitate termodinamică ale sistemelor membranare. Elementele care l-au impus constau pe de o parte, în confirmarea dublului strat lipidic ca element fundamental al structurii membranelor şi pe de altă parte, în definirea modului de asamblare a proteinelor în dublul strat lipidic. Autorii concep membrana celulară ca pe un fluid structurat alcătuit dintr-un bistrat lipidic aflat într-o stare de cristal lichid şi care este penetrat local sau parţial de proteine globulare cu caracter insular (fig. 5). Lipidele şi proteinele membranare, relativ libere prezintă mobilitate în planul membranei executând mişcări de difuziune şi rotaţie în jurul propriilor axe. La componentele de bază ale membranelor - lipidele şi proteinele - se adaugă constant carbohidraţii, apa şi o serie de ioni. Pe partea citoplasmatică membrana este susţinută (în numeroase cazuri) de o reţea de proteine fibrilare ce constituie un citoschelet.

27

Fig. 5. Structura unei membrane biologice (Stryr, 1991) a şi b = proteine periferice de membrană; c = proteină de membrană (tip lecitinic): traversează bistratul lipidic; d = proteină de membrană (tip Ig): traversează bistratul lipidic Modelul „mozaicului fluid” oferă cadrul conceptual adecvat pentru explicarea atât a funcţiilor de transport, cât şi a plasticităţii conformaţionale a celulelor, a proceselor imunologice şi a efectelor produse asupra membranelor de diferiţi agenţi chimici (hormoni, mediatori chimici, medicamente, toxine etc.). Membranele biologice au structuri fluide dinamice în continuă modificare; în fiecare moment, proteinele şi lipidele din structura membranelor sunt înlocuite cu altele noi. Ribozomii şi reticulul endoplasmatic, care sintetizează aceste proteine de membrană, le înzestrează cu capacitatea de a se îndrepta spre anumite ţinte, către anumite sedii celulare (transport vectorial). În celula vie, sinteza de membrane se face prin extensia membranelor preexistente (pattern-uri de membrană) în cursul procesului de multiplicare celulară (mitoza sau meioza), când celula mamă transmite celor două celule fiice o dată cu zestrea celulară şi o anumită zestre de membrană. Această moştenire a pattern-urilor de membrană de către celulele fiice de la celula mamă reprezintă un aspect al continuităţii în timp şi spaţiu a sistemului de membrane. Aceste aspecte de continuitate asigură de fapt continuitatea de funcţionare a celulei şi implicit, desfăşurarea normală a metabolismului celular. S-a dovedit că toate moleculele proteice din structurile de membrane vegetale sau animale au viaţă relativ scurtă, fiind înlocuite mai rapid (rapid turnover) sau mai puţin rapid (slow turnover). Din acest aspect reiese că orice tip de membrană biologică are o continuitate de organizare, dar nu şi continuitate de substanţă, deoarece din stratul proteic sunt înlocuite în permanenţă un număr de molecule de aminoacizi vechi cu molecule noi corespunzătoare, deşi funcţia respectivei proteine rămâne în permanenţă nemodificată.

2.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare Lipidele membranare formează un dublu strat cu grosimea de 4-5 nm: un strat extern, orientat spre faţa externă a membranei şi un strat intern, orientat spre faţa internă citoplasmatică a membranei. Lipidele sunt molecule insolubile în apă, dar înalt solubile în solvenţi organici (cloroform). Într-un µm2 de dublu strat lipidic se găsesc 5 x 106 molecule lipidice. Deşi compoziţia lipidică a diferitelor membrane variază mult, fosfolipidele, colesterolul şi glicolipidele reprezintă clasele de lipide cel mai frecvent întâlnite în structura membranelor biologice (tabelul 1). 28

Tabelul 1. Procent din greutatea moleculară totală a lipidelor membranare

Lipide Colesterol Fosfolipide Glicolipide Alte lipide

Membrana plasmatică a celulei hepatice (%) 17 54 7 22

Membrana plasmatică a eritrocitului (%) 23 60 3 13

Teaca de mielină (%) 22 42 28 8

Membrana externă şi internă a mitocondriei (%) 3 76 urme 21

Membrana reticulului endoplasmatic (%) 6 67 urme 27

Bistraturile lipidice membranare sunt formate din fosfo- şi glicolipide, ele reprezentând bariere de permeabilitate pentru moleculele hidrosolubile, deşi straturile sunt aproape fluide. Aceste lipide de membrană sunt amfipatice, conţin un cap hidrofilic, care are o varietate de structură relativ mică şi poartă sarcini electrice şi o coadă hidrofobă, formată din 12-24 atomi de carbon, lipsită de sarcini electrice şi cu o mare varietate de structură care se datorează unor acizi graşi deosebiţi. Acizii graşi pot fi saturaţi sau nesaturaţi, ei diferă cantitativ şi calitativ în raport cu specia, vârsta, condiţiile de viaţă etc. Cu cât gradul de nesaturare al acizilor este mai mare, cu atât fluiditatea structurilor membranare este mai mare. Datorită acestui caracter amfipatic, lipidele, în mediu lichid, pot forma: micelii (fig. 6a), strat dublu linear (fig. 6b), strat dublu circular (lipozomi, fig. 6c).

Fig. 6. Cele trei forme pe care le pot lua moleculele de lipide în mediu lichid datorită proprietăţilor lor amfipatice În acest strat dublu, capul hidrofilic este orientat spre exterior, iar coada hidrofobă este orientată spre interior. Moleculele de lipide se deplasează foarte rapid rotindu-se în jurul propriului lor ax şi difuzând lateral, în acest fel asigurând fluiditate de membrană. Fluiditatea este asigurată de prezenţa acizilor graşi şi a colesterolului. La eucariote, proporţia fosfolipide/colesterol în membrana plasmatică este de 1/1, colesterolul aflându-se la extremitatea hidrofilă, prevenind scăderea fluidităţii membranelor. Procesul de formare a acestui bistrat lipidic în mediu apos este un proces de autoasamblare, rolul major avându-l forţa de interacţiune hidrofobă (interacţiune necovalentă). Straturile bilipidice sunt înalt impermeabile pentru ioni şi pentru cele mai multe molecule polare (cu excepţia apei, care traversează foarte rapid această membrană). Pentru traversarea stratului bilipidic, bistratificat, o moleculă necesită o cantitate foarte mare de energie.

29

2.2.2. Componenta proteică a membranelor celulare În stratul lipidic plutesc proteine rigide hidrofobe. Proteinele reprezintă 50% din volumul de membrană. În timp ce lipidele au rol de barieră de permeabilitate şi de delimitare a componentelor biologice, proteinele mediază aproape toate funcţiile, de exemplu, proteinele din membrana plasmatică au rol de pompe în transportul transmembranar, receptori, enzime, antigene de membrană, iar proteinele din membrana internă a mitocondriilor şi cloroplastelor au rol de transductori de energie. Membranele care îndeplinesc funcţii diferite conţin în structura lor şi proteine diferite. Proteinele pot fi inserate în dublul strat lipidic în diferite moduri; acestea pătrund adânc sau chiar traversează stratul de lipide al membranei, numindu-se proteine integrale sau intrinseci (tip Ig), altele pot fi implantate la nivelul unui singur strat din cele două ale membranei lipidice (tip lecitinic), iar altele pot fi ataşate doar covalent (adsorbite) la extremitatea polară hidrofilă a lipidelor şi se numesc periferice sau extrinseci. Proteinele sunt amfipatice, conţinând o regiune hidrofobă care reacţionează cu regiunea hidrofilă lipidică (din interiorul stratului lipidic) şi o regiune hidrofilă situată la suprafaţa internă şi respectiv externă a membranei. În acest fel cele două suprafeţe de membrană diferă între ele prin cantitatea de lipide şi proteine, realizând o asimetrie funcţională. În regiunea transmembranară, proteinele de membrană conţin predominant regiuni hidrofobe cu structură secundară tip α-helix şi structuri terţiare şi cvaternare compacte. Proteinele de membrană pot forma pete difuze, se pot deplasa spre polii celulei unde sunt eliminate sau pot fi blocate în mişcarea lor laterală, rămânând fixe în plan orizontal (formând agregate care se ancorează de alte structuri ale citosolului sau de proteine din membranele celulare vecine). Proteinele periferice (extrinseci) pot fi eliberate prin simpla spălare cu soluţii saline sau prin modificări de pH (de exemplu, spectrina, localizată pe suprafaţa citoplasmei eritrocitelor, sau actina, cu rol în contracţia musculară). Proteinele integrale (intrinseci) interacţionează strâns cu hidrocarbonaţii din lipidele de membrană şi nu pot fi disociate decât în prezenţa detergenţilor şi a solvenţilor organici.

2.2.3. Mobilitatea lipidelor şi proteinelor de membrană Lipidele şi proteinele de membrană difuzează rapid în planul membranar, având o mişcare laterală constantă, ceea ce face ca o membrană biologică să nu fie o structură rigidă. Proteinele prezintă numai difuziune laterală; lipsa difuziei transverse face posibilă păstrarea timp îndelungat a asimetriei de membrană. O moleculă lipidică poate călători de la un capăt la altul al celulei bacteriene în timp de o secundă. Unele proteine de membrană difuzează în timp de un minut la distanţă de câţiva microni; alte proteine (rodopsina) sunt la fel de mobile ca şi lipidele, altele sunt virtual imobile (fibronectina). Lipidele prezintă difuziune laterală - mişcare paralelă cu planul bistratului (difuziune în planul membranei) sau transversă (tip fleep - flop), adică rotaţie spontană a moleculei lipidice de pe o faţă a membranei pe cealaltă. Este un proces foarte lent. Se produce o rotaţie la câteva ore (de exemplu, fosfolipide, urmărite prin tehnica de rezonanţă magnetică). Pe baza datelor prezentate se poate considera că atât fluiditatea dublului strat lipidic, cât şi liberă deplasare a lipidelor şi proteinelor în structurile membranare, constituie principalele elemente ce stau la baza caracterului dinamic al membranelor celulare.

30

2.2.4. Componenta glucidică membranară Carbohidraţii se întâlnesc pe suprafaţa tuturor membranelor plasmatice ale celulelor eucariote şi reprezintă 2-10% din greutatea componentelor membranare. Carbohidraţii, sub forma oligo- şi polizaharidelor se leagă covalent de proteine şi lipide formând glicoproteinele şi respectiv, glicolipidele. Dacă majoritate proteinelor aflate pe suprafaţa celulară sunt glicoproteine, numai una din 10 molecule lipidice ale monostratului extern conţine carbohidraţi. Carbohidraţii se întâlnesc şi în structura proteoglicanilor, molecule membranare integrale alcătuite din lanţuri polizaharidice lungi legate de un miez proteic. Proteina din structura proteoglicanilor traversează dublul strat lipidic, în timp ce lanţurile polizaharidice rămân în afara celulei, constituind parte componentă a matrixului extracelular. Zaharurile sunt foarte hidrolitice, ele preferă să se orienteze spre suprafaţa apoasă a membranei (şi nu spre miezul hidrofob), deoarece orientarea inversă ar cere un consum foarte mare de energie; deci absenţa respectivei cantităţi de energie reprezintă o barieră puternică în calea rotirii de tip fleep-flop a moleculei de hidrocarbonat. Hidrocarbonaţii de pe suprafaţa celulară au o mare densitate de structură şi au rol în recunoaşterea intercelulară (faţă de celulele sistemului imunitar). Structurile de glicoproteine au funcţie de receptori, ele primesc informaţia din mediul extern şi o transmit spre interiorul celulei sub forma unor cascade de reacţii biochimice, care au drept consecinţă modificări ale activităţii celulare (activitatea secretorie, de multiplicare, etc).

2.2.5. Glicocalixul Suprafaţa celulară este alcătuită din trei elemente: cortexul celular (zona periferică citoplasmei), membrana plasmatică şi glicocalixul, în cazul celulelor animale. Glicocalixul reprezintă zona periferică a suprafeţei celulei animale. În structura sa intră atât lanţurile oligo- şi poliglucidice ale glicolipidelor şi glioproteinelor membranare, cât şi glicoproteine sintetizate de celulă şi apoi absorbite pe suprafaţa celulară (Fig. 7). Faptul că cele două componente ale glicocalixului sunt în acelaşi timp şi elemente ale matricei extracelulare face dificilă stabilirea unei linii clare de demarcaţie între suprafaţa celulară şi matrice. Rolul glicocalixului nu este pe deplin elucidat. Concentraţia mare de oligozaharide complexe la suprafaţa celulară poate sprijini ipoteza implicării acestei structuri în procese de recunoaştere celulă-celulă sau celulă-matrice. De asemenea, majoritatea lanţurilor oligozaharidice conţin unul sau mai multe reziduuri de acid sialic, moleculă cu sarcină electrică negativă. Glicocalixul realizează deci, distribuţia sarcinilor electrice pe suprafaţa celulei. În plus, datorită încărcării electrice negative, glicocalixul poate funcţiona ca depozit de cationi (Ca2+) ce sunt mobilizaţi în celulă în funcţie de necesităţile exprimate la un moment dat.

Fig. 7. Prezentarea schematică a glicocalixului

31

2.2.6. Apa Apa deţine un loc important în structura membranară alături de celelalte componente chimice. Se găseşte în proporţie de 30-50 % asociată intim fie structurilor de la suprafaţă, fie sub formă foarte ordonată, structural asemănătoare gheţii (apa legată chimic). Într-o astfel de stare, apa joacă un rol precumpănitor în procesele de organizare moleculară a membranei, intervenind în stabilitatea structurilor proteice şi fosfolipidice bistratificate, ca un liant. Permeabilitatea selectivă poate fi privită ca fiind în raport cu apa structuralizată din membrană. Modificările de permeabilitate determinate de procesul de excitaţie poate fi consecinţa „topirii” structurii hidrice în anumite regiuni.

2.2.7. Asimetria distribuţiei componentelor membranare Imaginea membranei celulare ca o „soluţie lipidică” în care plutesc moleculele proteice pare astăzi simplistă. În multe celule proteinele şi lipidele sunt menţinute în regiuni bine delimitate ale membranelor. Distribuţia asimetrică a moleculelor membranare joacă un rol esenţial în realizarea funcţiilor celulare. Distribuţia asimetrică a compartimentului lipidic pe cele două feţe ale dublului strat lipidic a fost pusă în evidenţă pentru prima dată în membranele eritrocitelor. Astfel, în timp ce în monostratul extern al membranei predomină fosfatidilcolina şi sfingomielina, stratul intern conţine fosfotidiletanolamina şi fosfatidilserina drept componente lipidice majore. Deosebirile dintre aceste lipide nu se limitează doar la natura grupărilor polare, ea se referă şi la gradul de nesaturare a lanţurilor hidrocarbonate, ceea ce, în planul membranei, determină o fluiditate diferită a celor două straturi lipidice. În acest context este de remarcat faptul că există şi o distribuţie asimetrică a sarcinilor electrice. Singurul fosfolipid cu sarcină electrică negativă, fosfatidilserina, este localizat în monostratul intern al membranei eritrocitare. Implicaţiile asimetriei lipidelor la nivel funcţional nu sunt încă pe deplin cunoscute. Este posibil ca activitatea diferitelor proteine membranare să fie dependentă de microclimatul creat prin prezenţa fosfolipidelor specifice. De asemenea, activitatea enzimatică a proteinelor asociate structurilor membranare poate fi condiţionată de sarcina electrică a fosfolipidelor. Localizarea glicolipidelor în monostratul extern al membranelor plasmatice, cât şi caracterul lor special sugerează implicarea acestor molecule ca receptori în procesele de comunicare intercelulară. În acelaşi timp, toate proteinele membranare integrale au o orientare strictă în raport cu faţa citoplasmatică şi cea externă a membranei celulare. În plus, proteinele transmembranare sunt în majoritate molecule glicolizate. În membranele plasmatice lanţurile oligozaharidice marchează faţa exoplasmatică, în timp ce, în membranele organitelor celulare (reticul endoplasmatic, aparat Golgi) ele se găsesc pe faţa citoplasmatică. Stricta orientare a glicoproteinelor este corelată cu funcţiile celor două feţe ale membranelor celulare. Moleculele proteice transmembranare ce conţin cisteină cunosc şi ele o orientare strictă. Mai mult, grupările sulfhidril ale cisteinei formează punţi disulfurice inter şi/sau intra-catenare, doar pe faţă externă a membranei. În anumite celule, distribuţia asimetrică a lipidelor şi proteinelor conduce la delimitarea unor domenii specifice în membranele plasmatice. Astfel, membrana celulelor epiteliale este împărţită în domenii distincte: apical şi latero-bazal, ambele având un conţinut proteic şi lipidic diferit. Ca urmare, celulele epiteliale sunt capabile să împiedice difuzia moleculelor membranare. Acest lucru se realizează prin intermediul joncţiunilor strânse ce funcţionează ca o barieră între cele două domenii membranare.

32

2. 3. Mecanismele de transport prin membranele celulare Celula, din punct de vedere termodinamic, este un sistem deschis, existenţa sa fiind condiţionată de stabilirea unei permanente comunicări cu mediul înconjurător. Abordând această problemă din perspectiva schimbului de substanţe pe care celula îl realizează cu mediul extern, un rol major revine membranei plasmatice datorită caracteristicii sale fundamentale, permeabilitatea selectivă. Aceasta face posibilă alimentarea celulei cu molecule esenţiale (glucoză, aminoacizi, lipide) şi eliminarea atât a produşilor fiziologic activi (enzime, hormoni), cât şi a celor rezultaţi ca „deşeuri” în urma metabolismului celular (CO2, săruri de amoniu, uree). În paralel cu asigurarea continuităţii acestor schimburi, permeabilitatea selectivă creează cadrul favorabil desfăşurării unei activităţi metabolice stabile, atât prin menţinerea în spaţiul intracelular a unei concentraţii relativ constante de substanţe organice, metaboliţi şi electroliţi, cât şi prin reglarea volumului celular ca rezultat al relaţiilor osmotice celulă-mediu. Permeabilitatea selectivă se modifică dinamic aflându-se sub influenţa modificărilor mediului extracelular şi a metabolismului celulei. Această caracteristică a membranelor celulare prezintă particularităţi în raport cu diferenţierea funcţională a celulelor. Selectivitatea diferenţiată se manifestă atât la trecerea substanţelor din exterior în celulă, cât şi în sens invers. Deci, la baza noţiunii de permeabilitate selectivă stă conceptul de membrană ca barieră a schimburilor celulare. Traficul de substanţe ce se desfăşoară atât prin membrana plasmatică cât şi prin membranele interne ce delimitează organitele celulare antrenează diferite mecanisme de transport.

2.3.1. Procesul calitativ al traversării membranelor Se consideră că au loc următoarele etape (fig. 8): ƒ molecula trebuie să avanseze în zona apoasă (mediu şi zona periferică a membranei), ceea ce se realizează după legile difuziei simple în mediu apos. Fiecare moleculă formează legături de hidrogen cu apa din interiorul celulei. Agitaţia termică a moleculelor asigură moleculei energia de activare necesară ruperii unor legături de hidrogen, cu refacerea lor spontană şi imediată. În momentul când molecula atinge stratul hidrofil al membranei, acesta având conţinut de apă apropiat de cel al mediului, permite continuarea mişcării libere a moleculei. Prin urmare, traversarea stratului exterior hidrofil se realizează fără consum de energie (fig. 8, porţiunea a); ƒ în etapa următoare, molecula trebuie să se desprindă de stratul hidrofil şi să treacă în stratul lipofil, ceea ce necesită o energie de activare moleculară (fig. 8, porţiunea b). ƒ În raport cu caracteristicile moleculare, variază şi intensitatea energiei necesare pentru intrarea moleculei în stratul hidrofob; ƒ continuarea difuziei în startul hidrofob nu reclamă energie de activare suplimentară pentru că trebuie să se desfacă legături de hidrogen (fig. 8, porţiunea c); ƒ în fine, molecula părăseşte stratul hidrofob (fig. 8, porţiunea d), fenomen facilitat de formarea legăturilor de hidrogen cu moleculele de apă din stratul membranar proteic hidrofil interior, de unde trece prin acelaşi fenomen, în citoplasmă (fig. 8, porţiunea e).

33

Fig. 8. Modificările energetice care însoţesc traversarea unei molecule hidrosolubile printr-o membrană biologică (după Maziliak). Se descriu următoarele posibilităţi de traversare a unei membrane: ƒ proces pasiv: transfer pasiv, care asigură trecerea moleculelor mici hidrosolubile, inclusiv apa, prin simpla filtrare prin pori (filtrarea) şi a moleculelor mari liposolubile prin dizolvare în membrană (difuzia simplă); ƒ proces biochimic: transport specializat, fie activ, fie facilitat; ƒ proces biologic: endocitoză, când particulele de substanţă sunt înglobate de membrana celulară prin mişcări de invaginare şi transfer astfel spre interior.

2. 3 .2. Transportul ionilor şi moleculelor mici prin membranele celulare Maniera în care substanţele trec prin membranele celulare este determinată pe de o parte de caracteristicile substanţelor (greutate moleculară, dimensiuni, formă, grad de hidratare (grad de ionizare) iar pe de altă parte, de compoziţia chimică a membranelor. Principalul criteriu de clasificare a tipurilor de transport îl reprezintă dimensiunile substanţelor ce străbat membrana. Astfel, în timp ce ionii şi moleculele mici traversează dublul strat lipidic prin difuziune sau implicând proteinele membranare, transportul macromoleculelor şi al particulelor necesită sechestrarea lor în vezicule delimitate de membrane. Un alt criteriu de clasificare este consumul de energie metabolică sub formă de ATP. Din acest punct de vedere se disting două tipuri de transport: pasiv şi activ. 2.3.2.1.Transportul pasiv Traversarea membranelor celulare de către molecule şi ioni în sensul gradientului de concentraţie sau electrochimic (compus din gradientul de concentraţie şi gradientul electric) poartă numele de transport pasiv. Procesul nu implică consum de energie (ATP), dimpotrivă, el decurge cu pierdere de energie liberă. Unele gaze (O2, CO2) şi unele molecule mici cu caracter hidrofob sunt capabile să străbată dublul strat lipidic membranar prin difuziune simplă. Transportul moleculelor solubile în apă (glucoză, nucleotide, amonoacizi) şi al unor ioni (H+, K+, Na+, Ca2+) nu poate fi realizat în aceeaşi manieră, necesitând participarea unor proteine membranare specifice. Acest tip de transport este denumit difuziune facilitată. a. Difuzia simplă Cel mai simplu tip de transport pasiv constă în difuzia fizică a moleculelor determinată de gradientul lor de concentraţie sau electrochimic. În difuzia simplă moleculele nu sunt modificate chimic sau asociate altor specii moleculare în timpul trecerii lor prin membrană. Viteza cu care se desfăşoară etapa trecerii moleculelor din mediul apos extracelular/intracelular în interiorul hidrofob al membranei este dependentă de coeficientul de partiţie (K) al moleculei. Acesta măsoară afinitatea relativă a moleculei pentru mediul lipidic în raport cu apa, ilustrând gradul de hidrofobicitate al moleculei. Astfel, cu cât valoarea sa este mai mare, cu atât molecula are un mai pronunţat caracter hidrofob, deci este mai liposolubilă şi pătrunde mai repede în celulă. Se constată existenţa unei relaţii de directă proporţionalitate între coeficientul de partiţie al unei molecule şi 34

constanta de permeabilitate (P) a membranei celulare. Datorită vâscozităţii dublului strat lipidic, viteza de difuziune a moleculei prin interiorul membranei este mult inferioară vitezei sale de difuziune printr-un mediu apos. În cazul transportului prin difuzie simplă a moleculelor fără sarcini electrice, se respectă legea lui Fick. Aceasta enunţă că viteza de difuziune (dn/dt) a unei molecule este proporţională cu diferenţa de concentraţie, suprafaţa (S) şi coeficientul de permeabilitate (P). Deci, viteza de difuziune a unei molecule prin membrană conform legii lui Fick este: (dn/dt)= PxS (C1aq – C2aq)

unde: S - reprezintă suprafaţa membranei P este coeficientul de permeabilitate al membranei; C1aq, C2aq - sunt concentraţiile mediilor apoase separate de membrana celulară. Difuzia simplă prin membranele celulare se realizează cu pierdere de energie liberă. Calculele termodinamice demonstrează că la deplasarea unui mol de substanţă fără sarcină electrică, de la o concentraţie de 1M la o concentraţie de 0,1M (la 250C) sistemul pierde o energie liberă de 1,359 kcal/mol. În difuzia moleculelor încărcate electric legea lui Fick nu mai are aplicabilitate, procesul fiind exclusiv determinat de gradientul electrochimic. b. Difuzia facilitată În procesul de difuziune facilitată, transportul pasiv al moleculelor prin membrană este mediat de proteine membranare numite permeaze. Spre deosebire de difuzia simplă, difuzia facilitată se caracterizează prin specificitate faţă de molecula transportată. Permeaza leagă reversibil şi complementar la un situs activ o singură specie moleculară sau molecule aparţinând unei singure familii. În urma legăturii ce are loc pe o faţă a membranei se formează un complex moleculă-permează ce traversează dublul strat lipidic, disociindu-se pe cealaltă faţă a membranei cu eliberarea moleculei transportate. Unul din modelele care au încercat să explice maniera în care se desfăşoară difuzia facilitată este modelul transportorilor cărăuşi (carrier model). În acest model se consideră că transportorul exercită o mişcare de navetare sau rotaţie în dublul strat lipidic, fiind astfel capabil să treacă molecula transportată de pe o faţă pe alta a membranei celulare. Deoarece difuzia facilitată este un tip de transport pasiv, iar rotirea unei molecule proteice în planul membranei este defavorizată din punct de vedere energetic, modelul „carrier” rămâne aplicabil numai pentru transportul anumitor ioni de către polipeptide antibiotice (de exemplu, transportul ionului de K+ de către valinomicină). Cea mai bine caracterizată permează, D-gluco-permează (sau D-hexozo-permează), catalizează difuzia facilitată a glucozei prin membrana eritrocitelor (Fig. 6). D-glucopermeaza este o proteină transmembranară alcătuită de 12 α-helixuri care au în majoritate un caracter hidrofob. Are o greutate moleculară de 45.000 Da.

Fig. 9. Mecanismul transportului mediat de Dgluco-permează În parte, permeabilitatea selectivă a membranelor plasmatice poate fi explicită prin existenţa proteinelor canal. Aceste proteine transmembranare, străbătute de un canal delimitat de aminoacizi hidrofili, formează porii membranari. Proteinele canal specializate în transportul selectiv al diferitelor specii ionice se 35

numesc proteine canal de ioni. Transportul mediat de aceste proteine nu necesită consum de energie, ionii difuzând cu viteze diferite prin membrană în sensul gradientelor de concentraţie. Proteinele canal de ioni se deschid tranzitoriu, caracteristică ce a sugerat denumirea lor de proteine canal cu poartă (gate channels). De regulă, deschiderea canalelor reprezintă un răspuns celular la diferite semnale recepţionate de membrana plasmatică. În funcţie de factorii ce comandă deschiderea porţilor, se deosebesc trei tipuri de proteine canal: ƒ cu poartă comandată de stimuli mecanici; ƒ cu poartă comandată de liganzi. ƒ cu poartă comandată de voltaj (dependente de valoarea potenţialului de membrană) (Fig. 12). În acest caz canalele se deschid în urma legării la un receptor a unei molecule semnal ce poate fi un mediator extracelular (neurotransmiţător) sau un mediator intracelular (ion, nucleotid, proteină de legare a GTP) (Fig. 10, 11);

A Fig. 10. Modificarea conformaţională a receptorului acetilcolinic - proteină canal de Na+ cu poartă comandată de ligand.

B Fig. 11. Schema joncţiunii neuromusculare şi principalele proteine canal de ioni implicate de declanşarea contracţiei musculare sub acţiunea impulsului nervos. A - starea de repaus; B - starea activată

Fig. 12. Structura canalului de Na+ cu poartă comandată de voltaj 2.3.2.2. Transportul activ Deplasarea moleculelor şi ionilor prin transport pasiv evoluează spre egalarea concentraţiilor de o parte şi de alta a membranei şi, implicit, dispariţia potenţialului 36

membranar. Pentru a menţine homeostazia mediului intracelular, celula şi-a creat mecanisme de transport activ capabile să deplaseze moleculele şi ionii în sens invers gradientelor lor de concentraţie şi electrochimic. Acest tip de transport este mediat de proteine specifice şi prezintă toate caracteristicile cinetice ale difuziei facilitate. Plusul de independenţă faţă de compoziţia mediului înconjurător, pe care transportul activ îl oferă celulei, implică consum de energie metabolică. Astfel, eritrocitele utilizează 50% din energia stocată în moleculele de ATP pentru a menţine o concentraţie ionică relativ constantă a mediului intracelular. În funcţie de modul în care este utilizată energia se deosebesc două tipuri de transport activ. În transportul activ propriu-zis, molecula transportoare are funcţie ATP-azică, fiind capabilă să utilizeze direct energia rezultată în urma hidrolizei ATP în procesul de transport (pompele ionice). Al doilea tip de transport activ poartă numele de cotransport. În cadrul acestui transport moleculele şi ionii sunt deplasaţi împotriva gradientelor lor de concentraţie pe seama energiei eliberate în transportul pasiv al altor molecule şi ioni. În unele cazuri de cotransport, energia moleculelor de ATP este utilizată indirect prin intermediul gradientelor ionice. a. Pompele ionice Se cunosc trei clase de proteine ce cuplează direct transportul ionilor împotriva gradietelor lor electrochimice cu desfacerea legăturilor fosfodiesterice din molecula de ATP şi formarea de ADP (adenozin difosfat) şi fosfor anorganic (P): clasa ATP-azelor P; clasa ATPazelor V (H+-ATP-aze); clasa ATP-azelor F. Clasa ATP-azelor P conţine trei reprezentanţi. Primul reprezentant al acestei clase şi cel mai răspândit - Na -K+-ATP-aza (pompa de Na+-K+) prezentă în membranele plasmatice ale tuturor celulelor animale este unul dintre cele mai studiate sisteme de transport activ. Na+ K+-ATP-aza pompează Na+ în mediul extracelular şi introduce K+ cu sarcină în celulă. Mecanismul de acţiune Na+-K+-ATP-aza, deşi insuficient cunoscut, are la bază modificarea conformaţională a enzimei. Astfel, este posibilă formarea unor canale în proteina transportoare ce permite trecerea ionilor de Na+ şi K+ prin membrana plasmatică. Energia ce asigură conversia conformaţiei enzimei (E1 → E2) cât şi pomparea ionilor împotriva gradientului lor de concentraţie este furnizată de hidroliza moleculelor de ATP (Fig. 13). Funcţionarea Na+-K+-ATP-aza asigură menţinerea unei concentraţii intracelulare relativ ridicată a ionilor de K+ ce condiţionează desfăşurarea normală a unor procese celulare vitale cum sunt: biosinteza proteică, activitatea catalitică a unor enzime (piruvat-kinaza) şi menţinerea potenţialului de membrană a celulelor excitabile. Al doilea reprezentat al clasei de ATP-azei P este Ca2+-ATP-aza (pompa de Ca2+). Este localizată în membranele plasmatice asigurând menţinerea unei concentraţii intracelulare scăzute a ionilor de Ca2+. În celulele musculare enzima este prezentă în membrana reticulului sarcoplasmic, fiind implicată în transportul ionilor de Ca2+ din citosol în acest organit celular. Traficul Ca2+ prin membrana reticulului sarcoplasmic în celulele musculare, mediat de Ca2+ATP-aza, este esenţial în procesul de contracţie – relaxare musculară. Pomparea ionilor din reticulul sarcoplasmic în citosol determină contracţia musculară, în timp ce înlăturarea ionilor din citosol permite relaxarea musculară. O proteină capabilă să lege specific ionii de Ca2+ a fost identificată şi în citosol. Proteina numită calmodulină este alcătuită dintr-un singur lanţ polipeptidic şi are o funcţie reglatoare modificând viteza de pompare a ionilor de Ca2+ în raport cu concentraţia citosolică a acestora. Ultimul constituient al ATP-azelor P transportă ionii de H+, în unele cazuri împreună cu K+.

37

Fig. 13. Schema funcţionării Na+ - K ATP-azei a. proteina aflată în conformaţie E1 leagă Na+ la situsurile aflate pe faţa citoplasmatică a subunităţii α; b. legarea ATP este urmată de hidroliza acestuia şi fosforilarea unui rest de Asp din structura proteinei (E1~P); c. energia legăturii macroenergice E1~P asigură modificarea conformaţională a proteinei (E1-P) şi transportul Na+ în spaţiul extracelular; d. K+ se leagă la situsurile de pe faţa exoplasmatică ale subunităţii α; e. defosforilarea proteinei transportoare conduce la modificarea conformaţiei (E2); f. transportul K+ prin membrana plasmatică şi eliberarea lui în citosol are loc simultan cu revenirea proteinei transportoare la conformaţia iniţială (E1). Clasa ATP-azelor V (H+ - ATP-aze) este reprezentată de proteine transportoare ce realizează deplasarea protonilor în sens invers gradientului lor de concentraţie. H+-ATP-aza este prezentă în membranele plasmatice ale celulelor ce secretă produşi acizi (membrana apicală a celulelor epiteliale ce mărginesc lumenul vezicii urinare) şi în membranele lizozomale. Pompa de H+ dependentă de ATP din membranele lizozomale are rolul de a menţine un pH scăzut (4,5-5) în interiorul acestui organit celular. Clasa ATP-azelor F, ca şi cele ale clasei V sunt responsabile de transportul protonilor. Ceea ce caracterizează ATP-azele din clasa F, localizate în membrana mitocondrială, este faptul că acţionează în sensul cuplării-deplasării H+ de la o concentraţie mai mare la una mică cu sinteza ATP din ADP şi P. b. Cotransportul activ al ionilor şi al moleculelor prin membrana plasmatică nu utilizează în toate cazurile direct energia eliberată prin hidroliza ATP. Folosirea energiei gradientelor ionice în transportul transmembranelor activ constituie o cale indirectă de utilizare a energiei stocate în ATP. Deplasarea ionilor şi moleculelor împotriva gradientelor lor de concentraţie cuplată obligatoriu cu transportul pasiv al altor ioni - numiţi ioni cotransportaţi - defineşte procesul de cotransport. În acest transport activ, ionii de Na+ au un rol important în transportul zaharurilor şi aminoacizilor în celulă. Sunt descrise trei aspecte ale cotransportului: 1) uniport; 2) sinport; 3) antiport. Transportul uniport reprezintă trecerea prin membrană, la un moment dat, a unei singure specii moleculare sau ionice, fără a fi cuplată cu mişcarea altei specii moleculare. În acest caz, moleculele neutre nu se acumulează împotriva gradienţilor de concentraţie, ci transportul lor prin membrană este facilitat de gradientul de concentraţie scăzută şi catalizat de o proteină de import numită importer (fig. 14 a).

38

Fig. 14. Mecanisme de cotransport

Fig. 15. Proteina ce realizează simportul glucoză - Na+ asigură acumularea glucozei, împotriva gradientului de concentraţie, în celulele epiteliale ce delimitează lumenul intestinal. Na+K+-ATP-aza menţine gradientul electrochimic al Na+ prin pomparea ionilor în afara celulei epiteliale. Cooperarea celor două proteine transportoare face posibilă preluarea continuă a glucozei din lumenul intestinal. Tipul simport reprezintă cotransportul a două specii deosebite (o structură chimică solvită şi union încărcat H+) în aceeaşi direcţie, purtaţi fiind de către o proteină porter (fig. 14, b1). Dintre toate sistemele de simport cel mai bine cunoscut este simportul de lactoză în celula bacteriană (Escherichia coli) (fig. 14, b2). Antrenarea în circulaţie sanguină a glucozei absorbită din lumenul intestinal şi deplasarea aminoacizilor din tubii renali în sânge reprezintă procese cu o desfăşurare similară, în care un rol important îl joacă celulele epiteliale intestinale şi respectiv, tubulare. Pătrunderea acestor molecule în celulele epiteliale este cuplată obligatoriu cu intrarea ionilor de Na+. Simportul este asigurat de proteine specifice localizate în regiunea apicală (cu microvili) a membranei plasmatice (fig. 15). 39

Sistemul antiport reprezintă transportul de interschimb (fig. 14, c) între două substraturi solubizante în două direcţii opuse, transport catalizat de o proteină antiporter. Are loc schimbarea unei specii moleculare cu alta, de exemplu Na+ în locul ionului de H+, sau Cl- în locul grupării HCO3-. Prin acest tip de transport activ, Na+ este transportat intracelular, iar concomitent Ca2+ este scos în spaţiul extracelular; acest antiport reuşeşte să menţină scăzut nivelul citosolic al calciului în multe celule. Majoritatea acestor tipuri de transport activ simport/antiport, în celulele animale, sunt declanşate de gradienţi de Na+, generaţi, la rândul lor, de pompe ionice de Na+- K+-ATP-ază. Proteinele uniporter, simporter şi antiporter au structuri asemănătoare şi funcţionează prin mecanisme similare. Cele trei tipuri de transport , uniport, simport şi antiport au fost descrise întâi la bacterii (Escherichia coli), ulterior dovedindu-şi valabilitatea în toate celulele organismelor vii (fungi, plante, animale). c. Transportul apei şi reglarea volumului celular Presiunea osmotică - factor critic în transportul molecular de apă Deplasare moleculelor de apă prin membrana plasmatică sau printr-un strat de celule este rezultatul acţiunii diferenţei de concentraţie a celor două soluţii separate de membrană (stratul de celule) şi /sau gradientul de presiune hidrostatică. Mecanismul transportului molecular de apă prin dublul strat lipidic nu este încă cunoscut. Studii recente sugerează posibilitatea existenţei unor proteine canal de apă la nivelul membranelor plasmatice. Reglarea volumului celular şi a presiunii osmotice interne În anumite limite, celulele sunt capabile de a-şi modula tensiunea osmotică internă şi prin aceasta îşi pot menţine volumul relativ constant. Introducerea unei celule într-un mediu hipertonic (cu o concentraţie salină superioară conţinutului celular) este urmată de scăderea pH-ului citosolic, fapt ce determină activarea sistemului antiport Na+-H+ şi Cl-HCO3-. Primul sistem asigură intrarea în celulă a Na+ în schimbul ieşirii H+. Al doilea sistem acţionează în sensul deplasării Cl- în celulă şi exportul de HCO3-. Speciile ionice exportate în mediul extracelular (H+ şi HCO3-) sunt generate în celulă ca rezultat al acţiunii anhidrazei carbonice asupra produsului final al metabolismului celular CO2. Influxul de Na+ şi Clconduce la creşterea concentraţiei saline şi a tensiunii osmotice celulare ce fac posibilă intrarea moleculelor de apă în celulă şi în unele cazuri restabilirea volumului celular iniţial (fig. 16).

Fig. 16. Principalele proteine transportoare implicate în reglarea volumului celular, în condiţiile în care celula se găseşte într-un mediu hiperton (0,25 M NaCl)

40

2.3.3. Transportul macromoleculelor şi particulelor prin membrana plasmatică Schimbul de substanţe pe care îl realizează celula cu mediul înconjurător nu este limitat numai la ioni, molecule mici şi apă. Diferitele macromolecule (proteine, polinucleotide, poliglucide) şi particule traversează membrana plasmatică prin mecanisme de transport mediate de vezicule. Se disting două tipuri de transport: exocitoza şi endocitoza. Prin exocitoză macromoleculele sintetizate în celulă sunt excretate în spaţiul extracelular. Endocitoza este implicată în transportul în celulă a diverselor molecule, cât şi a fracţiunilor din fluidul interstiţial (pinocitoza). Deşi decurg după mecanisme diferite, cele două procese de transport menţionate prezintă unele caracteristici comune: ƒ sechestrarea moleculelor şi a particulelor transportate în vezicule; ƒ asigurarea unui transport strict direcţionat; ƒ rolul critic al procesului de fuziune membranară. Materialele ce pătrund în celulă prin endocitoză sunt fie supuse acţiunii enzimelor hidrolitice lizozomale, fie eliberate din nou în mediul extracelular. De cele mai multe ori macromoleculele de secreţie sunt eliberate din celulă prin aceeaşi regiune a membranei plasmatice prin care ele au pătruns. Există însă situaţii în care macromoleculele traversează spaţiul celular fiind secretate printr-o altă regiune membranară. Acest ultim tip de transport poartă numele de transcitoză. Procesul de exocitoză stă la baza desfăşurării secreţiei celulare (fig. 17). Studiul transportului macromoleculelor din celulă în mediul extracelular sugerează existenţa a două tipuri de exocitoză: constitutivă şi reglată (fig. 18). Exocitoza constitutivă este comună tuturor celulelor şi asigură eliminarea continuă a macromoleculelor sintetizate în spaţiul extracelular. Secreţia celulară de hormoni, neurotransmiţători şi enzime digestive este realizată prin exocitoză reglată. În acest caz moleculele sunt împachetate în vezicule de secreţii, iar fuziunea lor cu membrana plasmatică este comandată de un semnal extracelular, de cele mai multe ori, un mesager chimic.

Fig. 17. Calea clasică de transport a moleculelor de secreţie în spaţiul extracelular 41

Fig. 18. Prezentarea schematică a exocitozei constitutive şi reglate Endocitoza defineşte transportul mediat de vezicule din mediul extracelular în celulă al unor macromolecule, cât şi a substanţelor dizolvate în lichidul interstiţial (fig. 19). În funcţie de mecanismul procesului de endocitoză distingem: endocitoza mediată de receptori şi pinocitoza. Endocitoza mediată de receptori, reprezintă un tip de transport specific şi eficient al macromoleculelor. În urma recunoaşteri şi legării lor la receptori de membrană, macromoleculele intră în celule sub forma complexului de ligand-receptor, fără a fi însoţite de fluidul extracelular. De exemplu, colesterolul circulă în sânge legat de o proteină cu care formează complexe numite lipoproteine cu densitate scăzută (LDL) (fig. 20).

Fig. 19. Calea urmată de particulele ce au pătruns în celulă prin endocitoză

Fig. 20. Endocitoza mediată de receptori pentru LDL 42

Procesul de endocitoză mediată de receptoriare o semnificaţie biologică foarte largă, prezentând câteva aspecte particulare deosebit de importante şi anume: eliberarea metaboliţilor esenţiali către celule a colesterolului, a complexelor vitaminice B12, a ionilor de fier, care sunt recunoscuţi de către receptorii de suprafaţă ai celulelor, fiind fixaţi şi importaţi intracelular; modularea răspunsului la mulşi hormoni de natură proteică şi factori de creştere (de ex insulina, factorul de creştere epidermic, etc). Endocitoza îndepărtează aceşti hormoni din circulaţie şi fie celula, temporar, mai puţin receptivă la aceştia, prin scăderea numărului de receptori celulari; captarea proteinelor ţintite pentru distrugere şi eliberarea acestora către lizozomi(de ex celulele hepatice captează şi distrug glicoproteinele plasmatice senescente). Majoritatea receptorilor de pe suprafaţa celulelor care mediază endocitoza sunt glicoproteine transmembranare. Aceşti receptori au: ƒ un domeniu extracelular; ƒ 1-2, helixuri transmembranare; ƒ mică regiune citosolică. Mulţi dintre aceşti receptori sunt localizaţi în anumite regiuni ale membranei plasmatice, care ulterior invaginându-se vor forma cavele (coate pita). Partea citosolică a acestor zone, constituie un strat gros de clatrină (proteină ce va forma o reţea în jurul veziculelor membranare). Caveolele reprezină 2% din suprafaţa unei celule animale. Mecanismul endocitozei Endocitoza începe cu invaginarea unei asemenea regiuni din membrana plasmatică, cu formarea unei caveole; clatrina formează o reţea în jurul acesteia pe care apoi o închide rezultând în final o veziculă cu manta de clatrină(diametrul de 800Aº). Vezicule prinde rapid clatrina şi devine endozom (receptozom). Endozomii fuzionează şi formează vezicule mai mari cu diametrul de 2000-6000Aº (în circa 20 de secunde).Caracteristic pentru endozomi este pH-ul acid care determină disocierea celor mai multe complexe receptor – proteine; rezultă deci că soarta substratului este decisivă la acest nivel. Eliberarea clatrinei din vezicule reprezintă un moment cheie în endocitoză deoarece prezenţa acestei mantale proteice în jurul veziculei ar împiedica transmiterea proteinelor importate şi a receptorilor către destinaţiile lor. Clatrina este reciclată de către o enzimă activată de ATP. Acidifierea endozomilor prin acţiunilor unor pompe protonice (activate de ATP) duce la disocierea complexelor receptor-proteine, etapă absolut necesară pentru sortarea proteinelor şi dirijarea lor către destinaţii specifice. În raport cu mărimea şi complexitatea particulelor endocitate, se disting două variante particulare ale endocitozei şi anume: fagocitoza: endocitoza macromoleculelor sau a particulelor mici, corpusculare (virusuri, bacterii, fragmente de celule eucariote sau chiar celule întregi); pinocitoza: endocitarea moleculelor solubile (toxinele bacteriene). Fagocitoza (gr. fagiere=a mânca) este un proces de transport mediat de vezicule prin care celulele sunt capabile să ingere diverse particule din spaţiul extracelular. Dacă la organismele unicelulare fagocitoza reprezintă principala cale de nutriţie, la mamifere procesul joacă un rol important în apărarea organismului. Celule specializate numite fagocite sunt capabile să înglobeze şi să distrugă substanţe străine, microorganisme, celule îmbătrânite şi maligne, resturi celulare etc. În organismele animale se disting două tipuri de celule sanguine ce acţionează ca fagocite: monocitele (ce migrează în ţesuturi dând naştere macrofagelor şi ele celule cu funcţie fagocitară) şi neutrofilele. Legarea particulelor de fagocit - prima etapă a fagocitozei - implică participarea receptorilor de membrană ce recunosc specific liganzii aflaţi pe suprafaţa particulei ţintă. 43

Pentru a putea fi fagocitate, bacteriile sunt supuse unui proces de opsonizare (gr. opsonein=a pregăti pentru mâncare) ce constă în acoperirea suprafeţei bacteriene cu anticorpi şi/sau componente ale complementului. Anticorpii se ataşează pe suprafaţa bacteriilor în aşa fel încât regiunea prin care aceştia se leagă la receptori, numită regiune Fc, este expusă spre exterior. Receptorul Fc din membrana plasmatică a fagocitelor interacţionează cu anticorpii legând cele două suprafeţe membranare printr-un mecanism tip fermoar (membrane-zippering-mechanism) ce face posibilă fagocitoza (fig. 21). Există posibilitatea stabilirii unor legături încrucişate între anticorpii ataşaţi pe suprafaţa celulei ţintă cu formarea unor aglomerări (clusterii), proces numit patching. După un scurt timp de la formarea cluster-ilor, anticorpii se deplasează spre un pol al celulei-ţintă generând o structură de tip calotă ce împiedică fagocitarea celulei ţintă (fig 21). Procesul de calotare (capping) este energo-dependent necesitând prezenţa moleculelor de ATP. Activarea receptorilor specifici de către anticorpi, componente ale complementului sau diverse oligozaharide de pe suprafaţa microorganismelor, prin formarea complexului ligandreceptor, generează un semnal intracelular ce declanşează ingestia. Fig. 21. Fagocitoza se realizează printr-un mecanism „membrane-zipper” A – distribuirea uniformă a anticorpilor pe suprafaţa celulei - ţintă face posibilă fagocitarea acesteia B – procesul de „capping” împiedică fagocitarea celulei-ţintă Pinocitoza este un fenomen observat la macrofage şi reprezentat de invaginarea unei părţi a membranei celulare, sub influenţa unor particule mici, solubile (picături),cu formarea în final a unor vezicule citoplasmatice (cu dimensiuni de 1-2µm). Această veziculă migrează de la membrana celulară spre regiunea perinucleară, unde fuzionează cu lizozomii, conţinutul veziculei fiind hidrolizat. Transcitoza defineşte un tip de transport specific transcelular, al diferitelor microelemente. Procesul este întâlnit în celule (epiteliale) ale căror membrane plasmatice sunt împărţite în domenii distincte (apical şi latero-bazal) datorită pronunţatei asimetriei în distribuţia elementelor lipidice şi proteice componente. Un exemplu de transcitoză îl reprezintă transportul din stomac în circuitul sanguin al anticorpilor la nou-născut, anticorpi primiţi odată cu laptele matern.

2.4. RECEPTORII DIN MEMBRANĂ Receptorii membranari sunt glicoproteine transmembranare, având funcţia de legare specifică şi cu afinitate mare a unor molecule extracelulare numite liganzi (hormoni, neurotransmiţători, etc.) prin legarea cărora se induc răspunsuri celulare caracteristice. Unii dintre aceşti liganzi sunt numiţi mesageri de ordinul I. În interiorul plasmalemei, receptorul activat interacţionează apoi cu un sistem enzimatic care generează în citosol un mesager de ordin II, de obicei cAMP (adenozin-monofosfatul ciclic). Al doilea mesager declanşează un lanţ de reacţii intracelulare care provoacă în ultimă instanţă răspunsul celulei ţintă la ligantul fiziologic în cauză (fig. 22, 23, 24, 25).

44

În cazurile când interacţiunile moleculă semnal receptorul generează un nucleotid ciclic (adenozin sau guanozin- monofosfat ciclic) ci provoacă un influx rapid de ioni de calciu (Ca+2), în matricea citoplasmatică, datorită deschiderii canalelor de calciu ale membranelor celulare, atunci Ca+2, este considerat ca un mesager de ordinul II. Ligantul de care se leagă de receptor prin forţe slabe (hidrofobe,legături de hidrogen), într-o zonă specifică din molecula receptorului. Prin legarea de receptor apar diferite modificări ale plasmalemei ce induc apoi efecte intracelulare. Exemple de modificări ale plasmalemei pot fi: Redistribuirea receptorilor cu agregarea lor în anumite zone ale plasmalemei urmată de endocitoză; Modificări de permeabilitate a membranei, se produc la legarea neurotransmiţătorilor de membrana postsinaptică şi au rol în transmiterea şi generarea impulsului nervos Activarea unor enzime din plasmalemă (activarea adenilatciclazei de către hormonii polipeptidicihidrosolubili). Creşterea intracelulară a Ca+2 (prin deschiderea unor canale din plasmalemă care permit pătrunderea calciului extracelular ce se leagă în citosol de proteine specifice, de ex calmodulina). De remarcat că folosirea mesagerilor de ordin I şi activarea multor proteine şi enzime prin legarea unei singure molecule de ligand au ca rezultat creşterea extrem de mare a eficienţei receptorilor al căror procent nu depăşeşte 1% din totalul proteinelor de membrană.

2.4.1.Tipuri de receptori Se pot distinge două categorii mari de receptori după originea ligandului pe care îl leagă: receptori pentru substanţe endogene şi receptori pentru substanţe exogene. a. Receptorii pentru neurotransmiţători sunt situaţi în membrana postsinaptică a celulei nervoase, musculare sau alte celule efectuare (de ex, receptorii pentru acetilcolină, adrenalină, noradrenalină, dopamină, serotonină, histamină, acid gamma-amino-butiric, acid glutamic, glicină, acid aspartic, peptide mici ca encefalina).Unele dintre aceste molecule acţionează strict numai asupra unei celule postsinaptice, altele pot difuza local,influenţând mai multe celule, deci având efecte de mediatori chimici locali. b. Receptori pentru hormoni sunt localizaţi diferit în celulă,după cum hormonul este hidrofil sau hidrofos (cum este cazul hormonilor steroizi şi tiroidieni), el pătrunde uşor prin plasmalema celulei ţintă şi se leagă de receptorii intracelulari. Dimpotrivă, hormonii hidrofili se leagă de receptorii din plasmalemă şi aceşti receptori transmit celulei informaţia necesară spre a-şi modifica metabolismul. În acesta categorie intră receptorii pentru insulină, glucagon, adrenalină, hormoni ai hipofizei, parathormonul. c. Receptori implicaţi în reacţii imunitare sunt receptori pentru antigene endogene (foarte numeroşi în plasmalema unor limfocite), receptori pentru anticorpi, receptori pentru complement. Receptorii pentru substanţe exogene (vehiculate de obicei pe cale umorală) includ: ƒ receptori pentru virusuri; ƒ receptori pentru antigene străine de organism ƒ receptori pentru toxine bacteriene ƒ receptori pentru medicamente ƒ receptori pentru lecitine Deşi conceptul de receptor a fost enunţat de mai bine de 100 de ani de către P Erlich şi M. Hangley, pentru a explica mecanismul de acţiune al medicamentelor şi toxinelor numai recent, datorită progreselor tehnicii, au putut fi vizualizaţi unii receptori în ţesuturi umane obţinute post-mortem. 45

2.4.2. Modalităţi de comunicare intercelulară Sistemele de comunicare intercelulară reprezintă cheia înţelegerii funcţionării armonioase a celor aproximativ1x 1015celule din organismul uman. Comunicarea între celule este necesară începând cu dezvoltarea şi organizarea acestora în ţesuturi,continuând cu controlul creşterii şi diviziunii, ca şi pentru coordonarea diverselor activităţi ale celulelor mature. Pe de altă parte, într-o serie de boli alterarea comunicării are un rol patogenic important. Căile principale prin care se realizează schimbul mesajelor sunt: a) transmiterea indirectă la distanţă b) transmiterea directă între celulele aflate în contact. 2.4.2.1.Comunicarea intercelulară la distanţă Celulele pot schimba între ele, la distanţă,mesaje care difuzează în spaţiul extracelular. Acesta este cazul a două mecanisme fundamentale de transmitere a informaţiei: - transmiterea nervoasă, adaptată comunicării rapide şi selective a mesajelor şi, - transmiterea umorală, consecutiv eliberării unui mesager chimic în torentul circulator fiind adecvată transmiterii de informaţii generale, de exemplu metabolice. În ambele cazuri membranele celulare au un rol principal îndeosebi prin existenţa receptorilor specifici 2.4.2.2.Contactul intracelular direct Contactul celular direct, când mesajele se transmit fără o difuziune semnificativă în spaţiile extracelulare pot fi: ƒ permanente ƒ tranzitorii ƒ episodice Contactul direct permanent se realizează de obicei prin intermediul joncţiunilor permeabile de tip „gap” care leagă direct compartimentele citoplasmatice ale celulelor ce se influenţează reciproc şi prin care trec molecule mici. Contacul intercelular direct cu caracter efemer, tranzitoriu este exemplificat tipic de cooperarea celulelor sistemului imunitar a cărui organizare este astăzi comparată cu aceea a sistemului nervos elaborându-se conceptul de „reţea imunitară”. De asemenea există şi cazul conjugării celor două posibilităţi de comunicare anterioară când mesajele se transmit la distanţă prin contacte interpuse (de exemplu, cazul reţelei nervoase dintre celulele senzoriale şi cele musculare). Principalele sisteme de mesageri şi semnale intercelulare sunt hormonii (care nu mai sunt consideraţi produşi exclusiv ai glandelor endocrine), neurohormonii şi neuromediatorii, ionii şi nucleotidele, polinucleotidele şi ARN, virusurile şi interferonii, factorii de creştere, anticorpii şi antigenele, semnalele bioelectrice, etc.

2.4.3. Receptorii celulelor nervoase Când informaţia circula rapid de la şi către anumite locuri, mesajele sunt vehiculate printr-un mecanism electric de către nervi prin transmisie chimică între neuroni şi între aceştia şi celulele receptoare senzoriale sau efectuare. Pe plan celular, legătura este stabilizată prin contacte sinaptice intercelulare de 15 nm dintre celulele care participă la transmiterea mesajelor. Odată cu apariţia potenţialului de acţiune, capătul nervului eliberează neurotransmiţătorii în spaţiul sinaptic de unde o parte sunt distruşi şi o alta se prinde de receptorii specifici. Astfel de neurotransmiţători sunt: acetilcolina, noradrenalina, dopamina, glutamatul, glicina, ATP, substanţa P (un decapeptid), etc . Dintre receptorii şi antigoniştii lor, fac parte: receptorul colinergic, sensibil la nicotină (α-bungarotoxina); receptorul colinergic, sensibil la muscarină cu antagonist atropina; α-adrenergic (fentolamina); β-adrenergic – 46

(propanolul); si alţii . Axonul unui neuron motor de la broască, parcurgând câteva sute de micrometrii pe suprafaţa unui muşchi, formează câteva sute de contacte sinaptice la 1µm . În fiecare regiune presinaptică se găsesc vezicule presinaptice la capătul terminaţiei nervoase. Fiecare terminaţie conţine aproximativ 10000 molecule de acetilcolina. Fuziunea veziculelor cu acetilcolina cu membrana presinaptice este declanşată de o creştere rapidă şi trecătoare a concentraţiei Ca2+ în butonul terminal al axonului. Probabil că exocitoza se realizează prin filamentele mecanocontractile membranare, sub influenţa Ca2+, dar imediat acest Ca2+ liber dispare în momentul contopirii veziculelor cu membrana presinaptica. Ataşarea veziculelor cu acetilcolina de membrana presinaptica se face pe unele proteine intrinseci membranare, aşezate pe doua şiruri la fiecare sinapsa. În mai puţin de 100ms conţinutul de circa 10000 molecule de acetil-colina iese prin exocitoza în spaţiul sinaptic, legându-se de receptorii membranari postsinaptici. Receptorii membranari postsinaptici sunt concepuţi ca nişte canale proteice care se deschid la neurotransmiţător. Când doua molecule dintr-un neuro-transmitaţor (acetilcolina) se leagă de un receptor postsinaptic, scade energia stadiului conformaţional deschis şi, în acest mod, canalul proteic al respectivului receptor se va deschide; aceasta se face la întâmplare, într-o ms, cele 10000 molecule de acetilcolina trecând prin cele circa 2000 de canale în acelaşi timp cu 20000 ioni de Na+ într-un sens si tot atâţia de potasiu (K+) în sens invers. Diferenţa de voltaj între K+ care iese în spaţiul sinaptic si Na+ care intra în celula este aproape 0 (zero). Asemenea apropiere de zero depinde de numărul canalelor deschise şi de durata acestui stadiu. Deci, acetilcolina se descărca prin impuls nervos (impulsul nervos este acela care deschide canalele proteice) şi realizează în membrana postsinaptică prin mediaţie chimica un potenţial de membrana cu ajutorul canalelor receptoare de acetilcolina care transporta K+ şi Na+. Propagarea mai departe a influxului nervos depinde de existenta în membrana neuronului a unor canale ce se deschid pentru Na+ la o modificare a voltajului membranar şi a căror funcţionare de ,,poarta închisă şi deschisă” pentru Na+ este cauza, de fapt a potenţialului de acţiune (P.A.) (fig. 22). Fig. 22. Influxul nervos (schemă) În momentul aplicării unui stimul are loc o depolarizare locala slabă caracterizată printr-o mică modificare de voltaj care deschide canalele pentru Na+, transferând voltajul mai departe. Pătrunderea Na+, se accelerează, pana ce suprafaţa interna a membranei se pozitivează pe o unica porţiune. Ieşirea ionilor de K+ restabileşte repede potenţialul negativ al membranei . Inversarea voltajului determină potenţialul de acţiune ce se propagă de-a lungul axonului (fig. 23).

Fig. 23. Canalele de Na+ şi K+ (schemă) 47

Canalul Na+ este o proteină de circa 300000 daltoni, cu un por de 0,4-0,6 nm prin care trec ioni de Na+ cu o moleculă de apă. Pe suprafaţa sa canalul are grupări încărcate electric în poziţii bine determinate. Asemenea sarcini conferă canalului un moment dipol electric mare, care variază în direcţie şi mărime de câte ori se schimbă conformaţia moleculară a canalului, după cum el se închide şi apoi se deschide. Diferenţa de potenţial a membranei în repaus este, după cum se ştie, 70mV între incarcatura pozitivă de la exterior şi cea negativă de la interior, ceea ce înseamnă un câmp electric mare membranar, de aproximativ 100KV/cm. În consecinţa, dipolii electrici ai proteinelor canalului Na+ se aliniază cu câmpul electric membranar. Modificările în intensitatea câmpului membranar pot, să schimbe conformaţia proteinei canalului din ,,închisă” în ,,deschisă”, astfel că faţa internă (sau citoplasmatică) devine pozitivă prin pătrunderea Na+. Diferenţa de voltaj transmembranar care deschide canalul Na+ acţionează de asemenea, asupra canalului, determinându-i o stare conformaţională ,,închisă”, diferită de aceea din starea de repaus; este starea de inactivare ce apare mult mai lent ca procesul de activare, aşa fel încât canalele rămân deschise scurt timp, pentru ca apoi sa se închidă prin inactivare. Canalele rămân în stare de inactivare câteva ms şi abia apoi se închid trecând în starea de repaus. Deschiderea canalelor Na+ se face în modul ,,totul sau nimic”, deoarece fiecare canal deschizându-se face să crească conductanţa membranei de 8x10-12ohmi (Ω). Apoi, prin scoaterea K+ de câtre canalele K+ în afara fibrei nervoase, se stabileşte incarcatura negativă a feţei citoplasmatice a membranei; contracarând canalul Na+. Este de remarcat că, în axon se generează un singur impuls care se propagă de-a lungul sau în urma unui singur stimul, spre deosebire de corpul neuronului care, produce o serie de impulsuri la diferite intensităţi ale aceluiaşi stimul.

2.4.4. Receptorii care controlează permeabilitatea ionică Ţesuturile electrogene ale peştilor electrici au puţine joncţiuni neuromusculare. Membranele lor postsinaptice sunt foarte bogate însa într-un receptor colinergic reglat de nicotina . Cantităţile mici de nicotina sensibilizează receptorii, iar cele mari îl blochează . Este vorba de un complex de 3-4 polipeptide cu o greutate moleculară de 200000-300000 fiecare polipeptid având o GM=40000-65000 . Receptorul este relativ hidrofob şi glicolizat cu manoza şi galactoza. De un asemenea complex se pot lega, experimental, 4 molecule de αbungarotoxina marcată, constatându-se, după izolarea membranelor postsinaptice, asistentă a 30000 molecule de toxina marcată pe un µm2, deci aproximativ 7500 receptori dispuşi în arii hexagonale la suprafaţa membranei. Fiecare complex are 250000 daltoni, fiind compus din 3-4 tipuri de polipeptide de 50000 daltoni, hidrofobe şi glicolizate cu manoza şi galactoza. Un complex prezintă patru situsuri de legare pentru acetilcolina. Aceşti receptori, care se găsesc şi în creierul mamiferelor, sunt blocaţi când în sângele circulant apare un anticorp al sau datorită unei condiţii autoimunitare. În acest caz, nu se mai poate realiza transmisia neuromusculara şi apare o maladie musculară degenerativă.

48

Fig. 24. Transmisia chimică prin sinapse O caracteristică a receptorilor este că prezintă întotdeauna trei stări conformaţionale ale proteinelor constitutive, şi anume, o stare de repaus, una de activitate marcată prin conductanţei Na+ şi alta de desensibilizare (sau un stadiu rezistent la activare). Exista o multitudine de receptori a căror funcţionare este legată de canalele ionofore ale membranei celulare, funcţionând cu ,,porţi”care se deschid şi se închid sub influenţele chimice sau datorită variaţiilor de voltaj transmembranar. Receptorul acetilcolinei (antagonistul lui fiind bungarotoxina) acţionează când captează neurotransmitătorul, deschizând canalul Na+ ce pătrunde astfel înăuntru (Na+). Şi invers sunt inhibitori ai 49

neurotransmiţătorilor care au efecte de hiperpolarizare prin intermediul receptorilor specifici (ex. stricnina care sensibilizează specific receptorul pentru glicina), creşte permeabilitatea pentru Cl- şi K+ . Modificările în conductanţa membranei pentru Na+ şi K+ se datoresc unor canale care se închid şi se deschid selectiv faţă de ioni, ca în fibra nervoasă. Aşa, de exemplu sunt canalele ce lasă să treacă Na+, nu şi K+, altele care permit trecerea K+ nu şi a Na+ , unele lasă pentru 100 ioni K+ să mai treacă şi 85 Na+, altele pentru ≈100 K+ lasă să treacă doar 7 Na+. Canalele prin care trec 100 K+ şi 85 Na+ sunt activate de acetilcolina, având un por de 0,8nm diametru, destul de apos. Canalele K+ sunt mult mai mici şi au foarte puţina apă, cu toate că molecula de K+ este de 30 de ori mai mare decât Na+; densitatea unor asemenea canale este cuprinsă între 0- 10000µm2 (fig. 24). Procesul acesta de control a permeabilităţii ionice prin receptori este foarte vechi, datând de la infuzorii ciliaţi la care există receptori de presiune. Astfel, când un parameci înoată şi întâlneşte un obstacol, brusc se inversează bătaia cililor şi el înoată atunci înapoi. Experimental, aceasta inversare a bătăii ciliare se realizează în prezenta unei soluţii de KCl datorită unui influx al Ca2+ în infuzor, ca răspuns la presiune sau depolarizare. Celulele sunt foarte sensibile la o variaţie citoplasmatică a Ca2+, deoarece Ca2+ intracelular este într-o mică cantitate (0,01-1µ M), faţă de cel extracelular (1m M). Chiar cel mai mic influx de Ca2+ care trece prin canalele sale membranare produce perturbări în concentraţia sa intracelulară, cu modificările fiziologice corespunzătoare. Aşa de exemplu, discurile membranare ale celulelor cu bastonaşe din retina conţin ,,porţi” ionice de Ca2+, care sunt activate de către interacţiunea luminii cu rodopsina. Creşterea Ca2+ citoplasmatic de la 10-8 M la 10-6 M, ca răspuns la lumina, inhiba mişcarea Na+ prin membrana, hiperpolarizand celula şi inhibând sinapsele de la baza celulei. Tot astfel, activarea unei serii de receptori produce mobilizarea Ca2+ (receptorii colinergici, α-adrenergici, angiotensinici, β-glucozei, etc) în celula ţinta. Ca2+, ajuns în celule ,,cooperează” la realizarea exocitozei, contracţiei musculare, glicogenolizei, creşterii cantităţii de c GMP etc. Asemenea procese mediate de Ca2+ se realizează printr-o proteina ce leagă Ca intrat în celula, denumită calmodulina. Ea se leagă cu patru ioni de Ca modificându-si conformaţia, după care reacţionează cu o apoenzima sau cu o proteina receptoare, luând o noua conformaţie şi participând la tot felul de activităţi moleculare, cu diferite răspunsuri fiziologice. Calmodulina interacţionând ireversibil cu Ca2+ formează complexul proteina +4Ca2+ a cărui activitate este reglată de fluxul deschiderii canalelor de Ca2+.

2.4.5. Cuplajul celular metabolic şi electric Cuplajul celular se realizează structural prin joncţiuni strânse (,,cu gol” şi ,,scalariforme”), care solidarizează celulele adiacente pe anumite porţiuni. Astfel, orice cuplaj prin joncţiuni dintre celulele adiacente face posibilă ca o modificare a potenţialului de membrana într-o celula să se propage şi în celelalte. De exemplu, conductanţa electrică realizata la nivelul joncţiunilor ,,cu gol” dintre celulele adiacente este de 106 ori mai mare ca în restul membranelor celulare nelegate între ele. Trecerea diferitelor molecule prin joncţiunile cu gol depind de menţinerea în hialoplasma a unei concentraţii de Ca2+ sub 10-5 M. Când concentraţia Ca2+ creşte în celula, atunci scade şi permeabilitatea joncţiunilor şi creşte iar când scade nivelul Ca2+. Studiile electrofiziologice şi de microinjecţii au presupus existenţa unor canale la nivelul joncţiunilor, de 2nm diametru şi 20nm lungime. Aceste canale au fost confirmate de ME care a arătat că la nivelul acestor joncţiuni există nişte particule intramembranare care formează suprafeţe mozaicate în hexagoane şi care reprezintă proteinele cu canalele moleculare.

50

2.5. Schimburile energetice în celula vie Descoperirile ştiinţifice au permis omului să utilizeze cantităţi considerabile de energie. Această energie se prezintă sub mai multe forme: mecanică, hidraulică, calorică, electrică, nucleară etc. Energia este utilizată în maniere foarte variate, suferind numeroase transformări în instrumente sau maşini pe care le utilizăm zilnic. Astfel, motoarele, care funcţionează cu benzină sau electricitate, produc energie mecanică. Un receptor radio utilizează energia radiaţiilor electromagnetice şi transformă energia electrică în energie acustică. În celulele vii există, de asemenea, sisteme capabile de a converti energie dintr-o formă în alta. Astfel, radiaţiile solare ( energia luminoasă ) sunt transformate în energie chimică; transformarea are loc în cloroplaste. Energia astfel recuperată poate, în continuare, să servească la biosinteze sau activităţi fizice sau mecanice, graţie unor dispozitive care asigură conversia necesară. Aceste transformări au loc în sisteme constituite din ansambluri de molecule specifice. Înainte de a studia sistemele biologice care asigură transferul sau conversia energiei, este util să ne amintim câteva noţiuni fundamentale de termodinamică.

2.5.1. Noţiuni generale de termodinamică Studiul energiei şi transformările sale reprezintă o ramură a fizicii denumită termodinamică. Noţiunile generale de termodinamică sunt aplicabile şi la sistemele vii. NOTIUNEA DE ENTALPIE. Să considerăm un sistem, ca acela al unui fenomen fizic sau reacţie chimică. Sistemul se caracterizează prin stadiul său iniţial şi stadiul său final. Trecând de la stadiu iniţial la stadiul final, sistemul poate elibera energie în mediul său înconjurător. Astfel, dacă sistemul emite căldură, el va fi exotermic. Invers, dacă sistemul consumă căldură (energie calorică ), preluată din mediul ambiant, el este endotermic. Pare dificil, dacă nu chiar imposibil, de a evalua energia care există într-un sistem izolat, considerat la un stadiu dat. Din contra, putem măsura destul de uşor schimburile energetice care afectează sistemul când acesta trece de la un stadiu la altul. Astfel, schimburile de energie internă ∆E , pe care le suferă sistemul, este egal cu cantitatea de căldură Q pe care o primeşte din mediul exterior, mai puţin lucrul mecanic ( travaliul ) pe care îl realizează, W: ∆E = Q – W Această relaţie demonstrează capacitatea de conservare a energiei. Conform primului principiu al termodinamicii, energia totală a Universului rămâne constantă. Energia nu se pierde, ci suferă transformări. Într-o reacţie chimică ce se derulează sub presiune constantă ( de exemplu, presiunea atmosferică ), schimbul caloric care afectează sistemul ( căldura de reacţie ), constituie, prin definiţie, un schimb de entalpie ∆H: ∆E = ∆H - W Dacă sistemul nu produce nici un lucru mecanic, atunci relaţia este: ∆E = ∆H Această relaţie permite evaluarea schimburilor energetice interne ale unei reacţii care se derulează sub presiune constantă, cu un volum constant. Putem măsura schimburile de entalpie cu ajutorul unui calorimetru. Astfel, căldura de combustie a glucozei se ridică la 673.000 cal/mol, la 20 0 C, la presiune atmosferică: ∆H = - 673.000 cal/mol 51

Valoarea sa este negativă deoarece energia calorică produsă de sistem este cedată mediului înconjurător. VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE. Să considerăm o reacţie reversibilă în condiţii izoterme. Această reacţie tinde să dobândească un statut de echilibru. Dacă o altă reacţie se va opune, prima va realiza un efort (lucru mecanic, travaliu ), pentru a-şi obţine statutul de echilibru. Energia cheltuită pentru acest efort reprezintă un potenţial chimic. Această energie ( potenţialul chimic ), numită şi energie liberă, este desemnată astăzi prin expresia entalpie liberă. Când reacţia realizează un lucru mecanic, variaţia entalpiei libere ( ∆G ) este negativă şi reacţia este exergonică. Diminuarea entalpiei libere a sistemului reprezintă cantitatea maximă de energie disponibilă care ar putea fi transformată în energie chimică. Dacă, la o temperatură şi presiune constantă, variaţia entalpiei libere între stadiul iniţial şi stadiul final al reacţiei este negativă (∆F< 0), reacţia se poate realiza spontan. Ea va avea loc foarte rapid în prezenţa unor enzime specifice. Enzima diminuează energia de activare, care , pe de altă parte, nu depinde de variaţia entalpiei libere. În cazul unei variaţii de entalpie liberă pozitivă (∆F> 0 ), reacţia nu se mai poate realiza spontan. Se spune că este o reacţie endergonică (endoergonică)., pentru că ea are loc cu un aport exterior de energie care îi este necesară. Acest aport exterior de energie poate proveni din energia radiaţiilor luminoase sau din cuplajul cu o altă reacţie, în mod obligatoriu, exergonică. Pentru a se putea realiza cuplarea cu o altă reacţie, este necesar ca diminuarea entalpiei libere a sistemului exergonic să fie mai ridicată decât consumul sistemului endergonic. Variaţiei entalpiei libere este semnificativă prin posibilitatea de a şti dacă o reacţie are sau nu loc spontan. VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE ŞI VARIAŢIA ENTROPIEI. În toate sistemele se pot distinge două forme de energie, una numită energie internă, alta numită entropie. În sistemul reprezentat de o reacţie chimică, energia internă corespunde celei are este reprezentată de diferite legături chimice şi care poate fi convertită într-o altă formă de energie: mecanică, chimică, fizică. Entropia reprezintă energia cinetică a atomilor şi moleculelor, energie care se exprimă sub formă de vibraţii, rotaţii sau translaţii. Entropia este nulă într-un cristal perfect la 0 absolut şi, relativ scăzută, într-un solid. Ea este foarte ridicată într-un gaz, unde dezordinea moleculară este foarte accentuată. Entropia creşte odată cu temperatura, în măsura în care se accentuează (creşte) caracterul dezordonat al moleculelor. Fie o reacţie chimică care evoluează spontan, de-o manieră reversibilă faţă de poziţia sa de echilibru. Reacţia următoare leagă variaţia entalpiei libere ∆G, variaţia entalpiei ∆H şi variaţia entropiei ∆S : ∆G = ∆H – T ∆S T, reprezintă temperatura absolută a reacţiei. O scădere a schimbului de energie liberă este totdeauna asociată cu o creştere de entropie. Schimbul de entropie al sistemului, ∆S, la o valoare pozitivă se exprimă în calorii/grad/mol. După al doilea principiu al termodinamicii, entropia totală a unui sistem trebuie să crească. Stadiul dezordonat al energiei componenţilor săi are totdeauna tendinţa de acreşte. Totuşi, entropia poate să scadă într-un sistem unde au loc reacţii de sinteză şi, în mod particular, în fotosinteză. RAPORTUL ÎNTRE VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE ŞI CONSTANŢA DE ECHILIBRU. Să considerăm următoarea reacţie chimică reversibilă: A ↔ B. Ea atinge nivelul său de echilibru când survin modificările reacţiei. În egalitatea : Keq = B [

] /A [ ]

52

Keq, reprezintă constanta de echilibru pentru o temperatură şi o presiune determinată. Constanta de echilibru este legată de schimburile entalpiei libere prin reacţia: ∆G0 = - RT In Keq Unde R este constanta gazelor perfecte ( 1,987 cal/mol/grad ), T este temperatura absolută, Keq este logaritmul cu semn schimbat al constantei de echilibru iar ∆G0 schimbul standard al entropiei libere. În cazuri diferite se determină ∆G, reacţia efectuându-se la un pH = 7. determinând constanta de echilibru Keq, plecând de la analiza chimică, putem, în continuare, să calculăm variaţia entropiei libere a sistemului ∆G0. Să considerăm echilibrul: Glucoză – 1 – fosfat ↔ glucoză – 6 – fosfat, catalizat de enzima fosfoglucomutază. La 250 C, la pH = 7, soluţia are 0,001 M de glucoză – 1 – fosfat la stadiul iniţial. La stadiul final, analiza chimică indică un echilibru între 0,001 M de glucoză – 1 – fosfat şi 0,019 M de glucoză – 6 – fosfat. Keq = 0,019 / 0,001 = 19 ∆G = - 1,987 x 298 x In 19 = - 1745 cal / mol. Un asemenea echilibru, unde variaţia entalpiei libere este negativă, se efectuează spontan, de la stânga la dreapta; reacţia este exergonică. Dacă ∆G este pozitiv, reacţia va avea loc spontan, de la dreapta la stânga.

2.5.2. Transformări de energie în celula vie (energetica celulară) Celula este sediul activităţilor mecanice, cum sunt mişcările intracitoplasmatice, deformările, deplasările, creşterea etc. Ea efectuează, de asemenea, activităţi fizice: absoarbe activ substanţe, transportă molecule, concentrează soluţii, menţine un anumit echilibru osmotic etc. Celula realizează şi activităţi chimice : sinteze de macromolecule ( glucide, lipide, protide, acizi nucleici ), plecând de la numeroase molecule mici. De exemplu, pentru a forma o singură legătură peptidică, sunt necesare 4000 calorii/mol. Această valoare reprezintă schimbul de entalpie liberă (∆G) care aici este pozitiv. Ori, pentru a construi o singură macromoleculă de proteină este necesar să se stabilească sute sau chiar mii de legături peptidice şi, deci, de o mare cantitate de energie. Pentru a face faţă acestui necesar imens de energie celula dispune de mecanisme complexe proprii. Intre nevoia şi aportul de energie există intermediari capabili să efectueze multiple transformări. Aceşti intermediari sunt derivaţi fosforilaţi ai nucleotidelor, un rol aparte dintre aceşti compuşi îl are molecula de ATP ( adenozin trifosfatul sau acidul adenozin trifosforic). Deşi orice molecula care participa la metabolismul celular conţine o anumită cantitate de energie, doar un număr foarte redus din ele au o importanţă în stocarea şi vehicularea energiei chimice celulare. Aceşti compuşi trebuie să poată îngloba o cantitate apreciabilă de energie şi să poată ceda acolo unde şi când este necesar. Compuşii care fac parte din această categorie îşi datorează numele de macroergici (bogaţi în energie) faptului că hidroliza lor se soldează totdeauna cu eliberarea unei importante cantităţi de energie. Principalul izvor al energiei celulelor aerobe este procentul de respiraţie celulară: AH2+ 1/2O2→H 2 O + energie

53

În care A simbolizează un substrat oarecare, iar AH2-substrat redus. Energia degajată în cursul respiraţiei celulare este un mod normal parţial recuperată în cadrul unui proces biologic cuplat. Recuperarea se face prin stocarea energiei în molecule de ATP (adenozin trifosfatul sau acidul adenozintrifosforic), care se formează prin fosforilarea moleculelor de ADP (adenozin difosfat sau acidul adenozindifosforic). Întrucât această fosforilare este cuplată cu oxidările din cadrul respiraţiei procesul de recuperare a energiei respiratorii se numeşte fosforilare oxidativă: nADP + nPa+ energie→ n ATP Astfel, reprezentarea simbolică a proceselor cuplate generatoare şi recuperatoare de energie poate fi următoarea: AH2 + nADP + nPa + ½ O2 → A+ n ATP + H 2O Organismul utilizează în permanenţă mari cantităţi de energie atât pentru sinteza compuşilor cu structuri complexe (proteine, lipide, polizaharide) cât şi pentru susţinerea unor procese cum sunt: contracţia musculară, excitaţia nervoasă, transportul activ şi altele. De aceea, transferul energiei libere rezultată din reacţiile exergonice ale căilor degradative către aceste procese, trebuie să se realizeze eficient. Constanţa temperaturii face ca transferul energiei în sistemele biologice să fie posibil numai prin reacţii cuplate: două reacţii sunt cuplate dacă energia liberă a uneia care este exergonică, cedează energiei determină desfăşurarea celeilalte care este endergonică (consumă energie). În organism există numeroase reacţii cuplate prin intermediul acidului acetic a cărei formare întro reacţie puternic exergonică asigură desfăşurarea celei de-a doua, endergonică. Cuplarea celor două reacţii e redată în figura 25. Fig. 25. Schema unei reacţii cuplate Mecanismul acestui sistem de cuplaj asigură transferul energiei libere de la reacţiile degradative ale glucidelor, lipidelor şi protidelor către cale mai diverse reacţii consumatoare de energie. Sistemul ATP↔ADP constituie intermediarul energetic comun în majoritatea reacţiilor cuplate. Caracterul macroenergetic al legăturilor P≈O, din molecula ATP care scindează hidrolitic e reprezentat de energia G. 2.5.2.1. Molecula ATP şi proprietăţile sale Toate celulele, vegetale, animale şi bacteriene depind de ATP, compus izolat în anul 1930, din extracte acide de muşchi. Materia vie conţine 0,5 – 2,5 mg ATP/mol. Poate fi obţinut în stare pură prin cromatografie pe schimbători de ioni. Molecula de ATP este alcătuită dintr-o bază azotată purinică – adenina, un zahăr – pentoză – şi trei radicali fosfat (Fig. 26).

Fig. 26. Structura moleculei de ATP (a); complexul ATP cu ionul de Mg 2+ (b).

54

În celulă, cea mai mare parte a ATP- ului formează un complex cu ionul de Mg 2+. În moleculă, fosfatul terminal este stereochimic vecin cu un grup aminat al adeninei (fig. 30, b). Magneziul stabileşte legătura cu adenina şi cu cei doi fosfaţi terminali. Fosfaţii poartă patru sarcini negative, apropiate unele de altele şi care se resping. ATP este un polifosfat puternic încărcat electric. Prin hidroliză el se descompune în ADP şi acid fosforic. Aceşti doi copuşi, ATP şi ADP, sunt sediul unor reanjamente ale atomilor, care se realizează în maniera în care nivelul de energie al moleculelor este cel mai scăzut posibil. Ambii poartă încărcătură negativă. Hidroloza produce o importantă scădere a energiei libere a sistemului: ∆G = - 7000 cal/mol (pH 7; 25oC) Putem spune că legătura fosfat este bogată în energie, ceea ce este, de fapt, o neconcordanţă. Energia considerabilă de aici nu corespunde celei de la legătura covalentă dintre P şi O. Ea provine din hidroliza legăturii anhidrid fosforică. ADP poate, de asemenea, să se disocieze eliberând o cantitate de energie egală cu precedenta. Compuşii formaţi prin hidroliză sunt AMP (adenozin monofosfatul sau acidul adenozinmonofosforic) şi acidul fosforic. AMP poate, la rândul său să fie descompus, dar hidroliza legăturii ester care reţine fosfatul generează mult mai puţină energie. Reacţiile de transfer de fosfat (fosforilare →defosforilare) se fac totdeauna de la un compus cu potenţial de transfer ridicat către unul cu potenţial de transfer scăzut. Deci, compuşii cu fosfor pot fi donatori sau acceptori de fosfat după cum potenţialul lor de transfer e mai ridicat sau mai scăzut. Dacă luăm ecuaţia ATP ↔ADP +Pa, dacă ea se desfăşoară spre stânga ATP e donator de Pa în sens opus, ADP devine acceptor de Pa transformându-se în ATP. Grupările fosfat cedate de compuşii macroergici ajung la acceptori nu direct, ci prin intermediul sistemului ATP↔ADP. Acest sistem face legătura dintre compuşi macroergici (Penolpiruvat, 3-diP-glicerat şi P-creatina) spre compuşi microergici (glucoza, glicerol). Sistemul ATP↔ ADP funcţionează astfel ca o baterie de energie (dinam celular).(fig.27). Fig. 27. Schema „dinamului celular” (Florkin,modificat de Lippman) Sistemul ATP↔ADP ca donator de energie este implicat într-o serie de procese biochimice importante cum ar fi: contracţia musculară (sistemul creatinkinazic) al celui de-al doilea mesager implicat în pătrunderea unor hormoni prin membrana celulară (sistemul adenilatkinazic), dar şi în procesele de glicoliză sau de oxidare aerobă a glucidelor. (fig. 28).

55

Fig. 28. - Implicarea sistemului ATP↔ADP în unele procese biochimice celulare Aceste diverse reacţii sunt reversibile. Este permanent necesar să se furnizeze energie pentru refacerea AMP, ADP şi ATP- ului. Disocierea sau recombinarea unui compus fosforilat ca ATP se realizează în prezenţa enzimei adenozin trifosfataza (ATP-aza). 2.5.2.2. Alţi compuşi fosforilaţi Celula conţine o multitudine de compuşi fosforilaţi. Printre aceştia, PEP (fosfoenolpiruvatul) conţine o energie liberă de hidroliză considerabilă (∆G = - 12 800 cal/mol), mult mai ridicată decât cea a ATP –ului (∆G = - 7000 cal/mol). Aceşti compuşi au tendinţa de a se descompune cedând o moleculă de acid fosforic şi energie, favorizând sinteza de ATP din ADP şi fosfaţi liberi, prezenţi în mediu. Alţi compuşi au o energie liberă de hidroliză mult mai mică decât ATP-ul. Un exemplu este glucozo -1-fosfat, ∆G = 5000 cal/mol. Aceşti compuşi se formează în prezenţa ATP-ului care se descompune cedând energie şi o moleculă de acid fosforic. Între aceste două exemple extreme de potenţial energetic, PEP şi glucozo -1- fosfat, există numeroşi compuşi intermediari . Diferiţii compuşi fasfaraţi pot fi repartizaţi pe o scară, după potenţialul lor de transfer al grupului fosfat. Grupul fosfat tinde să treacă de la compusul cu potenţial de transfer ridicat, spre cel cu potenţial mai scăzut. Sistemul ADP – ATP, care are un potenţial de transfer de valoare medie, reglează transferul între cele două tipuri de compuşi. Există şi compuşi fosfaraţi, derivaţi de nucleotide, analogi ATP ului, dar în cantităţi mult mai scăzute. Astfel sunt: uridintrifosfatul (UTP), citidintrifosfatul (CTP), guanozintrifosfatul (GTP) etc. Aceste substanţe posedă, de asemenea, legături macroergice fosfat cu un înalt potenţial de energie.

2.6. Membrane care cuplează energie Membranele capabile de captarea şi conversia energiei aparţin cloroplastelor şi mitocondriilor.

2.6.1. Cloroplastele Viaţa pe Pământ depinde de energia produsă de steaua noastră apropiată, soarele. Energia solară traversează spaţiul sub formă de lumină. Aici, pe Pământ, lumina solară este captată de numeroasele frunze sau organe verzi ale plantelor. Acestea sunt capabile nu numai să capteze lumina solară ci să o şi prelucreze în „hrană”. 56

Cloroplastele sau plastidele verzi, prezente în toate organele verzi ale plantelor, sunt responsabile de conversia energiei luminoase în energie chimică, datorită clorofilei pe care o conţin. Studiile de microscopie electronică au evidenţiat pe suprafaţa lamelor stromatice şi granare, particule globulare cu dimensiuni de 100-200A0, considerate unităţile funcţionale ale fotosintezei şi care au fost numite cuantosomi (Park şi Pon,1963) . Un cuantosom este format, se pare, dintr-un strat de substanţe proteice îmbibate cu apă şi o componentă lipidică Molecula bipolară a clorofilei se orientează cu polul hidrofil (inelul porfirinic) spre stratul proteic, în timp ce polul hidrofob (reprezentat de fitol) se îndreaptă spre lipoizii de structură ai lamelei granare. S-a stabilit că un cuantosom conţine: circa 160molecule de clorofila-a, 70 molecule de clorofila-b, 48 molecule de carotenoizi, sute de molecule de lipide, circa 9500 atomi de azot proteic, precum şi doi atomi de mangan, doisprezece atomi de fier şi sase atomi de cupru. Membranele tilacoidelor, conţin 12% pigmenţi de două categorii: clorofile 10% şi carotenoizi 2%. Culorea verde a frunzelor este dată de prezenţa clorofilelor care maschează culoarea galben portocalie a carotenoizilor. Dintr-un extract brut de pigmenţi (extract in acetonă sau în alcool) poate fi separat prin cromatografie pe hârtie, placă sau coloană fiecare pigment din amestec. a. Pigmenţii clorofilieni Există două tipuri de clorofile a şi b, la plantele superioare, clorofila a, de culoare verde albastră, este mai frecventă decât clorofila b, de culoare verde gălbui. Structura chimică a celor două clorofile este apropiată. Se disting două regiuni: o regiune porfirinică (inel porfirinic) cu un atom de magneziu în centru şi cu o coadă „fitol”alcool cu C20. Majoritatea moleculelor de clorofilă sunt asociate proteinelor membranare (cromoproteine). Sineza clorofilelor se face în interiorul cloroplastelor. La plantele superioare, una dintre multiplele etape de sinteză necesită lumină şi fier, de unde sindromul de „cloroză”(îngălbenire) în cazul carenţei de fier sau lumină (etiolarea). b. Pigmenţii carotenoidici Sunt pigmenţi lipofili derivaţi de la izopren. Aceştia sunt: licopenul de culoare roşie şi carotenul de culoare portocalie; xantofilele, derivaţi hidroxilaţi ai pigmenţilor carotenoidici sau oxicaroteni. 2.6.1.1. Procesul general al fotosintezei Cloroplastele reprezintă suportul material, adică sediul la nivelul căruia se desfăşoară grandiosul proces al fotosintezei, în timpul căruia se sintetizează, în prezenţa luminii, substanţe organice din CO2 şi apă. Aceasta transformare de substanţă realizată în celula vegetală este dublată de conversia, la fel de intensă de energie, pentru ca sinteza moleculelor organice înseamnă înmagazinarea de energie chimică provenită din conversia energiei solare. S-a stabilit ca în procesul de fotosinteza, exista doua tipuri de reacţii: reacţii de lumina (faza de lumina, faza lui Hill) si faza de întuneric (faza obscura sau faza lui Blackman sau ciclul Calvin) (fig. 29).

57

Fig. 29 - Schema fotosintezei: A - reacţiile de lumină; B - reacţiile de întuneric (după P. Sitte, 1965)

În reacţiile de lumina, care au loc în tilacoidele cloroplastului, hidrogenul este smuls de la moleculele de apă şi dus de o serie de transformări la NADP, cu degajare de O2 în afara celulei. Acest transfer este posibil graţie aportului de energie libera-energie luminoasa-, care provoacă starea de excitaţie electronica a moleculei de clorofila. Concomitent cu acest transport de H2 (sau de electroni), are loc convertirea energiei luminoase în energie chimică, prin reacţia de fotofosforilare, cu sinteza moleculei macroergice de ATP . Se pare ca pentru fiecare doi electroni transportaţi revin două (sau fracţiuni între 1 şi 2) molecule de ATP. Reacţiile de lumina pot fi sintetizate astfel: H2O + NADP → ½ O2 + NADPH2; 2ADP + Pi → 2 ATP În reacţiile de întuneric, care se petrec în stroma cloroplastului, NADPH2 produc în reacţiile de lumina este folosit pentru reducerea CO2. Aceste reacţii sunt asociate cu o creştere în energia libera a sistemului celular, provenită din descompunerea ATP rezultat în fotofaza. Reacţiile de întuneric pot fi sintetizate astfel: CO2 + 2NADPH2 → (CH2O) + H2O + 2NADP 3ATP → 3ADP + 3Pi Astfel, procesele generale ale fotosintezei pot fi reprezentate prin reacţia: lumină CO2 + H2O → (CH2O) + O Hv

58

2.6.1.2. Reacţiile de lumină a. Fotonul Lumina este un fenomen de natură ondulatorie şi corpusculară. Fiecare corpuscul sau foton, transportă o energie W(un quantum) care are o valoare dată de lungimea de undă asociată relaţiei W=hν; h este o constantă, (constanta lui Planck) iar ν este frecvenţa undei(numărul de vibraţii /secundă), ν=c/χ, c-viteza luminii în vid. Astfel, un foton de lumină albastră cu o lungime mică a undei, transportă mai multă energie decât un foton de lumină roşie cu lungime de undă înaltă. b. Procesul de absorbţie a energiei luminoase Posibilitatea de a utiliza radiaţiile luminoase de către celulele plantelor verzi se datorează faptului că ele conţin în cloroplaste molecule de clorofila capabile de aşa numitul efect fotoelectric, care consta în emisiunea de electroni din atomul unei molecule, sub acţiunea luminii. Astfel, sub acţiunea radiaţiilor luminoase cu lungimea de unda între 380770nm, molecula de clorofila intra în starea de ,,excitaţie electronica” (stare activa),care se caracterizează fata de starea fundamentală printr-un exces de energie. Molecula de clorofila poate atinge trei niveluri de excitaţie electronica: 1. Adsorbind radiaţii cu lungimea de unda de 430nm (radiaţii albastre), un electron al moleculei este dizolvat şi trece pe orbita liberă, menţinându-şi sensul spinului. Energia înmagazinata în acest caz este egala cu 65Kcal/mol/gram. Aceasta reprezintă o stare de excitaţie singletică a moleculei de clorofila, având cel mai înalt nivel energetic faţa de starea fundamentala, ca urmare a duratei foarte scurte de viaţa (10-12 – 10-11s) este incapabilă să inducă reacţie fotochimică. Dezactivarea, ce aduce revenirea la starea fundamentală a moleculei se face prin pierdere de căldura (24Kcal/ mol/gram) şi molecula cade la un alt nivel energetic de excitaţie singlatica, cu 41Kcal/mol/gram. 2. Când molecula de clorofila este bombardată cu fotoni de lumina roşie (cu lungimea undei 670nm), ea atinge acelaşi nivel energetic (41Kcal/mol/gram) . Durata de viaţa a acestei stări de excitaţie electronica este puţin mai mare (10-9s), totuşi încă insuficientă pentru inducerea reacţiei fotochimice. Molecula ajunsă la acest nivel se dezactivează prin emisie de fluorescenta, sau prin pierdere de căldură, în valoare de 10Kcal/mol/gram. Cu aceasta ocazie se poate întâmpla să aibă loc şi răsturnarea spinului (care se face cu cheltuiala de energie de excitaţie) molecula cazând la un al treilea nivel energetic de excitaţie electronică, numită stare tripletica (sau metastabila). -4 -2 3. Starea de excitaţie tripletica are o durata de viaţa mai lungă (10 -10 s) şi, datorită ei, deşi are cel mai scăzut nivel energetic (31Kcal/mol/gram), se poate dezactiva prin inducerea unei reacţii fotochimice (fig.30).

Fig. 30. Stările de excitaţie electronică a unei molecule de clorofilă (după Libbert, 1974) 59

Există mai multe forme ale clorofilei-a, în funcţie de molecula proteică cu care este complexată şi care nu sunt echivalente funcţional. B. Kok si G. Hoch (1961) au descoperit o clorofila-a, care absoarbe radiaţii cu lungime de unda de 700nm; iar G. Doring şi colab. (1967) o altă formă activă a clorofilei-a, cu maximum de absorbţie la 682nm. Aceste forme au fost notate convenţional ,,P700” pentru fotosistemul I şi ,,P680” pentru fotosistemul II şi numai electronul dizlocat de pe aceste molecule este atât de bogat în energie, încât provoacă reacţia fotochimica. Celelalte forme de clorofila-a şi clorofila-b, carotenoizii, ficoeritrina şi ficocianina (de la alge)transfera energia luminoasă pe care o absoarbe pigmentul P700, care reprezintă ,,centrul fotochimic” al fotosistemului I, energia având tendinţa să migreze spre molecule care absorb radiaţii cu lungime de unda mai mare. c. Fotosistemul I si II Bazându-se pe observaţii începute din 1941 Emerson a arătat (în 1957) ca daca alga Chlorella este expusa la radiaţii roşii cu λ =680nm, se constata ca procesul fotosintetic decurge mult mai slab decât atunci când este expusa acţiunii întregului spectru luminos. De asemenea, acest cercetător a mai stabilit ca daca radiaţiile de lungime de unda (λ) de 680nm sunt asociate cu radiaţiile de mai mica, procesul fotosintetic arata un efect global superior sumei celor doua efecte parţiale produse de cele doua lungimi de unda aplicate independent. Acest fenomen a fost denumit ,,efectul Emerson” si a dus la ideea ca fotosinteza implica doua reacţii fotochimice în care lumina este absorbita de pigmenţi diferiţi. Studii ulterioare au confirmat existenţa celor doua reacţii fotochimice, după unii ,,înseriate”, dar contrar supoziţii originale a lui Emerson s-a stabilit de către E. Rabinowith si colab. (1969) că clorofila-a participa la ambele reacţii. Cercetări mai recente au stabilit ca unitatea procesului fotosintetic este compusa din doua fotosisteme (fotosistemul I şi fotosistemul II), fiecare fiind responsabil pentru anumite reacţii fotochimice având fiecare câte un centru fotochimic. Cele doua sisteme sunt individualizata funcţional si structural, dar sunt legate între ele prin intermediul lanţului transportorilor de electroni. Pigmenţii care absorb lumina sunt distribuiţi între cele doua sisteme. Fotosistemul I este reprezentat de particule mai mici si conţine ca ,,centru fotochimic” molecule de P700 (clorofila-a cu maxim de absorbţie la 700nm) sau clorofila-a I, reprezintă deci pigmentul fotochimic activ al acestui sistem. Alături de P700 mai exista si clorofila cu maxim de absorbţie la 680nm si o molecula de citocrom f . Se pare ca PS I nu conţine sau conţine o cantitate foarte mica de clorofila-b. Fotosistemul II este reprezentat de particule mai mari. El conţine clorofila-a cu maxim de absorbţie la 680nm (sau după alţii la 672), cunoscuta sub denumirea de P680 sau clorofila-a II si care reprezintă pigmentul activ al acestui sistem. Alături de P680 sistemul mai conţine clorofila-b si pigmenţi accesorii (clorofila-c şi fucoxantina la algele brune, proteinele ficobilinice la algele roşii si albastre). Energia luminoasa pe care o absorb aceşti pigmenţi este mai mica sau egala 680nm si apoi transferata centrului fotochimic al sistemului I. Atât clorofila-a I cât si clorofila-a II, socotite ca sensibilizatori optici, sunt singurii pigmenţi specializaţi în transformarea energiei luminoase în energie chimica. De asemenea, fiecărui sistem îi corespund reacţii fotochimice diferite, PS I fiind raspunzător de formarea NADPH2, iar PS II de degajarea O2. La bacteriile fotosintetizatoare nu exista decât un singur sistem pigmentar, echivalent cu PS I. Se pare ca pigmenţii β-carotenoizi sunt prezenţi în ambele fotosisteme .

60

d. Secvenţa transferului de electroni Transferul de electroni de la moleculele de apă (donor de e- ) la NADP (acceptor final) implica o serie de transportori de e- cu o secvenţa specifică. Transferul de e- se poate face spontan dacă are loc între un sistem foarte reducător, cu potenţial redox scăzut şi un sistem mai puţin reducător, cu potenţial redox ridicat.. În procesul de fotosinteza potenţialul redox al sistemului O2/H2o este foarte ridicat (+0,8 volţi la pH=7) iar cel al sistemului CO2/CH2O este foarte scăzut (-0.42 volţi la un pH=7). Deci fotosinteza este un proces constituit dintr-o serie de reacţii de oxido-reducere, care evoluează între un oxidant (CO2) cu potenţial redox –0.4 V şi un reductant (H2O), cu potenţial redox +0.8 V, deci în sens invers gradientului de potenţial redox. Migrarea protonilor de la H2O la CO2 nu se realizează spontan, ci cu aport de energie liberă, care este adusă de molecula clorofilei. Ea accepta fotoni incidenţi, induce oxidarea apei şi transporta H+ (respectiv electroni) între cele două sisteme redox . e. Fotoliza apei (oxidarea H2O) Provocată de molecula de clorofila excitată, este etapa esenţiala a fazei de lumina. Reacţia a fost descoperită în anul 1973 de câtre R. Hill şi ea se desfăşoară probabil în doua etapa: hv H2O → H+ + e- + OH 2OH → H2O ½ O2 Deci din fotoliza apei rezulta H+ legat (sau agentul reducător) pentru ca ea se efectuează cu intervenţia unui transportor, apoi a unui acceptor de H+ şi un radical (OH-) care va fi oxidat în prezenta unei enzime cu eliberare de O2. Mecanismul eliberării O2 este incomplet cunoscut . Se presupune că radicalul OH- se fixează pe un acceptor organic care se izomerizează într-un peroxid, din care O2 va fi eliberat de o peroxidoza (catalaza). catalaza 4OH → 2H2O2 → 2H2O + O2 Rolul de acceptor pare să fie jucat de carotenoizi şi de acidul tioctic. f. Lanţul transferului de electroni Reacţia de oxidare a apei este legată direct de FS II, în care funcţionează ca un centru de reacţii P680, care absorb radiaţiile luminii mai mici sau egale cu 680nm . Aceste radiaţii produc excitarea moleculelor de clorofila-a care cedează energie sub forma de e-, pentru a reveni la starea fundamentală. Ca donator de e- pentru P680 functioneaza molecule de apa. Electronul de la molecula de P680 este transferat unui acceptor cu natura chimica încă necunoscută, denumit Q. La rândul său, Q pierde electronul în favoarea unei molecule de plastochinona, care se reduce . Prin intermediul unei plastocianine, molecula de plastochinona transfera e- la citocromul b6 care, la rândul sau, îl cedează citocromului f.

61

Electronul eliberat de citocromul f furnizează clorofilei P700 (centrul de reacţie al PS I), electronul pe care acesta l-a pierdut sub acţiunea radiaţiilor luminoase cu λ = 680nm. Electronul pierdut de P700 este imediat preluat de un acceptor de e-, necunoscut denumit X, de la care apoi este cedat ferredoxinei, pe care o reduce şi căreia îi transfera energie. Ferredoxina redusă transferă e- primit moleculei de NADP, care apoi este redusă la NADPH2, reacţia fiind catalizată de o ferredoxin – NADP – reductoza. Pe parcursul transferului de e , la fiecare treapta a transportului se pierde energie, adică există o cădere a nivelului energetic al electronului cu fiecare nou acceptor al său, astfel încât electronul ajunge ,,descărcat de energie” la molecula de clorofila P700 şi aceasta se dezactivează trecând în starea ei fundamentala. Datorita cedării de energie pe parcursul transportului de e-, este posibilă sinteza de ATP (rezervorul energetic celular), printr-o reacţie de fotofosforilare (fig.31).

Fig. 31. Schema transferului de electroni în fotosinteză

g. Fotofosforilarea Capacitatea de fosforilare a cloroplastelor a fost descoperită de D. Arnon şi colab. (1954). Transportul de e-, de la apă la NDAP este însoţit de expulsia a doi protoni H+(la nivelul plastochinonei) din stroma cloroplastului, către spaţiul intratilacoidal, care se adaugă protonilor rezultaţi din fotoliza apei. Încărcătura pozitivă se acumulează deci în spaţiul tilacoidal. Membrana tilacoidală fiind impermeabilă pentru protoni, se crează un gradient electrochimic de protoni care va permite funcţionarea ATP-azei membranare.

62

Fig. 32. Schema fosforilării lineare (I) şi ciclice (II)

S-a precizat ca fosforilarea se poate realiza pe două căi: fotofosforilarea ciclica şi aciclica (lineară). Pentru ambele căi există locuri de fosforilare situate pe lanţurile transportoare între citocromi . Fosforilarea aciclica. În aceasta reacţie formarea ATP este asociată cu reducerea NADP şi este implicat şi fotosistemul II, deci şi fotoliza apei. În transferul electronilor proveniţi de la apă, energia necesară sintezei moleculelor de ATP se eliberează între citocromul-b şi citocromul-f. Cercetări recente, bazate pe studiul spectrelor de absorbţie a luminii, precum şi pe determinarea potenţialului redox al sistemelor transportoare de e-, implică în fosforilarea lineară citocromul b559 asociat cu plastochinona, locul fosforilarii fiind sistemul între citocromul-b559-plastochinona şi citocromul-f + plastochinona. Fosforilarea ciclica. Are loc în prezenţa unor sisteme redox şi a luminii . Electronul trasferat de P700 ferredoxinei, în loc sa fie cedat în final, NADP, poate fi transportat enzimatic pe citocromi, de unde este dus înapoi la molecula de clorofila-a din fotosistemul I, energia pentru sinteza ATP fiind eliberată între citocromul-b6 şi citocromul (fig. 32). 2.6.1.3. Reacţiile de întuneric a. Ciclul Calvin (calea C3 de reducerea CO2) NADPH2 şi ATP produşi în faza de lumina sunt utilizaţi în stroma cloroplastului, la încorporarea CO2 în compuşi organici (fig. 33). Cu ajutorul izotopului marcat 14C, furnizat Ca14CO2 unei culturi de Chlorella, Calvin şi Benson (1949-1950) au reuşit să elucideze calea urmată de CO2 în cloroplaste. După numai 5 sec, izotopul radioactiv a fost găsit în proporţie de 87% în acid fosfogliceric, 10% în acid fosfopiruvic şi 3% în acid malic. Deci primul produs după absorbţia CO2 este acidul fosfogliceric (APG), marcat în funcţia sa carboxilică. Încorporarea moleculei de CO2 se face prin carboxilarea unui acceptor al său, care s-a găsit că este un ester fosforic al unei pentoze: ribulozo -1,5 – difosfatul (RIDP), reacţia fiind catalizată de carboxidismutaza. Ribuloza – difosfatul adiţionând CO2 formează un compus intermediar instabil, cu 6 atomi de C, care se descompune hidrolitic, rezultând două molecule de acid fosfogliceric. Imediat după formarea acidului fosfogliceric apar trioze fosforilate, marcate la funcţia aldehidica. Reacţia de reducere a funcţiei carboxilice din molecula de acid fosfogliceric se petrece în două etape, sub acţiunea NADPH2 şi a energiei sincronizate în molecula de ATP. Astfel ,,agentul reducator” (NADPH2) şi ,, energia de asimilaţie” (ATP) leagă cele două faze ale procesului de fotosinteză. Deci, reducerea CO2 nu se face în mod direct, ci el este încorporat mai întâi în ribulozo- difosfat, apoi în acid fosfogliceric, care se reduce formând aldehida fosfoglicerică.

63

Fig. 33. Localizarea activităţii biochimice în cloroplast (după Binet şi Brunel, 1968)

64

Fig. 34 Schema reducerii CO2 Triozele obţinute sunt antrenate într-o serie de transformări, desfăşurate într-o secvenţa ciclica (ciclul Calvin) pe parcursul căruia, în urma unor serii de condensări, se formează hexozele şi în final, amidonul. Din totalul moleculelor de trioze, numai a VI-a parte parcurge această cale, iar celelalte cinci molecule ajung, prin faze intermediare la regenerarea moleculelor de ribozo-difosfat, capabile să accepte noi molecule de CO2 (fig. 34). Există însa plante la care celulele mezofilului foliar sunt incapabile să fixeze CO2 în hidraţii de C, dar el se încorporează activ în fosfoenol- piruvat (PEP) rezultând acizii tetracarbonici : malic şi aspartic. Astfel, CO2 ajunge pe ribulozo-difosfat intermediat de fosfoenol piruvat, prin transcarboxilare.

65

După acest criteriu, plantele se împart în două grupe mari, notate prescurtat cu C3fotosintetizante şi respectiv C4- fotosintetizante . Calea C4 s-a găsit la specii aparţinând mai multor familii de plante, în majoritate tropicale şi subtropicale. Unele genuri, ca de exemplu Atriplex, conţin atât specii C3 cât şi C4. b. Calea C4 - de reducere a CO2 În structura frunzei la speciile de plante tropicale şi subtropicale, apar unele particularitaţi anatomice şi de ultrastructură. Astfel, în jurul nervurilor se formează o teacă de celule parenchimatice mari, adesea lipsite de grana, care sunt singurele capabile sa reducă CO2 pe calea ciclului Calvin. Restul celulelor din mezofil sunt mai mici, au cloroplaste mai mărunte cu ultrastructura normală, în ele desfasurându-se ciclul Hatch – Stac (Calvin). Între aceste două tipuri de celule existând un schimb intens de substanţe . Speciile de plante C4 fotosintetizante au fost împărţite la rândul lor, după reacţiile particulare care duc la eliberarea CO2, în trei grupe. Grupa plantelor ,,NADP-ME”, în care intervine enzima malica, dependenţa de NADP (de ex. Triticum sp.); Grupa plantelor ,,PCK”, în care activează o fosfoenolpiruvat-carboxikinaza (de ex. Panicum maximum); Grupa ,,NAD-ME” în care este activată enzima malica dependenţa de NAD (de ex. Atriplex spongiosa). În desfăşurarea ciclului Calvin, la toate cele trei tipuri există momente comune. Astfel este momentul fixării CO2 pe oxalocetat, reacţie catalizată de fosfoenol-piruvat carboxilaza şi care se petrece în citoplasma celulelor mezofilului frunzelor. Mai departe, desfăşurarea ciclului diferă la cele trei tipuri de plante. În plantele din grupa NADP-ME, oxalatul este redus la malat în cloroplastele celulelor mezofilului, iar acesta este translocat în celulele tecii perifasciculare, unde este descompus (în cloroplastul acestora), eliberându-se CO2 care parcurge ciclul Calvin, formându-se în final, amidonul. Agentul reducător îl constituie NADPH2, format din malat prin intervenţia enzimei malice dependenţa de NADP . Cloroplastele celulelor tecii fasciculare furnizează ATP în ele având loc fosforilarea. Este de notat faptul că plantele C4 utilizează o moleculă de ATP în plus, fată de plantele C3, pentru fiecare moleculă de CO2 fixata de hidraţi de carbon (fig. 35A).

Fig. 35. A. Fixarea CO2 pe calea C4: A - plante "NADP - ME"; B - plante "PCK"; C - plante "NAD-ME"; ciclul FRC - ciclul fotosintetic de reducere a CO2 66

În celelalte două tipuri de plante C4 (PCK si NAD-ME) oxalatul format de fosfoenolpiruvat-carboxilaza, în primul moment al fixării CO2, este convertit prin transaminare, în afara cloroplastului, la aspartat, care migrează apoi în teaca perifasciculara de celule, unde din nou, este convertit prin transaminare înapoi la oxalacetat. Aceasta noua transaminare este localizată la tipul de plante ,,PCK” în citoplasma celulelor perifasciculare, iar la tipul de plante ,,NAD-ME” în mitocondriile lor. În plantele ,,PCK” oxalatul este decarboxilat de o PEP-carboxilaza citoplasmatică formându-se acid PEP, care este apoi convertit la piruvat (fig. 35 B). În plantele NAD-ME, oxalatul este mai întâi redus de către NAD-malat dehidrogenază în mitocondrii, apoi suferă în aceleaşi organite o decarboxilare oxidativă prin intervenţia enzimei malice, dependentă de NAD. Piruvatul eliberat la ambele tipuri de plante, este convertit în alanina prin transformare, iar alanina se întoarce în celulele mezofilului unde este transaminată din nou producându-se piruvat, care este reconvertit în cloroplaste la PEP (fig. 35 C). Astfel, calea C4 se caracterizează prin transportul unor mari cantitaţi de malat sau aspartat din celulele mezofilului în celulele tecii perifasciculare şi cantitaţi corespunzătoare de piruvat sau alanina în direcţie opusă. Acest flux, intercelular are loc, se crede prin plasmodesmele din pereţii celor două tipuri de celule.

2.6.2. Mitocondriile Mitocondria este considerată ,,centrul respiraţiei celulare” funcţia principală constă în înglobarea energiei sub forma de legături macroergice de ATP. Mitocondriile, datorită echipamentului lor enzimatic, localizat atât în membrane, cât şi în matrice, îndeplinesc în biologia celulei următoarele roluri: asigură în parte degradarea glucozei, sunt sediul efectuării ciclului Krebs şi al lanţului respirator ce derivă din acest ciclu, asigura efectuarea ciclului glicoxalatului şi sunt sediul unor sinteze şi degradări de substanţe. 2.6.2.1.Degradarea glucozei de către mitocondrii Se admite în general, că degradarea glucozei are loc în două etape: una extramitocondriala, care ia sfârşit cu formarea a două molecule de acid piruvic dintr-o molecula de glucoza şi alta intramitocondrială în care are loc oxidarea totală a acidului piruvic în CO2 si H2O. Prima serie de reacţii este cunoscută sub denumirea de glicoliza, calea EmdenMeyerhof, faza anaeroba a oxidării glucozei sau calea formării piruvatului. În linii mari, procesul de degradare anaerobă a glucozei se desfasoară astfel: ATP fosforilare ADP glucoza fosfokinaza

izomerizare glucoza-6-fosfat

fructoza-6-fosfat hexozoizomeraza

ATP fosforilare ADP fructoza-6-fosfat

fructoza-1.6-difosfat fosfofructokinaza

dihidroizi-acetona 3-fosfat aldehida-3-fosfoglicerina

NADH→H+NAD acid-3-fosfogliceric ambele sunt reduse de NADH

aldolaza acid piruvic (2 molecule) piruvatkinaza 67

Deci, în etapa extramitocondriala dintr-o moleculă de glucoza rezultă două molecule de acid piruvic (glicoliza), urmând ca oxidarea completă a acidului piruvic, în CO2 si H2O să aibă loc intramitocondrial, în ciclul Krebs. În acest scop acidul piruvic este convertit în prezenţa coenzimei-A (Co-A) în acetil-Co-A, când are loc o reacţie complexă de decarboxilare oxidativa, la care participă NAD+ ca acceptor de H+ şi enzima piruvatdecarboxilaza. Ciclul Krebs Denumit şi ciclul citric sau ciclul tricarboxilic (deoarece în desfăşurarea lui intervin acizi cu trei grupări –COOH), se desfăşoară în exclusivitate în matrice, iar reacţia lui fundamentală este oxidarea completa a grupării acetil a acetil-Co-A. Aceasta oxidare este realizată numai dacă în mediu se găseşte în exces altă substanţă– acidul oxalacetic, care ia naştere în urma carboxilarii în hialoplasma a acidului piruvic, în prezenta oxalacetalcarboxilazei şi a ionilor de Mn2+, cofactor: Mn2+

acidul piruvic

acid oxalacetic oxalacetal-carboxilaza.

Dacă în legătura cu producerea glucolizei mai există încă deosebire de vederi în ceea ce priveşte nivelul celular la care are loc, în schimb toţi biochimiştii, bazându-se pe date experimentale, sunt de acord ca ciclul Krebs se desfăşoară exclusiv în mitocondrie şi constitue cea mai importantă cale catabolica aeroba a oxidării hidraţilor de C, a acizilor graşi şi a majorităţii aminoacizilor până la CO2 şi H2O, cu punerea în libertate a unei importante cantitaţi de energie. Fazele de desfăşurare a acestui ciclu, stabilite de Krebs încă din 1930, au putut fi urmărite şi controlate în ultimele decenii cu ajutorul suspensiilor de mitocondrii. Acest ciclu are loc în mai multe etape, reacţiile fiecărei etape fiind catalizate de câte o enzimă. Prima etapă, considerată cea mai importantă, constă în pătrunderea acidului oxalacetic în matricea mitocondriei, pătrundere înlesnită de acetil-Co-A-sintetaza, identificată recent în membrană mitocondriala externă, prin condensare cu acetil-Co-A, aceasta va da naştere acidului citric, reacţie catalizată de citrat-sintetaza. Acid oxalacetc + acetil - Co-A

Citrat-sintetaza

acid citric + HS – Co-A

Mg2+ Acidul citric astfel format, în urma unor izomerizări şi decarboxilari dă naştere la o serie de acizi tri şi dicarboxilici ca acizii: izocitric, aconitic, cetoglutaric, succinic, fumaric, malic, acizi cu 6,5 şi 4 atomi de carbon şi, în sfârşit acidul oxalacetic de la care s-a plecat în tot acest timp, acidul acetic provenit din acidul piruvic iniţial, s-a degradat în CO2 si H2O, iar acidul oxalacetic activat, rezultat din transformarea altei molecule de acid piruvic (provenit dintr-o nouă molecula de glucoza), reluând ciclul Krebs (fig. 36).

68

Fig. 36. Ciclul Krebs 69

În cadrul ciclului Krebs se disting opt grupe, în urma cărora rezultă două molecule de CO2 (reacţiile III şi IV) şi opt atomi de H+. Ciclul Krebs este conectat cu lanţul respirator şi, împreună eliberează 216Kcal, din care 191 provin din lanţul respirator . Energia chimică rezultată este stocată în ATP (38 de molecule). În afara de oxidarea completa a radicalului acetil şi de stocarea energiei, ciclul Krebs asigură formarea a numeroase substanţe, cum sunt: α-cetogentaratul, care poate da prin aminare glutamat, care la rândul său este precursorul argininei, prolinei şi hidroxiprolinei; acidul oxalacetic dă prin transformare acid aspartic care este precursorul β-alaninei, treoninei, metioninei, lizinei; acidul succinic este precursorul nucleelor tetrapirolice care intra în constituia citocromilor. 2.6.2.2.Ciclul glioxalatului Studiile efectuate în special în ultimele decenii au demonstrat că numeroşi mutanţi de bacterii şi ciuperci cresc şi se dezvoltă mult mai bine pe mediile de cultură cărora li s-a adăugat acetat . Căutându-se explicarea acţiunii ionului acetat, s-a constatat printre altele, că prezenţa acestuia în mediul de cultură determină producerea de zahăr şi de proteine prin intermediul ciclului glicoxalatului datorită izocitrazei şi malat-sintetazei, enzime care lipsesc din celulele animale, bacteriile şi ciupercile întrerup ciclul Krebs la nivelul acizilor izocitric şi malic. Izocitraza descompune acidul izocitric în acizii glicoxalic şi succinic, iar malat-sintetaza, în urma condensării acidului glicoxalic cu o moleculă de acetat, dă naştere la malat, totul are loc ca şi când două molecule de acetat au dat naştere prin convertire unei molecule de succinat, care intervine în sinteza zaharurilor şi proteinelor ce apar în mediul de cultură. 2.6.2.3. β oxidarea acizilor graşi Lipidele se metabolizează direct sub acţiunea lipazei în glicerol şi acizi graşi. Acizii graşi sunt oxidaţi la nivelul mitocondriei. Schema procesului de oxidare a acizilor graşi a fost elaborată de Lynen şi este reprezentată de o elice în care fiecare spiră corespunde formării unui acetil-Co-A. În prezenţa ATP, intervin sisteme enzimatice în frunte cu HS-Co-A, producând treptat pierderea unui acid gras cu doi atomi de carbon mai puţin . Molecula de CH3-COOH rezultată nu rămâne liberă, ca atare, ci se combină imediat cu SH-Co-A, dând acetil- Co-A care intra în combinaţie cu acidul oxalacetic, cu formare de acid citric care trece în ciclul Krebs unde va fi complet degradat în apă şi CO2. În felul acesta, întregul lanţ lung al acidului gras este transformat integral în CO2 şi H2O şi energie . Formarea fiecărei molecule de acetil-Co-A reprezentată în urma acestei β oxidări este însoţită de reducerea unei molecule de NAD la NADH2 şi a unei molecule de FAD la FADH2. De asemenea, cercetările au arătat ca acizii aminati rezultaţi din hidroliza proteidelor în urma unui proces de dezaminare oxidativă dau naştere la acizi cetonici, care pot intra în diverse etape ale ciclului Krebs atât în mitocondria animală, cât şi în cea vegetală (fig. 37).

70

Fig. 37. β- oxidarea acizilor graşi

2.6.2.4. Sistemul transportor de electroni (lanţul respirator) Lanţul respirator denumit şi lanţul citocromic sau sistemul transportor de electroni, reprezintă ansamblul de reacţii care au loc în mitocondrie, prin care electronii pierduţi de substanţe (glucide, lipide sau protide), în timpul dehidrogenarii lor în matrice sunt transportaţi până la oxigen acţionându-l; oxigenul astfel activat devine acceptor de protoni (H+), dând naştere la H2O. Studiile biochimice ,,în situ” şi ,,în vitro” au demonstrat că acceptorii de H+ eliberat de substrat sunt NAD, NADP, FAD, iar cei de electroni sunt citocromii, derivaţi ai hematinei, în care fierul poate exista fie sub forma de Fe2+, fie Fe3+. Din mitocondrii au fost izolaţi mai mulţi citocromi care aparţin claselor a, b, c; de asemenea s-a mai precizat că citocromii mitocondriali a şi b sunt insolubili în apa şi sunt activi numai asociaţi cu fosfolipide, iar citocromul c este foarte solubil în apa. Transportul protonilor (H+) şi electronilor ⎯e până la O2 se face prin intermediul nucleotidelor şi citocromului. Unele din aceste nucleotide, ca FAD sunt în realitate coenzimele hidrogenazelor şi anume NADH2-dehidrogenazei şi succin-dehidrogenazei. Aceste dehidrogenaze cu coenzime flavinice, colorate în galben, sunt denumite flavo-proteine. 71

Cercetările biochimice din ultimele decenii au dus la concluzia că în procesul de trecere al H+ pe NAD şi NADP, care la rândul lor îl transportă pe FAD, intervine ubichinona sau coenzima Q. Din punct de vedere structural coenzima Q este o chinona cu un lanţ lateral poliizoprenic. Studiile de chimie ultrastructurală şi tehnicile de fragmentare a mitocondriei, au stabilit ca întregul lanţ respirator se afla localizat în membrana mitocondriei interne, în oxizomi, activitatea lui fiind în funcţie de integrarea structurală a oxizomilor. Green (1964) a reuşit să izoleze din oxizomi patru complexe enzimatice, denumite convenţional I , II, III si IV . Două din acestea, I şi II sunt dehidrogenaze şi sunt localizate la baza oxizomului, complexul III, localizat în regiunea mediana, catalizează reacţiile ce au loc de la coenzima Q până la citocromul C, iar complexul IV, care se găseşte la vârful oxizomului, catalizează reacţiile terminale ale lanţului respirator, adică transferul electronilor de la citocromul că la O2, în vederea activării lui. 2.6.2.5. Fosforilarea oxidativă Electronii în lungul lanţului respirator suferă o scădere de potenţial, materializată printro eliberare de energie, care are loc în etape şi care serveşte pentru regenerarea moleculelor de

Fig. 38. Conceptul fosforilării oxidative 72

ATP prin fosforilarea ADP cu fosfat anorganic (Pi) existent în matricea mitocondriei (fig. 38). Formarea ATP are loc în trei etape si anume: o prima etapa o constitue oxidarea NADH2 de câtre FAD, o a doua oxidarea citocromului b de către citocromul c şi a treia, oxidarea citocromului a, rezultând în final trei molecule de ATP. Ansamblul acestor reacţii de oxidare şi fosforilare a fost denumit fosforilare oxidativa. Energia astfel stocată sub forma de ATP serveşte în majoritatea cazurilor la biosinteza unor substanţe de mare importanţă. Fosforilarea oxidativă, denumită şi fosforilare cuplată, are un rol deosebit de important în reglarea numeroaselor etape ale metabolismului celular şi justificş denumirea de ,, centrală energetică” a celulei care se dă mitocondriei. Oxidarea completă a unei molecule de glucoză (glicoliză + ciclul Krebs) permite sinteza a 38 de molecule de ATP. Ecuaţia globală a respiraţiei unei molecule de glucoză se poate scrie astfel: C 6 H 12O 6 + 6O2 + 6 H2O→ 6CO2+ 12H2O + 38 ATP 2.6.2.6. Fermentaţiile Exigenţa organismelor faţă de oxigen nu sunt identice. Astfel se disting următoarele trei grupe: Organismele strict aerobe, care nu pot trăi decât în prezenţa oxigenului (animalele, plantele, unele microorganisme) Organismele strict anaerobe, care nu pot trăi decât în absenţa oxigenului liber, care le este nociv (numeroase microorganisme, de ex Clostridium) Organisme aerobe facultative, care pot trăi atât în prezenţa cât şi în absenţa oxigenului din mediu. Astfel, levurile aparţin acestei categorii dar şi unele plante superioare care sunt capabile să reziste la asfixie, adoptând o activitate metabolică diferită de respiraţie, numită fermentaţie. Fermentaţia este oxidarea incompletă a unui substrat organic în absenţa oxigenului (metabolism anaerob); acest substrat organic este transformat într-un produs rezidual organic. Reacţiile enzimatice care transformă substratul organic sunt cele de la glicoliză (localizate în citoplasma citoplasma celulară). Substratul este deci degradat până la acid piruvic. NADH2 format – neoxidat de oxigenul atmosferică din mitocondrie, va reduce acidul piruvic, transformându-l întrun „produs rezidual” produs ultim rezidual din procesul fermentaţiei. După natura acestui produs rezidual şi a echipamentului enzimatic al organismului fermentativ, pot exista mai multe tipuri de fermentaţie (alcoolică, lactică, acetică etc). Metabolismul anaerob este mult mai puţin eficace în ceea ce priveşte producerea de energie, decât respiraţia, deoarece fermentaţia nu utilizează în totalitate energia substratului degradat pentru sinteza ATP, de la o moleculă de glucoză fermentată se formează doar două molecule de ATP, în timp ce în cursul oxidării complete dintr-o moleculă de glucoză rezultă 38 molecule de ATP. Randamentul fermentaţiei este de 2%, faţă de 45% cât este pentru respiraţie. Organismele care îşi obţin energia din fermentaţie trebuie să descompună cantităţi considerabile de substrat; aceste organisme se numesc ,,descompunători”.

2.6.3.Comparaţie între fotosinteză şi respiraţie -

Fotosinteza şi respiraţia sunt două procese antagonice dar complementare: din punct de vedere energetic, fotosinteza transformă energia luminoasă în energie chimic, acumulată în legăturile carbon-hidrogen; respiraţia rupe această legătură şi eliberează energie; din punct de vedere metabolic, fotosinteza construieşte materie organică prin fixarea şi reducerea carbonului mineral, astfel că plantele cresc în greutate. Dar respiraţia 73

degradează rezervele organice (derivaţi de carbon) prin oxidare şi greutatea plantelor scade prin pierderea carbon mineral; schimburile gazoase sunt în sens invers: fotosinteza absoarbe CO2 şi apă şi degajă O2. Oxigenul fotosintetic degajat în biosferă asigură viaţa organismelor superioare (eucariote) care respiră acest oxigen, degajând CO2 şi apă; fotosinteza se manifestă numai în prezenţa luminii. Intensitatea respiraţiei este identică atât în condiţii de obscuritate cât şi de lumină; mecanismele biochimice sunt antagonice: lanţurile transportorilor de electroni funcţionează în sens opus. Lanţul fotosintetic, permite transportul electronilor de la apă la NADH2, lanţul respirator invers, electronii sunt transportaţi de la NADH2 la oxigen, rezultând apă. glucoza construită în cursul ciclului Calvin (faza de întuneric a fotosintezei) prin carboxilare, hidrogenare şi condensare, este „tăiată” de glicoliză, dehidrogenată şi decarboxilată de ciclul Krebs. Respiraţia şi fotosinteza sunt procese care se opun reciproc, dar, ambele participă la menţinerea vieţii şi creşterea organismelor vegetale sau animale. Formula generală pentru fotosinteză este următoarea: Energie (lumina) + 6CO2 + 6H2O →C6 H 12O6 + 6 O2 Formula generală pentru respiraţie conţine aceeaşi compuşi : C 6H 12 O 6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H 2 O + energie (ATP) După cum se observă din formulele generale ale fotosintezei şi respiraţiei celulare, aceste reacţii sunt exact în opoziţie una cu alta, respiraţia eliberând energia captată (de la soare) de fotosinteză. Cele două procese au şi etape similare. Astfel, ambele implică conversia energiei dintr-o formă în alta. În fotosinteză, energia, (lumina) solară este convertită în energie chimică. În respiraţie, energia chimică este convertită în ATP. În ambele procese energia electronilor ce se deplasează de-a lungul unui lanţ este folosită pentru sinteza ATP-ului. Atât cloroplastul cât şi mitocondria au o ultrastructură asemănătoare, ceea ce reflectă şi funcţii asemănătoare (transformatori de energie). Lanţul transportatorilor de electroni, prezent atât în mitocondrie cât şi în cloroplast, se datorează aranjamentului membranelor interne, care este foarte asemănător, în aceste două organite. Toate organismele scindează molecule organice pentru a-şi asigura „combustibilul” necesar proceselor vitale, dar numai plantele autotrofe sunt capabile să capteze energia solară şi să o transforme în „hrană” . Conversia energiei este procesul de bază de care depind toate fiinţele vii.

74

Capitolul 3 ADEZIUNEA CELULARĂ. JONCŢIUNILE CELULARE ŞI MATRICEA EXTRACELULARĂ În organismele pluricelulare, celulele specializate în realizarea unei anumite funcţii se recunosc şi interacţionează specific formând ţesuturi, care prin asociere dau naştere unităţilor funcţionale, numite organe. Interacţiunea dintre celule poate fi joncţională ( prin intermediul unor structuri specializate numite joncţiuni celulare) sau non-jonctională ( prin intermediul moleculelor suprafeţei celulare). Astfel, recunoaşterea şi aderarea intercelulară este posibilă datorită moleculelor de pe suprafaţa celulară, care pot fi diferite calitativ şi cantitativ, manifestând specificitate celulară. Suprafaţa celulară poate media trei tipuri de aderare: a) homofilică, dacă moleculele suprafeţei celulară care interacţionează sunt identice; b) heterofilică, dacă moleculele suprafeţei celulare sunt diferite dar complementare şi c) prin moleculă linker, moleculă extracelulară, ce nu aparţine suprafeţei celulare. Un rol important în stabilirea structurilor tisulare îl are matricea extracelulară, o reţea complexă de macromolecule prezentă în spaţiile interstiţiale şi care se află într-o permanentă interrelaţie cu celulele. Ancorarea celulelor în matricea extracelulară se realizează prin joncţiunile celulămatrice, regiuni specializate din membrana plasmatică. Implicarea joncţiunilor intercelulare şi a matricei, în adeziunea celulară, variază funcţie de tipul celular. În ţesutul epitelial, celulele sunt strâns unite între ele, iar matricea extracelulară este slab reprezentată. Rezistenţa ţesutului epitelial la forţele la forţele mecanice ce acţionează asupra sa este conferită de proteine fibrilare intracelulare (elemente de citoschelet), care se aşează pe faţa internă a membranei plasmatice, unde se formează joncţiuni specializate cu suprafaţa altor celule sau cu matricea extracelulară. În ţesutul conjunctiv, celulele sunt dispersate în matricea extracelulară, care ocupă cea mai mare parte a volumului tisular. În acest caz, elementele componente ale matricei asigură stabilitatea tisulară preluând aproape în totalitate stress-ul mecanic.

3.1. Molecule implicate în aderarea celulă-celulă Din categoria moleculelor suprafeţei celulare implicate în aderarea celulară nonjoncţională fac parte: selectinele, domeniile imunoglobulinice şi caderinele.

3.1.1. Selectinele Sunt proteine identificate pe suprafaţa membranară a leucocitelor, plachetelor sanguine, celulelor endoteliale. Sunt implicate în medierea interacţiunii limfocitelor cu peretele venulelor sau cu nodulii limfatici, fapt pentru care se numesc şi proteine transmembranare limfocitare. Selectinele recunosc şi leagă formaţiuni specifice de oligozaharide care aparţin altei celulei. Ele posedă un domeniu citoplasmatic care traversează membrana plasmatică şi un segment extracelular de lungimi variabile care se termină cu un domeniu pentru lectină. Acest domeniu terminal leagă lectine, proteine de legare care recunosc şi leagă specific moleculele de carbohidraţi de la suprafaţa celulei învecinate. Legarea selectinelor la carbohidraţi este Ca2+ dependentă. Selectinele sunt importante în răspunsul inflamator. Ele mediază legarea neutrofilelor de peretele vasului de sânge, favorizând invazia neutrofilelor prin peretele vasului la locul infecţiei sau leziunii. Pentru procesul invaziei neutrofilelor sunt necesare integrine (proteine receptori membranari de recunoaştere).

75

3.1.2. Domenii imunoglobulinice Unele domenii imunoglobulinice care nu aparţin structurii unui anticorp pot media interacţiuni non-joncţionale celulă-celulă Ca2+ dependete, homosau heterofilică. Interacţiunea heterofilică presupune prezenţa integrinelor. Proteinele care conţin domenii imunoglobulinice aparţin IgSF (superfamiliei imunoglobulinelor). Aderarea celor două celule adiacente se realizează prin suprapunerea domeniului Ig al unei celule cu domeniul Ig al celulei vecine. Membrii numeroşi ai IgSF mediază interacţiunea celulară în elaborarea răspunsului imun. Unul dintre aceştia, numit VCAMs (vascular cell- adhesion molecules) – factorul de adeziune vasculară – este important în dezvoltarea sistemului circulator la embrion şi în legarea neutrofilelor de peretele vascular înainte de invazie. Alţi doi reprezentanţi al IgSF sunt NCAMs (neural cell- adhesion molecules) sau factorul de adeziune neurală şi L1, ambii foarte importanţi în dezvoltarea sistemului nervos la embrion. NCAMs mediază interacţiunea celulă-celulă, iar L1 mediază alungirea conului de creştere în timpul dezvoltării neuronilor. Un domeniu Ig conţine proteine de suprafaţă ale unei celule care pot interacţiona cu o moleculă de integrină ale altei celule (de exemplu, aderarea neutrofilului la peretele vascular, interacţiune mediată de NCAMs celulelor endoteliale şi integrinele neutrofilelor).

3.1.3. Caderinele Sunt reprezentate de o largă familie de glicoproteine de adeziune, Ca2+ dependente. Ele mediază interacţiuni celulare homotipice non-joncţionale şi joncţionale şi transmit semnale din matrixul extracelular în citoplasmă. Caderinele au fost identificate în diferite părţi ale corpului (N-caderina în sistemul nervos, P- caderina în placentă, E- caderina în ţesutul epitelial). Caracteristic acestui tip de glicoproteine este faptul că ele leagă intre ele celule de acelaşi tip şi, deci şi caderine de acelaşi tip. Caderinele sunt alcătuite dintr-un segment lung extracelular ce conţine 5 domenii de legare, un segment transmembranar şi un mic domeniu citoplasmatic. Domeniul citoplasmatic interacţionează cu proteine din citosol care fixează caderine ce aparţin citoscheletului şi transmit informaţii în citoplasmă. Caderinele de pe aceeaşi suprafaţă celulară se asociază formând dimeri. Segmentele extracelulare ce aparţin la două celule adiacente pot interacţiona prin juxtapoziţia porţiunilor terminale sau a segmentului în totalitate. Ca2+ leagă segmentele în tandem menţinându-le într-o stare rigidă, stare necesară legării unei caderine de caderina celulei alăturate. Caderinele sunt molecule implicate în recunoaşterea celulelor de acelaşi tip, aderarea şi menţinerea lor într-un ţesut, respectiv alcătuirea unui ţesut la embrion şi menţinerea integrităţii unui ţesut la adult. În cancer, se produc modificări conformaţionale ale caderinelor care duc la scăderea adezivităţii celulare, eliberarea celulelor oncogene din ţesut şi migrarea lor, cu posibilitatea iniţierii metastazelor.

3.2. Joncţiunea celulară Joncţiunile celulare (joncţiunile intercelulare şi joncţiunile celulă-matrice extracelulară), structuri specializate şi stabile, permit sau împiedică schimburile intercelulare şi mediază contactele celulă-celulă şi celulă-matrice. Din punct de vedere funcţional se deosebesc trei categorii principale de joncţiuni: ƒ Joncţiunile de ocluzie sudează membranele plasmatice ale celulelor epiteliale, blocând fluxul de molecule şi ioni dintre lumenul organelor cavitare şi spaţiile interstiţiale; 76

ƒ ƒ ƒ

Joncţiunile de ancorare asigură legarea strânsă a celulelor unele de altele şi a acestora cu matricea extracelulară; Joncţiunile de comunicare sunt implicate în cuplarea electrică şi metabolică a celulelor ce îndeplinesc aceeaşi funcţie. Joncţiuni sinaptice conectează partea terminală a unui axon neuronal ( butonul terminal) cu celula – ţintă.

3.2.1. Joncţiunile de ocluzie Joncţiunile de ocluzie („zonulae occludens” – numite şi joncţiuni strânse sau impermeabile (tight jonction) sunt reprezentate la polul apical al celulelor epiteliale ce delimitează lumenul unor cavităţi. Observarea la microscopul electronic a unei secţiuni prin joncţiunile de ocluzie oferă imaginea a două membrane plasmatice adiacente care din loc în loc se găsesc în contact direct. Aceste puncte de „sudură”, separate de mici spaţii interstiţiale, sunt rezultatul anastomozei proteinelor joncţionale prezente în membranele plasmatice ale celulelor învecinate. Deşi proteinele nu au fost încă izolate, substratul molecular proteic al joncţiunilor de ocluzie este sugerat de acţiunea denaturantă pe care proteazele o au asupra acestor structuri. Proteinele joncţionale sunt ordonat depuse în mai multe şiruri ce înconjoară celula în regiunea apicală. Joncţiunile de ocluzie se formează în urma stabilirii contactului între şirurile de proteine aparţinând celulelor alăturate, oferind, în ansamblu, imaginea unei centuri situate imediat sub suprafaţa cu microvili a celulei epiteliale (fig.39) Fig. 39 – Joncţiunile strânse sunt formate din mai multe şiruri de perechi de proteine joncţionale situate în regiunea apicală a membranei plasmatice. Aceste structuri joncţionale împiedică deplasarea moleculelor şi a ionilor din lumenul organelor cavitare în spaţiile interstiţiale. Capacitatea de ocluzie variază funcţie de tipul de ţesut epitelial. În plus, se sugerează existenţa unei relaţii logaritmice între numărul şirurilor de proteine joncţionale şi gradul de impermeabilitate al joncţiunilor pentru diferite specii ionice. În celulele epiteliale sunt pompate selectiv substanţe nutritive care, în urma unui transport transcelular, difuzează în ţesutul conjunctiv de unde sunt preluate, în circulaţia sangvină. Acest flux unidirecţional al moleculelor, din lumen prin celulele epiteliale în sânge, este condiţionat de distribuirea asimetrică a componentelor membranare, care determină apariţia unor domenii distincte – apical şi laterobazal – în membrana plasmatică a celulelor epiteliale. Un exemplu concret îl constituie absorbţia glucozei din lumenul intestinal, proces care implică două tipuri de proteine cu o strictă localizare membranară. Proteinele din domeniul apical (faţa luminală a membranei), transportă activ glucoza pompând-o din lumen în celulele epiteliale. Eliberarea glucozei în spaţiile interstiţiale se realizează prin difuziune mediată de un set de permeaze, prezent în domeniul laterobazal. Prezenţa joncţiunilor de ocluzie la polul apical al celulelor face imposibilă retrodifuziunea glucozei din interstiţii în lumenul intestinal. (fig. 40). 77

Fig. 40 – Transportul glucozei în celulele epiteliale ce delimitează lumenul intestinal. Joncţiunile strânse sunt implicate în menţinerea priorităţii celulelor epiteliale împiedicând difuzia proteinelor transportoare în planul membranei plasmatice Menţinerea polarităţii celulelor epiteliale constituie a doua funcţie a joncţiunilor de ocluzie. Acestea acţionează în sensul împiedicării difuziei prin dublul strat lipidic al moleculelor ce compun domeniile membranare. Un argument în favoarea acestei afirmaţii este pierderea polarităţii celulare, datorită migrării lipidelor din stratul exoplasmatic şi al proteinelor în membrana plasmatică, ca urmare a scăderii concentraţiei Ca2+ în mediul extracelular, element esenţial în menţinerea integrităţii joncţiunilor de ocluzie. Atât prin împiedicarea schimburilor lumen-interstiţiu, cât şi prin menţinerea stabilităţii domeniilor membranare, joncţiunile de ocluzie permit ţesutului epitelial să se comporte ca o barieră cu o permeabilitate selectivă.

3.2.2 Joncţiunile de ancorare Joncţiunile de ancorare asigură contactul celulă-celulă şi celulă-matrice extracelulă. Acest tip de joncţiune antrenează elementele de citoschelet creând structuri de rezistenţă în celulele supuse stress-ului mecanic (epitelii, miocard, miometru etc). Din punct de vedere structural, joncţiunile de ancorare sunt alcătuite din două clase de proteine: proteine de ataşare intracelulară şi glicoproteine transmembranare de legare. Proteinele de ataşare intracelulară leagă elementele de citoschelet de complexul joncţional, în timp ce, glicoproteinele transmembranare interacţionează prin domeniile lor intracelulare cu proteinele de ataşare, iar prin cele extracelulare cu glicoproteine transmembranare din celulele adiacente. Ţinând cont de tipul elementelor de citoschelet asociate - filamente de actină sau filamente intermediare – joncţiunile de ancorare se clasifică în joncţiuni de adeziune şi structuri desmozomale. Atât joncţiunile de adeziune, cât şi structurile desmozomale se subdivid în joncţiuni de adeziune intercelulare şi joncţiuni de adeziune celulă-matrice şi respectiv, desmozomi şi hemidesmozomi, funcţie de tipul de contact pe care îl mediază. Toate cele patru tipuri de joncţiuni de ancorare coexistă în celulele ţesutului epitelial. 3.2.2.1 Joncţiunile de adeziune intercelulară În celulele epiteliale, joncţiunile de adeziune intercelulară sunt localizate la polul apical, imediat sub joncţiunile de ocluzie. Aceste structuri constituie situsuri de ancorare ale filamentelor de actină dispuse în mănunchiuri. Orientate paralel cu membrana plasmatică mănunchiurile de filamente de actină înconjoară polul apical al celulei formând o bandă de adeziune continuă („zonulae adherens”). Benzile de adeziune aparţinând celulelor învecinate se găsesc în opoziţie directă, contactul acestora fiind mediat de structurile joncţionale de adeziune intercelulară. Datorită aspectului lor, aceste joncţiuni au fost numite desmozomi în 78

bandă (belt desmosomes), denumire eronată, deoarece din punct de vedere chimic cele două structuri joncţionale sunt deosebite. Filamentele de actină interacţionează cu complexul joncţional printr-un set de proteine de ataşare dintre care cel mai bine caracterizate sunt vinculina şi α-actinina. Proteinele de ataşare se leagă de domeniul intracelular al unei glicoproteine transmembranare, ancorând astfel filamentele de actină în embrana plasmatică. Glicoproteina (uvomorulina) este un membru al familiei moleculelor de adeziune intracelulară calciu dependente, numite caderine. Domeniul extracelular al glicoproteinei interacţionează cu domeniile extracelulare ale glicoproteinelor din membrana plasmatică a celulelor învecinate. Ca rezultat al acestor interacţii, ce au la bază un mecanism Ca2+ dependent, membranele plasmatice adiacente sunt menţinute la o distanţă de 15-20 nm una de cealălantă (fig. 41). Conectarea reţelelor transcelulare de filamente de actină asigură adeziunea celulelor epiteliale conferind totodată rigiditate structurii tisulare. Fig. 41 – Distribuţia proteinelor de legare a actinei şi uvomorulinei la nivelul joncţiunilor de adeziune intercelulară din celulele epiteliale 3.2.2.2 Joncţiunile de adeziune celulă-matrice extracelulară Joncţiunile de adeziune celulă-matrice asigură contactul dintre celulă şi matricea extracelulară prin conectarea filamentelor de actină, ce alcătuiesc citoscheletul, cu elemente componente ale matricei. Aderarea celulelor la matrice implică regiuni specializate ale membranei plasmatice, numite contacte focale sau plăci de adeziune. La nivelul plăcilor de adeziune se stabileşte contactul dintre mănunchiurile de filamente de actină şi un element al matricei, prin intermediul unei glicoproteine transmembranare, ce aparţine familiei integrinelor. De cele mai multe ori, elementul matriceal este fibronectina, iar glicoproteina transmembranară este receptorul pentru fibrobnectină. Legarea filamentelor de actină de domeniul intracelular al receptorului este indirectă, fiind mediată de cel puţin pentru tipuri de proteine de ataşare: o proteină ce leagă capul filamentelor de actină („actin-filament-capping protein”), α-actinina, vinculina şi talina. 3.2.2.3 Desmozomii Dependent (fig. 42). desmozomii (desmozomii în pată) constituie regiuni de cimentare intercelulară. Aceste structuri joncţionale realizează contactul dintre filamentele intermediare ale celulelor adiacente, în urma cărora se formează o reţea transtisulară continuă. Tipul filamentelor intermediare antrenate de desmozomii în adeziunea intercelulară diferă funcţie de tipul celular. În celulele epiteliale, structurile desmozomale le sunt asociate filamentele de cheratină, în celulele musculare ale inimii, filamentele de desmină, în celulele mezenchimale, filamentele de vimentină etc. Vizualizarea la microscopul electronic a desmozomilor oferă imaginea a două discuri dense (15-20 nm grosime), situate pe faţa citoplasmatică a membranelor celulelor adiacente, 79

numite plăci citoplasmatice. Placa citoplasmatică este alcătuită dintr-un complex de proteine de ataşare – desmoplachine – ce leagă tangenţial filamentele intermediare şi o glicoproteină transmembranară – desmoglina-care interacţionează prin domeniul său intracelular cu proteine de ataşare. Cele două plăci citoplasmatice din membranele adiacente sunt conectate ca urmare a interacţiunii domeniilor extracelulare ale desmoglinelor printr-un mecanism Ca2+ Fig. 42 – Structuri desmozomale în ţesutul epitelial. (a) Desmozomul este alcătuit din două plăci citoplasmatice situate pe feţele citoplasmatice ale plasmalemelor celor două celule adiacente. Filamentele intermediare se ataşează tangenţial de plăcile citoplasmatice. Glicoproteinele transmembranare interacţionează prin domeniile lor extracelulare, consolidând structura desmozomală. (b) Hemidesmozomul asigură ancorarea celulelor în matricea extracelulară. Este alcătuit dintr-o singură placă citoplasmaticăde care filamentele intermediare sunt legate prin capete. În boala Penfigus se sintetizează anticorpi împotriva propriilor glicoproteine transmembranare. Legarea anticorpilor de desmoglină afectează structura desmozomilor responsabili de aderarea intercelulară a celulelor ţesutului epitelial din piele. Devenit lax, ţesutul epitelial este incapabil de a mai funcţiona ca barieră. Moleculele aflate în soluţie difuzează printre celulele epiteliale spre exterior, fapt ce conferă pielii un aspect vezicular. De vreme ce anticorpii afectează doar desmozomii din piele se presupune existenţa unor deosebiri biochimice între aceştia şi cei prezenţi în alte ţesuturi. Studiul desmozomilor a pus în evidenţă implicaţiile funcţionale pe care aceste structuri le au în alte ţesuturi decât cel epitelial. Astfel, în celulele ce alcătuiesc ţesutul muscular cardiac, filamentele de desmină asociate desmozomilor constituie o cale de transmitere a forţei de contracţie, iar în muşchii netezi desmozomii sunt consideraţi echivalenţi funcţionali ai discurilor „Z” din muşchii scheletici. 3.2.2.4 Hemidesmozomii Hemidesmozomii, similari desmozomilor din punct de vedere morfologic, asigură contactul dintre regiunea bazală a membranei celulelor epiteliale şi o structură specializată a matricei extracelulare, numită lamina bazală. Placa citoplasmatică constituie situsul de ancorare a filamentelor de cheratină ce intră în alcătuirea citoscheletului celulei epiteliale. Legarea plăcii citoplasmatice de lamina bazală este mediată de o glicoproteină transmembranară. În ţesuturile epiteliale, unde de regulă se semnalează prezenţa ambelor structuri desmozomale (desmozomi în pată şi hemidesmozomi), acestea sunt implicate atât în asigurarea adeziunii celulare, cât şi în distribuirea forţelor mecanice în întregul ţesut epitelial şi ţesutul conjunctiv adiacent.

3.2.3 Joncţiunile de comunicare Joncţiunile de comunicare (permeabile, „gap junction”) au o largă răspândire, regăsinduse în toate ţesuturile organismelor animale. În regiunea joncţiunilor de comunicare, 80

membranele plasmatice adiacente sunt separate de un spaţiu îngust (2-4 nm grosime) întrerupt din loc în loc de particule cilindrice. Aceste particule sunt străbătute de un canal ce face posibil contactul dintre citoplasmele celulelor cuplate prin joncţiunile de comunicare. Canalul, cu un diametru de 1,5-2nm, permite trecerea liberă, dintr-o celulă în alta, a moleculelor cu greutăţi moleculare sub 1500 -2000 Dar (glucide, aminoacizi, nucleotide, hormoni etc.)şi a diferitelor specii ionice. Prin stabilirea acestui tip de comunicare intercelulară, joncţiunile permeabile constituie elementul-cheie al cuplării electrice şi metabolice celulare, proces, ce stă la baza coordonării activităţii celulelor într-un ţesut. Cuplarea electrică mediată de joncţiunile de comunicare asigură: ƒ sincronizarea contracţiilor celulelor ce alcătuiesc ţesutul muscular; ƒ peristaltismul intestinal; ƒ propagarea potenţialului de acţiune de la un neuron la altul. Prin cuplarea metabolică, celulele sunt capabile să transfere diferite molecule celulelor învecinate incapabile să le sintetizeze. De asemenea, prin canalele joncţiunilor de comunicare pot trece mediatori intracelulari (ioni de Ca, AMP-ciclicetc.), implicaţi în reglarea numeroaselor procese metabolice celulare. Deplasarea mediatorilor intracelulari de la o celulă la alta prin joncţiunile de comunicare, explică activarea diferiţilor stimuli hormonali (vezi subcap.1.3.2). Joncţiunile de comunicare au un rol important în procesul de embriogeneză. Se presupune că primele etape ce urmează fecundării majoritatea celulelor sunt cuplate electric. Pe parcursul proceselor de diferenţiere, grupuri de celule cu o entitate distinctă se decuplează de restul celulelor urmând o cale comună de dezvoltare. Apariţia defectelor în dezvoltarea embrionului ca urmare a injectării, în etapele timpurii ale embriogenezei, a unor inhibitori ai joncţiunilor de comunicare sprijină această ipoteză. 3.2.3.1 Structura joncţiunilor de comunicare În alcătuirea joncţiunilor de comunicare intră un singur tip de proteină transmembranară, numită conexină (280000-320000Da). Lanţul polipeptidic (280 aminoacizi) străbate de patru ori membrana plasmatică. Cele patru domenii membranare prezintă o conformaţie αhelix. Al treilea domeniu α-helix al conexinei are un caracter amfipatic. Prin asocierea a şase molecule de conexină ia naştere o structură conexon. În interiorul conexonului, domeniile αhelix amfipatice, ale fiecărei proteine componente delimitează un canal ce străbate membrana plasmatică (fig.43). Fig. 43 – a) Joncţiunile de comunicare. Conexonii, complexe proteice prezente în membranele plasmatice sunt poziţionaţi cap la cap, dând naştere unor canale de comunicare intercelulară. b) Poziţionarea în membrana plasmatică a conexinei-subunitate a conexonului. În regiunea membranară implicată în joncţiunile de comunicare, sute de conexoni se aglomerează formând cluster-i (mănunchiuri) Conexonii din membranele celulelor învecinate se aşează cap la cap formând un canal de comunicare continuu între citoplasmele celor celule. 3.2.3.2 Reglarea permeabilităţii joncţiunilor de comunicare Joncţiunile de comunicare sunt structuri cu caracter dinamic, permeabilitatea lor fiind dependentă de diverşi factori: 81

ƒ ƒ ƒ ƒ

Scăderea pH-ului citosolic; creşterea concentraţiei Ca2+ liber în citosol; valoarea potenţialului de membrană la nivelul joncţiunilor; semnale chimice extracelulare etc. Modificarea permeabilităţii are la bază capacitatea joncţiunilor de comunicare de a adoptă două conformaţii distincte: închisă şi deschisă (fig. 44) Fig. 44 – Schema modificării conformaţionale a conexonilor Existenţa unui mecanism de reglare a permeabilităţii structurilor joncţionale dependentă de concentraţia de Ca2+din citosol are o importanţă vitală pentru funcţionarea normală a celulelor asociate din ţesuturi. Alterarea gravă a structurii celulare (ruperea membranei plasmatice, moarte celulară etc.) este însoţită de pierderea unor cantităţii însemnate de metaboliţi celulari, în paralel cu creşterea influxului de ioni de Na şi Ca. În acest caz, concentraţia mare a ionilor de Ca impune închiderea joncţiunilor de comunicare dintre celulele deteriorate şi cele şi cele normale. Prin această decuplare, sunt izolate regiunile tisulare afectate, ceea ce face posibilă funcţionarea normală a celulelor în restul ţesutului. Creştere permeabilităţii joncţiunilor de comunicare, în prezenţa unui semnal chimic extracelular, stă la baza activităţii celulare în cascadă. Un exemplu concret îl constituie răspunsul celular la acţiunea hormonului glucagon, ce comandă oprirea sintezei de glicogen în celulele hepatice şi eliberarea glucozei în sânge. În celulele hepatice stimulate de glucagon, are loc creşterea concentraţiei de AMP-c, care activează protein kinazele AMP-c dependente. Ele fosforilează atât enzimele, cât şi conexina din structura joncţiunilor de comunicare. Fosforilarea conexinei impune adoptarea conformaţiei deschisă de către joncţiuni, ceea ce permite trecerea AMP-c din celula activată în celulele învecinate. Activarea acestora nu necesită contactul direct cu hormonul, transmiterea semnalului realizându-se prin AMP-c.

3.2.4. Joncţiunile sinaptice Sunt structuri specializate de legătură între neuroni. Prin joncţiunea sinaptică, un axon în creştere se ataşează la celula-ţintă Acest tip de joncţiune este mediat de protocaderine (glicoproteine ce aparţin familiei caderinelor; conţin 6 domenii extracelulare de legare în tandem). Există mai mult de 50 de gene ce controlează sinteza diferitelor protocaderine. Numărul mare de protocaderine asociate în diferite combinaţii dau specificitatea sinaptică. Rolul protocaderinelor este acela de a ţine la distanţa optimă cele două componenete membranare ale sinapsei – membrana presinaptică şi cea postsinaptică, pentru a facilita transmiterea sinaptică.

3. 3. Matricea extracelulară Matricea extracelulară reprezintă o reţea complexă de carbohidraţi şi proteine ce ocupă spaţiile interstiţiale. Considerată un suport inert ce oferă doar stabilitate fizică ţesuturilor, matricea extracelulară se relevă, azi, ca o structură dinamică ce joacă un rol esenţial în dezvoltarea, migrarea, proliferarea, forma şi funcţiile metabolice ale celulelor cu care se află într-un contact permanent. Arhitectura, elementele componente, cât şi rolul matricei extracelulare diferă funcţie de tipul tisular. La interfaţa dintre ţesutul epitelial şi ţesutul conjunctiv subadiacent, se află o structură specializată a matricei extracelulare, numită lamină bazală, care mediază contactul 82

dintre cele două ţesuturi. În glomerulii renali, lamina bazală se comportă ca un filtru permiţând trecerea apei, ionilor şi a moleculelor mici din sânge în spaţiul urinar. În ţesutul conjunctiv lax, pe care se sprijină ţesutul epitelial şi diferitele glande. În ţesutul conjunctiv ce înconjoară capilarele sangvine, reţeaua intricată de macromolecule din spaţiile interstiţiale permite difuzia liberă a nutrienţilor şi a oxigenului din sânge în celulele ţesuturilor periferice. În ţesutul conjunctiv dens, prezent în cartilaje, tendoane şi oase, matricea extracelulară este responsabilă de elasticitatea şi rezistenţa mecanică ale acestor structuri.

3.3.1 Componentele matricei extracelulare Macromoleculele ce alcătuiesc matricea extracelulară sunt secretate de către celulele ce se găsesc dispersate în matrice şi care aparţin clasei fibroblastelor. În matricea extracelulară sunt prezente polizaharide de tipul glicozaminoglicanilor (GAG) care, de regulă, sunt legate covalent de moleculele proteice, formând proteoglicani. Proteinele fibrilare constituie cea de-a doua componentă a matricei. Se disting două tipuri de proteine fibrilare: proteine structurale (colagenul şi elastina) şi proteine de adeziune (fibronectina şi laminina). Proteinele fibrilare, dispuse în reţea, sunt responsabile de organizarea matricei, conferindu-i totodată rezistenţă mecanică. Această reţea proteică este înglobată în gelul hidrat de polizaharide. Faza apoasă a gelului permite difuzia metaboliţilor, hormonilor etc. în spaţiul dintre celule şi în capilarele sangvine. 3.3.1.1 Glicozaminoglicanii Glicozaminoglicanii reprezintă lanţuri poliglucidice lineare a căror unitate structurală este un diglucid. În mod obligatoriu, unul din componentele diglucidului este un amino-glucid de tipul N-acetilglucozaminei, al doilea rest glucidic este, de cele mai multe ori, acidul uronic. Aminoglucidul din unitatea diglucidică poartă grupări sulfat. Atât grupările sulfat, cât şi grupările carboxil ale acidului uronic conferă glicozaminoglicanilor încărcare electrică negativă. Ca rezultat al acţiunii forţelor de electrostatică, moleculele leagă diferiţi cationi (în special Na+). Specii ionice osmotice active, cationii cresc gradul de hidratare al matricei. Aceasta determină creşterea turgescenţei matricei extracelulare, factor ce conferă structurii rezistenţă la forţele de compresie. Lanţurile poliglucidice hidrofile, adoptă o conformaţie de tip „random coil” („încolăcire aleatorie”). Deşi glicozaminoglicanii reprezintă 10% din masa proteinelor fibrilare, datorită conformaţiei adoptate, aceste molecule ocupă cea mai mare parte a spaţiului interstiţial. Funcţie de tipul de reziduuri glucidice, a legăturilor ce se stabilesc între acestea, a numărului şi a localizării grupărilor sulfat, se disting patru clase de glicozaminoglicani: 1. acidul hialuronic; 2. condroitin sulfat şi dermatan sulfat; 3. heparan sulfat şi heparină; 4. cheratan sulfat. Cu excepţia acidului hialuronic, toate celelalte clase ale glicozaminoglicanilor prezintă caracteristici comune: ƒ conţin grupări sulfat legate de reziduuri glucidice; ƒ conţin unităţi diglucidice diferite dispuse într-o secvenţă complexă. ƒ sunt molecule scurte (mai puţin de 300 reziduuri glucidice) ƒ formează proteoglicani. Atât lanţul poliglucidic lung (câteva sute de reziduuri glucidice), cât şi unităţile diglucidice nesulfatate, ce se repetă regulat, definesc acidul hialuronic drept un reprezentant atipic al glicozaminoglicanilor. 83

Structura simplă a acestei molecule, prezenţa şi implicarea sa în fazele timpurii ale embriogenezei sugerează faptul că acidul hialuronic este primul reprezentant al glicozaminoglicanilor, din el derivând celelalte clase. Moleculele de acid hialuronic se leagă de suprafaţa celulelor care migrează,acoperindule ca o „haina”. Acest fapt, împiedică adeziunea intracelulară, făcând posibilă deplasarea liberă a celulelor şi favorizând proliferarea lor. Prin acest mecanism, acidul hialuronic joacă un rol important în migrarea celulelor pe parcursul morfogenezei şi al reparării structurilor tisulare. 3. 3.1.2 Proteoglicanii Proteoglicanii sunt reprezentaţi în toate ţesuturile conjunctive şi matricele extracelulare. Aceste molecule conţin un miez proteic (core) în care sunt ancorate lanţuri de glicozaminoglicani. Structuri heterogene, proteoglicanii diferă prin greutatea moleculară, componenta proteică, numărul şi tipul lanţurilor de glicozaminoglicani, aranjarea grupărilor hidroxil, sulfat şi carboxil în lanţurile poliglucidice. Componenta proteică a proteoglicanilor este sintetizată la nivelul ribozomilor ataşaţi de RE rugos. Concomitent cu procesul de translaţie proteică are loc translocarea proteinei în aparatul Golgi unde este asamblată în proteoglicani. În prima etapă a sintezei proteglicanilor, o secvenţă tricglucidică se leagă covalent de un rest de serină din molecula proteică (fig. 45). Fig. 45 - Structura proteoglicanilor. Glicozaminoglicanii se leagă prin intermediul unei secvenţe triglucidice de un rest de Ser prezent în structura componentei proteice a proteoglicanilor. Restul de Ser este frecvent localizat în interiorul unei secvenţe specifice de aminoacizi: Asp(Glu)-Asp(Gky)-X-Ser-GlyX-Gly, unde X poate fi oricare aminoacid.

La această secvenţă ce serveşte drept „primer” se leagă unul câte unul reziduurile glucidice printr-o reacţie catalizată de glicozil-transferaza. Simultan cu elongarea lanţurilor poliglucidice are loc în aparatul Golgi procesarea acestora, reacţii de sulfatare şi epimerizare. Eliminaţi în spaţiul interstiţial, proteoglicanii formează geluri hidratate, cu densităţi diferite şi pori de mărime variabilă, ce reglează traficul molecular şi deplasarea celulelor funcţie de mărimea sau/şi sarcina lor electrică. Structura heterogenă a proteoglicanilor sugerează faptul că aceasta nu constituie unica lor funcţie. Cercetări în acest sens au pus în evidenţă capacitatea proteoglicanilor de a lega molecule semnal (ex. factorul de creştere al fibroblaştilor – FGF). Organizarea acestor molecule în matricea extracelulară este încă un subiect controversat. În cartilaje, proteoglicanii formează agregate ce pot atinge o lungime de 4µm şi o masă moleculară de aproximativ 2 x 108 Da. Componenta centrală a acestor agregate o constituie acidul hialuronic. Miezul proteic al proteoglicanilor, de care sunt ataşate multiple lanţuri condroitin sulfat şi cheratan sulfat se leagă, necovalent de acidul hialuronic. Lanţurile sunt stabilizate de proteine de legare (fig. 46). 84

Fig. 46 – Proteoglicanii din cartilagii conţin şi acid hialuronic legat necovalent, prin intermediul unor proteine liker de miezul proteic. Pe o singură moleculă de acid hialuronic se pot lega o sută de monomeri de proteoglicani. Acest tip de organizare a proteoglicanilor conferă elasticitate cartilajelor. Proteoglicanii sunt prezenţi şi la nivelul membranelor plasmatice ale multor tipuri celulare. De miezul integrat în membrana plasmatică şi care proemină în spaţiul extracelular este ataşat un număr mic de lanţuri de glicozaminoglicani (fig. 47).

Fig. 47 – a) Proteoglicani prezenţi la nivel la nivelul membranelor plasmatice. Miezul proteic de care sunt ataşate patru lanţuri de heparan sulfat şi două de condroitin sulfat traversează integral membrana plasmatică; b) Legarea lanţurilor de condroitin sulfat la miezul proteic al proteoglicanilor din membrană. În acest caz proteoglicanii sunt implicaţi în legarea celulelor de matricea extracelulară şi în organizarea acromoleculelor ce compun matricea.

85

3.3.1.3 Colagenul Colagenul reprezintă o familie de proteine fibrilare insolubile, sintetizate în fibroblaste şi reprezentate în toate organismele animale la nivelul matricei extracelulare şi a ţesutului conjunctiv. Este principala componentă a matricei extracelulare. Se cunosc poate 12 tipuri de colagen. Dintre acestea tipurile I, II, şi III întâlnite în special în ţesutul conjunctiv, au capacitate de autoasamblare, formând polimeri ce poartă numele de fibrile de colagen. Tipul IV constituie comportamentul principal al laminei bazale, unde formează o reţea bidimensională. a. Structura moleculelor de colagen Unitatea structurală fundamentală a colagenului este o moleculă proteică cu o lungime de 300nm şi un diametru de 1,5 nm, alcătuită din trei subunităţi: două lanţuri α1 şi un lanţ α2. Celelalte trei tipuri polipeptidice, ce conţin fiecare 1050 aminoacizi, se înfăşoară unul în jurul celorlalte, de la stânga spre dreapta, formând o structură de tipul triplu helix. Fiecare rotaţie completă (tur) a helixuluide faptul că conţine trei aminoacizi (fig. 48) Fig. 48 - a) Modelul lanţului polipeptidic alfa din molecula de colagen. Gly ocupă a treia poziţie în secvenţa repetitivă: Gly-X-Y, unde X şi Y reprezintă oricare alt aminoacid. b) Modelul moleculei de colagen. Cele trei lanţuri alfa formează un tripluhelix. Repetiţia glicinei (Gly) la fiecare a treia poziţie, este justificată de faptul că aceasta este singurul aminoacid suficient de mic pentru a ocupa spaţiul din interiorul triplu-helixului. Molecula de colagen este bogată în prolină, lizină, aminoacizi ce apar de cele mai multe ori sub formă hidroxilată. Grupările hidroxil ale hidroxiprolinei participă la formarea legăturilor de hidrogen ce stabilizează triplu-helixul. În boala numită scorbut, datorat deficienţei de vitamina C, este inhibată reacţia de hidroxilare a prolinei, ceea ce împiedică organizarea lanţurilor polipeptidice în triplu-helix. Acestea sunt rapid degradate sub acţiunea unei enzime, numită colagenază. În consecinţă, matricea extracelulară şi vasele sangvine devin extrem de fragile, iar dinţii se desprind din alveolele dentare. Grupările hidroxil ale hidroxilizinei sunt implicate într-o reacţie de glicozilare. Glicozilarea colagenului conferă acestei molecule capacitatea de a se autoasambla în spaţiul extracelular.

86

b. Sinteza colagenului Prezenţa secvenţei repetitive – Gly-X-Y (unde X,Y reprezintă diferiţi aminoacizi cu excepţia glicinei)în structura colagenului, reflectă organizarea genelor ce îl codifică, sugerând faptul că evoluţia acestor gene are la bază fenomenul de duplicare genică. Gena ce codifică lanţul α1 conţine 41 de exoni. Cea mai mare parte a exonilor este alcătuită din 54 perechi de baze (pb) sau multipli de doi sau trei ai acestui număr, sintetizând 1,2 sau 3 unităţi primordiale. O unitate primordială conţine 6 secvenţe repetitive Gly-X-Y. Un număr mic de exoni din structura genei au pierdut, pe parcursul evoluţiei 9pb, unităţile primordiale codificate de către aceştia fiind mai scurte cu o secvenţă Gly-X-Y. Locul de sinteză al lanţurilor polipeptidice ce formează colagenul îl constituie ribozomii ataşaţi de RE rugos. Ca rezultat al translaţiei la nivel ribozomal sunt sintetizate lanţurile pro-α. Acestea sunt introduse în lumenul RE rugos, datorită prezenţei în structura lor a secvenţei semnal („signal peptide”). În regiunile carboxil- şi amino- terminale lanţurile pro-α conţin alte două secvenţe, numite propeptide. Aceste două secvenţe formează domenii globulare, în timp ce restul lanţului adoptă o conformaţie de tip helix. În lumenul RE reziduurile de lizină şi prolină sunt hidroxilate, iar între secvenţele propeptidice a trei lanţuri pro-α se stabilesc punţi disulfurice intercatenare. Ulterior formării legăturilor disulfurice, lanţurile se unesc (direcţia C - N), generând molecula de procolagen. Din RE, procolagenul este transportat în aparatul Golgi, unde se desfăşoară mai multe runde de procesare ce constau, în principal, în adaosul de reziduuri glucidice la hidroxilizină. Moleculele de procolagen sunt eliminate din aparatul Golgi în spaţiul extracelular. Sub acţiunea procolagen peptidazelor, secvenţele sunt clivate proteolitic, molecula de procolagen fiind convertită în colagen. Proteoliza secvenţelor propeptidice în spaţiul extracelular împiedică autoasamblarea colagenului în interiorul celulei,ceea ce ar avea drept consecinţă distrugerea celulară. c. Asamblarea moleculelor de colagen în spaţiul extracelular În spaţiul extracelular, moleculele de colagen (numit şi tropocolagen) de tip I, II şi III se asociază spontan formând polimeri ordonaţi ce poartă numele de fibrile de colagen (50nm în diametru). În fibrile, moleculele sunt dispuse în şiruri longitudinale. Între moleculele învecinate ale aceluiaşi şir există o distanţă („gap”) de 35 nm. Moleculele de colagen din şirurile adiacente sunt deplasate unele faţă de altele cu 67 nm, ceea ce reprezintă mai puţin de o pătrime din lungimea totală a moleculei. Se constată că din cinci în cinci molecule de colagen sunt aliniate identic (fig. 49). Spaţierea colagenului în fibrile conferă aceştia o maximă elasticitate. În regiunile amino-şi carboxil-terminale ale colagenului există segmente scurte ce au o conformaţie triplu-helix. Resturile de lizină sau/şi hidroxilizină din aceste regiuni participă la legături covalente încrucişate ce se stabilesc între extremitatea carboxilică a unei molecule adiacente. Aceste legături au rolul de a stabiliza asamblarea colagenului în fibrile. Organizarea fibrilelor diferă de la ţesut la altul. În piele, acestea se întretaie creând o reţea laxă. În oase şi în cornee, fibrilele de colagen sunt dispuse în plăci ordonat aranjate; fibrilele aceleiaşi plăci sunt paralele între ele şi perpendiculare pe cale ale plăcilor adiacente. În tendoane fibrilelor formează mănunchiuri, numite fibre. Fibrele sunt dispuse paralel şi orientate pe direcţia forţei ce acţionează asupra tendonului.

87

Fig. 49 – a) Sinteza colagenului şi asamblarea sa în fibre în spaţiul extracelular. 3.3.1.4. Elastina Elastina este o proteină neglicozilată, puternic hidrofobă, a cărei secvenţă de aminoacizi (830) este bogată în glicină şi prolină. Este proteina majoră a reţelelor de fibre elastice din matricea extracelulară. Spre deosebire de colagen, are un conţinut scăzut de lizină. În matricea extracelulară, resturile de lizină ale moleculei proteice participă la formarea legăturilor covalente încrucişate ce stabilizează elastina într-o reţea (filamente sau foiţe) ale cărei ochiuri îşi modifică forma în raport cu direcţia forţei ce acţionează asupra sa. Elasticitatea reţelei se datorează capacitaţii moleculelor de elastină de a adopta mai multe conformaţii random-coil. Oscilarea între conformaţii caracterizate de diferite grade de relaxare a moleculelor de elastină asamblate în reţea, conferă acestei proteine proprietăţi elastice similare cauciucului. Filamentele de elastină reprezintă constituenţi principali ai reţelei de fibre elastice prezente în matricea extracelulară din piele, vase sangvine sau plămâni. Componentul minor al fibrelor elastice este o glicoproteină. Dispusă pe suprafaţa fibrelor, glicoproteina intervine în organizarea moleculelor de elastină.

88

3.3.1.5. Fibronectinele Fibronectinele aparţin clasei glicoproteinelor de adeziune, a căror funcţie principală este de a media adeziunea celulă-matrice extracelulară. Fibronectinele au un rol important în menţinerea formei celulelor, în organizarea citoscheletului, iar pe parcursul embriogenezei sunt implicate în migrarea şi diferenţierea celulară. În organismele animale, fibronectinele sunt întâlnite în: ƒ sânge şi alte fluide, sub formă de dimeri solubili, favorizând fagocitoza, migrarea celulelor imune (în special macrofage), ataşarea trombocitelor de regiunile alterate ale vaselor sangvine; ƒ ataşate tranzitoriu pe suprafaţa celulară, ca oligomeri de fibronectină; ƒ în matricea extracelulară, unde formează fibre insolubile. a) Structura fibronectinelor Se cunosc mai multe tipuri de fibronectine. Codificate de către o unică genă (70 kb), fibronectinele sunt rezultatul splicing-ului alternativ al moleculei de ARN-m. Funcţie de tipul celular, pot fi generate una până la 20 molecule diferite de ARN-m pentru fibronectină ce dau naştere unui număr echivalent de lanţuri polipeptidice. Din punct de vedere structural, fibronectina este un dimer alcătuit din două subunităţi identice. Regiunile carboxiterminale ale celor două lanţuri polipeptidice (2500 aminoacizi fiecare) ce formează dimerul sunt legate printr-o pereche de punţi disulfurice. Fiecare subunitate prezintă şase domenii globulare, unite prin regiuni flexibile ale lanţului polipeptidic. Fiecare domeniu globular asigură legarea specifică a fibronectinei la receptori celulari, colagen, fibrină şi proteoglicani sulfataţi (figura 50). Identificarea, izolarea şi secvenţializarea domeniului prin care fibronectina se leagă la suprafaţa celulară au condus la evidenţierea unei secvenţe tetrapeptidice-Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS). Secvenţa RGD este comună mai multor proteine extracelulare de adeziune. Ea permite recunoaşterea şi legarea proteinelor de către integrine, o familie de receptori de membrană omologi. Dată fiind specificitatea recunoaşterii receptor-ligand, se sugerează implicarea, în acest proces, şi a altor secvenţe din structura proteinelor de adeziune. Fig. 50 – a) Structura fibronectinei. Cele două lanţuri polipeptidice sunt legate prin punţi disulfurice. Fiecare lanţ prezintă domenii globulare ce leagă specific molecule din matricea extracelulară sau receptori de membrană; b) domeniile de legare specifică au fost puse în evidenţă prin digestie cu proteaze. Se cunosc şase domenii: • două pentru heparan sulfat; • două pentru fibrină; • unul pentru colagen; • unul pentru receptorul fibronectinei.

89

b) Receptorul pentru fibronectină-reprezentant al familiei integrinelor Receptorul pentru fibronectină este un heteromer alcătuit din două lanţuri polipeptidice .α şi β, asociate prin legături necovalente. Lanţul α (140.000 Da) este scindat în două segmente; unul transmembranar şi altul extracelular. Segmentele sunt legate între ele printr-o punte disulfurică . Lanţul β conţine secvenţe repetitive bogate în cisteină. Ambele lanţuri polipeptidice ale receptorului sunt glicozilate (figura 51). Fig. 51 – Structura receptorului pentru fibronectină Rolul moleculei receptor este de a media contactul dintre fibronectină (recunoaşte secvenţa RGDS) şi elementele din structura citoscheletului (filamentele de actină). Receptorul pentru fibronectină este un membru al familiei integrinelor. Din această familie mai fac parte receptorul pentru laminină, o parte din receptorii pentru colagen, etc. Toate aceste molecule au o structură similară, fiind implicate în legarea componentelor matriceale de elementele citoscheletului. Nu toţi receptorii pentru constituenţii matricei extracelulare aparţin familiei integrinelor. Mai mult, în anumite celule, receptorul pentru colagen este reprezentat de o glicoproteină transmembranară cu o structură diferită de cea a integrinelor. c) Migrarea şi aderarea fibroblastelor în matricea extracelulară – proces ce implică recunoaşterea fibronectină – receptor În organismele animale adulte, migrarea celulară este un fenomen rar întâlnit. O excepţie o constituie procesul de reparare a leziunilor, în care fibroblaştii şi celulele sistemului imun migrează spre zona afectată. Aceste celule traversează cheagurile sangvine al căror element constituent principal este fibrina. Fibronectina, secretată de către fibroblaşti se leagă printr-unul din domeniile sale globulare la fibrină. Pe de altă parte, prezentând secvenţa specifică RGD, fibronectina este recunoscută şi legată de receptorul pentru fibronectină din membrana plasmatică a fibroblastelor. Datorită mobilităţii laterale a receptorului în membrana plasmatică, pe parcursul migrării fibroblastelor, se stabilesc şi se desfac succesiv contactele celulă-matrice. În momentul în care deplasarea încetează, în citoplasmă se organizează fibrele de stres bogate în actină. Aceste fibre se leagă de receptor prin intermediul proteinelor de ataşare intracelulare (vinculina şi talină), imobilizându-l în membrana plasmatică (fig. 52). Fig. 52 – Modelul regiunii de contact fibroblast-substrat. Fibrele de actină se ataşează prin intermediul vinculinei şi a talinei de receptorul pentru fibronectină. Receptorul leagă fibronectina care, la rândul săau, interacţionează cu alte elemente ale matricei extracelulare (colagen, proteoglicani). Contactul dintre fibronectine, din spaţiul extracelular şi mănunchiurile de fibre de actină, din interiorul celulei, mediat de receptorul pentru fibronectină, asigură aderarea celulei la matricea extracelulară.

90

3.3.2. Lamina bazală Lamina bazală, structură specializată a matricei extracelulare, delimitează suprafaţa bazală a celulelor epiteliate şi endoteliale, separând aceste celule de ţesutul conjunctiv subadiacent. Ea înconjoară celule individuale (musculare, adipoase, celule Schwann) sau se află interpusă între două straturi unicelulare în glomerulii renali şi în alveolele pulmonare. La microscopul electronic, lamila bazală apare din trei straturi: ƒ un strat electrono-transparent (lamina lucida sau lamina rara) situat în imediata vecinătate a membranei plastice a celulelor ce se sprijină pe lamila bazală; ƒ un strat electrono-dens (lamina densa); ƒ un strat cu aspect reticular (lamina reticularis) alcătuit din colagen şi care are rolul de a lega lamila bazală de ţesutul conjunctiv. 3.3.2.1. Structura laminei bazale Moleculele componente ale lamilei bazale sunt sintetizate sunt sintetizate de către celulele epiteliate, endoteliale şi mezenchimale. Deşi compoziţia lamilei bazale variază de la un ţesut la altul, colagenul de tip IV, proteoglicanii (heparan sulfat) şi laminina sunt elemente comune tuturor acestor structuri. a) Colagenul de tip IV Moleculele de colagen de tip IV sunt prezentate în exclusivitate în lamila bazală. Ele reprezintă elementul constituient major al lamilei densa ce compune lamila bazală. Similar moleculelor de colagen fibrilar, colagenul de tip IV este alcătuit din trei lanţuri polipeptidice ce formează un truplu helix (40 nm lungime). Secvenţa repetitivă Gly-X-Y, caracteristică tuturor moleculelor de colagen, este întreruptă de aproximativ 20 de ori în molecula de tip IV, ceea ce justifică apariţia unor discontinuităţi în structura truplu-helixului. Existenţa zonelor de discontinuitate conferă întregii molecule o mai mare flexibilitate. Spre deosebire de moleculele de colagen interstiţial, secvenţele propeptidice amino-şi carboxi-terminale ale colagenului IV nu sunt scindate proteolitic după eliberarea sa în mediul extracelular. Secvenţele propeptidice carboxi-terminale formează domenii prin intermediul cărora monomerii interacţionează formând dimeri lineari. Dimerii se asociază lateral prin regiunile cu conformaţie triplu-helix dând naştere unei reţele plane cu ochiuri hexagonale. Regiunile amino terminale ce predomină de o parte şi de alta a planului reţelei se asociază prin legături covalente generând o reţea multistratificată (figura 53). Fig. 53 – Modelul asocierii moleculelor de colagen de tip IV şi formarea reţelei multistratificate. În această reţea, moleculele de colagen sunt stabilizate prin legături covalente încrucişate şi punţi disulfurice. b) Laminina-glicoproteină majoră a lamilei bazale Laminina este localizată pe faţa dinspre membrana plasmatică a lamilei densa mediind legarea lamilei bazale de suprafaţa celulară. Molecula (850.000 Da) este alcătuită din trei lanţuri polipeptidice; un lanţ lung A şi două lanţuri mai scurte B. lanţurile sunt unite prin punţi disulfurice într-o structură 91

cruciformă. Cele trei braţe scurte ale moleculei de laminină prezintă câte o pereche de domenii globulare, iar braţul scurt are un singur domeniu (figura 54). Fig. 54 – Structura lamininei Proteina prezintă trei lanţuri polipeptidice (A, B1 şi B2) şi conţine mai multe domenii funcţionale: - un situs de legare a colagenului IV; - un situs de legare a proteoglicanilor sulfataţi; - două sau mai multe situsuri de legare la receptori de membrană. Ca şi fibrotectina, laminina conţine mai multe domenii funcţionale: câte un domeniu leagă colagenul IV şi heparan sulfatul, iar unul sau mai multe domenii sunt implicate în legarea receptorului prin laminină. Receptorii pentru laminină diferă funcţie de tipul celular, dar cel puţin o parte a acestora aparţin familiei integrinelor. 3.3.2.2. Funcţiile laminei bazale Lamina bazală se caracterizează printr-o pronunţată heterogenitate funcţională determinată de necesităţile fiziologice ale diferitelor ţesuturi. Interpusă între ţesutul epitelial şi ţesutul conjunctiv subadiacent, lamina bazală susţine celulele epiteliale şi totodată funcţionează ca un filtru molecular şi celular între cele două compartimente tisulare. În glomerii renali, rolul laminei bazale constă în reglarea traficului de molecule din sânge în urină. La nivelul joncţiunilor neuromusculare, lamina bazală prezintă o compoziţie chimică particulară ceea ce-i permite exercitarea funcţiei de coordonare a organizării spaţiale a componentelor joncţionale de o parte şi de alta a sinapsei. În regenerarea tisulară, lamina bazală constituie eşafodul pe care celulele migrează îndreptându-se spre zona afectată. Reglarea funcţiilor celulare vitale: adeziunea, creşterea şi diferenţierea celulară sunt independente de legarea receptorilor celulari la elementele componente ale laminei bazale.

92

Capitolul 4 CITOSCHELETUL Citoscheletul este alcătuit din microtubuli, filamente de actină, filamente intermediare, o reţea microtrabeculară şi din proteine asociate. Citoscheletul este o structură dinamică. Capacitatea sa de a-şi modifica structura, funcţie de necesitaţile celulare,are la baza reacţiile de polimerizare şi depolimerizare ale microfilamentelor şi ale microtubuliilor. Proteinele asociate au rol de a regla procesele de polimerizare şi depolimerizare ale filamentelor,de a interconecta elementele de citoschelet în reţea şi de a le lega de organitele celular şi/sau membrana plasmatică. Implicat în inducerea şi menţinerea formei celulei şi a prelungirilor celulare (cili,flageli,microvili,axoni),citoscheletul are în principal o funcţie de susţinere. Acesteia i se adaugă o funcţie motilă. Principalele mişcări celulare asigurate de elementele de citoschelet sunt: ƒ mişcarea cililor şi a flagelilor; ƒ deplasarea celulelor ce prezintă un tip de locomoţie ameboidal; ƒ transportul intracelular de particule materiale, vezicule de transport şi organite celulare; ƒ translocarea cromozomilor în timpul diviziunii celulare; ƒ desfaşurarea citokinezei; ƒ contracţia musculară; Interacţiunea elementelor de citoschelet cu membrana plasmatică, la nivelul structurilor joncţionale, prin intermediul proteinelor de adeziune intracelulară, solidarizează celule în ţesuturi, conferind acestora rezistenţă. Se apreciază că realizarea acestora funcţii constituie rezultatul cooperării citoscheletului cu reţeaua microtrabeculară.

4.1. Microtubulii Au fost evidenţiaţi pentru prima dată, cu ajutorul microscopului electronic, în celulele animale de către d. Slauttersack (1963), care a introdus şi termenul de microtubul.

4.1.1. Microtubulii – semnificaţia biologică Microtubulii sunt substructuri celulare omniprezente în citoplasma celulelor eucariote. În citoplasmă, ei se găsesc fie izolaţi – microtubuli citoplasmatici, fie fasciculaţi, dând naştere unor formaţiuni cu caracter efemer – fibrele fusului de diviziune, sau permanent – centrioli, corpusculi bazali şi axonemele organitelor locomotorii (cili, flageli). Microtubulii îndeplinesc în celulă un rol structural, intervenind ca parte componentă a citoscheletului, în inducerea şi menţinerea geometria spaţială a celulelor, şi un rol dinamic, aceste structuri coordonând motilitatea celulară. Principalele mişcări asociate microtubulilor sunt: ƒ mişcările cililor şi flagelilor ce asigură deplasarea celulelor libere, mobile; ƒ transportul intracelular de particule, vezicule şi organite celulare (nucleu, plastide, mitocondrii) ƒ translocarea anafazică a cromozomilor. Studiul comparativ al microtululilor din diferite compartimente celulare a arătat că tratamentul cu colchicină, temperaturile scăzute şi presiune hidrostatică mare determină degradarea microtubulilor citoplasmatici şi a celor ce alcătuiesc fusul mitotic, dar nu afectează 93

structurile microtubulare stabile (cetrioli, corpusculi bazali, microtubuli din organitele locomotorii). Aceste rezultate demonstrează existenţa unei populaţii heterogene de microtubuli.

4.1.2. Structura microtubulilor În imaginile electronomicroscopice, microtubulii se disting ca structuri cilindroide de lungimi variabile (până la zeci de nm) şi cu un diametru relativ constant de 24 nm. Fiecare microtubul este alcătuit din 13 protofilamente dispuse paralel cu axul longitudinal şi care delimitează un lumen. Protofilamentele sunt rezultatul asocierii cap la coadă a unui număr variabil de heterodimeri, ce poartă numele de tubulină (100.000 Da). Orientarea dimerilor, de tubulină în protofilamente, conferă microtubulilor un caracter polar, ce este conservant în toate structurile microtubulare. Unitatea fundamentală a microtubulilor, tubulina, este alcătuită din două proteine distincte: alfa şi beta tubulina (fiecare 50.000 Da). Cele două componente proteice ce compun heterodimerul sunt dispune heicoidal în peretele microtubulului. (fig. 55). Fig. 55 – Modelul structurii tridimensionale a microtubulilor. (Fiecare din cele 13 protofilamente ce alcătuiesc peretele microtubulului este formată din heterodimeri de tubulină α şi β, aşezaţi cap la coadă. În preparatele pure de microtubuli, în afara heterodimerilor de tubulină, s-a observat prezenţa unor proteine cu mase moleculare diferite. Deoarece, diversele structuri microtubulare conţin diferite tipuri de molecule proteice, iniţial, s-a considerat că acestea sunt proteine de contaminare. Dar raportul cantitativ constant dintre proteine şi subunităţile de tubulină, observat pe parcursul mai multor cicluri de polimerizare şi depolimerizare, a condus la concluzia că proteinele sunt asociate specific tubulinelor, motiv pentru care au fost numite proteine asociate microtubulilor (microtubule associated proteins - MAP). Cele mai bine caracterizate proteine asociate sunt proteinele tau, localizate exclusiv în structurile microtubulare din axonii celulelor nervoase. Codificate de o unică genă, cele cinci proteine tau cunoscute astăzi, sunt rezultatul unui proces de splicing (combinare) alternativ. Alte proteine asociate prezente în celulele nervoase sunt MAP1-MAP2. MAP1 este asociată microtubulilor din axoni şi dendrite, în timp ce MAP2 este întâlnită doar în structurile microtubulare din dendrite. Proteinele asociate au rol de a consolida structurile microtubulare prin interconectarea microtubulilor adiacenţi şi de a stabiliza edificiul arhitectural al citoscheletului prin legarea filamentelor intermediare. Majoritatea proteinelor asociate sunt fosforilate. Ciclurile de fosforilare şi defosforilare ale acestora pot constitui o etapă importantă în reglarea asamblării microtubulilor. Această presupunere este confirmată în cazul proteinei tau ce prezintă activitatea ATP - azică şi care acţionează în sensul accelerării polimerizării microtubulilor.

94

4.1.3. Polaritatea şi dinamica microtubulilor Geneza microtubulilor este un proces de autoasamblare a tubulului. Studiile în vitro au demonstrat formarea microtubulilor într-o soluţie pură de dimeri, la 37ºC, în prezenţa GTP (guanozin trifosfat) şi a ionilor bivalenţi. Sinteza microtubului primer, prima etapă a polimerizării, se desfăşoară lent, dar alungirea primer-ului, prin adăugarea de noi dimeri de tubulină, este un proces mult mai rapid. Expunerea unei soluţii de microtubuli la temperaturi scăzute (0ºC) are un rezultat contrar, determinând depolimerizarea cu eliberarea dimerilor αβ stabili. Creşterea temperaturii la 37ºC este însoţită de reasamblarea microtubulilor. Se demonstrează astfel caracterul dinamic al microtubulilor, structuri ce-şi modifică lungimea ca rezultatul a reacţiilor de polimerizare şi depolimerizare. Deşi adăugarea sau pierderea subunităţilor de tubulină poate avea loc în oricare din capetele microtubului, observaţiile electrono-microscopice subliniază funcţionalitatea diferită a extremităţilor acestor structuri. Viteza reacţiilor de polimerizare şi depolimerizare este de două ori mai mare la unul din capete, simbolizat cu plus (+). Capătul opus a fost notat cu minus (-). In vitro, la o anumită concentraţie a dimerilor liberi de tubulină se atinge o stare de echilibru (steady state), numărul dimerilor adăugaţi fiind egal cu cel al subunităţilor disociate de microtubuli. Această concentraţie a fost numită concentraţie critică (Cc). Când concentraţia dimerilor liberi depăşeşte valoarea critică predomină procesul de polimerizare, în timp ce, scăderea concentraţiei de tubulină, sub concentraţia critică, are ca rezultat depolimerizarea microtubulilor. În consecinţă, concentraţia dimerilor liberi reprezintă principalul factor implicat în reglarea polimerizării şi depolimerizării microtubulilor. Studiul dinamicii microtubulilor, în culturi de celule, a evidenţiat aspecte surprinzătoare şi aparent contrare rezultatelor, experimentelor in vitro. Se constată astfel, că, în timp ce unii microtubuli sunt subiectul unor repetate şi rapide procese de polimerizare şi depolimerizare, în aceeaşi celulă (la aceeaşi concentraţie a dimerilor liberi) alţi microtubuli se alungesc continuu sau rămân la o lungime constantă pe parcursul perioadei de observaţie. Manifestarea simultană a fenomenelor de creştere şi descreştere în lungime a microtubulior este explicată prin modelul dinamic (dynamic instability model). Acest model sugerează că o anumită structură a extremităţilor microtubulilor de determină adăugarea sau disocierea subunităţilor proteice. Fiecare dimer de tubulină conţine două molecule de GTP. Pe parcursul polimerizării sau în etapa imediat următoare încorporării dimerului (preferenţial la capătul +), GTP este hidrolizat la GDP (guanozin difosfat). Stabilitatea microtubulului apare reglată de doi factori concentraţia de tubulină liberă şi viteza reacţiei de hidroliză a GTP. Dacă, concentraţia dimerilor liberi este superioară valorii critice, polimerizarea microtubulilor este favorizată, iar viteza acestei reacţii este mai mare decât cea a hidrolizei GTP. În consecinţă, la extremitatea + se formează un cap GTP. Microtubulii care au o strucrură cap GTP, sunt stabili şi pot servi ca primer-i în procesul de polimerizare; se pot alungi. La o concentraţie scăzută a tubulinei libere (C < C C ), viteza de disociere a dimerilor depăşeşte viteza de polimerizare, ceea ce conduce la formare GDP. Prezenţa structurii GDP este asociată cu instabilitatea microtubulilor, determinând o accelerare a depolimerizării. În ceea ce priveşte influenţa celui de-al doilea factor, asupra stabilităţii microtubulilor, se constată că, cu cât viteza de hidroliză a GTP este mai mică, cu atât este mai favorizată formarea unui cap GTP şi deci, alungirea microtubulului. Viteza mare a hidrolizei GTP are un efect contrar. Modelul susţine că variaţiile locale ale celor doi factori pot determina evoluţia diferită a microtubulilor dintr-o celulă; în timp ce unii microtubuli se alungesc, alţii suferă un proces de depolimerizare.

95

4.1.4. Bazele diversităţii structurilor microtubulilor Deşi toţi microtubulii prezintă o organizare fundamentală comună, structurile rezultate prin asocierea acestora sunt foarte diferite, chiar şi în cadrul aceleiaşi celule. Iniţial, diversitatea structurilor microtubulare a fost pusă pe seama existenţei, la organismele eucariote, a subtipurilor de alfa şi beta tubulină. Aceste proteine sunt codificate de aceleaşi gene sau de gene diferite, caz în care poartă numele de izotipuri. Secvenţele de aminoacizi ale izotipurilor de alfa şi beta tubulină sunt aproape identice la păsări şi rozătoare. Diferenţele dintre subtipuri sunt, în mare parte, rezultatul modificărilor posttranslaţionale. Astfel, tubulinele alfa sunt antrenate într-o reacţie de acetilare a unui rest de lizină şi suferă adiţia sau deleţia unei tirozine carboxi-terminale. La tubulinele beta se remarcă modificări ale segmentelor carboxi –terminale. Este posibil că aceste modificări structurale să condiţioneze încorporarea subunităţilor în diferite structuri microtubulare şi legarea lor la proteinele asociate. Recent, s-a demonstrat că heterogenitatea subunităţilor de tubulină nu poate explica diversitatea structurilor microtubulare, deoarece modificările posttranslaţionale nu afectează semnificativ funcţionalitatea microtuburilor. Cercetări efectuate pe structurile microtubulare din neuron au condus la concluzia că fiecare microtubul conţine subunităţi alfa şi beta echivalente funcţional, particularităţile acestor structuri fiind dictate de tipul proteinelor asociate ce copolimerizează cu tubulinele sau se leagă de microtubuli ulterior polimerizării.

4.1.5. Centrii organizatorici ai microtubulilor Distribuţia nealeatorie a microtubulilor în celulă a condus la ipoteza existenţei unor factori ce controlează nucleaţia, diferenţierea şi dispunerea acestor formaţiuni celulare. Aceşti factori a căror existenţă a fost demonstrată prin cercetări experimentale poartă numele de centrii organizatori ai microtubulilor (MTOC) sau centrii de nucleaţie. Astăzi, dispunem de numeroase argumente ce atestă faptul că cel puţin centriolii şi corpusculii bazali acţionează ca centrii organizatorici ai micritubulilor. Microtubuli au o orientare strictă în raport cu centrele de nucleaţie (fig. 56). Fig. 56 – Orientarea microtubulilor în raport cu centrele de nucleaţie: A – Celulă ciliată aflată în interfază.Microtubulii citopasmatici au capătul (-) ancorat în regiunea pericentriolară.Microtubulii ce intră în structura axonemei au capătul poziţionat proximal faţă de corpusculul bazal; B – Celulă nervoasă.Microtubulii din axon sunt orientaţi cu capătul spre corpusculul bazal.Microtubulii din dendrite nu au o orientare fixă; C – Celulă aflată în mitoză.Microtubulii fasciculaţi dau naştere fibrelor fusului de diviziune ce se diferenţiază între cei doi centrii celulari prezenţi la polii opuşi ai celulei.

96

Capetele (-) sunt inserate în centrul organizator şi stabilizate de proteinele asociate, în timp ce, capetele (+) distale sunt libere. Sechestrarea şi stabilizarea capetelor explică de ce în vivo adăugarea şi disocierea dimerilor are loc doar la capetele (+) libere. De la această orientate fac excepţie microtubulii din dendritele şi axonii neuronilor. Datorită absenţei centrului organizator în dendrite, microtubulii nu păstrează aceeaşi polaritate; ei sunt dispuşi fie cu capătul (+), fie cu capătul (-) spre corpul celular. La baza axonului se remarcă prezenţa unui centru organizator, dar nu toţi microtubulii radiază din aceasta. Microtubulii ce au ca punct de plecare centrul de nucleaţie prezintă o orientare obişnuită (capătul (+) liber). Este posibil ca aceştia să dicteze şi poziţionarea microtubulilor liberi de vreme ce, în axon toţi microtubulii au aceeaşi polaritate; capătul (-) este orientat spre corpul celular. 4.1.5.1. Centriolii şi corpusculii bazali În coordonare asamblării microtubulilor şi a motilităţi celulare un rol-cheie îl joacă structurile microtubulare specializate. Microtubulii din celulele aflate în interfaza şi cei care alcătuiesc fibrele fusului mitotic îşi au originea într-o regiune perinucleară, numită centrul celular. Structura centrului celular este complexă, ea constând dintr-o pereche de centrioli situaţi central, înconjuraţi de o zonă citoplasmatică amorfă, numită centrozom sau regiune pericentriolară, delimitată, la rândul său, de o zonă mai puţin densă şi relativ omogenă, centrosfera. Cercetările experimentale au demonstrat faptul că centriolii izolaţi sau însoţiţi de materialul pericentriolar sun capabili să iniţieze polimerizarea tubulinei in vitro şi să coordoneze nucleaţia microtubulilor in vivo. În imaginile electronomicroscopice se observă însă că microtubulii nu au ca punct de plecare centriolii, ei radiind din regiunea pericentriolară. Un argument în plus, în favoarea rolului de centru organizator al centrozomului, îl constituie păstrarea capacităţii de organizare a microtubulilor în celulele eucariote, din care lipsesc centriolii. Se presupune că în celulele în care atât centriolii, cât şi centrozomul sunt prezenţi ambele structuri coordonează formarea microtubulilor din celulele aflate în interfază şi acelor din fibrele fusului mitotic. În formarea microtubulilor ce alcătuiesc axonemele cililor şi flagelilor sunt implicate alte structuri microtubulare, localizate la baza organitelor locomotorii şi care poartă numele de corpusculi bazali. Pe lângă rolul de centri organizatori ai microtubulilor, centriolii stau la baza fenomenelor de motilitate manifestate în timpul diviziuni celulare, iar corpusculii bazali, coordonează mişcările cililor şi flagelilor. 4.1.5.2. Ultrastructura centriolilor şi a corpusculilor bazali Studiile de microscopie electronică au condus la elucidare ultrastructurii centriolilor şi corpusculilor bazali. Ambele structuri microtubulare au forma unui cilindru ( 0,2 µm diametru şi 0,4 µm lungime ). Pereţi cilindrului sunt constituiţi din 9 fibrile dispuse circular, echidistant şi înclinate la un unghi de 30-40˚. Fibrilele sunt imobilizate într-o matrice amorfă ce înconjoară cilindrul. Fiecare fibrilă este formată din 3 subfibrile reprezentate de trei microtubuli. Subfibrilele din fiecare triplet sunt notate cu A,B şi C dinspre lumenul cilindrului spre exterior. Subfibrila A este un microtubul complex, format din 13 protofilamente, în timp ce subfibrilele B şi C sunt incomplete (10-11 protofilamente). La capătul proximal al centriolilor şi corpusculilor bazali se constantă prezenţa unui miez cilindric central, interconectat cu fibrilele periferice. Această structură, asemănătoare unei roţi cu spiţe, este absentă în regiune distală a celor două structuri microtubulare. (fig. 57).

97

Fig. 57 – Structura corpusculilor bazali şi a centriolilor.Cele 9 fibrile periferice formează peretele unui element de formă cilindrică. Fiecare fibrilă este un triplet de microtubuli (A,B,C). Fibrilele sunt legate între ele prin proteine conectoare. 4.1.5.3. Replicarea centriolilor şi a corpusculilor bazali Replicarea centriolilor are loc la un anumit moment al ciclului celular. În interfază, la începutul perioadei G1, cei doi centrioli, prezenţi în centrul celular, sunt situaţi unul lângă altul cu axele lungi în unghi drept. La sfârşitul perioadei G1, centriolii se separă, pentru ca în perioada sintetică ( S ) din fiecare centriol prexistent să se diferenţieze câte un centriolfiu, numit procentriol. Fiecare procentriol este orientat perpendicular pe centriolul din care a provenit. Iniţial, mai mici decât centrioli parentali, procentriolii se alungesc continuu, atingând dezvoltarea maximă în metafază. La începutul profazei, centrul celular se divide, iar cele două perechi de centrioli, fiecare constituie dintr-un centriol matur şi altul în creştere, se separă. Perechile de centrioli migrează spre polii celulei unde în metafază alcătuiesc polii fusului de diviziune. În momentul separări celulelor-fiice rezultate în urma diviziunii celulare fiecare, va conţine câte un cuplu de centrioli maturi, orientaţi perpendicular unul pe celălalt şi înconjuraţi de materialul pericetriol. (fig. 58).

Fig. 58 – Schema replicării centriolilor. Un fenomen replicativ similar este întâlnit şi la corpusculii bazali. Corpusculul nou format se diferenţiază din cel preexistent şi se orientează perpendicular pe aceasta. În momentul în care ajunge la maturitate, el se separă de corpusculul parental, generând apariţia unui nou flagel sau a unui nou cil. Replicarea centriolilor şi a corpusculilor bazali nu este pe deplin elucidată. Cercetări recente au demonstrat existenţa la nivelul corpusculilor bazali a unei molecule mici (6-9 milioane pb ) de ADN linear. Acest ADN conţine informaţia necesară codificării majorităţii proteinelor existente în corpusculi. Se presupune că translaţia are loc în ribozomii citoplasmatici, proteinele sintetizate fiind apoi transportate şi integrate în corpusculii bazali. Prezenţa ADN la nivelul corpusculilor bazali explică capacitatea lor de autoreplicare.

98

Există date experimentale ce confirmă presupunerea prezenţei în centrioli a unui ADN propriu. Se sugerează că ADN centriolar se găseşte în nucleu într-o formă inactivă, iar în urma translocării sale în centriol, molecula este activă. Interconvertibilitatea demonstrată a centriolilor şi corpusculilori bazali, asemănările structurale şi funcţionale dintre aceştia şi nu în ultimul rând prezenţa ADN au condus la concluzia că centrii organizatorici ai microtubulilor sunt componente ale unui sistem citoplasmatic. Capacitatea celulei de a coordona modificările morfologice şi funcţionale ce însoţesc procesele de creştere şi diferenţiere celulară se pot explica prin activarea şi dezactivarea centrelor de nucleaţie, ca rezultat al cooperării dintre unitatea genetică nucleară şi cea proprie sistemului citoplasmatic.

4.1.6. Mişcările cililor şi flagelilor Cilii şi flagelii sunt prelungiri celulare cu caracter permanent, prezente în multe celule eucariote animale şi vegetale. Deşi între cili şi flageli există unele deosebiri, ei sunt consideraţi variante ale acelaşi organit. La mamifere,inclusiv la om, celulele ciliate se găsesc în mucoasa tractului respirator,având rolul de a îndepărta particulele materiale ce pătrund în momentul inspirului în cavităţile nazale, faringe şi trahee. Ele sunt prezente şi în mucoasa oviductului, cilii asigurând deplasare ovulului. Spermatozoidul este singura celulă flagelată din organismele mamifere. Flageli execută mişcări ondulatorii, cu amplitudine constantă, în acelaşi plan. În majoritatea cazurilor, mişcările se propagă de la baza organitului către capătul său opus. Uneori mişcarea sub forma unei unde plane este înlocuită de o altă helicoidală. Cilii execută mişcări ciclice, în doi timpi: o bătaie activă şi o alta de întorcere. Fiecare ciclu durează 0,1-0,2 secunde. Bătaia constă în înclinarea sub un unghi larg a cilului aflat în extensie. Aproape concomitent are loc curbarea cilului în regiunea bazală, moment ce marchează începutul mişcării de întoarcere. Curbarea se propagă de-a lungul cilului determinând revenirea organitului la poziţia iniţială (fig. 59).

Fig. 59 – Schema mişcărilor cililor. Mişcarea cililor, ce formează o suprafaţă ciliată este defazată, diferenţa de fază între mişcările a doi cili consecutivi fiind constantă. Atât mişcarea cililor, cât şi a flagelilor sunt procese energo-dependente, energia necesară fiind furnizată prin hidroliza ATP.

99

4.1.6.1. Structura cililor şi a flagelilor Cilii şi flagelii celulelor eucariote au un plan de organizare comun, la baza structurii lor aflându-se microtubulii. Ambele organite sunt alcătuite din trei părţi: cilul sau flagelul propriu-zis, corpusculul bazal şi rădăcinile. Cilul sau flagelul propriu-zis constă dintr-o structură microtubulară complexă, numită axonemă, înconjurată de hialoplasmă şi protejată la exterior de o membrană celulară simplă, generată prin expansiunea plasmalemei. Axonema este alcătuită din 9 fibre periferice şi 2 centrale. Fibrele periferice sunt dublete subfibrilare ce se extind din corpusculul bazal în flagel (cil). Cele 2 subfibrile sunt notate cu A şi B. Subfibrila A este un microtubul complet (13protofilamente), în timp ce subfibrila B este incompletă (10-11 protofilamente). Rolul-cheie în interconectarea microtubulilor revine unei proteine numită tectină. În regiunea centrală a lumenului axonemei sunt localizate cele 2 fibre centrale, notate cu C1 şi C2 . Fiecare este alcătuită dintr-un unic microtubul 1 (singlet). Cele 2 fibre centrale sunt interconectate prin punţi transversale şi înconjurate de o structură fibrilară numită teaca internă. De subfibrila A, în partea opusă subfibrilei b, sunt ancorate 2 braţe orientate în direcţia acelor ceasornicului şi alcătuite dintr-o proteină ce poartă numele de dineină. Braţele externe ale dineinei apar de-a lungul microtubulilor la intervale regulate de 24 nm, iar distanţa dintre braţele interne succesive este de 32 nm. Tot din subfibrile A pleacă spre centrul axonemei braţe radiale ce se termină în aproprierea tecii interne, prin regiuni regulare şi care creează imaginea unei roţi cu spiţe. (fig. 60).

Fig. 60 – A. Structura axonemei. Peretele axonemei este alcătuit din 9 fibre periferice, fiecare formată din două subfibrile (A şi B ). Braţele dineinei şi elementele radiale sunt ataşate pe subfibrila A. În lumenul axonemei se găsesc singletele centrale, interconectate prin punţi transversale şi înconjurate de teaca internă; B. Fibra periferică este un dublet de microtubuli. Subfibrila A este un microtubul complet (13 protofilamente), subfibrila B este un microtubul incomplet (10 – 11 protofilamente). 100

Axonema este stabilizată prin interconectarea fibrelor periferice. Subfibrila A, dintr-un dublet, este legată de subfibrile B a dubletului adiacent prin intermediul unei proteine contractile numită nexină. Cilul sau flagelul propriu-zis este ancorat în corpul celular prin rădăcini cu o structură variată. 4.1.6.2. Mecanismul molecular al mişcări cililor şi flagelilor În mişcările cililor şi flagelilor un rol important îl joacă dineina, o proteină alcătuită din mai multe polipeptide, cu mase moleculare variate. La extremitatea fiecărui braţ de dineină există 2-3 regiuni globulare, reprezentate de un polipeptid (400.000 Da) cu activitatea ATP azică. În timpul mişcării cililor şi flagelilor, energia eliberată prin hidroliza ATP este utilizată în scopul desfacerii şi refacerii succesive a legăturilor dintre dineinile ataşate de subfibrila A a unui dublet şi subfibrila B a dubletului adiacent. Această deplasare a punţilor laterale dintre fibrele determină alunecarea dubletelor unul faţă de altul şi în consecinţă înclinarea cilului (flagelului). Elementele radiale şi teaca internă au rolul de a coordona intrarea în acţiune a dineinei, de la baza cilului (flagelului) spre vârful acestuia, convertind glisarea dubletelor într-o mişcare de înclinare a axonemei. Nexina, proteina contractilă ce leagă fibrele periferice adiacente, împiedică disocierea dubletelor în momentul glisării. Spre deosebire de cili, flageli se mişcă în acelaşi plan. Această limitare a mişcări este impusă pe de o parte de existenţa unei legături rigide, cu caracter permanent între dubletele externe, iar pe de altă parte de diferenţele morfologice dintre fibrele centrale.

4.1.7. Implicarea microtubulilor în diviziunea celulară Microtubulii joacă un rol-cheie în trei procese importante ce se desfăşoară în cadrul diviziuni celulare: ƒ formarea fusului de diviziune; ƒ deplasarea cromozomilori în planul ecuatorial şi celulei şi alinierea în ƒ placa metafazică; ƒ translocarea cromozomilori anafazici. 4.1.7.1. Formarea fusului de diviziune În celulele aflate în interfază, microtubulii citoplasmatici radiază din centrozomul centrului celular, având o orientare unipolară. Intrarea celulei în diviziune este anticipată de autoreplicarea centriolilor, scindarea materialului pericentriolar şi formare celui de-al doilea centru celular. Cei doi centrozomi coordonează nucleaţia microtubulilor care prin asociere generează fibre. Fibrele, cu capătul (-) inserat în centrozom şi capătul (+) distal, liber, sunt dispuse de jur-împrejurul fiecărui centrozom şi poartă numele de fibre asteriene (“stelare”). Totalitatea fibrelor asteriene ce radiază dintr-un singur centrozom alcătuieşte asterul. Fibrele din cei doi asteri ce se găsesc în contact se alungesc prin polimerizarea tubulinei, determinând depărtarea centrilor celulari şi deplasarea lor spre polii celulei, unde vor constitui polii fusului de diviziune. (fig. 61).

101

Fig. 61 – Formarea fusului de diviziune: a) – fibrele asteriene radiază din regiunea pericentriolară; b) – replicarea centriolilor are drept consecinţă apariţia celui de-al doilea centru celular; Alungirea fibrelor asteriene şi deplasarea celor doi centrii celulari spre polii opuşi ai celulei; c) – diferenţierea fibrelor polare ale fusului de diviziune între cei doi centrii celulari; d) – ancorarea cromozomilor la polii fusului de diviziune prin fibrele kinetocorice. Fibrele ce pleacă din centrozom spre planul ecuator al celulei poartă numele de fibre polare. Acestea se alungesc prin adăugarea dimerilor de tubulină la capetele (+) libere. În momentul dezorganizării membranei nucleare, fibrele polare pătrund în spaţiul nuclear şi ancorează prin capetele (+) kinetocorii cromozomilor. Fibrele ce leagă kinetocorii de polii fusului de diviziune se numesc fibre kinetocorice. Kinetocorii sunt complexe multiproteice cu structura trilamelară, ce se dezvoltă pe cele două feţe opuse ale centromerului (constricţie primare) la nivelul căruia sunt unite cele două cromatide ale cromozomului metafazic. Formarea acestei structuri specializate în interconectarea cromozomilor cu polii fusului de diviziune este controlată de secvenţe de ADN, numite ADN centromeric. Secvenţele au capacitatea de a lega proteine specifice ce iniţiază formarea complexului multiproteic. Totalitatea fibrelor asteriene, polare şi kinetocorice ce radiază din cei doi centrozomi, alcătuieşte fusul mitotic sau fusul de diviziune. Fusul de diviziune este format din două semifusuri, fiecare conţinând fibrele ce pleacă de la un singur centrozom. Caracterul polar al fusului de diviziune poate explica prin existenţa unui proces de stabilizare selectivă a fibrelor polare. În acest proces sunt implicate proteine asociate microtubulilor ce interconectează în plan ecuatorial fibrele polare învecinate antiparalele, împiedicând depolimerizarea acestora.

102

4.1.7.2. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorială a celulei şi alinierea lor în placa metafazică În prometafază, cromozomii se mişcă dezordonat, oscilând între cei doi poli ai fusului de diviziune. În timpul acestor mişcări, un set de fibre polare capturează unul din cei doi kinotocori ai cromozomului, după care şi celălalt kinetocor este ancorat de fibrele polare ce pleacă din centrozomul opus. Fiecare cromozom va avea astfel o orientare strictă în raport cu fusul diviziuni, prezentând kinetocorii spre cei doi poli ai celulei. Deplasarea cromozomilor spre planul ecuatorial al celulei este determinată în parte de polimerizare fibrelor kinetocorice. Aceste fibre au capătul (-) inserat în controzom şi capătul (+) legat de kinetocor şi stabilizat prin proteine. Injectând tubulină marcată, într-o celulă aflată în metafază, s-a constatat că dimeri sunt incorporaţi la capătul (+) al fibrelor kinetocorice. În timp ce detaşarea prin micromanipulare a fibrelor kinetocorice de cromozomi declanşează un proces rapid de depolimerizare a acestor fibre. Aceasta sugerează că kinetocorul protejează capetele (+) ale fibrelor kinetocorice, împiedicându-le depolimerizarea. Având ambele capete protejate, prin kinetocor şi centrozom, fibrele kinetocorice au o stabilitate mult superioară celorlalte fibre ce alcătuiesc fusul de diviziune. Polimerizarea fibrelor kinetocorice nu reprezintă singurul proces ce explică deplasarea cromozomilor şi alinierea lor în placa ecuatorială. Ruperea experimentală a fibrelor kinetocorice ce leagă cromozomul de unul din polii fusului de diviziune este precedată de rapidă deplasare a cromozomului spre polul de care a rămas ataşat. Aceasta demonstrează caracterul elastic al fibrelor kinetocorice. Deplasării cromozomilor, ancoraţi în fibrele de diviziune, spre unul din cei doi poli, i se opune o forţă ce atrage cromozomii spre polul opus. Forţa este direct proporţională cu lungimea fibrelor kinetocorice. S-a observat că, în urma exciziei kinetocorului, prin microchirurgie cu raze laser de pe un braţ cromozomial, aceasta se depărtează spre polul fusului de diviziune cel mai apropiat. Mişcarea braţului, lipsit de kinetocor, nu se datorează ancorării sale la fibrele fusului de diviziune. O explicaţie a acestui fenomen ar putea-o constitui rapida polimerizare a fibrelor fusului de diviziuni ce generează un curent care respinge structurile neataşate spre regiunea ecuatorială a celulei. Cele două forţe de respingere şi atracţie, spre polii celulei, acţionează asupra cromozomilor şi după alinierea lor în placa metafazică, ceea ce justifică permanenta reajustare a poziţiei lor prin mişcarea oscilatorii de mică amplitudine. 4.1.7.3. Translocarea cromozomilor anafazici Desăvârşirea replicării centromerilor şi separarea cromatidelor surori ale cromozomilor metafazici marchează sfârşitul metafazei şi iniţiază o altă etapă a mitozei, anafaza. În anafază au loc două evenimente distincte cu o desfăşurare simultană în timp. Primul eveniment constă în deplasarea cromatidelor surori spre polii opuşi ai fusului de diviziune şi constituie anafaza A. Pe parcursul anafazei A, fibrele kinetocorice se scurtează prin disocierea de tubulină de la capetele (+) (fig. 62). Fig. 62 – Deplasarea cromozomilor spre polii opuşi ai celulei în anafază. Mecanismul prin care cromatidele ascensionează spre polii fusului de diviziune nu este încă elucidat. Până în prezent au fost elaborate trei modele teoretice alternative ale acestui mecanism.

103

În primul model, rolul-cheie îl joacă anumite proteine kinetocorice cu activitate ATPazică similare dineinei şi kinezinei. Proteinele leaga capetele (+) ale fibrelor kinetocorice şi le stabilizează. Energia eliberată prin hidroliză ATP asigură deplasarea de-a lungul fibrelor a proteinelor kinetocorice cu funcţie ATP-azică, care antrenează în această mişcare întreaga cromatidă. Prin deplasarea proteinelor sun expuse capetelor (+) ale fibrelor kinetocorice care suferă depolimerizarea. Elementul central al celulei de-al doilea model îl constituie depolimerizarea fibrelor kinetocorice. Disocierea dimerilor de tubulină este însoţită de ruperea şi refacerea ciclică a legăturilor dintre proteinele kinetocorice (ce nu prezintă activitatea ATP – azică) şi microtubulii ce alcătuiesc fibrele kinetocorice. Aceste proteine manifestă probabil o afinitate crescută pentru tubulina polimerizată. În cel de-al treilea model, fibrele kinetocorice au numai rolul de a direcţiona deplasarea cromatidelor. Forţa ce determină această mişcare este generată de alte structuri, cum ar fi un sistem de filamente elastice ce interconecteză kinetocorii şi polii fusului de diviziune. Al doilea eveniment îl constituie anafaza B şi este reprezentat de alungirea fusului mitotic şi depărtarea centrilori celulari. Forţa ce determină acest proces este generată de interacţiunea fibrelor polare antiparalele (din cele două semifusuri) ce se întrepătrund în regiunea ecuatorială a fusului de diviziune. Rezultatele cercetărilor efectuate au condus la elaborarea unui model al mecanismului elongarii fusului de diviziune. Modelul se bazează pe două elemente: polimerizarea fibrelor polare şi presupunerea axistenţei unor proteine cu activitate ATP-azică, similare dineinei sau kinezinei. Prin adăugarea dimerilor de tubulină la capetele (+) libere ale fibrelor polare antiparalele acestea se alungesc şi se suprapun în regiunea ecuatorială a fusului de diviziune. Se presupune că proteinele cu activitate ATP - azică sunt ataşate de fibrele polare ale unui semifus. Energia eliberată prin hidroliza ATP permite deplasarea proteinelor de-a lungul fibrelor polare ce alcătuiesc al doilea semifus. Fibrele antiparalele sunt împinse spre centrii celulari determinând,în final, depărtarea lor. Nu este exclusă posibilitatea ca prin interacţiile cu cortica celulară microtubulii din fibrele asteriene să participe la deplasarea în direcţii opuse a polilor fusului, diviziune în timpul anafazei B.

4.1.8.Transportul intracelular mediat de microtubuli Organitele, veziculele şi particulele proteice nu se deplasează haotic în spaţiul intracelular. Ele sunt transportate în anumite situsuri, pe direcţi şi cu viteze caracteristice. În stricta orientare a transportului intracelular un rol-cheie îl joacă microtubulii. Iniţial, studiul implicării acestor elemente de citoschelet în transportul intracelular a folosit, ca sistem experimental, celulele nervoase. Această alegere se baza pe faptul că ribozomii sunt absenţi din axoni neuronilor, prezenţa proteinelor şi a organitelor celulare fiind rezultatul unui proces de transport de la situsurile de sinteză, din corpul celular, spre regiunea sinaptică. Procesul poartă numele de transport axonal anterograd. În paralele, în axon are loc şi un transport retrograd în care sunt antrnate vezicule ce conţin fragmente de membrană şi proteine citosolice. Acestea se deplasează dinspre terminaţiile sinaptice spre corpul celular, unde vor fi degradate de către enzimele lizozomale. Transportul axonal anterograd a fost pus în evidenţă prin injectarea aminoacizilor marcaţi radioactiv şi urmărirea, prin metode autoradiografice, a proteinelor libere sau incorporate în organitele celulare ce îi conţineau. Experimentul a demonstrat că deplasarea proteinelor, veziculelor şi a organitelor nu are loc cu aceeaşi viteză. Cu cea mai mare viteză (3mm/sec) sunt deplasate particulele şi veziculele mici, în timp ce proteinele ce intră în alcătuirea citoscheletului se deplasează foarte incet (fracţiuni de mm/zi).

104

O valoare intermediară o are viteza de transport a mitocondriilor. Tehnica microscopiei computerizate în contras de fază a permis vizualizarea asocierii organitelor cu structuri celulare filamentoase şi deplasarea lor de-a lungul axonului. În unele cazuri, se pot observa două organite deplasându-se de-a lungul aceluiaşi filament, în direcţi opuse, fără a intra în coliziune. Aceasta indică faptul că fiecare filament transportor conţine mai multe “benzi de transport “ pentru organitele celulare. Încercările de a caracteriza aceste filamente au condus la concluzia că ele reprezintă, de fapt, microtubuli plasmatici. În plus, studiul efectuat pe culturi de fibroblaste a demonstrat implicarea microtubulilor în dispersarea veziculelor rezultate prin fragmentarea aparatului Golgi, pe parcursul mitozei, şi reagregarea lor în interfaza ciclului celular. Pentru a înţelege mecanismul transportului intracelular asociat microtubulilor, s-a realizat un sistem experimental ce conţinea microtubuli obţinuţi prin autopolimerizarea dimerilor necontaminaţi cu proteine asociate sau citosolice şi vezicule sinaptice izolate din diferite tipuri celulare. S-a observat că atât legarea, cât şi deplasarea veziculelor necesită prezenţa în sistem a ATP şi a unor proteine specifice cu funcţia ATP-azcă. Una dintre aceste proteine este kinezina (380.000 Da). Molecula alcătuită din patru lanţuri polipeptidice este capabilă să lege, printr-unul din capete, microtubulul, iar prin celălalt capăt, vezicula transportată. În prezenţa ATP, kinezina de deplasează de-a lungul microtubulului împreună cu vezicula pe care a legat-o. Proteina asigură transportul anterograd al veziculelor, deoarece ea se deplasează întotdeauna de la capătul (-) al microtubulului spre capătul (+) al acestuia. Modul în care kinezina utilizează energia eliberată prin hidroliza ATP pentru a asigura transportul veziculelor de-a lungul microtubulului este încă neelucidat (fig. 63). Fig. 63 a) Transportul anterograd al veziculelor de-a lungul microtubulilor mediat de kinezină; b) Imobilizate pe suprafaţa unei plăci de sticlă, moleculele de kinezină deplasează microtubulul asociat spre capătul său (-). Responsabilă de transportul retrograd al veziculelor este o proteină asociată cu microtubulii plasmatici numită MAPIC (1.000.000 Da) sau dineină citoplasmatică. În mod similar kinezinei, proteina MAPIC este capabilă să lege microtubulul şi vezicula de transport, dar ea se deplasează dinspre capătul (+) spre capătul (-) al microtubulului, folosind energia rezultată din hidroliza ATP.

4. 2. Microfilamentele Microfilamentele de actina sunt componente citoplasmatice prezente în toate celulele eucariote. Atât în celulele musculare, cât şi în alte tipuri celulare ele sunt asociate cu o proteină fibrilară, numită miozină. În citoplasma tuturor celulelor, cu excepţia celor musculare, întâlnim microfilamentele izolate cu o distribuţie relativ difuză şi dinamică. 105

Acestea participă alături de microtubulii citoplasmatici şi filamentele inermediare la organizarea stucturii complexe a citoscheletului. În fibrele de stress, inelele contractile şi microvili, microfilamentele sunt fasciculate (asociate în mănunchiuri), ele îndeplinind atât un rol structural, de susţinere, cât şi un rol dinamic, fiind implicate în mişcările celulare ce au la bază mecanismul actină – miozină. În celulele musculare microfilamentele participă la realizarea contracţiei musculare. Aceste forme diferite de organizare a microfilamentelor, cât şi funcţiile asociate lor sunt determinate de tipul proteinelor ce leagă specific actina.

4.2.1. Microfilamentele de actină Actina reprezintă principala componentă a microfilamentelor. Actinele, izolate din diferite organisme şi tipuri celulare, au mase moleculare, conformaţie şi secvenţă de aminoacizi similare. Acest fapt sugerează că genele codanate au evoluat dintr-o genă ancestrală comună. La păsări şi mamifere există cel puţin 6 gene diferite ce codifică actina. Din cele 6 proteină, 4 prezintă un grad înalt de omologie (din cei 375 de aminoacizi doar 6 sunt diferiţi). Aceste proteine se numesc alfa actine. Fiecare specie moleculară de alfa actină este prezentă exclusiv într-un singur tip de celulă musculară (din muşchii striaţi, miocard, muşchii netezi ce delimitează vasele sangvine sau muşchii enterici ce mărginesc lumenul intestinal). Celelalte 2 specii moleculare de actină notate cu beta şi gama au un grad de omologie mai scăzut şi sunt prezente în citoplasma tuturor tipurilor celulare. Încercările de izolare şi caracterizare a acestor proteine au evidenţiat faptul că numărul tipurilor de actine este mai mare decât cel al genelor care le codifică. Se apreciază că modificările posttranslaţionale (acetilarea aminoacizilor din segmentul amino-terminal, metilarea unui rest de histidină) sunt responsabile de apariţia unui număr atât de mare de specii moleculare.Experimentele in vitro au demonstrat că moleculele de actina purificate din diverse surse sunt capabile să copolimerizeze şi că toate stimulează activitatea ATP - azică a miozinei. Deşi, încă, nedemonstrat experimental, este posibil ca speciile moleculare de actină să manifeste o afinitate diferită faţă de proteinele citoplasmatice cu care se asociază. Acest lucru ar explica funcţiile diferite ale microfilamentelor.Actina este un polipeptid cu o masă moleculară de 42.000 Da. Aspectul globular al proteinei justifică denumirea de actină globulară sau actină G. La o concentraţie ionică similară cele existente în spaţiu intracelular actina G polimerizează, în vitro, generând filamente de actină, numite actină fibrilară sau actină F. Filamentele de actină obţinute în vitro sunt identice cu microfilamentele izolate din celule. În filament moleculele de actină G, având caracter polar, se asociază cap la coadă formând un helix monocateran cu o grosime aproximativ de 7 nm. Pe fiecare tur de helix se găsesc două molecule de actină. Fiecare monomer este orientat perpendicular pe axa helixului stabilind interacţii puternice cu cei doi monomeri situaţi în imediata vecinătate şi interacţii slabe cu moleculele de actină G dispuse la dreapta şi la stânga sa de-a lungul helixului (fig. 64). Fig. 64 – Modelul molecular al actinei fibrilare (actina F). Atât polaritatea subunităţilor componente, cât şi stricta orientare a acestora în structura helicoidală conferă polaritate filamentului de actină. Dinamica microfilamentelor aminteşte de cea a microtubulilor. Adăugarea monomerilor sau disocierea lor pot avea loc la oricare din capetele microfilamentului, dar viteza cu care se desfăşoară reacţiile de polimerizare şi depolimerizare la capătul (+) este de 5-10 ori mai mare decât la capătul (-). 106

Similar dimerilor de tubulină ce stabilesc interacţii puternice cu GTP, monomeri de actină leagă strâns ATP. Hidroliza ATP are loc imediat după încorporarea actinei G în microfilament. Posibilele structuri cap ATP sau ADP nu influenţează polimerizarea monomerilor şi aceasta se datorează, în mare parte, faptului că la concentrarea ionică intracelulară (0,15M,KCI) este favorizată polimerizarea actinei. Pe de altă parte, concentraţia intracelulară a monomerilor liberi este mult mai mare decât concentraţia critică. În consecinţă, microfilamentele sunt structuri mult mai stabile decât micro tubulii. Această stabilitate este accentuată prin ataşarea de microfilamente a proteinelor asociate.

4.2.2. Miozina Miozina este o proteină cu largă răspândire în celulele organismelor eucariote. Până în prezent se cunosc 2 specii moleculare ale acestei proteine. Miozina tip I este absentă în celulele musculare, ea fiind implicată în fenomenele de motilitate celulară, ce au la bază mecanismul actină- miozină. Miozina de tip II se găseşte atât în celulele musculare din muşchii striaţi şi netezi, cât şi în alte tipuri celulare. Datorită rolului pe care miozina de tip II, din celulele musculare, îl joacă în contracţia musculară, ea a constituit subiectul numeroaselor cercetări experimentale. Miozina de tip II (470.000 Da) este alcătuită din 6 lanţuri polipeptidice dintre care 2 lanţuri grele (230.000 Da/lanţ) şi 2 perechi de lanţuri uşoare (20.000 Da/lanţ). Lanţurile grele sunt identice. Fiecare este format dintr-o regiune alfa heicoidală cu o lungime de 30 nm, numită coadă şi o regiune globulară carboxi – terminală, cu diametrul de 4 nm, numită cap. Regiunile alfa helicoidale ale celor 2 lanţuri grele sunt răsucite una în jurul celeilalte, în timp ce regiunile globulare rămân separate. Perechile de lanţuri uşoare sunt ataşate celor două regiuni globulare. Lanţurile uşoare ce alcătuiesc o pereche sunt identice între ele, dar diferite de lanţurile celeilalte perechi. În structura de miozină II se remarcă existenţa a două puncte de flexiune ce marchează domeniile structurale ale prote (fig.65).

Fig. 65 – Modelul molecular al miozinei. Molecula este alcătuită din două lanţuri grele şi două perechi de lanţuri uşoare. Lanţurile grele prezintă câte o regiune amino – terminală globulară, numită cap şi o regiune α – helicoidală, carboxi – terminală, numită coadă. Molecula prezintă două puncte de flexiune. Primul punct de flexiune este situat în regiunea alfa hericoidală, în timp ce al doilea separă capul bilobat de coada moleculei. Miozina poate fi scindată la nivelul punctelor de flexiune sub acţiunea unor enzime cu activitate proteazică. Chimotripsina scindează miozina în două domenii. Primul domeniu, meromiozina grea (HMM) conţine capul bilobat şi un segment din coada lanţurilor grele, iar al doilea domeniu meromiozina uşoară (LMM), cuprinde segmentul aminoterminal al cozilor. Prin tratarea domeniului HMM cu papaină segmentul de coadă este degradat şi sunt eliberate fragmentele S1, ce conţin câte un cap globular şi perechea de lanţuri uşoare asociate acestuia. Fragmentele S1, prezintă activitate ATP – azică. Pe regiunea globulară ce formează capul lanţurilor grele ale miozinei, sunt localizate atât situsurile de legare ale ATP cât şi cele pentru actină. 107

Studiile biochimice au evidenţiat faptul că în prezenţa filamentelor de actină activitatea ATP – azică a miozinei este stimulată; viteza de hidroliză a ATP creşte de 200 de ori. Moleculele de miozină polimerizează generând filamente de miozină. Polimerizarea implică agregarea cozilor moleculelor de miozină. În celulele nemusculare, filamentele de miozină au dimensiuni mici (diametru 60 Å) şi caracter tranzitoriu, ceea ce face dificilă vizualizarea lor la microscopul electronic. Organizarea în filamente a miozinei a fost pusă în evidenţă, pentru prima oară, în celulele musculare unde ele au o structură particulară şi sunt numite filamente groase. Filamentele groase (diametru 150-200 Å) conţin 500-600 molecule de miozină. Orientarea moleculelor în filament imprimă acestuia un caracter bipolar. Fiecare filament este alcătuit dintr-o regiune centrală şi 2 regiuni terminale. Regiunea centrală are un caracter exclusiv fibrilar fiind formată prin suprapunerea cozilor antiparalele ale moleculelor de miozină. În cele 2 regiuni terminale, capetele moleculelor de miozină se ataşează de jur-împrejurul filamentului, determinând îngroşarea acestuia.

4.2.3. Rolul actinei şi miozinei în contracţia musculară Mecanismul actină – miozină stă la baza unui tip particular de mişcare celulară, realizată de structuri specializate din muşchii striaţii, netezi şi cardiaci şi care poartă numele de contracţie musculară. Muşchii striaţi primesc o inervaţie motorie somatică. Datorită inserţiilor osoase ei asigură deplasarea şi păstrarea poziţiei corpului. Musculatura netedă prezintă o inervaţie vegetativă. Muşchii netezi înconjoară organele interne, fiind prezenţi la nivelul intestinului gros şi subţire al vezici biliare şi al vaselor sangvine. Contracţia şi relaxarea muşchilor netezi asigură deplasarea alimentelor de-a lungul tractului digestiv şi controlează diametrul vaselor sangvine. Spre deosebire de muşchii striaţi, cei netezi se contractă mai lent, tensiunea dezvoltată fiind menţinută pe o durată mai mare de timp. Muşchii cardiaci se aseamănă din punct de vedere structural cu cei striaţi, dar se află ca şi muşchii netezi sub controlul inervaţiei vegetative. Prin contracţia lor, sângele este pompat în circuitul sanguin.

4.2.4. Actina şi miozina în celule nemusculare Filamentele de actină din celulele nemusculare au un pronunţat caracter tranzitoriu. Formarea reţelei de microfilamente este reglată de factori proteici şi concentraţia ionilor de Ca. Una dintre cele mai importante proteine ce influenţează procesul de polimerizare a actinei, în aceste celule, este profilina. Proteina se leagă de monomerii de actină formând un complex numit profilin-actină. Deoarece profilina blochează etapa de nucleaţie, complexul este incapabil să polimerizeze spontan. În plus modul de legare a profilinei la monomer face imposibilă legarea complexului la capătul (-) al unui filament de actină preexistent, polimerizarea putând avea loc doar la capatul (+) al acestuia. După legarea profilin-actinei la capatul (+) al filamentului de actină, profilina este eliberată creând posibilitatea adăugării unui alt complex şi alungirii filamentului. În mod obişnuit, capetele (+) ale filamentelor de actină sunt ancorate în membrana plasmatică şi/sau stabilizate prin proteine asociate. În acest caz, profilina blochează complet polimerizarea actinei (fig. 66).

108

Fig. 66- Rolul profilinei în polimerizarea actinei, în celulele nemusculare. Reglarea procesului de polimerizare şi depolimerizare a actinei prin ionii de Ca este mediată de cel putin două proteine similare ca structură şi funcţie: vilina şi gelsolina. La o concentraţie citosolică mare a ionilor de Ca, proteinele rup filamentele lungi de actină, rămânând ataşate la capătul (+) al fiecărui fragment, împiedicând astfel reasamblarea filamentelor. O dată cu scăderea concentraţiei Ca2+, vilina (nu şi gelsolina) este capabilă să accelereze procesul de polimerizare al actinei. Ambele proteine joacă şi un rol structural, interconectând filamentele de actină în mănunchiuri. Filamentele de miozină din celulele nemusculare sunt mult mai mici (10-20 molecule) decât cele din celulele musculare. Molecula de miozină se aseamană cu cea din muşchii netezi. Activarea funcţiei sale ATP-azice necesită fosforilarea lanţurilor uşoare şi este reglată de complexul calmodulină – Ca2+. Din celulele nemusculare au fost izolate şi proteine asociate intalnite în celulele musculare, dintre care : tropomiozina şi alfa-actinina. Prezenţa calmodulinei, ca proteină reglatoare, explică absenţa complexului troponinic din celulele nemusculare. 4.2.4.1. Microvilii Microvilii sunt expansiuni ale celulelor epiteliale ce delimitează lumenul intestinal şi al tubului contort proximal în rinichi. Ei contribuie la mărirea cu 25% a suprafeţei de absorbţie a celulelor epiteliale. Structuri necontractile, microvilii sunt alcătuiţi dintr-o regiune centrală şi o reţea terminală (fig. 67). Regiunea centrală este reprezentată de un manunchi de filamente de actină dispuse paralel. Ele indeplinesc un rol structural, menţinând forma microvilului. Filamentele prezintă aceeaşi polaritate. Capetele (+) sunt indreptate spre vârful microvilului.

109

Fig. 67- Structura microvililor.Elementul central îl reprezintă mănunchiul de filamente de actină.Filamentele sunt interconectate prin proteine de legare şi ancorate în membrana plasmatică ce delimitează microvilul prin proteina 110 Kda şi calmodulina.Filamentele de actină fasciculate se extind din corpul microvilului în reţeaua terminală unde sunt stabilizate prin intermediul unor proteineconectoare (fodrina, spectrina etc.). Din regiunea centrală lipsesc miozina, tropomiozina şi alfa actinina. În schimb, au fost izolate alte proteine asociate filamentelor de actină, dintre care fimbrina şi vilina. Ambele proteine au rolul de a stabiliza filamentele în mănunchiuri. Cea mai interesantă proteină, asociată filamentelor de actină din microvili, este o proteină similară miozinei de tip I, proteina 110, cu activitate ATP-azică. Impreună cu calmodulina, proteina leagă filamentele de actină de la exteriorul manunchiului de membrana ce delimitează microvilul. Se apreciază ca tensiunea generată de proteina similară miozinei de tip I asigură menţinerea în poziţie centrală a mănunchiului de filamente. La polul bazal, regiunea centrală este ancorată într-o reţea terminală, alcătuită din filamente scurte de actină şi proteine asociate. Filamentele din reţeaua terminală interconectează filamentele de actină din manunchi şi leagă mănunchiurile între ele. Acelaşi rol îl joacă şi fodrina, principală proteina asociată, prezentă în reţeaua terminală. 4.2.4.2. Rolul actinei şi miozinei în citokineza Filamentele de actină şi miozina joacă un rol in desfaşurarea citokinezei la celulele animale. Ele alcătuiesc o structura contractila, cu caracter tranzitoriu, numita inel contractil, localizat imediat sub membrana plasmatică la nivelul şantului de clivare. În inelul contractil , flamentele scurte bipolare de miozina şi filamentele de actină sunt organizate în microsarcomere similare celor din muşchii striaţi, dar mult mai mici, din care lipsesc discurile Z. Filamentele de actină şi minisarcomerele adiacente sunt legate prin alfaactinina şi probabil şi alte proteine asociate. Inelul se contractă prin mecanismul actină-miozina. Simultan are loc un proces de depolimerizare a filamentelor de actină, ceea ce determină micşorarea continuă a diametrului inelului contractil şi, in final, separarea toatală a celor 2 celule fiice rezultate prin diviziunea celulară.

110

4.2.4.3. Mişcarea ameboidala Mişcarea ameboidala este un tip particular de locomoţie întalnită frecvent la protozoare, dar comuna şi altor tipuri celulare dintre care şi celulelor ce intra în alcatuirea organismului uman : macrofage, fibroblaste, limfocite. Miscarea ameboidala se realizează prin emiterea şi retracţia continuă a unor prelungiri celulare şi are la baza tranzitia reversibila a hialoplasmei din stare de gel în stare fluidă (sol). Studiile electronomicrodcopice, efectuate iniţial pe protozoare şi ulterior extinse la celulele din organismul uman ce prezintă acest tip de locomoţie, au pus in evidenţa existenţa a 2 regiuni diferite ale citoplasmei. Regiunea centrală, numită endoplasmă, conţine particule şi organite celulare aflate intro permanenta mişcare. În această regiune hialoplasma se găseşte în starea de sol. În regiunea distală a prelungirilor celulare, imediat sub membrana plasmatică, este localizată ectoplasma. Lipsită de organite celulare, ectoplasma conţine o reţea tridimensionala de filamente de actină. Filamentele sunt interconectate prin proteine ascociate. Una dintre acestea este filamina, o molecula flexibilă alcatuită din 2 lanţuri polipeptidice, prezentă în nodurile reţelei. Alte proteine asociate filamentelor de actină din ectoplasma sunt alfa actinina şi gelsolina (fig. 68). Fig. 68 – Filamina leagă filamentele de actină, favorizând formarea unei reţele tridimensionale. Studiul emiterii şi retractiei prelungirilor celulare numite pesudopode, la protozoare a demonstrat interconvertibilitatea celor 2 regiuni ceitoplasmatice. Pe parcursul formarii pseudopodelor, are loc deplasarea endoplasmei din centrul celulei în prelungirile celulare. În regiunea distala a pesudopodului endoplasma se transformă în ectoplasma prin tranziţia sol-gel a hialoplasmei. Procesele inverse au loc în momentul retractarii pseudopodelor. Se apreciază ca treansformarea reversibilă a endoplasmei în ectoplasma este controlată de celula şi reglată prin concentraţia intracelulară a ionilor de Ca şi pH. Aceşti doi factori afectează organizarea filamentelor de actină în cele 2 regiuni citoplasmatice printr-un mecanism încă suficient elucidat, în care un rol important par să-l aibă proteinele asociate. Filamina şi alfa actinina, proteine implicate în formarea şi stabilizarea reţelei filamentelor de actină , asigură probabil tranziţia hialoplasmei în starea de gel. O dată cu creşterea concentraţiei intracelulară a ionilor de Ca, filamentele de actină sunt scindate de gelsolina, reţeaua se dezorganizează şi hialoplasma trece în stare de sol. Dintre celulele din organismul uman ce se deplaseaza prin miscarile ameboidale, cele mai bine studiate sunt fibroblastele. Fibroblastul emite continuu, pe direcţia miscării m prelungirii celulare, numite lamelipode. În timpul deplasării, unele lamelipode aderă la substrat , prin intermediul unor structuri specializate, numite placi de adeziune sau contacte focale. Alte lamelipode se întorc spre partea dorsală a corpului celular.Pe parcursul deplasării, corpul celular lasa în urmă o coadă numită fibră retractilă.Fibra rămâne aderentă la substratul pe care se realizeaza mişcarea fibroblastului , fiind supusă în acelaşi timp tensiunii generate de ondulatiile de suprafata. Acţiunea conjugată a acestor 2 forţe conduce la elongarea fibrei retractile. În final, forţa ce asigură înaintarea fibroblastului determină fie detaşarea fibrei de substrat, fie ruperea ei şi ulterior retracţia cozii în corpul celular (fig. 69).

111

Fig. 69 – Schema deplasării fibroblaştilor. 4.2.4.4.Fibrele de stress În ataşarea de substrat a fibroblastelor cultivate in vitro rolul principal revine fibrelor de stress. Fibrele de stress sunt manunchiuri paralele de filamente de actină, localizate în regiunea citoplasmatica aflată în proximitatea plasmalemei aflată în contact cu substratul. În zonele de contact, filamentele de actină apr a fi inserate în membrana plasmatică. Alaturi de actină în fibrele de stress sunt prezente : miozina, alfa-actinina, tropomiozina şi proteina reglatoare miozin-LC kinaza. Se sugereaza ca filamentele de actină şi miozina sunt organizate în microsarcomere, tenşiunea generata prin mecanismul actină –miozina determinand aplatizarea fibroblastelor în culturi. Cercetarile experimentale au confirmat această ipoteză. Îndepartarea celulelor de pe substrat este însoţită de înlocuirea fibrelor de stress cu o reţea de filamente de actină şi revenirea celulei la forma sferică. Reintroducerea fibroblastelor în cultura este urmată la cateva ore de reorganizarea fibrelor de stress, ataşarea celulelor de suport şi aplatizarea lor.

4.3. Filamente intermediare Filamentele intermediare sunt elemente de citoschelet mai groase decât microfilamentele de actină şi mai subţiri decât microtubulii. Iniţial, ele au fost puse în evidenţa în celulele muschilor striaţi , unde formeaza o matrice ce înconjoară şi interconecteaza discurile Z. Ulterior, au fost identificate şi în alte tipuri celulare (celule epiteliale, mezenchimale şi neuroni). În celule, filamentele intermediare se pot gasi în ectoplasma, ancorate în structuri periferice (desmozomi) sau situate în prelungirile celulare (axoni).

4.3.1. Proteine ce alcătuiesc filamentele intermediare Ca şi microfilamentele de actină şi microtubulii, filamentele intermediare sunt rezultatul polimerizarii subunitaţilor proteice. Spre deosebire de actină G şi tubulina, proteinele ce formeaza filamentele intermediare sunt specifice pentru un anumit tip celular. La vertebratele superioare s-au identificat 5 tipuri de molecule proteice distincte ce intra în constituţia filamentelor intermediare : ƒ vimentina (57 000 Da) ; ƒ desmina (55 000 Da) ; ƒ neurofilamentele (trei specii moleculare : NF1 70 000 Da ; NFm 150 000 Da; NFh 210 000 Da); ƒ proteina gliala fibrilara acida( GFAP 50 000 Da) ; ƒ citocheratinele (peste 30 de specii moleculare). 112

Diversitatea proteinelor ce alcătuiesc filamentele intermediare nu constituie singurul aspect ce le diferenţiază de subunitaţile proteice ale microfilamentelor de actină şi microtubulilor. Cele cinci tipuri de proteine prezintă caracteristici structurale comune, fiind formate dintr-o regiune centrală alfa helicoidala şi 2 domenii globulare, de mărimi variabile, în regiunile carboxi- şi amino- terminale. Deosebirile există şi în maniera în care proteinele se asociază în filamente (fig. 70).

Fig. 70 – Nivele de asamblare ale filamentelor intermediare. Subunitatile proteice formează dimeri prin înfaşurarea stransă una în jurul celeilalte, a regiunilor centrale, în timp ce capetele globulare rămân separate. În dimeri, subunităţile sunt orientate paralel. Aceleaşi regiuni centrale par a fi responsabile de asocierea dimerilor în tetrameri dar la acest nivel de agregare dimerii sunt antiparaleli. Prin legarea cap la cap a tetramerilor se formează protofilamentul, iar 8 protofilamente generează filamentul intermediar. S-a constatat că vimentina, desmina, proteina gliala fibrilara acidă şi NF1 formează homopolimeri. În celulele în care genele ce codifică vimentina şi desmina se coexprima, proteinele copolimerizează. Cele 30 de tipuri de citocheratine sunt împarţite în 2 clase distincte : acide şi bazice /neutre. În filamentele de keratina raportul dintre citocheratine de tip I şi cele de tip II este de 1 :1. Studiul polimerizarii în vitro a monomerilor ce alcatuiesc filamente intermediare a demonstrat că acest proces nu necesită consum de energie metabolică. Modul de ordonare al subunitaţilor proteice în filamente imprimă acestora un caracter apolar. Deci, spre deosebire de microfilamentele de actină şi microtubuli, filamentele intermediare au capete echivalente funcţional; polimerizarea şi depolimerizarea se desfaşoară cu aceeaşi viteza la ambele extremitaţi. Cercetările experimentale au demonstrat că în condiţii fiziologice, 1% din proteine ce formează filamentele intermediare se găsesc sub formă de monomeri liberi, în timp ce 99 % dintre acestea sunt asociate în filamente. Raportul dintre subunităţile libere şi polimerizate exprimă caracterul mult mai stabil al filamentelor intermediare comparativ cu microfilamentele de actină şi microtubulii. 113

4.3.2. Tipuri de filamente intermediare şi semnificatia lor funcţională Filamentele de vimentina sunt prezente în celulele mezenchimale ( celule endoteliale ale vaselor sangvine) şi unele celule epiteliale. În celulele epiteliale filamentele de vimentina sunt ancorate în desmozomi, contribuind la creşterea rigidităţii ţesutului epitelial. În adipocite filamentele înconjoară picăturile lipidice, împiedicandu-le să fuzioneze între ele sau cu membranele celulare. În toate tipurile celulare filamentele de vimentina sunt fizic legate de membrana nucleară, fiind probabil implicate în coordonarea spaţială a nucleului celular. Se constată existenţa unei strânse asocieri între filamentele de vimentina şi microtubuli. Studiile efectuate de fibroblasti cultivaţi in vitro au demonstrat ca în celulele aflate în mitoza, filamentele intermediare înconjoară manunchiurile de microtubuli ce formează fibrele fusului de diviziune. Cele 2 tipuri de filamente sunt interconectate prin proteine, înca neidentificate. Tratarea acestor celule cu colchicina a condus la dezasamblarea microtubulilor urmată de deplasarea filamentelor de vimentina ce se organizează în manunchiuri în apropierea nucleului. Acest experiment sugerează rolul important pe care microtubulii îl au în organizarea filamentelor de vimentina. Filamentele de desmina se întalnesc în toate tipurile de celule musculare. Filamentele din celulele muşchilor striaţi formează o reţea ce strabate întreaga miofibra şi care leagă discurile Z între ele, de membrana plasmatică şi, posibil , de unele organite celulare(mitocondrii). Se apreciază că filamentele de desmina joacă, în principal, un rol structural, susţinand discurile Z şi miofibrele. Neurofilamentele sunt prezente exclusiv în axonii celulelor nervoase. În corpul celular cele trei polipeptide (NF1, NFm şi NFh) se asamblează în filamente şi se asociază cu microtubulii.. Complexele neurofilamentate-microtubuli se deplasează în axon, conferindu-i acestuia stabilitate. Filamentele gliale sunt caracteristice celulei gliale. Filamentele de cheratină sunt întalnite în celulele epiteliale. Ancorate în desmozomi, filamentele de cheratina formează în celula epiteliala o reţea ce asigură rezistenţa epiteliilor la factori mecanici. Se apreciază ca fiecare tip de celula epiteliala conţine un complement chitocheratinic specific.

4.4. Reţeaua microtrabeculară În celulă, microfilamentele, microtubulii şi practic toate celelalte componente subcelulare sunt conectate de un sistem de microteabecule (mici bare). Reţeaua microtrabeculara a fost descrisă la mărimi de circa 300.000x în citoplasma celulelor examinate la microscopul de înalt voltaj (peste 1.000.000. de volţi) care generează electroni rapizi ce pot penetra secţiuni relativ groase. Microtrabeculele (4mm) pot fi expresia fenomenului de gelificare când filamentele de actină se leagă încrucişat unul de altul. În consecinţa unii autori contestă realitatea lor biologică considerandu-le un artefact; alţii, dimpotrivă, le atribuie rol de suport al materiei biostructurale ( Eugen Macovschi, 1958).

4.5. Proteinele asociate citoscheletului O serie de proteine sunt asociate citoscheletului, oferind una din cheile înţelegerii structurii şi funcţiunii acestuia. Sunt bine cunoscute în prezent circa 14 proteine asociate cu actina (acrinogelina, acumentina, ankirina, brevina, caldesmona, filamina, fimbrina, fodrina, fragmina, gelsolina, profilina, vilina, vinculina, calmodulina), 9 proteine asociate cu filamentele intermediare (prekeratine, desmina, filagrina, plactină, proteină fibrilară acidă glială, proteinele neurofilamentelor, şinemina, titina, vimentina) şi 7 proteine asociate cu microtubulii (clatrina, dineina, MAP, MAP1, MAP2, nexina,) prezente predominant în anumite celule şi având proprietăţi diverse. 114

Capitolul 5 ORGANIZAREA NUCLEULUI ŞI EXPRESIA ACTIVITĂŢII GENELOR

Nucleul reprezintă compartimentul care încorporează genomul nuclear, deci el conţine aproape întreaga informaţie genetică. În situaţia aceasta, el îndeplineşte funcţiile de păstrare în condiţii de securitate a ADN-lui, de transmitere nealterată a acestei informaţii descendenţilor, de reglare şi control a activităţii celulei, prin semnale ce sunt recepţionate de molecula de ADN. În esenţă, funcţiile fundamentale ale nucleului se rezumă la două procese bazate pe existenţa în acest compartiment a genomului celular şi anume: replicarea ADN, proces complex prin care molecula de ADN se autoreproduce şi dă naştere la copii identice, ce vor fi transmise celulelor fiice; replicarea are loc în faza S (de sinteză) a ciclului celular; transcripţia ADN, proces la fel de complex, prin care informaţia conţinută în secvenţa ADN, este realizată prin sinteza moleculelor de ARN. ARN apare fie ca produs finit cum ARN ribozomal (ARNr) şi ARN de transport (ARNt), fie ca produs intermediar ARN mesager (ARNm), care urmează să transmită mesajul de la ADN în sinteza proteinelor, necesare funcţiilor vitale ale celulei. Transcripţia ADN se desfăşoară pe toată perioada interfazei şi este blocată în faza M (mitoza).

5.1. Morfologia şi structura nucleului Nucleul este constituit dintr-un înveliş (nucleolema, anvelopa nucleară), o materie internă, cromatina şi unul sau mai mulţi nucleoli care se găsesc în substanţa de fond, nucleoplasma (matricea). El există la toate celule organismelor eucariote, mai puţin la eritrocitele vertebratelor superioare, unde este eliminat printr-o exocitoză în cursul eritropoezei. Nucleul este constituentul esenţial al celulelor eucariote fără de care existenţa lor ar fi compromisă. ADN-ul cromozomilor este astfel organizat, încât o parte din secvenţele de baze purinice şi pirimidinice reprezintă cadrul după care sunt transcrise diferite mesaje sub formă de ARN, cealaltă parte a ADN-ului cromozomial are, probabil, rol în reglarea activităţii transcripţionale. Secvenţele de baze purinice şi pirimidinice se păstrează de-a lungul generaţiilor de celule datorită replicării semiconservative a ADN cromozomial. Tot în nucleu au loc sintezele diferitelor ADN-uri care, trecând în citoplasmă, constituie aşa numitul aparat de biosinteză proteică (fig. 71).

115

Fig. 71. Diagrama structurii nucleului.

5.1.1. Învelişul nuclear Pe faţa internă a membranei nucleare se distribuie, la nucleul vertebratelor, o împâslire de fibre fine, groasă de circa 200 - 600 Ả, care menţine rigiditatea nucleelor. Studiind raporturile învelişului nuclear, se observă că membrana externă, citoplasmatică, dezvoltă prelungiri scurte sau chiar tubuli care fac legătura cu reticulul endoplasmatic. Aria externă a nucleului este acoperită cu ribozomi; în plus, în multe cazuri apar aglomerări juxtanucleare de mitocondrii furnizoare de energie. Datorită grosimii sale, membrana nucleului este invizibilă la microscopul fotonic. Însă o parte din cromatină este dispusă sub membrana nucleului, astfel că pe secţiunile de ţesuturi colorate, liziera de cromatină perinucleară apare colorată, indicând şi limita externă a nucleului. La microscopul electronic se observă bine că membrana nucleului este dublă, prezentând pe faţa sa internă din loc în loc, îngroşări de care se prind fibrile cromatinei. Cromatină se mai ancorează şi la exteriorul inelelor şi chiar la granulul central. Totalitatea acestor fibre de cromatină constituie cromatină perinucleară . O funcţie importantă a învelişului nuclear constă în schimburile nucleoplasmatice, chiar dacă nu toate categoriile de molecule îl străbat . Astfel, prin învelişul nucleilor izolaţi nu trec glicogenul şi ovalbumina, în schimb trec tripsina, ribomeleaza, DNA-aza, histonele, polianionii ca heparina şi Hb şi bineînţeles, nucleotidele şi aminoacizii, „în vivo", ionii străbat în ambele sensuri învelişul nuclear, astfel că înăuntrul nucleelor se acumulează o cantitate dublă de Na+ şi K+ faţă de citoplasmă . Aminoacizii, monozaharidele şi dizaharidele (GM sub 500) pătrund prin dubla membrană nucleară, iar prin pori trec riboproteine sub formă de ribozomi, dar şi ribonuclează sau feritină. De regulă, calea de trecere transmembranară este urmată de molecule mici de tipul Fe coloidal, dar s-a observat că şi o serie de substanţe elaborate de reticulul endoplasmatic pot trece din el în spaţiul perinuclear (anticorpii antiperoxidazici ai hemocitoblaştilor). 116

Prin „înmugurirea" membranei exterioare a nucleului se formează lamele inela-te în citoplasmă, care sunt purtătoare de ribozomi sau ARN încorporat în membrane . La nucleele celulelor reproducătoare, atât de la plante cât şi de la animale, se pot observa înmuguriri ale învelişului nuclear care dau naştere la vezicule ce pătrund în citoplasmă unde, dezorganizându-se eliberează conţinutul de nucleoproteine. Prin granulul său central, polul opune totuşi o rezistenţă difuziei libere a diferitelor molecule în valoare de 1Ω/cm2. Moleculele cu sarcină electrică pozitivă trec uşor din citoplasmă în nucleu, însă cele încărcate negativ sunt oprite de inelele porilor de care se leagă . EM s-au observat ieşind helixuri de ribonucleoproteine prin porii nucleelor de amibe, iar prin porii nucleelor glandelor salivare de chironomide trec granule de 200 - 400 Å diametru, tot de ribonucleoproteine. Ribonucleoproteinele ajunse în citoplasmă reprezintă diferiţi ARN m, precum şi fracţiile 18 S, 25 S, 5 S ale ARN v asociate cu proteinele lor specifice. Însăşi ca numărul porilor poate creşte sau scade dă o indicaţie asupra rolului lor în reglajul transferului de informaţie care, în mare, se realizează de la nucleu către citoplasmă prin mesageri dar şi de la citoplasmă spre nucleu prin proteine histonice şi nonhistonice, printre nonhistonice figurând unele enzime. Este bine cunoscut faptul că, sub acţiunea fitohemaglutininei, limfocitele în cultură se transformă în limfoblaşti. Fitohemaglutinina acţionează asupra unor receptori membranari care activează AMP-cicloza, producând cAMP. Acest nucleotid ciclic stimulează o proteinkinaza, care produce o proteină ce pătrunde în nucleu. Acolo determină o puternică activitate transcripţională, sintetizându-se ARN m, ARN t şi ARN v care trec din nucleu în citoplasmă. Astfel se asigură o intensă activitate de biosinteze citoplasmatice, dar şi de mitoze ale limfoblaştilor. Învelişul nuclear mai are şi rol de formarea lamelelor inelate . în telofază, când are loc refacerea membranei nucleare pe seama reticulului endoplasmatic, rămâne un „surplus" de membrane endoplasmatice fie incluse în nucleu, fie în citoplasmă din jurul acestuia. Membranele respective se dispun paralel şi nu mai participă la reconstrucţia învelişului nuclear din cauza rapidităţii ciclului celular. Asemenea membrane inelate se întâlnesc, de obicei, în celule embrionare şi sexuale cu cicluri celulare scurte. În interfază, membrana exterioară a nucleului înmugureşte spre citoplasmă vezicule care ulterior se desprind şi, aşezându-se cap la cap, constituie lamele inelate. Prin contopirea acestora rezultă cisternele golgiene. În alte cazuri, membrana exterioară a nucleului, după ce pierde ribozomii, înmugureşte pe o porţiune anumită, dând naştere unei serii de vezicule. Acestea, cu timpul, se desprind şi depunându-se în şiraguri, se contopesc formând cisterne golgiene. În timp ce se formează o cisternă, pe faţa sa externă (uneori convexă) se dispune un alt şir de vezicule, şi aşa mai departe, în asemenea mod luând naştere un dictiozom. Porii Dubla membrană este străbătută de pori având un diametru de circa 700 Å care conţine fiecare câte un inel proteic ce limitează orificiul porului la 500 Å. Distanţa dintre centrele a doi pori alăturaţi este de circa 1300 Å, sau un multiplu al acestui număr, existând întotdeauna o legătură cu cromozomii interfazici, deoarece opt fibrile ale cromatinei se ataşează de marginile fiecărui por . De fiecare por sunt asociate o serie de structuri care fac parte din matricea nucleară . Fiecare por cuprinde un material inelar, o diafragmă, un granul central şi un material fibrilar. Materialul inelar cuprinde opt particule sferice proteice de circa 200 Å diametru aşezate pe fiecare faţă a porului; acest material îşi modifică structura în funcţie de metabolismul celular.

117

Dilatările şi contracţiile porilor se explică prin adiţia, respectiv pierderea proteinelor constitutive ale inelului. Diafragma este o substanţă densă, amorfă din interiorul porului, care se întinde spre centrul lui, unde se află un granul central riboproteic de 250 Å diametru. De el se leagă fibrilele de 50 Å diametru, care fac legătura cu particulele sferice interne şi externe ale porului. O fibrilă încercuieşte lumenul porului la interior, solidarizând astfel materialul său fibrilar ( fig. 72; fig. 73). Fig. 72. Structura porului nuclear: a( structura octogonală a complexului nuclear al porului în membrana nucleară; b) o secţiune verticală a complexului; granula centrală apare numai în anumiţi pori.

Fig. 73. Secţiune prin porul nuclear care prezintă schematic şi ipotetic sub formă de cilindru, tunelul care ar exista în structura porului şi prin care moleculele sunt transportate în interiorul sau exteriorul nucleului.

5.1.2.Matricea nucleului Reprezintă o structură proteică formată dintr-o reţea de fibrile foarte strânse şi fine, care umplu complet spaţiile dintre blocurile mai mici sau mai mari de cromatină. Matricea nucleului poate fi văzută la microscopul fotonic prin tratarea celulelor cu alfaamanitină. Acest alcaloid produce în două ore contracţia cromatinei, iar după fixare şi colorare cu hemalaun-enzimă, la microscopul fotonic se observă cum matricea este separată de blocurile cromatinei contractată, prin conturări clare, necolorabile (deci spaţii goale). Matricea dintre blocurile cromatinei este Feulgen (-), deci nu conţine ADN şi se colorează slab cu albastru de toluidină, hemalaun sau verde luminos, deci nu conţine grupări fosfatice multe. Matricea rezistă bine la „digestia" cu RN-ază, dar poate fi uşor solubilizată cu pepsină, ceea ce indică un conţinut predominant proteic. Tratarea nucleilor izolaţi din culturi celulare (Hela - S3) cu tampoane bogate în săruri, DN-ază şi ditiotreitol a permis izolarea unei structuri de natură proteică asemănătoare ca aspect cu cea a nucleului, dar „golită" de cromatină care a fost digerată cu DN- ază. Analizele ultrastructurale şi biochimice indică faptul că matricea constă din elemente membranare şi fibrilare cu o compoziţie chimică de 87% proteine, 12% fosfolipide, 1% ADN, 0,1% ARN. Proteinele separate prin electroforeză în strat subţire de dodecil-sulfat de sodiu (SDS) în gel de poliacrilamidă s-au dispus în 30 - 35 de benzi cu GM între 14.000 - 20.000. Matricea este reprezentată prin două clase de peptide majore, cu o greutate maximă cuprinsă între 14.000 - 18.000 şi respectiv 45.000-75.000. 118

În celulele sincronizate (aduse la aceeaşi fază a ciclului celular) se constată că în toate fazele ciclului celular au loc sinteze de polipeptide matriceale, dar ele sunt mai reduse în faza S/G2 (divizibil). După diviziunea celulară, în lipsa biosintezei proteice, vechile polipeptide cu GM cuprinsă între 45.000 - 75.000 persistă după mitoză şi refac noua matrice a nucleului interfazic. Cercetările de histochimie EM, combinată cu analiza electroforetică a proteinelor matriceale, au permis fundamentarea teoriei fibrilare a matricei nucleare (D. Comings şi T. Okada, 1978). După extragerea cromatinei nucleelor hepatocitelor de şoarece cu soluţii saline concentrate şi tratate apoi cu DN-ază şi TRITON X-100 rămâne numai matricea, cu o structură fibrilară, care este reprezentată prin porii şi lamina fibrilară a învelişului nuclear, componenta fibrilară a nucleolilor şi matricea intranucleară propriu-zisă. E.M., matricea nucleară este compusă din fibrile proteice de 20 - 30 Å, denumite matrixină. Ele se asociază în fibre mai groase, de 100 - 300 Å. Separarea electroforetică a matrixinei evidenţiază trei benzi polipeptidice cu greutatea maximă 65.000, 67.000 şi 68.000. Peste tot matrixină se leagă de fibrile de cromatină, ea având un rol principal în organizarea acestor fibre în cromomerele cromozomilor mitotici şi meiotici.

5.1.3.Proteinele contractile nucleare Au fost evidenţiate în diferite tipuri de nuclee din care s-au extras cromatină. Apoi din cromatină s-au izolat mai departe proteinele nonhistonice, prin electroforeză . În felul acesta sau putut separa: miozina (G.M. 200.000), actina (G.M. 45.000), tropomiozina (G.M. 34.000) şi subunităţile sale. Comparându-se conţinutul în miozina şi actină din cromatină hepatocitelor şi cea a neuronilor, se constată că în ficat miozina este în cantitate de 1,8 mai mare ca în creier şi actina de 2,3 ori. Este foarte probabil ca activitatea transcripţională a hepatocitelor în mesager (ARN m) ai actinei şi miozinei să fie de două ori mai mare ca în neuroni. Există deci un raport invers proporţional dintre conţinutul actinei cromozomale şi activitatea transcripţională. Probabil, actina exercită o represie asupra cromatinei, prin condensarea ei la maximum, făcând-o astfel netranscripţională. Se pare că actina nu se leagă direct cu ADM ci realizează un anumit tip de condensarea cromatinei.

5.1.4.Cromatina Toţi nucleii prezintă în interfaţă regiuni extrem de împachetate ale fibrelor cromozomale . Nucleii interfazici fixaţi şi coloraţi cu coloranţi bazici (albastru de toluidină, de metilen, Azur A etc.), care colorează cromatina, o evidenţiază sub formă de particule mai mari sau mai mici şi împlântate în matrice, ca o pătură subţire cromatică pe faţa internă a învelişului nuclear şi una sau mai multe blocuri în jurul nucleonului. Aspectul general al cromatinei este asemănător la nucleii aceluiaşi tip celular, dar variază în anumite limite după fixarea folosită . Astfel, cromatina se poate prezenta sub formă de grămezi sau grămăjoare de granule fine şi prelverulente, până la o reţea cu unele noduri ceva mai groase. Aspectul variază după tipul de celulă şi gradul ei de activitate metabolică, dar şi ci specia considerată . Examenul electrono-microscopic al cromatinei arată ca ea este formată din fibre împachetate - filamente nucleoproteice - cu traiectorie spiralată şi cu diametrul variabil. In zonele mai groase fibrele au diametrul de 200 - 500 Å, pe când în zonele subţiri de numai 60 100 Å. între grămezile de cromatina se găsesc spaţii intercromatiniene, colorate slab cu coloranţi bazici, în care se mai află o serie de structuri: ƒ fibrile cromatiniene, distanţate unele de altele şi fără traiecte spiralate; ƒ fibrile pericromatice, de 30 - 50 Å diametru, care mărginesc blocurile de cromatina; ƒ granule intercromatiniene, de 250 Å diametru, formate din tasări de fibrile pericromatiniene. Asemenea granule sunt rezistente la DN-ază şi numai după tratare cu pronază 119

pot fi digerate după aceea cu DN-ază. Asemenea granule intercromatiniene par a fi trei forme succesive de ARN m şi ARN v care ies din nucleu în citoplasmă unde rămâne câtva timp inactive datorită proteinelor pe care le conţin ƒ granule pericromatiniene situate la periferia cromatinei, mari de 450 Å diametru şi înconjurate de un halou clar care le separă de masa fibrelor cromatinei. Asemenea granule sunt formate din fibrile de 30 Å diametru, foarte neregulate ca traseu, ce depăşesc uneori marginea granulelor . Ele sunt tot de natură ribonucleoproteică şi au rol în transmiterea unor informaţii în sens invers, adică de la ARN la ADN; ƒ corpii spiralaţi din regiunile intercromatiniene, care reprezintă împachetări de fibrile răsucite, de 400 - 600 Å diametru, asociate sub formă de agregate sferice de 0,5µ. Ele sunt tot de natură ribonucleoproteică şi mai conţine şi nişte fibrile subţiri, de 50 Å, care se înfăşoară în jurul axului lor. Cromatina se găseşte sub două forme: eucromatină, considerată ca fiind acea parte din cromatină cu fibre fine şi uniforme repartizate în nucleu, active în replicarea ADN şi în transcripţia ARN şi heterocromatina rezultată compactizarea cromatinei sub formă de granule şi grămezi de diferite mărimi. Este intens colorabilă în roşu prin reacţia Feulgen pentru ADN şi albastru când se tratează cu coloranţi bazici. Studiile comparative de ME efectuate la plante şi animale au arătat că structuralizarea cromatinei se prezintă, funcţional şi evolutiv, diferit la plante şi animale. Astfel, în nucleii de Arabidopis cromatină formează cromocentre (cromozomi heterocromatici sau porţiuni de cromozomi care rămân condensate şi astfel colorabile în interfază); la Viscum album heterocromatina este reprezentată tot prin cromocentre, în schimb eucromatină formează cromomere şi cromonemate mai subţiri decât heterocromatina, dar la fel de intens colorabile. La Hedera helix, nucleii meristematici prezintă blocuri mari de heterocromatina condensată printre eucromatină decondensată, sau nucleii adulţi, care printr-o subreplicare (replicare a numai unei părţi din genom) devin tetraploizi (4n), suferă o cădere apreciabilă a cantităţii de heterocromatina condensată . în acest caz, eucromatină nu mai este activă în replicarea ei, probabil, numai în transcripţie . Între speciile de plante există o variaţie a cantităţii de cromatină condensată prin faptul că atât heterocromatina, cât şi eucromatină se condensează. Condensarea eucromatinei este determinată la plante de cantitatea de ADN a speciei date, precum şi de compoziţia acesteia. Variaţia cantităţii de cromatină din nucleii unei specii de plante este expresia replicării diferenţiale a heterocromatinei, care este în întregime constitutivă şi nu se exprimă prin condensări şi decondensări funcţionale în raport cu activitatea fiziologică a celulelor . La mamifere, însă celulele cu o activitate mitotică intensă sunt complet eucromatice, adică cu cromatină decondensată. La aceeaşi cantitate de ADN în ţesutul considerat, coexistă nuclee cu cromatină decondensată, mase de cromatină şi nuclee cu aproape toată cromatină condensată. În toţi aceşti nuclei cromatină condensată este constitutivă, Giemsa + şi încorporează mai târziu timidină tritiată, deci are o replicare întârziată - expresie a inactivării diferenţiale a cromatinei. O stare de condensare completă a cromatinei se întâlneşte la eritrocitele nucleate ale nemamiferelor şi care este total nereplicativă, ca şi în nucleii spermatozoizilor. La animale, gradul condensării cromatinei este dependent de funcţia celulei, fiind specifică unei activităţi tisulare anumite. Heterocromatina transcrie o foarte mică cantitate de ARN. Dat fiind complexitatea problemei, este necesar de schiţat o clasificare a aspectelor pe care la prezintă condensarea şi decondensarea cromatinei: Termenul de „heterocromatina" se foloseşte pentru heterocromatina constitutivă, care ocupă o regiune permanent condensată din cromozom şi a cărei localizare este identică la cromozomii analogi. Aceasta conţine o mare cantitate de ADN respectiv (secvenţe de baze care se repetă), se replică după eucromatină, nu transcrie ARN şi se colorează diferit;

120

Termenul de „heterocromatina facultativă" exemplifică cromozomul X, inactiv, al femelelor de mamifere, care apare heteropicnotic în interfază, adică foarte condensat şi colorabil (cromatina sexuală). La fel sunt şi cromozomii X sau Y din celulele sexuale ale unor insecte care se aglomerează în corpusculi Feulgen +. Acest tip de heterocomatină se caracterizează prin prezenţa unor proteine care modifică ADN făcându-l total inactiv, deoarece caracterele localizate pe un singur cromozom X - genele recesive - sunt singurele care se pot manifesta; aceasta deoarece cromozomul Y la mamifere a suferit o inactivare genetică prin heterocromatinizare, astfel că genele de pe X au devenit semizigote la mascul. Termenul de „cromatina condensată" semnifică eucromatina inactivată în mod specific de proteine, cum este cazul limfocitelor inactive, al eritrocitelor nucleate, al spermatoizilor etc. Prin stimularea celulelor cu lecitine, acestea se transformă în celule blastice (tinere), iar cromatina se decondensează şi ADN-ul poate sintetiza diferiţi ARN mesageri .

5.1.5.Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina. Nucleozomii Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina este realizată prin dublu helix al ADN şi prin diferite proteine (histone, protamine, nonhistone foarte variate). Analiza cromatinei interfazice realizată prin metoda precipitării cu magneziu, arată că ADN este 19,4%, ARN 14% şi proteinele 66.6% . Dintre proteine, 30,6% sunt solubile în 0,2 MH2SO4 . Considerând că fiecare cromozom este format dintr-un singur dublu-helix de ADN, spiralizat la rândul său însă de câteva ori, s-a putut calcula că lungimea totală a ADN tuturor cromozomilor complet despiralizaţi dintr-un nucleu este, în medie. De un metru la mamifere . Când volumul nucleului respectiv este în jur de 15 µ3, se pune întrebarea cum este posibil să încapă un metru ADN, oricât ar fi el de subţire (20 Å), într-un volum atât de mic? Mai mult chiar, existenţa ADN cromozomal în micul volum oferit de nucleu asigură o serie de funcţii şi roluri ale cromozomilor cum sunt replicarea şi reparaţia materialului genetic (ADN), precum şi transcrierea diferitelor ARN etc. La această întrebare s-a răspuns prin teoria structurii nucleozomale a cromozomilor. O serie de cercetări din ultimii 10 ani (P. Oudet şi Ada Olins, R.D.Kornberg, A. Klug) au dus la concluzia existenţei în nuclee a unor corpusculi numiţi nucleozimi. Ei sunt compuşi dintr-un miez histonic, în jurul căruia se înfăşoară dublul helix al ADN . întregul dublu helix al ADN al fiecărui cromozom se înfăşoară pe un şir enorm de asemenea corpusculi hiostonici, într-un mod neîntrerupt, adică de la un capăt la celălalt al cromozomului. Această situaţie sugerează imaginea unor mărgele înşirate pe aţă. ADN ar reprezenta aţa, iar miezul histonic ar fi mărgelele. Numai că în cazul structurii nucleozomale, corpusculul nu este străbătut de helixul dublu al ADN, ci acesta se înfăşoară în jurul corpuscului. Miezul histonic al nucleozomilor este constituit din patru clase histonice: H4, H3, H2A şi H2B, având un conţinut de 25% lizină, arginină şi histidină. Moleculele histonice H4 şi H3 sunt identice la toate speciile, în schimb moleculele H2A şi H2B au o mai mică fidelitate, cu toate că porţiunea fără caracter bazic a rămas nemodificată. Miezul nucleozomului este reprezentat printr-un set de opt molecule histonice, şi anume, câte două din clasa H4, H3, H2A şi H2B; miezul este deci, un octamer histonic. Acest complex, de histone, numit octamer, ce constituie miezul nucleosomic, este înconjurat la exterior de două spire ale ADN-ului cromozomal, constituit din 166 nucleotide. Legătura dintre doi nucleozomi succesivi se face printr-un segment de dublu helix ADN cu o lungime variabilă de câteva zeci de perechi de nucleotide care este asociat cu o moleculă de histonă H1. Molecula H, (H, din nucleii eritrocitelor de pasăre) este diferită de celelalte clase histonice, deoarece este de două ori mai mare cu o bazicitate crescută la 37%, cu un conţinut ridicat de lizină, alanină şi valină, s-a arătat că, în soluţii tampon cu o concentraţie ionică medie, regiunile mijlocii şi carboxiterminale ale moleculelor celor 5 clase histonice (H1, H2A, H2B, H3, H4) sunt globulare (fig. 74).

121

Fig.74 - Structura nucleozomilor. Nucleozomii sunt formaţi din două spire de ADN (ture) care înfăşoară un miez („core”) format din 8 molecule de histone (câte 2 de fiecare tip de histonă (H2A,H2B,H3 şi H4). Nucleozomii sunt legaţi între ei de un fragmant de ADN „linker” care nu este legat de proteine.Prin hidroliză enzimatică nucleozomii se separă conţinând ADN de aprox. 146 pb. Moleculele histonice se pot separa una de alta şi apoi reasocia experimental, toate sau o parte din ele, pentru a se cunoaşte rolul fiecăruia în ansamblul molecular nucleozomal. Nucleonii au formă sferică şi un diametru de 100 Å. În urma digestiei prelungite a cromatinei, cu nucleoză, urmată de purificare, rezultă particule lipsite de histonă H1 care conţine 140 ± 10 perechi de baze de ADN. Variabilitatea lungimii de la 180 la 250 perechi de nucleotide este determinată în exclusivitate de variabilitatea lungimii segmentului internucleosomic. Localizarea şi asamblarea celor 8 molecule histonice în miezul nucleosomic sunt cu aproximaţie cunoscute. Partea centrală a octomerului histonic este formată dintr-o unitate tetramerică (2H3+2H4). Octomerul histonicare formă de inimă, datorită aranjamentului sub formă de disc al tetramerului 2H3 - 2H4, care formează partea centrală şi vârful inferior al inimii şi asocierii sale cu cei doi dimeri (2H2A şi 2H2B) spre a forma cele două vârfuri superioare ale inimii. Octomerul este probabil stabilizat în urma interacţiunii capetelor C - terminale hidrofalse ale histonelor care, fiind globulare, se angrenează spre a constitui partea centrală a octomerului, pe când, capetele N - terminale, bogate în arginină şi lizină rămân la periferie sub forma unei cozi care interacţionează cu ADN ce se înfăşoară în jurul miezului sub forma aproape două (l şi 3/4) tururi super helicale negative. Studiile de reconstituire de cromatină în care s-au format cele patru fracţii histonice ce alcătuiesc miezul nucleosomic, în diferite combinaţii, au condus la obţinerea unor date care confirmă aranjamentul stabilit de histonele în alcătuirea nucleosomilor. Nici o combinaţie de histone nu se poate realiza atunci când se omit histonele H3 şi H4, cel mai puternic asociindu-se aceste histone bogate în arginină a căror secvenţă de aminoacizi a fost puternic conservată în decursul evoluţiei. Interacţiunile dintre moleculele H3 şi H4 sunt foarte puternice şi ele conferă miezului nucleosomal o formă specială de glugă, deci controlează starea conformaţională a complexului de molecule. Toate histonele, cu excepţia hi se leagă şi neutralizează sarcinile negative numai pe o parte ale dublului helix ADN, pe partea opusă fiind încă prezente repulsii de aceeaşi sarcină, permiţând astfel plierea ADN în jurul miezului histonic. Cromatina lipsită de histona H1 nu prezintă o structură regulată. Când din cromatină se extrage H1 şi este menţinută la puteri ionice scăzute, nucleosonii sunt încă distribuiţi de-a lungul matrixului ADN la aproximativ 200 perechi de baze, dar au un aspect mai puţin regulat şi ADN nu mai intră în şi iese din miezul nucleosomic la acelaşi punct, ci la puncte opuse. Dacă puterea ionică este ridicată peste 40mM NaCl, cromatina se condensează în aglomerări, nu în structuri helicale. 122

Aceste cercetări sugerează că histona H1 are un rol structural şi este esenţială pentru nivelele superioare de organizare a cromatinei. Constituenţii de bază ai cromozomului eucariot sunt fibrile de cromatina de 100 şi 300 Å diametru. Dacă cromatina intactă care conţine toate histonele este menţinută la o concentraţie scăzută de săruri (1mM NaCl), acestea se prezintă ca o structură destul de deschisă, cu nucleosonii bine definiţi, cu ADN ce intră şi iese din direcţii opuse la un acelaşi punct. Această formă s-a numit filament nucleosomal, având diametru de 100 Å. În prezenţa unor concentraţii saline apropiate de tonicitatea celulară, lanţul nucleosomal formează suprastructuri helicoidale cu ture de către şase nucleozomi. Sunt aşa numiţii solenoizi sau supersuperhelix, care pot fi văzuţi la microscopul electronic; diametru unei structuri supersuperhelix sau solenoid este de 250 - 300 Å. În cromozomii metafazici s-au evidenţiat (Back, 1979) fibre ce circa 400 Å diametru care s-ar forma prin condensarea fibrelor de 250 - 300 Å diametru, rezultând o structură suprasolenoidală care s-a numit fibra-unitară (unit-fiber). Prin plierea acestei fibre rezultă morfologia cromozomului metafazic. În cromozomi, cromatina este ancorată la un schelet proteinic care formează partea centrală a întregii structuri cromozomale. Dacă din cromozomi sunt eliminate histonele şi asemenea - se vizualizează EM, acest schelet proteinic împreună cu ADN formează un „halou" de circa 4.000 bucle de aproximativ 40.000 - 90.000 perechi de baze lungime, bucle care pornesc cu o ramură dintr-un punct al scheletului proteinic şi se întorc cu cealaltă ramură într-un punct adiacent acestuia. Când se reasociază cu histone, ADN-ul formează structuri moniliforme (structură nucleosomală). O condensare ulterioară produce fibra de 100 Å, apoi fibra de 300 Å (solenoizii) care la rândul lor sunt organizate, de asemenea, în fibre cu configuraţii helicale de ordin superior. Pornind de la ADN, condensarea generală este de 5.000 - 8.000 ori până la 250.000 de ori în cromozomul metafazic. Aşa se explică cum moleculele de ADN extinse de la nivelul cromozomilor complementului cromozomal uman având o lungime totală de 164 - 170 cm (aproximativ 2 m) pot fi adăpostite la nivelul celor 46 de cromozomi a căror lungime totală este de până la 200 µm. La fel se explică şi în cazul mamiferelor posibilitatea cuprinderii moleculei de ADN care alcătuieşte cromozomii într-un volum nuclear foarte mic. Ierarhia de helixuri a fibrei de cromatina porneşte de la dublu helix ADN care se condensează de şapte ori în nucleosom, fibra nucleosomală se spiralează la rândul ei de cinci ori în solenoid şi de 40 de ori ca suprasolenoid. Aceasta se mai condensează încă de cinci ori, aşa încât în cromozomul metafizic condensarea ajunge la un nivel mediu de 7.000 ori. Prin „digestia" cromatinei cu eudonucleoza micrococală s-au obţinut particule nucleosomală monomerice de care sunt asociate ADN-polimerazele, care împreună cu alte enzime (fosfoprotein-fosfatazele acide şi neutre, enzimele de restricţie şi reparaţie, RN-azele, proteazele etc) şi diferite proteine de structură, sunt clasate în aşa-numitele proteine nonhistonice. Studii biochimice au arătat că în nucleu, ca şi în mitocondrii şi cloroplaste, se găsesc o serie de ADN-polimeraze prin care se realizează replicarea semiconservativă a ADN.

5. 2. Replicarea ADN la eucariote Deoarece ADN conţine informaţia genetică a celulei, sinteza sa este unul dintre cele mai importante evenimente din viaţa acesteia . Realizată prin intervenţia unui complex aparat enzimatic, sinteza ADN, este o reacţie de tip selectiv, reprezentând singurul caz din lumea biomoleculară în care o substanţă îşi dirijează propria sa sinteză . Replicarea acizilor nucleici stă la baza reproducerii vieţii, orice sistem biologic realizând sinteza replicativă de ADN ca o precerinţă a reproducerii sale. Complementaritatea celor două catene a dublului helix ADN a sugerat lui Naston şi Crik modelul semiconservativ de replicare. Aşa cum a arătat Batson (1976), mecanismul replicării este asemănător 123

mecanismului cheie-broască, vrând să sugereze, prin acest sistem dual mecanic, complementaritatea structural-funcţională a celor două catene ADN, fiecare servind drept model, drept matriţă, pentru sinteza unei noi catene complementare care se numeşte replică. Termenul de REPLICARE derivă de la cuvântul englezesc „to replicate" = a copia (fig. 75). Fig. 75 - Înlănţuirea bazelor într-o singură catenă de ADN. Sinteza unei noi molecule de ADN se realizează aşadar printr-un proces de copiere, unic în lumea macromoleculelor şi în lumea vie, proces care se numeşte replicare. Replicarea este caracteristică doar acizilor nucleici. Aceştia prezintă o structură uimitor de potrivită pentru realizarea replicării în care, dintr-o moleculă iniţială iau naştere două molecule identice între ele şi totodată identice cu molecula iniţială. Astfel, molecula iniţială îşi „topeşte" identitatea în cele două molecule fizice care derivă din ea şi care sunt identice ei. Se asigură, pe de o parte reproducerea fidelă şi continuitatea fenomenului ereditar de-a lungul generaţiilor (fig. 76).

Fig. 76. a). Schema simplificată a replicării semiconservative. Bazele din cele două catene ADN (vechi sau noi) sunt complementare.Când ele se separă în cursul replicării,sunt adăugate bazele complementare la catenele vechi pentru a forma catenele noi (fiice).Acest model asigură ca moleculele noi de ADN să fie identice cu cele vechi. b). Replicarea la eucariote (se realizează bidirecţional; de la o singură origine (O) se formează două furci de replicare în direcţii opuse). În condiţiile vieţii actuale, replicarea acizilor nucleici nu poate avea loc decât în celule, fie procariote, fie eucariote. Replicare acizilor nucleici virali nu poate avea loc în virion - particulă virală naturală - ci numai în celula gazdă în care au pătruns în timpul infecţiei virale. Este, de asemenea, remarcabil pentru lumea vie faptul că nu se poate crea „de -novo" nici o moleculă de ADN, sinteza replicativă a ADN implicând existenţa obligatorie a unei molecule preformate care participă direct în reacţie, având loc formarea a două molecule fiice, identice cu molecula preformată. Continuitatea este asigurată de faptul că în moleculele nou formate intră şi câte o catenă din molecula iniţială, astfel că moleculele fiice vor avea o catenă veche 124

cea care a funcţionat ca matriţă şi o catenă nouă sintetizată - replicarea complementară a matriţei. Moleculele fizice de ADN moştenind doar una din cele două catene ale moleculeimamă, mecanismul de replicare se numeşte semiconservativ. In vivo sinteza acizilor nucleici se desfăşoară în trei etape: a.) sinteza precursorilor nucleotidelor purinice şi pirimidinice adică a acidului inozinic şi respectiv acidului uridilic ; b.) sinteza nucleotidelor propriu-zise care intră direct în alcătuirea macromoleculei acizilor nucleici: ƒ dezoxiadenozintrifosfat - d ATP ; ƒ dezoxigreananozintrifosfat - d GTP ; ƒ dezoxicitidintrifosfat - d CTP ; ƒ dezoxitimidintrifosfat - d TTP (pentru ADN) şi: ƒ adenoziritrifosfat - ATP; ƒ guanozintrifosfat - GTP; ƒ citidintrifosfat - CTP; ƒ uridintrifosfat - UTP pentru ARN. c.) polimerizarea ordonată a nucleotidelor într-o secvenţă complementară unei matriţe după modelul semiconservativ şi sub cataliza unor enzime polimerazice celulare.

5.2.1.Complexul de enzime polimerazice implicate în replicare În desfăşurarea reacţiei de polimerizare este necesară prezenţa tuturor celor patru tipuri de dezoxiribonucleide sub formă lor trifosfatică, absenţa numai a uneia dintre ele blocând activitatea enzimei polimerizatoare. La bacterii au fost descrise trei enzime ADN - polimerizatoare: ADN -polimeraza I numită enzima lui Kornserg şi simbolizată Pol I, ADN - polimeraza II şi ADN - polimeraza III. Deşi la început s-a crezut că ADN - pol I este implicată în reacţia de replicare, ulterior sa dovedit că doar ADN - pol III este enzima polimerizatoare în replicare, pe când ADN - pol I joacă rol esenţial în repararea leziunilor produse în ADN de către diferiţi agenţi mutageni fizici sau chimici. Funcţia ADN - pol II bacteriene nu este încă precizată, dar ea nu joacă rol esenţial în replicare, putând, de asemenea, fi implicată în procesele reparatorii sau de recombinare. La eucariote s-au descris mai multe tipuri de ADN polimeraze: ƒ polimeraza alfa (α) - implicată în replicarea propriu - zisă; este responsabilă de 80% din activitatea totală a enzimelor de replicare. S-ar părea că vertebratele au acelaşi fel de polimeraza, iar nevertebratele una asemănătoare. Polimeraza a este constituită dintr-o unitate catalitică de 150.000 daltoni, asociată cu 4 polipeptide de 54.000, 58.000, 61.000 şi 64.000 daltoni ce formează subunitatea heteropolimerică stimulatoare a regiunii catalitice sau cu funcţie stabilizatoare a complexului ADN-polimeraza. - polimeraza beta (β), implicată în reparare. Este prezentă la toate metazoarele, dar nu se întâlneşte la plante şi protezoare, în timp ce a polimerază se află la toate celulele eucariate . O caracteristică interesantă a β - ADN - palimerază este capacitatea de a folosi o matrice ribonucleotidică în prezenţa unei „amorse" ADN. Această proprietate aminteşte de transriptaza inversă virală, cu precizarea că enzima poate copia un ARN natural. ƒ polimeraza gama (γ), care se pare a fi polimeraza mitocondrială, fiind prezentă şi în mitocondrii, nu numai în nucleu. ADN - polimerazele prezintă specificitate de direcţie, nu însă şi de secvenţă (nu recunosc o anumită secvenţă specifică de baze azotate din ADN), deplasându-se pe ambele catene matriţă doar în direcţie dinspre 3' spre 5', catalizând formarea punţilor fosfodiestenice (polimerizarea nucleotidelor) doar în direcţia 5' spre 3', astfel că totdeauna polaritatea replicei este de sens opus polarităţii matricei, catenele complementare fiind deci antiparalele .

125

Faptul că ADN - polimeraza nu are specificitate de secvenţă este dovedit de folosirea, în reacţiile „în vitro", în calitate de matriţă, dar monocatene de ADN de orice proeminenţă ar fi ele. ADN - polimeraza nu poate folosi ca matriţă ADN bicatenar.

5.2.2. Iniţierea replicării Separarea celor două catene complementare - ce devin catene matriţă - în procesul de replicare se realizează progresiv, astfel că, în desfăşurarea procesului, macromoleculele ADN capătă forma literei „Y ", bifurcaţia sa numindu-se bifurcaţie de replicare şi reprezentând cele două catene - matriţă ce-şi expun bazele în vederea împerecherii cu bazele azotate ale nucleotidelor libere. La nivelul bifurcaţiei de replicare se desfăşoară procesele mecanismului semiconservativ de replicare prin intervenţia unui complex aparat enzimatic. Iniţierea replicării se face într-un punct de pe macromoleculă ADN numit originea replicării. O asemenea secvenţă de origine se caracterizează (la toate sistemele biologice analizate) G - C. La nivelul perechilor A - T are loc iniţierea separării celor două catene, aceste perechi având doar două punţi de H, sunt mai uşor de separat comparativ cu perechile G - C care având trei punţi de H sunt mai stabile . În celule, macromoleculele ADN se află sub formă de structuri terţiene sau cuaternare, iar cele circulare, cum sunt ADN bacterian, ADN mitocondrial, datorită superspiralizării prezintă numeroase superrăsuciri. În vederea replicării, pentru a se permite înaintarea bifurcaţiei de replicare de-a lungul circumferinţei moleculei, este necesară relaxarea macromoleculei torsionate, prin superspiralizare. Această torsionare este înlăturată prin acţiunea unei enzime care are capacitatea de a introduce crestături monocatenare tranziente în duplexul ADN, ceea ce permite rotaţia liberă a unei catene, în jurul celeilalte. Această enzima numită iniţial pivotază, enzima de creştere - închidere, enzima de relaxare pe ADN sau UNWINDAZĂ, a primit în ultimul timp numele de TOPOIZOMERAZĂ - ADN. Topoizomerazele introduc superspiralizări tranziente negative în ADN. Topoizomeraza este alcătuită din două subunităţi luate de câte două ori, constituind un tetramer. Una din aceste subunităţi funcţionează ca topoizomerază propriu-zisă, pe când cea de-a doua subunitate a topoizomerazei acţionează ca ADN - GIRAZĂ sau PROTEINĂ OMEGA (Ω) introducând tururi superhelicale în ADN nou sintetizat, refăcând starea superhelicală a moleculei fiice de ADN . De aceea, metaforic s-a spus că topoizomerazele - ADN „desfac şi fac nodurile din ADN". ADN-giraza superspiralizează ADN printr-un mecanism numit inversie de semn, în care o superhelice pozitivă este direct convertită într-una negativă, printr-o creştere tranzientă monocatenară a ADN bicatenar într-un anumit punct. La eucariote s-a arătat că proteinele nonhistonice, desemnate HMG1 şi HMG2, pot separa catenele dublului - helix ADN. După intervenţia topoizomerazei care determină relaxarea ADN la nivelul originii replicării, intervin enzime numite HELICAZE - ADN. Acestea realizează separarea catenelor prin ruperea punţilor de H, folosind energia provenită prin defosforilarea ATP. Există şi alternativa ca primul eveniment în separarea catenelor dublului helix să fie intervenţia la punctul de iniţiere a replicării, a unei endonucleoze care, recunoscând în mod specific secvenţa de nucleotide de la nivelul acestei origini, produce o „tăiere" a uneia dintre cele două catene tăiere care nu este altceva decât desfacerea unei legături covalente fosfodiesterice. În urma acestei „creşteri" rezultă 2 extremităţi, una având gruparea 3' - OH şi alta 5' - fosfat. Energia liberă de la nivelul acestei „creşteri" este suficientă pentru a desface încă 2-3 punţi de H, moment în care se ataşează ADN - polimeraza - enzima polimerizatoare. La E. coli, helicaza descrisă sub denumirea de proteină reparatorie se deplasează pe monocatena ADN în direcţia 3' - 5', îndepărtând catena complementară. O altă helicaza numită helicaza III se deplasează în direcţia 5' - 3', având o aceiaşi acţiune ca şi proteina reparatorie. Proteine neenzimatice denumite UNWINDAZE sau proteine destabilizatoare ale dublului helix (HDP), respectiv proteine de topire a ADN, intervin în asigurarea stabilizării monocatenelor, 126

nepermiţând, odată ataşate la ele, reasocierea monocatenelor complementare, astfel că acestea să poată funcţiona ca matriţă. După desfacerea structurii bicatenare în monocatenare şi stabilizarea monocatenelor la nivelul originii replicării, intervine enzima PRIMAZA care determină sinteza unui scurt segment de ARN care s-a numit ARN-PRIMER.

5.2.3. Primarea replicării Toate enzimele ADN - polimerazice au capacitatea de a alungi catene polinucleotidice deja existente, nu însă şi de a iniţia sinteza „de novo" a unei catene. Pentru aceasta, în desfăşurarea polimerizării de nucleotide din cadrul replicării ADN, este necesară ca primă etapă intervenţia unui ARN - polimeraze - enzima care are capacitatea de a iniţia sinteza „de novo" de catene polinucleotidice, folosind ca model o catena - matriţă . Această intervenţie a ARN - polimerazei în procesul de replicare a ADN apare ca un element ajutător, dar esenţial. Prin activitatea ARN - polimerazei în procesul de iniţiere a replicării ADN se sintetizează un scurt segment de ARN (primer).

5.2.4. Alungirea lanţului de ADN nou - sintetizat şi terminarea replicării Capătul 3'-OH al fiecărui nucleotid aliniat pe matriţă, serveşte de fiecare dată drept primer pentru activitatea de polimerizare a ADN - polimerazei. Polaritatea opusă a catenelor - matriţă, 3' - 5' pe una şi 5' - 3' pe cealaltă, a ridicat problema existenţei a două polimeraze care să catalizeze polimerizarea, una în direcţia 3' - 5', alta în direcţia 5' - 3' . Dar, în ciuda tuturor încercărilor, nu au fost descoperite două ADN polimeraze care să polimerizeze în direcţii opuse. S-a stabilit cu certitudine că în replicare intervine o singură enzimă polimerizatoare - la bacterii ADN - pol III, care se deplasează numai în direcţia 3' - 5' pe ambele catene matriţă, determinând polimerizarea numai în direcţia 5' - 3'. În anul 1968, Okazaki şi colaboratorii au demonstrat prin experienţe de marcare pulsatorie (contactul materialului biologic cu H - timidină este de foarte scurtă durată), că noile catene complementare catenelor - matriţă sunt sintetizate pe segmente mici, care sau numit fragmente OKAZAKI, având circa 1.000 - 2.000 nucleotide şi apoi aceste fragmente sunt unite prin punţi fosfodiesterice sub acţiunea unei enzime numite ADN - ligaza, rezultând segmente mai lungi. în ultimă instanţă, rezultă din unirea acestora din urmă catena nou sintetizată, replică a matriţei. Fiecare fragment Okazaki va fi primat, de un ARN - PRIMER, prin intervenţia primazei. După sinteza fragmentului Okazaki, ARN - primer este îndepărtat prin excizie de către un ADN - polimeraza I care are activitatea exonucleazică (de hidroliza legăturilor fosfodiesterice). Golul rămas în urma exciziei ARN primer va fi umplut prin activitatea tot ADN - pol I care va realiza completarea printr-o reacţie de polimerizare regională. În felul acesta fragmentele Okazaki sunt asamblate fără ARN -primer. Modelul de replicare discontinuă propus de OKAZAKI s-a dovedit a fi aplicabil la toate sistemele biologice . Este posibil ca replicarea pe o catena să fie înaintată faţă de cea de-a doua catena sau unirea fragmentelor OKAZAKI să fie mai rapidă pe o catena, numită catena directoare (leading), pe când aceea cu sinteză încetinită se numeşte catena succesoare (lagging) (fig. 77; fig. 78).

127

Fig. 77 - Replicarea ADN. Se realizează în direcţia 5' - 3'. Catena leading se sintetizează în mod continuu, catena lagging se sintetizează în mod discontinuu; fagmentele Okazaki sunt unite de către ADN – ligază. În aceste condiţii şi pe catena lagging sinteza are loc tot în direcţia 5' - 3'. Fig. 78 - Schema generală a replicării în care fiecare enzimă sau proteină auxiliară sunt prezentate în mod individual.Ele acţionează la nivelul furcii de replicare.

5.2.5. Corectarea erorilor de replicare Replicarea ADN, fiind un proces complex, care se desfăşoară cu mare viteză, necesită ca produşii rezultaţi să fie copiaţi cu mare acurateţe, iar în cazul când sau introdus erori, în mod accidental, ele să fie corectate imediat. La nivel molecular există mecanisme care asigură corecţia replicării şi care face ca un nucleotid liber, greşit împerecheat cu nucleotidul de pe matriţă să fie excizat, altfel desfăşurarea polimerizării este stopată (fig. 79).

128

Fig. 79 - Schema reparării ADN (înlocuirea dimerilor de timină). Acest sistem de corectare postreplicativ, implică mai multe etape şi mai multe enzime de reparare: - recunoaşterea bazei incorecte introduse (deci a mutaţiei) - îndepărtarea secvenţei lezate de către nucleaze, fiind eliminate de la 10, până la 50 nucleotide - completarea regiunii excizate cu o secvenţă corectă, de către polimeraza I - unirea fragmentelor pentru stabilirea continuităţii catenei, de către ADN – ligază (fig. 80).

Fig. 81 - Schema generală a sistemului de reparare postreplicativ la bacterii, care cuprinde cel puţin 4 etape: recunoaşterea leziunii ADN; îndepărtarea de către nucleaze a secvenţei lezate; completarea de către ADN-pol I a întreruperii create în monocatena de ADN; legarea celor două capete de către ADN ligază.

5.2.6. Unităţile de replicare Numite şi repliconi - la procariote, reprezentaţi de cromozomul bacterian care funcţionează ca unitate de replicare, la eucariote reprezintă acele regiuni ale ADN unde se găsesc punctele de iniţiere (de origine) ale replicării. Spre deosebire de cromozomul viral şi bacterian, cromozomul eucariotelor este o structură multirepliconică, fiind constituit din mai mulţi repliconi (unităţi de replicare), complementar - matriţei ADN. Acest segment de ARN s-a numit PRIMER, procesul în care are loc sinteza sa s-a numit PRIMARE, iar ARN - polimeraza care catalizează asemenea sinteză s-a numit PRIMAZĂ. Sinteza unei catene ADN, a replicei, începe deci de la primerul ARN, sub acţiunea ADN polimerazei care este eficientă în alungirea catenei polinucleotidice iniţiată prin sinteza primerului ARN. ARN - primer oferă ADN - polimerazei capătul său de 3'-OH, care este liber şi care pătrunde într-un sit special al acestei enzime numit SIT PENTRU CAPĂTUL 3'-OH Ah PRIMERULUI. ADN - polimeraza realizează în cadrul acţiunii sale catalitice condensarea, adică esterificarea grupei 3'-OH a primerului ARN cu grupa 5' - fosfat a primerului dezoxiribonucleotid trifosfat aliniat pe matriţă în virtutea complementarităţii sale cu baza azotată corespunzătoare din matriţă.

129

5.3. Transcripţia ADN sau sinteza ARN 5.3.1. Mecanismul general Mecanismul prin care informaţia genetică, conţinută în molecula de ADN, se materializează în sinteza proteinelor a fost elucidat în ultimii 40 de ani. Proteinele sunt componente celulare care, de fapt, realizează toate activităţile ce au loc în celulă. Numărul proteinelor este de aproximativ 109 – 1010 molecule/celulă, reprezentate de aprox. 10. 000 de tipuri diferite. Desfăşurarea acestui flux informaţional apare sub denumirea de dogmă centrală a biologiei moleculare ( 1960 – 1970 ). Această dogmă consideră că ADN transmite informaţia la ARN şi de la ARN la proteine, după schema: Transcripţie Translaţie ADN ----------------→ ARN -------------→ PROTEINE Mesager de transport ribozomal Temin şi Baltimore au stabilit (1970) că este posibilă transmiterea informaţiei şi de la ARN la ADN, proces realizat de o enzimă (ce se găseşte de la virusuri până la eucariote) denumită reverstranscriptază. În acest caz, ARNm reprezintă matricea (template) pentru molecula de ADN, procesul fiind denumit reverstranscripţie şi astfel dogma centrală este contrazisă. Din schema de mai sus, se observă că ADN nu intervine direct în sinteza proteinelor. Transmiterea informaţiei se face prin ARNm, care este un produs intermediar, a cărei funcţie este de a translata mesajul genetic în proteine. Acest proces de sinteză a ARN este denumit transcripţia ADN, sinteza ARN sau expresia genică. Se foloseşte termenul de expresie genică, pentru că o regiune din molecula de ADN reprezentată de o genă, când este activată, transcrie un ARNm pentru o proteină dată. Indiferent din ce celulă provine ADN (procariote sau eucariote) conţine mii de gene a căror secvenţă corespunde, în întregime sau parţial, secvenţei aminoacizilor din proteine. Secvenţa genelor din genomul celulelor procariote corespunde în întregime secvenţei aminoacizilor din proteina pe care a codificat-o şi ele sunt numite gene coliniare (fig. 82). Spre deosebire de acestea, genele din genomul celulelor eucariote sunt întrerupte de secvenţe care nu vor fi regăsite în secvenţa proteinelor. Astfel, o genă (sau mai bine zis unitatea transcriptibilă a genei) la eucariote este formată din două grupuri de secvenţe: ƒ exoni, secvenţe care sunt transcrise în ARN precursor, sunt conţinute de ARNm şi sunt regăsite în secvenţa aminoacizilor din proteină; ƒ introni, secvenţe din genă, care sunt transcrise în ARN precursor, dar nu mai sunt conţinute în ARNm şi deci nu se mai găsesc în secvenţa aminoacizilor din proteinele transcrise (fig.83). În prima etapă, gena este transcrisă în întregime într-o moleculă de ARN numită precursor (pre-mesager sau ARN nuclear heterolog). Intronii sunt eliminaţi din molecula de ARN precursor prin mecanisme speciale. În urma acestui proces, rezultă o moleculă de ARNm, care conţine numai exoni şi a căror secvenţă serveşte pentru sinteza proteinelor. Astfel, molecula de ARNm apare mult mai mică decât transcriptul primar – ARN heterolog. Fig. 82 - Genă structurală care corespunde exact secvenţei ARNm şi proteinei sintetizate.

130

Fig. 83 - Gene structurale eucariote intrerupte de introni. Din ARN precursor intronii sunt îndepărtaţi, exonii sunt uniţi între ei (splicing) pentru a da naştere ARNm sau matur, care prin translata proteina, în care secvenţele intronilor nu se mai regăsesc. Majoritatea genelor pentru ARNt sau ARNr din genomul a numeroase eucariote conţin şi ele introni care sunt eliminaţi din transcriptul primar. Chiar şi ADN mitocondrial conţine uneori introni în genele care codifică toate tipurile de ARN. Sunt însă gene care nu au introni, de exemplu, genele pentru histone, interferoni şi retrogenele (genele provenite din revers- sau retrotranscripţia ARNm).

5.3.2. Elemente implicate în transcripţie Transcripţia implică sinteza unui lanţ polinucleotidic de ARN care preia mesajul de pe molecula de ADN. ARN este, ca şi ADN, un lanţ lung neramificat, format din cele patru nucleotide (A,U,G,C) informaţia genetică a unei singure catene de ADN va fi transmisă la o secvenţă complementară de ARN. În acest scop, cele două catene de ADN se vor separa, temporar şi pe lungimi scurte, pentru ca una să servească de matrice pentru ribonucleotidele ce vor fi aşezate complementar secvenţei catenei de ADN. Deci ARNm (ca şi celelalte tipuri de ARN) sintetizat ca un lanţ monocatenar este complementar catenei de ADN care l-a transcris şi este identic cu cealaltă catenă de ADN netranscrisă (fig. 84).

Fig. 84 - Transcripţia ADN. ARN polimeraza sintetizează ARN, copiind mesajul de pe o singură catenă ADN. Opţiunea pentru catena ce va fi copiată este determinată de poziţia promotorului în secvenţa ADN. 131

Transcripţia ADN este un mecanism coplicat, care necesită un aparat de transcripţie. Pe lângă ARN polimeraza specifică fiecărui ARN sunt implicate în acest proces numeroase proteine auxiliare (factori de transcripţie) şi o serie de elemente de control existente în structura ADN.

5.3.3. Aparatul enzimatic de transcripţie Transcripţia ADN implică producerea a trei specii de ARN: ARN mesager (ARNm), ARN ribozomal (ARNr) şi ARN de transfer sau de transport (ARNt). Procesul de transcripţie este realizat de enzima ARN polimeraza. La procariote există un singur tip de ARN polimerază care este responsabilă pentru sinteza celor trei specii de ARN. La E.coli numărul total de molecule de ARN polimerază/celulă este de aprox. 7000. Angajate în transcripţie sunt probabil 2000-5000 de molecule. Enzima completă sau holoenzima are o greutate moleculară de aprox. 480.000 Da şi este formată din două componente: enzima core (de bază) şi factorul σ (sigma). Greutatea moleculară a factorului σ variază de la 32000 la 92000 da. Enzima, pe lângă factorul σ, conţine alte patru componente, codificate de gene distincte şi care au funcţii diferite în procesul de transcripţie. Iniţierea transcripţiei se face prin holoenzimă (enzima completă), factorul σ fiind componenta implicată numai în recunoaşterea şi fixarea corectă a punctului de iniţiere. Transcripţia odată iniţiată este continuată de enzima core, deoarece factorul σ nemaifiind necesar , se desprinde de complex şi se asociază la o altă ARN- polimerază, care va începe activitatea la un alt punct de iniţiere. La celulele eucariote, aparatul de transcripţie este mult mai complex şi mai puţin cunoscut decât la procariote. Într-o celulă eucariotă există trei tipuri de ARN- polimeraze nucleare. Ele ocupă poziţii distincte în spaţiu nuclear şi fiecare tip de enzimă prezintă o structură complexă. La eucariote, cele trei specii de ARN (ARNr, ARNm, ARNt) sunt transcrise, fiecare, de către un tip de polimerază, şi anume: - ARN-polimeraza I – este o enzimă localizată în nucleol şi catalizează transcripţia ARNr; ea reprezintă activitatea sintetică cea mai mare (aprox. 50 – 70 % din total); - ARN- polimeraza II – este o enzimă nucleoplasmatică, responsabilă pentru transcripţia ARNm (activitate egală cu aprox. 20 – 40 % din total); - ARN- polimeraza III – este o enzimă tot nucleoplasmatică care transcrie ARNt şi 5S ARNr activitate egală cu aprox. 10 % din total ). Fiecare celulă eucariotă conţine între 2 x 104 până la 2 x 107 molecule de ARNpolimeraze. Procesul de transcripţie catalizat de ARN- polimeraze prezită trei etape importante. 1. etapa de iniţiere, care include: recunoaşterea de către ARN- polimerază a genei care trebuie transcrisă ( gena ţintă ), a punctului de iniţiere unde are loc desfacerea helixului ADN pentru generarea unei regiuni monocatenare scurte şi încorporarea primelor nucleotide care formează lanţul de ARN; secvenţa ADN necesară pentru realizarea acestor reacţii este reprezentată de promotor; locul la care primul nucleotid este încorporat se numeşte punct de iniţiere (start point şi se notează cu + 1); 2. etapa de elongaţie, reprezintă faza în care nucleotidele sunt legate covalent la capătul 3' al lanţului polinucleotidic. Bazele sunt adăugate succesiv la lanţul ARN, când are loc formarea hibridului molecular ADN-ARN, în regiunea desfăşurată a helixului. Sinteza continuă şi polimeraza alunecă de-a lungul ADN, desfăcând dublul helix pentru a expune un nou segment al matricei sub formă monocatenară; 3. etapa de terminare, care reprezintă punctul unde sinteza lanţului de ARN se termină iar hibridul ADN-ARN format, se separă. ADN se reface sub formă de dublu helix, ARNpolimeraza şi molecula de ARN sintetizată se desprind şi devin libere în mediu. 132

Terminarea sintezei este realizată de o secvenţă specifică în structura genei care se numeşte terminator. Pentru realizarea procesului complex de transcripţie, pe lângă ARN-polimerază este necesar un mare număr de proteine auxiliare numite factori de transcripţie, care interacţionează cu secvenţe specifice de ADN şi care pot acţiona stimulator sau inhibitor asupra expresiei genice.

5.3.4. Factorii de transcripţie Spre deosebire de procariote, unde ARN-polimeraza se leagă de ADN, la eucariote ADN-polimeraza se leagă de proteine care au identificat promotorul genei ce va fi transcrisă. Aceste proteine, reprezintă factorii de transcripţie care intră în aparatul transcripţional format din aprox. 20 de proteine, implicat în: - menţinerea duplexului ADN după legarea factorilor de transcripţie (FT); - menţinerea stării active a genei ţintă sub acţiunea altor factori transcripţionali şi legarea ARN-polimerazei; - obţinerea energiei necesare sintezei, prin hidroliza ATP; - iniţierea transcripţiei ( a sintezei ARN); - elongarea transcriptului. Cercetări analitice au permis să se izoleze şi purifice, din extractul nuclear, o serie de factori de transcripţie. Primul care recunoaşte promotorul şi în special TATA-box, este factorul de transcripţie D (notat TFIID), TF de la transcription factor şi II de la ARN-polomeraza II. Pentru că el se leagă de secvenţa TATA-box a promotorului a fost denumit şi TBP (TATABinding Protein). Acest factor odată legat la ADN va atrage şi alţi factori de transcripţie, cât şi ARN- polimeraza. Alţi factori de transcripţie (notaţi cu I, II, III, specificând tipul de ARN-polimerază care se leagă) sunt notaţi cu litere: A (de ex: TFIA), B (TFIIB), D, E, F, G, H. Dacă ARN-polimerazele sunt universale, identice pentru toate ţesuturile şi celulele, factorii de transcripţie sunt specifici pentru anumite ţesuturi. Ei joaca un rol important în diferneţierea celulară şi menţinerea tipurilor de celule. Pe lângă aceşti factori de transcripţie, implicaţi direct în sinteza ARN există şi proteine care reglează desfăşurarea procesului, în sensul ca îl intensifică, atenuează, nu blochează. Acestea sunt proteine reglatoare, care ca şi factorii de transcripţie au capacitatea de a se lega de ADN. Pentru acestea se impun cel puţin doua condiţii: - proteina trebuie sa conţină în structura ei o secvenţa specifică de aminoacizi (de obicei 10100) care reprezintă domeniul (sau motif-ul) de interacţiune cu ADN. Aceste domenii sunt considerate ca elemente de recunoaştere a genelor ţintă şi de aceea se numesc şi capete de citire (Reading Head); - la nivelul ADN trebuie să existe de asemenea secvenţe nucleotidice specifice (de obicei 515) care să corespundă domeniilor (motif-elor) din proteinele reglatoare respective. Aceste secvenţe sunt denumite elemente responsive (Responsive elements). În aceasta categorie de proteine intră receptorii hormonali steroidici, care transportă hormoni (corticoizi, estradiol, progesteron etc.) în nucleu şi interactionează cu secvenţele specifice ADN (elementele responsive) iniţiind, accelerând sau blocând transcrierea unor gene.

5.3.5. Elemente de control în expresia genetică Reglarea specifică a expresiei genice implică sinteza ARN, care copiază o singură catenă a moleculei de ADN. Catena care se copiază asigură sinteza moleculei de ARN în direcţia 5'-3' (deci va fi întotdeauna catena ADN cu direcţia 3'-5', iar catena nouă va avea direcţia 5'-3'. O genă conţine atât informaţia pentru structura proteinei, cât şi elementele (secvenţele) de control care reglează expresia genei, deci a sintezei ARN. (fig. 106). 133

Gena din punct de vedere funcţional şi structural conţine 2 regiuni: regiunea reglatoare şi regiunea de transcripţie (sau unitatea transcriptibilă) care sunt separate de punctul de iniţiere a sintezei ARN (punctul start care se noteaza cu +1, adică primul nucleotid din molecula ARN). Regiunea reglatoare, care nu se transcrie, are ca element principal promotorul: o secvenţă de nucleotide specifică fiecarei gene, iar la eucariote (mamifere) de factorii de transcripţie. La bacterii promotorul conţine doua secvenţe caracteristice şi necesare pentru legarea ARN polimerazei si pozţionarea ei cu precizie faţă de punctul de iniţiere: ƒ secventa-10,care reprezintă TATA-box (sau PRINBOW BOX); ƒ secvenţa -35 (minus indicând că aceste secvenţe se află la stânga faţă de punctul de iniţiere, adică upstream (fig. 85).

Fig. 85 - Schema generala a elementelor de control. Promotor cu (TATA box); secvenţele activatoare –UAS şi enhancer-ii La eucariote promotorul conţine 2 secvenţe caracteristice: - secventa -27, care reprezinta TATA-box (sau HAGNESS BOX) - secvenţa -84. TATA box situată la -27 pb este secvenţa indispensabilă pentru iniţierea corectă a transcripţiei de la punctul start (acelaşi rol îl are secvenţa -10 la procariote). Promotorul este considerat o secvenţă esenţiala pentru reglarea ARN polimerazelor şi a factorilor de transcripţie. Abilitatea promotorului de a iniţia transcrierea unei gene poate fi foarte mult acentuată de prezenţa unui enhancer. Enhancer-ii sunt elemente reglatorii implicaţi în activarea ratei de transcripţie a unei gene. Ei pot creşte transcripţia unui promotor până la 1000 de ori. Ei determină acetilarea histonelor care determină o relaxare a miezului histonelor, promotorul devenind mai accesibil factorilor de transcripţie. Enhancer-ii pot fi situaţi în secvenţa de ADN „în susul” (upstram) promotorului său „în josul” lui (down stream) faţă de punctul de iniţiere a sintezei ARN(+1) (fig 85). Există şi alte elemente similare, de exemplu la drojdii, aşa-numitele secvenţe activatoare(upstream activator sequences – UAS). Aceste secvente UAS care sunt localizate la distanţe diferite de promotor pot funcţiona în orice orientare. Enhancerii şi aceste elemente UAS pot exista până la 3000-5000 pb distanţă de promotor, de unde îşi pot exercita efectul pozitiv asupra transcripţiei.

5.4. Mecanismul transcripţiei În general, ambele catene ale ADN pot servi drept matrice pentru sinteza ARNm. În realitate, numai o singură catenă a ADN este transcrisă, iar ARN sintetizat este echivalent în secvenţa nucleotidelor cu monocatena de ADN netranscrisă (catena opusă). Promotorul, care, în funcţie de poziţia lui în secvenţa ADN, asigură legarea ARN polimerazei şi orientează “citirea” (sinteza) într-o direcţie sau alta. În orice caz, sinteza ARN având loc numai in direcţia 5’ – 3’, promotorul, în funcţie de orientarea în structura ADN, va decide care catenă de ADN va fi copiată (fig. 86). 134

Figura 86 - Promotorul este orientat bine(in direcţia 3’-5’ a catenei ADN) si sinteza ARN se va face in direcţia 5’3’. La procariote legarea ARN polimerazei la promotor este determinată de două secvenţe scurte: secvenţa-35 şi secvenţa-10. Aceste două secvenţe împreună cu punctul de iniţiere (+1) determină de fapt promotorul şi aşezarea topografică, direcţia de transcripţie (-35…-10…+1). Modificări importante (mutaţii) produse la nivelul acestor secvenţe (numite secvenţe consens) au ca efect abolirea activităţii de promotor. La bacterii, factorul sigma (σ) are rol de recunoaştere a secvenţei promotorului şi de fixare corectă a punctului de iniţiere a sintezei. La E. coli, fixarea polimerazei s-a constatat că are loc în două etape: - ataşarea lejeră a enzimei complete, la secvenţa -35, unde se formează un complex “închis”. - apoi, complexul “închis” este transformat într-un complex “deschis’, când, aprox. 17 pb, începând de la secvenţa -10, se desfac, expunând catena matrice a ADN permiţând introducerea primelor ribonucleotide (necesare sintezei moleculei de ARN) pentru iniţierea sintezei (a transcripţiei). Secvenţa -10 conţine în general, baze AT, care permit desfacerea dublei catene a ADN, cu mai multă uşurinţă decât perechile GC (fig. 87). Figura 87 – Secvenţa -10 (TATA box),formată din baze de complementare T-A,A-T,se desfac pentru a permite transcripţia unei catene de ADN. După ce ARN-polimeraza s-a fixat şi aprox. 8 nucleotide ARN au fost ataşate pe matriţa ADN, factorul sigma (σ) se desprinde de ARN-polimeraza. Enzima core poate continua în aceste condiţii sinteza ARN. În timpul elongaţiei, unde intervine un număr de factori de elongaţie, sinteza catenei de ARN se desfăşoară cu o viteză de aprox. 30 nucleotide pe secundă. Prin urmare, un polimer ARN de aprox. 5000 nucleotide, la temperatura de 370 C, este realizat în aprox. 3 minute. Factorii de elongaţie sunt de fapt proteine a căror structura este cunoscută, însă funcţia lor exactă nu a fost elucidată. Procesul de elongaţie a moleculei de ARN este oprit, în momentul când enzima întâlneşte o altă secvenţă specială în regiunea transcriptibilă a ADN ( de obicei 6A ce vor fi reprezentate în ARN prin UUU…). Această secvenţă a fost denumită terminator. Secveţa terminator reprezintă semnalul terminării sintezei şi la acest punct ARN-polimeraza se desprinde de catena ADN, iar hibridul format din moleculele ADN-ARN se desface, duplexul ADN se reface, iar molecula ARN transcrisă este eliberată în mediu. 135

La eucariote, ARN+polimeraza nu recunoaşte direct promotorul, ci prin intermediul unuia dintre factorii de traanscripţie specifici procesului de sinteză a ARN. ARN+polimeraza se va lega de factorul rspectiv şi nu de secvenţa de ADN. Factorii care iniţiază transcripţia se deosebesc se ceosebesc de factorul sigma pe care îl conţine ARN-polimeraza bacteriană. Factorii de transcripţie formează complexe de transcripţie, relativ stabile, care în mod selectiv atrag moleculele de ARN-polimerază la promotorul de care ei s-au legat. Secvenţa desfăşurării procesului ar fi următoarea: - primul factor de transcripţie care recunoaşte promotorul, în special TATA box, este TFIID (sau TBP); - complexul ADN+TFIID acţionează ca un situs de legare pentru un alt factor: TGIIB care legându-se va stabiliza complexul. Acest factor are acţiune ATP-azică, eliberând energia necesară desfacerii catenelor de ADN, pentru formarea complexului deschis (open); - la acest complex se asociază alţi factori: TFIIE şi TFIIH; - acum, de acest complex se leagă ARN-polimeraza II şi în urma unui proces ATP-dependent începe iniţierea transcripţiei. Iniţierea începe când s-a format complexul de iniţiere, la nivelul promotorului genei ţintă; - la acest complex se asociază un alt factor: TFIIS, care este factorul de elongaţie. Acest factor împiedică terminarea prematură a sintezei ARN. ARN-polimeraza I şi II formează complexe cu factori de transcripţie care se leagă upstream (înaintea punctului de iniţiere) pe când majoritatea factorilor de transcripţie pentru ARN+polimeraza II se leagă downstream (în mijlocul unităţii de transcripţie). Viteza de sinteză a ARN este de 45 nucleotide/secundă. Sinteza (transcripţia) trebuie făcută cu acurateţe pentru ca la nivelul ARN nu există sisteme de corectare a erorilor. Dacă au apărut erori, ARN având un timp de înjumătăţire biologic ( T1/2) relativ scurt, nu pot produce perturbaţii de ordin genetic, (transmisibile) ca în cazul erorilor ADN. Procesul pe etape, prezentat în cazul procariotelor, se pare că este asemănător şi pentru eucariote, cu excepţia că ARN sintetizat este reprezentat de molecule precursor, care necesită a fi procesate. Procesarea, numită ARN splising, este necesară pentru eliminarea secvenţelor intronice, care au fost transcrise în ARN precursor, dar care nu vor mai fi regăsite în secvenţa aminoacizilor din proteinele corespunzătoare.

5.5. ARN splicing În procesul de transcripţie produşii sintetizaţi sunt reprezentaţi de fapt de precursorii ARNt, ARNr şi ARNm (numit şi pre-ARNm). Moleculele de ARN precursor, înainte de a fi exportate în citoplasmă, ca să devină funcţionale sunt supuse la o serie de modificări: tăiere, ordonare şi unire (splicing). Acest proces este necesar pentru ca intronii prezenţi în moleculele precursor să fie eliminaţi şi numai secvenţele exonice să fie unite, pentru a realiza molecula de ARN matur. Procesul trebuie să se realizeze cu mare acurateţe. O eroare produsă, prin introducerea unui singur nucleotid necorespunzător, poate conduce la un ARNm care nu mai poate translata o proteină funcţională. Cercetările experimentale au relevat două aspecte în splicing-ul ARN, şi anume: - self-splicing-ul ARN care a fost pus în evidenţă la nivelul pre-ARNm mitocondrial; - splicing-ul ARN nuclear ce are lor la nivelul pre-ARNm. Odată cu descoperirea intronilor self-splicing, aceştia au putut fi comparaţi cu structura intronilor din pre-ARNm. Din această analiză a reieşit că intronii self-splicing pot fi împărţiţi în două clase: introni de grupa I şi introni de grupa II. Cataliza este realizată de un complex ribonucleoproteic, numit splisozom (spliceosome), care conţine ribonucleoproteine nucleare mici (U1, U2, U5, U4,U6) plus alte componenete.

136

La intronii din grupa I reacţia de splicing începe la o nucleotidă guanodinică (G), iar intronii din grupa II la o nucleotidă adeninică (A). La ambele grupuri s-a constatat că splicingul are lor în urma a două reacţii de transesterificare ( transfer de grupări fosfat ) şi anume: - o adenină (A) din secvenţa intronului, situată aproape de situsul splice 3', realizează un atac nucleofil (prin gruparea terminală 2-hidroxi - de la riboză) la nivelul situsul splice 5', unde molecula de pre-ARNm este clivată. Capătul 5' al intronului devenit liber se leagă covalent de adenina intronului formând o buclă; - în etapa a doua hidroxilul 3' al primului exon, care s-a format în prima etapă, se ataşează la capătul celui de-al doilea exon, unde are loc cel de-al doilea atac nucleofil, rupând molecula de pre-ARNm. În urma acestui atac intronul este îndepărtat şi cei doi exoni care erau separaţi în molecula precursor, se unesc. În felul acesta toţi intronii din molecula de ARN precursor sunt eliminaţi. Genele celulelor de la mamifere conţin mai mulţi introni decât exoni. Mărimea lor este de aprox. 80 până la 10.000 nucleotide sau chiar mai mult. Se pare că intronii reprezintă un „sac” de acumulare a mutaţiilor şi protejează în felul acesta ADN-ul de anumite leziuni. Exonii existenţi se unesc cap la cap şi realizează o moleculă matură de ARNm. Aceste molecule sunt exportate în citoplasmă şi pe baza informaţiei pe care le conţin se face sinteza proteinelor funcţionale. ARNm, prin transcripţie conţine următoarele secvenţe importante: - o secvenţă specifică (5-10 nucleotide) care asigură legarea ARNm de subunitatea mică a ribozomului, numită Ribosome Binding Sequence (secvenţă de legare la ribozomi); - urmată de codonul de iniţiere a translaţiei ( AUG); - secvenţa de nucleotide (codoni) pentru sinteza polipeptidului (proteinei); - o secvenţă terminator (stop) reprezentată de unul din codonii stop sau terminatori: UAA, UGA sau UAG (aceştia nu codifică nici un aminoacid). După transcripţie şi splicing (procesare) ARNm suferă două procese (posttranscripţionale) şi anume: - captarea ARNm în urma căruia se adaugă la prima guanidină (la capul moleculei), o grupare metil (– CH3) în poziţia 5'; - se adaugă o „coadă” de poli (A)+ la capul 31-OH terminal al moleculei. Coada formează un polimer de aprox. 200 Ǻ, fiind realizată de o enzimă numită poli(A) polimeraza. Aceste două procese nu sunt codificate în secvenţa ADN, de aceea ele sunt numite procese post-transcripţionale.

5.6. Asigurarea necesarului de ARNm Genele din genomul celulelor haploide se găsesc într-o singură copie, deci în cele diloide se găsesc în cel puţin două copii. Pentru asigurarea o cantitate suficientă de proteine pentru celulă sau organism, celula foloseşte două moduri de amplificare a ARNm, şi anume: -

gena respectivă va fi transcrisă de mai multe ori şi va rezulta o cantitate mai mare de ARNm; şi/sau - ARNm este folosit de mai multe ori pentru sinteza proteinei respective. În acest caz el va avea un T1/2 mai mare şi nu se va degrada după ce a dat prima copie de proteină. Prin acest mecanism se explică cum gena fibroinei (2 copii/genom) produce în 4 zile 105 molecule de ARNm, iar ARNm produce 1010 molecule de fibroină. Această cantitate formează firele necesare pentru o gogoaşă la viermele de mătase. Sunt gene care codifică un singur tip de proteină, însă ele se găsesc în genomul celular în mai multe copii. Acesta este cazul genelor pentru histone: H1, H2A, H2B, H3 şi H4.

137

Capitolul 6 TRANSPORTUL INTRACELULAR În anul 1976, un grup de cercetători de la Yale University (G.E.Palade, Jamieson, Tartecoff, Sheele şi Berger), studiind mecanismul sintezei zimogenului de către celulele acinoase pancreatice (celule specializate în sinteza şi exportul proteinelor), au reuşit să demonstreze pentru întâia oară, drumul complet al unei proteine (proteină de tip secretor) de la sinteză până la eliminarea sa din celulă, astfel au putut fi diferenţiate fazele: - de sinteză proteică la nivelul ribozomilor; - de concentrare, segregare a proteinelor în cisternele reticului endoplasmatic(RE); - de transport intracelular, prin îmbarcarea proteinelor în vezicule de transport (vezicule carriers) şi dirijarea lor spre complexul Golgi; - de concentrare a proteinelor în vezicule de condensare (la polul apical al celulei, acinul pancreatic); - exportul (eliminarea) proteinelor în lumenul acinului pancreatic. Rezultatele acestor studii au deschis calea cercetărilor în problema transportului intracelular. Treptat s-a dovedit că aproape toate proteinele membranare (cu excepţia unei părţi din proteinele membranelor mitocondriale şi cloroplastice) sunt sintetizate la nivelul ribozomilor. Producţia de proteine în celule este concentrată într-un compartiment anumit denumit citozom (matrice celulară). Din acest compartiment celular de sinteză proteică, proteinele sunt dirijate cu precizie şi cu maximum de eficienţă către circa 20-25 de destinaţii diferite: biomembrane, elemente structurale, conţinutul unor compartimente celulare. Dirijarea precisă a proteinelor non-sintetizate către o anumită destinaţie finală se datorează unei anumite informaţii pe care proteina o poartă în structura sa. Este vorba despre un semnal specific al proteinei (o anumită structură chimică) pentru recunoaşterea respectivei proteine de către un anumit receptor de membrană (situs membranar).

6.1. Sistemul vacuolar intracitoplasmatic Folosirea microscopului electronic a arătat prezenţa intracitoplasmatică a unui sistem complex de membrane, care limitează tubuli, trabecule, vezicule, saci turtiţi sau cisterne .Componenta membranară intracitoplasmatică are o structură trilaminară, cu o grosime variabilă între 50 – 70 Ǻ, caracteristică. Diversitatea, complexitatea şi plasticitatea sistemului de citomembrane constituie un suport structural important în explicarea heterogenităţii funcţionale care caracterizează biologia celulei. Componentele reticulului endoplasmatic păstrează strânse interrelaţii topografice şi funcţionale între ele, ca şi cu toate organitele celulare . Astfel, există o relaţie directă cu zonele aparatului Golgi, elemente ale reticulului constituind membranele saculilor golgieni. Tot elemente ale reticulului endoplasmatic sunt implicate în geneza lizozomilor. Prin legăturile contractate cu membrana celulară plasmatică, cât şi prin comunicarea directă cu membrana nucleară, componentele reticulului endoplasmatic servesc transportului de materiale în celulă; sunt de asemenea, în contact cu mitocondriile, în jurul cărora formează tubuli orientaţi regulat. Aceste observaţii au acreditat ideea că, pe de o parte, între citomembranele sistemului vacuolar şi celelalte membrane celulare (plasmatică, nucleară) există relaţii de continuitate, iar pe de altă parte diferitele tipuri de reticul endoplasmatic se pot transforma unul în altul. Astfel, s-au constatat contacte între reticulul endoplasmatic şi membrana celulară, ceea ce sugerează o continuitate între aceste categorii de membrane. 138

În acelaşi timp, relaţiile de continuitate între membrana nucleară externă şi membranele rugoase, cât şi asemănările ultrastructurale dintre acestea, au permis a se considera că spaţiul perinuclear este o extindere a sistemului vacuolar citoplasmatic. Consecinţele acestor continuităţi sunt importante funcţional. În mod evident, spaţiul perinuclear este în comunicare cu toate regiunile celulei, pe calea cisternelor citomembranelor reticulare. Sunt cazuri când membrana nucleară trimite prelungiri îndreptate către aparatul Golgi Corelaţia de acest tip a permis aprecierea că membrana nucleară poate contribuie la formarea membranelor golgiene. Microscopul electronic a semnalat şi formarea membranelor golgiene netede pe seama membranei nucleare. În afara acestor corelaţii ale membranelor golgiene cu membranele nucleare şi citoplasmatice, frecvent au fost observate continuităţi structurale şi funcţionale ale acestora cu reticulul endoplasmatic cu ribozomi. În apropierea zonelor Golgi, reticulul endoplasmatic capătă aspect vezicular, pierde ribozomii şi se transformă în membrane agranulare netede. Astfel, s-a acreditat ideea unei modificări succesive, ergastoplasma şi reticulul endoplasmatic nuclear fiind aspecte ale aceluiaşi sistem structural endocelular, care corespund la stări funcţionale distincte, iar veziculele mici reprezintă structuri „de transport” care asigură legături funcţionale dintre reticulul endoplasmatic şi aparatul Golgi. După structura sa, sistemul vacuolar citoplasmatic se împarte în reticul endoplasmatic granular (ergastoplasmă), reticul endoplasmatic neted (agranular), acesta în raport cu prezenţa sau absenţa la suprafaţa membranelor a poliribozomilor, aparatul Golgi, ca o diferenţiere a sistemului vacuolar citoplasmatic şi structurile lizozomale.

6.2. Rolul citomembranelor granulare în sinteza proteică O dezvoltare abundentă a citomembranelor granulare se observă în celule angajate activ în sinteza de proteine „de export” (secretorii), cum sunt celulele glandelor salivare, pancreas exocrin. O dezvoltare abundentă a sa se observă în celulele organului Corti, epiteliul tiroidian, nefrocite. Studiile lui George Palade, aduc precizări asupra modalităţii in care reticulul endoplasmatic participă la sinteza proteinelor intracelulare, arătând că la nivelul reticulului endoplasmatic granular sunt sintetizate proteinele „de export”. Rezultatul acestor studii este sintetizat în teoria lui Palade asupra mecanismului sintezei proteinelor secretate, după care, spre deosebire de sinteza proteinelor structurale, al cărui sediu este reprezentat de ceilalţi ribozomi şi se realizează într-un timp lung, sediul sintezei proteinelor secretate este reticulul endoplasmatic granular la nivelul ribozomilor ataşaţi de membrane, într-un timp scurt (până la un minut). După sinteză, proteinele secretate sunt transferate în cisterne, prin sistemul de citomembrane, unde se maturează în timp, de circa 90 minute. După transferul în spaţiul intracisternal, proteinele sunt transferate în zona golgiană.

6. 3. Biosinteza proteinelor sau translaţia ARNm Prin microscopie electronică (Porter şi colab, 1945) şi prin metode biochimice s-a demonstrat existenţa ribozomilor legaţi de membrana reticului endoplasmatic şi rolul major al reticulului endoplasmatic în biosinteza proteică. În celula vie, ribozomii sunt „situsul” sintezei proteinelor. În decursul acestui proces ARNm, cu ajutorul codului său triplet nucleotidic, poartă mesajul ADN şi se fixează de ribozomi. Complexele aminoacizilor-t-ARNm (aminoacil-t-ARN) ”recunosc” acest cod triplet şi aminoacizii se adaugă pe rând, lanţului polipeptidic în creştere. Codul este tradus de ARN-m, care se deplasează traversând ribozomul. În mod simultan, moleculele de ARN-t se eliberează şi complexele noi de aminoacil-t-ARN se fixează pe ribozomi. O serie de factori de natură proteică ce au situsuri de fixare pe ribozomi, favorizează acestora „citire” a mesajelor venite de la ADN, iar la sfârşitul ei polipeptidul se eliberează de ARN-t. 139

6.3.1. Decodificarea informaţiilor genetice În cadrul sintezei proteice se realizează ultima etapă a transferului informaţiei genetice conţinută în secvenţa de baze azotate din ADN. Ea este transcrisă sub formă de mesaj genetic în ARNm şi acesta este tradus, respectiv decodificat, la nivelul ribozomului, dintr-o secvenţă de codoni, într-o secvenţă de aminoacizi. Astfel informaţia genetică din stare potenţială aflată în structura ADN, devine o „realitate” într-o secvenţă de aminoacizi de la nivelul catenelor polipeptidice. Al treilea nivel de transfer informaţional (translaţia) condiţionează convertirea informaţiei din alfabetul cu 4 litere al ARNm (A-U; C-G) în alfabetul de 20 litere, reprezintă cei 20 aminoacizi esenţiali ai proteinelor. Dicţionarul folosit de celulă, în această traducere este reprezentat de colecţia sa formată din cele 54 tipuri de ARNt.(fig. 88).

Fig. 88 - Al treilea nivel informaţional (translaţia) Toate procesele metabolice ale celulei se bazează pe existenţa şi funcţionarea proteinelor care pot avea fie rol structural (colagenul), fie rol metabolic transportor (hemoglobina), fie rol în apărarea organismului (imunoglobulinele), fie rol enzimatic. Până în prezent au fost identificate, la diferite sisteme biologice analizate, peste 100 000 de proteine diferite. Rolul proteinelor în desfăşurarea proceselor vieţii este esenţial. Însăşi structura, dar mai ales desfăşurarea celor două funcţii esenţiale ale materialului genetic – autocatalitică (replicare) şi heterocatalitică (dirijarea de sinteze specifice de proteine sau de alte biomolecule: ARNm, ARNt, ARNr) sunt dependente de proteine precum histonele, 140

proteinele – enzime, în cadrul cărora intră şi cele care au rol hotărâtor în replicarea ADN (polimeraze, topoizomeraze, ADN-ligaze, etc), în transcrierea (ARN polimeraze), în translaţie (factori de iniţiere şi terminare), în recombinare (recombinaze), în repararea leziunilor induse de ADN (excionaze, polimeraze, ADN- ligaze). Este evident că fără participarea proteinelor, materialul genetic nu ar putea să îndeplinească nici una din funcţiile sale. În cadrul biosintezei proteinelor participă deopotrivă acizii nucleici şi proteinele. Pentru sinteza unei singure catene polipeptidice sunt mobilizate sute de alte molecule proteice cu rol structural şi enzimatic. Această intervenţie a unui număr mare de proteine în diferite etape ale procesului decodificării este cerută de o traducere exactă a mesajului genetic. Proteinele sunt polimeri de aminoacizi. Polimerizarea aminoacizi, realizată la nivelul ribozomilor, implică formarea de legături sau punţi peptidice între gruparea carboxil (COOH) a unui aminoacid şi gruparea amino (- NH2) a altui aminoacid cu eliminarea unei molecule de H2O. Formarea de punţi peptidice succesive determină polimerizarea aminoacizi liberi, adică includerea lor într-o catenă polipeptidică care reprezintă structura primară a proteinei . Unele proteine sunt alcătuite dintr-o singură catenă polipeptidică, altele din mai multe catene polipeptidice identice sau diferite, în ultimul caz, informaţia genetică pentru fiecare dintre aceste catene polipeptidice diferite, fiind deţinută de gene diferite, participante în alcătuirea aceleaşi proteine ( o genă – o catenă polipeptidică). La terminarea catenei polipeptidice, aceasta se prezintă sub forma structurii sale primare, reprezentând secvenţe de aminoacizi care a fost determinată de mesajul genetic, adică de secvenţa codonilor din ADN m . Catenă polipeptidică este apoi supusă prelucrării post translaţionale în cadrul căreia ea adoptă o structură secundară prin interacţiunea aminoacizilor săi, în anumite condiţii fiziologice, de t° sau pH, prin intermediul unor punţi de H sau al unor punţi bisulfidice (- S S -). Prin acestea, catena polipeptidică capătă configuraţii spaţiale bidimensionale sau tridimensionale . în urma formării punţilor de H, intercatenare dintre grupările ceto (C = O) şi imino (N = H) ale legăturilor peptidice, rezultând o configuraţie regulată a polipeptidului, cunoscută sub denumirea de configuraţia α - helix al cărui model a fost propus de Linus Pauling pentru care a primit premiul Nobel. Prin răsucirea catenelor polipeptidice asupra lor însele datorită acţiunii unor forţe de atracţie dintre diferite aminoacizi ai catenei polipeptidice rezultă structura terţiară a proteinei . Ea are la bază legături de H, electrostatice, hidrofile sau covalente. Când proteina este alcătuită din mai multe catene polipeptidice identice sau diferite, asocierea lor pentru a alcătui molecula proteică funcţională se realizează, de asemenea, prin intermediul unor asemenea legături şi acest caz proteina se prezintă sub formă de structură cuaternară. Hemoglobina umană normală (HbA) este alcătuită din 2 catene α şi 2β; molecula de insulina este formată din două catene polipeptidice; o catenă A, formată din 21 aminoacizi şi o catenă B formată din 30 aminoacizi; iar molecula de imunoglobulină anticorp are două catene grele (H) şi două uşoare (L) unite între ele prin punţi bisulfidice (- S - S - ) ca şi catenele de insulină. Se înţelege de la sine că pentru îndeplinirea funcţiei sale normale, proteina trebuie să fie normală la toate nivelele sale structurale : primar, secundar, terţiar şi cuaternar, structura primară fiind determinată pentru toate celelalte nivele structurale. Structura şi funcţia proteinelor reprezintă expresia primară a informaţiei genetice. În decodificarea informaţiei genetice rolul primordial îl joacă acizii ribonucleici celulari: ARNm, ARNt şi ARNr . Rolul ARN în decodificarea informaţiei genetice a fost evidenţiat după anul 1950 de către BRACHE T şi CASPERSSON, sinteza proteică fiind însoţită de o creştere considerabilă a cantităţii de ARN în celulă. 141

Toate tipurile de ARN celular sunt sintetizate pe matriţa de ADN, în cadrul căruia există pe lângă genele structurale ce determină informaţia genetică pentru sinteza diferitelor proteine, informaţie ce este transcrisă în ARN m care devine astfel purtător de mesaje genetic, şi gene pentru diferite tipuri de ARNt şi ARNr. Dintre toate cele trei tipuri fundamentale de ARN celular, doar ARNm este tradus în proteină, ARNt şi ARNr îndeplinind însă roluri esenţiale în asigurarea traducerii mesajului genetic din ARNm. Dependenţa sintezei proteice de informaţia genetică din nucleu şi de sinteza diferitelor categorii de ARN celular pe matriţa de ADN nuclear a fost determinată de Brodnet (1955), Mazia şi Prescott (1963) la alga verde unicelulară „Acetabularia mediterranea". Ribozomii asigură interacţiunea ARNm -ARNt în cadrul căreia codonii din ARN m sunt recunoscuţi secvenţial de anticodonii din ARNt - urile corespunzătoare, asigurându-se astfel citirea mesajului genetic . Integritatea structural - funcţională a ribozomilor condiţionează o citire corectă a mesajului genetic şi o traducere fidela a sa într-o secvenţă de aminoacizi. De exemplu, la bacteria E. coli, antibioticul streptomicină interacţionează cu 2 situsuri ale proteinei ribozomale Gu asociată cu ARNr 16G din subunitatea ribozomală mică (30 S) ceea ce face ca ribozomul să nu mai fie funcţional, iar biosinteza proteică să fie stopată. Acest lucru nu se întâmplă însă şi la mutanţii rezistenţi la streptomicină, aceştia prezentând în catena polipeptidică a proteinei ribozomale Gi2 două substituţii de aminoacizi în poziţiile 42 şi 87. Rezultă că această proteină ribozomală este esenţială în împerecherea codon anticodon de la nivelul ribozomului. Folosindu-se agenţi care blochează sinteza ARN m (actinomicina D) s-a demonstrat că sinteza proteică, în aceste condiţii durează atâta timp cât să fie sintetizată circa 1 0 2 0 molecule proteice. Aceasta înseamnă că după folosirea ca mesager pentru sinteza a 10 - 20 catene polipeptidice o moleculă de ARN m este hidrolizată, fiind necesară sinteza (sau adăugarea în cazul sistemului acelular de sinteză (in vitro) a unei noi molecule de ARN m, pentru ca sinteza proteică să poată continua . De astfel, în celulă, în condiţii normale, are loc o „amplificare genetică" indirectă realizată nu prin mărirea numărului de copii ale genei ci prin transcrierea repetatată a informaţiei genetice conţinută de o genă cu sinteza unui număr mare de molecule ale unui ARNm. Astfel, se poate realiza sinteza unui număr mare de catene polipeptidice. Viteza de transcriere a unei gene este variabilă. De exemplu gena triptofansintetazei (enzimă ce intervine în sinteza triptofanului) este de 28 nucleotide pe secundă, iar traducerea ARN m corespunzător se face cu viteza de 21nucleotide/ secundă, la 370 C. Sinteza hemoglobinei umane se realizează cu o viteză de 4 aminoacizi/ secundă la aceeaşi temperatură. Dacă celula vegetală poate să-şi sintetizeze toţi aminoacizi de care are nevoie, celula animală nu poate sintetiza decât o parte dintre ei. Astfel, din cei aproximativ 100 de aminoacizi identificaţi numai 20 intră, în mod obişnuit, în structura celor circa 100.000 de proteine naturale identificate până în prezent, proteine care au specificitate de specie, organ, ţesut, celulă şi chiar organit celular. Pentru celula animală, următorii 10 aminoacizi sunt esenţiali sau indispensabili, adică trebuie să-i primească prin surse alogene (prin hrană, de exemplu), deoarece nu este capabilă să-i sintetizeze singură: lizina, triptofonul, arginina, metionina, leucina, izoleucina, valina, fenilalanina, arginina şi histidina.

142

Aminoacizii: glicina, alanina, serina, cisteina, acidul aspartic, asparagina, acidul glutamic, glutamina, tirazina şi prolina sunt neesenţiale, pentru că celula animală îi poate produce pe diferite căi metabolice, pornind de la aminoacizii esenţiali. Ca orice reacţie de polimerizare şi biosinteza proteinelor se desfăşoară în trei etape ce se succed neîntrerupt: iniţierea, alungirea (sau elongaţia) şi terminarea catenei polipeptidice.

6.3.2.Iniţierea catenei polipeptidice Sinteza unei catene polipeptidice începe cu un aminoacid -N - terminal şi se termină cu un aminoacid - C - terminal. Ordinea includerii aminoacizilor în catena polipeptidică este stabilită de ordinea codonilor din ARNm. Prima etapă în biosinteza proteică este activarea aminoacizilor cu ajutorul ATP, reacţia fiind catalizată de enzima aminoacilsintetaza (numită şi aminoacid ARN t - ligaza) şi care este specifică fiecărui aminoacid. Aminoacilsintetazele sunt enzime cheie în „recunoaşterea" cifrului codului genetic. Aminoacizii nu se pot lega direct la ARN m . Este necesară o moleculă adaptatoare reprezentată de ARN t. Mai are loc ataşarea aminoacidului activat de ARNt corespunzător lui (în etapa a doua), ataşare realizată la gruparea CCA de la capătul 31 al ARNt şi care este catalizată de aceeaşi enzimă aminoacilsintetază, folosind energia rezultată din hidroliza ATP: ATP + H2O ATP + H2O ADP + H2O

ADN + P AMP + PP AMP +P

cu eliberarea a 7 Kcal./mol cu eliberarea a 8 Kcal./mol cu eliberarea a 6 Kcal./mol

Pentru formarea legăturii peptidice se folosesc 0,5 Kcal./mol, restul de energie liberă fiind necesară menţinerii echilibrului reacţiei spre a se realiza sinteza proteică şi nu a avea loc hidroliza proteinelor. Între restul de adenozină (A) de la capătul 31 al ARN t şi aminoacidul activat se formează o legătură covalentă macroergică a cărei energie va fi folosită în reacţia de polimerizare a aminoacizilor:+ AA1+ATP aminoacilsintetază AA1 ~ AMP + P + P AA1 ~ AMP + ARNt aminoacilsintetaza AA1 ~ ARNt + AMP Ataşarea eronată a unui aminoacid la ARN t, altul decât cel care este specific acelui ARN t va fi eliminată prin intervenţia aceleiaşi enzime aminoacil - sintetaza, care prezintă o activitate de corecţie, recunoscând această „eroare" şi hidrolizând legătura dintre aminoacidul greşit ataşat şi ARNt. Este un lucru bine stabilit că deşi există mai multe tipuri de ARN t pentru un acelaşi aminoacid (fapt determinat de caracterul degenerat al codonului genetic), există doar o singură enzimă aminoacil - ARNt – sintetază pentru fiecare aminoacid. Aminoacilarea ARNt catalizată de aceste enzime este un proces riguros controlat deoarece o încărcare greşită a unui ARNt cu un aminoacid necorespunzător are aceeaşi consecinţă ca şi o mutaţie - determinând includerea eronată a unui aminoacid în catena polipeptidică. Aminoacil - sintetazele şi ARNt joacă deci rol esenţial în decodificarea informaţiei genetice.

143

Etapa a treia în iniţierea unei catene polipeptidice se desfăşoară la nivelul ribozomului care prezintă suprafeţe specifice de legare stereochimică a ARNm, ARNt şi a catenei polipeptidice în creştere. Ribozomul asigură de aşa manieră asocierea acestor trei elemente, încât să facă posibilă recunoaşterea codonului din ARNm de către anticodonul corespunzător din ARNt, pe principiul complementarităţii, cu constituirea unei asocieri tranzitorii prin intermediul punţilor de H, asociere care durează până ce aminoacidul legat de ARN t este deconectat de la acesta şi înserat la catena polipeptidică unde rămâne ataşat de aminoacidul precedent, printr-o legătură chimică covalentă — legătura peptidică (fig. 89). Fig. 89 – Schema transmiterii informaţiei: codon (ARN m) – anticodon (ARN t) – aminoacid Proteina ribozomală S1 cu proprietăţi contractile joacă un rol important în realizarea opoziţiei mesagerului (ARNm) şi adaptorului (ARNt) ea asigurând deplierea ARNm atunci când acesta, interacţionează cu ribozomii şi legarea acestuia la subunitatea ribozomală mică 30 S. Iniţierea catenei polipeptidice este asigurată de intervenţia unor factori de iniţiere de natură proteică, denumiţi IF1, IF2 şi IF3. Cu ajutorul unei secvenţe denumită secvenţă leader aflată la capătul S1 al ARNm, acesta se leagă la subunitatea ribozomală mică 30 S, secvenţa leader nefiind tradusă. La acest complex ARNm - subunitatea ribozom de 30 S se ataşează subunităţii ribozomale de 50 S, constituindu-se particule ribozomale întregi (70 S la bacteria E. coli) funcţionale în asigurarea sintezei catenei polipeptidice .Complexul aminoacil ARNt se asociază cu subunitatea ribozom 50 S care prezintă trei situsuri : situsul aminoacil (A), situsul peptidil (P) şi situsul de ieşire - exit - (E). În situsul A pătrunde aminoacil ARN t corespunzător codonului din ARNm recunoscut de anticodonul din ARNt. De regulă situsul P acceptă complexul aminoacil ARNt numai dacă acesta a realizat recunoaşterea codon - anticodon, adică numai dacă a trecut prin situsul A şi apoi a fost translocat în situsul P. Acceptarea se bazează pe unele posibile modificări conformaţionale pe care le-a suferit complexul aminoacil ARN t când a fost în situsul A. La nivelul ribozomului, sinteza tuturor catenelor polipeptidice începe cu metionina, al cărui codon din ARNm este codonul de iniţiere AUG sau, mai rar GUG. Dar, în interiorul catenei polipeptidice metionina este specificată de acelaşi codon AUG . Ca urmare, pentru ca ribozomul să recunoască în mod specific codonul de iniţiere AUG este necesar un semnalul suplimentar de discriminare între AUG iniţiator şi AUG din interiorul mesajului genetic. 144

Acest semnal discriminator este reprezentat de aşa numita secvenţă Shine - Dalgarno, descoperită de Shine şi Dalgrano în anul 1975. Aceasta reprezintă o secvenţă de 7 - 15 ribonucleotide bogate în purine şi aflată în amonte de codonul de iniţiere AUG, fiind complementare cu 3 - 7 baze dintr-o secvenţă de polinucleotide de la capătul 3' al moleculei de ARNr de 16 S din cadrul subunităţii ribozomale mici (30S) . Această interacţiune dintre capătul 3' al moleculei de ARNr 16 S şi secvenţa Shine - Dalgarno din ARN m selecţionează codonul AUG iniţiator şi-1 aduce la nivelul situsului P al ribozomului, fără al mai trece la nivelul situsului A, aceasta fiind unica excepţie, toţi ceilalţi codoni trebuind să treacă mai întâi la nivelul situsului P. În plus, o secvenţă în buclă (hairpird) adiacentă secvenţei Sherie - Dalgarno are valoarea unui semnal suplimentar de iniţiere. O altă particularitate a procesului de iniţiere este folosirea unui ARN t specific de iniţiere ce diferă de omologul său ce interacţionează cu codoni AUG interni pentru metionină . Acest ARN t iniţiator a fost denumit f - metionină ARN tMET la procariote şi i - metionină - ARN t MET la eucariote . După încărcarea ARN tMET iniţiator cu metionină el devine metionil ARN t MET şi este supus unei formulări prin ataşarea grupului formil sub acţiunea enzimei formilază la gruparea NH2 a metioninei aceasta devenind formilmetionină (f - ARN t MET). Formilaza este întâlnită la procariote şi ca urmare doar la aceste organisme primul aminoacid al oricărei catene poliptidice este formilmetionină ARNt iniţiator încărcat cu formilmetianină este singurul ARN t care se leagă direct la situsul P al ribozomului cu ajutorul factorului de iniţiere IF2. Acest f- Met - ARN t se leagă la ARNr 23 S cu o mai mare afinitate decât la orice alt ARNr, ceea ce face să aibă loc selecţia f -Met - ARNt în situsul P. Formilarea metioninei determină blocarea grupării amino, ceea ce face ca ea să nu mai poată participa în vreo reacţie de polimerizare. Ca urmare formil - metionina ocupă poziţia unu a catenei polipeptidice dar oferă restul reactant COOH care unindu-se cu gruparea NH2 a următorului aminoacid, prin eliminarea unei molecule de apă, va forma puntea legătură peptidică. După terminarea sintezei catenei polipeptidice grupa formil de la metianină este îndepărtată prin intervenţia unei enzime de deformilare, iar uneori este îndepărtată însăşi metionina (fig.90).

Fig. 90 - Sinteza proteică: ciclul de elongare al lanţului peptidic.Formarea legăturilor aminoacil – ARNt, formarea legăturilor peptidice,translocaţia (adaptat după Stryger, 1991). 145

6.3.3.Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice O dată formată prima legătură peptidică, ARNt iniţiator, rămas fără aminoacid, părăseşte situsul P. Eliberat, acesta va putea primi cel de-al doilea aminoacil - ARNt care a trecut în prealabil prin situsul A spre a se realiza recunoaşterea codon - anticodon. Se formează cea de-a doua punte peptidică şi translocarea succesivă din A în P permite citirea secvenţială, codon după codon, a întregului mesaj genetic conţinut în ARNm, de către anticodonii complexelor aminoacil - ARNt ce pătrund, de asemenea, secvenţial prin situsul A al ribozomului, selecţia complexului aminoacil ARNt din amestecul de aminoacil ARNt - uri făcându-se în virtutea complementarităţii codon - anticodon. Translocarea succesivă din A în P, însoţită de fiecare dată de formarea unei noi legături peptidice, condiţionează desfăşurarea celei de-a doua etape în biosinteza catenei polipeptidice şi anume elongarea sau alungirea catenei. În alungirea catenei polipeptidice intervin aşa numiţii factori de elongaţie (alungire) care au fost denumiţi EF -Ts şi EF-G, care nu sunt altceva decât proteine ribozomale care se ataşează particulei ribozomale în faza de funcţionare a acesteia în sinteza proteică . Aceşti factori de elongaţie se fixează în subunitatea ribozomală mare (50 S) între proteinele h17 şi h12. EF - T4 şi EF - Ts asigură fixarea aminoacil ARNt pe ribozom iar EF - G determină deplasarea acestui complex la nivelul ribozomului. Funcţionarea unor asemenea factori de elongaţie este dependentă de energia eliberată prin hidroliza GTP. După ce ribozomul a asigurat traducerea a circa 25 de codoni, capătul 5'al ARNm devine liber spre a forma cel de-al doilea complex de iniţiere şi astfel, al doilea ribozom se angajează în traducerea mesajului genetic spre a asigura sinteza unei a doua catene polipeptidice, apoi un al treilea, al patrulea si aşa mai departe, astfel că, la un moment dat, aceeaşi moleculă de ARNm este asociată cu mai mulţi ribozomi, rezultând un polisom sau poliribozom.

6.3.4.Terminarea sintezei catenei polipeptidice Când, în deplasarea sa pe macromolecula de ARNm, ribozomul ajunge cu situsul său A în dreptul unui codon nonsens ( codon de stop sau codon terminal ) în acest situs nu mai pătrunde nici un complex aminoacil - ARNt -, deoarece nu există anticodoni care să recunoască codonii nonsens . Ca urmare, are loc încetarea sintezei catenei polipeptidice. Codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni nonsens sau terminatori care sunt recunoscuţi de factori de eliberare sau de terminare denumiţi TF - Ri, TF - R2 şi TF - R3. Din interacţiunea codonilor nonsens cu factorul de terminare - ribozom, rezultă un complex de terminare care nu mai permite alungirea în continuare a catenei polipeptidice TF - R3 din cadrul acestui complex, acţionând enzimatic la nivelul situsului P, separă grupul carboxil al aminoacidului C terminal de legătura sa cu ARN t printr-o hidroliza. TF - R3 va rupe legătura esterificată a catenei polipeptidice cu ARNt final, aflat în situsul A şi astfel pot fi eliberaţi din ribozom atât catena polipeptidică, cât şi ARN t, având loc totodată disocierea" ribozomului în cele două subunităţi ale sale, proces care este mediat de IF3. Proteinele ribozomale h1 şi h2 sunt implicate în terminarea sintezei catenei polipeptidice pe o cale neelucidată (fig.91, 92).

146

Fig. 91 – Schema sintezei proteinelor la procariote 147

Fig. 92 – Schema sintezei proteinelor la eucariote 148

6.3.5.Particularităţile decodificării la procariote şi eurocariote La procariote, transcrierea mesajului genetic şi traducerea sa pot avea loc simultan, deoarece înainte ca să fie terminată sinteza ARNm pe matriţa de ADN capătul său 5' poate să se asocieze cu ribozomii spre a forma complexul de iniţiere în traducerea sa într-o catenă polipeptidică. ARNm la procariote este policistronic, deoarece aceeaşi moleculă de ARNm poate transcrie mai multe gene structurale ale aceluiaşi operon, purtând mesajul genetic pentru mai multe catene polipeptidice, reprezentând enzime diferite care intervin într-o aceeaşi cale metabolică. De exemplu, în sinteza histidinei intervin 10 enzime-10 gene. La eucariote, transcrierea are loc în nucleu, iar traducerea în citoplasmă unde se află ribozomii. Trecerea mesagerului ARNm din nucleu în citoplasmă, se realizează la nivelul porilor anvelopei nucleare. ARNm la eucariote este monocistronic, fiecare moleculă de ARN purtând mesajul genetic pentru sinteza unei singure catene polipeptidice.

6.4. Mecanismul sintetizate

compartimentării

celulare

a

proteinelor

nou-

Ribozomii, substratul molecular complex pe care se traduce mesajul ARNm în molecule proteice, în celula eucariotă apar ca două populaţii spaţial separate: ribozomii ataşaţi de membrana RE şi ribozomii neataşaţi de membrană, care sunt liberi în citosol (dar şi ei apar legaţi de fibre ce aparţin citoscheletului). Ambele tipuri de ribozomi sunt din punct de vedere structural şi funcţional echivalente. Ei diferă numai prin tipul de proteine pe care le sintetizează (tabelul 2). Diferenţierea este înscrisă în mesajul moleculei de ARNm, într-o secvenţă de nucleotide specială pe care o posedă (secvenţa semnal sau secvenţa leader sau signal peptide). După iniţierea translaţiei proteina cu această secvenţă va orienta ribozomul spre RE, care se va ataşa de membrana organitului. Pe aceşti ribozomii sunt sintetizate numai acele proteine care vor fi introduse în RE, modificate şi care apoi, în cea mai mare parte vor fi secretate (exportate) sau transportate la diferite organite şi la membrana plasmatică. Moleculele de ARNm care nu posedă această secvenţă în structura lor se leagă de ribozomii care vor rămâne în citosol (ribozomii liberi). Pe ei sunt sintetizate toate celelalte proteine, care nu necesită o prelucrare specială (glicolizare, acetilare, etc.) prelucrare care are loc numai în RE şi aparatul Golgi. Tabelul 2. Proteinele sintetizate de diferite clase de ribozomi Localizarea ribozomilor

Ribozomii citoplasmatici legaţi de membranele RE

Ribozomii citoplasmatici nelegaţi de membranele RE(ribozomii liberi )

Clasa de proteine sintetizate - proteine secretate - glicoproteinele pentru membranele :plasmatice, nucleare, RE, aparatul Golgi - enzime lizozomale - enzime ale REG - enzime ale aparatului Golgi - proteine ataşate pe suprafaţa externă a membranei celulare (fibronectina, laminina, colagenul). proteine citoplasmatice solubile proteine ataşate pe suprafaţa externă a membranei celulare (actina, spectrina,) proteine mitocondriale codificate de ADN-ul nuclear proteine peroxizomale - proteine nucleare (histone, lamine)

149

Compartimentarea intercelulară a noilor proteine sintetizate în hialoplasmă are loc în faze separate în timp şi spaţiu. Într-o primă fază considerată a fi compartimentarea primară, proteinele nou sintetizate se împart în proteine care rămân în hialoplasmă, proteine care migrează în nucleu şi proteine care sunt transferate prin membranele intracelulare sau se încorporează în membrane. În faza de compartimentare secundară, dintre proteinele ce se transferă prin membrane unele ies din reticulul endoplamatic şi trec în lizozomii primari, în peroxizomi, în mitocondrii şi cloroplaste şi altele sunt încorporate de membrana celulară. Ca exemplu, vom analiza pătrunderea proteinelor de secreţie în cisternele RE. Cum se cunoaşte din experienţele lui G.Palade, proteinele de secreţie sunt sintetizate de ribozomii ataşaţi de membrana RE şi apoi transferate prin membrana acestuia în interiorul lui. Din cisternele RE, se desprind vezicule pline cu proteinele de secreţie care sunt transportate la aparatul Golgi, unde suferă transformări şi se includ în granulele de secreţie al căror conţinut va fi exocitat. ARNm al unor asemenea proteine „de export”conţine în afară de codonul iniţiator al translaţiei, un codon semnal care, tradus într-un peptid semnal (signal recognition particule SRP) compus din 15-25 aminoacizi, face posibilă joncţiunea ribozomilor funcţionali cu membrana RE. Acestă legătură se realizează datorită unor proteine receptoare (SRP-receptor), care fac parte din structura membranei RE. Asemenea proteine membranare joacă rol de adevăraţi receptori ribozomali. Când peptidul semnal vine în contact cu receptorii membranari, aceştia se mişcă în planul tangenţial al membranei şi se agregă într-un canal sau „tunel” membranar. Asocierea receptorilor membranari stabileşte situsuri de fixare pentru subunitatea mare a ribozomului, care permite tunelului său, cu peptidul în formare, să vină în prelungire cu tunelul membranar neoformat. Astfel peptidul semnal este separat de stratul bimolecular de fosfolipide şi prin tunelul membranar, va intra în interiorul cisternei RE, după care va continua să intre restul lanţului polipeptidic. Dar, în momentul în care peptidul semnal ajunge în lumenul reticulului, o peptidază semnal membranară le secţionează de lanţul peptidic în formare. Sinteza se continuă şi polipeptidul propriu-zis trece în întregime prin tunelul membranar, în cisterna membranară, până la terminarea lanţului. Atunci peptidul va fi liber în întregime în spaţiul intercisternal. Apoi, prin difuzia în planul membranei reticului a receptorilor semnalului, se dezorganizează tunelul membranar de care era legat ribozomul care, se desprinde şi se desface în cele două subunităţi (fig. 93).

Fig. 93- Schema generală a transportului proteinei nou – sintetizate în lumenul reticulului endoplasmatic (RE): 150

1) Proteina fiind în curs de sintetizare, o particulă semnal de recunoaştere (SRP) se leagă de secvenţa semnal a proteinei (signal peptide) şi de ribozom; 2) Complexul format se leagă de receptorul SRP din membrana RE; 3) Proteina, prin secvenţa semnal este inserată în membrană şi translocată în lumen; 4) Complexul ribozom – SRP se disociază şi ribozomul continuă translaţia, iar SRP este deplasat şi reciclat. În concepţia lui G Blobel, formarea „tunelui” transmembranar din proteinele receptoare, scoaterea peptidului - semnal de către peptidază şi segregarea finală a lanţului complet polipeptidic în spaţiul intracisternal al RE sunt considerate ca un program cotranslaţional. Detaşarea ribozomului şi dispersarea proteinelor receptoare ale tunelului în membrană reprezintă fenomene post-translaţionale. În unele cazuri, lanţul polipeptidic în formare are o secvenţă „stop” (foarte hidrofobă) care, trecând prin membrană dezorganizează tunelul şi opreşte transferul lanţului. Aşa se întâmplă cu proteina G a virusului Stomatitis vezicular, care rămâne cu capătul carboxil în afară şi cu cel amino înăuntru. Este interesant cazul proteinelor lizozomale ale fibroblaştilor, care sunt acumulate în RE împreună cu proteinele peroxizomale şi cele secretoare. Aceste proteine sunt eliminate din celule, însă cele lizozomale, care conţin în plus şi carbohidraţi, fiind „recunoscute” de receptorii membranari (aprox. jumătate din numărul lor) sunt reintroduse în celulă prin pinocitoză. Pe de altă parte, se consideră că proteinele lizozomale sunt „sortate” de celelalte proteine în cadrul regiunilor RE pregolgian şi anume, în zona proximă a complexului Golgi. Spre deosebire de proteinele de secreţie, proteinele lizozomale şi cele peroxizomale au” secvenţe de sortare” în plus, prin care, ele pătrund în anumite membrane ce conţin receptori pentru anumite secvenţe şi astfel iau naştere vacuolele cu enzimele lizozomale şi peroxizomale. Citocrom C- oxidaza mitocondrială este constituită din 7 subunităţi proteice, dintre care 4 se sintetizează în citoplasmă şi 3 în mitocondrii. În citoplasmă, se sintetitizează o proteină precursoare peroximală mai mare decât suma celor patru subunităţi, diferenţa reprezentând tocmai suma unor secvenţe „semnal” cu care recunosc receptorii suprafeţei mitocondriale, ceea ce le permit încorporarea lor în membrana internă mitocondrială. După pătrunderea celor 4 subunităţi, aceştia pierd oligopeptidele semnal.

6.5. Corelaţia particularităţilor structurale şi funcţionale ale reticulului endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcţională a celulelor Reticulul endoplasmatic neted prezintă o dispoziţie a elementelor structurale, caracteristică pentru fiecare tip de celulă, particularitatea structurală fiind legată de heterogenitatea funcţională a celulelor respective. Astfel, celulele care sintetizează steroli prezintă un reticul endoplasmatic neted format din numeroşi tubuli ramificaţi şi bifurcaţi, dispuşi într-o reţea complexă în toată citoplasma. În celulele luteinice ale corpului progestativ din ovar, reticulul prezintă numeroase vezicule fenestrate, turtite, în strânsă vecinătate cu mitocondriile. O formă specializată de organizare a reticulului endoplasmatic nuclear se întâlneşte la fibrele musculare striate, unde în jurul fiecărei miofibrile, se găseşte un sistem de tubuli şi cisterne dispuse longitudinal, constituind un sistem perimiofibrilar numit reticul sarcoplasmic (sarcotubuli). Tubulii alungiţi ai reticulului endoplasmatic fuzionează în zona striei H, ca şi în zona benzii Z, în câte o cisternă, aşa încât formează un fel de manşon continuu în jurul miofibrilei, întins între două benzi Z(sarcomer).

151

La acest nivel (banda Z), între două cisterne ale celor două manşoane ale reticulului sarcoplasmic pătrunde o invaginaţie a plasmalemei turtită în plan transversal al fibrilei (tubulul T). În felul acesta, la nivelul benzii Z se formează o triadă, cu două elemente (două cisterne) ale reticulului sarcoplasmic şi un tubul T (fig. 94). Triada aceasta este foarte importantă funcţional şi anume prin tubulii T se transmite potenţialul de acţiune de la suprafaţă la elementele contractile. Fig. 94 - Reticulul endoplasmatic al fibrelor musculare striate (reticulul sarcoplasmic). Tot prin tubulul T, din plasmă intră în reticulul sarcoplasmic ioni de Ca 2+ şi ATP, difuzând uşor prin reticul şi permiţând contracţia musculară . Reticulul uşurează distribuţia rapidă a Ca2+ şi ATP la nivelul miofibrilelor, printre care se găseşte dispus. Manşonul din dreptul benzii A conţine cea mai mare cantitate de Ca2+ şi ATP, necesară tocmai în acest loc unde apare contracţia. În timpul relaxării, Ca2+ se acumulează în cisternele terminale ale reticulului sarcoplasmic şi, de aici trece în tubulii transverşi (T) şi apoi în sarcoplasmă. O altă dispoziţie particulară a reticulului endoplasmatic nuclear este cea de pe faţa internă a membranei plasmatice la neuroni, atât ai vertebratelor cât şi ai nevertebratelor, unde se găsesc vezicule mari, turtite numite cisternele de sub plasmalemă. Aceste cisterne sunt numai în neuroni (nu şi în celulele Schwann sau celulele endoteliale), atât în sistemul nervos central cât şi cel periferic. Structuri asemănătoare se găsesc şi în unele celule senzoriale sau musculare, care generează sau conduc variaţii de potenţial electric. Studiile lui Porter şi Palade asupra reticulului endoplasmatic la muşchii vertebratelor au arătat asocierea acestor cisterne cu anumite locuri de pe plasmalemă prin care stimulii pot ajunge în celule. Cisternele stau, deci, la baza aşa-numitelor locuri senzitive („senzitive spots”). Sarcolema cu cisterne prezintă o permeabilitate selectivă, ionii specifici fiind absorbiţi la suprafaţa membranelor intracelulare ale cisternelor. Cisternele modifică mobilitatea şi concentraţia ionilor la suprafaţa internă a sarcolemei. Asocierea cisternelor cu mitocondriile sugerează că, în asemenea mod, permeabilitatea membranelor este modificată şi transferul de materiale uşurat, datorită energiei rezultată din hidroliza ATP din mitocondrii. O altă formă particulară de organizare a reticulului endoplasmatic nuclear a fost observată în unele celule secretoare ale adenohipofizei, unde tubulii reticulari se dispun concentric, asemănător unui bulb de ceapă secţionat. Aşezate lângă nucleu, aceste formaţiuni au fost numite paranuclei endoplasmici. Formaţiuni asemănătoare au fost observate în hepatocite după administrarea de toxice sau după hepatectonie experimentală.

152

Un tip special de reticul neted a fost descris în celulele stratului pigmentar al retinei, unde ocupă aproximativ 50% din citoplasmă, găsindu-se situat la polul bazal al celulei şi în procesele care migrează între conuri şi bastonaşe. Structurile reticu-lului formează aşa-numiţii corpi mielinici, care au un aspect lenticular biconvex, de 4 - 5µ în axul lung, alcătuiţi din săculeţe turtite, dispuse în stive. Adesea corpii mieloizi sunt grupaţi câte 4 – 5 laolaltă. Asemănarea citomembranelor celulelor pigmentare cu structurile din complexul de fotorecepţie a luminii, permit interpretarea că şi acestea intervenin în metabolismul vitaminei A şi conversia rodopsinei. Pe numeroase tipuri de celule au fost evidenţiată o variaţie cantitativă şi calitativă a reticulului endoplasmatic în cursul desfăşurării procesului de diferenţiere celulară. Astfel, în hepatocitele de şobolan, în ziua a treia prenatală reticulul endoplasmatic neted lipseşte, fiind prezent cel granular, în ziua a opta postnatală reticulul devine de tip neted. Modificările se reflectă în variaţiile raportului ARN/proteină, care scade în favoarea raportului fosfolipoproteic /proteină. Această modificare a raportului este proporţională cu vârsta . Noile membrane sunt, deci, sintetizate în reticulul endoplasmatic granular şi transferate apoi reticulului endoplasmatic neted. Pe lângă fosfolipide şi proteine, citomembranele netede conţin şi enzime. Faptul că celulele a căror funcţie principală este sinteza lipidelor sau sterolilor au un reticul neted dezvoltat au dus la concluzia localizării la nivelul acestuia a enzimelor de sinteză a sterolilor, trigliceridelor şi a altor lipide . A fost atestată, de asemenea şi localizarea enzimelor care participă la sinteza glicogenului. Date experimentale sugerează sinteza la nivelul reticulului endoplasmatic neted a enzimelor detoxifiante, capabile să anihileze acţiuni ale drogurilor (exemplu fenobarbital). Dispoziţia spaţială a reticulului permite considerarea acestui sistem structural, ca un „sistem circular” endocelular, foarte mobil, la nivelul căruia se pot realiza schimburi de substanţe între mediul extracelular şi matricea nucleară. Reticulul endoplasmatic intervine în schimburile ionice între citoplasmă şi nucleu, concomitent cu un intens schimb hidric. Un rol important al reticulului endoplasmatic este hidroxilarea medicamentelor Peste două sute de compusi chimice, printre care fenobarbitalul şi hidrocarburile polichimice declanşează in vivo un efect inductor asupra enzimelor microzomale (microzomi = fracţiuni heterogene cuprinzând fragmente din membranele reticulului endoplasmatic, membrana nucleară, membrana plasmatică, ribozomi), iar în unele cazuri produc chiar o amplificare genică a unor enzime implicate în apărarea organismului.

6.6. Segregarea şi concentrarea proteinelor Studii efectuate cu 3H – leucină în pancreas au stabilit că proteinele sintetizate în ribozomi (reticulul endoplasmatic granular) sunt trecute apoi în reticulul endoplasmatic neted. S-a stabilit că în reticulul endoplasmatic granular se sintetizează două tipuri de proteine: o proteină „secundară”, într-un ritm scăzut şi o proteină „exportabilă”, cu un „turnover” foarte rapid. În vecinătatea aparatului Golgi ergastoplasma pierde ribozonii şi membrana devine netedă. Reticulul endoplasmatic neted astfel format se veziculeză, constricţiile fiind un stadiu în detaşarea de microvezicule libere, care sunt identice cu acelea din vecinătatea dictiozomului. Conţinutul veziculelor trece apoi în vacuolele de condensare, mecanismul intern fiind încă discutabil. Observaţiile au sugerat cel puţin trei căi: 1) fuzionarea veziculelor cu cisterne ale dictiozomilor; 2) fuzionarea veziculelor cu vacuole de condensare; 3) fuzionarea unor microvezicule Golgi formând o vacuolă multiveziculată la care membranele vor forma membrana limitantă a vacuolei de condensare. 153

În vacuola de concentrare proteinele suferă un proces de concentrare în granule de zimogen printr-un mecanism încă neclar (probabil printr-un proces de deshidratare, apa acumulându-se în săculeţii care se umflă). Proteinele granulelor de zimogen sunt reprezentate de o serie de enzime condensate care se descarcă la exterior prin pinocitoză inversă.

6.7. Sinteza şi secreţia polizaharidelor Sinteza zaharurilor complexe, cum este glicogenul, are loc la nivelul citoplasmei fundamentale. În schimb, sinteza glicoproteinelor şi mucopolizaharidelor se efectuează în aparatul Golgi. În formarea granulelor de diferite glicoproteine a fost formulată părerea că există două etape: într-o primă etapă, datorită unei transferaze, în reticulul endoplasmatic pătrund N – acetilgalactozomină şi monozohexozomină, care se leagă de lanţul polipeptidic sintetizat la acest nivel. Vacuolele transportoare duc aceste proteine la care s-au adiţionat grupări glucidice, la aparatul Golgi, unde într-o a doua etapă, se adiţionează galactoza, fructoza, manoza şi acidul sialic, în circa 5 minute. O localizare în timp în diferite formaţiuni ale aparatului Golgi a fost observată şi pentru sulful radioactiv 35S injectat ca SO4Na2, acesta apărând mai întâi în dictiozomi şi apoi în granule de mucus. Detectarea mucopolizaharidelor acide s-a făcut, de asemenea, numai la nivelul zonei Golgi, care asigură formarea proteinelor în vacuolele din concavitatea cisternelor şi în granulele de secreţie. În formarea lipoproteinelor, sinteza iniţială este asociată cu reticulul endoplasmatic, membranele golgiene având rolul de a uni produşii separaţi (proteine – lipide) într-o moleculă mare – complexul lipoproteic. Întrucât produşii secretaţi de aparatul Golgi au un caracter variat, se apreciază că această zonă posedă mecanisme speciale pentru formarea de entităţi macromoleculare. Ca atare, complexul de membrane al aparatului Golgi nu poate fi privit numai ca un compartiment de pasaj al unor tipuri de molecule, ci ca pe un compartiment la nivelul căruia are loc o activitate enzimatică mult diferită şi o complexare a moleculelor mici într-o moleculă mare. Aceste complexe macromoleculare specifice sunt formate din combinaţii între proteine, hidraţi de C şi lipide. Reacţia de sulfatare este interpretată tot ca o formă specială de complexare. Produsul care urmează să fie secretat va suporta apoi o remaniere suplimentară după detaşarea veziculelor din săculeţii golgieni. Produsul secretat se prezintă ca material diferit (enzime, mucus, înveliş celular, hormoni etc.). Granule dense la fluxul de e- (ME) au fost observate şi în zonele golgiene la numeroase tipuri de celule neurosecretoare, considerându-se neurosecreţia ca produs al lamelelor golgiene. Se precizează ca la acest nivel membranele aparatului Golgi joacă rolul de „complexare”, folosind şi materialul sintetizat în reticulul endoplasmatic. Un rol particular al aparatului Golgi este evidenţiat în formarea acrozomului din spermatozoid, care are o poziţie supra nucleară. La nivelul spermatocitelor s-a evidenţiat apariţia unor granule proacrozomale în zona centrală a aparatului Golgi, care, prin fuzionare, dau naştere acrozomului matur. S-a evidenţiat de asemenea, rolul reticulului endoplasmatic in elaborarea unor vezicule care, fuzionând cu lamelele golgiene, furnizează cel puţin o parte din materialul acrozomal. La contactul cu ovulul şi sub influenţa acestuia, acrozomul suferă o serie de transformări variabile dar care includ eliberarea de substanţe litice care participă la liza structurilor rezistente ale ovulului faţă de pătrunderea spermatozoidului. Complexul golgian este, structural şi funcţional, legat de reticulul endoplasmatic şi, aşa cum e arată polaritatea lui, endomembranele se modifică într-un flux continuu de la reticul spre membrana celulară. În cursul acestui flux membranar, aparatul Golgi transferă şi concentrează proteinele, neoformează materiale membranare, sintetizează polizaharide şi 154

glicoproteine. Participarea aparatului Golgi la formarea noilor membrane celulare a fost considerată de unii autori ca o funcţie principală a sa. S-a acreditat ideea unui circuit intracelular al subunităţilor membranare hialoplasmice care participa la formarea veziculelor transpoare ce se desprind din reticulul endoplasmatic, apoi imbogatesc membranele golgiene, reinoindu-le permanent, fiind posibila formarea vacuolelor de secretie, care, in final, se deschid la exteriorul celulelor. Aceste vacuole se fragmenteaza dupa exocitoză in vezicule mici prin a caror dezorganizare se reface stocul subunitatilor membranare din hialoplasma. Secreţiile solide. Aparatul Golgi îndeplineşte un rol şi în secreţiile solide şi anume, astăzi este dovedit că participă la formarea pereţilor celulozici ai plantelor prin sinteza celulozei.

6.8. Lizozomii Sunt structuri tranzitorii din multe celule, limitate la o membrană, care includ o serie de hidrolaze acide. Ei se găsesc în hepatocite, pe lângă canaliculii biliari şi abundă în macrofage, histiocite, granulocite, la diferite alge unicelulare, granulele vitelusului proteic (în faza când cristalizează proteinele sunt tot formatiuni lizozomale). Tot o activitate litică au şi veziculele golgiene, ca de exemplu din glanda multifidă de melc. Sinteza enzimelor lizozomale are loc în poliribozomii reticulului endoplasmatic, de unde trec pe faţa distală a aparatului Golgi formată din saculi şi tubuli anastomazaţi. De aici, prin înmugurirea acestora, se formează lizozomii.

6.8.1. Funcţiile lizozomilor Rolul lizozomilor primari este de a aproviziona cu enzime fagozomii sau autofagozomii, transformându-i în vacuole heterofagice, respectiv autofagice sau să elimine la exterior conţinutul lor, în realizarea unei „digestii externe”, ca în cazul diferitelor glande de la vertebrate (fig. 95).

Fig. 95 - Clasificarea dată de Ch. de Duve funcţionalităţile lizozomilor 155

Endocitoza diferitelor particule sau pinocitoza lichidului extracelular se face cu participarea filamentelor mecanocontracţiilor sub-membranare (fig. 96). Particulele care aderă la suprafaţa membranei celulare, imobilizează proteinele acesteia, crescând permeabilitatea Na+ care intră în celulă şi provoacă depolarizarea membranei. Unda de depolarizare eliberează Ca2+ din reticulul endoplasmatic.

Fig. 96 - Dinamica endocitozei; desfăşurarea procesului este figurată de la stânga la dreapta: sub acţiunea Ca++ filamentele contractile de sub membrana celulară realizează înglobarea unei particule care intră în citoplasmă, înconjurată de membrana respectivă. Circulând în citoplasmă se încarcă cu enzimele lizozomale, transformându-se în heterolizozomi, după care corpii reziduali pot fi excretaţi printr-un mecanism în care proteinele mecanocontractile, sub acţiunea Ca++, se depărtează de faţa internă a membranei şi uşurează astfel deschiderea vacuolei în exterior În prezenţa Ca2+ are loc reunirea actinei cu miozina şi formarea actomiozinei, proces care este însoţit de contracţia microfilamentelor respective in sensul invaginării membranei celulare. Astfel, fagozomul iniţial, a mică invaginare ce conţine o mică parte din mediul extern, este separat de citoplasmă printr-o porţiune din membrana plasmatică. Glicocalixul ei, devenit interior, se separă de membrană formând în interiorul fagozomului o masă amorfă, polizaharidică, care apoi dispare. După pierderea glicocalixului fagozomul suferă o deshidratare, nu mai are formă sferică, migrează prin căile microtubulare de-a lungul citoplasmei şi se fragmentează. Fogozomul se poate deschide la exterior (regurgitare), sau se asociază cu lizozomii primari devenind vacuole heterofagice. Vacuolele heterafagice pot acumula coloranţi şi medicamente din mediul extracelular. 156

Astfel, clorochina, acumulându-se în heterolizozomii plasmodiului malariei, determină ruperea membranei şi enzimelor lizozomale distrug parazitul. În mod normal, particulele captate prin fagocitoză sunt digerate în vacuole heterofagice şi componentele lor trec prin membrana lizozomală în citoplasmă, hrănind celula. La fel sunt digerate bacteriile de către leucocitele neutrofile şi macrofage şi sunt degradate substanţele toxice şi medicamentoase, prin aceasta detoxificându-se organismul. Enzimele lizozomale eliminate în afara celulelor permit unor celule să-şi croiască drum printre zone tisulare compacte şi greu de străbătut. Se ştie că una din proprietăţile fundamentale ale celulelor este de a-şi reînnoi permanent structurile lor funcţionale. Acest proces are loc pe trei căi: prin hidrolazele nelizozomale din nucleu şi citoplasmă; prin enzimele lizozomale care ies din lizozomii primari şi digeră structurile respective; prin autofagie. Autofagozomii care se formează în ficat şi rinichi distrug permanent organitele celulare în mod constant, metabolismul celulelor refolosind în acelaşi timp materialele acestora în sinteze ulterioare. Vacuola autofagică se constituie din contopirea unui autofagozom cu lizozomii primari. Autofagozomul ia naştere prin circumscrierea unei porţiuni de citoplasmă cu organitele respective de către membranele cisternelor reticulului endoplasmatic sau ale saculilor golgieni; în alte cazuri, rezultă din contopirea mai multor vacuole endocitare. Când autofagozomul s-a format, în el se varsă conţinutul enzimatic al lizozomilor primari. În circa 300 de zile mitocondriile unui hepatocit se reînnoiesc de aproximativ 30 de ori, ceea ce înseamnă că într-o celulă o mitocondrie este distrusă la fiecare 15 minute. În cursul ontogeniei, autofagia unei structuri constituie un mecanism care influenţează integralitatea organelor, curburile encefalului, individualizarea falangelor, formarea rinichiului, dispariţia cozii larvare la anure, etc. Tot prin autofagie se limitează extinderea unor procese degenerative (ale hepatocitelor şi celulelor pancreatice de actinomicină – inhibitor al sintezei ARN) etc. Celulele unui animal supus la inaniţie se nutresc prin autofagia propriului conţinut, iar celulele moarte sunt lizate de enzimele lizozomale proprii. Când organismul nu mai are nevoie de anumiţi hormoni atunci glandele care le elaborează distrug prin autofagie granulele de secreţie respectivă. Ceea ce rămâne nedigerat în hetero-fagozomi şi autofagozomi apare sub forma unor figuri mielinice, pigmenţi biliari, feritine, lipofuxime etc. Rezultă aşa-zişii „corpi reziduali” care pot să-şi elimine de foarte multe ori conţinutul afară. Faptul că enzimele lizozomale nu digeră membrana lizozomilor s-ar putea datora rezistenţei învelişului propriu glicoproteic de pe faţa internă a membranei lizozomale. Fig. 97 - Funcţiile peroxizonilor 157

Sunt cazuri când membrana lizozomală este distrusă prin diferiţi factori externi (şocuri traumatice, anoxie, endotoxine, virusuri, praf de cărbune etc.). În maladii ca pneumoconiozele (leziuni pulmonare, ale branhiilor, scleroza parenchinului pulmonar) datorită inhalării de C, Be, Si, Zn – se produc lize ale membranei lizozomilor, iar enzimele eliberate omoară celule. Într-o serie de maladii genetice, fie membranele lizozomilor fuzionează dând lizozomi mari de 2 – 5 µφ, permeabili ce produc scăderea rezistenţei organismului la infecţii, spleno şi hepatomegalie, albinism, fotofobie, iar la copii moartea rapidă, fie, sunt cazuri când nu se mai pot transcrie mesaje pentru o serie de enzime lizozomale (glucozidaze, sfingomielinaze, galactizidaze) astfel că, o serie de substanţe ce pătrund în lizozomi, negăsind enzima respectivă responsabilă de hidroliza lor, se acumulează in cantitate mare într-o serie de celule, cu diferite consecinţe chimice.

6.9. Peroxizomii Sunt corpusculi de 0,5 µφ formaţi dintr-o membrană şi o matrice, iar uneori cu formaţiuni poli-şi multitubulare, denumite nucleoizi sau o placă marginală mai densă la primate. În peroxizomi se întâlneşte catalaza care distruge H2O2 cu producere de H2O, fie prin oxidarea unui substrat redus, fie când donorul de O2 este H2O2 . Peroxizomii produc o cantitate mică de energie, reglează catabolismul glucozei, jucând rol în gluconeogeneză, sintetizând glucoza din precursori neglucidici, intervenind şi în sinteza sterolilor (fig. 97).

6.10. Proteinele chaperone Studiile de specialitate şi biologie moleculară din ultimii ani au demonstrat, pe un număr mare tot mai mare de organisme procariote şi eucariote, existenţa unei clase speciale de proteine cu rol esenţial în viaţa celulei. Aceste proteine au fost denumite „proteine chaperone” sau „chaperoni moleculari”, ceea ce înseamnă „proteine de însoţire” deoarece intervin pe tot parcursul sintezei celorlalte proteine din organisme, post-translaţional, determinând conformaţia structurală normală, starea corectă de pliere şi agregare finală a acestora şi implicit, funcţionarea normală corespunzătoare; ele reactivează proteinele legate după stres şi au rol de catalizatori prin creşterea vitezei de înfăşurare a proteinelor, ajutându-le astfel să-şi găsească o structură terţiară stabilă. Proteinele charperone au capacitatea comună de a-şi regla propria asamblare şi pliere (împăturire) motiv pentru care au fost numite şi autofoldaze. Cunoaşterea acestei noi clase de proteine a permis în ultimii ani deschiderea unor noi căi în abordarea şi înţelegerea proceselor celulare survenite în condiţii de stres, senescenţă cât şi în fenomenele degenerative tip boli prionice .Datele acumulate pledează pentru existenţa unui număr foarte mare şi complex de proprietăţi funcţionale ale acestor proteine. Cercetările efectuate în ultimii 25 de ani au demonstrat că există o uniformitate izbitoare în modul în care diferite organisme răspund la diferite forme de stres. Răspunsul la stres implică alăturarea transcrierii unui set anumit de gene care codifică pentru proteinele de şoc termic (hsp) numite şi „proteine de stres”. Dintre acestea cea mai cunoscută la bacterii este proteina de şoc termic hsp70k1. Aceste proteine de stres ajută celulelor supuse stresului să-şi menţină proteinele într-o conformaţie corectă, ajută ca aceste proteine să fie translocate către diferite organite celulare (transport 1

kilodaltoni

158

vectorial), şi ghidează atât proteinele normale nou-sintetizate, cât şi pe cele anormale, să atingă o conformaţie normală. Proteinele de stres joacă un rol important şi în condiţii de nonstres, anume în perioada de diferenţiere celulară, creştere şi dezvoltare. În condiţii de stres pot să apară proteine împăturite, sau o mare cantitate de proteine nascente neâmpăturite; aceste stări declanşează imediat răspunsul „la stres”, sugerând deci că o proteină anormal împăturită reprezintă componentă cheie a procesului de recunoaştere a stresului de către celulă. Răspunsul la stres este reglat în principal la nivel de transcriere, deşi, în unele cazuri, au fost deschise şi reglări la nivel de translaţie. Modul în care celula este capabilă să sesizeze acumularea intracelulară de proteine anormal împăturite,declanşând procesul de transcriere/translaţie a proteinelor de stres nu este încă bine cunoscut. În celula eucariotă, reticulul endoplasmatic (RE) se comportă ca nu senzor ce captează toate variaţiile în condiţii de stres (metabolismul calciului, potenţialul redox, proteinele semiîmpăturite din lumenul şi membrana RE. Proteina chaperone grp94 este cea mai abudentă dintre toţi chaperonii din RE (în proporţie de 50%) şi aparatul Golgi, corespunzându-i în citoplasmă proteina chaperone hsp90. Se pare că grp94 este o glicoproteină transmembranară (hidrofobă şi cu afinitate pentru lipide); est considerată drept „marker de stres”. În aceste condiţii, grp94 se redistribuie în aparatul Golgi, cantitatea ei creşte în nucleu şi este secretată parţial în mediul extracelular. Studiile asupra redistribuirii proteinei grp94 în condiţii de stres au adus lumină asupra înţelegerii patern-urilor de glicolizare ale grp94 modifică după stresul celular. Proteina chaperone hsp90 este de asemenea implică în protecţia microtubulilor şi a filamentoase citoplasmatice faţă de stres (şoc termic). Dintre proteinele de stres, cele mai cunoscute sunt proteinele de şoc termic hsp (heat shock protein). Proteinele hsp se diferenţiază între ele prin greutatea lor moleculară (exprimată în kda): hsp60, hsp70, hsp90. Proteinelor chaperone li se atribuie multiple funcţii: -

protecţia celulară crescută în condiţii de stres, acordând termotoleranţă. Hsp90 protejează proteinele ţintă de proteoliză şi le asigură înmagazinarea;

-

determinarea stării de împăturire,asamblare/dezasamblare a proteinelor non-sintetizate; chaperonii hsp60 şi hsp70 au rol în împăturire, translocaţie, asamblare, stabilitate; hsp90 are rol în reglarea, activitatea factorilor de transcriere şi a activităţii kinazelor proteice. Hsp90 constituie 1-2% din totalul proteinelor citoplasmatice. Această proteină a fost deschisă atât la procariote cât şi la eucariote. Formează complexe mari citosolice cu numeroşi alţi chaperoni;

-

traficul proteinelor (transport vectorial); la procariote s-a demonstrat existenţa unui sistem de proteine chaperone care acţionează succesiv, într-o reacţie în lanţ, având rol vital în sinteza, translocaţia, plierea şi funcţionarea normală a proteinelor nou-sintetizate. La eucariote, proteina chaperone hsp70 are rol în sortarea proteinelor anormale, dar şi a anumitor proteine normale (cu viaţă scurtă) atât la procariote cât şi la eucariote;

-

asamblarea complexelor ribonucleoproteice a ribozomilor. Hsp90 se asociază cu fibrele de ribonucleoproteine modulând stuctura ARN-ului;

159

-

biogeneza mitocondriilor şi peroxizomilor. Chaperonii, prezenţi în toate organismele, au rol şi în biogeneza unor structuri macromoleculare. Dintre aceştia, proteinele hsp60 şi hsp70 s-au dovedit a avea rol în biogeneza mitocondriilor. Proteinele hsp70 au rol şi în stabilizarea citosolica a proteinelor peroxizemale.

-

răspunsul imun; faptul că proteinele chapenare au potenţialul de a-şi creşte sinteza şi in condiţii de stres, ar explica în mare măsură , rolul în imunogenitate. Într-un număr mare de infecţii (bacteriene şi parazitare cu protozoare şi helminţi) moleculele chaperone devin ţinte imune proeminente pentru celulele T. Au fost deschise drept ţinte imune proteinele hsp10 de la Mycobacterium leprae şi proteinele hsp60 şi hsp70 de la Mycobacterium leprae şi M. tuberculosis;

-

replicarea ADN-ului la virusuri, procariote şi eucariote. Chaperonii au rolul în menţinerea stării de răsucire moderată a moleculelor de ADN; în această stare, ADN-ul poate fi uşor antrenat în activitatea de transcriere, replicare, recombinare. Hsp90 este implicat în asamblarea diferitelor complexe virale (complex ARN reverstransciptaza);

-

asamblarea şi reglarea activităţii receptorilor pentru hormonii steroizi.Hsp90, prin legarea de receptorii pentru hormonii steroizi, face ca acestora să se menţină în stare parţial despăturită capabilă de a fixa hormonul respectiv;

-

rolul protector în SNC. Unele observaţii sugerează că hsp exercită o acţiune de citoprotecţie asupra SNC ca urmare a răspunsului la stres. Stresul excitator este mediat de scăderea cantităţii intracelulare de glucoză, activitatea kinazei, scăderea pH-ului intracelular, clivajul proteolitic al proteinelor structurale şi prezenţa de radicali liberi mediaţi de denaturarea proteinelor. Starea toxică este potenţată de eliberarea continuă de glutamat după producerea leziunii iniţiale. Toate aceste procese sunt implicate în producerea răspunsului de tip proteine şoc termic (hsp). Cel mai mare rol protector îl au proteinele din familia hsp70. Proteinele hsp70 sunt prezente în ţesutul nervos şi în condiţii de nonstres. Aceste proteine hsp70 reprezintă o proteină asociată cu microtuburi şi implicată în transportul axonal lent. Hsp70 se leagă de ATP, având o slabă acţiune ATP-zica; poate fi fosforilată în prezenţa unui înalt nivel de calciu. Mecanismul protector al hsp se pare că este legat de combinarea acestora cu proteazele, fosfolipazele, kinazele sau receptării controlul transmiţătorilor, având drept rezultat atenuarea efectelor distructive.S-a demonstrat că insulina induce producerea de proteine hsp70;

-

intervin în procesul de dezvoltare celulară. Date recente (Cyermely şi Colab, 1998) arată că funcţia majoră a hsp90 pare a fi participarea acesteia la omogenizarea, menţinerea şi remodelarea arhitecturii celulare (citoscheletul). Hsp90 şi grp94 intervin în ciclul celular şi diferenţierea celulară (hsp90 intervine dezvoltarea neurală, retiniană, osoasă, musculară). Hsp90 se asociază cu nucleolii, cu fibrele de ribonuleoproteine ale pericromatinei , modulează stuctura ADN-ului nuclear, a ARN-ului şi proteinelor . Se ataşează de ADN desfăşurând activitate de tip topoizomerază şi nuclează, regenerează ADN-ul după şoc termic; prin formarea complexelor ADN-hsp90-histone, din cursul mitozei, proteina hsp face posibilă asamblarea centrozomilor, rearanjările majore în structurile nucleare în cursul oogenezei şi embriogenezei precoce.

Hsp90 şi grp94 intervin în apoptoză şi în procesele de îmbătrânire celulară; aceşti caperonii oferă celulei protecţie faţă de factorii de necroză a tumorilor (TNF) şi faţă de leziunile oxidative.

160

Capitolul 7 REPRODUCEREA CELULARĂ Creşterea organismelor şi transmiterea caracterelor ereditare de-a lungul generaţiilor au la bază o caracteristică fundamentală a materiei vii - reproducerea. La nivel celular, reproducerea se realizează prin forme diferite. Reproducerea celulelor eucariote are loc printr-un proces complex denumit diviziune celulară, în urma acestui proces, celula parentală se divide, dând naştere la două celule fiice. Diviziunea celulară implică desfăşurarea unor evenimente celulare replicative, prin care se realizează duplicarea constituenţilor celulari şi distributive, ce asigură partiţia constituenţilor celulei în celulele fiice. Apariţia unor descendenţi celulari cu acelaşi potenţial genetic reclamă exercitarea unui riguros control asupra replicării şi distribuirii materialului genetic. Procesul distributiv al moleculelor ADN se realizează prin mecanisme specializate, la eucariote cele mai frecvent întâlnite fiind mitoza şi meioza. Mitoza este caracteristică celulelor somatice şi asigură o repartizare egală în celulele fiice a materialului genetic replicat. Meioza este întâlnită la celulele germinale. în urma meiozei se formează 4 celule fiice (gameţii), fiecare prezentând o jumătate din informaţia genetică a celulei parentale. Prin fuziunea gameţilor (spermatozoidul şi ovulul) ia naştere oul fecundat din care se dezvoltă ulterior întregul organism multicelular. Acest capitol îşi propune să prezinte principalele etape ale reproducerii celulare şi mecanismele de control implicate în desfăşurarea acestui complex proces.

7.1. Ciclul celular Reproducerea celulară implică evenimente multiple şi complexe ce se succed ciclic şi care constituie ciclul celular. Funcţie de compartimentele celulare în care se desfăşoară aceste evenimente se disting două componente ale ciclului celular: ciclul cromozomial şi ciclul citoplasmatic. În ciclul cromozomial dublarea cantităţii de ADN alternează cu mitoza; în ciclul citoplasmatic are lor dublarea numărului de organite celulare şi citokineza.

7.1.1. Ciclul celular la plante La plantele superioare rata ciclurilor celulare este invers proporţională cu temperatura (5 – 30o), la fiecare interval de temperatură diferite faze ale ciclului rămânând constante ca cinetică. Iniţierea replicării genomului depinde de o sinteză proteică prealabilă, care este inductoare pentru nucleii cu capacitate de replicaţie; această capacitate pare a fi coordonată de prezenţa intranucleară a ADNr, adică a segmentului genomic ce transcrie ARNr (organizatorul nuclear). Duplicarea cromozomilor nu pare să fie în legătură cu distribuţia lor, fiind posibile mitoze fără duplicarea cromozomilor sau duplicarea fără mitoze, ceea ce duce la endoploidii. O altă sinteză proteică are loc la începutul fazei G2, fiind necesară condensării cromozomilor profazici. Sinteza care are loc chiar în profază este necesară desfăşurării mitozei şi dacă ea lipseşte celulele revin în interfază . o

7.1.2. Ciclul celular la animale Ca şi la plante, cea mai mare parte a ciclului celular de la animale este reprezentată de interfază, adică de perioada de la sfârşitul unei diviziuni şi începutul următoarei. 161

Nucleul nu prezintă în interfază transformări vizibile la microscopul fotonic, în schimb, citospectrofotometric, se poate detecta, după reacţia Feulgen pentru AND, dublarea a acestuia, ca şi a histonelor (fig. 98). Interfaza Faza G1. Urmează mitozei şi durează 5 – 10 ore la mamifere . În cursul ei nu se înregistrează noi sinteze de ADN şi celulele conţin cantitatea de ADN caracteristică speciei sa ţesutului respectiv . La om (46 cromozomi), cantitatea de ADN a nucleilor diploizi este de 6,8 x 10 –12g, cantitate care rămâne constantă în decursul perioadei G1. Fibra nucleozomală unitară, de aproximativ 250Å diametru, formează în anumite locuri de-a lungul cromozomilor împachetări mai voluminoase, denumite cromomere în raport cu proteinele matriceale. Aglomerarea mai multor cromomere dă naştere blocurilor de heterocromatină. Fibrele de cromatină dintre blocurile heterocromatinice sunt mai puţin împachetate, constituind eucromatina. Biosinteza proteică depinde de activitatea genică transcripţională din eucromatină, care elaborează diferiti mesageri sub formă de ARN m ce servesc după aceea în biosinteza proteică citoplasmatică . Faza S . Durează 6 – 8 ore, în cursul căreia cantitatea de ADN se dublează . Această replicare necesită separarea celor două lanţuri de ADN în punctele de iniţiere. Fiecare lanţ serveşte ca model complementar al altuia nou care se sintetizează enzimatic . Marcajele cu 3H – timidină a unor culturi celulare sincronizate arată că încorporarea „marcajului” (3H timidină) are loc în primele 10 minute ale fazei şi apare pe autoradiografii la periferia nucleului şi nucleolului. Rata replicării helixului de ADN de la mamifere este de 0,5 – 1 µ / minut, raportul dintre lungimea cromatinei cu fibra unitară de 250 Å diametru şi lungimea ADN este la nucleii umani de 1 : 4.

Fig. 98 - Ciclul celular şi mitoza celulei animale 162

În această perioadă sintetică cantitatea de ADN creşte de la nivelul diploid 2n, trecând prin etape intermediare: 2,5C; 3C, 3,5C până ajunge la nivelul 4C, moment în care, prin mecanisme foarte exacte de reglaj celular, încă necunoscute, este încetată încorporarea de 3H timidină. Celula şi-a dublat cantitatea de ADN; iniţială în vederea repartizării aceleiaşi cantităţi 2C, de ADN în celulele fiice, respectiv aceleiaşi cantităţi de informaţie genetică. Prin ţinerea materialului biologic în contact cu 3H – timidină pentru durate diferite de timp presupuse a corespunde începutului, mijlocului şi sfârşitului perioadei S, se evidenţiază autoradiografic o replicare timpurie, mijlocie şi târzie (tardivă) a unor segmente cromozomale sau cromozomi întregi ai complementului unei celule sau specii. Când materialul biologic este ţinut mai puţin timp în contact cu izotopul, se constată că numai anumite părţi ale cromozomilor metafazici vor apare radiografic ca „grain-uri” (puncte) de încorporare a acestuia. Acestea sunt segmentele eucromatice ale cromozomilor; care au deci replicare precoce, la începutul perioadei S. Când materialul biologic stă mai mult timp în contact cu trasorul, corespunzând la 1 / 2 sau 2/3 din stadiul S, se constată că cea mai mare parte a cromozomului metafazici ca şi cei mai mulţi din cromozomii complementului prezintă marcaj radioactiv, puţine segmente, respectiv cromozomii, rămânând totuşi nemarcaţi. Acestea sunt segmente heterocromatice, respectiv cromozomi cu replicare tardivă. Când materialul biologic a stat în contact cu trasorul pentru un timp ce corespunde unei perioade S integrale, cromozomii metafazici, apar total marcaţi radioactiv. Faza G2. Este mai scurtă, durând 4 – 5 ore şi începe odată cu terminarea replicării heterocromatinei. Sintezele de ADN persistă, iar cantitatea de ADN este dublă faţă de G1. Faza M (sau mitotică). Reprezintă separarea duplexurilor de cromozomi (sau a cromatidelor – surori, după unii autori), împreună cu două loturi de citoplasmă care includ toţi constituenţii săi, în cele două celule fiice. Prin cinematografie cu contrast de fază s-a stabilit că profaza durează 10 – 15 minute, prometafaza şi metafaza 25 – 35 minute, anafaza 5 – 8 minute şi telofaza 20 minute . Derularea ciclului celular implică reglarea succesiunii evenimentelor ce se desfăşoară în cadrul acestuia Acurateţea proceselor de replicare şi segregare a ADN depinde de rezolvarea de către celulă a problemei succesiunii evenimentelor ciclului celular într-o ordine strictă, astfel încât, declanşarea unui nou eveniment să survină doar în urma încheierii complete a evenimentului precedent. Rezolvarea acestei probleme reclamă funcţionarea unor mecanisme de control şi existenţa la nivel celular a unor factori reglatori. Primele date privind existenţa unor factori implicaţi în reglarea ciclului celular au fost furnizate de experienţele de fuziune celulară Obţinerea populaţiilor de celule sincronizate (în care celulele se află în aceeaşi perioadă a ciclului celular) şi experienţele de fuziune celulară au sugerat existenţa unor factori reglatori ce controlează trei evenimente cheie ale ciclului celular: a) iniţierea sintezei ADN; b) derularea replicării materialului genetic nuclear; c) declanşarea procesului mitotic în care are loc segregarea materialului genetic. S-a constatat că în urma fuzionării unei celule aflate în perioada G1 cu o alta ce se găseşte în perioada S a ciclului celular, ADN celulei G1 începe să se replice. Experimentul a stat la baza presupunerii existenţei unui semnal capabil să activeze aparatul ADN replicativ. Acest semnal absent probabil din celulele G1, dar prezent în citoplasmă celulelor S a fost numit activator al perioadei S (S - phase activator). Deoarece în celulele hibride G2 x G1 nu s-a înregistrat iniţiera replicării ADN în nucleul G2, s-a considerat că activatorul fazei S este eliminat (sau blocat) din citoplasmă celulelor, la scurt timp după încheierea perioadei sintetice.

163

În urma fuziunii celulelor aflate în perioadele G2 şi S ale ciclului celular, sinteza ADN în nucleul celulelor din S continuă până în momentul replicării complete a materialului lor genetic, ceea ce indică absenţa unui inhibitor al sintezei ADN în citoplasmă celulelor G2. în acelaşi timp prezenţa activatorului perioadei S nu pare să afecteze nucleul G2 de vreme ce nu se înregistrează o reiniţiere a replicării ADN în acest nucleu, procesul replicativ fiind blocat până la trecerea celulei în perioada G1 a unui nou ciclu celular. Funcţionarea unui mecanism de blocare a sintezei ADN poate explica de ce într-o celulă nu are loc derularea repetată a procesului ADN replicativ. S-a constatat că atât replicarea incompletă a materialului genetic, cât şi existenţa unor erori în molecule ADN nou sintetizate ce reclamă intervenţia mecanismelor de reparare, determină întârzierea intrării celulei în mitoză. Deoarece procesul replicativ şi cel de reparare sunt asociate cu existenţa ADN monocatenar, se consideră că excesul de ADN monocatenar declanşează sinteza unui factor citoplasmatic, semnal ce împiedică intrarea celulelor în mitoză până în momentul desăvârşirii replicării sau reparăii erorilor. Acest factor ce controlează acurateţea procesului ADN replicativ a fost numit semnal de întârziere a perioadei mitotice (M - phase delaying signal). Intrarea celulelor în mitoză este determinată de dispariţia semnalului de întârziere a mitozei şi acumularea în citoplasmă a unui factor ce iniţiază mecanismul de segregare a materialului genetic, numit factor de activare a mitozei (M - phase promoting factor: MPF). Studiile bazate pe experienţele de fuziune celulară, în care s-au obţinut hibrizi g1 X M; G2 x M şi S x M, au demonstrat că prezenţa MPF (factor citoplasmatic prezent în celulele aflate în mitoză) declanşează în nucleul celulelor aflate în oricare perioadă a ciclului celular condensarea cromatinei, eveniment caracteristic mitozei. Se sugerează că factorul de întârziere a mitozei exercită un efect inhibitor asupra sintezei MPF. Acţiunea inhibitoare dispare în prezenţa MPF de vreme ce în celulele hibride, rezultate prin fuziunea celulelor G1, S sau G2 cu celulele M, în care factorii citoplasmatici coexistă, are loc condensarea cromatinei.

7.1.3. Ciclinele şi protein - kinazele dependente de cicline Ciclinele şi protein - kinazele dependente de cicline constituie componentele motorului ciclului celular. Modificările apărute în statusul motorului, ca urmare a interacţiunilor dintre cele două componente, declanşează evenimentele ciclului celular (fig. 99). Aceste evenimente pot fi clasificate în patru grupe: a) evenimente declanşate de depăşirea punctului de START: - iniţierea replicării ADN; - replicarea centrilor organizatori ai microtubulilor (MTOC). b) evenimente ce au loc pe parcursul derulării replicării ADN. c) evenimente iniţiate în momentul intrării celulei în mitoză; - asamblarea fusului de diviziune; - condensarea cromatinei; - dezorganizarea membranei nucleare. d) evenimente ce marchează încheierea procesului mitotic; - dezasamblarea fusului de diviziune; - segregarea cromozomilor; - decondensarea cromatinei; - reorganizarea membranei nucleare; - citokineza.

164

Fig. 99 - Schema generală a funcţionării motorului ciclului celular. Interacţiunile ce se stabilesc între cicline şi protein kinaze dependente de cicline (cdk) au ca rezultat declanşarea evenimentelor caracteristice diviziunii celulare. 7.1.3.1. Protein - kinazele dependente de cicline (cdk) Prima protein kinază dependentă de cicline (34 KDa) a fost descoperită în 1988 ca produs al genei cdc2 din Saccharomices pompe şi al genei CDC 28 din Saccharomices cerevisiae. Ea a fost numită proteina p34 cdc2/CDC28 sau cdk1. Proteina cdk1 joacă un rol important în controlul ciclului celular, operând la nivelul punctelor de graniţă G1/S şi G2/M. Gene omologe cdc2/CDC28 au fost identificate şi în genomul uman. Introduse prin clonare în drojdii defective în cdc2/CDC28, genele umane au fost capabile să suplinească absenţa genelor corespondente din drojdii. Constatarea sugerează că proteina cdkl a fost conservată de-a lungul evoluţiei speciilor, acest element implicat în reglarea ciclului celular fiind comun tuturor celulelor eucariote. Descoperirea unei proteine, p33 (33KDa), numită cdk2 datorită asemănării structurale şi funcţionale cu cdk1, a demonstrat existenţa unei întregi familii de protein kinaze dependente de cicline. în prezent, şase membri ai acestei familii au fost identificaţi. 7.1.3.2. Ciclinele Ciclinele reprezintă un grup restrâns de proteine a căror sinteză se realizează într-o manieră dependentă de perioadele ciclului celular. Ele activează cdk formând cu acestea complexe ce prezintă activitate kinazică. Pe parcursul formării complexelor, ciclinele induc modificări conformaţionale şi de locaţie a cdk ceea ce conferă acestora specificitate în fosforilarea diferitelor substrate. Specificitatea activităţii catalititce a complexelor ciclină/cdk stă la baza parcurgerii de către celulă a ciclului celular.

165

Fig. 100 - Complexele ciclină/cdk implicate în diferitele perioade ale ciclului celular. Spre deosebire de cicline, care se acumulează în celulă într-o manieră dependentă de perioadele ciclului celular, cdk sunt prezente pe tot parcursul ciclului celular. Funcţie de omologia secvenţelor de aminoacizi şi implicarea lor în perioadele ciclului celular, ciclinele se clasifică în trei grupe (fig. 100): a) ciclinele perioadei G1 (ciclinele G1): ciclineie D şi E; b) ciclinele perioadei S: ciclina A; c) ciclinele perioadei M (cicline mitotice): ciclina B. Ciclinele G1 asigură traversarea de către celulă a perioadei G1 şi tranziţia G1/S. Din această grupă fac parte cele trei subtipuri ale ciclinei D (D1, D2, D3) şi ciclina E. Ciclinele D sunt sintetizate în faza timpurie a perioadei G1. Ele formează complexe cu diferite tipuri de cdk (cdk1 - cdk6). Se sugerează că complexele ciclina D/cdk constituie primele componente ale cascadei ciclinelor, ele acţionând în sensul activării ciclinelor E, care Ia rândul lor activează ciclinele A implicate în derularea perioadei sintetice a ciclului celular. Ciclinele E sunt sintetizate târziu în G1. Mai selective comparativ cu ciclinele D, ciclinele E se asociază doar cu cdk2 şi cdk3. Acţiunea celor două tipuri de complexe G1 se suprapune spre sfârşitul perioadei G1 având ca rezultat propulsarea celulei în perioada sintetică a ciclului celular. Ciclina A se asociază cu cdk2 la graniţa dintre perioadele G, şi S. Complexul favorizează derularea perioadei sintetice şi intrarea celulei în G2. În faza târzie a perioadei S se formează complexul ciclina A/cdk1 ce conduce celula de-a lungul perioadei G2 spre graniţa G/M. Ciclina B prin asociere cu cdk1 dă naştere unui complex cunoscut sub numele de factor de promovare a celulei în mitoză (MPF – Maturation Promotion Factor) ce operează în punctul de tranziţie G2/M. Studiile efectuate pe drojdii au furnizat informaţii interesante cu privire la modul în care complexul ciclină B/p34cdc2 acţionează în sensul propulsării celulei în perioada mitotică a ciclului celular (figura 101).

166

Fig. 101 - Ciclinele B se acumulează pe parcursul interfazei, formând prin asociere cu p34cdc2 complexul pre-MPF. Acesta este imediat fosforilat la nivelul Tyr 15 şi a Thr 160 din p34cdc2 de către tirozin/treonin kinaza (wee1), pierzându-şi activitatea kinazică. Sub acţiunea tirozin fosfatazei (cdc25) pre-MPF este defosforilat, transformându-se în MPF activ la începutul mitozei. în ultimele etape ale mitozei ciclinele B sunt rapid degradate de proteaze. Sinteza ciclinelor B este iniţiată în faza târzie a perioadei sintetice. Pe parcursul perioadei G2 ciclinele B se asociază cu p34cdc2 dând naştere unui complex pre-MPF, lipsit de activitate kinazică. Pierderea activităţii kinazice de către pre-MPF se datorează faptului că acest complex constituie unul dintre substratele unei tirozin/treonin kinaze. Enzima, produs al genei weel, fosforilează tirozina 15 şi treonina 160 din lanţul de aminoacizi ai proteinei p34cdc2. Fosforilarea tirozinei 15 este responsabilă de inhibarea funcţiei kinazice a proteinei p34cdc2. Defosforilarea tirozinei 15 are loc la sfârşitul perioadei G2 a ciclului celular, sub acţiunea unei tirozin fosfataze codificată de gena cdc25. Reacţia de defosforilare, transformă pre-MPF inactiv în MPF cu activitate protein kinazică (figura 102). MPF inhibă tirozin/treonin kinaza şi activează tirozin fosfataza, ceea ce conduce la acumularea masivă a MPF în citoplasmă şi, ulterior, declanşarea unei rapide şi ireversibile treceri a celulei în perioada mitotită a ciclului celular. Fig. 102 - Reacţiile de fosforilare şi defosforilare ale MPF Evenimentele ce marchează intrarea celulei în perioada mitotică sunt rezultatul fosforilării directe sau indirecte a unor proteine de către MPF. Prin fosforilarea laminelor nucleare, MPF declanşează dezorganizarea membranei nucleare. Fosforilarea histonei H1, proces ce iniţiază condensarea cromatinei, este cataliuzaqtă de proteinkinaza, enzimă activată prin fosforilare de către MPF. Se consideră că un mecanism indirect de fosforilare similar stă la baza asamblării fusului de diviziune. Dintre enzimele activate de MPF fac parte şi cele implicate în conjugarea ciclinelor cu molecula marker a proteolizei, numită ubiquitină.

167

În urma ubiquitinării, ciclinele sunt rapid degradate. Scăderea concentraţiei ciclinelor în celulă este urmată de disocierea complexelor ciclină/cdk. în absenţa acţiunii efectorilor pozitiv (cicline) scade capacitatea catalitică a cdk ceea ce determină ieşirea celulelor din mitoză şi intrarea lor într-un nou ciclu celular.

7.1.4. Interacţiunea cicline- proteina Rb - mecanism de reglare pozitivă a ciclului celular Proteina Rb transcrisă de antioncogena Rb1 este o proteină nucleară ce face parte dintrun mecanism de blocare a proliferării celulare sub acţiunea factorilor antimitotici (sau în absenţa factorilor mitotici). În stare hipofosforilată proteina Rb leagă diferite proteine nucleare implicate în reglarea principalelor procese ce asigură creşterea celulară, inclusiv factori de transcripţie. Unul dintre aceştia este factorul E2F responsabil de exprimarea genei ce codifică ciclina A. Sechestrarea factorului E2F blochează sinteza ciclinei A, ceea ce determină menţinerea celulei în G1. Ciclinele D prezintă o secvenţă peptidică amino-terminală (Leu-X-Cys-X-Glu) prin care se pot lega la un domeniu specific (pocket region) al proteinei RB, blocându-l. Pe de altă parte, datorită activităţii kinazice, complexele ciclina D/cdk determină trecerea proteinei Rb în stare hiperfosforilată, ceea ce conduce la eliberarea factorului E2F şi sinteza ciclinei A. La rândul lor, ciclinele A menţin proteinele RB în stare hiperfosforilată pe parcursul perioadelor S, G2 şi M ale ciclului celular (figura 103). Se sugerează că proteinele Rb funcţionează ca un comutator molecular în activarea în cascadă a ciclinelor prin reglarea sintezei ciclinei A. Fig. 103 - Fosforilarea proteinei RB are loc la sfârşitul perioadei G1 sub acţiunea complexelor ciclină D/cdk. Proteina este menţinută în stare hiperfosforilată până la ultimele etape ale mitozei, când revine în starea hipofosforilată.

7.1.5. Reglarea ciclului celular prin mecanisme feed-back Apariţia unei desincronizări între durata necesară desfăşurării unui eveniment al ciclului celular şi funcţionarea motorului are ca rezultat iniţierea în celulă a unui nou eveniment înaintea încheierii celui precedent. Aceasta conduce inevitabil la alterare genetică şi moarte celulară. Existenţa unor mecanisme de control feed-back face posibilă încetinirea sau blocarea temporară a motorului ciclului celular în momentul în care desincronizarea a fost detectată. Un exemplu în acest sens este oprirea intrării celulei în mitoză, prin blocarea activării MPF în condiţiile unei replicări incomplete a ADN (fig. 104). Un mecanism de control feed-back reclamă existenţa a cel puţin trei elemente: a) un senzor ce monitorizează desfăşurarea evenimentului; b) un semnal generat de senzor; c) un răspuns la nivelul motorului celular care permite progresia, întârzierea sau oprirea depăşirii punctului de control de către celulă. Tot prin mecanisme feed-back celula este capabilă să detecteze şi să remedieze erori ce apar în desfăşurarea proceselor de replicare şi segregare a materialului genetic. Un rol interesant în unele mecanisme feed-back îl au inhibitorii cdk (ICDK). Aceste proteine au drept ţintă cdk şi complexele ciclină/cdk, în special cele active în perioada G. 168

Un inhibitor cdk este produsul genei GADD45 (Specific Growth Arrest DNA Damage Inductible). El face parte dintr-o cale de transmitere a semnalelor ce controlează oprirea ciclului celular în urma lezării ADN sub acţiunea radiaţiilor ionizante. Această cale mai implică cel puţin doi participanţi: proteina codificată de gena AT (ataxie-telangiectazie) şi proteina p53 (figura 110). În urma detectării leziunii la nivel ADN, se remarcă acumularea proteinelor p53 în celulă, printr-un mecanism ce implică produsul genei AT. Proteina p53 funcţionează ca un factor de transcripţie ce induce exprimarea genei GADD45. Prin acţiunea inhibitoare asupra complexelor cicline G,/cdk, proteina GADD, prelugeşte perioada G, oferind timp celulei să repare leziunea înainte de a intra în perioada S a ciclului celular. Acest mecanism feed-back este inactivat la persoanele ce suferă de ataxietelangiectazie, o boală autozomală recesivă ce se manifestă prin hipersensibilitate la radiaţii, o incidenţă crescută a cancerelor, ataxie cerebrală progresivă şi deficienţe în sistemul imun. Recent s-a descoperit un alt mecanism p53 dependent, prin care celula este oprită în perioada G1 ca urmare a lezării ADN prin radiaţii ionizante sau alţi factori de stres celular. Proteina p53 induce exprimarea unei gene ce codifică un inhibitor cdk, numit proteina p21 (WAF1 -Activated Fragment-1 sau CIP1 –cdk Interacting Protein-1).Prin legarea proteinei p21 de diferiţi cdk ce acţionează în G, este blocată activarea complexelor ciclină G,/cdk ceea ce împiedică fosforilarea substratelor ţintă, cum ar fi proteinele Rb. în acelaşi mod se consideră că ar acţiona şi proteina 16 (p 16). Fig. 104 - Mecanismele feedback sincronizează funcţionarea motorului ciclului celular cu derularea evenimentelor celulare. Sunt prezentate schematic trei situaţii: a) sincronizarea perfectă a replicării ADN cu activarea MPF ce declanşează mitoza; b) replicarea ADN nu este complet încheiată în momentul activării MPF. c) Desincronizarea conduce la moarte celulară; d) activarea MPF este blocată prin mecanism feed-back ceea ce permite finalizarea procesului replicativ.

169

Fig. 105 - Mecanisme feed-back controlează replicarea ADN în celulele supuse acţiunii factorilor de stress (radiaţii ionizante). Sunt prezentate două căi de control dependente de proteina p53. Atât calea AT p53 - GADD45, cât şi calea p53 - p21 - RB conduc la oprirea celulei în G1 ca urmare a detectării unei leziuni la nivel ADN. GADD45 şi p21 funcţionează ca inhibitori ai cdk activi în perioada G1 a ciclului celular.

7.1.6. Alţi factori responsabili de controlul proliferării celulare în organismele pluricelulare În organismele unicelulare, proliferarea este un proces rapid a cărui desfăşurare este influenţată în principal de aportul nutriţional şi viteza metabolismului celular. În organismele pluricelulare, celulele individuale ce le compun cooperează în scopul asigurării supravieţuirii acestora. Menţinerea integrităţii structurale a organismului reclamă stabilirea unui permanent echilibru între proliferare şi moarte celulară (apoptoză). Acest echilibru este reglat prin numeroşi factori extra şi intracelulari. Majoritatea acestor factori acţionează asupra unui punct de control (check point) echivalent punctului start la drojdii, numit punct de restricţie (R). Diverşi factori ce reglează trecerea celulelor din G1 în S impun reguli stricte de depăşire a punctului de restricţie, ceea ce ilustrează semnificaţia sa deosebit de complexă la organismele pluricelulare. Încălcarea acestor reguli determină grave modificări la nivel celular ce conduc la malignizare sau moarte celulară. Diversitatea factorilor şi a mecanismelor prin care ei reglează trecerea din G1 în S a celulelor ce alcătuiesc organismele pluricelulare sugerează existenţa la sfârşitul perioadei G1 a mai multor puncte de restricţii.

7.1.7. Ciclul cromozomial şi creşterea celulară Similar organismelor unicelulare, depăşirea perioadei G1 de către celulele organismelor pluricelulare este condiţionată de atingerea dimensiunii standard. Există foarte puţini indici cu privire la modalitatea prin care celulele sunt capabile să-şi sesizeze propria dimensiune. Dat fiind relaţia de proporţionalitate dintre dimensiunea celulei şi gradul său de ploidie, s-a sugerat că raportul dintre volumul celular şi cantitatea totală de ADN sau numărul seturilor de gene din genomul celular ar constitui un factor critic. Mecanismul prin care dimensiunea celulei influenţează ciclul cromozomial implică probabil sinteza unei molecule într-o manieră dependentă de cantitatea de ADN celular, în aceste condiţii, raportul dintre cantitatea totală a moleculei şi ADN celular rămâne constantă.

170

Scăderea concentraţiei moleculei sub o valoare prag, determinată de creşterea volumului celular, ar putea constitui un semnal de depăşire al punctului de restricţie şi de iniţiere a replicării ADN. În organismele pluricelulare numeroase celule se găsesc în stadiul G0. În aceste celule raportul dintre sinteza şi degradarea proteinelor este modificat în comparaţie cu cel al celulelor proliferative aflate în perioada G1. Atât aparatul proteosintetic (ribozomi, ARNm, proteine implicate în desfăşurarea sau reglarea acestui proces), cât şi viteza sintezei proteice sunt mult diminuate. Celula îşi sintetizează proteinele de întreţinere, rămânând viabilă, dar nu mai creşte, în urma stimulării cu factori de creştere a celulelor aflate în G0, se constată o intensificare a proteosintezei, ea evoluând paralel cu ciclul cromozomial. Legătura dintre creşterea şi proliferarea celulară nu este rigidă. Afirmaţia se bazează pe rezultatele experienţelor pe culturi de celule în care s-a reuşit blocarea sintezei proteice fără ca ciclul cromozomial să fie afectat şi invers. De asemenea, pentru unele celule aflate în G0, (de exemplu neuronii) creşterea celulară nu reclamă replicarea ADN.

7.1.8. Implicarea factorilor de creştere în reglarea diviziunii celulare Factorii de creştere sunt proteine implicate specific în stimularea diviziunii celulare. Recunoaşterea lor de către celule prin intermediul receptorilor, prezenţi la nivelul membranei plasmatice, reprezintă o primă etapă a unui mecanism complex finalizat prin inducerea replicării ADN. Factorul de creştere derivat din trombocite (platelet-derivated growth factor-PDGF) este unul din cele aproximativ 30 de tipuri de factori de creştere identificaţi. El stimulează proliferarea fibroblaştilor în culturi celulare şi a celulelor din ţesuturile conjunctiv şi muscular neted, făcând astfel posibilă repararea leziunilor tisulare. Alţi factori de creştere sunt prezentaţi în tabelul 3. Recunoaşterea şi legarea factorului de creştere de către receptorul specific declanşează evenimente ce se derulează în cascadă, prin intermediul cărora semnalul este transmis de la nivelul membranei plasmatice la genele implicate în proliferarea celulară (procesul fiind denumit signal transduction). În transmiterea semnalului un rol important îl are fosforilarea proteinelor antrenate în acest proces. Receptorul pentru factorul de creştere este o proteină cu activitate tirozinkinazică. Formarea complexului receptor-factor de creştere determină autofosforilarea la nivelul tirozinei a regiunii intracitoplasmatice a receptorului, care devine astfel capabila sa fosforileze alte proteine asociate membranei plasmatice. Semnalul amplificat este preluat de proteine citoplasmatice cu activitate tirozin sau treonin/ serin-kinazica şi ulterior transmis în nucleu proteinelor ce joaca rolul de factori de reglare ai replicării şi ai transcripţiei AND. Factorii de reglare operează la nivelul materialului genetic în sensul activării genelor ce transcriu proteinele implicate în iniţierea sintezei AND, fapt care determină depăşirea de către celulă a punctului de restricţie. Majoritatea proteinelor antrenate în răspunsul celular la factorii de creştere sunt codificate de proto-oncogene, gene care prin diferite mecanisme (mutaţie punctiformă, rearanjare cromozomială, amplificare genetică sau inserţie mutatională) se pot activa, devenind oncogene, capabile să inducă transformarea malignă a celulei (fig. 106).

171

Tabelul 3. Factorii de creştere şi acţiunea lor asupra celulelor ţintă Factorii de creştere Factorul de creştere epidermal (EGF) Factori de creştere de tip insulinic (IGF-I; IGF-II)

Acţiunea asupra celulelor ţinta Stimulează proliferarea mai multor tipuri celulare. Stimulează proliferarea adipocitelor si a celulelor di tesutul conjunctiv. Stimulează proliferarea: - fibroblaştilor; Factorul de creştere a fibroblastilor - celulelor endoteliale; (FGF) - mioblaştilor. Induce creşterea axonală si viabilitatea neuronilor Factorul de creştere neuronal (NGF) simpatici şi senzori. Interleukina 2 (IL2) Stimulează proliferarea limfocitelor T. Stimulează proliferarea celulelor stem şi a Interleukina 3 (IL3) majoritatii celulelor precursoare ale multor celule diferenţiate. Stimulează proliferarea celulelor precur-soare ale Eritropoietina eritrocitelor. Stimulează proliferarea: - celulelor precursoare ale macrofagelor şi Factori de stimulare a coloniilor granulocitelor; granulocitare (G-CSF) - neutrofilelor. Factori de stimulare a coloniilor de Stimulează proliferarea: macrofage (M-CSF) - celulelor precursoare ale macrofagelor şi granulocitelor; - macrofagelor. Fig. 106 - Principalele proteine codificate de protooncogene ce intervin în transmiterea semnalului de proliferare celulară de la factorul de creştere la ADN. Activitatea proto-oncogenelor în oncogene şi implicit codificarea unor proteine ce prezintă modificări calitative sau/şi cantitative conduce la pierderea capacităţii celulei de a răspumde corect faţă de factorii de creştere. Celulele transformate se comportă ca şi cum complexul receptor-factor de creştere ar avea un caracter permanent, ramânând întro continuă stare proliferativă. 7.1.8.1. Competiţia celulelor pentru factorii de creştere Deoarece celulele conţin numeroase tipuri de receptori, proliferarea este dependentă de coexistenţa mai multor factori de creştere. În organismele pluricelulare, factorii de creştere prezenţi în combinaţii variate reglează selectiv diviziunea diferitelor tipuri celulare. Factorii de creştere constituie elemente prin care celulele sunt capabile să controleze proliferarea altor celule (mecanisme paracrine) ce se încadrează în clase diferite sau aparţin aceleiaşi clase (mecanisme autocrine). 172

În acest ultim caz, cooperarea intercelulară permite menţinerea unei anumite densitatea a populaţiei celulare. Afirmaţia se bazează pe rezultatele studiilor interprinse pe culturi celulare. S-a observat că într-o cultură de fibroblaşti formarea monostratului induce inhibarea proliferării celulare, fenomen cunoscut sub numele de inhibiţie de contact sau inhibarea diviziunii celulare dependenta de densitate. Densitatea populaţiei celulare în monostrat, la care proliferarea este inhibata, depinde de concentraţia factorilor de creştere din mediu. Deoarece factorii de creştere sunt prezenţi în mediu în concentraţii foarte mici (PDGF=10-10 M), iar celulele ţintă conţin numeroşi receptori specifici (105 receptori pentru PDGF/ fibroblast), celulele ce alcătuiesc populaţia se găsesc într-o permanentă competiţie pentru factorii de creştere. În momentul în care densitatea populaţiei celulare depaşeşte o valoare prag, concentraţia factorilor de creştere scade şi în consecinţa diviziunea celulara este oprită. 7.1.9. Influenţa adeziunii celulare asupra proliferării S-a constatat ca celulele cultivate în suspensie, supuse unei permanente agitari, devin sferice şi îşi pierd capacitatea proliferativă, fenomen numit dependenţa de ancorare a diviziunii celulare. În culturile statice, celulele se ataşează de suportul solid, prin intermediul contactelor focale ce reprezintă locuri de ancorare în matricea extracelulară a filamentelor de actină ce alcătuiesc citoscheletul. Ataşarea impune celulei adoptarea unei forme aplatizate şi favorizează proliferarea acesteia, fapt ce sugerează existenta unui mecanism ce cuplează diviziunea celulara cu organizarea citoscheletului. La majoritatea celulelor organismelor vertebrate, formarea adeziunilor intercelulare şi celula-matrice este o condiţie importantă în depăşirea punctului de restricţie . După intrarea în perioada sintetică, până la încheierea mitozei, celulele pierd parţial legăturile ce le stabilizează în ţesut şi se rotunjesc (fig.107).

Fig. 107 - Celulele ce se găsesc în mitoză pierd legăturile ce le stabilizează în ţesut prin dezorganizarea contactelor focale Mecanismul ce stă la baza pierderii de către celule a adeziunii la substrat (in vitro) sau la matricea extracelulară (in vivo) este încă insuficient cunoscut. Un rol important în acest mecanism îl joacă proteina SRC, care, conform experimentelor cu anticorpi monoclinali, pare a fi concentrate la nivelul contactelor focale. Proteina cu activitate tirozin-kinazica, SRC, poate determina dezorganizarea contactelor focale pe doua căi. 173

Prima cale implică fosforilarea receptorului pentru fibronectină. În urma fosforilării scade afinitatea receptorului pentru fibronectină (element al matricei extracelulare), căt şi pentru talină (proteină de adeziune intacelulară). Acest fapt conduce la instabilizarea legăturilor dintre componentele contactului focal şi la eliberarea mănunchiurilor de filamente de actină. A doua cale constă în secreţia masivă a unei enzime proteolitice, numită activator de plasminogen. Ea este capabilă să activeze prin clivarea plasminogenului, plasmina, o alta enzima proteolitică. Printre proteinele degradate de plasmină se numără şi proteinele matricei extracelulare, inclusiv fibronectina. Activarea SRC în celulele normale are loc în urma legării unui factor de creştere la receptorul specific (fig.108).

Fig. 108 - Schema modificărilor ce apar la nivelul contactelor focale ca urmare a recunoaşterii şi legării factorilor de creştere de către receptori specifici Există cel puţin patru argumente ce stau la baza acestei afirmaţii: ƒ acţiunea SRC are caracter tranzitoriu; ƒ SRC este implicată în stimularea proliferării celulare prin factori de creştere; ƒ într-o primă etapă, stimularea unei celule prin factori de creştere determină pierderea de către celula a adeziunii la substrat; ƒ in vivo, dezorganizarea structurii complexe de la nivelul contactelor focale nu este suficientă pentru inducerea replicării ea necesită şi prezenţa factorilor de creştere. Găsirea unui răspuns cu privire la modul prin care adeziunea celulară declanşează replicarea AND şi depăşirea punctului de restricţie se dovedeşte a fi foarte dificilă. Până în prezent, se consideră că pentru inducerea sintezei ADN, într-o celulă normală, sunt necesare trei evenimente: ƒ ancorarea celulei la matricea extracelulară prin asamblarea într-o structură complexă a proteinelor intercelulare specializate şi a elementelor de citoschelet; ƒ activitatea acestei structuri prin factori de creştere şi eliberarea unui semnal ce dictează depăşirea punctului de restricţie; ƒ dezasamblarea structurilor ce asigura adeziunile celulă-celulă şi celulă-matrice, ca rezultat al eliberării semnalului.

174

Ciclurile de ataşare şi detaşare celulară permit probabil rearanjarea punctelor de contact, implicate în adeziunea celulă-celulă şi celulă-matrice. Aceasta face posibilă ordonarea şi ulterior legarea în ţesut a celulelor rezultate în urma diviziunii celulare. În celulele maligne dezorganizarea structurilor implicate în adeziunea celulară este suficientă, pentru generarea semnalului de proliferare.

7. 2. Diviziunea celulară În cea de-a patra perioada a ciclului celular, perioada mitotică, au loc procese distributive, de repartizare în celulele fiice ale constituenţilor celulari implicaţi în interfază. Totalitatea acestor procese poarta numele de diviziune celulară indirectă, deoarece întâi are loc cariokineza, denumirea fiind sugerată de schimbările majore ce au la nivelul nucleului celular şi apoi citokineza, respectiv separarea maselor de citoplasmă (diviziunea citoplasmei). Desfasurarea diviziunii celulare indirecte necesită diferenţierea în spaţiul intracelular a aparatului mitotic. Acesta este alcătuit din două componente: aparatul cromatic (cromozomii) şi aparatul acromatic (fusul de diviziune şi centrii celulari). Formarea aparatului mitotic este iniţiată de proteine activate prin fosforilare directă sau indirecta de catre MPF. Activarea protein kinazei H1 de către MPF face posibilă fosforilarea histonei H1 şi, în consecinţă, condensarea cromatinei şi apariţia cromozomilor. Acest eveniment fascinant al diviziunii mitotice constituie pentru celulă un mecanism eficient ce garantează repartizarea egală a materialului genetic în celulele fiice. Segregarea cromozomilor ar fi însa imposibilă în absenţa aparatului acromatic a cărui organizare implică fosforilarea indirectă a proteinelor asociate cu microtubulii de către MPF. Apariţia celui de al doilea centru celular conferă celulei un caracter bipolar. Între cei doi poli ai celulei se formeaza fusul de diviziune ce are rolul de a ancora şi separa cromatidele surori ale cromozomului mitotic, care se comportă ca elemente pasive în procesul de segregare. La celulelor, cu un numar mare de cromozomi, s-a impus rezolvarea problemei uşurării accesului fibrelor fusului de diviziune la cromozomi. Soluţia pe care celula a găsit-o, pentru aceasta problemă, constă în dezorganizarea şi reorganizarea membranei nucleare. Modificările la nivelul membranei nucleare se datorează fosforilării şi defosforilării laminelor, proces reglat direct de MPF. Se apreciază că MPF nu reglează doar procesul distributiv al materialuilui genetic, ci şi scindarea celulei parentale în celulele fiice (citokineza). Este posibil ca acest mecanism de reglare să se realizeze prin fosforilarea proteinelor asociate filamentelor de actină şi miozină ce intră în structura inelului contractil. În funcţie de modul de desfăşurare, se deosebesc două tipuri de diviziune celulară indirectă : Mitoza şi Meioza.

7.2.1. Mitoza (diviziunea mitotică) Mitoza (greaca: mithos=aţă, fir) constituie tipul de diviziune caracteristic celulelor somatice ale tuturor organismelor eucariote. Ea este denumită şi diviziune ecvaţională, deoarece în cadrul ei celula îşi conservă garnitura cromozomilală initială, celulele fiice prezentand acelaşi număr de cromozomi ca şi celula parentală.

175

Fig. 109 - Schema generală a mitozei. Mitoza poate fi impărţită în cinci etape caracterizate prin modificări morfologice specifice : profaza, prometafaza, metafaza, anafaza şi telofaza. Cea de-a şasea etapă a diviziunii mitotice, citokineza, debutează în anafază şi se încheie la sfârşitul ciclului celular (fig.109). A. Profaza Profaza se caracterizeaza prin condensarea cromatinei şi individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente, subţiri, duble şi ataşate pe faţa exoplasmatică a membranei interne nucleare. Filamentele sunt intim asociate formând un spirem (ghem). Cele doua cromatide ce alcatuiesc cromozomul sunt unite la nivelul centromerului şi sunt strâns răsucite una în jurul celeilalte (spiralizarea plactonemică). Condensrea cromatinei continuă pe intreaga durată a profazei conducând la scurtarea şi ingrosarea progresivă a filamentelor cromatidice. La începutul profazei centrul celular se divide generând doi centri celulari. Fiecare conţine câte o pereche de centrioli din care unul matur şi altul în crestere. Centrii celulari rezultati se deplaseaza spre polii opuşi ai celulei. Concomitent se înregistrează dezorganizarea microtubulilor citoplasmatici, parte componentă a citoscheletului interfazic şi apariţia fusului de diviziune, structura bipolară alcatuită din microtubuli şi proteine asociate, dispusă între cei doi centrii celulari. Fusul de diviziune se asamblează iniţial în afara nucleului. Profaza se caracterizeză prin condensarea cromatinei cu individualizarea cromozomilor bicromatidici, diferenţierea fusului de diviziune şi dezorganizarea nucleolului (fig. 110).

Fig. 110 - Profaza 176

Creşterea gradului de condensare a cromatinei este însoţită de o încetinire a proceselor de transcripţie şi sinteză proteică. Principalele proteine sintetizate în profaza timpurie şi mijlocie sunt cele implicate în condensarea cromatinei şi edificarea aparatului acromatic. Scăderea gradată a procesului transcriptional determină iniţial micşorarea volumului nucleolar şi ulterior, la sfârşitul profazei, fragmentarea şi completa sa dezorganizare ca rezultat al blocării sintezei ARN. B. Prometafaza Prometafaza debutează prin fragmentarea învelişului nuclear în vezicule delimitate de membrană ce staţionează pe întreaga duratî a mitozei în jurul fusului de diviziune. În urma acestui eveniment, carioplasma fuzionează cu hialoplasma formând mixoplasma. Dezasamblarea membranei nucleare permite accesul fibrelor fusului de diviziune în regiunea nucleară (fig. 111).

Fig. 111. Prometafază În prometafaza pe cele doua feţe opuse ale centromerului se maturează complexe proteice specilizate în ancorarea cromozomilor de către fibrele fusoriale, numite kinetocori. Cei doi kinetocori ai unui cromozom sunt capturaţi de fibre ale fusului de diviziune ce pleacă din centrii celulari opuşi. Acestea au fost numite fibre kinetocorice. Fibrele fusoriale libere, orientate spre planul ecuatorial al celulei, poartă numele de fibre polare. Tensiunea exercitată de fibrele kinetocorice asupra cromozomilor imprimă acestora o mişcare agitată, de oscilare între cei doi poli celulari. C. Metafaza Metafaza este inertă din punct de vedere sintetic, cromatina atingând condensarea maximă. Cromatidele surori ale cromozomului metafazic sunt situate una alături de cealaltă. Fibrele kinetocorice aliniază cromozomii într-un singur plan perpendicular pe axa fusului de diviziune, localizat la jumatatea distanţei ce separă polii celulari, formand placa ecuatorială sau metafazică (fig. 112). Alinierea cromozomilor în planul ecuatorial al fusului de diviziune constituie principalul eveniment al metafazei.

177

Fig. 112 - Metafaza: alinierea cromozomilor în planul ecuatorial al fusului de diviziune, formând placa ecuatorială sau metafazică Mecanismul deplasării cromozomilor spre regiunea ecuatorială a celulei şi a alinierii lor în placa metafazică este prezentat pe larg în capitolul 4. La sfârşitul metafazei are loc desăvarşirea replicării centromerilor, ceea ce are drept consecinţă separarea cromatidelor surori ale cromozomilor în anafază. D. Anafaza Primul eveniment ce marchează începutul anafazei constă în segregarea kinetocorilor pereche din fiecare cromozom, ca rezultat a replicării centromerilor şi separarea ulterioara a cromatidelor surori. S-a constatat că detaşarea, prin micromanipulare, a fibrelor kinetocorice ce ancorează unul din cromozomii metafazici nu interferă cu separarea cromatidelor surori. Segregarea cromatidelor tuturor cromozomilor, inclusiv a celui detaşat se desfăşoară simultan. Observaţia sugerează ca iniţierea anafazei nu este dictate de aparatul acromatic, ci de un semnal specific. Studiile întreprinse , pe cultura de celule, au demonstrate ca declanşarea anafazei este însoţită de creşterea concentraţiei intercelulare a ionilor de calciu. Mai mult, creşterea experimentală a concentraţiei de Ca2+ în spaţiul intracelular conduce la iniţierea prematură a anafazei. Se consideră că un semnal, încă necunoscut, determina eliberarea Ca2+ din veziculele delimitate de membrane ce înconjoară fusul de diviziune şi prin aceasta, intrarea celulei în anafază. La trecerea celulei din metafază la anafază are loc defosforilarea unui număr mare de proteine, inclusiv histonele H1 şi laminele. Identificarea proteinelor antrenate în aceasta reacţie ar putea reprezenta o cale spre descoperirea semnalului ce iniţiază anafaza. În anafaza, cromatidele surori ale cromozomilor sunt deplasate spre poli opuşi ai celulei cu viteza de aproximativ 1mm/min. Acest eveniment ce constituie anafaza A este rezultatul depolimerizării fibrelor kinetocorice. Concomitent are loc îndepărtarea polilor celulari prin alungirea fibrelor polare, eveniment ce marchează anafaza B. Mecanismele prin care se realizează translocarea cromozomilor anafazici şi îndepărtarea polilor celulari sunt prezentate în capitolul ce prezintă elementele componente al citoscheletului (capitolul 4). Cromozomii anafazici, monocromatici suferă de regulă un proces de decondesare, însoţit de creşterea lor în lungime. La sfârşitul anafazei, cromozomii se afla grupaţi la cei doi poli ai celulei şi fibrele kinetocorice dispar (fig. 113).

178

Fig. 113 - Anafaza; a) depolimerizarea fibrelor kinetocorice; b) polimerizarea fibrelor polare. E. Telofaza În telofază se desfăşoară procese inverse celor ce au loc în profaza. Decondensarea cromozomilor continuă. Dacă la începutul telofazei ei au aspectul unor fibre fine, alungite şi încolăcite unele în jurul altora formând câte un spirem, la fiecare pol celular, spre sfârşitul ei, cromatina îşi recapătă aspectul caracteristic interfazei (fig. 114). Fig. 114 - Telofaza Veziculele delimitate de membrană, ce înconjoară fusul de diviziune, fuzionează delimitând doua spaţii nucleare situate la polii celulari opuşi. Porii nucleari se reasamblează, iar laminele defosforilate se reasociază formând lamina nucleară. Un rol important în reorganizarea membranei nucleare îl are lamina B ce rămâne permanent ataşata de membranele veziculelor rezultate prin fragmentarea învelişului nuclear în prometafază. La nivel nuclear, reîncepe sinteza ARN, iar în citoplasmă procesul de proteosinteză se intensifică. Transcripţia genelor ARNr, din organizatorii nucleolari şi formarea subunităţilor ribonucleoproteice (RNP) prin asocierea ARNr cu proteinele specifice importate în nucleul din citoplasma, conduc la reapariţia nucleolului. La om, cele cinci perechi de organizatori nucleolari controlează formarea în telofază a cinci nucleoli. De regula aceştia fuzionează astfel încât în majoritatea celulelor interfazice nucleul celular prezintă un singur nucleol. Pe întreaga durata a telofazei are loc dezorganizarea aparatului acromatic.

179

F. Citokineza Citokineza defineşte fenomenul de diviziune a citoplasmei. Deşi s-a constatat ca citokineza nu are loc niciodată înaintea diviziunii nucleare, totuşi procesul mitotic nu condiţionează strict declanşarea diviziunii citoplasmatice. Studiul primei etape a dezvoltării embrionale la Drosophila melanogaster ne oferă un exemplu concret. Oul fecundat al Drosophilei melanogaster parcurge 13 cicluri de diviziuni nucleare, transformându-se intr-o celula multinucleară. Prima diviziune citoplasmatica are loc după cel de-al 13-lea ciclu mitotic si conduce la formarea aproximativ a 600 de celule uninucleate. La celulele animale diviziunea citoplasmatica se realizează prin clivarea. Locul de clivare devine vizibil încă din anafaza, sub forma unei adâncituri (sunt), pe suprafaţa membranei plasmatice. El este situate in planul plăcii ecuatoriale, perpendicular pe fusul de diviziune. Experimentele efectuate, in vitro, în care s-a realizat deplasarea prin micromanipulare, a fusului mitotic la începutul anafazei, au avut drept rezultat invariabil schimbarea situsului de clivare. Aceasta demonstrează ca planul de scindare al citoplasmei este determinat spaţial de poziţia fusului de diviziune. Deci, este posibil ca o anume orientare a fusului de diviziune să dicteze caracterul simetric sau asimetric al diviziuni celulare. Recent, s-a constatat ca distrugerea fusului mitotic, prin tratare cu colchicina, după apariţia şanţului de clivare nu duce la blocarea diviziunii citoplasmice. Deci, după momentul iniţierii clivării, mecanismul citokinezei devine independent de structurile microtubulare. Rolul principal revine acum inelului contractil. Această structura alcătuită din filamente de actină şi miozină, ataşate de fosa citoplasmatică a plasmalemei prin proteine încă necaracterizate, se asamblează la începutul anafazei. Contracţia inelului prin mecanismul actină - miozină concomitent cu depolimerizarea filamentelor de actină ce-l alcătuiesc, conduc la continua micşorare a diametrului sau/şi implicit la adâncirea şanţului de clivare. La sfârşitul perioadei mitotice cele doua celule fiice sunt încă unite printr-o regiune centrală (“midbody”), ce conţine fibre polare ale fusului de diviziune parţial dezorganizate înconjurate de hialoplasma (fig. 115). Fig. 115 - În cazul celulelor animale citokineza se realizează prin clivare. Separarea completa a celulelor fiice, moment ce marchează desavarşirea citokinezei, are loc la începutul următoarei interfaze. Fiecare celulă fiică moşteneşte în urma citokinezei un set de componente celulare, deoarece, cu excepţia nucleului, organitele celulare nu se pot duplica în absenţa unei copii preexistente, în celula parentală are loc duplicarea constituenţilor celulari înaintea declanşării citokinezei. Duplicarea organitelor celulare se realizează prin mecanisme diferite. Mitocondriile cresc şi se divid prin fisiune, aparatul Golgi şi reticulul endoplasmatic se fragmentează în vezicule din care se vor fi construite noile organite celulare, în timp ce ribozomii se multiplică prin asamblarea elementelor constituente (ARNr şi proteine ribozomale). 180

Ţinând cont de numărul de copii ale organitelor celulare dintr-o celulă eucariotă şi de duplicarea lor înaintea diviziunii, se apreciază că celula nu dispune de un mecanism specializat de distribuire a organitelor celulare. S-a constatat că suprafaţa totală a celulelor fiice este mai mare decât cea a celulei parentale. Deci, membrana plamatică a celulei ce se divide este insuficientă pentru celulele rezultate în urma citokinezei. Aceasta impune intensificarea biosintezei membranei plasmatice în celula parentalăp , anterior declanşării diviziunii celulare.

7.2.2. Meioza (diviziunea meiotică) Meioza (geacă ”meiosis = micşorare”) este întâlnită în procesul de gametogeneză (formarea gameţilor) şi reprezintă un tip de diviziune nucleară caracteristic celulelor germinale. Meioza se caracterizează prin înjumătăţirea numărului de cromozomi în celulele progene. În celulele diploide (2n), inclusiv cele germinale, nucleul conţine cu excepţia cromozomilor de sex (X şi Y), perechi de cromozomi omologi, fiecare pereche fiind alcătuită dintr-un cromozom matern şi altul patern. Gameţii ( spermatozoidul şi ovulul) rezultaţi prin diviziunea celulelor germinale sunt celule haploide (n). În nucleul lor se găsesc câte un cromozom din fiecare pereche de omologi (autozomii) şi un singur cromozom ce determină sexul (heterozomii, X şi Y). Meioza reprezintă un mecanism complex ce implică desfăşurarea succesivă a două diviziuni indirecte – meioza I şi meioza II (fig.116). Fig. 116 - Schema generală a meiozei Cele doua diviziuni ce au loc în cadrul meiozei sunt precedate de o interfaza premeitica (identică cu interfaza mitotică) şi separate de o interfază scurtă, din care lipseşte perioada sintetica (replicarea AND), numită Interfaza meiotică. A. Prima diviziune a meiozei (meioza I) Meioza este o diviziune reducţională complet diferită de mitoza somatică. Ea asigură înjumătăţirea numărului de cromozomi în celulele progene. Meioza I are loc imediat după încheierea interfazei premeiotice, astfel încât la începutul acestei diviziuni AND este complet replicat (celulele sunt tetraploide), fiecare cromozom fiind alcătuit din doua cromatide surori. Cromozomii bicromatidici omologi (matern şi patern) se grupează în perechi formând o structura tetracromatidică, numită cromozom bivalent sau tetradă. 181

Cromatidele nesurori ale bivalentului sunt antrenate în procese de remaniere cromozomială. Separarea ulterioară a cromozomilor omologi , translocarea acestora spre polii celulari opuşi şi citokineza conduc la formarea a două celule progene. Fiecare progen conţine câte două copii ale unui singur cromozom din fiecare pereche de omologi ai celulei parentale (jumătate din numărul cromozomilor celulei mamă). Copiile sunt asociate formând un cromozom bicromatidic . Înţelegerea proceselor ce se desfăşoară pe parcursul meiozei, face necesară prezentarea etapizată a acestui tip de diviziune Similar mitozei somatice, în cadrul meiozei I, se disting cinci etape: profaza, prometafaza, metafaza, anafaza şi telofaza. Meioza I se încheie cu procesul de citokineză. a) Profaza meiozei (profaza I) Profaza I se deosebeşte de profaza mitotică atât sub aspectul duratei (90-95% din desfăşurarea meiozei I), cât şi sub cel al evenimentelor ce au loc în această etapă. Profaza I este împărţită în cinci stadii succesive: leptoten, zigoten, pachiten, diploten şi diachineza. Laptotenul se caracterizează prin condensarea cromatinei şi individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente lungi şi subţiri. Deoarece in perioada S a interfazei, materialul genetic al celulei parentale (2N) a fost replicat, celula în leptoten este tetraploidă (4N). Fiecare cromozom este alcătuit din două cromatide surori unite la nivelul centromerului şi intim asociate, ceea ce oferă cromozomului un aspect monocromatidic Cromozomi sunt ataşaţi cu ambele capete de învelişul nuclear prin intermediul unor structuri specializate numite placi de ataşare. La sfârşitul leptotenului, pe o singura parte, în lungul fiecărui cromozom se diferenţiază o lama proteică (400-700 A grosime), numita axă. Cromatina ce formează cromatidele surori proeminează sub forma unor bucle, pe faţa opusă axei (fig.117). Fig. 117 - Stadiul de leptoten Zigotenul reprezintă stadiul în care are loc conjugarea cromozomilor omologi, numit sinapsis (sinapsarea sau formarea sinapsei). Conjugarea este anticipată de apropierea omologilor. Recunoaşterea şi gruparea cromozomilor omologi în pereche se realizează prin intermediul proteinelor ce intră în alcătuirea axelor. Un rol în aceste evenimente il joaca şi învelişul nuclear de vreme ce, în zigoten, cromozomi continuă să fie ataşaţi de membrana nucleară. Conjugarea cromozomilor omologi poate fi iniţiată de la o extremitate a acestora (proterminală) ori din una sau mai multe regiuni centrale (procentrică). Iniţierea conjugării implică interacţii între perechile de baze complementare ale ADN din regiuni cromozomiale specifice numite zigomere sau sinapsomere. Prin stabilirea interacţiilor se realizează alinierea cromozomilor, astfel încat fiecare genă dintr-un cromozom este juxtapusă genei omologe din cromozomul pereche. Din punctele de iniţiere conjugarea se extinde progresiv, cuprinzând integral cromozomii prealiniaţi într-o manieră zipper like (zipper = fermoar). Rezultatul desăvârşirii conjugării îl constituie formarea bivalenţilor, numiţi şi tetrade, denumire sugerată de numărul cromatidelor ce-i alcătuiesc.

182

În momentul conjugării, cele doua axe ale cromozomilor omologi sunt dispuse faţă în faţă, la o distanta de 100 nm, constituind elementele laterale ale unei structuri trilamelare, numită complex sinaptinemal. O lama proteică (200 Å grosime) este interpusă între cele doua axe. Ea reprezintă cea de-a treia componentă a complexului sinaptonemal şi poarta numele de element central. Elementele laterale sunt conectate la elementul central prin intermediul unor benzi protice transversale dispuse în mod similar treptelor unei scări (fig. 118). Fig. 118. Stadiul de zigoten. În meioza I, complexul sinaptonemal joacă un rol important în stabilizarea cromozomilor omologi în tetradă. Conjugarea cromozomilor X si Y, pe parcursul meiozei I a celulelor germinale din indivizii masculi, este posibilă datorită existenţei la cei doi cromozomi de sex a unei regiuni terminale omologe. Pachitenul începe în momentul desăvârşirii conjugării cromozomilor. Ca rezultat al condensării progresive a cromatinei pe parcursul primelor doua stadii ale profazei I , în pachiten cromozomii sunt mai groşi şi mai scurţi. Principalul eveniment ce caracterizează pachitenul este crossing-over-ul, fenomenul ce implica ruperea în aceiaşi poziţie a extremităţii unei cromatide materne şi a alteia paterne şi reunirea încrucişată a fragmentelor. Prin schimbul reciproc de fragmente între cromatidele surori se realizează recombinarea genetică. Fiecare cromozom va conţine gene aparţinând ambilor genitori, noua combinaţie de gene creată transmiţându-se generaţiilor următoare. Structura ce oferă premisele desfaşurării crossing-over-ului este reprezentată de complexul sinaptonemal. Procesul de recombinare este catalizat de către complexe multiproteice a căror diametru este de 90 nm, numite noduli de recombinare. Aceştia se formează în interiorul complexului sinaptonemal ocupând aproape integral spaţiul ce separa cele două axe ale cromozomilor omologi (fig.119). Fig. 119. Stadiul de pachiten Deşi implicarea complexelor multiproteice în recombinarea genetică nu a fost demonstrată experimental, se consideră că nodulii de recombinare conţin întregul echipament enzimatic necesar clivării cromatidelor surori, reunirii încrucişate a fragmentelor cromatidice.

183

Participarea acestor noduli în desfăşurarea crossing-over-ului a fost sugerată de următoarele constatări: a. corelarea existentă între numărul nodulilor şi cel al chiasmelor evidenţiate în stadiul următor al profazei I; b. distribuţia spaţială similară a nodulilor de recombinare şi a evenimentelor de crossingover de-a lungul complexului sinaptonemal; c. la mutanţi de Drosophila melanogaster ce prezintă o diminuare şi o distribuţie anormală a crossing-over-ului, numărul nodulilor de recombinare este mai mic, iar localizarea lor diferă de cea întâlnită la indivizii normali. Aceste observaţii atestă rolul important pe care nodulii îl joacă în procesul de recombinare, numărul şi localizarea acestora în complexul sinaptonemal determinând frecvenţa şi situsul crossing-over-ului. Diplotenul reprezintă stadiul profazei I în care are loc separarea parţială a omologilor prin dezorganizarea complexului sinaptonemal. Cromozomi omologi rămân ataşaţi la nivelul situsurilor la care are loc crossing-over-ului. Aceste puncte de ataşare poartă numele de chiasme. Deşi încep să se formeze în pachiten, chiasmele devin vizibile numai după desinapsarea cromozomilor ce alcătuiesc bivalentul. Concomitent cu desinapsarea omologilor are loc separarea cromatidelor surori ce rămân unite prin centromer. Ambele evenimente sunt caracteristice stadiului diploten . Bivalenţii pot prezenta una sau mai multe chiasme, numărul lor ilustrând frecventa crossing-over-ului. La nivelul fiecărei chiasme, doua din cele patru cromatide ale bivalentului se intersectează în spaţial delimitat de cromatidele omologe (fig. 120). Fig. 120 - Stadiul de diploten Deşi teoretic, chiasmele se pot forma în orice zonă cromozomială s-a constatat absenţă lor în regiunile heterocromatidice. Deci, aceste regiuni nu sunt antrenate în evenimente de crossing-over împiedică desfăşurarea unui eveniment similar în zonele imediat învecinate, ceea ce impune o anumită distanţă între chiasmele situate pe acelaşi braţ cromozomial . Ea a fost denumită distanţă de interferenţă . În meioza I, chiasma joacă un rol similar celui pe care îl are centromerul în mitoză, asigurând segregarea corectă a materialului genetic. Absenţa chiasmei într-un bivalent face imposibilă segregarea cromozomilor omologi în următoarele etape ale meiozei, fenomen cunoscut sub numele nondisjunctie. În acest caz, o parte din gameţii rezultaţi vor avea un cromozom în minus, în timp ce alţii vor conţine o copie cromozomială în plus. Deoarece în ocite, diplotenul poate dura luni sau ani, în acest stadiu cromatina suferă un proces de uşoară decondensare ceea ce face ca sinteza ARN să fie reiniţiată. Diachineza debutează cu condensarea cromatinei şi blocarea transcripţiei. Cromozomii se detaşează de membrana nucleară. În fiecare bivalent cromozomii omologi sunt uniţi la nivelul chiasmelor iar cromatidele surorii ale fiecărui cromozom din pereche sunt legate prin intermediul centromerului (fig.121).

184

Fig. 121 - Diachineza În timpul diachinezei chiasmele încep să se deplaseze spre extremităţile cromozomilor, fenomen numit terminalizare. b) Prometafaza meioze I (prometafaza I). În prometafaza l, se dezorganizează învelişul nuclear şi se formează aparatul acromatic. La nivelul centromerelor se diferenţiază kinetocorii. Cei doi kinetocori ce se dezvoltă pe centromerul unui cromozom bivalent sunt ancoraţi de fibre kinetocorice ce pornesc de la acelaşi pol al fusului de diviziune. Kinetocorii de pe centromerul cromozomului omolog sunt legaţi prin fibre kinetocorice de polul opus. c) Metafaza meiozei I (metafaza I) Mobilizarea bivalenţilor spre regiunea ecuatorială a celulei şi alinierea lor în placa metafazică, constituie evenimentele caracteristice metafazei I. Cei doi centromeri ai bivalentului sunt orientaţi spre polii celulari opuşi (fig. 122). Fig. 122 - Metafaza meiozei I. Bivalenţii sunt aliniaţi în placa ecuatorială. Kinetocorii de pe cromatidele surori sunt orientaţi spre acelaşi pol al fusului de diviziune. Chiasmele localizate terminal menţin cromozomii omologi uniţi pe toată durata metafazei I. Sfârşitul acestei etape este marcat de dispariţia chiasmelor şi eliberarea cromozomilor din bivalent. d) Anafaza meiozei I (anafaza I) Odată eliberaţi din tetrada.cromozomii omologi sunt translocaţi spre polii celulari opuşi printr-un mecanism similar celui întâlnit în mitoză (depolimerizarea fibrelor kinetocorice şi alungirea fibrelor polare). Spre deosebire de cromozomii monocromatidici din anafază mitotica, cromozomii din anafaza mitozei I sunt bicromatidici (fig. 123). Migrarea la polii celulari ai cromozomilor bicromatidici conduce la reducerea la jumătate a numărului de cromozomi prezenţi iniţial în celuia parentală. Concomitent începe procesul de decondensare a cromozomilor. Fig. 123 - Anafaza meiozei I. Cromozomii omologi sunt completseparaţi şi migrează spre polii opuşi ai celulei e) Telofaza meiozei I (telofaza I) În telofaza I, cromozomii se găsesc la polii fusului de diviziune. Decondensarea cromozomilor continua fără ca aceştia să-şi piardă individualitatea. Relaxarea cromatinei face posibilă reînceperea sintezei ARN. 185

Membrana nucleară se reorganizează delimitând cei doi nuclei rezultaţi în urma diviziunii. Meioza I se încheie cu procesul de citokineza prin care sunt separate celulele progene. Fiecare progen conţine o jumătate din garnitură cromozomială a celulei parentale, deşi cantitatea de ADN corespunde unei celule diploide. Aceasta se explică prin existenţa în fiecare celulă a două copii ale aceluiaşi cromozom. Datorită recombinării genetice ce are loc în profaza I, copiile nu sunt perfect identice (fig. 124). Fig. 124 - Celulele fiice rezultate în urma primei diviziuni meiotice Interfaza meiotică Mai scurtă decât interfaza mitotică, interfaza meiotică, ce separă cele două diviziuni meiotice se caracterizează prin absenţa perioadei S. Pe parcursul interfazei meiotice se desfăşoară procese transcripţionale şi de proteosinteză ce pregătesc intrarea celulei în meioza II. Se apreciază că acum are loc reorganizarea kinetocorilor, care se poziţionează pe feţele opuse ale centromerului fiecărui cromozom bicromatidic. Reorientarea face posibilă segregarea materialului genetic pe parcursul celei de-a doua diviziuni meiotice. Interfaza meiotică nu este întâlnită la toate celulele eucariote, fiind posibilă derularea succesivă a celor două diviziuni. B. A doua diviziune a meiozei (meioza II) În celulele progene, rezultate în urma meiozei I, iniţierea celei de-a doua diviziuni meiotice, are loc simultan. Meioza II reprezintă, de fapt, o diviziune mitotică, ecvaţională, ce asigură repartizarea egală a copiilor cromozomiale din cele două celule fiice şi în consecinţă formarea gameţilor. Etapele şi evenimentele celulare caractzeristice acestora sunt similare celor întâlnite în cadrul diviziunii mitotice. Meioza II debutează cu profaza II, etapă mult mai scurtă decât profaza mitotică, în care are loc formarea unui nou aparat acromatic şi dezorganizarea înveluşului nuclear. Fibrele kinetocorice ce radiază din polii opuşi ai fusului de diviziune ancorează kinetocorii de pe cele două cromatide ce alcătuiesc fiecare cromozom.Unite prin intermediul centromerului, cromatidele surori sunt deplasate şi aliniate în planul ecuatorial al celulei formând în metafaza II placa metafazică. Sfârşitul acestei etape este marcat de replicarea centromerului şi separarea celor două cromatide. În anafaza II cromatidele surori sunt translocate spre polii opuşi ai celulei.Cromozomii monocromatidici anafazici se alungesc ca rezultat al relaxării cromatinei. În telofaza II decondensarea cromozomilor continuă astfel încât la sfârşitul meiozei II cromatina îşi recapătă aspectul caracteristic interfazei. La polii opuşi ai celulelor se reorganizează învelişul nuclear. Separarea celor patru celule haploide (gameţii) este consecinţa directă a procesului de diviziune citoplasmatică. 186

Capitolul 8 APOPTOZA Apoptoza reprezintă procesul fiziologic de moarte celulara programată (PCD = Programmed Cellular Death). Timp îndelungat au fost studiate doar mecanismele de proliferare şi diferenţiere celulară, în vreme ce procesul de moarte celulară a fost considerat doar un proces haotic. Procesul apoptotic are loc în toate organismele vii, atât în viaţa embrionară cât şi în cea adultă, prin acest mecanism, organismele eliminând celulele nedorite, nocive sau anormale din punct de vedere funcţional. Apoptoza nu rezultă din leziune, nu este reversibilă şi nici nocivă pentru organism, ci chiar necesară pentru menţinerea normalităţii. Drept sinonime pentru apoptoza celulară se mai folosesc denumirile: moarte celulară normală sau moarte celulară fiziologică. Astăzi se cunoaşte că procesul de apoptoză are rol în medierea proceselor de dezvoltare şi a efectelor nutriţionale care prelungesc cursul vieţii. Descreşterea anormală a apoptozei poate avea rol în declanşarea bolilor autoimune şi a evenimentelor legate de senescenţă (tumorigeneză).

8.1. Mecanismele de producere a apoptozei În cursul procesului de apoptoză se elimină un număr mare de celule fără a se produce vreun proces inflamator. Arhitectura tisulară şi celulară adiacentă este păstrată intactă şi ea umple spaţiile lăsate goale de celula apoptotică. Celulele apoptotice sunt caracterizate printr-un proces de adunare şi redistribuire a cromatinei sub forma unei mase compacte care rămâne pe membrana nucleară, urmată de zbârcirea suprafeţei celulare. Organitele celulare şi in special mitocondriile sunt bine conservate, iar celula apoptotică se rupe în corpusculi apoptotici. Asemenea corpi apoptotici pot transporta antigene (incluzând fragmente de AND intacte), care, în condiţii anormale, pot deveni responsabile de dezvoltare de autoanticorpi (în lupusul eritematos sintetic). Deoarece aceşti corpusculi sunt rapid generaţi de celulele vecine şi fagocite, ei sunt observaţi foarte rar chiar şi în timus, acolo unde viteza apoptozei este foarte mare. Procesul de apoptoză se desfăşoară în trei timpi : -

în faza iniţială, celulele individuale, enclavate în ţesutul normal, pierd legăturile cu celulele vecine, cromatina nucleară se condensează, rezultând fragmentarea AND-ului celular; celulele se retractă din cauza pierderii de conţinut citoplasmic şi a condensării proteinei citoplasmatice; cele mai multe organite citoplasmatice rămân însă intacte;

-

în faza a doua, membrana celulară se zbârceşte, se găureşte şi se fragmentează, formându-se corpi apoptotici care conţin resturi nucleare;

-

în faza finală, celulele vecine şi macrofagele fagocitează aceste fragmente până la completa lor degradare (fig.125).

187

Fig. 125 - Aspecte de apoptoză Procesul de apoptoză este foarte rapid şi durează în total câteva ore. Apoptoza ca proces active necesită atât energie în formă de ATP, cât şi sinteză de ARN şi de proteine. Formarea inozitolfosfaţilor care determină creşterea concentraţiei intracelulare de ioni Ca²+ este un eveniment precoce al apoptozei, urmat de exportul rapid şi selective de ioni şi apă, ceea ce are drept consecinţă condensarea citoplasmei şi cromatinei şi formarea fragmentelor ADN. Corpusculii apoptotici conţin un schelet de proteine crosslinkate (anvelope) rezistente la proteoliză. Recunoaşterea celulelor apoptotice şi fagocitarea lor de către celulele fagocite par a fi mediate de către numeroşi receptori (vitronectina, tromboplastina etc.) de pe celulele umflate; proteazele dependente de prezenţa ionilor Ca²+ pot participa la degradarea citoscheletului corpusculilor apoptotici. În cursul apoptozei, pe partea extremă a membranei plasmatice apare fosfatidilserina, care, în mod normal, îşi are sediul pe partea internă a acesteia, aspect ce trebuie luat în considerare, deoarece poate semnifica un semnal de activare a fagocitării celulelor apoptotice.

8. 2. Necroza Spre deosebire de apoptoză (moarte celulară normală), necroza reprezintă o moarte celulară patologică; este un proces pasiv care apare sub acţiunea unor noxe celulare, având drept consecinţă leziuni grave. În cursul necrozei se produce dilatarea reticulului endoplasmatic, creşterea volumului mitocondriilor, flocularea cromatinei nucleare, umflarea celulelor urmată de ruperea, printr-un dezechilibru osmotic, a respectivelor celule. Cromatina devine tot mai compactă şi nu apare distribuită pe membrana nucleară; apar leziuni ultrastructurale ale organitelor celulare; în final, membrane plasmatică, organitele şi nucleul se dezintegrează, iar resturile sunt digerate de către fagocitele infiltrate. În contrast cu apoptoza, în care procesul se produce într-o celulă solitară, în cazul necrozei procesul apare simultan într-un grup de celule în care s-a produs în prealabil o leziune în arhitectura celulară. În final, ingestia fagocitară de celule necrozate (în contrast cu cele apoptotice) este acompaniată de eliberarea de mediatori chimici ai inflamaţiei, care induc un răspuns de tip inflamator. Aceste aspecte se explică prin existenţa unui set diferit de semnale, implicat în fagocitoza celulelor apoptotice, în comparaţie cu setul de semnale implicat în fagocitarea celulelor necrotice sau a agenţilor infecţioşi.

8.3. Frecvenţa procesului de apoptoză După cum s-a arătat mai sus, apoptoza este un mecanism eficient de eliminare atât a anumitor celule în cursul dezvoltării embrionare cât şi a celulelor adulte normale. Există de obicei un număr de celule normale care sunt depăşite la un moment dat dintr-o multitudine de cauze; un exemplu este cel al celulelor neuronale care se produc în exces în 188

sistemul nervos al vertebratelor; în acest caz, 50% din diferitele tipuri de neuroni mor curând după ce au format conexiunile sinaptice cu celulele ţintă. Aceste celule neuronale au avut probabil o funcţie în timpul evoluţiei şi dezvoltării, dar au încetat la un moment dat să mai fie necesare (au atins momentul de regresie a metamorfozei lor). Apoptoza are loc şi în celulele adulte somatice, în cursul reînnoirii normale a ţesuturilor.

8.4. Gene implicate în procesul apoptotic 8.4.1. Gene letale În prezent există evidenţa unei gene sau a unui set de gene care codifică proteine cu efect letal (de sinucidere) asupra celulei purtătoare. Astfel, la organismul nevertebrat Caenorhabditis elegans (nematode) au fost descrise două asemenea gene: Ced 3 şi Ced 4 cu acţiune letală; în cazul în care una din aceste gene este inactiva prin mutaţie, nu mai survine moartea celulară. Aceste două gene acţionează autonom pentru a produce moartea celulară programată. În mod similar, un număr de gene letale au fost evidenţiate la mamifere; astfel, sa arătat că gena protooncogenă c-myc, care în mod normal stimulează diviziunea celulară, este implicate şi în inducerea apoptozei. În cazul genei supresoare de tumori p53, s-a observat cum creşterea nivelului proteinei p53 este asociată cu moartea celulară apoptotică. Aceste gene s-au dovedit esenţiale pentru moartea celulară apoptică, apoptoza rezultând în cazul supra expresiei genelor c-myc sau p53, sau prin coexpresia simultană a mai multor gene. Apoptoza trebuie privită ca un proces fiziologic normal faţă de influenţele mediului extern; acest proces este mediat de o cascadă de transducţii de semnale la suprafaţa celulară, probabil printr-un program genetic îndreptat împotriva unei stări antiproliferative. Astăzi se ştiu încă puţine lucruri despre căile acestei morţi celulare. S-a demonstrat că multe gene letale sunt activate în cursul apoptozei. După cum am arătat deja, se pare că o creştere a concentraţiei ionilor de Ca2+ în citosul ar avea un rol important în funcţia de reglare a apoptozei; totuşi acest mecanism rămâne încă neclarificat. Se pare că acest calciu citosolic ar declanşa şi evenimentele secundare legate de activarea transglutaminazelor. Enzimele de membrană şi citosolice (în particular proteinaza C) implicate în fosforilarea proteinelor au rol central în transducerea semnalelor apoptotice. Pornirea apoptozei necesită inducerea unui program genetic nou. Este posibil ca şi oncogenele nucleare cu activitate reglatorie transcripţională să aibă un rol în apoptoză.

8.4.2. Genele supravieţuirii (gene antiapoptotice) Genele supravieţuirii sunt acelea care, în mod normal, acţionează ca o frână asupra mecanismului de moarte celulară normală. Dacă aceste gene sunt inactivate printr-o mutaţie, multe celule care ar trăi în mod normal mai departe sunt supuse, în acest caz, apoptozei. La organismul Caenorhabditis elegans,gena Ced-9 s-a dovedit că acţionează drept antogonist al morţii apoptotice celulare. Activarea anormală a acestei gene Ced-9 face ca moartea celulară să nu se mai producă. În cazul contrar, când se inactivează gena Ced-9, celula intră sub influenţa genelor Ced-3 şi Ced-4, care determină moartea precoce a respectivului organism. Astăzi este demonstrat faptul că asemenea gene de supravieţuire există şi în celulele mamiferelor. Astfel, la mamifere, s-a descris o proteină din constituţia membranei interne a mitocondriilor bcl-2, care, în condiţii de supraexprimare, determină inhibarea apoptozei.

189

Această proteină bcl-2 nu stimulează proliferarea celulară, ci favorizează supravieţuirea celulară într-o stare nonciclină; aceeaşi genă bcl-2 inhibă inducerea apoptozei de către gena c-myc şi face celulele mai puţin sensibile la radiaţii şi droguri citotoxice.

8.5.

Rolul apoptozei în embriogeneză şi dezvoltare

În prezent se ştie că echilibrul apoptotic joacă un rol important în embriogeneză şi dezvoltare. Exprimarea fiziologică a genei bcl-2 (inhibitoare a apoptozei) este prezentată în ţesuturile fetale unde probabil joacă un rol în dezvoltarea şi morfogeneza normală. Este demonstrat faptul că există un impact important al nutriţiei din cursul embriogenezei şi perioadei precoce de după naştere asupra dezvoltării nou-născutului şi evoluţiei individului în cursul vieţii adulte. La specia umană, greutatea mai mare la naştere şi alăptare la sân micşorează riscul dezvoltării bolilor cardiace la vârstă adultă. Pe modele animale s-a dovedit experimental existenţa unei tumorigeneze crescute în cazul în care respectivele animale au primit o dietă bogată în grăsimi în cursul embriogenezei, prin scăderea nivelului apoptozei, dar nu şi atunci când această dietă a fost administrată după naştere şi înţărcare. Respectivele efecte tumorigene imprimate de dieta bogată în grăsimi din cursul embriogenezei au apărut abia la a doua generaţie.

8.6.

Aspecte de reglare a apoptozei

De mare importanţă pentru un organism este menţinerea balanţei între genele letale şi genele de supravieţuire, dar modul în care se menţine această balanţă este în prezent foarte puţin cunoscut. Se ştie că semnalele extracelulare pot rupe această balanţă, rezultatul fiind supravieţuirea sau moartea, după cum sunt induse sau supresate respectivele gene. S-a dovedit că niveluri înalte ale proteinei corespunzătoare genei bcl-2 de la mamifere inhibă apoptoza, iar cele ale proteinei corespunzătoare genei Ced-9 de la nematodul Caenorhabditis elegans au un efect similar. Experienţa in vivo a demonstrat că, în absenţa hormonilor specifici, multe celule dependente de sistemul endocrin (de exemplu, neuronii şi oligodendrocitele) necesită pentru dezvoltare factori neurotrofici şi citokine, iar alte celule (tip celule hemotopoietice) necesită unul sau mai mulţi factori de stimulare (de exemplu, limfocitele T necesită interleukina 2). Trebuie menţionat cazul particular al blastomerelor, care supravieţuiesc şi se divid în cultură, în absenţa moleculelor semnal exogene; blastomerele sunt unicele celule embrionare care necesită un minimum de comunicare. În general, atât supravieţuirea cât şi proliferarea sunt simulate prin semnale provenite de la alte celule; se pare că există un control al mediului asupra vieţuirii şi morţii celulare.

8.6.1. Factori implicaţi în reglarea apoptozei • Factori inductori Printre factorii interni care declanşează şi controlează apoptoza se numără tiroxina, glucocorticoizii, retinoizii (molecule lipofile). Aceştia interacţionează cu receptorii nucleari, determinând activarea transcrierii genelor legate de inducerea apoptozei. S-a demonstrat, de asemenea, că un antigen de suprafaţă al timocitelor (antigenul Fas) este implicat în procesul de apoptoză. Agenţi externi nefiziologici, ca radiaţiile ionizate, substanţele toxice (toxine), drogurile (agenţi antitumorali chemoterapeutici), şocul termic ester-forbolul, ionii de Ca++, acţionează ca inductori ai apoptozei.

190

•

Factori inhibitori

Factorii de creştere, factorii de activare a macrofagelor, factorii serici şi citokinele (aTNF) inhibă apoptoza. De asemenea, la vertebrate, apoptoza este inhibată de către toţi inhibitorii sintezei ARN-ului, ai sintezei proteice, ai proteinkinazei, ai tirozinfosforilării, ai endonucleazelor, ai transaminazelor şi ai proteazelor. A fost evidenţiată existenţa unui timing (intrare în funcţie la un moment precis) al apoptozei, în special în cursul morfogenezei şi dezvoltării. Aceste aspecte sunt însă foarte greu de urmărit şi clarificat, deoarece citoplasma celulară şi nucleul celular sunt potenţial autonome în declanşarea procesului de apoptoză, şi anume: celulele fără nucleu pot declanşa apoptoza, dar şi nucleii pot declanşa modificări caracteristice de apoptoză în ADN-ul unor celule intacte. •

Glucocorticoizi – sistem imun – apoptoză

Nelson (1992) emite ipoteza conform căreia ar exista o implicare neuroendocrină în întârzierea îmbătrânirii ca urmare a dietei hipocalorice. La şoareci s-a demonstrat experimental că o dietă hipocalorică creşte nivelul glicocorticoizilor în cadrul ritmului circadian, cu începere înainte de miezul nopţii, atingând vârful chiar înainte de ora prânzului; scăderea nivelului de corticosteron are loc după administrarea hranei; acest rezultat demonstrează importanţa ritmului cardiac atunci când se urmăreşte măsurarea nivelelor circulatorii ale adrenocorticosteroizilor, cât şi faptul că reducerea raportului de colorii poate afecta semnificativ secreţia de adrenocorticoizi. Se pare că atât indigestia totală de calorii cât şi pattern-urile de alimentare (perioada de post cu hrănire intermitentă/acces continuu la hrană) ar putea influenţa viteza apoptozei şi a proliferării celulare. Hrana hipocalorică cronică creşte atât nivelul diurn al corticoizilor plasmatici, cât şi rata apoptozei. Hrănirea după o perioadă de post apare asociată cu o scădere a ratei de apoptoză. Dieta hipocalorică favorizează, prin creşterea nivelului corticoizilor (cu rol important în modularea apoptozei), întârzierea îmbătrânirii celulare şi a fenomenelor de tumorigeneză. Sistemul imun produce un mare exces de limfocite care sunt programate să moară dacă nu sunt recrutate pentru răspunsul imun. Se presupune că, în organele nonlimfoide, apoptoza este foarte restrânsă şi foarte rară în comparaţie cu cea în sistemul imun. La un individ normal, nivelul de corticoizi şi răspunsul glucocorticoid la stres scade cu vârsta, dar acest declin poate fi atenuat printr-o dietă hipocalorică. Nivelul crescut de corticoizi cu capacitate de a elimina selectiv, prin apoptoză, celulele limfoide în exces (de exemplu, celule T autoreactive ale sistemului imunitar) caracterizează un sistem imunitar tânăr. Prelungirea acestei capacităţi în cursul vieţii adulte ar putea fi întreţinută timp îndelungat printr-o dietă hipocalorică. Pentru menţinerea unei funcţii normale a timusului este necesar un anumit nivel de bază al glucocorticoizilor circulanţi. Celulele timice intrinseci exprimă enzime steroidogene şi produc pregnenolon şi dezoxicorticosteron. Se pare că aceşti steroizi sintetizaţi local acţionează într-o manieră paracrină. Faptul că glucocorticoizii pot fi sintetizaţi local de organele aparatului imunitar (incluzând aici şi timusul) ridică posibilitatea ca o dietă hipocalorică să aibă efecte favorabile asupra bolii autoimune, prin modularea generală local de glucocorticoizi. S-a avansat ipoteza conform căreia glucocorticoizii ar putea modula procesul de selecţie şi maturare, în cursul dezvoltării sistemului imun. Din cele prezentata mai sus reiese că sistemul imun incluzând timusul ar putea fi un focar important pentru dezvoltarea şi pentru efectele de maturare ale glucocorticoizilor, în funcţie de modularea dietei alimentare. Corticoizii (sintetizaţi fie sistemic, fie local) ar putea avea un efect critic asupra proceselor timice şi de imprinting, incluzând selecţia pozitivă a celulelor CD4 şi CD8. 191

•

Lipidele Ω - 3 şi apoptoza

Asocierea acizilor graşi saturaţi cu incidenţa crescută a bolilor cardiovasculare a determinat substituirea, în dieta alimentară, a grăsimilor saturate cu uleiuri vegetale nesaturate (Ω - 6). În SUA, consumul de grăsimi este 170 grame pe zi, din care 90% sunt de origine vegetală. Substituirea grăsimilor saturate cu uleiuri vegetale reduce cantitatea de colesterol şi de lipide LDL. Acizii graşi nesaturaţi şi metaboliţii lor servesc nu numai drept componenţi structurali ai celulelor şi ca substrat pentru sinteza prostaglandinelor, leucotrienelor şi trumboxanului, ci ei mediază şi exprimarea genelor. Acidul eicosapentaenoic (EAP) scade proliferarea şi stimulează apoptoza. Acidul arahidonic (care asigură fluiditatea membranelor celulare) poate activa receptorii nucleari pentru hormoni steroizi, tiroidieni şi retinoizi; această observaţie sugerează că acizii graşi polinesaturaţi ar putea avea efect direct asupra supresării genelor H-ras (p.221) În ultima vreme s-a trecut la utilizarea uleiurilor nesaturate Ω-3 extrase din peştele oceanic, constatându-se că acest tip de ulei a adus beneficii, ameliorând severitatea bolii autoimune şi prelungirea vieţii. Esenţial este că acest ulei de peşte să fie conservat cu anti-oxidanţi potriviţi (vitamina E), pentru a împiedica oxidarea şi reîncezeala în cursul perioadei de păstrare. Lipidele oxidate pot determina formarea de radicali liberi, ceea ce ar putea explica unele rezultate nefavorabile (contradictorii) obţinute în studiile anterioare referitoare la efectele uleiurilor de peşte. În prezent se recomandă o utilizare a uleiurilor de peşte Ω-3 ca supliment în dietă, dar cu condiţia îmbunătăţirii procesului tehnologic (cu adaos de antioxidanţi corespunzători). Uleiurile nesaturate Ω-3 şi Ω-6 duc la scăderea bolii arteriosclerotice; în plus Ω-3 au efect favorabil asupra funcţiei imune şi supresoare a tumorigenezei. S-a dovedit că consumul crescut de lipide Ω-3 are la om efecte benefice în caz de artrită, boli cardiovasculare, diabet, boli renale şi boli de piele. Efectul uleiurilor de peşte asupra apoptozei s-ar realiza prin exprimarea crescută a enzimelor antioxidante şi scăderea formării de radicali liberi. Lipidele Ω-3 cresc exprimarea enzimelor de tip superoxiddismutaza şi catalaza, care îndepărtează (mătură) radicalii liberi scad nivelul peroxizilor circulanţi, reduc stresul oxidativ cronic. Deci lipidele Ω-3, administrate în cadrul dietei alimentare, ar putea scădea producerea de radicali liberi şi ar menţine un nivel normal de apoptoză.

8. 7. Apoptoză – îmbătrânire – senescenţă Printr-un proces de apoptoză controlat genetic în cursul vieţii, se produce treptat o pierdere de masă celulară, ceea ce duce la îmbătrânire. Procesul normal de îmbătrânire evoluează către stadiul final de senescenţă, când celulele nu mai proliferează, devenind rezistente atât la proliferare cât şi la apoptoză. O dată cu înaintarea în vârstă scade eficienţa apoptozei, organismul fiind predispus la modificările legate de vârstă (degenerări, dereglări imune, tumorigeneză). Dereglarea apoptozei poate duce la alterarea funcţie imune, la dezvoltarea bolii autoimune şi la tumorigeneză. În prezent se ştie că o dietă hipocalorică (fără malnutriţie sau deficienţe de elemente esenţiale, dar cu scăderea aportului de carbohidraţi, proteine, grăsimi) duce la creşterea nivelului apoptozei, întârziind îmbătrânirea, prelungind perioada de viaţă şi întârziind momentul apariţiei modificărilor legate de vârstă (degenerări, dereglări imune, tumorigeneză); până în prezent sa dat totuşi prea puţină atenţie legăturii existente între prelungirea perioadei de viaţă (prin administrarea unei diete hipocalorice), pe de o parte, şi nivelul apoptozei, pe de altă parte. 192

Deşi mecanismele implicate în procesul de senescenţă şi tumorigeneză rămân insuficient clarificate, se cunoaşte faptul că acumularea de radicali liberi derivaţi dintr-un metabolism oxidativ şi leziunile celulare rezultate din acţionarea radicalilor liberi joacă un rol important în aceste fenomene. Printr-o dietă hipocalorică se poate reduce stresul oxidativ, homeostazia celulară fiind menţinută şi asigurându-se prelungirea vieţii.

8.8. Apoptoza şi starea de boal㠃 Agenţii infecţioşi virali şi infecţia virală Agenţii virali patogeni dezvoltă strategii pentru inhibarea apoptozei, permiţând astfel replicarea virală în celula gazdă, a cărei viaţă este prelungită. Astfel, s-a demonstrat că adenovirusurile, virusul papilloma uman şi SV40 pot modula apoptoza, prin interacţiunea unei proteine virale cu proteina celulară p53. În cazul infecţiei cu virusul HIV1, depleţia de limfocite este rezultatul unui proces complex, în care legătura glicoproteinei gp120 (de pe suprafaţa virusului HIV1) de antigenul CD4 al limfocitelor T CD4 face celula sensibilă la apoptoză, la a doua stimulare. Ţinând cont de acest aspect, Sindromul de Imunodeficienţă Acută la Om (SIDA) poate fi privit ca un dezechilibru între viteza morţii celulelor limfocite T CD4 şi procesul de reînnoire a acestor celule. Apoptoza crescută peste normal poate fi deci nocivă prin pierderea unor celule CD4, a căror prezenţă ar fi atât de necesară în cazul de mai sus. ƒ Boala autoimună Boala autoimună reprezintă o altă consecinţă a dereglării apoptozei în sistemul imunologic. În condiţii normale, limfocitele (autoreactive) mor prin apoptoză. Un deficit în deleţia (dispariţia, moartea) lor, predispune la boala autoimună. Supresia apoptozei joacă un rol important atât în bolile autoimune, cât şi în patogeneza cancerului (de exemplu în limfoame). Administrarea de glucocorticoizi exogeni ameliorează boala autoimună (de exemplu, lupusul eritematos) prin creşterea apoptozei. S-a observat de asemenea că o perioadă scurtă de post sau de regim hipocaloric are efecte evidente asupra sintezei de glucocorticoizi şi asupra creşterii apoptozei, care contribuie la eradicarea celulelor autoreactive din boala autoimună in vivo. S-a demonstrat că administrarea de uleiuri Ω-3 (din peşte oceanic) duce la supresia bolii autoimune şi la prelungirea vieţii. Celulele CD4-CD8- (precursoare ale celulelor timice T) rezistente la apoptoză, exprimă o cantitate mai mare de proteină bcl-2 decât celulele CD4+ şi CD8+ sensibile la apoptoză, confirmând astfel că ar exista o corelaţie între exprimarea genei bcl-2 şi rezistenţa la apoptoză. ƒ

Apoptoza şi procesul de oncogeneză

Procesul neoplazic este înţeles astăzi drept o dereglare a echilibrului apoptoză/proliferare celulară. Conform ipotezei lui Stryer (1991), toate genele oncogene cunoscute până astăzi ar fi forme alterate ale genelor celulare normale. Aceste gene oncogene pot influenţa circuitele moleculare care controlează creşterea şi dezvoltarea. În acest context trebuie privită şi acţiunea genei protooncogene celulare c-myc. În condiţii normale, gena c-myc, menţine un echilibru între proliferarea celulară şi apoptoză. În condiţii anormale, un retrovirus cu rol declanşator, prin inserţie pe respectiva genă protooncogenă, poate activa transcrierea genei c-myc, ceea ce are drept consecinţă o dereglare a echilibrului apoptoză/proliferare celulară; în aceste condiţii de dereglare a 193

apoptozei, apare o deteriorare a funcţiei sistemului imun şi o creştere a riscului de tumorigeneză o dată cu înaintarea în vârstă. Prin activarea produsă prin inserţia retrovirusului, gena protooncogenă c-myc devine oncogenă (implicată în geneza limfomului Burkitt). Se admite astăzi că procesul de oncogeneză apare în urma unor modificări de replicare a ADN, când se produce o acumulare anormală de celule cu mutaţie. În general, proporţia dintre diviziunea celulară şi moartea celulară determină viteza de dezvoltare a unui proces oncogen. Unele celule canceroase se divid mult mai încet decât celulele normale, dar procesul neoplazic se poate totuşi întinde din cauza perioadei de viaţă prelungite a respectivei celule. Apoptoza trebuie privită ca o măsură de protecţie care previne transformarea malignă. În organisme au evoluat mecanisme eficiente pentru eliminarea celulelor cu leziuni genetice (rezultate dintr-o diviziune neprogramată), supunând aceste celule transformate apoptozei, drept răspuns la semnalele adverse de creştere. Luvers, apariţia unei tumori necesită evenimente genetice secundare care să atrage calea apoptotică; cel mai bun exemplu în acest sens sunt evenimentele mutaţionale suferite de gena gp53 supresoare de tumori. Produsul genei gp53 normale a fost numit “poliţistul molecular“, deoarece induce poptoza în celulele care au suferit leziuni ireversibile ale ADN. Mutaţii ale genei supresoare ale tumorii gb53 reprezintă una din alterările genetice cel mai frecvent semnalate în cazul tumorilor umane. Genele codificatoare de proteine care conferă rezistenţă la apoptoză ar putea fi, de asemenea, incriminate în oncogeneză; o asemenea genă ar fi protooncogenă bc1-2 (genă mitocondrială), care inhibă apoptoza într-un număr de tipuri celulare.

194

Capitolul 9 PROCESUL DE ÎMBATRÎNIRE-SENESCENŢA Sedlow 1974 şi Curtis 1996 indică strânsa interrelaţie /eficenţa reparării ADN-ului (prin excizia leziunilor) şi durata de viaţa a speciilor. La mamifere (inclusiv la om) perioada lungă de viaţa se găseşte sub controlul unui număr foarte mare de gene (control poligenic), şi anume: ƒ gene pentru replicarea corectă a ADN-ului; ƒ gene pentru repararea ADN-ului; ƒ gene pentru sinteza de factori antioxidanţi (enzime etc.); ƒ gene pentru sinteza corectă a proteinelor; ƒ gene pentru supresia de tumori; ƒ gene pentru reglarea activităţii sistemului inimi. După maturarea totală a unui organism, începe procesul îmbătrânirii, acesta reprezentând inexorabilul declin al capacitaţi de menţinere homeostaziei fiziologice. Îmbătrânirea reprezintă pierderea treptată a masei celulare dintr-un organism, prin apoptoza controlată genetic. Pierderea celulelor premature sau excesive, în cursul unui proces de îmbătrânire precoce (de exemplu, sindromul Werner) poate duce la disfuncţie de organ sau boală. Procesul normal de îmbătrânire evoluează treptat către senescenţă. Senescenţa este stadiul final al îmbătrânirii când celulele nu mai proliferează, ele devenind rezistente atât la proliferare, cât şi la apoptoză (celulele devin senescente în momentul în care telomerele devin brusc prea scurte şi nu mai pot suporta o nouă diviziune celulară).

9.1. Gene implicate în controlul senescenţei Senescenţa este o caracteristică a organismelor superioare. Acest proces se află sub un control genetic activ, fiind implicate trei categorii de gene: ƒ Gene reglatoare pentru menţinerea integrităţii somatice şi a proceselor de reparare. Aceste gene reglează sistemele intracelulare (mecanismul de reparare a ADN-ului, acţiunea enzimelor antioxidante) până la mecanismele de turnover celular (ale sistemului imun, ale structurilor epidermice etc.) Prin reglarea acestor procese, activitatea respectivelor gene menţine un nivel înalt de protecţie faţă de agenţii de stress intrinseci şi extrinseci, împiedicând acumularea de leziuni somatice responsabile de producerea senescenţei. ƒ

Gene pleiotrope. Aceste gene conferă avantaje în stadiile timpurii de viaţă, dar ulterior suferă deleţii, având în consecinţă o serie de efecte negative asupra organismului.

ƒ

Factori genetici individuali. Aceşti factori determină fenotipurile procesului de îmbătrânire-senescenţă, care ulterior este modular (amplificat sau menţinut la nivel scăzut) prin acţiunea agenţilor din mediu extern. În reglarea îmbătrânirii celulară şi a senescenţei, un rol important are, după ultimele date un ceas (un mecanism programator) reprezentat de telomere. Acestea sunt secvenţe repetitive de ADN situate la extremităţile libere ale cromozomilor liniari. Astfel la om capetele cromozomilor conţin 2-3kb de unităţi repetitive telomerice, (TTAGGG), în ADN-ul telomeric, secvenţele TTAGGG sunt orientate cu extremităţile bogate în G spre capul 3 OH 195

al firului de ADN, apărând astfel, în final, orientate în tandem pe cele două fire ale dublului lanţ de ADN cromozomial cu capete libere. Telomerele nu sunt codificatoare (nu conţin gene), în celule, ele au rol de a cronometra fiecare diviziune celulară, probabil datorită acţiunii enzimei telomeraza. Telomelere sunt structuri importante ale arhitecturii cromozomiale, în condiţii normale, ele împiedică fuziunea extremităţilor cromozomiale cât şi dezintegrarea ADN-ului fiind totodată şi responsabil de fixarea cromozomilor pe membrana nucleară. Telomerele au fost deja clonate şi secvenţiate (ADN-ul telomeric reprezentând 0,03% din totalul ADN-ului genomului uman). Ele nu se sintetizează în cadrul ciclului de replicare a lanţului ADN corespunzător ci separat sub acţiunea telomerazei. Sub acţiunea acesteia se adună mai întâi blocuri de oligonucleotide telomerice care se fixează la capul 3’-OH al lanţului ADN matriţa (fig 126). Telomeraza (complex ribonucleioproteic) orientează capetele băgate în G ale respectivelor secvenţelor telomerice spre extremitatea 3’-OH a lanţului matriţă. Această alungire a lanţului matrice duce la formarea unui loop astfel încât capătul 3’OH ajunge să servească drept primer pentru sinteza unor noi secvenţe nucleotidice telomerice în apropierea lanţului fiică.. ADN-ligaza ajută la fixarea acestor noi secvenţe telometrice la capătul 5’ al lanţului fiică iar apoi nick-aza clivează loop-ul la nivelul subsecventelor telomerice (secvenţe incomplet sintetizate) astfel încât, în final, capetele celor două fire de ADN să rămână libere. Pe cele două fire de ADN telomerele sunt formate din secvenţe repetitive identice dar aşezate în tandem (5’-TTAGGG faţă de TTAGGG-3’-OH). Rezultă o catenă fiică de aceeaşi lungime cu catena matrice dar cu secvenţe telomerice mai puţin numeroase; această catena fiică va juca rol de matriţă în runda următoare de replicare şi va da naştere unei noi catene fiice cu un număr şi mai mic de secvenţe telomerice astfel încât, după un număr de replici, catena fiică rezultată, cu telomerul foarte scurt va deveni incapabilă de o nouă replicare.

Fig. 126 - Terminalizarea cromozomilor sub acţiunea telomerazelor Nu se cunoaşte încă bine interrelaţia dintre apoptoză şi lungimea tolomerelor, în cursul perioadei de îmbătrânire; se ştie doar că apoptoză întârzie îmbătrânirea şi supresează tumorigeneza, acest fenomen fiind acompaniat atât de supresarea leziunilor celulare cumulative, cât şi de ce a leziunilor ADN.

9. 2. Principalele mecanisme (ipotetice) implicate în senescenţă Aceste mecanisme sunt: • Acumularea de mutaţi somatice; • Acumularea de leziuni oxidative; • Acumularea de proteine aberante; • Acumularea de mutaţii în ADN-ul mitocondrial.

196

Plecându-se de la studiul acestor patru mecanisme, care au o acţiune sinergică, s-a ajuns la elaborarea unei teorii a reţelei prin care se încearcă ipotetic să se explice astăzi intrigarea şi interacţiunea la nivel molecular a mecanismelor implicate în procesul de senescenţă (fig. 127).

Fig. 127 - Reţeaua interacţiunilor dintre diferite mecanisme intracelulare ipotetice implicate în procesul de senescenţă (după Kingwood, 1996). A. Acumularea de mutaţii somatice În culturile de ţesuturi prenatale provenite de la rozătoare s-a demonstrat că celulele au capacitate foarte înaltă de reparare ADN, această capacitate scăzând o dată cu creşterea numărului de pasaje. Culturile celulare de fibroblaste umane diploide au oferit, de asemenea, un model experimental excelent pentru studiul fenomenelor de înbătrînire; pe acest model s-a demonstrat că pentru respectivele celule, după o perioadă de multiplicare activă, timpul de generaţie creşte, iar apoi mitoza încetează progresiv (perioadă de senescenţă); potenţialul de creştere în cultură a acestor celule este invers proporţional cu vârsta donatorului de celule. O dată cu înaintarea în vârstă, eficenţa apoptozei scade, organismul fiind mai predispus la modificările de vârstă (degenerări, dereglări imune, tumorigeneza). În celulele vârstnice există o frecvenţă înaltă de ruperi de lanţuri ADN (probabil prin acumularea situs-uri labile la alcalii); concomitent apar modificări ale histonelor, care îngreunează accesibilitatea enzimelor la nivelul cromatinei, în vederea acţiunii de reparare a ADN. Organismele care trăiesc mai mult timp fie acumulează în cursul vieţii cantităţi mai mari de ADN lezat decât organismele cu viaţă mai scurtă, fie posedă sistem de reparare ADN mult mai eficient. Multe teorii referitoare la îmbătrânirea celulară se bazează pe ipoteza leziunii genomului celular somatic,multe dintre aceste teorii postulează o relaţie între viaţa celulei şi apariţia leziunilor (erorilor) ADN. Pînă în prezent mutaţiile somatice au fost studiate foarte puţin. Un asemenea exemplu de mutaţii somatice apărut la un moment dat în cursul vieţii în organisme este apariţia unui spot bleu pe un iris brun. George Martin de la Universitatea Washington din Seattle (1996) estimează că mutaţiile care ating 7% din genomul uman pot avea capacitatea de a modula apariţia unui fenotip al procesului de îmbătrânire la om.

197

O singură mutaţie nu este suficientă pentru declanşarea unui proces de îmbătrânire, ci sunt necesare cel puţin câteva mutaţii pentru a modula aspectele multiple ale unui fenotip de îmbătrânire (de exemplu sindromul Werner la adulţi sau sindromul Giolford la copii). În aceste două sindroame a fost evidenţiată o mutaţie tip deleţie pe braţul scurt al cromozomului 8 (Gotto şi colab 1982). Strânsa interrelaţie dintre mutaţii şi îmbătrânire a fost demonstrată şi de constatarea existenţei unui grup semnificativ de patern-uri de mutaţii somatice specifice de specie în cursul procesului de îmbătrânire la mamifere .Tot la mamifere s-a constatat că frecvenţa unor mutaţii intragenice şi cromozomiale se află invers cu longevitatea respectivului organism, cu cît numărul este mai mare cu atât viaţa respectivului organism este mai scurtă. B. Acumulare de leziuni oxidative Produşii oxidanţi rezultaţi din metabolismul normal determină treptat o dată cu înaintarea în vârstă, leziuni ale ADN-ului proteinelor şi lipidelor. Acţiunea acestor produşi este echivalenta cu cea a radiaţiilor. Aceşti produşi oxidanţi contribuie la : - procesul de îmbătrânire; - producerea de boli degenerative (prin leziuni somatice celulare, o dată cu îmbătrânirea: cancer, boli cardiace, disfuncţii imunologice şi cerebrale, cataracta). Experimental, s-a demonstrat că leziunile oxidative ale ADN-ului se acumulează o dată cu vârsta, un şoarece devenind astfel bătrân în numai doi ani (când se acumulează circa un milion de leziuni ADN per celulă). Deşi organismele posedă factori de apărare cu acţiune antioxidantă (ascorbat tocoferoli, carotenoizi, sistem enzimatic auto oxidant tip superooxiddismutaza), ADN-ul suferă efecte oxidante care se acumulează cu vârsta, deoarece respectivele sisteme de apărare nu sunt perfecte. Numărul loviturilor oxidante asupra ADN-ului per celulă şi per zi este de circa 100 000 la şoarece şi de zece ori mai mic la om. Enzimele de reparare a ADN-ului îndepărtează eficient un număr mare de leziuni, dar nu reuşesc nici ele să le îndepărteze pe toate. Mutaţiile se acumulează o dată cu vârsta prin multiplicarea respectivelor leziunilor ADN în cursul diviziunilor celulare. În cursul fosforilărilor oxidative se produc substanţe oxidante la nivelul mitocondriilor, având drept consecinţă un nivel de zece ori mai mare al leziunilor oxidative la nivelul ADN-ului mitocondrial decât la nivelul ADN –ului nuclear. Celulele se apără singure împotriva unui număr mare de leziuni printr-un turnover constant mitocondrial, prin care se îndepărtează, probabil, mitocondriile alterate (care produc un număr mare de substanţe oxidante). Totuşi leziunile oxidative reuşesc să se acumuleze cu vârsta, mai mult în ADN –ul mitocondrial decât în cel nuclear. Substanţele oxidante produc leziuni şi la nivelul proteinelor, enzimele proteolitice protectoare care hidrolizează proteinele oxidante nu sunt suficiente pentru a împiedica acumularea de proteine oxidate o dată cu înaintarea în vârstă. George Martin de la Departamentul de Patologie şi Genetică al Universităţi Washington din Seattler arată că există o strânsă legătură între îmbătrânirea biologică intrinsecă şi biologia neoplozilor, această interrelaţia dezvoltându-se pe baza unei instabilităţi genomice. Cel puţin pentru regnul animal, se consideră astăzi că biologi neoploziei este un aspect particular al îmbătrânirii precoce intrinsece (de exemplu, adenocarcinoamele de colon şi prostata). Ca şi în cazul senescenţei, se pare că în procesul de tumorigeneza radicalii liberi derivaţi dintr-un metabolism oxidativ au un rol important în provocarea leziunilor celulare. C. Acumulare de proteine aberante S-a arătat deja la capitolul referitor la acumularea de mutaţii somatice că o dată cu înaintarea în vârstă apar histone modificate, care îngreunează accesibilitatea enzimelor de reparare la nivelul cromatinei, în vederea reparării ADN.

198

Una dintre teoriile îmbătrâniri celulare (teoria lui Orgel) susţine că apariţia întâmplătoare a cromozomilor în genomul celular ar explica acumularea de anomalii în moleculele proteice esenţiale din organism. Din punct de vedere teoretic, un asemenea fenomen s-ar explica prin acumularea treptată de ADN, care duce la deteriorarea mai mult sau mai puţin rapidă a mecanismelor de transcriere şi translaţie, având drept consecinţă sinteza unor proteine deficitare şi scurtarea vieţii. Cercetările din ultimii ani menţionează alterarea sintezei unor proteine reglatoare în perioada de creştere somatică, ca urmare a unor fenomene epigenice ce apar în cursul vieţii, subliniind rolul acestor fenomene în procesul de îmbătrînire. Prin fenomene epigenice (epimutaţii) se înţeleg acele evenimente acumulate care pot duce la alternarea structurii şi funcţiei genelor, fără apariţia unei modificări în senescenţa primară a nucleotidelor. În acest fenomen s-ar încadra reactivările (paradoxale) unor anumite locusu-uri de pe cromozom (de exemplu cromozomul x la şoarece) drept consecinţă a unor modificări ale stării de metilare a citozinei de pe lanţul ADN cromozomial. În 1983 Wilson şi Jones arată că metilarea ADN-ului scade o dată cu vârsta (cu excepţia celulelor neopolizice). Faptul că alterări în metilarea ADN-ului au fost observate la şoareci cu vârsta de 6 luni demonstrează că aceste modificări sunt determinate viitoarea dezvoltare şi adaptare, consecinţa acestor modificări fiind tulburarea sintezei unor proteine reglatoare în perioada de creştere somatică. Din datele acumulate până în prezent s-a putut conchide că procesul de alterare a metilării ADN-ului, o dată iniţiat, evoluează permanent, ducând tardiv în cursul vieţii la efecte negative, atunci când forţa de selecţie naturală a organismului scade evident. Un alt aspect al acumulării de proteine aberante este cel al acumulării cu mult peste nivelul normal admis de proteine oxidante în organism; această situaţie duce la declanşarea unuia dintre cele două sindroame de îmbătrânire prematură: sindromul Werner şi sindromul Hutchinson Gilford (progeria). În aceste sindroame de îmbătrânire precoce la om se produce o pierdere celulară prematură şi excesivă, având drept consecinţă disfuncţii de organe şi instalare unei stări de boală. Sindromul Werner este o boală autosomală de tip recesiv caracterizată printr-un număr mare de degeneraţi tipice; prima manifestare este întârzierea creşteri urmată de albirea părului atrofia ţesutului subcutant şi a pielii, hiprekeratoza căderea generalizată a părului, alterarea vocii, cataracta bilaterală, ulceraţii ale pielii în jumătate din cazuri apare diabetul zaharat; alte semne tipice arterioscleroza severă, osteoporoza, atrofia musculară scheletică, degenerescenţa gravă testiculară, durata medie de viaţă de 47 de ani, în 10% din cazuri apar neoplasme. În acest sindrom a fost evidenţiat un linkaj genetic constituit din 5 markeri pe cromozomul 8 (Gotto et al. 1992). Sindromul Rothmund Thomson este o afecţiune congenitală transmisă recesiv, considerată de unii autorii drept o variantă a sindromului Werner. Sindromul Hutchinson Gilford (progeri) este o afecţiune autosomală cu transmisie recesivă, cu semn de senilitate evidentă deja la vârsta de 10 ani. Boala prezintă complicaţii de tip arterioscleroză coronariana, care determină moartea pacienţilor în primii 20 de ani de viaţa. Pe culturi celulare provenite de la persoane cu acest sindrom, Epstein şi colaboratorii au evidenţiat o restaurare defectuoasă a ADN-ului. Celulele nu au supravieţuit în cultură mai mult de 11 generaţii, celulele au fost incapabile să restaureze corect lanţurile de ADN, după expunerea la raza y şi cobalt. D. Acumularea de mutaţii în ADN-ul mitocondrial (ADNmt) Se consideră ca într-un organism normal (cel puţin teoretic) toate moleculele de ADNmt sunt identice; această situaţie caracterizează starea de homoplasmie. În cazul unei boli mitocondriale cu mutaţii (de exemplu deleţie) respectivul organism conţine mai multe tipuri de ADNmt, situaţia care caracterizează starea de heteroplasmie. Starea de heteroplasmie poate apărea şi la un individ normal, o dată cu înaintare în vârstă; o 199

deleţie, o dată apărută pe ADNmt, se multiplică exponenţial cu vârsta. Nivelele cele mai înalte de deleţie au fost evidenţiate postmitotic în ţesuturile aerobe muşchi scheletici, muşchiul cardiac şi SNC). Aceste observaţii au crescut interesul cercetătorilor pentru rolul jucat de mutaţiile de la nivelul ADNmt în cursul procesului de îmbătrânire şi în cel al bolilor neurodegenerative. În cursul procesului normal de îmbătrânire la un individ sănătos, proporţia de ADNmt cu deleţie este în foarte rare cazuri mai mare de 0,1% din totalul ADNmt şi poate fi detectată numai prin reacţia polimerizării în lanţ; reiese deci că nu este încă clarificat dacă orice deficit funcţional poate fi legat de acest tip de mutaţie. În schimb în bolile mitocondriale bazată pe selecţii ale ADNmt, proporţia de ADNmt, cu deleţie trebuie să reprezinte mai mult de 60% din ADNmt total pentru a putea fi exprimat fenotipic. Leziunile oxidative continue ale ADN-ului sunt responsabile de scăderea capacitaţii de fosforilare oxidativă o dată cu înaintarea în vârsta. Se pare că un proces similar ar fi implicat în pierderea de neuroni, predispunând astfel organism la unul din fenotipurile neurodegenerative tip boala Parkinson, boala Huntington sau boala Alzheimer. La om este astăzi dovedit statistic că o dată cu vârsta creşte şi incidenţa bolilor. Constatările de până în prezent ne permit să afirmăm că există o relaţie directă între procesul de îmbătrânire şi boală, deşi natura precisă a acestei relaţii nu este încă dovedită experimental din considerente etice. Este foarte greu de afirmat că la o vârstă înaintată (de 90 ani sau mai mult), într-un organism chiar aparent sănătos nu au apărut modificări patologice în corp, creier, sistemul senzorial, chiar dacă acea persoană nu a fost diagnosticată cu o anumită boală specifică. Modificări la nivelul anumitor organe apar în mod normal o dată cu vârsta, căci senescenţa, deşi este un proces fiziologic normal, implică apariţia unor aspecte anormale. Astfel în cursul senescenţei se produce, treptat, o modificare a genotipului somatic şi totodată acumularea unor defecte care pot duce la un moment dat la conturarea unui anumit fenotip (de boală). Unele boli apar cu frecvenţă mai mare la vârstă mai înaintată, deoarece mecanismele cauzale necesită probabil un timp pentru ca efectele lor să devină evidente. Astfel acumularea de alterări somatice pot duce, în cadrul bolilor degenerative asociate procesului de îmbătrânire, la malignizarea într-o linie celulară. În contextul relaţiei mai sus amintite, îmbătrânirea-boală se poate afirma că există o relaţie fundamentală directă între îmbătrânire şi cancer. Se pare că acelaşi mecanism care protejează organismul împotriva acumulării unor leziuni responsabile de senescenţă protejează organismul şi împotriva unor mutaţii ce duc la declanşarea cancerului. Astăzi sunt consideraţi factori care întârzie (protejează organismul de) senescenţă: dieta hipocalorică şi exerciţiul fizic. La om, este dovedit că subnutriţia creşte ulterior în viaţă, riscul de hipertensiune şi boli cardiovasculare. În schimb, nutriţia hipocalorică postnatală, la rozătoare duce la creşterea evidentă a duratei de viaţă. Implicaţiile interacţiunii dintre dieta hipercalorică şi mecanismul fundamental care reglează senescenţa şi durata vieţii la om rămâne încă a fi investigat în detaliu. Referitor la exerciţiul fizic se consideră că acesta aplică cu regularitate la om poate ameliora modificările legate de vârstă la nivelul mitocondriilor din ţesutul muscular. Exerciţiul fizic, prin creşterea vitezei turnover-ului la nivelul mitocondriilor, întârzie îmbătrânirea aparatului mitocondrial din ţesutul muscular.

200

Capitolul 10 RĂSPUNSUL IMUNITAR 10. 1. Noţiuni generale despre imunitate şi sistem imunitar Imunitatea reprezintă capacitatea de a recunoaşte şi neutraliza macromolecule sau celule străine organismului şi care, pătrunse în mediul intern, ar putea produce dereglări ale homeostaziei. Imunitatea înlătură, în afară de substanţele străine şi pe cele proprii organismului, dar pe care acesta nu le mai recunoaşte ca proprii, din cauză că au suferit anumite modificări. Imunitatea poate fi moştenită (naturală), când s-a instalat ca urmare a contactului generaţiilor anterioare cu un anumit antigen şi se transmite ereditar, sau poate fi dobândită, ca urmare a contactului prealabil al organismului cu un anumit antigen (imunitate consecutivă anumitor boli infecţioase). Imunitatea poate fi dobândită şi artificial, prin vaccinuri care conţin germeni atenuaţi sau morţi – imunitate activă, sau prin administrarea unor seruri imune conţinând anticorpi specifici – imunitate pasivă. Sistemul imunitar este un sistem responsabil cu apărarea organismului împotriva efectelor nocive ale corpurilor străine (antigeni). Principala funţie a sistemului imunitar este de a recunoaşte şi ataca antigenii străini. Răspunsurile imunitare sunt de două tipuri: 1. Răspunsuri umorale - ce constau în generarea de anticorpi, (proteine cu structuri similare), cunoscute sub numele de imunoglobuline şi care sunt specifici unui anumit antigen; în cadrul răspunsului imunitar umoral specific, anticorpii sunt produşi pe calea stimulării limfotitelor B sau a celulelor plasmatice (plasmocite). 2. Răspunsuri celulare - de exemplu infiltrarea limfocitelor în pielea sau organul grefat. Răspunsul imunitar celular este generat de limfocitele T, care stimulate specific devin celule T efectoare. Celulele T sunt de mai multe feluri în funcţie de natura reacţiei pe care o determină. Astfel, celulele T pot să: - amplifice răspunsul imunitar (celular T ajutătoare); - reducă răspunsul imunitar (celule T supresoare); - distrugă efectiv celelele ţintă (celule T citotoxice). Răspunsul imunitar umoral este important pentru infecţiile bacteriene, iar răspunsul imunitar celular pentru acţiunea organismului asupra celulelor maligne, a transplatelor tisulare şi infecţiilor (ciuperci sau fungi). Limfocitele au un rol deosebit de important în cazul, ambelor tipuri de răspuns imunitar, demonstrându-se că aceste celule pot transforma de la un organism la altul capacitatea de a produce anticorpi şi de a rejecta grefele .Această capacitate de transfer a limfocitelor face ca ele să joace un rol cheie în apariţia răspunsurilor imunitare. Răspunsul imunitar celular este dependent de starea timusului de aceea limfocitele respective poartă numele de celule T (timus dependente). Similar, limfocitele producătoare de anticorpi, care sunt dependente de măduva osoasă poartă numele de celule B (de la bursa lui Fabricius, organ limfoid prezent la păsări, timus independente). Sistemul imunitar acţioneză deci ca un sistem defensiv în cazul apariţiilor unor infecţii. Din această cauză, persoanele cu deficienţe imunitare congenitale, dacă sunt netratate, nu pot supravieţui (fig. 128). Un răspuns imunitar constă din două părţi: 1. răspunsul specific la un anumit antigen; 2. creştere nespecifică a efectului răspunsului. În cazul răspunsului imunitar specific, acesta este mai rapid şi cu o amploare mai mare în cazul în care reîntâlneşte un antigen particular. Această comportare poartă numele de memorie imunitară, şi este cea care asigură eficienţa ridicată a acţinii sistemului imunitar. 201

Fig. 128 - Componentele sistemului imun Un răspuns are două faze: 1. faza de recunoaştere - în care antigenul este recunoscut ca un corp străin; 2. faza activă în care aticorpii elimină antigenul

10.2. Organizarea sistemului imunitar Celulele esenţiale pentru generarea răspunsului imunitar, limfocitele işi au originea în măduva oaselor. Din cadrul sismului imunitar fac parte două categorii de organe: 1. Organe limfocitare primare: timusul şi măduva osoasă ce conţin celule care dezvoltă un proces de maturare a celulelor sensibile la antigeni; 2. Organe limfocitare secundare: nodulii limfocitari, splina şi ţesuturi limfocitare asociate mucoaselor care sunt cele ce conţin celule sensibile la antigeni aflate intr-un circuit de recirculare prin organism. 3. Celule libere, circulante în fluxul sanguin. Din această categorie fac parte limfocitele, macrofagele, neutrofilele, bazofilele, eozinofilele. Celula centrală in imunologie este limfocitul. Limfocitele sunt componente celulare specifice pentru antigeni. Ele acţionează prin receptorii de pe suprafaţa membranei, fiecare receptor având o înaltă specificitate. Diferite clone limfocitare au propria lor specificitate unică. Studiul markerilor de pe suprafaţa limfocitară şi a activităţii lor funcţionale a permis identificarea celor două populaţii de limfocite T (timus dependente) şi B (bursodependente – de la bursa lui Fabricius, organ limfoid întâlnit la păsări, timus independente). Celulele T şi B circulă prin organism pe un traseu bine stabilit prin organele limfocitare secundare. Cele mai multe celule limfocite care sunt recirculate sunt cele de tip T, al căror ciclu complet durează aproximativ 24 de ore, dar sunt recirculate şi celule B, inclusiv cele care au „memorie". Originea limfocitelor şi diferenţierea. La mamifere precursorii limfocitelor apar în insule sanguine din sacul vitelin şi migrează prin placentă în ficat, splină şi măduvă osoasă. În timpul vieţii măduva osoasă produce celule susă care au printre descendenţii lor şi precursorii limfocitelor. Limfocitele T. Sunt derivate din timus sau influenţate de timus în timpul dezvoltării lor. Ele migrează încă din timpul vieţii fetale în timus unde se diferenţiază diferit în zona corticală, faţă de zona medulară. În zona corticală, aproximativ 90% din celulele T se divid rapid, conţin pe suprafaţă mulţi antigeni şi sunt sensibilile la liza prin acţiunea corticosteroizilor. În zona medulară, limfocitele în număr redus sunt rezistente la cortizon, se divid lent şi conţin pe suprafaţă puţini antigeni. Celulele care părăsesc timusul dobândesc receptorul pentru antigen, intră în organe limfoide secundare (ganglioni limfatici, splină) şi se localizează în arii timodependente. Aceste celule T au viaţă scurtă. Dacă sunt expuse la antigen se maturizează în celule sensibilizate care sunt circulante şi au viaţă lungă. Aceste celule sunt capabile să se transforme în celule efectoare timice dacă sunt reexpuse la antigen. Limfocitele T sunt răspunzătoare de reactivitatea cutanată întârziată, apărarea împotriva anumitor microorganisme, fungi, bacterii patogene, virusuri, respingerea alogrefelor, imunitatea antitumorală. Limfocitele T nu produc anticorpi circulanţi şi nu dau naştere la celule secretoare de anticorpi. Există două categorii funcţionale de limfocite T: limfocite T 202

reglatoare care pot amplifica (celule helper) sau pot suprima (celule supresoare) răspunsurile altor limfocite (T sau B) şi limfocite T efectoare, răspunzătoare de reacţii imune mediate celular, cum sunt: reacţiile de hipersensibilitate cutanată întârziată, respingerea de grefe şi tumori, eliminarea de celule infectate etc. Din această categorie fac parte limfocitele T citotoxice (celule killer), care participă ultimile la răspunsul imun şi limfocitele T de hipersensibilitate întârziată, care eliberează limfokine (citokine), glicoproteine care mediază răspunsul inflamator. Limfocitele B. Limfocitele B şi celulele plasmatice produc anticorpi sau imunoglobuline (Ig), proteine plasmatice circulante şi sunt răspunzătoare de imunitatea umorală. După generarea lor în măduva osoasă, celulele B imunocompetente migrează în arii specifice din organe limfoide periferice. Aceste celule au viaţă scurtă ca şi celulele T şi necesită expunerea la antigen pentru a se maturiza în celule B sensibilizate, recirculante, care răspund la reexpunerea la antigen prin proliferare şi diferenţiere prin celule B de memorie şi plasmocite. Rolul principal al limfocitelor B este în realizarea imunităţii rapide. Răspunsul imun primar are loc la primul contact al limfocitului cu antigenul. Limfocitul se transformă în limfoblast (imunoblast) care are un nucleu palid cu o cantitate mare de eucromatină şi 2 - 4 nucleoli. După activare, limfocitele B se divid şi dau naştere la clone celulare B. Unele limfoblaste se diferenţiază în plasmocite, celule care produc imunoglobuline, iar altele devin circulante, transformându-se în celule cu memorie, reţinând în memoria lor primul contact cu acelaşi antigen. Se dezvoltă astfel un răspuns imun secundar, prin care la un nou contact cu antigenul, celulele cu memorie îl recunosc şi se transformă mai rapid în imunoblaste.

10.3. Molecule cu rol esenţial în cadru sistemului imunitar 10.3.1. Antigenii Antigenul (Ag) este capabil să provoace un răspuns imun. El reacţionează atât cu receptorii celulelor T, cât şi cu anticorpii. O moleculă antigenică poate avea mai mulţi determinanţi antigenici (epitopi): fiecare epitop se poate lega cu un anticorp individual şi o singură moleculă care poate deci provoca mai multe molecule de anticorpi. Anumite molecule numite haptene deşi nu sunt capabile să provoace răspunsuri imunitare ele însele, pot însă să reacţioneze cu anticorpi existenţi şi cu celule T receptoare. Asemenea molecule trebuie să se asocieze cu moleculele - purtător pentru a fi antigeni. Pentru anumite chimicale, cum ar fi medicamentele, purtătorul poate fi o (auto)proteină gazdă. Structura terţiară, ca şi secvenţa de aminoacid este importantă pentru determinarea caracterului antigenic. Lipidele pure nu sunt antigeni (nu provoacă un răspuns imun), iar acizii nucleici sunt de asemenea slabi antigeni. Antigenii sunt la rândul lor împărţiţi în mai multe categorii, în funcţie de factorii necesari a interveni pentru provocarea răspunsului imun, astfel : a. antigeni dependenţi de timus necesită participarea celulelor T pentru a provoca producerea de anticorpi (exemple de asemenea antigeni sunt serurile de proteine străine şi celulele roşii străine de corp); b. antigeni independenţi de timus: nu necesită celule T pentru producţia de anticorpi, ei stimulând direct limfocitele B pentru a produce anticorpi Ig; asemenea antigeni sunt polizaharidele bacteriale (din pereţii celulari bacteriali) şi endotoxinele. Există şi alţi factori diferiţi de proprietăţile intrinseci ale antigenilor, care influenţează calitatea răspunsului imun, printre care se pot enumera: natura moleculelor (conţinutul de proteine, mărimea, solubilitatea); doza (mică, moderată, mare); calea de intrare (injecţie intradermale, intramusculară, intravenoasă, subcutanată, pe cale orală, inhalare); adăugarea unor substanţe cu efect sinergetic, de exemplu adjuvante alţi antigeni etc.; factorii genetici. 203

10.3.2. Anticorpii Anticorpii (Ac) sau imunoglobulinele (Ig) sunt molecule proteice heterogene cu proprietatea de asociere specifică cu substanţa care a provocat formarea lor (antigenul). Sunt produşi de celulele B şi plasmocite, provenite din celule B. Cu excepţia Ig naturale, anticorpii se formează ca răspuns la o substanţă străină (Ag). Ig reprezintă receptorul celulei B pentru Ag. Imunoglbulinele reprezintă 20 % din totalul proteinelor plasmatice. La electroforeza serului, majoritatea Ig migrează spre gamaglobuline, dar cantităţi semnificative migrează şi spre zona betaglobulinică; diferite cantităţi de Ig se găsesc în lichidele extravasculare, în secreţii exocrine, pe suprafaţa limfocitelor. Un anticorp în structura sa de bază este alcătuit din patru lanţuri: - două lanţuri identice grele (H); - două lanţuri identice usoare (L). Fiecare lanţ este alcătuit din domenii de aproximativ 110 aminoacizi. Domeniile au aceeaşi structură de bază şi la compararea secvenţelor de aminoacizi se pot pune în evidenţă multe arii similare. Domeniul terminal N al lanţurilor grele si al celor uşoare este foarte important pentru recunoaşterea antigenilor, deoarece el cuprinde zona de legătură. Secvenţa de aminoacid a acestor domenii terminale variază de la anticorp la anticorp, de aceea sunt cunoscute sub numele de regiuni variabile V. Învecinat cu regiunea variabilă a moleculei de anticorp se află regiunea constantă C, constituită dintr-un domeniu în cazul lanţurilor uşoare şi din trei domenii în cazul celor grele (fig. 129). Fig. 129 - Structura de bază a unui anticorp. VL - reprezintă domeniul variabil al lanţului uşor; CL - domeniul constant al lanţului uşor; VH- domeniul variabil al lanţului greu; CH- domoniul constant al lanţului greu. Lanţurile grele determină clasa (isotipul) anticorpului, precum şi funcţia fiziologică a unei molecule particulare de anticorp. Când un domeniu terminal N al unei molecule de imunoglobuline a reacţionat cu un anticorp, molecula suferă o schimbare în conformaţia lanţurilor grele. Principalele clase de imunoglobuline sunt următoarele: - IgM are o moleculă mare, constituită din patru unităţi de bază menţinute într-o structură unitară de un lanţ de legătură, rolul major al acestor imunoglobuline fiind neutralizarea vasculară a microorganismelor, în sprecial a viruşilor; reprezintă 10 % din totalul imunoglobulinelor; - IgG este o imunoglobulină mai mică, care poate uşor penetra ţesuturile; este singura imunoglobulină care penetrează placenta pentru a furniza protecţie imunologică fătului; reprezintă 75 % din totalul imunoglobulinelor; - IgA este imunoglobulina cea mai importantă care apare în mucoase; ea este o secreţie a mucoaselor şi constă din două unităţi de bază unite printr-un lanţ de legătură; reprezintă 15 % din totalul imunoglobulinelor; - IgD este imunoglobina sccretată de limfocitele B şi probabil implicată în activarea acestor celule de către antigeni; reprezintă 0,2 % din totalul imunoglobulinelor; - IgE este imunoglobina produsă de plasma celulelor, dar principalul ei rol fiziologic nu este încă cunoscut, deşi se bănuieşte că este implicată în expulzarea paraziţilor intestinali, în inflamaţii şi alergii; reprezintă 0,04 % din totalul imunoglobulinelor. 204

10.3.3. Celule T Celulele T recunosc un antigen atunci când le este prezentat într-o formă adecvată, adică în general, după prelucrarea lor de către celulele de prezentare (macrofagele). Celulele receptoare T prezintă două lanţuri, alfa şi beta. Structura probabilă a unei astfel de celule este prezentată în figura 130. Fig.130 - Structura celulei receptoare T La fel ca imunoglobulinele, ambele lanţuri de celule T receptoare au regiuni variabile, regiunile constante sunt alcătuite din domenii, iar lanţurile sunt pliate. Aceste similarităţi au dus la presupunerea că genele pentru celulele T receptoare îşi au originea în aceleaşi gene părinte ca genele pentru imunogiobuline, ambele fiind membre ale familiei de „supergene".

10.3.4. Antigeni de histocompatibilitate Aceşti antigeni nu sunt atât de bine definiţi, dar au un rol important în răspunsul imun. Au denumirea dc antigeni de histocompatibilitate din cauza reacţiilor foarte puternice pe care le provoacă în cazul nepotrivirii transplanturilor de organe. Sunt implicate în recunoaşterea antigenilor de către majoritatea celulelor T. Antigenii de histocompatibilitate umani sunt cunoscuţi sub denumirea de antigeni HLA şi sunt la rândul lor de două tipuri: - antigeni HLA de clasa I; - antigeni HLA de clasa II. În figura 131 se prezintă structura acestor antigeni. Acestea sunt glucoproteine de la suprafaţa celulelor şi au un grad avansat de polimorfism genetic, adică variabilitate genetică între indivizi. Majoritatea indivizilor care nu sunt înrudiţi prezintă antigeni HLA diferiţi, deci este foarte dificilă obţinerea unei potriviri a acestor antigeni în cazul unor transplanturi de organe de la indivizi neînrudiţi. Fig. 131 - Structura unor antigeni

10.3.5. Citokinele Fazele de desfăşurare ale imunităţii naturale şi specifice (împotriva virusurilor şi bacteriilor, de exemplu), sunt în mare parte mediate de hormoni proteinici numiţi citokine. În imunitatea naturală citokinele efectuare sunt produse in special de fagocitele mononucleare şi astfel sunt numite monokine. Deşi monokinele pot fi induse direct de microbi, ele pot fi de asemenea secretate de fagocitele mononucleare celulelor T stimulate antigenic deci ca parte a imunităţi specifice.

205

De asemenea, monokinele joacă roluri importante fiind continuatori ai activării limfocitelor, amplificând astfel mecanismele pentru răspunsurile imune specifice. In imunitatea specifică, majoritatea citokinelor sunt produse de limfocitele T activate şi se numesc limfokine. Celulele T produc câteva citokine ce reglează activarea, creşterea şi diferenţierea populaţiilor limfocitare variate. Alte citokine, derivate din celulele T activează şi reglează celulele inflamatorii care sunt fagocitele mononucleare, neutrofilele şi eozinofilele. Aceste citokine sunt molecule efectuare ale imunităţii imediate celular şi sunt, de asemenea, responsabile pentru comunicaţiile dintre celulele sistemelor imune şi inflamatorii. Limfocitele şi fagocitele mononucleare produc şi alte citokine numite factori stimulatori ai coloniei, ce stimulează creşterea şi diferenţierea leucocitelor imature in măduva oaselor. Prin urmare, citokinele sunt un grup divers de glicoproteine, având următoarele proprietăţi generale: - citokinele sunt produse în timpul fazelor efectuare ale imunităţii naturale şi specifice şi servesc medierii şi reglării răspunsurilor imune şi inflamatorii; - secreţia citokinelor este un eveniment self-limitat scurt. Citokinele nu sunt stocate ca moleculele pre-formate şi sinteza lor este iniţiată de o nouă transcripţie genică. Activarea transcripţională este tranzitorie, moleculele de ARNm sunt instabile; combinaţia unei perioade scurte de transcripţie cu o durată de viaţă a ARNm pentru citokine determină caracterul tranzitoriu al sintezei citokinelor. Odată sintetizate citokinele sunt rapid secretate; - multe citokine sunt produse de diverse tipuri celulare. Citokinele produse deci de tipuri celulare diverse, acţionează de asemenea, asupra multor tipuri de celule diferite, proprietate numită pleiotropism; - acţiunile citokinelor sunt deseori redundante, de fapt fiind implicate mai multe citokine diferite); citokinele influenţează sinteza altor citokine; citokinele influenţează acţiunea altor citokine (doua citokine pot avea acţiune antagonică,ori sinergică-efect crescut ori adiţionale); - citokinele, ca şi alţi hormoni polipeptidici iniţiază acţiunea lor prin legarea la receptorii specifici de pe suprafaţa celulelor ţintă. Când aceeaşi celulă ţintă secretă citadine acţiunea se numeşte autocrină; când o celula din apropriere secretă citokină, acţiunea se numeşte paracrina, iar când o celulă este stimulată de la distanţă prin citokinele secretate în circulaţie, acţiunea este endocrină, ca in cazul hormonilor adevăraţi; Expresia multor receptori ai citokinelor este reglată de semnale specifice (care pot fi alte citokine, de exemplu). Majoritatea răspunsurilor celulare la citokine este lentă, după o perioadă de câteva ore şi necesită un nou ARNm şi sinteza proteică. Pentru multe celule ţintă, citokinele acţionează ca regulatori ai diviziunii celulare, adică ca factori de creştere (de pildă, ca factori de creştere epiteliali şi mezenchimali în repararea tisulară). Funcţiile citokinelor sunt clasificate astfel: ƒ mediatori ai imunităţii naturale (induse de agenţi infecţioşi din fagocitele mononucleare); ƒ regulatori ai activităţii, creşterii şi diferenţierii limfocitelor (induse în răspunsul recunoaşterii antigenului specific de limfocitele T); ƒ activatori ai celulelor inflamatoare nespecifice (induse ca răspuns la recunoaşterea antigenului specific de limfocitele T); ƒ stimulatori ai creşterii leucocitelor imature şi ai diferenţierii (produşi de limfocite stimulate şi alte celule). Citokinele ce mediază imunitatea naturală Citokinele ce mediază imunitatea naturală împotriva infecţiei virale şi pe cea care iniţiază reacţiile inflamatorii împotriva bacteriilor sunt următoarele:- interferonii tip I; - factorul de necroza tumoare; - interleuchina; -1; - interleukina-6: - citokinele inflamatorii cu greutate moleculară joasă.

206

Interferonul tip (IFN I) Include două grupe de proteine distincte serologic şi anume IFN-A (produse de fagocit molecular în principal) şi IFN-B (produse de fibroblast) având patru acţiuni biologice: 1. IFN de tip I inhibă replicarea virală: IFN induce sinteza unui număr de enzime, ca 2-1oligoadenilat, sinteza care interferă cu replicarea ADN ori ARN viral. 2. Acţiunea antivirală a IFN este de tip paracrin, adică celula infectată viral secretă IFN pentru protecţia celulelor vecine încă neinfectate. Se spune că o celulă care a răspuns la IFN şi este rezistentă la infecţia virală se află intr-o stare antivirală; 3. IFN inhibă proliferarea celulară. Această acţiune este datorită aceloraşi enzime care inhibă replicarea virală dar şi inducţiei altor enzime ce previne sinteza aminoacizilor, în special a aminoacizilor esenţiali ca triptofanul; 4. IFN creşte potenţialul letal al limfocitelor nativ ucigaşe; 5. IFN modulează expresia moleculară autogenelor de histocompatibilitate. Acei interferoni cresc expresia moleculelor din clasa I şi inhibă expresia celor din clasa II. Deoarece majoritatea limfocitelor citolitice recunosc antigenele străine legate de clasa I de antigene ale complexului major de histocompatibilitate IFN ajută faza efectuare a răspunsurilor imune mediate celular, mărind eficienţa uciderii;în acelaşi timp; IFN poate inhibă faza cognitiv a răspunsurilor imune, prevenind activarea ajutătoare. Prin urmarea cele trei activităţi funcţiilor litice ale limfocitelor ucigaşe si creşterea in expresia moleculelor din clasa I a complexului major de histocompatibilitate, acţionează concertat eradicarea infecţiei virale. Factorul de necroză a tumori (FTN) Este principalul mediator al răspunsului gazdei la bacterii gram negative. Sursa celulara majoră a acestui factor sunt fagocitele mononucleare activate de lipopolizaharidul (endotoxina) derivat din peretele celular al bacteriei. Acest factor, al concentraţiei scăzute (cea 10-9 M) acţionează local ca regulator paracrin şi autocrin al leucocitelor şi celulelor endoteliale, astfel: 1. FNT permite celulelor endoteliale să devină adezive pentru leucocite iniţial pentru neutrofile, apoi pentru monocite care se acumulează la locurile inflamaţiei; 2. FNT activează leucocitele inflamatori pentru a omorî, în special neutrofilele dar şi eozinofilele mononucleare; 3. FNT stimulează fagocitele mononucleare şi alte celule Nn produc citokine, în special IL-1 Ni IL-6; 4. FNT este un costimulator al activităţii celulei T; 5. FNT induce sinteza CSF de către celule endoteliale şi fibroblaste; 6. FNT exercită o acţiune protectoare împotriva viruşilor şi amprente expresia clase I de molecule ale complexului major de histocompatibilitate potenţând liza mediata de limfocite asupra celulelor infectate viral. De asemenea JFNT exercită acţiuni sistematice diverse (este un hidrogen endogen, simulează fagocitele mononucleare să secrete IL-1 Ni IL 6, hepatocitele să sintetizeze anumite proteine serice, etc.), iar în concentraţii mari poate avea efecte letale (deprimă contractilitatea miocardului, reduce presiunea sanguina şi perfuzii, cauzează trombon intravasculară,etc.) Interleukina-1 (IL-1) Funcţia principală a IL-1 este acea de mediator al răspunsului inflamator în imunitatea naturală. Sursa celulară a IL-1 este fagocitul mononuclear activ. Local, acest factor măreşte proliferarea celulelor T CD şi creşterea şi diferenţierea celulelor B, stimulează diferite celule în răspunsul imun, etc. Interleukina-6 (IL-6) Este sintetizată de celule endoteliale, fibroblaste, etc având două acţiuni binecunoscutele hepatocite (care sintetizează fibrinogen ce contribuie la faza acută) şi pe celulele B, ca principal factor de creştere. 207

Citokinele inflamatorii cu greutate moleculara joasă: familia interlekina-8 Aceste citokine inflamatorii derivă din: a. celule T activate antigenic; b. fagocite mononucleare,celule endoteliale, fibroblaste sau celule epiteliale; c. plachete. Ele servesc ca principali mediatori secundari ai inflamaţiei. Citokinele ce reglează activarea limfocitelor, creşterea şi diferenţierea Aceste citokinele sunt produse în principal de limfocitele active antigenic, în special din subsetul CD. Aceste celule T sunt utile atât pentru răspunsul imun mediat umoral, cât şi pentru acela mediat celular, în mare parte prin secreţia citokinelor. Citokinele ce acţionează primar pentru a regla limfocitele, sunt interleukina-2, interleukina4, β factorul de transformare a creşterii (β -FTC). Interleukina-2 (IL-2) IL-2 este principala citokină responsabilă pentru trecerea limfocitelor T de la fazi G la faza S a ciclului celular. Este produsă în special de celulele T. CD acţionează pe aceleaşi celule care o produc, deci ea funcţionează ca un factor de creştere endocrin. Acţionează de asemenea pe limfocitele T din apropiere (pe ambele substraturi CD şi CD) şi deci este totodată şi un factor de creştere endocrin. În timpul răspunsurilor imune fiziologice, ce nu circula în sânge pentru a acţiona la distanţă şi de aceea nu este considerată un factor de creştere endocrin. Principalele ei acţiuni pe limfocite sunt: Interleukina-2 este factorul de creştere endocrin major pentru limfocitele T Ni cantitatea de IL-2 sintetizată de celulele T CD activate este un determinant important al magnitudinii răspunsurilor imune; IL-2 stimulează creşterea celulelor nativ ucigaşe şi măreşte funcţia lor catalitica (sunt produse aşa numite celule killer-activate de limfokinază). IL-2 acţionează pe celulele B umane ca un factor de creştere cât şi un stimul pentru sinteza anticorpilor. Deoarece IL-2 este considerat in prezent o "cheie" în imunologia celulei T şi un agent terapeutic promiţător în lupta anticanceroasă, menţionăm că în structura tridimensională a proteinei a fost identificat recent un helix necesar pentru folding-ul terţiar bioactiv—care este un mănunchi afla- helical antiparalel (0,3 nm), capătul C-terminal formând helixul ce se extinde de la poziţia 117 la 133 în secvenţele de aminoacizi.

1. 2. 3. 4.

Interleukina (IL-4) IL-4 este produsă de celule T CD Ni are efecte importante pe patru timpuri de celule: IL-4 este un factor de creştere şi diferenţiere pentru limfocitele B (putând fi necesară atât pentru proliferare cât şi pentru secreţia anticorpilor de celulele B ca răspuns la antigenele proteice). IL-4 este singurul factor comutator cunoscut pentru producerea IgE. IL-4 este un factor de creştere autocrin pentru un subset de celule T CD clonate c secretă IL4JL-5 Ni IL-6 în contrast cu majoritatea clonelor cere produc IL-2, gamainterferon şi limfotoxină; IL-4 este un factor de creştere pentru mastocite şi acţionează sinergic cu IL-3 Nn stimularea proliferării mastocitelor; IL-4 este de asemenea un factor de activare a macrofagelor (chiar dacă efectele de potenţare sunt mai reduse decât efectele gama-interferonului). De asemenea, s-a sugerat recent că IL-4 poate contribui si la imunitatea mediată celular.

208

Factorul β de transformare a creşterii ( β - FTC) Celulele T activate antigenic cât şi macrofagele activate secretă β - FC biologic activ. Acţiunile acestui factor sunt pleiotropice. El inhibă creşterea multor tipuri celulare şi stimulează creşterea altora; uneori însă poate fie să inhibe creşterea aceluiaşi tip celular în cultură; β - FTC cauzează sinteza proteinelor matrice extracelulare asemenea, β - FTC determina creşterea de noi vase sanguine, un proces numit angiogeneză. Ca o citokină, β - FTC este potenţiala important deoarece antagonizează multe răspunsuri ale limfocitelor. De exemplu, β - FTC inhibă proliferarea celulelor T la miogen policlonali, inhibă maturarea celulelor CTL1, inhibă activarea macrofagelor, etc. În vivo, anumite tumori pot scăpa de un răspuns imun secretând mari cantităţi de β - FTC. Citokinele ce activează celulele inflamatorii Aceste citokine provin în principal din limfocite T CD şi CD şi servesc în special activării funcţiilor celulelor efectoare nespecifice. Astfel, aceste citokine mediază faza efectoare a răspunsurilor imune mediate celulare şi ele includ gama-interferon, limfotoxină, interleukina-5 şi factorul de inhibare a migrării. Interferonul imun sau gamma (gamma-IFN) Acest interferon (numit şi interferonul tip II) induce - ca şi interferonul tip I - o stare antivirală şi antiproliferativă, însă are câteva proprietăţi legate de imunoreglare care ii separă funcţională de IFN tip I. Este produs atât de celulele T ajutătoare CD ce secretă IL-2 cât de celulele T CD. În imunoreglare, acest interferon are următoarele funcţii: 1. Gama-IFN este un activator important al fagocitelor mononucleare. El induce direct sinteza enzimelor ce permit macrofagelor să omoare microbii fagocitaţi. Citokinele care cauzează modificări funcţionale în favoritele mono nucleare au fost numite factori de activare a macrofagelor. Astfel, gama-IFN este principalul factor de activare a macrofagelor şi el furnizează mijloace prin care celulele T activează macrofagele; 2. Gama-IFN creşte expresia moleculară din clasa I de antigene a complexului major de histocompatibilitate, în contrast cu IFN tip I care, la o varietate de tipuri celulare, determină expresia moleculară din clasa 11 a acestui complex; 3. Gama-IF acţionează direct pe limfocite T şi B pentru a promova diferenţierea; 4. Gama-IFN activează neutrofilele (însă mai puţin decât FTN sau limfotoxină); 5. Gama-IFN este un activator potent al celulelor nativ ucigaşe (mai mult decât IFN tip l); 6. Gama-IFN este un activator al celulelor endoteliale vasculare (promovând adeziunea limfocitelor CD şi alterează caracterele morfologice ce facilitează extravazarea limfocitelor). Limfotoxina Limfotoxina este sintetizată de celulele T şi de obicei acţionează local ca un factor paracrin şi nu ca mediator al injuriei sinteticele este un activator potent al neutrofilelor furnizând limfocitelor un mijloc de reglare a reacţiilor inflamatorii acute. LT este, de asemenea un activator al celulelor endoteliale vasculare acuzând creşterea aderării leucocitelor la endoteliu, producerea citokinelor şi modificări morfologice ce facilitează extravazarea leucocitelor. Interleukina-5 (IL-5 ) Este produsă de celulele T CD activate şi mastocitele activate. O acţiune importantă; IL-5 este capacitatea de a stimula centra şi diferenţierea eozinofilelor şi de a activa eozinofilele mature ca acestea sa poată omorî helminţii.

209

Factorul de inhibare a migrării Acumularea fagocitelor mononucleare în ţesuturi depinde de reţinere acestor celule ca răspuns la citokinele produse local ce inhibă motilitatea. Se considera în prezent că reţinerea leucocitele în ţesuturi este controlată de exprimarea recepţionerilor specifici pentru moleculele matrice extracelulare, cum sunt integrinele. Acest factor nu reprezintă o citokină unică, fiind donate molecule cu această activitate. Citokine ce stimulează hematopoieza Reacţiile imune şi inflamatorii care consumă leucocitele induc producerea de noi leucocite care înlocuiesc celulele inflamatorii. Se ştie că maturarea unei leucocite implică comutarea la o linie particulară cu pierderea capacităţii de dezvoltare în alte tipuri de celule mature. Citokinele ce stimulează expansiunea şi diferenţierea progenitorilor din măduva oaselor sunt denumite factori de stimulare a coloanei (FSC). Acţiunile acestor citokine sunt influenţate de alte citokine. De exemplu FNT, LT, gama-IFN, FTC inhibă creşterea celulelor din măduva oaselor, în timp ce IL-l, IL-6, măresc răspunsul la aceşti factori. Mediatorii creşterii leucocitelor imature B ai diferenţierii lor sunt interleukina-3 de stimulare a coloniei macrofagelor, factorul de stimulare a coloniei granulocite-macrofag, factorul de stimulare a coloniei granulocitelor B, interleukina-7. În timp ce interleukina-3 (cunoscută ca factor de multitudine) promovează expansiunea celulelor ce se diferenţiază în toate tipurile de celule mature cunoscute, acţiunea inteleukina-7, recent descrisă, vizează progeniturii hematopoietice comutaţii la linia limfocitelor B. În concluzie, citokinele exercită numeroase funcţii utile organismului, însă în cazul producerii lor excesive se poate instala dezordinea tisulară şi chiar moartea. Ele servesc creşterii chiar şi a celulelor nemuritoare, adică celulelor canceroase. De exemplu, IL-6 acţionează ca factor de creştere pentru multe celule maligne plasmatice (plasmacitoame sau mieloame) B, astfel multe celule tumorale ce cresc autonom secretă IL 6 ca un factor de creştere autocrin. Mai mult, IL-6 promovează creşterea celulelor somatice hibride produse prin fuziunea celulelor B normale cu celule mielomului, adică a "hibridoamelor"ce produc anticorpi monoclinali.

10.4. Relaţii de cooperare între componentele sistemului imun Antigenele macromoleculare conţin epitopi multipli sau determinanţi, fiecare din aceştia putând fi recunoscuţi de un anticorp. Anticorpi sunt produşi in RER al celulei B; lg de la suprafaţa celulei B este receptorul celulei B pentru antigen. Moleculele de anticorpi secretaţi neutralizează antigenele, activează sistemul complement, obsonizează antigenele şi amplifică fagocitoza lor de către diferite celule. În plus, diferite izotipuri de anticorpi se leagă la receptorii Fc pe eozinofile, mastocite şi celule native ucigaşe şi stimulează funcţiile acestor celule ca pe o consecinţă a legării antigenului. Alţi receptori Fc de pe celulele epiteliale mediază transportul transepitelial al anticorpilor IgA si IgG. Celulele T recunosc antigenul numai pe suprafaţa celulelor accesorii, în asociaţie cu produsul unei gene a self-ului, complex major de histocompatibilitate. Prin urmare, celulele T recunosc şi răspund la antigenele proteice străine numai când antigenul este ataşat de suprafaţa altor celule, în timp ce celulele B şi anticorpii secretaţi leagă antigenele solubile aflate în circulaţie sau în faza apoasă. Limfocitele T helper şi citolitice specifice pentru antigenele proteice străine recunosc deci simultan două structuri, antigenul străin şi o moleculă MHC self, prezente pe suprafaţa celulelor accesorii sau celulelor ţintă. Celulele accesorii cel mai bine definite pentru limfocite T helper includ: - fagocitele mononucleare; - limfocite B; - celule dendritice (celule de prezentare, respectiv macrofagele); 210

- celule Langerhans ale pielii; - celulele endoteliale. Limfocitele T helper CD+4 recunosc antigenele în asociaţie cu produsele clasei a doua a complexului major de histocompatibilitate şi celulele CD+8, CTL 1 recunosc antigenii în asociaţie cu produsele genice din clasa întâia complexului major de histocompatibilitate. CD4 şi CD8 sunt glicoproteine de suprafaţa exprimate exclusiv pe sub seturi de celule T mature cu modele distincte de restricţie a complexului major de histocompatibilitate. Proteinele exogene străine sunt internalizate în celulele accesorii unde suferă procesarea într-un compartiment vezicular acid. Procesarea asigura ca porţiuni ale unei proteine (heptone imunodominante) se vor lega la moleculele clasei II a complexului major de histocompatibilitate şi vor forma complexe imunogenice. Aceste complexe sunt exprimate pe suprafaţa celulelor accesorii, unde sunt recunoscute de celulele T CD+4. Genele complexului major de histocompatibilitate clasa I funcţionează ca gene ale răspunsului imun; produsele lor se leagă selectiv şi prezintă unele antigene, dar nu altele. Antigenele ţintă pentru CD+8 CTL sunt proteine sintetizate endogen, astfel ca antigenele virale, care sunt procesate şi asociate cu moleculele complexului major de histocompatibilitate clasa I. Multe tipuri celulare au capacitatea de a prezenta antigenele celulelor T ajutătoare CD+4. Reglarea expresiei genelor complexului major de histocompatibilitate clasa II reprezintă un punct de control important pentru răspunsurile imune. Anomaliile antigenelor de histocompatibilitate asociate unor boli ca spondilita anchilozantă. artrita reumatoidă, hemocromatoza idiopatică, sindromul Sjogren cât şi o serie de boli autoimune (de exemplu lupusul sistemic eritomatos, miastenia gravis, dermatita herpetiformă, diabetul insulinodependent etc). Celulele T limitate la un complex de histocompatibilitate exprimă clonal receptori proteici heterodimerici (alfa,beta) legaţi prin legături disulfidice ce sunt omologi moleculelor Ig. Aceşti receptori leagă specific antigenul procesat complexat la moleculele complexului major de histocompatibilitate de suprafaţa celulelor (APC 1). Rezultatul legării antigen-complex major de histocompatibilitate la celulele T este o serie de evenimente intracelulare numite cu un termen comun activarea celulei T care începe cu generarea celui de al doilea mesager şi terminarea cu dezvoltarea funcţiilor efectuare şi proliferarea celulei T. Cele mai timpurii evenimente din această cascadă includ modificarea fosfolipidelor membranare, activitate crescută a proteinkinazei C, creşterea concentraţiei în calciul citoplasmatic; apoi câteva proteine sunt fosforilate. Aceşti mesageri secundari stimulează transcripţia genelor necesare pentru răspunsurile proliferative şi efectoare ale celulei T. Diviziunea mitotică a celulelor T are ca rezultat expansiunea clonelor de celule cu aceiaşi specificitate antigenică şi astfel amplifică răspunsurile imune la un antigen particular. Pe limfocitele B se găsesc markeri fenotipici şi moleculari funcţionali de suprafaţă. În plus la Ig şi clasa II ale complexului major de histocompatibilitate (cu rol în interacţiunea celulă T-B), limfocitele B exprimă o varietate de proteine de suprafaţă cu semnificaţie funcţională (incluzând receptorul C3d pentru virusul Epstein Barr). Aceste proteine de pe suprafaţa celulelor B sunt importante deoarece: - ele pot fi de markeri fenotipici de maturitate şi ai liniei de celule B; - ele pot funcţiona activând ori reglând celula B; - anticorpi împotriva proteinelor de suprafaţă pot fi utilizaţi să localizeze şi să trateze tumori derivate din limfocitele Bd) unele proteine de suprafaţă sunt receptori pentru citokine. De exemplu, celulele B exprimă receptori de înaltă afinitate pentru câteva citokine incluzând IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 şi IL-6. În general celulele B în repaos exprimă un număr scăzut de receptori pentru citokine (de la câteva sute la 1.000 per celulă), însă exprimarea acestora este crescută pe celulele B stimulate via Ig din membrană, cu anticorp anti-lg sau prin alţi activatori policlonali. Prin urmare, răspunsurile anticorpului sunt iniţiate prin interacţiunea antigenului cu molecule Ig specifice de membrană de suprafaţa limfocitelor B. 211

Această interacţiune stimulează celulele B să intre în ciclul celular, probabil via producere de mesageri secunzi intracelulari. În plus, antigenele proteice ale celulei T sunt procesate de către celulele B şi prezentate în asociaţie clasa II de molecule ale complexului major de histocompatibilitate, limfocitelor T ajutătoare. Interacţiunea limitată la complexul major de histocompatibilitate dintre celula B şi limfocitele T ajutătoare furnizează ea însăşi semnale activatoare celulelor B restante şi conduce la secreţia diverselor citokine de către celulele T. Diferite citokine induc proliferarea celulelor B, secreţia anticorpilor şi alte trăsături ale răspunsului imun umoral la antigenele proteice. Celulele accesorii (de exemplu macrofagele) pot juca un rol important în iniţierea răspunsului imun, prezentând antigenele celulelor T şi secretând citokine ce promovează expansiunea şi diferenţierea ambelor feluri de limfocite, T şi B. Principalele funcţiuni ale fagocitelor mononucleare (monocite, macrofage) în imunitatea naturală includ următoarele: ƒ macrofagele fagocitează particule străine (microbi, macromolecule, incluzând antigene şi chiar ţesuturi proprii vătămate ori moarte, de exemplu eritrocite senescenţe); substanţele fagocitate sunt degradate de enzimele lizozomale. În plus, aceste celule secretă enzime, specii reactive de oxigen, mediatori derivaţi din lipide, ca prostagladinele, toate acestea omorând microbii, controlând întinderea infecţiei şi pot vătăma chiar ţesuturile normale în imediata vecinătate; ƒ macrofagele produc citokine care recrutează alte celule inflamatorii, în special neutrofile şi sunt responsabile pentru multe din efectele sistemice ale inflamaţiei ( febra, eritemul, tumefierea, creşterea temperaturii locale). ƒ Macrofagele produc de asemenea factori de creştere pentru fibroblaste şi endoteliul vascular ce promovează repararea ţesuturilor vătămate. Fagocitele mononucleare joacă următoarele roluri în faza cognitivă, de activare şi efectuare a răspunsurilor imune specifice: ƒ Macrofagele dispun antigene străine pe suprafaţa lor intr-o formă ce poate fi recunoscută de limfocitele T antigene specifice. Ele secretă şi conţin în membrană proteine ce promovează activarea celulei T; ƒ în faza de efectuare a răspunsurilor imune mediate celular celulele T ajutătoare secretă citokine ce activează macrofagele. Macrofagele astfel activate sunt mai eficiente in realizarea funcţiilor fagocitice, degradative şi citolitice decât celulele nestimulate. În acest fel, macrofagele figurează printre principalele celule efectuare ale imunităţi medie celular; în faza efectuare a răspunsurilor imune umorale antigene străine, ca microbii, devin învelite sau opsorizate de anticorpi şi proteine ale complementului. Deoarece macrofagele exprimă receptori de suprafaţă pentru anticorpi şi anumite proteine ale complementului, ele leagă şi fagocitează particulele opsonizate mult mai avid decât pe cele neînvelite (neopsonizate). Astfel, macrofagele participă la eliminarea antigenelor străine prin răspunsuri imune umorale. Capacitatea macrofagelor şi limfocitelor de a-şi stimula unele altora funcţiile dovedesc un mecanism de amplificare importantă pentru imunitatea specifică. În plus, la limfocite şi fagocitele mononucleare, alte leucocite şi granulocite participă în faza efectuare a răspunsurilor imune specifice. Granulocitele, numite şi celule inflamatorii, deoarece joacă roluri importante în inflamaţie şi imunitatea naturală, au şi funcţia de a elimina microbi şi celulele moarte. Ele sunt stimulate ca şi macrofagele, de citokinele derivate din celula T şi fagocitează particule opsonizate. Neutrofilele răspund rapid la stimuli chemotactici putând fi iniţial activate de citokinele produse de macrofage. Ele posedă receptori pentru porţiunea Fc a anticorpilor şi pentru proteinele complementului, migrând şi acumulându-se la locuri de activare a complementului. Ele fagocitează particule opsorizate şi funcţionează ca celule efectuare ale imunităţi umorale. Eozinofilele exprima receptori Fc pentru o clasă de anticorpi IgE, fiind efectori importanţi in reacţiile imune la antigenii ce induc nivelele ridicate de IgE, astfel ca paraziţi, ele distrug 212

helminţi ce rezistă deseori enzimelor lizozomale ale neutrofilelor şi macrofagelor. Eozinofilele sunt numeroase la locurile reacţiilor de hipersensibilitate imediată,in alergie, datorate producerii de anticorpi IgE. Eozinofilele sunt activate şi de alţi anticorpi ca formula secretată AigA. Creşterea şi diferenţierea eozinofilelor sunt stimulate de o citokină derivată din celula T helper numită interleukina-5, astfel încât activarea celulei T herper poate contribui la acumularea eozinofilelor la locurile cu reacţii de infestare parazită şi alergice. Bazofilele şi mastocitele exprimă receptori de înaltă afinitate pentru IgE şi leagă astfel anticorpi IgE. Interacţiunea antigenelor cu aceste molecule IgE stimulează bazofilele şi mastocitele de a excreta conţinutul granulelor lor, care sunt mediatori chimici ai hipersensibilităţi imediate. Astfel, aceste granulocite sunt celule efectuare ale hipersensibilităţi imediate datorită IgE. Prin urmare, citokinele servesc multor funcţiuni ce sunt critice în apărarea împotriva agenţilor patogeni şi furnizează legături între imunitate specifică şi naturală. Este ştiut că interferonii, de exemplu, au acţiunea antivirală, antiproliferativă şi imuno modulatoare. Citokinele reglează de asemenea amplitudinea şi natura răspunsurilor imune prin influenţarea creşterii şi diferenţierii limfocitelor. În sfârşit, citokinele asigură mecanisme de amplificare importante ce fac capabile limfocitele în număr scăzut, specifice pentru oricare antigen, să activeze o varietate de mecanisme efectuare pentru a elimina antigenul. Pe de altă parte, când rezultă un defect în unul din efectorii sistemului imun (limfocitele T şi B, fagocite, proteinele complementului) se vorbeşte de imunocompromis. De asemenea, producţia excesivă ori acţiunile citokinelor pot conduce la distrucţie tisulară şi chiar moarte. Imunopatia instalată în anumite cazuri poate conduce deci la cronicizare ori moarte. Administrarea citokinelor sau a inhibitorilor lor constituie o abordare potenţială pentru modificarea răspunsurilor biologice asociate cu boală. De pildă efectele antitumorale ale interleukinei-1 pot fi înregistrate prin 3 mecanisme: ƒ direct citolitic; ƒ activarea celulelor imune; ƒ inducţia linfokinelor antitumorale sau facilitarea efectelor lor.

10.5. Baza umorală a răspunsului imun Este mediată de celulele B, producătoare de Ig. S-a stabilit că limfocitele sunt celule care iniţiază răspunsul imunitar specific şi care posedă memorie imunitară. Unele dintre ele sunt responsabile cu recunoaşterea, iar altele cu efectuarea acţiunii. Limfocitele efectoare sunt de două tipuri: celule B şi celule T. Cum s-a spus anterior, celulele B produc anticorpi, responsabili cu neutralizarea, opsonizarea sau dizolvarea antigenilor. Celulete T pot fi la rândul lor împărţite în trei categorii, în funcţe de natura lor, astfel: - celule T ajutătoare – actionează pentru pregătirea terenului de acţiune a celulelor T efectoare şi supresoare şi a celulelor B; - celulele T efectoare – distrug antigenii sau determină inflamarea ca răspuns la acţiunea antigenului; - celuleT supresoare – suspendă, atunci când acest lucru este necesar, acţiunea celulelor T ajutătoare, deci implicit, acţiunea celulelor T efectoare şi a celulelor B.

213

10.5.1. Prezentarea antigenilor Primul stadiu al răspunsului imun la acţiunea oricărui tip de antigen implică modificarea antigenului de către macrofagi. Acesta nu este un proces specific. Macrofagele au rol în concentrarea şi prezentarea unor antigene, în prelucrarea antigenelor, în reglarea tipului de răspuns şi amploarea răspunsului imunitar. Antigenul purtat de către macrofag este apoi „prezentat" limfocitelor care sunt predeterminate să reacţioneze la antigen. Din cauza tipului de acţiune desfăşurat de către macrofagi, acestea sunt denumite celule de prezentare (sau auxiliare). Procesul ce are loc la nivelul celulelor macrofage este o parte esenţială a procesului de generare a răspunsului imun care implică celulele T. Calitatea răspunsului este îmbunătăţit de prezenţa celulelor macrofage datorită, probabil, producerii de factori solubilizanţi, inclusiv interleukine 1.

10.5.2. Producerea de anticorpi Producerea de anticorpi implică cel puţin patru tipuri de celule: - celulele macrofage ─care acţionează ca celule de prezentare - celule B; - două tipuri ce celule T, ajutătoare şi supresoare. Celulele B Anticorpii sunt produşi de către celulele B, care pot fi uşor recunoscute datorită prezenţei pe suprafaţa lor a imunoglobulinelor. O astfel de celulă pare capabilă să producă mai multe tipuri de imunoglobuline, pe măsură ce se maturizează. Astfel, de la producerea de IgM, poate trece la producerea de IgM şi IgD pentru ca în final să producă IgG, IgA şi IgE. Tipul final de imunoglobulinăde la suprafaţă pare să prezinte natura anticorpului produs de celulă. Această secvenţă de maturare se potriveşte cu cinetica răspunsului, răspunsul primar fiind preponderent IgM, iar cel secundar preponderant IgG (fig. 132). Fig. 132 - Ciclul de dezvoltare al celulelor B; C - lanţ citoplasmatic; S - lanţ de suprafaţă. O parte din celulele B răspund direct la antigenii numiţi antigeni Tindependenţi. Ele au determinanţi antigenici şi repetabili şi determină un răspuns cu IgM, nu cu IgG, IgA sau IgE. Asemenea substanţe pot provoca proliferarea nespecifică a celulelor B de memorie (celule produse care prezintă aceleaşi imunoglobuline la suprafaţă), de accea sunt cunoscute sub denumirea de celule B policlonale mitogene. Pentru aceste acţiuni nespecifice pot fi responsabili şi alţi determinanţi, alţii decât epitopi.

214

Majoritatea celulelor B însă nu răspund direct în majoritatea antigenilor chiar când aceştia sunt prezentaţi de celulele ajutătoare adecvate. Este nevoie de încă un semnal de activare pentru stimularea acestor celule B. Deoarece semnalele sunt în mod normal generate de celulele T, antigenii sunt denumiţi antigeni T-dependenţi. Adăugarea celulelor T determină un răspuns, chiar dacă celulele T singure nu sunt capabile să determine anticorpi. Celulele T sunt de aceea denumite ajutătoare. Celulele T ajutătoare Acţiunea celulelor T este specifică antigenului. Doar celulele ajutătoare T care au răspuns la antigenul prezentat de către celulele macrofage poate în continuare să ajute celulele B. Celulele ajutătoare T recunosc la celulele de prezentare antigenul şi antigenul HLA de clasa II ca un complex. Ele recunosc apoi aceeaşi combinaţie de antigen şi antigen de clasa II specific celulei B corespunzătoare. Chiar dacă celulele T sunt separate de celulele B printr-o membrană, ele pot încă să stimuleze un răspuns la celulele B, sugerând faptul că factorul solubilizant eliberat de celulele T mediază efectul de ajutorare a celuleor B. Antigenii de clasa II joacă un rol important în activitatea celulelor ajutătoare T. Celulele T de la un individ nu pot coopera cu celulele macrofage şi celulele B de la altul. Când o celulă ajutătoare T întâlneşte un antigen pentru prima dată, ea ajută pe de o parte celulele B, iar pe de altă parte declanşează un proces de transformare şi proliferare care are ca efect o creştere a numărului de celele ajutătoare T specifice, disponibile atunci când individul va fi din nou supus acţiunii antigenului. Răspunsul imunitar la o expunere ulterioară va fi mai rapid şi mult mai viguros. Celulele T au glicoproteine de suprafaţă specifice care acţionează ca marcatori care le diferenţiază. Ele pot fi recunoscute de anticorpii monoclonali. Unele din aceste glicoproteine se găsesc doar la celulele T. Recunoaşterea antigenului implică mai mulţi receptori la suprafaţa celulelor T ajutătoare. Celule B, care recunosc antigenul prin imunoglobulinele de suprafaţă, văd acelaşi epitop diferenţiat. De exemplu, haptenele pot fi recunoscute ca antigeni de celulele T doar cuplate cu un purtător, iar haptenele libere pot reacţiona cu anticorpii. Celulele T supresoare Efectele celulelor T ajutătoare sunt contrabalansate de celulele T supresoare. Acestea au pe suprafaţă o glicoproteină specifică CDS, iar funcţia lor nu este în totalitate cunoscute. Ele par să fie capabile să lege direct antigenul, fără a necesita şi acţiunea celulelor de prezentare, acţionând mai degrabă asupra celulelor ajutătoare T dect asupra celulelor B. Ca şi celulele T ajutătoare, celulele supresoare T sunt specifice unui anumit antigen. Acţiunea celulelor T supresoare poate fi accentuată de anumite acţiuni de imunizare; de exemplu, la animalele de experiment injectarea repetată a unor doze relativ mari de antigen poate duce la toleranţă în care nu este produs nici un anticorp specific ca răspuns la acţiunea antigenului, pe când capacitatea de răspuns la alţi antigeni rămâne nemodificată.

10.6. Răspunsul imunitar mediat de celule Răspunsul specific antigenului mediat este generat de celule limfocitare T. Celulele T pot să: dezintegreze antigenii specifici: citotoxicitate; elibereze substanţe solubile biologic active (limfokine) care stimulează inflamarea: hipersensibilitate întârziată.

215

Aceste două tipuri de răspunsuri ale celulelor T sunt mediate de populaţii specifice: citotoxicitatea este determinată de celulele citotoxice T; hipersensibilitatea întârziată este determinată de celalele T de hipersensibilitate întârziată. Celulele citotoxice T Celulele citotoxice T dizolvă celulele infectate cu virusuri. Această citotoxicitate este dependentă de virus şi doar celulele care prezintă proteine virale relevante la suprafaţa lor sunt distruse. De vreme ce pe suprafaţa celulelor infectate apar proteinele specifice virusului înainte de producerea altor virusuri, celulele citotoxice T sunt foarte importante în faza de refacere, distrugând celulele infectate înainte de producerea altor particule virale. În comparaţie cu celulele T ajutătoare, celulele citotoxice T recunosc antigenii virali împreună cu antigenii HLA de clasa I. Ele prezintă specificitate pentru antigenii HLA, putând distruge doar celulele care prezintă acelaşi antigen HLA clasa I. Inducerea celulelor citotoxice T necesită celule precursoare şi interleukine – 2 de la celulele T ajutătoare. Inducerea este declanşată de antigenii de clasa I şi este reglată de celulele T supresoare. Celulele citotoxice T sunt implicate în rejecţia grefelor. Celulele T de hipersensibilitate întârziată Reacţia de tip hipersensibilitate întârziată este cunoscută de foarte mult timp. Reacţiile determinate de vaccinuri sunt de acelaşi tip. De exemplu, reacţia la injecţia intradermală cu tuberculină în cazul testului Hantoux este o reacţie de acest tip. În contact cu antigenii străini, celulele T de hipersensibilitate întârziată eliberează limfokine care mediază un răspuns imflamatoriu. Limfokinele sunt substanţe solubile capabite să influenţeze cinetica altor celule inflamatoare. Sunt atrase la locul unde are loc reacţia de hipersensibilitate întârziatăcelule macrofage, neutrofile şi alte limfocite; celulele sunt apoi imobilizate şi este declanşată inflamarea. Macrofagii pot fi de asemenea activaţi de linokine să distrugă paraziţii intracelulari ca microbacteriile. Limfokinele includ interferon, care este bine cunoscut pentru efectul său antiviral direct, dar care activează de asemenea un tip de celule ucigaşe naturale NK (Natural Killer).

10.7. Interacţiuni celulare în răspunsul imun Mecanismele de declanşare şi control ale reacţiilor imune sunt complexe şi antrenează o cascadă de reacţii de stimulare sau inhibiţie între diversele populaţii celulare şi speciile moleculare. În linii mari, succesiunea evenimentelor care au loc după pătrunderea antigenului în organism este următoarea: în câteva minute, antigenul este captat de către macrofage şi degradat în fagolizozomi în material neantigenic şi în componente înalt imunogene. Fracţiunile imunogene sunt proiectate pe membrane macrofagului, care le transportă la nivelul organelor limfoide secundare. Prin receptorii pentru antigen, limfocitele primesc informaţii referitoare la structura imunogenului, acestea sunt traduse şi transmise AND-ului care la rândul său v-a ordona diviziunea celulară. Clona respectivă începe să se multiplice activ, să elaboreze limfokine care vor acţiona asupra macrofagelor, a unor limfocite încă nesensibilizate şi asupra altor celule accesorii. Macrofagele la rândul lor, eliberează monokine, amplificând şi mai mult reacţiile. Celulele efectuare de la nivelul organelor limfoide formează foliculi şi centri germinativi unde îşi vor exercita activitatea distructivă, acţionând asupra antigenului fie direct, prin reacţii de citotoxicitate , fie indirect prin secreţie de imunoglobuline cu funcţii de anticorp. Deoarece limfocitele cu receptori pentru antigenul în cauză părăsesc circulaţia şi se localizează în organele limfoide, în primele momente ale stimulului antigenic proporţia lor in sângele periferic scade considerabil. Când limfocitele B sunt stimulate antigenic ele se divid prin mitoze repetate, dând naştere la clone celulare B. Din acestea unele imunoblaste se diferenţiază în plasmocite - celule secretoare de imunoglobuline. 216

Alte imunoblaste se reîntorc la forma de limfocit circulant, devenind celule B cu memorie. Acestea reţin în memoria lor (în acizii nucleici) primul contact cu antigenul. Anticorpii sintetizaţi sunt exocitaţi şi depuşi fie la suprafaţa membranei celulare, fie trecuţi în sânge, declanşându-se imunitatea umorală rapidă. După 24-48 de ore, datorită proliferării clonale active, celulele de memorie încep să revină în circulaţie, unde patrulează un timp îndelungat, pregătite să facă faţă unui nou atac. Celulele efectuare rămân la nivelul centrilor germinativi unde continuă prolifelarea şi secreţia de limfokine sau monokine, organul limfoid fiind astfel crescut în volum tumefiat şi edemaţiat. Durata scurtă de viaţă a celulelor efectuare reprezintă un mijloc eficient de stingere a reacţiilor imune. După ce complexele antigen-anticorp uşor fagocitabile sunt eliminate din organism, celulele efectuare mor, rămânând de veghe numai celulele de memorie, cu viaţă lungă, care asigură supravegherea imunologică. Spre deosebire de limfocitele diversificate clonal, macrofagul captează antigenul nespecific, aceiaşi celulă putând fagocita diferite molecule indiferent de structura lor. Antigenul formând complexe cu anticorpii, complexele se vor ataşa la FcR (receptorul Fc – fragment cristalizat), a macrofagului (opsonizare), funcţiile fagocitare fiind mult activate. Legarea prin porţiune Fc a complexelor antigen-anticorp la FcR a macrofagului, induce şi formarea unor compuşi chimici simpli, care ar stimula la rândul lor sinteza şi exprimarea pe membrana macrofagului a antigenelor I (asociate regiunii I din MHC – major histocompatibility complex class I). Fc este un receptor membranar care leagă Ig. Este un dimer constituit din două jumătăţi C-terminale ale lanţurilor H (grele) de Ig. Receptorii Fc sunt glicopreteine rezistente la tripsină, nu şi la pronază. Interacţiunea celulară ar interesa succesiv câte două tipuri de celule legate prin punţi formate de către antigen: macrofag şi limfocit TH ( helper) şi ulterior limfocit TH şi limfocit B. În unele situaţii, celula care reprezintă antigenul limfocitului T poate fi limfocitul B şi nu macrofagul. În această interacţiune guvernează aceleaşi restricţii genetice ca acele implicate în interacţiunea limfocite T - macrofag, în care macrofagul prezintă antigenul "prelucrat" limfocitelor T şi eventual cel "neprelucrat" limfocitelor B. Prezentarea antigenului de către macrofag atât celulelor T, cât şi celulelor B, poate fi importantă în reacţiile imune faţă de antigene cu moleculă mare, care trebuie "sfărâmate", operaţie de care sunt capabile numai celulele cu funcţii fagocitare. Interacţiunea s-ar putea instala şi simultan, între toate 3 tipuri celulare (macrofag, celule T şi B) după cum cooperează s-ar putea realiza fără contact intercelular, prin mediatori eliberaţi de limfocitul helper sau ajutător (TH) care ar activa macrofagul sau direct celula B. De asemenea, cooperarea celulară se instalează atunci când limfocitele sunt expuse stimulilor mitogenici şi nu numai celor antigenici. În declanşarea şi controlul răspunsului imun intervin numeroşi factori a căror apariţie şi dispariţie din scenă este ordonată de multiple semnale şi circuite de reglare şi control. De exemplu, o populaţie de celule T ajutătoare (TH) activează multiplicarea şi transformarea unei clone de precursori B spre plasmocite secretoare de imunoglobina dar prin alte canale semnalizează şi celule T supresoare (TS) care vor controla atât proliferarea precursorilor B cât şi cea a limfocitelor TH. Astfel se asigură un permanent control homeostatic care menţine cadrul normal al reacţiilor imune.

10.7.1. Unele mecanisme de apărare imună în infecţiile bacteriene În general, sunt folosite predominant mecanismele imunităţii mediate umoral împotriva speciilor care trăiesc în afara celulei şi cele alte imunităţii mediate celular contra celor adaptate la viaţa intercelulară, fără a fi însă graniţe rigide între cele două tipuri de reacţii imune. De asemenea poate interveni şi citotoxicitate anticorpodependentă (ADCC), adică mijloace de apărare celulară condiţionate insă de prezenţa anticorpilor specifici. 217

10.7.1.1. Mijloace de apărare imună mediate umoral Sunt cunoscute in infecţiile bacteriene: a. imobilizarea germenilor ciliaţi sau flagelaţi; b. inhibiţia aderenţei; c. bacterioliza dependentă de anticorpi; d. neutralizarea toxinelor bacteriene; e. opsonizarea. Imobilizarea germenilor ciliaţi sau flagelaţi poate fi realizată practic de către toate clasele imunoglobuline şi se dovedeşte eficientă în frânarea virulenţei unor germeni gram negative (Salmonella, Proteus, E.coli, etc). Inhibiţia aderenţei la seroase sau mucoase se realizează de asemenea, graţie anticorpilor (în special cei din clasa IgA), care interferând cu adezinele, inhibă aderarea şi, în consecinţă, multiplicarea bacteriei. Bacterioliza dependentă de complement, ca şi în cazul hemolizei prin complementare loc ca urmare a activării complementului de către anticorpii care s-au fixat pe bacterie, mai susceptibile la liză fiind formele SD, ale germenilor gram-negativi (cei gram-pozitivi sunt practice rezistenţi). Acest mijloc de apărare antimicrobiană nu este important deoarece subiecţii cu deficienţe congenitale în componentele complementului nu sunt mai semnificativ expuşi la infecţii în comparaţie cu cei normali. In schimb, neutralizarea toxinelor bacteriene (realizată aproape exclusive de către anticorpii din clasa IgG) este un mijloc important de apărare (în special în cazul germenilor din genurile Clostridium, Staphylococcus etc. care secretă exotoxine). In ceea ce priveşte opsonizarea, se ştie că bacteriile au o serie de factori care le protejează de acţiunea fagocitară a macrofagelor. Este cazul capsulei proteinei M la Streptococcus, microvililor, polizaharizilor capsulari, proprietăţilor hidrofile ale peretelui celulei bacteriene, etc. Împotriva acestor factori antifagocitari, granulocitele şi macrofagele au receptori membranar pentru fragmentul Fc sau pentru fracţiuni ale complementului prin intermediul cărora bacteria este "prinsă" pe căi indirecte. "Activarea" fagocitozei sau "opsonizarea" este mediată prin anticorpi din clasa IgG, prin factorii C3 sau C4 ai complementului, ori în absenţa anticorpilor specifici. De exemplu, pentru a conferi condiţii favorabile opsonizării S. typhimurium, trebuie să fixeze cca 8.000 molecule de IgG pe suprafaţa bacteriei. În cazul complexelor antigen + anticorp, fragmentul FC este fixat la FCR şi bacteria este fagocitată. În cazul complementelor C3 sau C4, are loc ataşarea la receptorul pentru complement, dar nu şi fagocitoza, bacteria fiind "reţinută" la peretele celulei. Prin urmare, mecanismele opsonizării includ legarea complexului bacterie-anticorp prin receptorul pentru FC (FCR) sau legarea complexului bacterie-anticorp prin receptorul complement (CR), iar în absenţa anticorpilor specifici opsonizarea se realizează fie prin activarea complementului pe cale alternativă, fie prin agregate de molecule de imunoglobulină fără funcţii specifice pentru bacteria respectivă. 10.7.1.2. Mijloace de apărare imună mediată celular Unele bacterii (M .tuberculosis, Toxoplasma etc.), chiar dacă sunt fagocitate de către macrofagele opsonizate, nu sunt atacate de enzimele lizozomale, fiind inhibată fuziunea lizozomilor cu fagozomii. Nefiind distruse, bacteriile pot persista timp îndelungat în fagozomi sau distrug fagozomi, şi ajung în citoplasmă. Astfel simpla opsonizare este total ineficientă deoarece, după fagocitare, este omorâtă de regulă, celula fagocitată şi nu bacteria. Prin mecanisme mediate celular, macrofagele, sunt activate de limfokine eliberate în special din limfocite T, dobândesc proprietăţi citotoxice şi bactericide şi proliferează la locul infecţiei sau inflamaţiei. La rândul lor, macrofagele activează funcţiile citotoxice ale limfocitelor T care apoi distruge eficient celulele infectate bacterian (sau viral). Bacteriile sau celulele infectate cu bacterii pot fi lizate spontan, natural şi de celule nativ-ucigaşe (NK). 218

10.8. Reglarea imunologică Reglarea imunologica este de foarte mare importanţă mai ales în cazul maladiilor umane, deoarece orice dezordine poate cauza o boală autoimună sau o boală de imunodeficienţi.

10.8.1. Reglarea normală Factorii care reglează un răspuns imun normal sunt multiplii, dar ei includ disponibilitatea antigenilor şi influenţa anticorpilor anti-idiotip. Disponibititatea antigenitor Răspunsul imun este declanşat în mod natural de antigeni. Concentraţia de antigeni va scădea în urma metabolizării sau îndepărtării acestora, ca urmare a proceselor imune care au loc. Stimulul de bază, pentru răspunsul imun devine deci mai slab, declanşând doar clonele care au receptori cu mare afinitate. Rata în care antigenii declanşeză celulele B este probabil un factor important în limitarea producerii de anticorpi. Anticorpi anti-idiotip Structura zonei de legătură a antigenului este unică pentru fiecare anticorp şi poartă numele de idiotip. Sunt produşi anumiţi anticorpi anti-idiotip în cadrul unui răspuns imun normal; asemenea anticorpi sunt, prin definiţie, autoanticorpi. Se pare că asemenea anticorpi anti-idiotip sunt implicaţi în cazul reglării unui răspuns imun normal.

10.8.2. Reglarea alterată Factorii care reglează răspunsul imun pot fi manipulaţi experimental. Ajustarea adecvată a dozei şi a ratei de expunere la un anumit antigen, poate împiedica apariţia unui răspuns imun. Această stare de absenţă a răspunsului este cunoscută sub numele de toleranţă. Mecanismele implicate includ activarea celulelor T supresoare şi eliminarea celulelor ajutatoare T şi a celulelor B corespunzătoare. Există bineînţeles, toleranţa naturală la antigenii proprii. Este esenţial ca un sistem imunitar să nu reacţioneze cu celulele gazdă. Inexistenţa auto-toleranţei duce la apariţia bolilor autoimune.

10.9. Intensificarea răspunsului imun Rolul răspunsului imun este distrugerea antigenilor străini, indiferent dacă aceştia sunt molecule inerte sau organisme. Întepărtarea atigenilor este influenţată de mai mulţi factori printre care: - concentraţia de antigeni; - zona de pătrundere a antigenului; - disponitilitatea anticorpilor; - viteza răspunsului imun. Anumiţi factori nespecifici pot creşte efectele anticorpilor. Principalii factori sunt: - celulele fagocitare (macrofagii şi leucocitele poliformonucleare care indepărtează antigenii). - sistemul complementar care poate fi să distrugă un organism, fie să faciliteze, fagocitarea sa. 219

10.9.1. Sistemul complement Sistemul complementar constă dintr-o serie de proteine activate pe rând. Componentele există în mod normal ca şi precursori inactivi, dar o dată activată, o componentă complementară poate acţiona ca o enzimă care scindează mai multe molecule ale următoarei componente din secvenţă. Fiecare precursor este scindat în două sau mai multe fragmente, ca în figura 133. Fig. 133 - Scindarea unei molecule precursoare sub acţiunea unei componenete complementare Fragmentul principal are două zone active biologic: - o zonă pentru legarea de membrană celulară; - o zonă pentru scindarea enzimatică a componentei complementare următoare. Fragmentele minore generate prin scindare au proprietăţi biologice deosebit de importante în faza fluidă, cum ar fi, de exemplu, activarea chemotactică. Rolul major al căii complementare este furnizarea unei posibilităţi de înlăturare şi distrugere a antigenului, indiferent dacă acesta devine sau nu învelit cu anticorpul. Funcţia de bază a sistemului complementar este probabil opsonizarea microorganismelor şi complexelor imune; microorganismele învelite (opsonizate) cu imunoglobuline şi/sau complement sunt mult mai uşor recunoscute de macrofagi şi mult mai repede fagocitate. Fragmentele minore sunt generate la aproximativ fiecare etapă în cascadă şi contribuie la generarea răspunsului inflamator. Unele dintre ele cresc permeabilitatea vasculară, în timp ce altele atrag neutrofilele şi macrofagele pentru fazele următoare de opsonizare şi fagocitare.

10. 9.2. Alte categorii celulare implicate în imunitate Macrofagele Macrofagele sunt celule echivalente cu monocitele şi împreună cu monocitele, reprezintă sistemul mononuclear responsabil cu fagocitoza. Limfocitele şi mcrofagele provin din trunchiuri înrudite de celule din măduva spinării. Monocitele circulă doar câteva ore înainte de a intra în ţesuturi, unde trăiesc pentru câteva săptămâni sau luni, devenind nediferenţiabile de macrofagi. Ţesuturile macrofage sunt eterogene în aspect, metabolism şi probabil în funcţie. O funcţie majoră sistemului de fagocite mononucleare este fagocitoza organismclor care invadează organismul gazdei şi a altor antigeni. Macrofagii au în interior nişte granule care conţin diferite enzime degradate cu care distrug materialul fagocitat. Materialul distrus poate fi un organism viabil, celule moarte, un antigen sau un complex imun. Pentru a-şi putea îndeplini funcţia, macrofagii trebuie sa fie activaţi în această stare, ei prezintă o potenţialitate distrugătoare crescută. Macrofagii sunt de asemenea importanţi pentru prezentarea antigenilor altor celule ale sistemului imunitar, aşa cum a fost prezentat anterior.

220

Leucocite neutrofile polimorfonucleare Neutrofilele joacă un rol foarte important în apărarea organismului în cazul infecţiilor acute. Ele pot adera sau pot migra din vasele de sînge în ţesuturi. Această migrare apare ca efect a acţiunii agenţilor chemotactici produşi la locul inflamaţiei. Neutrofilele sunt celule fagocitare. Din punct de vedere morfo-fiziologic, procesul de fagocitare este similar atât neutrofilelor cât şi fagocitelor mononucleare. Neutrofilele, în plus, sunt, capabile să degradeze substanţele pe care le digeră. Realizarea acestei degradări necesită o cantitate considerabilă de energie, un consum marit şi o producţie crescută de superoxid. Celule ucigaşe (killer) Celulele ucigase sunt celuule non- fagocitare mononucleare cu morfologie limfoidă, responsabilă pentru citotoxicitatea dependentă de anticorp. Ele sunt capabile să recunoască celulele care au reacţionat sub acţiunea IgG şi le distrug, printr-un mecanism încă necunoscut. Ele nu pot distruge celule în absenţa anticorpului. Celule ucigaşe naturale (natural killer) Celulele ucigaşe naturale ( NK ) arată că limfocitele granulare mari pot distruge celule . În absenţa anticorpului sau stimulării antigenice şi sunt diferite de celulele ucigaşe prezentate anterior. Ele pot fi activate nespecific de agenţi mitogeni sau interferon şi deci pot fi recrutate de orice celulă T. De menţionat că celule ucigaşe naturale nu sunt celule ale sistemului imunitar în sens strict ca macrofagii de exemplu, şi nu au memorie imunitară. Aria lor potenţială în acţiune este foarte mare. Organismele care au un deficit de celule ucigaşe naturale au o incidenţă , mai mare a tumorilor. Aceste celule sunt considerate foarte importante pentru supravegherea apărării organismului împotriva tumorilor.

10.10. Finalitatea răspunsurilor imune O dată ce sistemul imun a fost iniţiat, rezultatul final al acţiunii sale depinde de natura şi localizarea antigenului, indiferent dacă răspunsul predominant a fost de natură umorală sau mediat de celule.

10.10.1. Funcţia directă a anticorpilor Neutralizarea este unul din efectele directe ale anticorpilor, iar IgG este în mod special remarcabil pentru aceasta. Un mare număr de antigeni, inclusiv toxina tetanusului, difteriei şi mulţi viruşi, pot fi neutralizaţi de anticorpi. O dată neutralizate, aceste substanţe nu se mai pot lega de ţesuturile receptoare; complexul autigen-anticorp rezultat este în general îndepăttat din circulaţie şi distrus de macrofagi. Desi rolul anticorpilor IgE nu este îincă cunoscut, ei par să fie implicaţi în expulzarea paraziţilor din tractul gastrointestinal.

10.10.2. Funcţia indirectă a anticorpilor Opsonizarea este procesul prin care un antigen devine învelit cu substanţe care îl face să fie mai uşor distrus de celulele fagocitare ( fig. 134).

221

Fig. 134 - Relaţia dintre opsonizare şi fagocitare.

10.10.3. Uciderea celulelor ţintă Celulele ţintă ucise ca urmare a unui răspuns imun includ organismele şi celule care conţin antigeni virali sau tumorali specifici la suprafaţă. Aceste celule ţintă pot fi distruse de mecanisme specifice.

10.10.4. Procesul inflamator Inflamarea este definit ca o creştere a permeabilităţii vasculare însoţită de infiltrarea celulelor „inflamatoare”. Creşterea permeabilităţii vasculare este determinată de un număr de agenţi specifici, printre care fragmente de complement.

10.10.5. Controlul prin reacţie inversă O etapă importantă a răspunsului imun este declanşarea unui mecanism de autocontrol (feed-back), mecanism care împiedică eventualele reacţii de autodistrugere a organismului.

10.11. Genetica sistemului imunitar După cum a fost menţionat anterior, fiecare moleculă de imunoglobulină este de fapt o proteină compusă din două lanţuri uşoare (L) identice şi două lanţuri grele (H) identice, care sunt legate prin punţi. Există doua tipuri de lanţuri uşoare: - lanţ uşor de tip Kappa; - lanţ uşor de tip Lambda. Lanţurile uşoare sunt identice la toate clasele de imunoglobuline dar fiecare clasă are un lanţ greu caracteristic, după cum este prezentat în tabelul urmator: Clasele Ig G Ig M Ig A Ig D Ig E

Greutatea moleculară 150000 900000 160000 185000 200000 222

Lanţ greu γ µ α ρ ε

Lanţ uşor k/γ k/γ k/γ k/γ k/γ

Fiecare lanţ al imunoglobulinei conţine trei regiuni: - regiunea variabilă (V); - regiunea de joncţiune (J); - regiunea constantă (C). În lanţurile grele există o regiune diversificată (D), aflată între regiunile variabile şi cea de joncţiune. Gena responsabilă cu crearea lanţului uşor Kappa se găseşte pe braţul scurt al cromozomului 2, în timp ce gena pentru lanţul uşor Lambda este pe cromozomul 22. Locusul pentru gena lanţului greu este pe cromozomul 14. Fiecare din aceste gene este în realitate o genă cluster (ciorchine). Gena cluster pentru lanţul greu conţine: aproximativ 200 de gene variabile; circa 50 de gene diverse; 6 gene de joncţiune ş una sau mai multe gene pentru regiunea constantă a fiecărei clase de imunoglobuline. În fiecare celulă plasmatică, printr-un proces de recombinare somatică o genă V, o genă D, o genă J şi o genă C sunt alaturate şi transcrise într-o moleculă unică continuă a ARN-ului mesager. Restul de ADN al mănunchiului este excizat şi constituie marcatori pentru limfocitele de origine ale celulelor B. Se poate produce orice combinaţie, acestea ducînd la mai mult de 12000 de combinaţii posibile. Suplimentar, se pot însera extranucleotide la nivelul joncţiunii şi aceste gene sunt predispuse să sufere mutaţii somatice după ce au fost obţinute, ceea ce are ca rezultat o mai mare diverisificare. Deşi combinaţia VDJ de obicei rămîne constantă pentru celulele plasmatice şi toţi descendenţii lor, este posibilă o schimbare a genelor constante, de exemplu pentru IgM spre IgG, dar specificitatea antigenică rămîne neschimbată. Aceasta este realizată iniţial de diferitele fragmente ale ARN-ului lipite şi secvenţializate, cu ajutorul ADN-t recombinat. Receptorul celulelor B este anticorp (de ebicei de tip IgM) şi astfel, o celulă plasmatică care răspunde la diferiţi antigeni poate să exprime o combinaţie VDJC diferită. Genele cluster pentru lanţurile uşoare Kappa şi Lambda au o structură similară cu aproximativ 200 de gene variabile şi 4 gene de joncţiune, dar în schimb au o genăconstantă şi nu au gene diferite. Fiecare celulă plasmatică produce lanţul uşor VJC într-o singură combinaţie şi produce fie lanţul Kappa, fie lanţul Lambda, dar nu amîndouă. Această abilitate a fiecărei gene cluster de a produce diferite polipeptide este o excepţie importantă a regulii: o genă - o polipeptidă. Receptorul celulelor T este foarte asemănător ca structură cu imunoglobulina şi constă din doua lanţuri: un lanţ alfa şi un lanţ beta. Aceste lanţuri sunt legate între ele prin punţi bisulfurice. Gena cluster pentru lanţul alfa al receptorului T este pe cromozomul 14, iar gena cluster pentru lanţul beta este pe cromozomul T. Fiecare are o structură analoagă cu gena cluster pentru lanţtul usor al imunoglobulinei, iar amîndouă suferă o recombinare somatică pentru celulele T cu specificitaţii diferite.

10.11.1. Imunodeficienţa dobîndită Imunodeficienţa dobîndită poate apare în fiecare sau în amîndouă componentele răspunsului imun. Simptomele şi semnele acesteia depind de mecanismele de apărare rămase intacte, dar în general includ invaziile timpurii susceptibile faţă de infecţii.

223

Aşa cum sunt conturate tabelul de mai jos, aceste condiţii de apariţie arată o eterogenitate genetică. Boală Combinaţii imunodeficienţe severe Agammaglobulinemia Sindromul Wiskott-Aldrich Boli granulomatice cronice Sindromul Chediak-Higashi Sindromul DiGeorge Deficienţă Properdin Sindromul Limfoproliferativ

Moduri de moştenire AR, XR XR, AR XR XR,AR AR deleţie cromozomială XR XR

Imunodeficienţa moştenită este cauzată în 50% din cazuri de defectele anticopilor, în 400% din cazuri ca urmare a defectelor de imunitate celulară, iar în 60/o din cazuri depinde de defectele sistemului complementar. Cele mai previzibile defecte sunt deficienţele IgA-lor (1/570), iar mulţi din aceşti pacienţi sunt asimptomatici cu o frecvenţă de 1/1000 de combinaţii în cazul unor deficienţe ale sistemului fagocitar şi o frecvenţă de 1/70000 pentru combinaţii imunodeficiente severe.

10.11.2. Grupele sanguine Grupe sanguine sunt determinate de proteinele de suprafaţă ale antigenilor de pe celulele roşii. Până acum au fost descrise aproximativ 400 de grupse sanguine, iar dintre acestea cel mai bine cunoscute sunt ABO şi sistemele Rh ale grupelor sanguine. Sistemul sanguin ABO Există 4 fenotipuri majore AB0: .A, B, 0 şi AB, care sunt determinate de reacţia celulelor roşii ale indivizilor cu anticorpii respectivi anti-A şi anti-B, conform tabelului de mai jos: Fenotipul celulelor roşii 0 A A AB

Anti-A + +

Anti-B + + -

unde: + înseamnă aglutinare, iar – non-aglitinare .

Antigenii AB0 sunt de asemenea prezenţi pe multe alte celule din organism, inclusiv pe celulele sanguine. Indivizii care au grupa A au antigen A pe celulele lor roşii, cei care au grupa B au antigeni B, cei cu grupa AB au ambele tipuri de antigeni, iar cei cu grupa 0 nu au nici un antigen. Indivizii cu grupa A au în serul lor IgM anti-B (izo-glutine), cu grupa B auanti-A, iar cei cu grupa 0 le au pe amândouă.

224

Gena pentru grupele AB0 este localizată lânga braţul lung al cromozomului 9 şi au fost identificate 3 alele majore: 0, A şi B. Deşi sunt posibile genotipuri 00, AA, A0, BB, B0 şi AB, A şi B sunt gene dominante, iar gena pentru grupa 0 este recesivă. În continuare este prezentat un tabel cu genotipurile şi fenotipurile locusurilor AB0: Genotip

Fenotip

00 AA A0 BB B0 AB

0 A B B B AB

UK frecvenţa 0,46 0,42 0,09 0,09 0,09 0,03

Antigene ale celulor roşii nici unul A B B B AB

Anticorpi serici Anti-A, Anti-B Anti-B Anti-A Anti-A Anti-A nici unul

Nu este posibil să distingem în grupele sanguine grupa AA de A0 sau BB de B0, dar acest lucru se poate face folosînd informaţii de ascendenţă. Sistemul Rh sanguin Există 2 fenotipuri Rh: Rh + şi Rh Aceste fenotipuri sunt determinate de reacţia celulelor roşii ale indivizilor cu anticorpii anti-Rh.Persoanele Rh + posedă antigeni Rh pe celulele lor roşii şi pe cele tisulare, în timp ce persoanele cu Rh - nu au aceşti antigelii. Complexul genelor pentru Rh este pe cromozomul 1 cu 2 altele, fiecare având 3 locusuri strâns legate C, c, E, şi D sau non-D. Persoanele cu Rh + sunt hetero- sau homozigote pentru alelele D (tabelul 4). Tabelul 4. Genotipurile şi fenotipurile Rh. Genotip

Notaţie prescurtată

UK frecvenţa

Fenotip Rh

cde/cde CDe/cde

rr Rr

0,15 0,32

+

CDe/CDe

RR

0,17

+

cDE/ede

Rr

0,13

+

cDe/cDE

RR

0,14

+

cDE/cDE

RR

0,04

+

0,05

posibil +

altele (rare)

85% din populaţia Europei Occidentale, de exemplu, are Rh+, dar acest procent variază la alte popoare. Aproape toţi orientalii şi nord-americanii au Rh+ de asemenea, în timp ce 30% din populaţia bască sunt Rh.

10.12. Interacţiunea între peptidele sistemului imun şi peptidele sistemului nervos şi endocrin Sistemul imun interacţionează cu sistemul nervos şi endocrin prin inervaţii ale ţesutului limfoid, neurohormoni endocrini sau neuropeptide şi vice-versa. Organele limfoide primesc o extensivă inervaţie intraparenchimală simpatică. 225

Celulele sistemului limfoid poartă receptori adrenergici. Numărul de receptori variază cu tipul celular, astfel: celule supresoare T > monocite > celule citotoxice T >celule helper. După ablaţia sistemului nervos simpatic la animale, numărul receptorilor β2 -adrenergici creşte pe celule limfoide; antagoniştii-adrenergici cresc nivelul cAMP în celulei limfoide şi alterează funcţia. Datele experimentale sugerează că sistemul nervos simpatic modulează răspunsurile imune şi că supraactivitatea sistemului nervos simpatic aşa cum este de aşteptat în stres scade responsivitatea imun. Efectul modulator al sistemului nervos simpatic este mediată în partea via neurotransmiţători şi în parte printr-o peptidă cu greutate moleculară mare ce inhibă marcat răspunsul limfocitar proliferativ şi reduce producţia de IL-l şi FNT de către macrofage. Neuronii simpatici răspund direct la IL-1, cel puţin în vitro şi se ştie că conţinutul în norepinefrină din organele limfoide scade în timpul răspunsului imun. Sistemul imun este capabil să producă factori, care pe lângă rolul lor crucial în timp răspunsului imun servesc integrării circuitelor imuno-neuro-endocrine cu consecinţe imuno regulatoare şi metabolice pentru gazdă. Celulele imune stimulate pot creşte nivelele sanguine în hormonul adrenocorticotrop (ACTH) şi corticosteroidul şi scade conţinutul de norepinefrină al hipotalamusului, mimând astfel două din modificările neuroendocrine observate în timpul răspunsului imun. De asemenea, s-a arătat recent că IL-1 induce o rapid şi profunda creştere în ACTH şi corticosteroidul din sânge ,fără să afecteze marcat nivelele sanguin ale altor "hormoni ai stresului",cum sunt catecolaminele, prolactina,hormonul creşteri şi hormonul α- melanostimulator. Alt efect important al IL-1 este capacitatea sa de a afecta homeostazia glucozei. Injectarea în vivo a acestei citokine are ca rezultat o profundă hipoglicemie, care nu se datorează acţiunilor secretagoge insulinice ale acestei citokine. Mai mult ,o simplă injectare a IL-1 poate normaliza nivelele sanguine în glucoză pentru o durată de cel puţin 6 ore la animale diabetice incluzând şoarecele diabetic insulino-rezistent. Modularea citokinonică a neuropeptidelor hipotalamice: interleukine ce reglează creşterea şi stresul. Reglarea centrală a sistemului imun este in prezent bine stabilit, sporind dovezile că peptidele legate de imunitate(adică citokinele) pot afecta profund sistemul nervos central. S-a relevat faptul că IL-1 şi IL-6 induc rapid eliberarea somatostatinei IL-1 induc încet dar semnificativ creşterea şi în alte neuropeptide hipotalamice. Se pare că interleukinele pleiotropice stimulează axa hipotalamo-hipofizaro-adrenală într-un loc situat probabil în nucleul paraventricular şi ar deprima creşterea prin stimularea predominată a somatostatinei comparativ cu factorul liberator al hormonului creşterii. Se consideră că stresul infecţiilor şi traumatismelor pot stimula macrofagele şi nevroglia să producă citokine IL-1,care în schimb reglează secreţia anumitor hormoni ce pot influenta evenimentele imune , în timp ce stresul psihologic induce secreţia interleukinei-6 (ce este mediată de sistemul nervos autonom). O altă citokină care posedă efecte pleiotropice este factorul de necroză (α-FTN) derivat din macrofag . α -FTN stimulează secreţia IL-1 de către macrofagele activitatea, promovează mobilizarea grăsimilor corpului şi pierderea în greutate şi are proprietăţi anorexigene.P Lângă aceste efecte, α -FTN exercită câteva efecte extraimunologice. Printre altele α -FTN este cunoscut ca un mediator al reţelei bidirecţionale neuro-endocrino-imune. Citokinele interferează cu secreţia hormonilor, incluzând în reproducere (în acest cu hormonul luteinizant, LH şi foliculinstimulator, FSN). De reţinut că atât interleukina-l-alfa ( IL-l ) cât şi factorul de necroză tumorală α - FTN împart cu hormonul liberator al corticotropinei unele efecte comportamentale ca mediatori ai sistemului. Atât IL-1 cât şi α - FTN pot induce, similar hormonului eliminator a corticotropinei, beta-endorfina ,adrenocorticotropină, sintetază eliberarea de prolactină.

226

Se ştie că factorul hipotalamic eliberator de corticotropină are rol pivot în reglarea axei hipotalamice-hipofizare-suprarenale, şi exercită efectele centrale inhibitorii pe funcţii reproducătoare (ce poate fi inhibată de stres). Aceste efecte au loc prin eliberarea de betaendorfina neuronală şi hipofizară şi sunt anatagonizate prin tratament cu antagoniştii opiacei. De asemenea IL-1, α -FTN şi hormonul eliberator de corticotropină induc o creştere a pragului nociceptiv. Hormonul eliberator de corticotropină şi citokinele diferă însă în ceea ce priveşte tipul de stres pe care îl recunosc, adică stresul cognitiv sau non-cognitiv. Alte studii recente sugerează creşterea producţiei de peptide neuroendocrine după stimularea celulelor cu IL-2. Astfel, prin metode imunohistochimice s-a detectat clonarea intensă a citoplasmei celulelor mononucleare (ACTH şi β endorfinice pozitive) din sângele periferic şi o creştere a dimensiunii celulare medii după stimularea cu interleukina -2. Alte studii sugerează, în plus, că una din moleculele de ACTH ce este sintetizat de celule imune stimulează direct migrarea monocitelor umane, sugerându-se astfel un rol posibil al peptidelor ACTH in răspunsul imun. In prezent, numeroase interacţiuni intre sistemele imune şi neuroendocrine sunt demonstrate şi se crede că numeroase peptide pot fi utile noilor strategii terapeutice.

10.13. Relaţiile virusuri-celule gazdă. Relaţiile virusuri-membrane celulare 10.13.1. Receptorii virali Prezenţa sau absenta receptorilor celulari specifici influenţează nemijlocit spectrul de gazdă tropismul tisular şi celular al virusului;elementele respective pot interveni însă în etape ulterioare, de exemplu penetrare, decapsidare, antrenare a metabolismului celulei gazdă în producţia componentelor virale. Receptori celulari sunt, frecvent, de natură glicoproteică iar acidul sialic este considerat o componentă critică în interacţiunea virus-receptor. Virusul Sendai se leagă de o structură carbohidrat specifică ( NeuAc ) dar nu de alte gangliozide, conţinând unul sau mai multe reziduuri de acid neurinamic. Alte mixoviruri sunt mai puţin restrictive. Pentru virusul gripal toţi compuşii neurinamic pot acţiona ca receptori indiferent de modalitatea de legare a carbohidratului. Virusurile gripale A şi B au receptori (glicoforina) pe hematii; virusul rabic are receptori pentru acetilcolină la joncţiunea neuromusculară; virusul Epstein-Barr are receptori ( CR2 pentru C3d ) pe limfocite B iar HIV are receptori (molecula CD4 sau T4) pe limfocit T etc. Trei metode moderne au permis studiu receptorilor celulari cu acurateţe: a) sinteza anticorpilor monoclonali antireceptori; b) sinteza anticorpilor antiidiotip care mimează antigenele virale; c) utilizarea unor analogi peptidici ale situsurile de ancorare virală A fost introdus conceptul de receptor productiv, adică de receptor care conduce singur la infecţie, deosebit de alţii implicaţi în legarea nespecifică a virionilor. Ataşarea nespecifică a virionilor la unele substraturi (colagenul de exemplu), poate avea importanţă patogenică pentru că se realizează concentraţii mari de virusuri în zone unde există şi receptori productivi. În general, organele-ţintă ale infecţiei virale au astfel de receptori productivi care sunt similari cu receptorii cu afinitate înaltă. Receptorii cu afinitate înaltă la nivelul "butonilor" terminali ale axonilor explică neurotropismul unor virusuri. În ceea ce priveşte virusul gripal, care este bine cunoscut, datele de biologie moleculară precizează următoarele: acest virus este un orthomixovirus cu înveliş membranar; anvelopa constă dintr-un strat bilipidic cu proteina M asociată cu porţiunea internă a dublului strat şi două glicoproteine membranare, ai căror spiculi extramembranari se pot observa în microscopia 227

electronică. Una dintre proteinele transmembranare este hemaglutinina, iar cealaltă, naurominidaza. Aceste două proteine permit virusului să se lege de suprafaţa celulei gazdă şi să fuzioneze cu membrana celulară. A fost clonată gena pentru neuraminidază, proteina conţinând 454 aminoacizi cu greutatea moleculară 50.087 Da. Această proteină prezintă o zonă hidrofobă majoră, care o ancorează in membrana virală. Proteina prezintă 5 situsuri de glicozilare şi este incorporată in membrana virală sub forma unui trimer simetric cu laturile polipeptidice identice. Rolul neuraminidazei in infecţie nu este cunoscut,dar se ştie că ea clivează acidul N-acetilneuraminic(acid sialic) al lanţului hidrocarbonat glicoproteina. Substratul neuraminidazei poate fi glicoproteina celulei-gazdă sau glicoproteina-hemaglutinică a virusului. Activitatea enzimatică a neuraminidazei este necesară pentru producerea infecţiei, deoarece anticorpii antineuraminidază inhibă replicarea virală. Cealaltă glicoproteină transmembranară a virusului gripal, hemaglutinina, leagă virusul la acidul sialic conţinut de receptorii membranei celulei-gazdă. De asemenea,ea mediază fuziunea celulară a virusului. Hemaglutinina virusului gripal este un trimer de 224.640 Da. Fiecare trimer conţine un lanţ oligozaharidic. Glucidele sunt localizate la suprafaţa proteinei pe întreaga sa lungime si au rolul de a proteja hemaglutinina de degradarea proteolitica nespecifica. Pentru ca virusul gripal sa fuzioneze cu membrane celulei-gazda,hemaglutinina trebuie sa cliveze in doua fragmente , HA1 si HA2, prin hidroliza legăturii peptidice a argininei din poziţia 238. Clivarea hemaglutiniei în cele două fragmente creşte infecţiozitatea virusului de 100 ori, fără să afecteze activitatea hemaglutinică. Molecula de hemaglutinina provoacă fuziunea ăn absenţa oricăror alte componente virale.Tipul viral cel mai patogen al gripei - tipul A - conţine 13 subtipuri de hemaghetinine (HA) notate HA1 - HA 13 si 9 antigene de tip neuraminidaza (N) notate Nl-N9. Fiecare virus prezintă 300-600 spiculi de hemaglutina care explica ataşarea virionilor la celule. Intr-o prima etapă, hemaglutinidele virale se leagă pe reziduurile de acid sialic ale glicoforinelor A. Caracterizarea precisă a domeniilor de legare la nivelul proteinelor virale şi a receptorilor celulelor gazdă deschide o noua cale în terapia antivirală: experimentarea şi producerea unor agenţi care să acţioneze în competiţie cu virusurile în legarea pe receptor.

10.13.2. Penetrarea virusului în celulă Procesul de internalizare a virionilor, declanşat de ataşarea lor ireversibilă la receptorii celulari este numit viropexie (enducitoza). În plus, virusurile cu anvelopa (ortho-si paramixovirusurile, rhabdo- si togavirusurile etc.) datorită includerii în structura externa a unei porţiuni lipidice pot penetra si printr-un proces de fuziune. Pătrunderea paramixovirusurilor în celulă prin fuziunea dintre anvelopa virală şi membrana celulară, perturbează permeabilitatea acesteia din urma, ceea ce poate avea urmări toxice ca hemoliza (la hematii), liza "din afară" (la celulele nucleate) şi chiar modificării nucleare şi alterări cromozomale. Studii electronomicroscopie combinate cu detectare a antigenului cu anticorpi marcaţi de peroxidază au lămurit în cazul virusurilor respirator sinciţial şi rujeolic, secvenţa evenimentelor timpurii ale infecţiei. Astfel, consecutive absorbţiei (la +37C) anvelopa virală şi membrana celulara fuzionează, apoi antigenele virale se dispersează în regiunile adiacente ale membranei, întreaga celulă devenind specific reactivă cu anticorpii antivirali marcaţi. Aceasta difuziune explică cel puţin două fenomene: - starea refractara a celulelor la fuziunea cu alte virusuri şi, - difuzarea infecţiei din aproape în aproape prin antrenarea celulelor vecine în procesul de sincitizare. În cazul papovavirusurilor, ca rezultat al absorbţiei se notează o creştere rapida a fluidităţii membranei celulare datorită activităţii unor enzime membranare, probabil declanşată de procesul endociotic.

228

Prin urmare, absorţia la suprafaţa celulei este urmată de penetraţia virusului în celulă, care se poate desfăşoară pe doua căi: a) fuziune directa cu membrane plasmatică; b) prin endocitoza (viropexie) simplă (absorptiva) sau mediată de receptori (clatrinică). Virusurile încapsulate pot urma ambele cai, în timp ce virusurile nude numai endocitoza. Endozomul (fagozomul) fuzionează apoi cu lizozomul a cărui aciditate favorizează fuziunea membranelor virale şi lizozomale ; procesul este foarte rapid, încât expulzarea nucleocapsidei în citoplasma se efectuează fără distrugerea ei de către enzimele lizozomale de degradare.

10.13.3. Tipuri de efect citopatic Sunt descris mai multe tipuri morfologice de efecte citopatice viral - induse în culturi, de pildă: a. citotoxic (produs de infecţii masive, hiperacut, fără a exista timp pentru sinteza virusului progen; leziunile au fost asimilate cu fenomenul lizei "din afara" in cazul bacteriilor parazitate de fagi); b. citolitic (caracterizat prin alterări celulare acute-rotunjire,ratatinare-şi pierderea capacitaţii celulelor de a retine coloranţii vitali); c. sinciţial (indus de virusuri care poseda proteine structurale de "difuziune" ca herpesvirusuri, paramixovirusuri, retrovirusuri); d. incluziogen (caracteristic unei replicări virale relativ lente şi însoţit, în afara de apariţia incluziilor virale (noi particule de virus) de vacuolizari citoplasmice, citomegalie, sincitizare etc. De reţinut faptul ca relaţiilor virus-celula gazda, exprimate morfologic, le corespunde o proporţie semnificativ mai mare de interacţiuni neproductive, aşa cum infecţiile clinic aparente sunt amplificate epidemiologic de infecţiile subclinice.

10.13.4. Leziuni cromozomale determinate de virusuri Virusurile induc diverse anomalii cromozomale ca: aberaţii cromozomale (fragmentări, pulverizaţii, rupturi, schimburi cromatiniene); anomalii ale aparatului mitotic (mitoze multipolare , mitoze colchicina-like); cariotip anormal cu complement instabil sau stabil; policariocite. În ceea ce priveşte patogeneza virala la nivel molecular, de notat ca datele actuale evidenţiază adaptarea continuă a genomului viral şi a gazdei, astfel încât să fie asigurată supravieţuirea ambilor parteneri. Temin a propus o serie de intermediari evolutivi între elementele genetice mobile şi retrovirusuri, trecând prin provirusuri. Însăşi retrovirusurile cuprind grupe evolutive si anume: retrovirusuri nononcogene, lent-oncogene şi rapid oncogene . Se ştie că un concept recent asupra oncogenezei virale susţine integrarea unui provirus retroviral adiacent la o genă celulară potenţial oncogenă (c-onc). Important din punct de vedere teoretic este deci faptul ca inserarea elementelor genetice mobile (sau a provirusurilor) într-un loc sau altul al genomului celular mobil este urmată de inactivarea sau activarea unor gene celulare. Astfel de activări, consecinţă a controlului exercitat de un nou promotor, pot fi la originea unor tumori canceroase. -

229

10.13.5. Natura şi funcţia unor structuri virus-like: prionii Un capitol de patologie moleculară a celulei interesant în virusologie, genetică şi clinică priveşte în prezent natura, compoziţia chimica si funcţia unor structuri puse in evidentă prin diverse metode, ori demonstrate direct prin microscopie electronică. Astfel proteina prion (PrP) este una din proteinele majore produse in exces in encefalopatiile spongiforme subacute la om si animale de laborator. Natura exactă a agenţilor neconvenţionali care induc aceste boli este necunoscuta in prezent. Au fost evocate câteva ipoteze conform cărora agenţii ar prezenta: un virus convenţional, o noua clasa de agenţi numiţi virioni, o proteină autoreplicabilă (numita Prion), un retrovirus sau este vorba de o boala post-translatională , care implică dereglarea sintezei proteice. Acumularea PrP , ca şi a proteinei acidice fibrilare gliale (GFAP) în infecţiile experimentale la şoarece cu scrapie, în special în creier, implică aceste proteine în mecanismele lezionale ale sistemului nervos central (SNC). PrP (33-35 KD) este o sialoglicoproteină celulară localizată pe faţa externă a neuronilor în cultură, ancorată printr-un glicolipid fosfatidilinozitol. Nivelul expresiei genetice PrP este menţinut strict pe parcursul vieţii. Studii de cinetică a expresiei genetice PrP si GFAP pun în evidenţa faptul că ARNm GFAP şi PrP variază semnificativ în timpul dezvoltării normale postnatale a creierului de şoarece. ARNm pentru proteina prion a fost detectată imediat după naştere şi a crescut de patru ori în dezvoltarea ontogenetică. În prezent este investigată expresia genelor PrP si GFAP în creierul in dezvoltare infectat cu scabie pentru cunoaşterea mecanismelor de reglare şi/sau dereglare în astfel de infecţii. Toate encefalopatiile spongiforme transmisibile, incluzând scrapia, sindromul GerstmannStraussler-Scheingker şi encefalopatia spongiformă bovină conţin forma agregată, parţial rezistentă la proteaze, ca un marker specific pentru boala oferit de această proteină PrP. Se consideră în prezent că spre deosebire de PrP normală de la suprafaţa neuronilor, forma agregată PrP apare fie dintr-o infecţie , sau de la o genă mutantă PrP, care acţionează ca un catalizator în conversia proteinei normale endogene PrP în cea agregată şi abundentă, astfel incît funcţia normală a proteinei este abolită şi rezultă boala degenerativă. Conform altor opinii, proteina normală PrP acţionează ca receptor pentru un agent al scrapiei încă neidentificat; de asemenea este incriminat un mic acid nucleic care este un virus neconvenţional ( de aceea este dată denumirea de virus neconvenţional sau virină). Din alt punct de vedere este frapantă similitutidinea de patologie a scrapiei cu studii recente privind receptorul poliovirus (PVR).Unele studii recente transgenetice au arătat de exemplu că şoarecele transgenetic exprimând PVR uman devine susceptibil la poliovirus; şoarecele normal este rezistent. Pe măsură ce şoarecii transgenetici ce exprimă PVR au dezvoltat această boală, ei arată modificări patologice corespunzătoare. O variantă a PrP a fost implicată recent în producerea sindromului Gerstmann-StrausslerSchemgker, boală umană rară similară scrapiei, caracterizată prin patologie spongiformă, proteină PrP protează rezistentă si placi (depozite mari proteice). S-a arătat în cazul acestui sindrom, un linkaj între incidenţa bolii şi mutaţia proteinei PrP şi anume, o substituţie a proliniei cu leucina la codonul 103. Ar fi vorba deci de o leziune genetică care poate cauza neurodegenerarea spongiformă transmisibilă sau mutaţia produce o modificare în structura proteinei sau în stabilitate, care mimează efectul legării unui agent patogen. Termenul de prion a fost introdus în biologia moleculară în anul 1982 de către Harley Prusiner de la universitatea din San Francisco. Prionii (cunoscuţi şi sub numele de protovirine, virineos, virusuri latente) reprezintă o clasă de agenţi infecţioşi subvirali, cu greutatea de 27000-30000, unici în felul lor, fiind rezistenţi la toate procesele de inactivare care degradează acizii nucleici (căldura, razele u.v, radiaţii ionizante); prionii rămân o enigmă „o perplexitate” a biologiei moleculare, deoarece admiterea existenţei lor drept agenţi infecţioşi, lipsiţi de acid nucleic şi formaţi exclusiv din 230

proteine, ar pleda pentru dărmarea dogmei centrale a biologiei moleculare, prin acceptarea unei codificări şi multiplicări a acestei proteine prionice infecţioase, nu prin intermediul acidului nucleic al celulei gazdă. Pentru acelaşi motiv,bolile prionice sunt considerate astăzi „pseudoinfecţioase” în comparaţie cu bolile infecţioase clasice, ale căror agenţi etiologici sunt microorganisme (virusuri, bacterii) care conţin în structura lor acid nucleic. Caracteristicile principale ale bolilor prionice sunt: - afectează sistemul nervos central (SNC) provocând encefalopalii spongiforme; - au o perioadă foarte lungă de incubaţie: de la câteva luni la 37-40 de ani; - au o evoluţie lentă, progresivă, totdeauna letală. Pâna în prezent au fost deschise 12 boli priorice: şase la animale şi şase la om (tabelul 4). Dintre acestea, cele mai bine studiate sunt scrapie la animale şi boala Crentzfeldt-Jakobs (CJD) la om. Celelalte zece boli prezintă similarităţi de ordin clinic, anatomo-patologice şi hismitochimic cu aspectele din scrapie. În aceste boli, principala caracteristică moleculară o reprezintă acumularea masivă în SNS a unei proteine PrPc a gazdei, dar într-o izomorfă anormală tip PrPsc (tip proteină din scrapie) la animal respeciv PrPcjd (tip proteină din CJD la om). În prezent se admit trei posibilităţi de producere a bolilor prionice : infecţia lentă, infecţie sporadică şi alterare genetică (tabelul 5). Tabelul 5. Bolile prionice Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Boala Scarpie Eucefalopatia transmisibilă curcilor (TME) Boala cronică devastatoare (CWD) Eucefalopatia spongiformă a copitatelor (EVE) Eucefalopatia spongiformă felină(FSE) Eucefalopatia spongiformă bovină(BSE) boala vacilor nebune Kuru Boala Crentyfeldt - Jakols Sindromul GertmannStröussler Insomnia fatală familială

11. Scleroza multiplă 12.

Frecvenţa SUA, Anglia, Franţa, Elveţia Rară dar cu mortalitate >90% SUA(Colorado, Wyoming) Anglia Anglia(1989) Anglia Papua – Noua Guinee 1/1.000.000 pe tot globul <0,1milion/an Japonia Italia, Anglia, Franţa, America Insulele Faroe, Scoţia, Irlanda, Key West

Boala lui Alper 231

Gazda naturală

Data transmiterii exprerimentale

capre, oi

1936

curci

1939

elan, căprior

1983

Nyola şi antilopa africană pisici domestice

-

bovine

1988

om

1966

om

1968

om

1981

om

-

om, unele tulpini au produs scrapie la oi om

1993

Particularităţi de diferenţiere a prionilor de virusuri Prionii se diferenţiază de virusuri prin următoarele caracteristici majore: Absenţa ADN-ului. În încercările de purificare a prionilor, prin electroforeză în gel sarcosil şi sedimentare în gradient discontinuu de sucroza (proteină) cu greutatea moleculară de 27.000-30.000 (PrP= proteină prionică), dar nici un acid nucleic. Structura exclusiv proteică. În ţesutul cerebral al animalelor cu infecţie prionică plăci de amiloid şi fibre amiloide (SAF =fibre asociate scrapiei). Amiloidul reprezintă un derivat dintr-o glicoproteină celular normală (PrPc), care se găseşte în mod normal pe membrana celulei neuronale.Se ştie astăzi că în cursul infecţiei prionice se produce conversia unei cantităţi de proteină PrPc (prin modificări posttranslaţionale) în PrPsc reprezintă tocmai SAF (proteină înalt infecţioasă). Plăcile amiloide sunt incluzii de prioni. PrPc şi PrPsc au aceeaşi greutate moleculară (33-35Kda), dar PrPc poate fi complet digerată „în vitro” de proteineaza K, în timp ce PrPsc este rezistentă, fiind doar parţial digerată lăsând un miez rezistent proteinoza K; acest miez este reprezentat de PrP 27-30 (GM= 30Kda). PrPsc are o are o abilitate foarte mare de a determina modificări posttranslaţionale ale propriei molecule şi de a forma amiloid, fapt pentru care are consecinţe asupra replicării, transmisibilităţii şi neuropatogenici bolii. Fibrele de amiloid reprezintă produse de degradare (de rupere) PrPsc infecţioase. Modificările posttranslaţionale care contribuie la transformarea PrPc în PrPsc au fost considerate un timp doar modificări conformaţionale de împăturire (substituirea α-helixurilor cu β-sheet-uri); date recente pledează şi pentru modificări de ordin chimic. Absenţa imunităţii. Spre deosebire de virusuri, care produc răspuns imun prionii nu sunt imunogeni. Bolile prionice sunt cu evoluţie lentă, apar paradoxal în absenţa oricărui răspuns imun care a putea opune rezistenţă înaintării infecţiei. Existenţa unor forme multiple cu grad înalt de infecţiozitate. Prionii pot exista sub formă de bastonaşe, complexe proteice cu lipit-detergent (DhPCs) şi sub formă de lipozomi. Aceste forme sunt interconvertibile; în toate aceste forme singura moleculă identificată este tot PrPsc. Ipoteze referitoare la natura prionilor Referitor la natura prionilor s-au emis imens unele ipoteze (ipoteza viroidului animal, ipoteza virină, ipoteza retrovirusului, grupul ipotezelor de agenţi infecţioşi „fără geamăn” etc.). Până în prezent nici una din ipoteze nu se bucură de adeziunea întregii comunităţi ştiinţifice. Prionii rămân o clasă aparte, fără precedent, de agenţi infecţioşi fudamental diferiţi de virusuri şi viroizi. Multe întrebări referitoare la prionii îşi aşteptă răspunsul în viitor. Este de menţionat însă faptul că problema BSE (boala vacii nebune) şi cea a radioactivităţii ocupă în prezent aceeaşi nişă psihologică în societate, în timp ce fumatul, obezitatea, abuzul de alcool, lipsa de mişcare (agenţi ai unor boli cu incidenţă a mortalităţii extrem de mare pe glob) sunt total ignoraţi. Ipoteza viroidului animal Viroizii sunt agenţi subvirali exclusiv din ARN fără înveliş (capsidă) proteic. Spre deosebire însă de viroizii cunoscuţi (potato spindle tuber viroid), foarte rezistenţi la u.v., prionii sunt de 10 ori mai rezistenţi decât ARN-ul purificat al acestora; de asemenea, în timp ce viroizii sunt sensibili la nulează, prionii sunt rezistenţi. Ipoteza virină O moleculă de acid nucleic ce conţine informaţia biologică (prion) ar fi protejată de o moleculă de proteină a gazdei, fomând împreună o particulă infecţioasă, capabilă de replicare; prezenţa acestui acid nucleic nu a fost încă confirmată. 232

Ipoteza retrovirusului Pentru asigurarea retrovirală a prionilor se aduc ca argumente tropismul pentru SNC şi modificările de membrană (induse foarte rar) fără răspuns inflamator major. -

Argumente contra originii retrovirale a prioinilor sunt următoarele: nu a putut fi pus în evidenţă nici un retrovirus, prin metodele actuale, în bolile prioniei; rezistenţă foarte mare la formaldehidă şi glutaradeldehidă (retrovirusurile fiind sensibile la aceste doua substanţe).

Grupul ipotezelor de agenţi infecţioşi „fără genom” Plecând de la conceptul iniţial de prior respectiv „proteină autoreplicabilă”, se emit mai multe ipostaze prin care se încearcă explicarea modificării proteinei celulare normale PrPc în proteină izomorfă patologică PrPsc, fie datorită unor mutaţii suferită de gena ce codifică PrPc, fie datorită unor perturbatori ce apar posttranslaţional în conformaţia spaţială a proteinei în diferite etape. Modele viitoare Modelele transgenetice deşi au sporit cunoaşterea noastră în înţelegerea bolilor scrapielike nu au clarificat totuşi complet rolul proteinei PrP. Se speră ca în viitorul apropiat să se creeze prin recombinare omoloagă, linii de şoarece cu modificări precise în gena PrP endogenă şi fără nici o extracopie. De pildă, şoareci cu gene PrP nefuncţionale ar permite să se elucideze funcţia normală a PrP în sistemul nervos şi ar putea fi folosiţi să demonstreze dacă această proteină a gazdei este într-adevăr necesară pentru replicarea agentului scrapie. De asemenea, numeroase observaţii electronomicroscopice în boli ca lupusul eritematos ,dermatomiozită, glomerulonferită, etc, s-au referit la incluziile "tubulare" (paramixovirus-like) dm citoplasmă celulelor endoteliale , fibroblastelor, macrofagelor , limfocitelor, etc. Formaţiunile respective au circa 1,5 um în diametru şi fiecare tubul măsoară circa 20-25 nm. In secţiune transversală, tubulii prezintă un mers dens (probabil acid nucleic), apoi o zonă cu densitate medie şi o pătură periferică (probabil proteică), fiind similar ca aspect general cu nucleocapsidele fără înveliş ale paramixovirusurilor.În sprijinul naturii virale a "tubulilor" pe lângă trăsăturile morfologice în examinarea directă , s-a invocat capacitatea acestora de a perpetua în culturile de celule păstrându-se sensibilitatea la ribonucleaza cât si depozitarea complexelor imune virale de tip C în piele. S-a emis chiar ipoteza potrivit căreia etipatogenia aşa-ziselor colagenoze s-ar petrece mai întâi infecţia virală (acidul nucleic viral ar fii un timp în stare biofită )şi apoi imunocompromisul indus de virus. Conform altor opinii,asemenea agregate tubulare larg răspândite la om şi la animale , în diferite ţesuturi şi în diferite boli, ar prezenta fie material celular alterat eliberat în circulaţii după răniri , fie produse de regenerare celulară sau chiar complexe imune. De regulă RER apare anormal dilatat în celulele endoteliale ale vaselor sanguine din piele şi muşchiul scheletic la subiecţi cu astfel de boli, conţinând tubulii caracteristici. Deşi problema acestor formaţiuni tubulare este şi ea grevată de necunoscute , se acceptă încă folosirea lor ca elemente de diagnostic în unele boli ale ţesutului conjunctiv. În sfârşit, în sindromul de imunodeficienţă dobândită (SIDA) unele limfocite conţin în citoplasmă particule sferice , dispuse ordonat după un model paracristalin- ca un stadiu în morfogeneza virală.

10.14. Relaţiile bacterii-celulele gazdei Bacteriile sunt importante din punct de vedere teoretic şi practic prin rolul jucat în experienţele de recombinare a ADN (inginerie genetică) şi prin caracterul patogen al unor specii. În patogenia umană ele produc infecţii-boală, datorită factorilor de patogenitate determinaţi genetic. 233

Prin virulenţa lor, ele pot depăşi capacităţile de apărare al gazdei, factorii de virulenţă incluzând factorii de colonizare şi factorii care contribuie la multiplicare. O importanţă majoră pentru aderenţă şi colonizare o are doza infectantă; în intestin numai o singură celulă bacteriană din câteva mii ajunge să adere şi să colonizeze. În procesul de aderenţă participă anumite structuri macromoleculare antigenetice, de la suprafaţa bacteriei numite adezine şi receptorii corespunzători ai celulelor epiteliale. Adezinele(glicoproteine,liporoteine de 1000-125000 Da) sunt reprezentate în general de filamente (numite fimbrii la bacteriile gram-negative)şi de fibrile (la cele gram-pozitive). Prezenţa receptorilor celulari corespunzători diferitelor adezine determină în mare parte specificitate de specie sau de ţesut a aderenţei bacteriene. Odată aderate şi înglobate în stratul de mucus secretat de celulele epiteliale, unele bacterii se limitează la epitelii (C. dipteriac, E. coli etc) întrucât nu pot trece de fagocitele subepiteliale anticorpi, factori bactericizi serici etc, în timp ce altele (Str. pyogenes, Salmonella etc) pătrund în ţesuturile subepiteliale. Penetrarea acestora este asigurată de enzime (histolitice şi citolitice) componente ale peretelui celular (peptidoglicani etc) şi de endocitoză de către celulele epiteliale care ulterior le exocitează. După depăşirea membranelor bazale (care acţionând ca un filtru le temporizează diseminarea),bacteriile ajung în ţesutul subepitelial de unde pe cale limfatică şi/sau sanguină, sau fagocitate, pot difuza în tot organismul. De reţinut că bacteriile foarte mobile şi subţiri (spirochetele) pătrund prin epiteliile gazdei atât prin endocitoză cât şi prin mişcări active datorită aparatului locomotor, formei spiralate şi extremităţilor ascuţite, singura zonă unde se găsesc şi adezine. Fibrele periplasmatice ale spirochetei Tr. pallidum sunt implicare în locomoţia bacteriei care se deplasează "înşurubându-se" în mediul lichid. Dacă virusurile gripale sunt cantonate la epiteliul ciliar al tractului respirator superior, în cazul bacteriilor deficienţe ale aparatului mucociliar ale acestui tract favorizează producerea sinuzitelor, bronşitelor, pneumoniilor, de către flora nazofaringiană normală. Sisteme enzimatice complexe situate la suprafaţa celulei bacteriene sau eliberate în mediu (care permit consumul elementelor nutritive ca atare sau modificate conform necesităţilor metabolice proprii) asigură multiplicarea lor. Agresinele de la suprafaţă (mucopeptide, polipeptide, enzime) permit inhibarea ori ocolirea mecanismelor de apărare a gazdei, iar toxinele (proteice şi lipopolizaharidice) generează diverse efecte patologice; toxina difterică, de pildă citotoxică, inhibă sinteza proteinelor, producând leziuni predominant cardiace, hepatorenale şi nervoase. Oricare ar fi gradul patogenecităţii bacteriei implicate şi severitatea căii de pătrundere în organism, starea de imunitate a gazdei reprezintă factorul major de condiţionare a manifestării patogenităţii.

234

Capitolul 11 BIOTEHNOLOGIA Secolul XX şi în special perioada de după al doilea Război Mondial, a însemnat un uriaş pas înainte în dezvoltarea cercetărilor de genetică şi inginerie genetică, de biologie celulară şi moleculară, de biochimie şi microbiologie, precum şi a tehnicilor de culturi de celule vegetale, animale şi microorganisme. S-au creat astfel premizele apariţii biotehnologiilor moderne şi a bioindustriei. Biotehnologia este o ramură industrială complexă care utilizează drept materie primă microoganismele (bacterii, drojdii, mucegaiuri etc), culturi de celule vegetale şi animale, pentru obţinerea de organisme şi de substanţe utile economic. Astfel, biotehnologiile moderne au mari implicaţii în industria alimentară ( producerea de proteine monocelulare neconvenţionale, sinteza unor aminoacizi esenţiali, cum sunt lizina şi acidul glutonic, producerea de enzime, sinteza de aditivi alimentari), în industria farmaceutică (producerea de antibiotice, hormoni, vitamine, substanţe antivirale şi amtitumorale, vaccinuri, anticorpi monoclonali etc), în bioexploatarea petrolului şi minereurilor (creşterea gradului de recuperare cu ajutorul unor microorganisme), în ecologie ( valorificare biomasei, preparate cu rol în purificarea apelor industriale şi menajere ), în medicină (produse de interes medical utilizate în diagnostic, tratament sau cercetare fundamentală. O importanţă deosebită au biotehnologiile moderne pentru manipularea genomului celulei vegetale şi animale în vederea creării de soiuri de plante şi rase de animale pe căi neconvenţionale, mult mai repede şi mai eficient.

11.1. Ingineria genetică Progresele spectaculoase ale biologiei, aşa cum se exprimă ele în realizările ingineriei genetice sunt strâns legate de înaintarea impresionantă a tehnicilor analitice, ca ultracentrifugare, marcarea moleculelor prin izotopi radioactivi, electroforeză, cromatografia de afinitate (de ex., tehnica separării moleculelor complexe prin anticorpii monoclonali corespunzători), electrofocalizarea bidimensională (permiţând analiza a 50 000 de proteine ale unei celule), microanaliza (de ex., determinarea structurii primare a unei proteine pornind de la numai 10 nanograme, dar şi a structurii altor macromolecule biologice).

11.1.1. Tipuri de transfer de gene Prin această tehnologie se realizează noi combinaţii de ADN de la două organisme diferite, prin transfer de gene de la un organism la altul, obţinându-se în acest fel organisme transgenice. Până în prezent s-au obţinut următoarele tipuri de transfer de gene: a) Gene virale transferate la virusuri; b) Gene virale transferate la eucariote; c) Gene de la procariote transferate la procariote; d) Gene de la procariote transferate la eucariote; e) Gene de la eucariote transferate la procariote; f) Gene de la eucariote transferate la eucariote. Gene virale transferate la virusuri. Folosindu-se un asemenea transfer s-a putut obţine prin tehnica de recombinare genetică un nou vaccin rabic cu o eficienţă mult crescută faţă de cele folosite în mod obişnuit. 235

Rabia este o infecţie virală ce se transmite prin muşcătură (în cazuri speciale şi prin aer) de câine, vulpe (Europa), sconcşi, ratoni, lupi, câini, vulpi polare, lilieci (America). În fiecare an se înregistrează 50000 de decese umane prin rabie pe glob (majoritatea în Asia) şi câteva milioane de decese la animale. Gene virale transferate la eucariote. În 1995, Becker şi Darai arată că ingineria genetică cu viruşi vectoare reprezintă un subiect de primă importanţă pentru dezvoltarea protocoalelor de terapie genică la om. Cu ajutorul retrovirusului recombinat Herpes simplex tip I a fost transportată gena timidinkinaza HSV-1TK de la acest virus în celule pulmonare canceroase de la om. Respectiva enzimă a indus în celulele canceroase sinteza de monofosfat de aciclovir şi ganciclovir şi apoi fosforilarea acestora până la forma de trifosfat, care a inhibat sinteza ADN celular din celulele canceroase, oprind diviziunea celulară şi propagarea celulelor neoplazice. În aceeaşi categorie de transfer de gene se încadrează metoda de preparare a vaccinului hepatitei B (vaccin Engerix-B). Biologia moleculară a permis determinarea cvasi-totală a materialului genetic al virusului hepatitei B. Astfel, în secvenţa ADN a fost identificată gena S drept responsabilă se sinteza proteinei S (antigen HBs); proteina S este un antigen de suprafaţă al virusului (antigen prezent, în mod constant, în serul bolnavilor de hepatită virală tip B). Prin aplicarea unei tehnologii genetice, din ADN viral a fost izolată gena S şi, cu ajutorul unui vector, a fost inserată în materialul genetic al unei celule gazdă eucariote ( o levură), care prin multiplicare a permis ulterior exprimarea şi sinteza în cantitate mare a respectivei proteine a antigenului HBs. Respectivul antigen nu este infecţios, ci doar imunogen. Pentru prepararea vaccinului Engerix-B (ADN recombinat), a fost selecţionată levura Saccharomyces cerevisiae (1991) (Smith Kline-RIT). Pentru producerea vaccinului la scară industrială, tulpina de levură pe care se realizează procesul de recombinare este însămânţată în cuve de fermentaţie (bioreactoare), în care levura se multiplică rapid, producând proteina-antigen HBs. Celulele de levură sunt apoi recoltate, broyate, iar antigenul HBs este izolat şi înalt purificat, înainte de a fi condiţionat în vaccin. Gene de la procariote transferate la procariote Pentru a realiza introducerea ADN-ului (gena) bacterian într-o altă bacterie, sunt folosite două tehnici. Prima constă în utilizarea plasmidelor* ca vectori, iar a doua în utilizarea bacteriofagilor. Deoarece bacteriile sunt organisme haploide, reasortarea materialului genetic nu se poate realiza prin recombinare în cadrul aceleaşi celule, ci prin transferul de material genetic de la o tulpină donoare la una receptoare (diferită de prima), din cadrul aceleiaşi specii sau între specii bacteriene înrudite. Rezultă o celulă care conţine întreg genomul receptorului şi un fragment din genomul donorului. S-au descris patru mecanisme diferite de transfer genetic: • transformarea; • transducţia; • conjugarea; • transpoziţia (translocarea sau recombinarea cu specificitate de situs). Transformarea reprezintă prelucrarea unei molecule de ADN de la o tulpină donor de către o celulă receptoare competentă. ADN-ul transformat se leagă de celula competentă, la nivelul unor situs-uri specifice ale învelişului celular, pătrunde apoi în celula receptor şi se integrează prin recombinare în regiunea omologă a cromozomului receptor. * Plasmidele = clasă majoră de elemente genetice mobile, formate dintr-un duplex ADN; sunt cromozomi accesorii, se pot replica autonom (replicon).

236

Transducţia reprezintă transferul de material genetic de la o bacterie la alta, prin intermediul fagilor transductori. Acest fenomen este practic posibil la toate speciile bacterine, dar numai anumiţi fagi au proprietatea de a fi transductori (fagul λ de la E. coli, fagul P1 de la E. coli, fagul P22 de la Salmeonella typhimurium). Conversia. Anumiţi fagi (convertizori) transportă gene cu alte funcţii decât cele virale, cel mai cunoscut fiind gena “tox” responsabilă de toxinogeneza tulpinilor de bacil difteric. Conjugarea presupune un transfer de material genetic de la celula donatoare la celula receptoare, prin intermediul factorului de fertilitate F (factor plasmidic = vector), numit şi factor de fertilitate. Transferul de material genetic este polarizat de la celula F+ (celula donatoare, care conţine factorul de fertilitate F ) către celula F- (celula receptoare, lipsită de factorul F), începând cu capătul 5’ al ADN-ului. Factorul F pătruns în celula receptoare Fpoate rămâne liber în citoplasmă şi atunci celula F- devine F+, sau se poate integra în cromozomul bacterian (cu frecvenţă de 105 per generaţie); în acest ultim caz, celula receptoare F- devine Hfr (high frequeney recombination), deoarece prezintă frecvenţa înaltă de recombinare. Transpoziţia este fenomenul prin care copii (elemente transpozabile) ale unor secvenţe specifice de acid nucleic, dintr-un genom bacterian, se deplasează de-a lungul aceluiaşi lanţ de acid nucleic sau pe cel al altui genom bacterian, având capacitatea de a se insera pe unul sau mai multe situs-uri specifice. Gene de la procariote transferate la eucariote S-a obţinut transferul unei gene (responsabilă de sinteza unei endotoxine care omoară insectele) de la Bacillus thuringiensis în celule vegetale (bumbac) cu ajutorul unui plasmid Ti asociat cu un retrovirus. Această tehnologie generică este folosită cu rezultate foarte bune de mai bine de 30 de ani. Plasmidul Ti provine de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, bacterie care parazitează plantele; plasmidul Ti poate trece spontan în celulele vegetale infectându-le, rezultatul fiind producerea unor tumori la plante, tumori cunoscute sub numele de “creasta cocoşului”. Aceste plasmide Ti, folosite astăzi, în asociere cu un retrovirus, drept vectori pentru manipulări genetice (transfer între o celulă procariotă şi o celulă eucariotă), îşi pierd capacitatea tumorigenă şi o păstrează doar pe cea de vector a unei gene străine (de ex., gena de sinteză a endotoxinei bacteriene de mai sus). Gene de la eucariote transferate la procariote Acest transfer este practicat de 20 de ani. Genele din genomul eucariot sunt transferate cu ajutorul unui vehicul corespunzător în organismul procariot iar apoi aceste noi gene transferate se multiplică (cu rată foarte înaltă) în organismul procariot. În acest fel, organismele procariote (microorganisme tip bacterii) cu rată foarte înaltă de multiplicare pot fi utilizate pentru sinteza anumitor gene din organismele superioare. Acest tip de combinaţie ADN in vitro, urmată de clonarea genelor nou transferate, se foloseşte astăzi pe scară industrială şi se realizeză după următoarele etape: ƒ ADN din cromozomul organismului eucariot este extras şi purificat, apoi tăiat de endonucleaze de restricţie; ƒ se foloseşte un vehicul izolat dintr-o bacterie. Plasmidul de formă circulară este deschis (cu ajutorul unei enzime de restricţie), obţinându-se un lanţ ADN unic. Deoarece endonucleazele se fixează pe plasmid doar la nivelul aceloraşi secvenţe de baze ca cele de pe fragmentul ADN, rezultă locuri de tăiere cu secvenţe complementare. Acest aspect reprezintă condiţia esenţială pentru fuziunea fragmentului ADN cu plasmidul deschis. Pe baza capetelor ADN lanţ unic cu secvenţe complementare (sub influenţa ADN-ligazei) se pot lega cele două lanţuri ADN străine (plasmid + gena de la eucariot), formând deci un lanţ dublu ADN. În acest fel, plasmidul se închide, incluzând şi gena eucariotă, care devine astfel o parte integrantă din sistemul genetic al procariotului, rezultând un plasmid 237

hibrid. Pentru a se facilita pătrunderea acestui plasmid hibrid în celula bacteriană se foloseşte soluţia de CaCl2, care creşte permeabilitatea membranei bacteriene, determinând terminarea transferului de gene. ƒ selectarea celulelor bacteriene care conţin gena eucariotă se realizează cu ajutorul unui plasmid care poartă unul sau mai mulţi markeri de rezistenţă la antibiotice. Dacă cultura bacteriană cu plasmidul mai sus-menţionat este pusă în prezenţa antibioticelor respective, bacteriile, cu câteva excepţii, vor fi omorâte. O bacterie rezistentă posedă o genă (eucariotă) străină (cuplată cu plasmid cu markeri de rezistenţă). Aceste celule bacteriene cresc pe respectivul mediu sub formă de colonii în care există un număr de ordinul a sute de milioane de celule bacteriene cu genă eucariotă, deci fiecare celulă bacteriană dintr-o colonie rezistentă la antibiotice conţine o genă eucariotă. Aceste celule bacteriene au fost transformate. Prin tehnologia genetică de transfer de gene de la eucariote la procariote s-au obţinut următoarele sinteze: - somatotropina (hormon de creştere uman) (1979) - interleukina umană (1980) - interferon leucocitar de fibroblaşti (1980). Gene de la eucariote transferate la eucariote Gene umane (responsabile de sinteza unor produse metabolice) au fost transferate în celule de drojdii; acestea, după integrarea în genomul lor a genelor umane, au putut sintetiza produse metabolice umane. În prezent drojdiile se folosesc în acest scop pe scară largă în industria farmaceutică. Gene umane au fost inoculate şi în culturi de celule de mamifere. De pildă, gena umană (de pe cromozomul 10) responsabilă de sinteza factorului VIII al coagulării a fost clonată şi transferată în celule renale de hamster, celula de hamster începând să sintetizeze produsul acestei gene, adică factorul VIII de coagulare, necesar în tratamentul hemofilicilor; preţul acestui produs s-a dovedit a fi mult mai ieftin decât al factorului VIII extras din plasma de la om sănătos. Pentru cele 4000 de boli genetice umane cunoscute astăzi ca nevindecabile se preconizează o terapie genetică prin: reperarea genelor mutante responsabile de defectul genetic şi ulterior, înlocuirea genei mutante printr-o alelă normală. Această terapie este încă la început; se încearcă introducerea unei gene normale în genomul pacientului şi urmărirea acestei acţiuni în timp. Acest prim pas reprezintă “adiţia de gene“; principiul acestei metode este recoltarea de la pacienţi de celule cu defect, injectarea acestora cu gene sănătoase fixate pe un virus vector, apoi reinfuzarea respectivelor celule la pacient.

11.1.2.

Terapie cu gene ţintă (Gene Targeting)

În condiţiile progresului actual al ştiinţelor biologice, există premisele tratării într-un viitor foarte apropiat a unor boli genetice, infecţii HIV, boli neoplazice. În aceste boli, terapia cu gene are drept scop introducerea unor gene intacte din punct de vedere funcţional în celulele cu genă defectă şi apoi exprimarea acestor gene nou introduse. Din punct de vedere teoretic, terapia cu gene poate fi de două feluri: ƒ terapie cu gene somatice, în care celulele receptoare de genă intactă sunt celulele organismului. În acest caz, tratamentul este restrâns doar la pacienţii trataţi, dar rămâne fără efect asupra descendenţilor; ƒ terapie cu gene sexuale, în care celulele receptoare de genă intactă pot fi celulele sexuale sau celula ou fecundată, în acest caz influenţa tratamentului transmiţându-se progeniturii. Astăzi este însă interzis prin lege transferul de gene la nivelul celulelor sexuale umane; rămâne practicabilă doar terapia cu gene în celulele somatice. Principiile de bază ale terapiei cu gene sunt următoarele: 238

ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ

recoltarea de celule ţintă de la pacient; cultivarea şi multiplicarea celulelor ţintă în culturi celulare, în condiţii speciale; clonarea genelor sănătoase; introducerea în celulele ţintă cu ajutorul unor vectori corespunzători (retrovirusuri) a unor gene sănătoase; selectarea celulelor care conţin gene sănătoase străine şi exprimarea lor; multiplicarea celulelor dorite în culturi de celule; reintroducerea acestor celule la pacienţi.

a. Terapia cu gene în boli ereditare Majoritatea bolilor genetice la om sunt determinate de mutaţii punctiforme sau deleţii. În prezent se studiază posibilităţile tratării, pe baza terapiei cu gene, a următoarelor boli ereditare: ƒ boli sanguine de tip talasemie şi meniscocitoză (sickle cell anemia); în aceste boli există o genă deficitară în sinteza subunităţii tip β-globină din structura hemoglobinei; celulele ţintă pentru terapia cu gene sunt reprezentate, în acest caz, de celulele stem pentru seria eritrocitară din măduva osoasă; ƒ hipercolesterolemia familială; este o tulburare genetică a metabolismului grăsimilor, bazat pe absenţa receptorilor LDL (lipoproteine cu densitatea scăzută) ai celulelor hepatice. Anderson şi colab. De la Univ. Houston din Texas preconizează pentru tratamentul acestei boli realizarea unor ‘neo-organe’ (structuri din materiale artificiale plasate în vecinătatea ficatului), în care sunt introduse celule hepatice injectate cu gene care au capacitatea de a atrage colesterolul. Acest ‘neo-organ’ (cu rol de ligand), dacă va fi conectat printr-o reţea de vase sanguine cu ficatul, va extrage excesul de colesterol din sistemul circulator (unde colesterolul poate determina tulburări cardiovasculare) şi îl va îndrepta prin reţeaua sanguină către ficat, care îl va elimina; ƒ distrofia musculară Duchenne; se manifestă printr-o topire rapidă a masei musculare; boala apare ca urmare a inactivării genei responsabilă de sinteza distrofinei. Această inactivare este consecinţa inserţiei, în exonul 48 al respectivei gene, a unui retrotranspozon L1; ƒ mucoviscidoza (fibroza chistică) este o boală genetică recesivă care afectează pancreasul exocrin; se caracterizează prin creşterea consistenţei secreţiei pancreatice având drept consecinţă obturarea glandelor exocrine şi formarea de chisturi pancreatice cu distrugerea ţesutului pancreatic şi scăderea nivelului enzimelor pancreatice. În această boală este prezent şi un deficit funcţional al enzimei mitocondriale NAD- dehidrogenaza cât şi o creştere intercelulară de ioni de Ca++; ƒ boala imunodeficienţei combinate severe (SCID) cu deficit funcţional al limfocitelor T (prin absenţa enzimei adenozindezaminaza A şi B). Această boală este foarte rară, până astăzi fiind descrise numai 50 de cazuri în literatura de specialitate. Absenţa respectivei enzime determină scăderea capacităţii de apărare a organismului şi moartea copilului în primul an de viaţă. Epoca terapiei cu gene a început în septembrie 1990 în SUA, când Francis Anderson, şeful secţiei de Hematologie Moleculară de la Naţional Heart, Lung and Blood Institute al Universităţii Houston Texas, şi medicii Michael Blaese şi Kenneth Culver de la Naţional Cancer Institute au efectuat prima terapie cu gene tocmai într-un caz cu deficit funcţional de limfocite T. Procedeul a constat în recoltarea de limfocite T de la copilul bolnav; aceste limfocite au fost cultivate şi multiplicate în culturi celulare. Cu ajutorul unui vector, aceste celule T din culturi au fost inoculate cu gene pentru enzima adenozindezaminază. Apoi aceste limfocite inoculate au fost cultivate şi multiplicate mai departe în culturi celulare, fiind apoi reinfuzate i.v. la acelaşi copil. Acest tratament va trebui repetat în cursul vieţii pacientului. Cu referire specială la utilizarea retrovirusurilor drept vectori de gene, trebuie menţionat că Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Tehnology a imaginat o metodă eficace 239

de prelucrare prealabilă a acestui virus. Această prelucrare constă în eliminarea prealabilă a majorităţii genelor virale din structura acestuia şi combinarea ulterioară a segmentului de virus rămas cu genele care urmează să fi injectate în celulele umane. În acest fel, virusul lipsit de majoritatea genelor proprii devine inofensiv, deposedat fiind de capacitatea infecţioasă, păstrând însă capacitatea ca, o dată introdus într-o celulă, să-şi poată îngloba încărcătura genetică în aceasta. Retrovirusurile reprezintă astăzi uneltele cele mai larg utilizate în ingineria genetică. Retrovirusurile sunt mai mici decât celelalte virusuri şi, spre deosebire de acestea, nu ucid celulele pe care le contaminează. Fenomenul prin care retrovirusul vector transportă şi fixează o anumită genă în nucleul unei celule ţintite poartă numele de transducţie. Pentru terapia genică, alegerea celulelor ţintă este foarte importantă. Iniţial s-a încercat folosirea celulelor stem (celule-tulpină) din măduva osoasă, dar aceste celule s-au dovedit a fi ţinte foarte dificile, fiind foarte greu de obţinut; proporţia acestor celule stem în ţesuturile medulare este mai mică de 1/10000 şi nu există nici o metodă adecvată de separare a celulelor stem de celelalte celule. În plus, fenomenul de transducţie poate avea loc doar în celule care se divid, or celulele stem, se divid foarte rar, deci transducţia în aceste celule este practic imposibilă. De aceea, deşi celulele stem au o durată de viaţă infinită în comparaţie cu limfocitele ( cu viaţă doar de câteva luni), au fost preferate limfocitele drept celule ţintă pentru vectori. Pentru a fi ‘altoite’ cu retrovirusul transductor, limfocitele sunt puse în contact, într-o mixtură cu acesta, într-o cultură de celule; în câteva ore virusul va pătrunde în majoritatea acestor limfocite, care apoi vor fi infuzate pacientului. Este posibil ca limfocitele corectate (prin injectare cu virus vector + gena pentru sinteza enzimatică) să asigure un timp, cel puţin parţial, un anumit nivel imunitar organismului. b. Terapia cu gene în infecţia HIV Anderson şi colab. Împreună cu R. Gallo (National Cancer Institute) preconizează tratamentul cazurilor de SIDA prin terapie ţintită cu o genă pentru sinteza unei proteine receptoare CD4 pe suprafaţa limfocitului. În prezenţa respectivei gene, limfocitele ar fi capabile să sintetizeze o cantitate mare din această proteină. Virusul HIV, în primul stadiu al pătrunderii sale în organism, se fixează pe această proteină de pe suprafaţa limfocitelor. În cazul în care în sistemul sanguin ar putea exista şi circula o cantitate mare dintr-o proteină similară, această proteină ar putea fixa virusul HIV, acesta nemaiputând să pătrundă în celulele sistemului imunitar, ciclul de multiplicare virală intracelulară fiind astfel oprit. c. Terapia cu gene în boli neoplazice A fost utilizată întâia oară în melanomul malign. În 1991, două persoane cu forme avansate de melanom malign au fost supuse următorului tratament: li s-au extras o cantitate de macrofage pe care s-au grefat apoi vectorii (retrovirusuri) purtători de gene pentru sinteza de ‘factor de necroză a tumorilor ‘ (factor TNF). Factorul TNF este o proteină formată din 157 de aminoacizi cu rol în captarea şi distrugerea celulelor tumorale şi a substanţelor străine organismului. În mod normal, acest factor TNF este sintetizat de macrofage şi eliberat în circulaţie; în cazul acestor doi pacienţi cu macrofage defectuoase, TNF nu se poate injecta direct în torentul circulator, deoarece există pericolul diluţiei acestui factor, la locul tumorii nemaifiind posibil să ajungă o concentraţie suficient de activă de TNF. De aceea, macrofagele extrase şi întreţinute pe culturi celulare au fost inoculate cu vector purtător de TNF şi apoi reinlocuite la cei doi pacienţi cu melanom.

240

11.1.3. Aplicarea metodelor de biotehnologie în agricultură în vederea obţinerii de organisme transgenice Biotehnologiile moderne, aplicabile la plante şi animale, au în vedere obţinerea de organisme modificate genetic (transgenice), care să prezinte caracteristici îmbunătăţite, în interesul omului. a. La plante Până de curând, cunoştinţele de genetică vegetală se foloseau doar pentru studiul eredităţii, pentru analiza segregărilor* la descendenţii rezultaţi din hibridizări. Posibilitatea de a utiliza elementele disociate (ţesuturi, celule) din organisme vegetale, de a manipula şi cultiva in vitro, în vederea regenerării plantelor, a deschis primele căi de intervenţie genetică;de asemenea, obţinerea primelor organisme transgenice a deschis noi perspective în ingineria genetică vegetală. Organismele transgenice (plante şi animale) sunt organisme care pe lângă înzestrarea lor genetică câştigă proprietăţi noi, ce se incorporează în genom şi se transmit descendenţilor. Biotehnologia de hibridare somatică Această procedură permite hibridări totale sau parţiale, permutaţii de organite citoplasmatice, fuzionare de protoplaşti (celule fără perete pectocelulozic) chiar de la două specii diferite. Se obţin hibrizi în afara sexualităţii. Prin acest procedeu se obţine regenerarea unui număr mare de plante - figurile: 135, 136 şi 137).

Fig. 135 - Etapele de izolare şi cultură a protoplaştilor (după CachiţăCosma,1984). 241

Fig. 136 - Prin fuziunea protoplaştilor se produc hibrizi somatici, cibrizi şi himere (după Badea şi Raicu, 1984).

Fig. 137 - Prezentare schematică a principalelor posibilităţi de obţinere a unor noi varietăţi de plante (după Brezeanu şi Soran, 1985). Biotehnologie de haploidizare Ţesuturi care au suportat meioza (deci sunt haploide) sau celule rezultate din pseudofecundaţie provocată sunt introduse în culturi in vitro. Există 2 tipuri de haploidizare: - androgeneza = cultura şi regenerarea plantelor plecând de la microspori (fig. 138); - ginogeneza = cultura şi regenerarea plantelor plecând de la ovul sau de la celule haploide asociate.

242

Fig. 138 - Diferite faze ale desfăşurării androgenezei la Datura innoxia: 1 – structuri embrionare diferenţiate direct din anteră; 2,3 – plante complet diferenţiate din antere; 4 – plantă androgenetică în tub; 5 – plantă androgenetică la ghiveci (după Badea şi colab.,1987). Plantele regenerate au un singur set cromozomial (patern de androgeneză şi respectiv matern de ginogeneză) şi ar fi rămas sterile dacă n-ar fi fost puse la punct mecanismele de autodedublare a acestor cromozomi. Prin aceste metode de haplodiploidizare se crează plante diploide perfect homozigote (linii izogene) şi de utilitate majoră în ameliorarea calităţii speciilor de plante (descendenţi absolut omogeni în anumite condiţii de reproducere) (fig. 139). Fig. 139 - Obţinerea de plante haploide, linii izogene şi mutante la nivel haploid prin cultura in vitro a gametofiţilor. Biotehnologie de transfer Un exemplu a fost menţionat la capitolul despre tipurile de transfer de gene procariote la eucariote în scopul obţinerii de specii de plante (bumbac) rezistente la insecte. Primele organisme transgenice prin biotehnologie de transfer s-au obţinut la cereale: la orez în 1988, la porumb în 1990, la grâu în 1992. Spre aceste trei specii de cereale, care reprezintă circa jumătate din necesarul de substrat alimentar pentru alimentaţia populaţiei globului cu proprietăţi cât mai adecvate, prin folosirea tehnologiei genetice. În general se urmăresc obţinerea următoarelor proprietăţi în noile organisme transgenice: ƒ fixarea azotului din atmosferă; ƒ rezistenţa la infecţii virale, bacteriene, vegetale, insecte; ƒ toleranţa la uscăciune, temperatură nefavorabilă, metale grele, concentraţie crescută de Na în sol, ierbicide; ƒ creşterea producţiei de substanţe nutritive, creşterea cantităţii de acizi graşi nesaturaţi; ƒ izolarea din plante a substanţelor cu proprietăţi farmaceutice.

243

Până în prezent au fost obţinute noi soiuri transgenice de roşii, grâu, tutun şi petunii, rezistente la uscăciune, căldură, metale grele, grad înalt de salinitate şi rezistente la insecticide. În anul 1992 erau raportate 40 de soiuri noi de plante transgenice. În timp ce pentru o cultivare de plante clasice sunt necesari zece ani, pentru obţinerea unui nou caracter, în cazul utilizării tehnicilor genetice, acest interval scade la şase ani. În 1994, în SUA a fost proiectată crearea unor soiuri de plante transgenice rezistente la ierbicide, în timp ce buruienile rămân sensibile la ierbicide. Obţinerea de noi soiuri de plante rezistente la infecţiile virale se realizează prin: ƒ integrarea unei părţi din ADN viral în genomul plantei; prin aceasta, exprimarea proteinei de înveliş viral va asigura rezistenţa plantei la respectivul virus; ƒ inhibarea replicării virale prin tehnica antisens (1992). În 1993, în SUA au fost obţinute soiuri de roşii transgenice prin metoda de inhibare cu ARN antisens, care a oprit sinteza enzimei poligalacturonaza, responsabilă de compunerea peretelui celular al tomatei. În aceste condiţii, tomatele pot fi culese când se află la punctul favorabil al coacerii şi se pot păstra şase-opt săptămâni fără a fi puse la rece. În 1995, în SUA se prevedea obţinerea de noi soiuri de plante transgenice rezistente la insecte, care să fie livrate pe piaţă în următorii zece ani. Pentru viitor, trebuie luate în considerare anumite riscuri care apar drept consecinţă a apariţiei unor variante de specii vegetale. Pentru acest motiv oamenii de ştiinţă vor trebui să folosească cu multă grijă şi măsură aceste posibilităţi moderne ale biotehnologiei. Dintre riscurile posibile, se pot enumera: ƒ pierderea diversităţii lumii vegetale, având drept consecinţă dezechilibrul ecosistemelor; ƒ deşteptarea unor gene ancestrale nedorite; ƒ riscul dezvoltării explozive a unor ‘patotipuri’ adaptate în mod special; ƒ restrângerea gamei de calităţi organoleptice naturale ale unor noi sorturi de legume şi fructe; ƒ noi biosinteze, neprevăzute în prezent; ƒ posibilităţi de biosinteze nedorite de acizi graşi, glucozide, alcaloizi, enzime, hormoni (produse vegetale); ƒ dezechilibre nutriţionale. Prevenirea riscurilor menţionate mai sus cere multă prudenţă cât şi anticiparea remediilor posibile înainte de crearea noilor variante. În acest sens se recomandă: ƒ evitarea difuzărilor tipurilor omogene şi uniforme de vegetale pe suprafeţe foarte întinse; ƒ efectuarea detailată a analizelor de structură şi control în faza precoce a noilor variante ale unui sort vegetal; ƒ încheierea de acorduri internaţionale pentru înfiinţarea unei comisii de etică cu posibilităţi de control permanent, etapă de etapă, asupra varietăţilor nou-obţinute. b. La animale S-au obţinut crapi transgenici prin transfer de gene de creştere de la creştere de la păstrăvi; aceste noi organisme transgenice au avut o viteză mult mai mare de creştere decât organismele noi organisme transgenice au avut oviteză mult mai mare de creştere decât organismele normale. La porci au fost transferate gene responsabile de sinteza hormonului de creştere, în vederea obţinerii unor organisme transgenice cu metabolism activat, cu o eficienţă înaltă de utilizare a hranei şi cu o creştere foarte rapidă.

244

11.1.4. Ingineria genetică utilizată în prepararea de noi conservanţi alimentari Nizina, substanţă din categoria lantibioticelor, şi-a găsit o foarte largă aplicabilitate practică în industria alimentară; astfel, în 1989, nizina era utilizată drept conservant alimentar în peste 50 de ţări de pre glob. Nizina este produsă de tulpinile de Lactococcus lactis 6F3, ATTC 11454 GR. 4 Lancefield; în concentraţie mai mică de 30 µl/ml inhibă dezvoltarea diferitelor specii de germeni gram-pozitive , prezentând activitate inhibitorie maximă la un pH mai mic de 5,5. Nizina inhibă de asemenea sporularea la bacterii din genul Clostridium şi Bacillus, dar nu are nici un efect asupra majorităţii bacteriilor gram-negative şi nici asupra fungilor şi levurilor. Din 1951, nizina este folosită în industria alimentară pe scară internaţională, drept conservant natural pentru vegetale, fructe, brânzeturi proaspete şi procesate, carne, peşte, cacao, băuturi alcoolice (vinuri). Această largă utilizare se datoreşte faptului că nizina prezintă marele avantaj de a nu avea efecte nocive asupra organismului viu, în comparaţie cu nitraţii şi nitriţii (folosiţi tot drept conservanţi), care prin producerea de nitrozamine au acţiune carcinogenă asupra organismelor. Pentru produsele în care nu se poate renunţa total la adaosul de nitraţi (nizina fiind ineficientă asupra florei gram-negative), cantitatea de nitraţi poate fi redusă considerabil, prin utilizarea lor asociată cu nizina. Nizina prezintă şi avantajul de a fi hidrolizată complet de către proteazele tractului digestiv uman, neproducând nici o dereglare a florei intestinale gram-negative. Totuşi în prezent se consideră că posibilităţile de utilizare ale nizinei drept conservant alimentar sunt încă limitate din cauza slabei ei solubilităţi şi a stabilităţii scăzute la pH neutru; în prezent ea poate fi utilizată drept conservant activ în alimente cu pH-ul mai mare de 6,5. În perspectiva dezvoltării biotehnologice, se preconizează obţinerea prin procedee de inginerie genetică şi proteică a unor variante de nizină cu spectru larg de activitate, variante ce vor putea fi utilizate drept conservante într-o gamă mult mai largă de produse alimentare, evitându-se astfel nocivitatea altor conservanţi alimentari asupra sănătăţii publice. În ultimii ani, prin studiile de micribiologie au fost identificate tulpini microbiene care printr-un proces de bioconversie microbiană/enzimatică acţionează asupra acizilor graşi (acid linoleic şi linolenic) şi esterilor, ambele clase de substanţe derivate din uleiuri vegetale, ducând în final la obţinerea unor arome naturale (lactone şi metilketone) cu utilizare largă în industria alimentară.

11.1.5. Ingineria genetică şi rezolvarea unor probleme de ecologie Posibilităţile tehnologiei genetice au importanţă nu numai pentru dezvoltarea cercetării fundamentale, a dezvoltării ştiinţelor medicale şi agriculturii, ci şi pentru rezolvarea în viitor a unor probleme ecologice, de exemplu creşterea sintezei unor resurse naturale din mediu. Multe tulpini bacteriene de Pseudomonas putida posedă un plasmid responsabil de descompunerea hidrocarburilor din petrol, aspect ce semnifică posibilitatea unei mai bune utilizări a petrolului brut natural. În acest sens, se încearcă în prezent obţinerea unei bacterii ‘ îmbunătăţite’, al cărei plasmid să crească eficienţa utilizării petrolului brut.

11.2. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne şi perspectivele secolului XXI Progresele recente în cunoaşterea la nivel molecular a interacţiunilor extra- şi intracelulare, mediate de clase specifice de molecule şi semnale au contribuit la construirea unui fundament pentru elaborarea viitoarelor strategii de sinteză a unor noi agenţi terapeutici cu următoarele calităţi: 245

ƒ ƒ ƒ ƒ

eliberarea ţintită (situs-specifică) în circulaţie prelungirea timpului de înjumătăţire efect prelungit la locul de acţiune efecte benefice mărite asupra organismului. În acest sens există deja o metodologie pentru obţinerea unor proteine-himere, cu aplicabilitate practică în domeniul terapiei: A. anticanceroase B. antivirale C. cardiovasculare D. în boli metabolice.

A. Terapia anticanceroasă În prezent, terapia anticanceroasă cu citostatice este nesatisfăcătoare într-un număr mare de cazuri din cauza: ƒ dezvoltării rezistenţei la droguri ƒ efectelor secundare nocive (imunodepresie medulară, toxicitate hepatică şi renală etc.). Ţinând seama de aceste considerente, cercetătorii şi-au propus: ƒ îmbunătăţirea gradului de acţiune selectivă a drogului, înţelegând prin aceasta o acţiune cât mai ţintită asupra celulelor tumorale, bazându-se pe achiziţiile cele mai recente ale biologiei moleculare; ƒ minimalizarea cât mai mult cu putinţă a efectelor toxice secundare ale drogurilor, în cursul distribuţiei acestora în organismul bolnav. Pornindu-se de la aceste elemente, s-a încercat construirea unor noi molecule cu potenţial antiumoral, şi anume: a. Inhibitori ai topoizomerazelor Topoizomerazele sunt enzime destinate a modifica structura spaţială a ADN-ului înainte de replicare, suprimând superrăsucirile dublului helix. b. Molecule active pe tubulină (antimitotice) Au acţiune antimitotică împiedicând diviziunea celulară prin stabilizarea microtubulilor (spre diferenţă de Vinca, alcaloizi care determină depolimerizarea tubulinei). Dintre antimitotice, taxolul a fost testat experimental prin administrare intratumorală în tumori vezicale la şoarece. Acesta s-a dovedit foarte eficace în asociaţie cu alte antimitotice curente, prezentând sinergie cu metotrexatul şi adriamicina. Derivaţii de platină reprezintă astăzi o clasă foarte studiată de antimitotice; dintre acestea, pentru cisplatină şi carboplatină a fost demonstrată eficacitatea clinică. Diaminociclohexanul şi axoliplatina sunt în curs de experimentare şi nu au atins încă faza de testare clinică; sunt platine liposolubile care se pot administra cu ajutorul liposomilor. c. Substanţe antiangiogenice S-a studiat rolul factorului de creştere fibroblastic (bFGF) asupra mecanismelor de angiogeneză (geneza vaselor sanguine) şi consecinţa acesteia asupra metastazării. S-a constatat că acest factor bFGF are o acţiune de stimulare a proliferării celulelor endoteliale de activare a angiogenezei (neoformaţie de vase sanguine). Pentru contracararea acţiunii bFGF, a fost sugerat un mecanism de blocare a receptorilor celulelor endoteliale cu ajutorul unor analogi ai heparinei, peptide antagonice, anticorpi. Pe modele experimentale s-a demonstrat şi eficacitatea ologozaharidelor sulfatate, care, blocând receptorii celulelor endoteliale, opresc fixarea bFGF pe respectivii receptori, împiedicând în consecinţă angiogeneza şi inhibând simultan adenoamele experimentale (de pancreas, sân, prostată) de origine umană.

246

Se pare că aceste substanţe antiangiogenice acţionează prin oprirea dezvoltării de noi vase sanguine şi nu prin distrugerea celor formate; deci opresc neoformaţia şi, în consecinţă. metastazarea. d. Inhibitori de kinaze Sunt inhibitori ai tirozinkinazei proteinkinazelor, tioindolului, inhibă autofosforilarea bFGF (via tirozinfosforilare); prin inhibarea acţiunii bFGF este oprită proliferarea fibroblastelor, fiind astfel inhibată dezvoltarea metastazelor (prin inhibarea neoformaţiei de vase de sanguine). e. Substanţe antisens Studiul acestor substanţe a fost posibil datorită cercetărilor de biologie moleculară; acţiunea lor a fost urmărită până în prezent pe linii celulare, ţintele principale de acţiune a acestor substanţe dovedindu-se a fi: ƒ gena oncogenă c-myc (pentru substanţele AACR 1833, AACR 3154. AACR 3668, AACR 3672, AACR 3679) ƒ proteinele p120 (pentru substanţele AACR 1832, AAXR 3155) ƒ proteinele p53 (pentru substanţele AACR 3630, AACR 3668). În prezent sunt studiate metodele de inoculare cele mai eficiente a acestor substanţe în organismul bolnav, căutându-se a se ameliora penetrabilitatea lor în celule. Pentru a se înţelege mecanismul de acţiune (‘’controlul’’) al ciclului nucleic antisens asupra unui proces de oncogeneză (“expresie oncogenă“), trebuie amintit mai întâi că transformarea celulelor normale în cellule maligne reprezintă un proces în mai multe etape: ƒ activarea protooncogenelor ƒ inactivarea genelor supresoare de tumori ƒ inactivarea genelor de reparare a ADN. Pornind de la aceste aspecte, astăzi sunt urmărite următoarele obiective: ƒ descompunerea unor droguri care să poată inhiba selectiv efectele biologice ale produşilor oncogeni ƒ restabilirea funcţiei factorilor supresori de tumori şi a genelor pentru repararea ADN-ului. Majoritatea drogurilor existente în prezent acţionează la nivelul proteinelor. Chiar şi drogurile anticanceroase care interacţionează cu ADN îşi exercită acţiunea biologică prin inhibarea enzimelor (topoizomeraze) care procesează ADN. Modul cel mai simplu de a corecta activitatea acidului nucleic este cel de a folosi tocmai acid nucleic; pornindu-se de la această idee, s-au preparat fragmente scurte de acid nucleic (oligonucleotide), care să se lege selectiv de o secvenţă complementară a unui acid nucleic unic lanţ (un ARNm sau un ARN viral). Acest oligonucleotid (antisens) blochează, prin legarea lui de ARN-ul ţintă (target), translaţia sau respectiv reverstranscriptaza ARN-ului (viral) ţintă. Oligonucleotidele antisens sunt fosfodiesteri naturali care au diferite mecanisme de acţiune. Oligonucleotidele antisens de tip oligofosfotioaţi se folosesc şi în tratamentul leucemiilor şi al infecţiilor cu HIV. Un oligoribonucleotid (ribozim) ARN se leagă de o secvenţă complementară a ARN ţintă, ca şi oligonucleotidul antisens, dar poate include în plus şi clivajul catalitic al ARN ţintit. f. Strategia “ de sens” cu structuri oligonucleotidice În 1980 a apărut o nouă strategie şi anume cea a antigenelor în care oligonucleotidul are drept “ţintă” un ADN dublu helical, pentru a forma în final un triplu helix la nivelul căruia este blocată transcrierea (ceea ce reprezintă blocarea primei etape a expresiei genelor). Oligonucleotidele pot fi folosite pentru controlul genelor în aşa-numita strategie de sens (sense approach); este vorba de un oligonucleotid “capcană”, folosit pentru a prinde “în cursă” un factor de transcriere (de expresie) care duce în final la alterarea expresiei tuturor genelor de pe respectivul fragment ADN. Rezultă că în comparaţie cu strategiile “antisens” (tip ribozim), strategia de sens este mai piţin selectivă. Totuşi oligonucleotidele “capcană” pot 247

fi utilizate pentru a prinde “în cursă” exprimarea unui număr de gene din genomul unui virus sau al unui parazit. Efectul acestor oligonucleotide de strategie de se3ns poate fi deci selectiv pe un virus sau parazit. g. Strategia aptamer Recent a fost elaborat un nou mod de utilizare a acestor oligonucleotide, pe baza legărilor lor de o proteină a cărei funcţie normală nu implică creo interacţiune cu acidul nucleic; este vorba de strategia aptamer. În cadrul acestei strategii, se folosesc oligonucleotidele cu rol de liganzi pentru enzime, receptori, factori de creştere. h. Utilizarea anticorpilor monoclonali Dezvoltarea intensivă a noilor concepte molecular-biologice din imunologia ultimilor 20 de ani a deschis noi perspective în terapia cancerului. Una din problemele dezbătute în prezent în această direcţie este obţinerea unor proteine de fuziune cu anticorpii monoclonali recombinaţi, în scopul utilizării acestor noi preparate în imunoterapia cancerului. i. Proteine de fuziune (anticorpi monoclonali - interleukina IL2) Aceste proteine de fuziune au fost realizate prin tehnici de inginerie genetică. Anticorpii monoclonali antitumorali (cu specificitate unică), care, în condiţii de recombinare, poartă fixate pe molecula lor citokine, direcţionează aceste citokine atunci când sunt introduşi în organismul bolnav către situs-urile celulelor tumorale corespunzătoare. Aceste proteine de fuziune (anticorpi-IL2) sunt injectate în organismul bolnav. Construirea acestei proteine fuzionate recombinate se face în scopul obţinerii unei eficienţe biologice optime, prin combinarea capacităţii de ţintire unică a anticorpilor monoclonali cu activităţile multifuncţionale ale citokinelor. j. Terapie genetică cu gene codificatoare pentru citokine S-a pornit de la observaţia că citokinele reglează reactivitatea imunologică, maturaţia, activitatea şi migrarea celulelor inflamatoare. Observaţiile efectuate pe animale de experienţă au arătat că “o provizie locală” formată din diferite tipuri de citokine infuzate direct, sau obţinută în urma unei terapii genice cu gene (sintetizatoare) de citokine, poate induce o imunitate antitumorală puternică de lungă durată şi ocazional, poate determina chiar şi îndepărtarea unei tumori preexistente. În 1995, literatura de specialitate semnala existenţa a 19 cazuri clinice la om, supuse tratamentului cu citokine. Principiul acestei terapii constă în implatarea în organismul bolnav a unor celule somatice (limfocite) modificate din punct de vedere genetic (limfocite pe care sau transferat în prealabil gene codificatoare de citokine); aceste celule limfocitare vor fi foarte bune vehicule în organismul bolnav datorită capacităţii lor de a prolifera, ca răspuns la administrarea de interleukina 2 (IL2) sau antigen, cât şi datorită faptului de a putea migra şi răspândi în tot organismul. Schmidt-Wolf şi colab. (1995) au propus un protocol de terapie genică bazat pe utilizarea celulelor CIK (celule killer transfectate cu gena IL7) pentru inducere de citokine IL7. Aceste celule CIK s-au dovedit a fi celule efectoare citotoxice foarte eficiente, cu efect antitumoral mult mai înalt decât cel al celulelor LAK (celule killer activate de limfokine standard). B. Terapie antivirală Terapie anti-HIV La începutul anilor 1980 exista în întreaga lume opinia că datorită antibioticelor şi vaccinurilor va fi rezolvată problema infecţiilor bacteriene şi virale, deoarece aceste preparate terapeutice reuşiseră mai mult sau mai puţin să ducă la dispariţia acestor infecţii de pe glob. Dar în 1981 apărea virusul HIV (Human Immunodeficiency Virus), care se dovedeşte foarte 248

curând a declanşa mari epidemii SIDA (Syndrome d’Immuno-Deficience Acquise) pe glob, creând o panică tot atât de gravă ca şi cea determinată de ciuma bubonică din Europa secolului al XIV-lea. În decembrie 1994, datele OMS estimau în lume: ƒ 4,5 milioane cazuri de boală SIDA declanşată, din care doar 1025073 cazuri înregistrate; ƒ 17 milioane de persoane infectate (purtătoare de virus) HIV, din care un milion de copii. În România s-au înregistrat între 1985-1994, 3119 cazuri de boală SIDA, dintre care 2885 la copii şi 234 la adulţi. La sfârşitul anului 1999, Programul UNAIDS şi al OMS-ului raporta 50 de milioane de persoane infectate cu HIV de la declanşarea epidemiei de SIDA, din care 16 milioane au decedat din cauza bolii. În 1999, numărul cazurilor noi de persoane infectate a fost de 5,6 milioane iar decesele au atins cifra record de 2,6 milioane de persoane pe glob. În România, la 30 septembrie 1999 se înregistrau 10000 de persoane infectate cu HIV, dintre care 6000 deja bolnave. Trebuie remarcată diferenţa între infecţie şi boală; o persoană poate fi infectată cu virus HIV fără a fi încă bolnavă. Infecţia înseamnă că virusul HIV, prezintă în organism dar ascuns în nucleul celulelor limfocitare, se află în “stare dormindă” timp de luni de zile până la 5-20 de ani; persoana este sero-pozitivă, dar nu este încă bolnavă. Boala reprezintă starea organismului în momentul în care virusul HIV din “stare dormindă” se trezeşte, se multiplică, invadează organismul, devenind deci agresiv, având drept consecinţă apariţia simptomelor de boală. Astăzi infevţia HIV reprezintă o criză majoră de sănătate publică. Conform rapoartelor OMS, pentru anul 2000 se prevăd pe Terra 30 de milioane de purtători HIV. Până în prezent oamenii de ştiinţă nu au reuşit să prepare încă un vaccin pentru această infecţie, din cauza marii variabilităţi a virusului HIV. Această mare variaţie genetică a virusului a constituit obstacolul major în prepararea unui vaccin HIV. Pentru a se prepara substanţe terapeutice cu acţiune antivirală au fost necesare întâi studii de biologie moleculară în vederea determinării structurii virusului HIV şi a ciclului de viaţă al acestuia. Virusul HIV face parte din categoria virusurilor ARN (retrovirusuri) care prezintă un aspect particular de multiplicare. Studiile molecular-biologice au demonstrat că ciclul de viaţă a HIV în organismul uman cuprinde3 trei etape: I.- ARN viral se transcrie în ADN în prezenţa enzimei virale revers transcriptaza; acest aspect reprezintă particularitatea multiplicării acestui virus, şi anume curgerea inversă a informaţiei genetice din direcţia ARN→ADN II. - Acest ADN viral (copie după ARN) se integrează în genomul celulei gazdă sub influenţa enzimei virale integraza;urmează starea dormindă a virusului. III. - Etapa de transcriere: după tiparul (pattern-ul) ADN viral integrat, se resintetizează ARN viral şi proteina virală corespunzătoare, dar această proteină primară nou-sintetizată are lanţuri foarte lungi şi este inactivă. Pentru a deveni activă, această proteină foarte lungă trebuie secţionată (procesată) de nişte enzime virale numite proteaze. Prezenţa acestor proteine scurte şi active, cât şi cea a respectivului ARN viral nou format vor duce la formarea virusului matur care va fi capabil să invadeze alte celule. Substanţele anti-HIV utilizate până în prezent, de tipul zidovudinului (analogi nucleozidici) şi derivaţi (dideoxiinozin, dideoxicitidin),acţionează la nivelul etapei I, fiind inhibitoare ale reverstranscriptazei şi împiedicând astfel conservarea virusului în copii, în stare dormindă şi integrată în nucleul celulelor, virusul ARN dispărând prin imposibilitatea multiplicării sale. Dar aceste substanţe terapeutice s-au dovedit a avea efecte toxice foarte puternice, în special la nivelul sistemului nervos central (SNC). De asemenea, aceste substanţe au determinat şi dezvoltarea rezistenţei virusului HIV la drog.

249

În prezent se experimentează o substanţă cu acţiune anti-HIV la nivelul etapei a III-a de dezvoltare a virusului, şi anume o substanţă care să inhibe proteazele virale, împiedicând tăierea lanţurilor lungi de proteine inactive. În aceste condiţii, proteina rămânând sub formă de lanţ lung şi inactivă, virusul matur nu se mai poate forma, dispărând deci posibilitatea de invadare de către virus a altor celule ale organismului. În 1997 trei companii mari farmaceutice lucrau la obţinerea unei asemenea substanţe de tip inhibitori ai proteazei virusului HIV, şi anume: ƒ firma Merck, Sharp & Dohme - substanţă cod 693541 ƒ firma Hoffmann-LaRoche - substanţă cod Ro-31-8959 ƒ firma Abbott - substanţă cod A-77003 Substratul de preparare a substanţei active părea a fi un material biologic, dar firmele păstrau secretul de fabricaţie. Rămân încă de rezolvat probleme legate de: - acţiunile secundare farmacokinetice (toxice); - dezvoltarea rezistenţei la drog; - eficacitatea substanţei prin administrare per os . C. Terapie ţintită cardiovasculară Se referă la tratamentul cu anticorpi monoclonali antitrombocite umane în cazul infarctelor, în scopul unei trombolize rapide şi al prevenirii reocluziei. S-au preparat anticorpi monoclonali (anti Mo-1) fată de receptorul de adeziune al trombocitelor. Studii in vitro pe câine au demonstrat capacitatea acestor anticorpi de a reduce leziunile ischemice miocardice postinfarct cu 46% în comparaţie cu animalul martor. Reducerea zonei de infarct s-a dovedit a fi independentă de severitatea ischimei. S-a observat, de asemenea, o îmbunătăţire a recanalizării arteriale coronariene, prin injectarea de anticorpi monoclonali antireceptor trombocite umane (gpIIb şi gpIIIa) şi activarea reocluziei vasculare. Metoda Anderson pentru liza trombilor vasculari se bazează pe receptorii gpIIb şi gpIIIa, sintetizaţi de gene din familia genelor “integrine”; aceşti receptori mediază mecanismele de adeziune (fixare) de fibrinogen, fibronectina, vitronectina, factor Wilabrand, trombospondin. În cazul implantelor vasculare se preconizează învelirea acestor receptori în strat de celule injectate cu o genă sintetizatoare de un factor litic care, prin liza cheagului sanguin, să prevină apariţia trombilor vasculari. D. Terapie în boli metabolice Prepararea de liganzi proteici tip lipoproteine Apolipoproteinelesunt proteine care datorită structurilor lor helicale amfipatice leagă lipide. Ele reprezintă liganzi pentru receptori specifici. Apolipoproteinele de densitate înaltă (HDL), prin legarea lor de o mare varietate de celule (macrofage, hepatocite) şi ţesuturi, joacă un rol esenţial în transportul şi reglarea metabolismului colesterolului. Se preconizează utilizarea lor în tratamentul hipercolesterolemiei familiale. E. Vaccinuri recombinate În pragul mileniului al treilea, cercetările sunt aproape gata să introducă în practica medicală tehnologia unei noi vaccinări, cea a imunizării directe cu ADN; ar fi al cincilea tip de vaccinare cunoscut în istoria medicinii după: vaccinurile vii atenuate, cele cu agenţi microbieni omorâţi, cu componente purificate şi cele obţinute prin inginerie genetică. În cadrul tehnologiei vaccinurilor ADN, ADN-ul care codifică o proteină specifică este cuplat cu elementele genetice de control pentru a se obţine plasmide care se vor replica atunci când vor fi introduse în bacterii corespunzătoare. Creşterea bacteriilor va duce la producerea unui număr mare de copii plasmidice din care se separă ADN-ul imunizat pentru a fi folosit apoi drept vaccin.

250

În prezent se încearcă prepararea unor asemenea vaccinuri pentru administrare nazală sau per os, luându-se în considerare faptul că acest tip de vaccin este mult mai sigur, mai puţin costisitor şi mai uşor de administrat decât vaccinurile convenţionale. Se preconizează că acest tip nou de vaccin va avea o eficienţă enormă asupra bolilor infecţioase care astăzi dau încă o rată foarte înaltă de mortalitate, în bolile emergente, bolile reemergente, cât şi în cazurile de rezistenţă la chimioterapice. Prin vaccinarea cu ADN existând posibilitatea de a vaccina pentru un număr mare mai mare de proteine specifice deodată, această vaccinare apare ca o terapie “multidrog”. Vaccinurile ADN stimulează atât imunitatea umorală cât şi cea celulară ; potenţialul acestor vaccinuri de a stimula capacitatea citolitică a celulelor T reprezintă un punct de răscruce în vaccinologie. S-a demonstrat că aceste vaccinuri ADN induc celulele T de tip T1 helper cu efect împotriva virusului HIV. Aceste vaccinuri produc un răspuns imun persistent, ca şi vaccinurile cu virusuri atenuate, dar fără a exista pericolul recâştigării virulenţei de către virusul vaccinant. Toate aceste vaccinuri ADN se prepară după acelaşi principiu al plasmidelor, nefiind necesară de fiecare dată inventarierea unei noi tehnologii, în funcţie de fiecare agent infecţios. Aceste vaccinuri sunt foarte stabile atât la temperatură scăzută cât şi foarte ridicată, motiv pentru care se pot transporta la temperatura mediului ambiant fără a fi necesară refrigerarea. F. Acţiunea de depoluare a ecosistemelor În condiţiile creşterii populaţiei globului, a urbanizării şi industrializării, consecutiv cu lipsa unei educaţii ecologice elementare a populaţiei, necesară pentru conservarea mediului înconjurător, în ultimii 30 de ani s-a ajuns la un dezechilibru ecologic major care astăzi ameninţă viaţa pe Terra (defrişări masive, deşertificări întinse, grad foarte ridicat de poluare a râurilor, fluviilor, distrugerea florei şi faunei marine etc.). În aceste condiţii , astăzi oamenii de ştiinţă pun tot mai acut problema refacerii cadrului natural şi a reciclării deşeurilor poluante. În acest context, cercetătorii încearcă să folosească agenţii microbieni (bacterii) în acţiunea de reducere a poluării solului (pentru dezintegrarea gunoiului şi a deşeurilor domestice, municipale, industriale) cât ţi a contaminanţilor din mediul extern. Astfel, după îndepărtarea prealabilă a conţinutului toxic de metale grele (Cd, Zn, Cu) din gunoaiele menajere, se trece la prelucrarea reziduurilor organice în vederea obţinerii unei producţii eficiente de compost care să aibă calităţi foarte apropiate de îngrăşământul natural pentru agricultură. Acest nou compost îmbunătăţeşte structura solului iar prin conţinutul său în microorganisme (care au capacitatea de a inhiba dezvoltarea unei flore microbiene fitopatogene de sol) contribuie la îmbunătăţirea calităţii plantelor şi a recoltelor. Pe viitor vor continua investigaţiile în vederea detectării unor microorganisme cu potenţial de degradare şi transformare a poluanţilor din diferite deşeuri materiale. În vederea progresului rapid în această direcţie se urmăreşte crearea şi aplicarea unei „tehnologii sensor” care să cuantifice activitatea fiziologică şi biochimică a microorganismelor.

251

Capitolul 12 METODE ŞI TEHNICI MODERNE MOLECULAR - BIOLOGICE ŞI APLICAŢIILE LOR 12. 1. RECOMBINAREA ADN - ului Teoria stabilitaţii genomului celular a fost zdruciunatǎ în anul 1951, odatǎ cu descoperirea elementelor transpozabile. Fenomenul destabilizării genomului celular a rǎmas inexplicabil până în momentul în care a fost posibil studiul moleculei de ADN. Concentrarea studiilor asupra ADN a fǎcut posibilǎ injectarea genelor cu ajutorul virusurilor vectoare in celule, deschizînd perspectivele noii terapii cu gene (terapie geneticǎ = Gene Targeting). Respectivele virusuri (vectoare de gene) cu aspect de ,,ace” sînt introduse ţintit prin ,,împuşcare” (shotgun) într-un numǎr foarte mare de ,,ţinte celulare”, care includ linii foarte variate de organisme; Aceastǎ metodǎ a dus la o revoluţie tehnico-ştiinţificǎ a cǎrei consecinţǎ a fost construirea de noi genotopuri, la toate tipurile de bacterii, plante, animale. Faptul cǎ informaţia geneticǎ a organismelor vii se gǎseşte acumulatǎ pe helixul ADN, iar acest material genetic poate fi izolat iar cele douǎ lanţuri ale dublului helix ADN separate şi apoi fiecare din cele douǎ lanţuri recombinate cu un alt lanţ de ADN străin complementar, dǎ posibilitatea creǎrii de noi organisme, atît în condiţii naturale,cât şi laborator. Procese naturale de recombinare ADN (recombinare genetică) Joacă un rol foarte important în natură, reprezentând un factor evolutiv; existenţa acestor procese se explică apariţia unor noi specii. Procese artificiale de recombinare ADN (tehnologia ADN-ului recombinat) Se realizează în condiţii de laborator, în vederea obţinerii de noi variante de microorganisme şi plante, printr-un număr de metode ce formează tehnologia genetică, cunoscute la nivel internaţional sub numele de Genetic Engineering. Descrierea compoziţiei şi structurii spaţiale a ADN de către J. D. Watson şi Fr. Crick din anii 1953 au reprezentat cunoştinţele fundamentale care au stat ulterior la baza noilor direcţii de cercetare, şi anume a tehnologiei genetice. Prima reuşită de recombinare a fost realizată în SUA în 1970. Aceste tehnici încearcă pe cale artificială combinatrea informaţiei genetice (a genelor) de la două organisme diferite, în vederea creării unui organism nou cu proprietaţi prestabile (ţintite); organismele rezultate sunt organismele recombinate care formează astăzi obiectul unor studii cu implicaţii deosebite în dezvoltarea ştiinţifică şi economică pe scară internaţională, cu mari perspective de viitor. Aceste tehnici de recombinare genetică stau la baza cercetărilor fundamentale şi aplicare în biologia moleculară, farmacologie şi în medicina viitorului, în scopul ameliorării diagnosticului şi terapiei medicale într-un număr mare de boli. Aceste tehnici vor avea implicatii majore şi în dezvoltarea agriculturii, în ceea ce priveşte crearea unur specii noi de plante cu o mare eficienţă economică.

12.1.1. Principiul recombinării Un proces natural de recombinare genetică există la organismele eucariote (cu set diploid de cromozomi) în cursul meiozei (diviziune reducţională). Meioza are loc în celulele germinale şi duce la reducerea setului dublu de cromozomi (set diploid) în set haploid (simplu). În prima fază se produce un schimb de fragmente cromatidiene între cromozomi omologi (M/P=materni/paterni) alăturaţi printr-un fenomen de ,,crossing-over”, ceea ce reprezintă un fenomen de recombinare genetică. 252

Într-un organism diploid cu un anumit număr de perechi de cromozomi omologi şi o singură pereche de cromozomi sexuali, fiecare cromozom în interfază apare format din cîte două cromatide (iar fiecare cromatiodă la rîndul ei dintr-o moleculă de ADN dublu helix). Prin încrucişarea cromatidelor (crossing-over) pe locul de încrucişare, lanţurile duble ADN ale celor două cromatide vor fi tăiate, vor interschimba fragmente de ADN, iar apoi capetele tăiate se vor lega altfel, rezultând cromatide recombinate (molecule ADN recombinate). La cromozomii umani există în medie două-trei asemenea fenomene de crossing-over şi interschimburi de fragmente ADN pe ambele cromatide ale unui cromozom. Aceste procese se produc atît de exact, încît nu se pierde nici un nucleoid. După interschimburile între cromatidele cromozomilor omologi se produce separarea acestor cromozomi cu cromatidele interschimbate şi împarţirea lor între cele două celule fiice. În faza a II-a a meiozei urmează separarea cromatidelor în patru celule germinative mature. Aceste patru celule pot conţine: ƒ c1 = numai material matern ƒ c2 = numai material patern ƒ c2 şi c3 = material cromatidian recombinat (rezultat din fenomenul de crossing-over) matern şi patern.

12.1.2. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering) Cu ani în urmă era posibilă doar cercetarea indirectă a ADN-ului asupra produselor ARN şi proteice, sau analiza genetică foarte laborioasă asupra funcţiei genelor prin cercetarea aspectelor fenotipice ale organismelor mutante şi ale progeniturii acestora. Tehnologia ADNului recombinat, care a apărut în jurul anilor ’70, a revoluţionat biochimia, oferind posibilitaţile cele mai eficiente pentru analizarea şi modificarea genelor (ADN) şi proteinelor din organismele vii. Pe baza acestei tehnologii, astăzi poate fi modificat într-un mod dinainte stabilit şi ţintit bagajul genetic al organismelor. Tehnicile de recombinare ADN stau la baza progreselor biotehnologiei moderne, aceste tehnici vizînd direct informaţia genetică a organismelor, utilizarea acestor metode putînd duce în viitor la înfrângerea barierei între specii. Prin procedeele de inginerie genetică se poate obţine, prin introducerea unei informaţii genetice într-un organism, un organism cu priorietăţi noi (de exemplu, obţinerea de noi soiuri de plante cu rezistenţă crescută şi agenţi dăunători). Tehnologia ADN recombinant presupune următoarele etape: ƒ tăierea lanţurilor duble ADN în fragmente specifice, prin acţiunea enzimelor de restricţie, astfel încât să fie obţinute în final fragmente ADN de lanţ unic; pe această cale, moleculele ADN cu greutate moleculară înalta sînt tăiate în molecule cu greutate moleculară mult mai mică. Concomitent cu ADN-ul de cercetat, vectorul (virusul) este supus şi el acţiunii aceloraşi enzime de restricţie, pentru că, în final, pe ambele lanţuri de acid nucleic (lanţ unic de cercetat şi lanţ unic al vectorului), să se obţină acelaşi tip de capete adezive: ƒ fragmentul de acid nucleic de cercetat, cît şi cel al vectorului se leagă covalent (în cursul unui process de circularizare) în prezenţa ADN-ligazelor ƒ introducerea, o data cu vectorul, a respectivului fragment de ADN selecţionat şi fixat pe vector în celula gazdă (celula bacteriană avirulentă de Esch. coli K12) ƒ multiplicarea sincronă, o data cu celula gazdă, a vectorului şi a fragmentului ADN străin încorparat în genomul celulei gazdă. Apar în consecinţă un număr mare de celule purtătoare de copii identice de ADN recombinat. Acest process poartă numele de clonare. În cadrul acestui proces, celula bacteriană astfel ,,nou construită” (cu ADN recombinat) ƒ reprezintă celula cap de colonă. Construirea unui genom nou prin introducerea unei secvenţe ADN străine în genomul unei celule gazdă (de exemplu, bacteria, organisme multicelulare) reprezintă de fapt tehnica de inginerie genetică prin care se obţin genomuri modificate ce pot fi ulterior exprimate 253

(transcrise şi translaţionate) de către celula gazdă, prin sinteza de noi proteine (caractere noi cîştigate de celula gazdă). Termenul Genetic Engineering este adesea folosit drept similar celui de recombinare ADN, din care rezultă un nou genom (prin introducerea, în genomul unei celule, a unei secvenţe străine de ADN cu autorul vectorului), celula respectivă cîştigă caractere noi. Prin aceste metode genetice pot fi manipulate, modificate şi interschimbate sau nou recombinate atît secvenţele codificatoare, cît şi secvenţele de control ale unei gene. Este posibil să se facă noi combinaţii pentru secvenţele de control ale unei gene şi să se determine în acest fel exprimarea unei gene dorite, intr-o anumită celulă. Astfel, prin alegerea unei anumite secvenţe de control, se poate reuşi exprimarea practice permanentă a unei gene altminteri slab activă; în acest context proteinele, care în cantităţi mari în calula nou construită. Pentru creşterea acestei cantităţi de proteine se utilizează de regulă fragmente de ADNc (secvenţe codificatoare fără introni). Dacă se urmăreşte introducerea şi exprimarea unor gene eucariote în bacterii şi drojdii, se folosesc tot fragmente ADNc deoarece aceste microorganisme nu sînt capabile să îndepărteze prin fenomene de splicing din ARNm transcris secvenţele de introni. Etapele metodei de inginerie genetică utilizată în vederea obţinerii unei anumite proteine în cantitate mare sînt următoarele: ƒ se porneşte de la matricea ADN; ƒ se obţine o copie de ADNc (în prezenţa reverstranscriptazei); ƒ se obţine un lanţ dublu ADN; ƒ respectivul lanţ dublu ADN este clonat; ƒ fragmentul ADNc clonat este înglobat în vectorul de exprimare; ƒ fragmentul ADNc înglobat în vector este introdus în celula receptor o dată cu vectorul; ƒ în celula receptor se produce transcrierea şi translaţia fragmentului ADNc strain (introdus), obţinându-se în final sinteza proteinei dorite. Folosind această metodă s-a reuşit ca celulele bacteriene, drojdiile şi celulele de memifere să fie aduse în starea de a produce cantităţi mari de anumite proteine ţintă. În acest fel devine posibilă analiza proteinelor celulare, care, în mod normal se găsesc în organism în cantităţi foarte mici (doar urme) şi ar scăpa astfel cercetării. Proteinele sintetizate prin această metodă şi-au găsit utilizare în terapie şi profilaxie. Pornindu-se de la aflarea expresiei anumitor gene s-a putut ajunge la descifrarea funcţiei unor proteine cu rol în procesele şi diviziune celulară, prin aceasta creîndu-se bazele pentru cercetarea şi găsirea cauzelor unor boli genetice.

12.1.3. Elemente de lucru utilizate în tehnologia ADN recombinat -

Aceste elemente de lucru sunt reprezentate de: enzimele de restricţie; ADN-ligazele; vectorii.

12.1. 3. 1. Enzimele de restricţie Sunt endonucleaze de origine bacteriană; ele clivează moleculele de ADN strain (de exemplu, ADN viral pătruns în respectica celulă bacteriană) fără a cliva însă ADN-ul bacterian propriu, deoarece ADN-ul bacterian poartă un semn de recunoaştere (un password ) care este reprezentat de nişte situs-uri specifice metilate. Metilarea reprezintă un mecanism de apărare al celulei bacteriene faţă de propriile endonucleaze; într-o celulă bacteriană, un dublu helix ADN nou-sintetizat şi metilat numai pe un lanţ este recunoscut ca propriu de către celula bacteriană, nefiind digerat de endonucleaze, iar în timp metilaze converteşte treptat ADNhemimetilat în total metilat. Metilazele recunosc pe lanţul ADN bacterian aceleaşi secvenţe ca şi endonucleazele. Nucleazele bacteriene se clasifică în: 254

ƒ ƒ

exonuleaze care se fixează pe molecula de ADN numai la capătul ei; endonucleaze care nu se fixează la extermităţile moleculei ADN, ci se fixează în interiorul moleculei de ADN, unde produc ruptura (tăierea). În această categorie se încadrează şi endonucleazele de restricţie. Endonucleazele de restricţie au acţiuni secvenţial-specifică; se fixează pe o anumită secvenţă nucleotidică, despicând-o (clivare prin hidroloza legăturii fosfodiesterice) îndepărtând astfel respectivul segment dublu de ADN. Secvenţele de baze recunoscute de către aceste enzime sînt palindromice (aceleaşi, dar poziţionate în sens invers pe cele două fire ale dublului helix ADN), fiind citite de aceste enzime la fel pe cele două lanţuri şi rezultând un clivaj poziţionat simetric pe ambele lanţuri. Aceste endonucleaze se găsesc în număr mare la procariote. S-au descris enzimele de restricţie I, II şi III, dintre care: ƒ enzimele I şi II recunosc secvenţele specifice şi se fixează pe acestea cu următoarele particularitaţi: ƒ enzimele I taie nespecific 100-1000 de perechi de baze, în afara regiunii specifice în direcţia 5’ Æ 3’ pe lanţul ADN; ƒ enzimele II au locul recunoaştere, fixare şi tăiere (4-6 nucleoide) de obicei constant deci au specificitate de secvenţă absolută, motiv pentru care sînt preferate în studiile de recombinare ADN; ƒ enzimele III taie nespecific 20-30 de perechi de bază în direcţia 5’ Æ 3’ pe lanţul ADN. Endonuleozele de restricţie sunt denumite după microorganismele din care se izolează: ƒ enzime I Eco K şi B (izolate din E. coli); ƒ enzime II Eci RI (izolate din E. coli); pot recunoaşte situs-urile ţintă ale ADN ului palindronic, dar în prealabil trebuie să fie rupte perechile de baze care ţin unite cele două lanţuri complementare ADN ƒ Bam HI (izolate din Bacillus amilolichefaciens) ƒ Hpa I (izolate din Haemophilus parainfluenzae) ƒ Hin + III (izolate din Haemophilus influenzae) Enzima II au fost supranumite şi, foarfeci moleculari”; ele recunosc o secvenţă de 4-6 nucleotide şi pot tăia cele două lanţuri ale helixului ADN, în mod: simetric, rezultând capete drepte; asimetric, rezultând capete coezive. Până în prezent s-au purificat peste 90 de enzime de restricţie. Un segment de ADN obţinut prin acţiunea unei enzime de restricţie poate fi clivat main departe în segmente mai mici de către alte enzime de restricţie. Structurile acestor fragmente finale pot servi drept, amprente” (fingerprints) ale unei molecule de ADN. Cromozomii complecşi care conţin sute de milioane de bace pot fi astfel secţionaţi şi apoi cartaţi stabilindu-li-se harta genelor, prin folosirea enzimelor de restricţie. Prin enzimele de restricţie s-a descris şi un grup special de enzime care au fost numite izoschizomeri; acestea recunosc aceleaşi secvenţe nucleotidice, deşi fiecare taie asemenea secvenţe localizate, însă în poziţii diferite pe respectivul lanţ ADN. Descrierea enzimelor endonucleaze de restricţie a făcut posibilă revoluţia ştiinţifică biologică şi dezvoltarea tehnologiei ADN recombinat (modificări ţintite în structiura genelor şi proteinelor şi analiza acestora bazată pe enzimologia acizilor nucleici). 12.1. 3. 2. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele) ADN-ligazele nu pot lega două lanţuri unice de ADN, ci doar două lanţuri ADN ce aparţin aceleiaşi molecule ADN duble helix. Aceste enzime catalizează formarea unei legături fosfodiesterice între gruparea 3’-OH a unei extermităţi a unui lanţ ADN şi gruparea 5’-fosfat de la extermitatea celuilalt lanţ. Procesul de legare (linkare) mediat de ADN-ligaze este esenţial pentru sinteza normală a ADN, procesul de reparare a ADN, procesul de recombinare genetică..

255

12.1.3.3. Vectorii Se deosebesc două categorii majore de vectori: A. Vectori de expresie; B. Vectorispeciali. Vectorii de expresie Vectorii folosiţi pentru sinteza unor cantităţi mari de proteine: - plasmide: factorul F, factorul R, factorul Col; - bacteriofagi: fagul λ; φ80; fagul µ - cosmide (fragmente de φ* λ+ plasmid ) - fragemide (φ+plasmid) - secvenţe de inserţie (SI) 0,8-1,4 kb. Vectori de transcriere (pentru sinteza ARN): - plasmid + φ promotor (SP6) - plasmid +2 φ promotori (SP6 ş T7) Vectori speciali: - retrovirusuri - retrovirus+plasmid Ti A. Vectori de expresie a1). Vectori folosiţi pentru sinteza unor cantitaţi mari de proteine. Plasmidele Reprezintă o clasă majoră de elemente genetice mobile. Sunt prezente atît celulele procariote (bacterii), cît şi la eucariote. La procariote sunt molecule de ADN dublu helix circular din dimensiuni de la două la cîteva sute de kilobaze; reprezintă material genetic extracromozomial (cromozomi accesorii). Spre diferenţă de ADN-ul cromozomial, esenţial pentru supravieţuirea celulei, ADN-ul extracromozomial poate disparea la un moment dat din celulă, fără ca absenţa acestuia să afecteze viaţa celulara. În unele celule pot exista simultan 1*20 copii ale unei plasmide. În celula bacteriană, genomul celular este reprezentat de materialul genetic cromozomial genetic cromozomial şi extracromozomial (inconstant). Greutatea moleculară a unui plasmid variază între 1,5-200 x 10 6 daltoni (5% din greutatea cromozomială). Un plasmid este constituit dintr-un segment format din una sau mai multe gene, care imprimă o proprietate sau mai multe proprietăţi celulei bacteriene (de exemplu, rezistenţă sau multirezistenţă la antibiotice);un segment care asigură transferul plasmidic de la o celulă la alta (factor de transfer). În 1976, plasmidele erau definite de Novick drept ,,repliconi stabili moşteniţi în stare extracromozomială, capabili a se replica independent de cromozom”. În 1981, Dhillon şi Colob. propun pentru plasmide termenul de ,,repliconi accesori” (neesenţiali), dar astăzi se ştie că aceşti repliconi joacă un rol important în procesele de selecţie şi de adaptare a celulelor bacteriene, ca răspuns la modificarile din mediul extern. Plasmidele s-au dovedit a fi unelte foarte valoroase în cercetarile efectuate în scopul aprofundării unor procese fundamentale de biologie moleculară (replicarea ADN, incompatibilitatea). Astăzi plasmidele sunt considerate ,,entităţi fundamentale ale celulei bacteriene”, reprezentînd o parte vitală a pool-ului de gene, determinînd potenţialul de adaptare al celulei gazdă la condiţiile de mediu. Prin cîştigarea plasmidelor, celulele bacteriene au fost înzestrate cu noi căi enzimatice în cursul evoluţiei. Zestrea plasmidică este un atribut de tulpină (şi nu de specie).

256

Plasmidele pot fi: ƒ neintegrate, libere în citoplasma celulei. Se mai numesc şi autonome (de exemplu, factorii de bacteriocinogenie ColE1 Æ colE8, Col I, Col V). aceste plasmide de replica autonom, asincron şi mai frecvent decît ADN-ul cromozomial; în acest caz există 10-20 de copii per celulă; ƒ integrate (epizomi), inserate în cromozomul bacterian (de exemplu, factori de bacteriocinogenie pentru sinteza piocinelor). De replica concomitent cu ADN cromozomial şi există în una-două copii per celulă. În 1972, Clowes delimita două grupe majore de gene plasmidice (plasmid-borngenes): ƒ agregate, exclusiv de origine extracromozomială; au potenţial de răspândire foarte larg a anumitor caractere printe bacterii; s-au dezvoltat primele, din ele derivînd apoi cointegratele. Sînt sisteme economice pentru conservarea anumitor mesaje genetice care se transmit masei de celule dar în caz de nevoie, în cursul procesului de adaptare la noi condiţii de mediu. Una sau mai multe plasmide (neconjugative, de exemplu factorul Col) se transmit 100% de la o celulă la alta cu ajutorul factorul F (plasmid conjugativ); în cazul tratamentului celulei receptor cu un factor curing (acridin oranj etc.) se pierde doar factorul F, dar rămân factorii Col (linkaj reversibil). ƒ cointegrate reprezintă elemente genetice compuse din doi sau mai mulţi repliconi aşezaţi într-o continuitate liniară, în care fiecare replicon îşi păstrează independenţa fizică a replicării deoarece fiecare replicon are propriul său replicator (de exemplu, cointegratul F. ColV. ColB. trp.cys.) Cointegratele sunt sisteme funcţionale mai eficiente decît cele ale agregatelor din punct de vedere al transferului şi stabilităţii caracterelor linkate. În raport cu caracterele fenotipice exprimate, se cunosc pînă în prezent următoarele tipuri de plasmide: ƒ de rezistenţă la agenţii microbieni; ƒ de rezistenţă la raze u.v. (codifică enzime care intervin în mecanismele de reparare a ADN celular); ƒ pentru sinteza bacteriocinelor; ƒ pentru sinteza agenţilor antitumorali: de exemplu, agrocina 84 (sintetizată de tulpina bacteriană de Agrobacterium radiobacter) cu acţiune bactericidă asupra bacteriei abrobacter tumefaciens (agent de colonizare, adeziune, hemolizine, enterotoxine, factori chelatori de ioni de fier); ƒ codificatoare de enzime ale unor căi metabolice, fixate de azot (de exemplu, la tulpini de Klebsiella), degradarea camforului, toluenului (tulpina de Pseudomonas); ƒ plasmide ,,criptice” ale unor caractere somatice (nu au putut fi încă indetinficate). Factorul F Este plasmidul care induce conjugarea la bacterii. Acest fenomen presupune un transfer de material genetic de la celula donoare, la celula receptoare, prin intermediul factorului F (factor plasmidic-vector), numit şi factor de fertilitate. Celula donoare conţine factorul F liber în citoplasmă este notată F+, sau inclus în cromozomi (Hfr); celula receptoare (F-) este celula care primeşte factorul F. Reiese de aici că trasnferul de material genetic este polarizat de la celula F+ sau Hfr către celula F-, începând de la capătul 5’ al ADN-ului. Factorul Col Reprezintă plasmidul responsabil de sinteza colicinelor (bacteriocine produse de tulpinile bacteriene de Escherichia coli). În general bacteriocinele sunt principii actici sintetizate de bacterii, cu acţiune bactericidă asupra unor bacterii din aceeaşi specie, specii inrudite dar şi foarte îndepărtate. Bacteriocinele se subdivid în două categorii:

257

ƒ

necorpusculare (nonparticulare) cu greutate moleculară mica, de natură chimică enzimatică, analogi adenin-nucleozidici, proteică dau de natură complexă glicoproteică. ƒ corpusculară (particulară) cu greutate moleculară mare, prezentînd aspecte omologe cu diferite, componente fagice defective (capete goale de fagi, structuri de cozi goale sau pline, cozi fagice incomplete umplute cu un lanţ scurt de ADN). Printre bacteriocinele cele mai studiate şi mai bine cunoscute astăzi se numără colocinele şi cloacina DF13. Producerea de bacteriocine se datorează prezenţei plasmidului de bacteriocinogenie în respectivea celulă bacteriană. Plasmidul (factor genetic responsabil de sinteza de bacteriocină) poate fi: ƒ nonintegrat (replicon accesoriu), liber în citoplasmă; de exemplu, factorii Col E1, E2, E3, E6, EI, EV,şi ColDf 13; ƒ integrat în cromozom; de exempli, factorul pentru sinteza aeruginocinelor,colicinelor I-2, V- K94, şi piocinelor. Plasmidele nonintegrate se subdivid în: ƒ nonconjugate: se transmit numai cu ajutorul factorului F sau al unui fag transductant, au o greutate moleculară joasă, între (4,2-8) x 10 8 megadaltoni prezintă un număr mic de greutate moleculară joasă, de obicei în număr mare de copii (15-60) per ADN cromozomial (de exemplu, factorii Col E1, E1a, E2, E3, E7, A, K, CloDF13); ƒ conjugative: se transmit singure prin conjugare, au greutate moleculară (40-80)x10 6 megadaltoni, au un număr, mare de gene funcţionale (100-200), de obicei prezente în 1-2 copii per celulă (de exemplu, factorii Col, Col Ib, Col IB, Col I, Col V). Structura plasmidelor Col nonintegrate conjugative şi nonconjugative a fost studiată cu ajutorul endonucleozelor de restricţie; acest studiu a demonstrat că ambele tipuri de plasmide conţin în structura lor: - un grup de gene (cluster) ,,rep” esenţial pentru replicarea autonomă; locus-ul de origine pentru replicarea plasmidului este prezent într-un punct pe această zonă; - o genă responsabilă de sinteza proteinei (colicină); - o genă responsabilă pentru sinteza proteinei de imunitate (evidenţiată la plasmidele Col E1, E2, E3, CloDf13). Plasmidele conjugative posedă în plus: un extra grup (extracluster) de gene (G – T) implicate transfer. Acest grup de gene conţine circa 20% din SADN-ul plasmidic. În general, celulele bacteriocinogene sunt immune la propria bacteriocină datorită prezenţei de imunitate mai sus mentionate. Ruperea acestei imunităţi se produce doar în prezenţa unei concentraţii foarte înalte de bacteriocină, acest fenomen purtând numele de fenomenul de rupere a imunităţii (break-down immunity). Există însă şi cazuri particulare în care unele bacteriocine (welchicinele) sunt active chiar şi pe celulele producătoare (în acest caz explicaţia fiind absenţa genei de imunitate pe plasmidul de bacteriocinogenie). În funcţie de interrelaţiile de factorul Col cu alţi factori plasmidiali din celula bacteriană, s-au descris: ƒ agregate; de exemplu linkajele: F. ColE2 şi Col Ib. Col E1, în ultimul agregat factorul Col Ib jucând rol de factor de transfer. Aceste aggregate au origine exclusiv extracromozomială şi posedă un potenţial foarte înalt de răspândire a proprietăţii de bacteriogenie în populaţia bacteriană; ƒ cointegrate; de exemplu, combinaţia F. Col V. trp.cys. Se pare că proprietatea de colicinogenie este mai rar răspândită la tulpinile bacteriene de origine umană, dar este prevalentă în flora apelor menajere şi în populaţia de enterobacterii de la animalele domestice. Cu referire specială la rolul plasmidelor de bacteriocinogenie în organismul uman şi animal, trebuie menţionate următoarele: ƒ factorul Col v codifică sinteza unui sistem de chelare (fixate, legare şi transport) al fierului din mediul extern, de către celula bacteriană, ducînd astfel la creşterea virulenţei 258

bacteriilor. În acest sens, sistemul aerobactinei este considerat astăzi un mijloc crucial de supravieţuire şi proliferare a celulelor bacteriene invasive; ƒ factorul Col V conferă tulpinilor bacteriene capacitate de supravieţuire în ser in vitro, crescând rezistenţa acestora la efectul bactericid al serului; ƒ factorul Col conferă capacitatea de adeziune celulelor bacteriene pe epiteliul intestinal (atribut al virulenţei celulei bacteriene); ƒ la tulpinile de Esch. coli enterale autohtone, factorul Col are rol protector determinând producerea de colocine cu acţiune îndreptată împotriva unor bacterii enterale patogene (de exemplu, Shigella), îngreunîndu-le acestora implantarea; ƒ în culturi celulare s-a remarcat o acţiune de inactivare a toxinei tulpinilor de E coli enterotoxigene de către colicina sintetizată de alte tulpini de Myzobacterium smegmatis are o acţiune citocidă asupra celulelor eucariote tumorale (inhibă creşterea celulelor tumorale umane,animale), dar rămîne fără efect asupra celulelor normale din aceeaşi specie (datorită selectivităţii de membrană) prezintă agrocina (bacteriocină); tulpinile bacteriene de Agrobacterium radiobacter produc bacteriocina agrocină 84, capabilă să omoare tulpina bacteriană Agrobacteruim tumefaciens (purtătoare de plasmid Ti), care determină o stare canceroasă (boala cocoşului) la plante dicitiledonate. Se presupune că structuri nucleozidice analogigrocinei 84 cu acţiuni citocidă pe celulele canceroase ar fi mai răspândite în natură decît se cunoaşte astăzi; ƒ plasmidele Col sunt considerate a fi entităţi fundamentale pentru multe celule bacteriene ţinându-se cont de faptul că sunt implicate în multe activităţi celulare.Pe baza cunoştinţelor actuale despre plasmidele Col se poate aprecia că acestea reprezintă o parte vitală din poolul de gene al speciilor bacteriene. Cele două posibilităţi de linkaj al plasmidelor de bacteriocinogenie (system aggregate şi cointegrate) pot fi considerate aspecte particulare ale potenţialului de adaptare în cursul evoluţiei. Gradele diferite de complexitate prezente de diferitele sisteme de bacteriocinogenie pot imprima şi explica potenţialul de adaptabilitate al celulei gazdă la condiţiile permanent în schimbare din: - datele acumulate pîna în prezent pledează pentru o strînsă relaţie filogenetică între plasmidele de bacteriocinogenie (factorul Col), pe de o parte şi factorii plasmidiali F şi R, pe de altă parte; - prezenţa şi similaritatea genelor ,,kill” şi ,,de imunitate” în plasmide de bacteriocinogenie şi fagi pledeaza pentru o strînsă interrelaţie în cursul evoluţiei între aceşti determinanţi genetici; - fenomenul de bacteriocinogenie este considerat a fi un split-phenotype al răspunsului celular SOS la agenţi inductori (raze u.v., mitomicina C, acid nalidixic). Genele celulare rec A şi lex A posedă o capacitate complexă de a regla diferite răspunsuri celulare SOS, incluzînd aici şi fenomenul de bacteriocinogenie, în scopul asigurării supravieţuirii şi adaptării celulare la condiţiile de mediu extern. A fost dovedit rolul multiplu de copii plasmidice autonome/integrate per celulă; - datele prezente sugerează că fenomenul de bacteriocinogenie semnifică o cale enzimatică specifică cîstigată în cursul evoluţiei; - studiul fenomenului de bacteriocinogenie a permis aprofundarea unor aspecte fundamentale de biologie moleculară (replicarea ADN-ului plasmidic, controlul replicării, fenomenul de incompatibilitate plasmidială, interrelaţiile evolutive între celula gazdă şi factorul Col). Factorul R Fenomenul de rezistenţă la drog a fost descris de către Ehrlich în perioada anilor19101913. Rezistenţa celulelor bacteriene la antibiotice prezintă două aspecte: ƒ rezistenţa naturală – proprietate intrinsecă a speciei, stabilă, de natură cromozomială;

259

ƒ

rezistenţa dobîndită – caracter cîştigat în urma unei terapii cu antibiotice (prin cîştigarea de plasmid R, mutaţie, sau în urma unui process de recombinare). Plasmidele R (factori de rezistenţă multiplă la antibiotice) au fost descries atît la germeni gram-pozitivi cît şi gram-negativi. Au fost semnalate întîia oară în Japonia, bacilii Gram negative (Akiba,1959). Factorii R sunt molecule de ADN, dublu catenar formând anse închise covalent autonome în citoplasma celulară bacteriană. Au sisteme proprii de replicare şi pot exista în mai multe copii. Posedă unul sau mai mulţi determinanţi de rezistenţă (markeri). Se pot transfera: ƒ vertical la descendenţi (ereditate extracromozomială) ƒ orizontal între specii. Acest ADN plasmadial codifică sinteza de proteine (enzime) prin intermediul unui ARNm. Factorii R sunt: - conjugativi (autotransferabili), au greutate moleculară de 20 x 106 Æ 2000 x 106 daltoni, sunt alcătuiţi din trei secvenţe nucleotidice cointegrate, şi anume: ƒ factorul RTF (factor de transfer de rezistenţă similar factorului F) care iniţiază transferul plasmidului de la celula donoare la celula receptoare; ƒ factorul codificator al autoreplicării plasmidului (replicator); ƒ determinanţii de rezistenţă la antibiotice de la 1 pâna la 20 de markeri. Cu cât plastidele sunt mai mari, cu atât replicarea lor se produce mai lent (I -2 copii/celulă). - nonconjugativi (netransferabili), posedă un ADN circular, fără factorul RTF, conţinând numai replicatorul şi determinanţii de rezistenţă. Au greutatea moleculară de 0,5x106 până la 5,5x106 daltoni, codifică rezistenţa la unul-două antibiotice, replicarea este mai rapidă pe generaţie, se formează uşor copii multiple. Transferul plasmidelor R se face între celulele bacteriene, depăşind barierele de specie, gen şi chiar de familie. Se realizează prin mecanisme de: - transfer clasic (conjugarea la bacili gram negativi, transducţie la stafilococi şi transformare) - recombinare (pe baza omologiei ADN gazdă-ADN străin) prin crossing-over la nivelul cromozomului bacterian. Acest fenomen de recombinare este foarte rar. Plasmidele R pot fi pierdute: - spontan; se pot pierde unul sau mai mulţi markeri de rezistenţă, de exemplu prin conservarea tulpinilor bacteriene la +4 C câteva luni.; - sub influenţa unor factori fizici (raze u.v.), chimici (acridinoranj, acriflavină). Reasortarea plasmidelor R (din punct de vedere al numărului, proprietăţilor si sediului markerilor) se realizează prin elemente transpozabile tip transpozomi. Transpozomii sunt elemente genetice mobile ce poartă gene determinate de rezistenţă la antibiotice; ei se pot exciza dintr-un ADN şi autoinsera în altul (într-un plasmid sau cromozom). Se pot integra în situs-uri diferite, pe aceeaşi moleculă de ADN. Prin mecanismele lor de translocare (cromozom-plasmid, plasmid-cromozom) determină un schimb larg de determinanţii R intre specii. Au fost descrişi transpozomi care codifică rezistenţa la β- lactamine (penicilina, ampicilina), la trimetoprim/sulfametoxozol, neomicină/kanamicină, gentamicină/tobramicină, eritomicină etc. Unii trenspozomi au dimensiuni foarte mari, codificând rezistenţa la un număr foarte mare de antibiotice. Referitor la circuitul plasmidelor R în natură trebuie menţionat că flora intestinală comensală şi saprofîtă (oportunist patogenă) la om şi la animale este izvorul natural de bacili gram-negativi; la nivelul acestor germeni microbieni are loc cel mai important schimb de plasmide R între specii. Mecanismele de rearanjare a markerilor de rezistenţă plasmidici şi 260

transferul plasmidic explică formarea rapidă a rezervorului de bacterii multi-rezistente. Epidemiile apar atunci când aceste plasmide R cu markeri multipli de rezistenţă ajung la bacterii înalt patogene şi cu înaltă contagiozitate. Răspândirea plasmidelor R este favorizată de utilizarea necontrolată şi abuzivă a antibioticelor, condiţii ce determină selectarea şi vehicularea în cadrul infecţiilor intraspitaliceşti a unor tulpini bacteriene cu un spectru foarte larg de antibiorezistenţă, ce creează mari dificultăţi terapeutice. Bacteriofagii Sunt virusuri care infectează bacteriile. Se fixează pe membrana celulei bacteriene, unde îşi abandonează învelişul proteic, injectându-şi materialul genetic în celula bacteriană. Virusurile împrumută aparatul metabolismului celular bacterian, pentru propria replicare, sunt deci paraziţi obligatorii ai celulelor, multiplicându-se pe socoteala acestora. In natură, virusurile apar în general drept paraziţi obligatorii ai organismelor şi celulelor vii (bacterii, plante, animale, celule umane). Materialul genetic ai virusurilor constă din ADN sau ARN, în formă liniară sau circulară închisă. Materialul genetic viral, după injectare în celula bacteriană, poate evolua pe una din cele două căi: - poate fi integrat în genomul bacterian (cale lizogenă) - poate trece imediat la multiplicare folosind aparatul enzimatic de sinteză al celulei bacteriene gazdă (receptoare). Noii fagi sintetizaţi prin acest ciclu „litic" ,în urma lizei celulare, sunt eliberaţi în mediul extern, de unde pătrund şi parazitează alte celule bacteriene.

Fagul λ Este foarte bine studiat şi utilizat ca vector. Cu ajutorul sistemului proteic reglator este capabil să aleagă între cele două posibilităţi de evoluţie mai sus prezentate. Alegerea căii de multiplicare este determinată de starea de nutriţie şi sănătate a celulei receptor (gazdă). Gazda fagului λ este celula bacteriană de E. coli.; genomul acestui fag este reprezentat de un lanţ dublu ADN. Din ADN-ul fagului λ poate fi îndepărtată o cantitate de 40% fără ca funcţiile vitale ale acestui fag să fie evident influenţate. Datorită acestui aspect este posibil ca în fagul să poată fi introdus ADN străin. Membrana proteică a fagului are o capacitate limitată de acceptare de ADN, deci cantitatea de ADN străin ce poate fi înglobată este limitată. După introducerea ADN străin prin membrana proteică fagului λ se poate trece la injectarea acestui fag (în care este înglobat ADN-ul străin) în celulele bacteriene de E coli. Bacteriofagii au un sistem propriu de transport pentru fragmentele ADN străine care pot fi astfel introduse pe cale naturală şi multiplicate în celula gazdă. Fagii lizogeni pot media (ca şi factorii plasmidici F) schimburi de gene. Astfel fagul λ (ADN) se poate insera pe cromozomul celulei de E coli între genele gal şi bio. Când se formează virionii progeni, excizia nu este totdeauna precisă, în acelaşi loc. În unul din 105 virioni, ADN-ul fagului λ conţine fie operonul gal, fie operonul bio. Infecţia cu asemenea fagi se numeşte λ gal sau λ bio; ea introduce genele celulei bacteriene de E coli, alături de genele fagului λ într-o nouă celulă infectată de respectivul fag. Fagul φ 80 Este înrudit cu fagul; se insera lângă operonul trp şi poate purta gena trp de la o celulă infectată la alta.

261

Fagul µ Se insera în orice loc pe cromozomul celulei de E. coli; transportă totdeauna un fragment din acest cromozom. Aceşti fagi transductori (ca şi factorul plasmidic F) sunt elemente genetice mobile care declanşează interschimbul între genele bacteriene, accelerând în acest fel evoluţia bacteriană. Cosmide Sunt plasmide în care a fost introdus un anumit fragment de ADN din fagul λ . Cosmidele sunt îmbrăcate în membrana proteică a acestui fag. Prin infecţie fagică (pătrunderea fagului în celulă), cosmidul este injectat în respectiva celulă gazdă. În celula gazdă, cosmidul se replică apoi ca un plasmid. Fagemide Reprezintă o nouă clasă de vectori în care o parte din genomul unui fag cu lanţ unic ADN (de exemplu M13) este combinat cu un plasmid ADN. Fagemidul se multiplică în celula gazdă ca un plasmid cu lanţ dublu ADN. Dacă în momentul introducerii fagului se injectează în celula gazdă şi un fag helper, atunci famegidul se multiplică ca un fag cu lanţ unic ADN. Secvenţe de inserţie (SI) Sunt elemente transpozabile. Transpoziţia este fenomenul prin care copii (elemente transpozabile) ale unor secvenţe specifice de ADN dmtr-un genom, se deplasează de-a lungul aceluiaşi lanţ de ADN sau pe cel al altui genom, având capacitatea de a se insera pe unul sau mai multe situs-uri specifice. S-au descris două tipuri de elemente transpozabile: secvenţe de inserţie (SI) cu dimensiuni de 0,8-1,4 kilobaze (kilobaza (kb)=1000 perechi de baze); transpozonii (Tn) cu dimensiuni de 3-20 kb (numiţi şi gene săritoare). 2) Vectorii de transcriere. Reprezintă o clasă specială a vectorilor de expresie. Se folosesc pentru sinteza ARN. Prototipul acestor vectori de transcriere este format dintr-un plasmid în care a fost înglobat un fag, promotor (SP6) sau chiar doi fagi promotori (fagii SP6 şi T7). Vectorul format din plasmid cu un fag promotor ( φ SP6) Acest vector poartă numele de SP6. Celula gazdă pentru φ SP6 este celula bacteriană de Salmonella typhimurium; promotorul φ SP6 reprezintă secvenţa start ADN de unde porneşte transcrierea (deci sinteza ARNm-ului). în spatele promotorului φ SP6 se găseşte o zonă formată dintr-un număr de secvenţe nucleotidice (zona MC S= muItiple cloning site), care oferă mai multe locuri de tăiere pentru multe enzime de restricţie (Fig. 140). Fig. 140 - Vector format din plasmid şi fag promotor SP6. Este de menţionat că zona MCS reprezintă porţiunea din sistemul vector unde pot fi înglobate de plasmid noi fragmente de ADN. După tăierea zonei MCS în două, de către o enzimă de restricţie, şi 262

înglobarea unui fragment de ADN dublu lanţ (fragment ADN sau ADNc) în mijlocul zonei MCS (fig.134), zona MCS este tăiată din nou de către alte enzime ADNc de restricţie, vectorul linearizîndu-se (fig.141).

Fig. 141 - Tăierea zonei MCS şi înglobarea unui nou fragment ADN

Fig. 142 - Vector linearizat De obicei ADN-ul înglobat este cel care urmează a fi transcris în ARN. Transcrierea cu ajutorul unui singur fag promotor este unidirecţională. Vectorul format dintr-un plasmid şi doi fagi promotori (SP6 şi T7). Acest sistem cu doi promotori este vector bidirecţional, deoarece cei doi promotori dirijează transcrierea în sensuri opuse (fig. 143 şi fig. 144).

Fig. 143 - Vector format dintr-un plasmid şi doi fagi promotori

Fig. 144 - Tăierea cu ajutorul enzimelor de restricţie a celor două zone MCS şi transcrierea în sens opus a celor două lanţuri ADN cu ajutorul fagilor SP6 şi T7 263

Pentru utilizarea acestui sistem de transcriere bidirecţională se aleg două enzime diferite de restricţie; aceste două enzime acţionează pe situs-uri diferite pe zona MCS, după tăierea prealabilă a acestei zone în două segmente între care a fost înglobat noul segment ADN. Astfel prima enzimă taie primul fragment MCS între fagul SP6 şi ADN-ul înglobat, iar a doua enzimă taie al doilea fragment MCS între fagul T7 şi ADN-ul înglobat. Promotorii SP6 şi T7 sunt astfel orientaţi încât primul să conducă transcrierea unui lanţ din ADN dublu-lanţ înglobat într-un sens iar al doilea promotor, transcrierea celuilalt lanţ ADN (al aceluiaşi ADN dublu lanţ nou-înglobat) în sens opus (fig. 145). Acest sistem vector cu doi promotori care acţionează în două sensuri opuse, permiţând transcrierea concomitentă a celor două lanţuri a ADN (dublu-lanţ) nou-înglobat, se numeşte vector bidirecţional.

Fig. 145 - Tăietura I – Vector linearizat. Utilizarea sistemului SP6 pentru transcrierea unuia din lanţurile ADN înglobate. Alegerea vectorilor Se face după mărimea fragmentului ADN care urmează a fi înglobat într-o celulă. Lungimea fragmentului ADN sau ARN se stabileşte după numărul de perechi de baze: 1 kb (kilobază) = 1000 baze (sau 500 perechi de baze); 1 mb (megabaze) = 1 milion de baze (sau 500 000 perechi de baze). Cosmidele se folosesc drept vehicule pentru fragmente foarte mari de ADN (de 30-45 kb). În ultima vreme s-au putut construi cosmide-vectori în care s-au putut îngloba fragmente mari de ADN de 100 kb - 1 mb, de pildă vectori YAC (yeast artificial chromosome), numiţi şi minicromozomi. Un vector tip YAC se comportă în celulele de drojdii ca un cromozom care se dublează înainte de diviziunea celulară, iar, în cursul acestei diviziuni, îşi împarte materialul ADN între cele două celule fiice. Aceste cosmide ajută la studiul poziţiei genelor pe harta genetică a cromozomului sau pe fragmente lungi de ADN. Vectorii de expresie reprezintă vectori construiţi anume care conţin în structura lor multe secvente de control optim pentru transcrierea şi translaţia genelor. Fiecare fragment de ADNc străin care va fi înglobat de către vector se va fixa pe acest vector tocmai în apropierea acestei secvenţe de control (cu rol de promotor); aceasta secvenţă de control (promotor) va porni apoi transcrierea secventei ADNc strain inglobat. S-au construit un numar mare de vectori de expresie care să fie propice pentru diferite tipuri de celule. Secvenţele de control nu sunt aceleaşi pentru diferitele tipuri de celule. Vectorii de expresie trebuie selectionaţi pentru fiecare tip de celulă în care urmează a fi introdusă o gena straină pentru a se obtine sinteza 264

unei anumite proteine. Astfel, prin alegerea unor vectori de expresie adecvaţi, s-a reuşit introducerea unor fragmente ADNc străin (de la eucariote) în celula bacteriană şi sinteza ulterioară a urmatoarelor proteine: insulina; eritropoetina; factorul VIII de coagulare; somatotropina; activator de plasminogen; vaccinuri pentru boli bacteriene şi virale; anticorpi monoclonali; factori imunologici (factori de necroza a tumorilor, interferon, interleukine); hiradin (antitrombotic); până de curând principiul activ se extragea direct din râme. B. Vectori speciali b1. Retrovirusurile Sunt virusuri ARN cu o treaptă ADN în replicare (de exemplu: HIV, VISNA). Multe retrovirusuri sunt oncogene, putADN determina formarea unor tumori in organismul gazda (virusul sarcomului Rous, virusul leucemiei aviare). Retrovirusurile ARN au capacitatea ca, o dată patrunse în organismul celulei gazdă să declanşeze, în prezenţa reverstranscriptazei, o transcriere inversă, adică de la ARN spre ADN, determinând astfel sinteza unui ADN dublu lant (după paltern-ul respectivului ARN viral). Acest ADN dublu lanţ se integrează apoi în cromozomul celulei gazdă (umană sau animală). Celula poartă în acest fel, integrată în cromozomul ei, informaţia pentru sinteza virusului ARN, care este declansată însă doar în anumite condiţii. Retrovirusurile sunt mai mici decat celelalte virusuri; spre deosebire de virusurile ADN, ele nu ucid (nu lezeaza) celulele pe care le contaminează, motiv pentru care ele sunt folosite astăzi drept vectori în tehnicile de inginerie genetică şi de terapie genetică, în scopul transferului unor gene străine în celula ţintă. În aceste cazuri, retrovirusurile joacă rolul unor carcase pentru transportul respectivelor gene străine către o anumită celulă ţintă. A fost imaginată o metodă eficace de prelucrare prealabilă a retrovirusului vector (Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Technology USA), prin care se elimină în prealabil un număr de gene virale, iar segmentul de virus rămas este combinat apoi cu gene care urmează a fi injectate ţintit într-o anumită celulă. În acest fel, virusul, lipsit de majoritatea genelor sale, devine inofensiv, deposedat de capacitatea lui infecţioasa, dar vector de o gena (de gene) nouă, pe care a fixat-o şi pe care o introduce în celula ţintă (mecanismul de transductie); injectat în celula ţinta, prin mecanismul de transcriere inversa, retrovirusul vector declansează actiunea reverstranscriptazei care determină sinteza ADN-ului corespunzator (replică a ARN-ului vector + gena fixată). Aceasta replică ADN se integrează în cromozomul celulei gazdă, conferind celulei gazdă o noua proprietate corespunzatoare noii gene fixate. Retrovirusurile reprezintă astazi uneltele (vectorii) cele mai utilizate în ingineria genetică pentru transportul de gene către genomul unei celule tintă. b 2. Retrovirusuri şi plasmidul Ti Plasmidele Ti se găscsc în bacteriile Agrobacterium tumefaciens din sol. Prin infectarea unor leziuni ale plantelor cu această bacterie, plasmidele Ti ajunse în celulele vegetale determină apariţia unei tumori. Deci plasmidele Ti au efect tumorigen. 265

Prin utilizarea unui vector special, format dintr-un retrovirus şi un plasmid Ti, acesta din urmă, prin prelucrarea prealabila, pierde capacitatea de a mai produce tumori şi păstrează doar rolul de vector de gene către o celulă ţintă. Procesul de transfectie si vectori speciali În biologia molecularaâă, introducerea unui ADN străin (gene) în celulele organismelor superioare (plante, mamifere) poartă numele de tranfecţie. Introducerea acestor gene străine în organismul plantelor sau mamiferelor (animale, om) se face cu ajutorul unor vectori speciali: plasmide Ti şi retrovirasuri. Dintre aceşti vectori, retrovirusurile reprezintă astazi uneltele (vectorii) cele mai larg utilizate în ingineria genetică şi terapia genică, prin transport de gene către genomul unor celule ţintă. Introducerea acestor gene străine în celule se mai poate face cu ajutorul particulelor de metal nobil (experienţe balistice biologice), dar aceste metode produc leziuni grave celulei. Altă metodă constă în supunerea celulei unui câmp electric (electroporare), tratament prin care respectivele celule devin capabile (permeabile) să accepte macromoleculele din exterior. Se mai utilizează razele laser care produc orificii foarte fine în peretele celular rigid (la plante) prin care se injectează apoi molecula de ADN străin.

12.2. HIBRIDAREA Este o tehnica de recombinare de acizi nucleici, care vizeaza construirea unei molecule de acid nucleic dublu lant din doua lanturi unice, separate, pe baza complementaritatii bazelor azotate. Imperecherea de baze complementare se poate face intre: ADN - ADN ADN-ARN ARN-ARN Totdeauna hibridizarea are loc intre doua lanturi unice de acid nucleic. Hibridizarea se foloseste ori de cate ori se urmareste identificarea secventelor nucleotidice pe un acid nucleic (secventa tinta).

12.2.1. Principiu Se analizeaza o secventa de acid nucleic unic lant (secventa tinta). Analiza acestei secvente necunoscute se face fata de o sonda genetica (proba de acid nucleic) marcata (radioactive sau prin alte metode) cu o secventa de baze cunoscute. Daca sonda si secventa tinta sunt total sau partial complementare din punct de vedere al secventelor de baze nucleotidice, se formeaza o molecula hibrid de acid nucleic in care se identified secventele nucleotidice pe secventa tinta, in raport cu bazele (complementare) de pe secventa nucleotidica cunoscuta a sondei genetice. Pentru lucru, ADN dublu lant trebuie intai denaturat (supus actiunii caldurii sau substantelor chimice alcaline) pentru a fi disociat in lanturi unice. Lantul unic va reprezenta apoi substratul pe care se va efectua hibridizarea cu sonda genetica.

12.2. 2. Denaturarea Dupa cum s-a aratat, pentru analiza si identificarea secventelor nucleotidice ale unui acid nucleic tinta, acesta trebuie intai adus la forma de lanturi unice prin denaturare. Denaturarea reprezinta modificarea structurii acidului nucleic prin tratament cu caldura (temperatura de 266

100"C) sau substante chimice, sau supunerea in mediu alcalin (pH>l 1). Folosind aceste metode se realizeaza desfacerea legaturii de hidrogen dintre bazele complementare. a). Denaturarea prin caldura Reprezinta taierea lantului dublu ADN cu ajutorul temperaturii inalte. Punctul de topire reprezinta temperatura la care 50% din respectivul acid nucleic dublu lant disociaza in unic lant. Acest punct de topire poate fi influentat de: o zona bogata in guanina-citozina, care cere totdeauna o temperatura mai inalta, deoarece aceste baze se leaga prin trei punti de hidrogen, in timp ce bazele adeninatimina se leaga doar prin doua punti de hidrogen; concentratia in NaCl a solutiei; o concentrate scazuta de NaCl determina destabilizarea moleculei de acid nucleic, aceasta necesitADN o temperatura de topire mai scazuta; concentratia cationilor. b). Denaturarea chimica Se face prin adaos de substante denaturante (formamida, uree) care determina scaderea punctului de topire.

12.2.3. Renaturarea (annealing/reannealing) Reprezinta o hibridizare. Prin scaderea temperaturii sau a pH-ului este favorizata refacerea gaturilor intre bazele complementare de pe cele doua lanturi unice de ADN - ARN sau ARN - ADN. Reactiile de renaturare se produc de regula la temperaturi care corespund unei iferente de 20-30 C fata de temperatura punctului de topire al dublului lant de acid nucleic. iaca temperatura insa scade brusc, lanturile raman separate. Cantitatea de acid nucleic unic lant, care prin renaturarea trece in dublu lant, depinde de: - concentratia moleculara a acidului nucleic din solutie; - lungimea moleculei de acid nucleic; - zona bogata în guanina-citozina; concentratia în NaCl; - concentraţia de formamida.

12.2.4. Factorul stringent Este un important factor de hibridizare. Reprezintă intensitatea reactiei de hibridizare. Dacă două lanţuri unice de acid nucleic sunt pe toată lungimea lor formate din baze implementare, iar conditiile de reacţie sunt favorabile, stringenta (intensitatea) reacţiei de ambinare este foarte puternică. Dacă pe cele două lanţuri de acid nucleic există doar zone parţiale cu baze complementare, stringentă este mai scazută (această situaţie apare în special atunci cADN cele două lanţuri de acid nucleic provin din două organisme diferite).

12.2.5. Tipuri de hibridări a. Hibridare Blotting: a.1. Southern Blotting (ADN Blotting) a.2. Norhern Blotting (ARN Blotting) a.3. Western Blotting (Protein blotting) a.4. Dot Blotting 267

a.5.Slot Blotting b. Hibridizare in situ; c. Hibridizare Colonială. a. Hibridizare Blotting Este o tehnică specială prin care acidul nucleic ţintă (de cercetat) este axtras din materialul de cercetat prin încălzire la 100 grade C şi răcire la gheaţă şi apoi depus pe o membrană(de nitroceluloză sau filtru de nylon) şi fixat. Hibridarea acestui acid nucleic necunoscut are loc direct pe filtru cu ajutorul sondei genetice (acid nucleic cunoscut şi marcat). Noţiunea de "Blot" reprezintă fitrul+acidul nucleic fixat(imobilizat). Acţiunea de "Blotting" reprezintă trecerea acidului nucleic pe filtru. Există mai multe variante de hibridare Blotting şi anume: a.1. Southern Blotting A fost imaginată de Southern în 1975.Evidenţiază secvenţele specifice ale unor fragmente de ADN separate prin gelelectroforeză. Etapele reacţiei: - se extrage ADN dintr-un produs patologic lichid(ser sanguin care conţine acid nucleic viral) sau solid(celule,ţesuturi); - ADN este tăiat cu enzime de restricţie; - fragmente de ADN(de circa 1000 perechi de baze)sînt supuse electroforezei şi separate în funcţie de greutatea lor moleculară; - fragmentele ADN obţinute în gel sînt supuse denaturării; - trecerea fragmentelor de lanţ unic ADN de pe gelul sensibil(de nitroceluloză) care fixează aceste fragmente de ADN. Pentru transferul respectivelor fragmente de ADN de pe gel pe fitru se folosesc diferite metode,dintre care una este cea prin transfer capilar (Fig.146). Gelul (2) este pus pe hărtie de fitru (1) umedă(care a absorbit prin capilaritatea lichid din vasul cu soluţie tampon); peste gel (2) se pune altă hîrtie de filtru (3) uscată, care se îngreunează prin aplicare,deasupra ei,a unei lame de sticlă (4) şi a unei greutăţi (5). Curentul de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se formează prin capilaritate,de la hîrtia de fitru umedă spre cea uscată,acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din gel şi le trage către şi pe hîrtia de fitru superioară (4). Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hîrtia de fitru superioară prin acţiunea căldurii sînt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv). Hibridizarea se realizează prin incubarea hîrtiei de fitru (3) într-o soluţie care conţine sonda genetică radioactivă (de exemplu, ADN marcat cu 32P); molecula-hibrid realizată va fi evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi. Utilizarea practică a variantei Southern Blotting Gelul (2) este pus pe hărtie de fitru (1) umedă(care a absorbit prin capilaritatea lichid din vasul cu soluţie tampon); peste gel (2) se pune altă hîrtie de filtru (3) uscată, care se îngreunează prin aplicare,deasupra ei,a unei lame de sticlă (4) şi a unei greutăţi (5). Curentul de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se formează prin capilaritate,de la hîrtia de fitru umedă spre cea uscată,acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din gel şi le trage către şi pe hîrtia de fitru superioară (4). Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hîrtia de fitru superioară prin acţiunea căldurii sînt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv). Hibridizarea se realizează prin incubarea hîrtiei de fitru (3) într-o soluţie care conţine sonda genetică radioactivă (de exemplu, ADN marcat cu 32P); moleculahibrid realizată va fi evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi.

268

Fig. 146 - Hibridarea Southern Blotting 269

Utilizarea practică a variantei Southern Blotting Prin apariţia unei mutaţii în genomul celulelor germinative (modificarea unei baze), care se moşteneşte, respectiv ADN modificat, dacă va fi supus acţiunii enzimelor de restricţie,va prezenta una din următoarele două ipostaze posibile: - lanţul ADN rămîne netăiat,deoarece enzimele de restricţie nu mai recunosc situs-ul specific; - din contră, poate apare un nou situs specific de tăiere pentru aceste enzime. În acest al doilea caz, pot apărea în consecinţă noi tipare de fragmente ADN; acest fragment a fost numit "polimorfism de lungime al fragmentelor de restricţie" (RFLP). Studiul acestor fragmente şi a diferenţei dintre ele, cu ajutorul metodei Southern Blotting,a putut aduce noi informaţii în cercetările efectuate asupra unor boli genetice şi în medicina judiciară. Astfel s-a putut demonstra că: - la germenii univitelini, aceste tipare RFLP sînt complet identice; - la rude, aceleaşi tipare RFLP sînt în mare parte identice; - în boli genetice se evidenţiază prezenţa unor gene defecte (pe baza unor fragmente ADN cu un tipar individual); - prezenţa unor modificări genetice în cazul unor procese tumorale; - pe baza tiparelor RFLP s-au putut clasifica microorganismele (virusuri şi bacterii) - în medicina judiciară, pe baza pattern-urilor RFLP (ADN minisatelite=fragmente hipervariabile din genom, care nu sînt transcriptibile) se poate face determinarea paternitaţii. De asemenea, pe baza aceloraşi pattern-uri RFLP se pot face identificări de persoane în criminalistică, prin studiul unor probe de sânge sau spermă; ADN de origine umană şi cel provenind de la cimpanzeu şi gorilă sînt omologate în proporţie de 97%(diferenţa constă în cromozomul X). Speciile de cimpanzeii sunt mult mai copiate de om decât alte specii de maimuţa. În Africa de Sud a fost studiată originea speciei Quagga (Equus quagga), care a dispărut în 1883, şi pe baza studiilor filogenetice s-a stabilit că aceasta reprezintă forma originară a tuturor speciilor de zebră; Studiul genelor pentru globină la primate (responsabile pentru sinteza proteinei hemoglobină) a demonstrat că aceste gene sînt localizate la un loc,într-un cluster pe cromozomii umani 11 şi 16. Dimensiunea acestor clusteri este asemănătoare la om, gorilă şi gibon. a. 2. Northern Blotting Această variantă a hibridizării Blot pune în evidenţă secvenţe specifice ale unor fragmente ARN departe prin gelelectroforeză. Etapele reacţiei sunt: - ARN este extras din materialul de cercetat; - ARN este pus în prezenţa substanţei denaturatei (glicoxal dimetilsulfoxid formaidehidă sau metilmercur); - ARN este supus separării electroforetice; - transferul moleculelor ARN pe filtru (nylon sau mitriceluloză); - hibridizarea ARN de pe filtru cu o sondă genetică ARN sau ADN; - evidenţierea moleculei hibrid construite. Aplicaţii practice ale variantei Northen Blotting - determinarea ribotipurilor tulpinilor bacteriene (în studii genetice, epidemiologice). - În epidemiologie, reprezintă o motodă foarte modernă şi utilă de cercetare pentru determinarea filiaţiei cazurilor în epidemii, această metodă fiind mult mai sensibilă decât determinarea hizotipurilor de tulpini. Astfel, în actuala a VII -a pandemie de horelă, cu ajutorul metodei de ribotipare s-a putut demonstra că profilul genetic al tulpinilor de Vibrio cholerae biotip eltor, prezente în Asia şi Europa, este în mai mult de 70% din cazuri identic. 270

a. 3. Western Blotting (tehnica immunoassay) Această variantă a hibridizării Blot nu reprezintă o reacţie de hibridizare propriu-zisă (anume construirea unei molecule ADN dublu lanţ din două lanţuri separate de ADN). Această variantă foloseşte doar principiul reacţiei de hibridizare, şi anume desfaşurarea substratului de cercetat pe gel de electroforeză şi apoi trecerea acestuia pe o membrană de nitroceluloză,unde este apoi cuplat şi evidenţiat prin intermediul unor grupări chimice complementare.În acest caz de Western Blotting, substratul de cercetat nu este reprezentat de un acid nucleic ci de o proteină. Reacţia foloseşte la evidenţierea unor cantităţi foarte mici de proteine prezente în lichidele sau celulele unui organism, prin cuplarea acestora cu anticorpi specifici corespunzători (marcaţi). Etapele reacţiei sunt următoarele: - proteina este supusă electroforezei în gel SDS*-policrilamidă; - transferul spoturilor proteice (antigene) pe membrana de nitroceluloză; - adaos de anticorpi specifici marcarţi (cu enzime sau radionuclizi); - spălarea anticorpilor rămaşi nefixaţi; - aplicarea deasupra membranei de nitroceluloză a unui film fotografic; - expunere şi developare; - citirea prin autoradiografie a benzilor de proteină cu ajutorul anticorpilor specifici marcaţi şi fixaţi. Avantajul metodei este acela de a pune în evidenţa prezenţa unei anumite proteine, dintro mixtură complexă.Această metodă este folosită pentru clonarea genelor. a. 4. Dot Blotting Se execută pe o placă de plexiglas cu godeuri rotunde (fig.147). Este necesară extracţia prealabilă a acidului nucleic din probele de cercetatare(ser,extracte celulare sau tisulare. Proba de acid nucleic extrasă se depune într-unul din godeurile rotunde ale plăcii de plexiglas.În fiecare godeu se depune altă probă de acid nucleic,în total pe o placă depunînduse atîtea probe câte godeuri are placa. Apoi respectiva placă se acoperă cu hîrtie de filtru, care absoarbe aventualele probe de acid nucleic prezent. Nu se face nici o separare electroforetică; probele de acid nucleic de pe hîrtia de filtru sînt supuse apoi denaturării (prin încălzire la 100 gradeC şi răcire la gheaţă). Apoi probele de acid nucleic denaturat de pe filtru sînt hibridizate cu sonde genetice. Fig. 147 - Tehnica Dot Bloptting a. 5. Slot Blotting Se execută pe o placă de plexiglas cu godeuri de formă dreptunghiulară (Schlitz-uri = tăieturi sau Slot-uri). Principiul metodei este identic cu cel de la Dot Blotting. Aceste ultime două variante de hibridizare se folosesc atunci când se lucrează deodată cu un număr foarte mare de probe patologice nefracţionate (probe de ser, extract celulare sau tisulare). 271

12.2.6. Hibridizare in situ Se efectuează direct pe celule şi ţesuturi. În cazul hibridizării Blotting este necesară extracţia prealabilă a acidului nucleic din proba de cercetat; prin această extracţie, se pierde însă informaţia asupra sediului exact al respectivului acid nucleic (ADN sau ARN) din anumite structuri celulare. Această informaţie se poate obţine numai cu ajutorul hibridizării in situ.Prin această ultimă metodă se poate realiza evaluarea exactă a distribuţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN direct in situ simultan cu determinări calitative şi semicantitative. Se folosesc fragmente de ţesuturi, amprente de celule, culturi celulare (prelucrate, aplicative şi fixate pe lame obiective). Fixarea se face cu xilol, etanol (100% şi apoi 70%). Lama obiectiv cu celule fixate corespunde filtrului cu acid nucleic legat prin hibridizare Blotting. Reacţia de denaturare şi hibridizare se face pe lama obiectiv şi anume: după depunerea probei pe lama obiectiv, pentru denaturarea probei se foloseşte o încălzire puternică sau tratarea cu proteaze şi digitonină, ultima slăbind şi desfăcând citoscheletul şi rezultînd molecula ţintă de acid nucleic unic.Lama cu probă pentru denaturarea se acoperă cu o placă, realizîndu-se o cameră umedă. După denaturare, lama se spală (pentru îndepărtarea particulelor nelegate) şi abia apoi urmează hibridizarea cu sonda (ADN sau ARN) marcată; în cazul reuşitei hibridizării, secvenţele ţintă din acidul nucleic de cercetat (din ţesuturi) sînt evidenţiate la autoradiografie (prin cuplare cu secvenţele de acid nucleic complementare din probele marcate cu biotină). Biotina din sondă a fost fixată de un necleotid cu uracil; acest uracil se va împerechea în lanţul de acid nucleic ţintă cu o adenină;după ce se produce această reacţie de hibridizare, se face o spălare cu o soluţie tampon,care îndepartează moleculele nelegate de acid nucleic din probă. Marcarea cu biotină este evidenţiată ulterior prin diferite variante de lucru (vezi "Sonde genetice.Marcarea"). Aplicaţiile practice in situ sunt: evidenţierea şi localizarea diferiţilor agenţi infecţioşi în diferite celule şi ţesuturi ale organismului: virusul hepatitei virale tip B, HIV, virusul Epstein-Barr, virusul cito-megaliei, virusul herpes simplex, virusul papilloma; cercetarea relaţiilor virus-procese oncogene (de exemplu, relaţia virusul hepatitei virale tip B-carcinom hepatic); diagnosticul pre- şi postnatal în boli genetice; localizarea genelor defecte pe cromozom (de exemplu, în fibroza chistică, distrofia musculară Duchenne); identificarea anormalităţilor cromozomiale (de exemplu: trisomia 21, sindromul Langdon Down, sindromul Turner); stabilirea sexului la embrion; cercetarea tiparelor de expresie genetică (stabilirea momentului activării anumitor gene); stabilirea hărţii genetice cromozomiale (stabilirea relativă a locus-ului fiecărei gene pe cromozom); hibridarea colonială. Pe plăci cu medii de cultură se însămînţează colonii bacteriene din două tipuri de clone: o clonă bacteriană de origine(cu plasmid); o clonă bacteriană cu ADN ţintă (cu plasmid+ fragmente de ADN ţintă). Prin replica plating se obţine copii ale acestor colonii din cele două clone pe un filtru de nitroceluloză. Aceste copii de clone bacteriene (de pe fitru) sunt supuse lizei pentru a se obţine ADN. ADN este supus denaturării pentru obţinerea lanţurilor unice de ADN. Lanţul unic ADN este supus hibridizării cu probele ADN cunoscut şi marcat radioactiv. După fixarea probelor ADN radioactive(fixarea complementară)pe lanţul unic de ADN ţintă 272

(de cercetat) se procedează la evidenţierea autoradiografică a marcării pe un film Roentgen. Prin compararea imaginii radiografice se identifică şi se diferenţiază clonele bacteriene care conţin fragmente de ADN ţintă faţă de clonele bacteriene de origine. Clonele bacteriene care poartă ADN ţintă recombinant (plasmid + ADN ţintă) vor fi multiplicate mai departe (sincron se vor multiplica şi fragmentele de ADN straniu).

12.2.7. Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi biologie Această reacţie a pus bazele unui număr de tehnici care au ajutat la progresul cercetării biologice fundamentale,cît şi la progresul diagnosticului medical într-un număr de boli. Astfel s-a reuşit: stabilirea concentraţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN într-o mixtură de secvenţe; determinarea numărului de copii dintr-o anumită secvenţă prezentă într-un dovedirea gradului de înrudire între diferite organisme în raport cu numărul de secvenţe ADN identice; stabilirea activităţii genelor pentru care s-au pus în evidenţă moleculele de ARNm corespunzătoare; evidenţierea secvenţelor specifice ADN şi ARN în material biologic de cercetat (sânge, celule, ţesuturi); evidenţierea acidului nucleic viral; în serul sanguin LCR, în vederea elucidării diagnosticului unor infecţii virale cronice: evidenţierea acidului nucleic viral în aceste produse semnifică prezenţa particulei virale în organismul respectiv. Evidenţierea prezenţei acidului nucleic viral direct în produsele patologice (ser, LCR) sau în materialul citologic reprezintă o posibilitate de diagnostic rapid şi precoce, în vederea instituirii a unei terapii de urgenţă în special la persoanele bolnave de SIDA sau la cele imunosupresate (terapeutic) în urma unor transplante de organe. În aceste cazuri diagnosticul serologic de obicei nu poate fi de ajutor deoarece pozitivarea serului în cazul infecţiei cu HIV se produce abia după câteva săptămâni de infecţie, iar în cazul imunosupresaţilor după câteva luni sau chiar deloc; ƒ evidenţierea prezenţiei virale în tumori de origine virală; ƒ studiul efectuat asupra produsului de transcriere (ARNm) a unor secvenţe ADN celulare glucogene nevirale a ajutat la complectarea şi aprofundarea diagnosticului de tumoră. Astfel o reacţie de tip imunohistochimic a putut pune în evidenţă un produs de transcriere (ARNm) specific de ţesut (de exemplu, prezenţa unui anumit ARNm corespunzător unei munoglobuline prezente în caz de limfoane maligne sau prezenţa unui anumit ARNm hormonal în anumite tumori neuroendocrine. Această metodă reprezintă o unealtă foarte eficientă pentru cercetarea activităţii genelor oncogene prin evidenţierea indirectă imunohistochimică a produselor lor de translaţie (ARNm corespunzător); ƒ diagnosticul pre- şi postnatal al bolilor ereditare (la femei care doresc copii sau la care se pune problema întreruperii sarcinii); ƒ determinarea defectelor metabolice; ƒ utilizarea metodelor ce folosesc sonde genetice pentru diagnosticarea infecţiilor virale ale arborilor fructiferi (cu o precizie de diagnostic pentru o cantitatea de antigen de 2x10 nanograme); ƒ aplicaţii în epidemiologia moleculară în vederea depistării unor noi markeri genetici (de exemplu, robotip, pulsotip); ƒ se precizează ca în viitor metoda hibridizării să ofere posibilităţi pentru elucidarea mecanismelor de reglare a activităţii genelor.

273

12. 3. SONDE GENETICE Cu ajutorul enzimelor de restricţie, astăzi se pot izola, teoretic, toate genele tuturor organismelor vii, în vederea obţinerii unei bănci de gene (le vivant mondial). Principiul hibridizării în vitro a două ADN-uri complementare stă la baza metodei care foloseşte sondele moleculare(coduri de ADN cunoscute asociate cu un marker). Cu ajutorul unor asemenea sonde, la un individ dintr-o anumită specie se pot repera codurile complementare pe care sonda "le luminează" prin procesul de hibridizare moleculară. Cu ajutorul ADN-polimerazelor s-a reuşit şi amplificarea ulterioară a acestor fragmente de ADN bine determinate şi deci clonarea genelor pentru a face şi mai uşoară (mai sensibilă) reperea lor. Astăzi,graţie sondelor genetice, etichetarea, reperarea şi cartografierea genelor au devenit operaţii de rutină în marile laboratoare din lume, ceea ce va asigura în viitor progresul rapid al alcătuirii hărţilor cromozomiale complete ale genomului uman. Sondele genetice (probe de acid nucleic tip ADN sau ARN marcate) reprezintă unealta esenţială de lucru în metoda de hibridizare pentru analiza secvenţelor nucleotidice din secvenţele "ţintă" ale ADN-ului de cercetat (genele). Aceste sonde genetice (proba de ADN sau ARN) sunt marcate (radioactiv sau nonradioactiv) pe un singur nucleotid (cu o secvenţă de baze cunoscute). În prezent sondele genetice pentru cercetare şi diagnostic se pot comADNa şi cumpăra de la casele producătoare. Sondele genetice se prepară prin aceleaşi metode de hibridizare utilizate şi pentru secvenţierea (sequencing) acidului nucleic, şi anume prin metodele Blot (Western Blot,Southern Blot) şi metoda hibridizării in situ. A. Prepararea probelor de acid nucleic(sonde genetice) pentru reacţiile de hibridizare Sondele genetice pot fi: probe de ADN şi probe de ARN. a. Prepararea probelor de ADN: a.1. Din fragmente ADN dublu lanţ clonate (în vederea obţinerii ulterioare de sonde genetice). Aceste fragmente se obţin prin încorporarea de fragmente da ADN genomic(tăiate cu ajutorul enzimelor de restricţie) sau de fragmente ADNc (sintetizate cu ajutorul reverstranscriptazei după modelul unei matriceARNm) într-un vector şi prin introducerea lor, o dată cu acest vector (recombinant), într-o celulă gazdă, unde vectorul se multiplică rezultînd în final o cantitate mare de ADN clonat. Pentru hibridizări sînt în special de preferat fragmentele ADNc clonat, deoarece reprezintă secvenţe de ADN fără introni şi fără altă secvenţă care ar putea reacţiona nespecific. Moleculele ADNc sunt, iniţial, unic lanţ, dar prin diferite metode sunt transformate în ADN dublu lanţ şi apoi introduse în vectori şi multiplicate o dată cu aceştia în celula gazdă. În acest caz, într-o moleculă finală de ADNc dublu lanţ doar un lanţ conţine secvenţe corespunzătoare moleculei matriţă ARNm, iar celălalt lanţ ADNc reprezintă secvenţele complementare respectivului lanţ matriţă ARNm. Probele ADN dublu lanţ pot fi ulterior marcate în vederea obţinerii sondelor genetice (vezi „ Marcarea sondelor genetice”). a.2. Sub forma de oligonucleotide ADN unic lanţ prin sinteza chimică în "maşini de gene". În aceste maşini se pot realiza concomitent sinteza şi marcarea sondelor genetice. Aceste oligonucleotide ADN-unic lanţ reprezintă baza materială pentru: ƒ sonde genetice; ƒ sinteza de gene; ƒ primeri pentru reacţii polimerazice în lanţ.

274

b.Prepararea probelor ARN (sonde genetice) b.1. În " maşini de gene":ca şi probele ADN unic lanţ. b.2. Prin metoda de transcriere in vitro cu ajutorul vectorilor de transcriere. Această metodă de transcriere in vitro (sinteza ARNm după o matriţă ADN) se realizează cu ajutorul vectorilor de transcriere unudurecţionali şi bidirecţionali, ăn vederea obţinerii de probe ARN lanţ unic (sondă genetică), care se utilizează ulterior în reacţiile de hibridare.Prin această metodă, ADN este transcris în afara celulei, în ARN, ARN-ul respectiv putând fi marcat direct în cursul sintezei. Vectorii de transcriere (clasă aparte a vectorilor de expresie), nu se folosesc caşi ceilalţi vectori de expresie pentru sinteza de proteine, ci pentru sinteza de ARN. Vectorii de transcriere sunt formaţi dintr-un plasmid ADN, în care au fost înglobaţi un fag promotor (SP6) sau doi fagi promotori (SP6 şi T7). În cazul vectorilor cu un fag promotor (SP6), transcrierea in vitro va fi unidirecţională, iar în cazul vectorilor cu doi fagi promotori, bidirecţională. Promotorul reprezintă secvenţe de ADN de unde începe procesul de transcriere, deci sinteza ARNm. b.2.1. Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6 După înglobarea în sistemul SP6, ADN-ul străin este cel care urmează a fi transcris în ARN. După linearizare se adaugă în mediu SP6-ARN-polimeraza şi patru ribonucleotide (dintre care trei nucleotide marcate şi unul nemarcat).ARN- polimeraza se va lega de promotorul SP6 pornind transcrierea genelor în direcţia SP6>fragment MCS>fragment ADN nou înglobat (fig. 148). Va fi transcris unul din cele două lanţuri de ADN nou înglobat. În sinteză, ARN-polimeraza va folosi ribonucleotidele marcate şi nemarcate, pentru formarea unei molecule ARNm conform matriţei ADN.

Fig. 148 - Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6 Având în vedere că transcrierea începe la nivelul promotorului SP6 şi se termină la locul de tăiere a enzimei de restricţie, înseamnă că prin utilizarea diferitelor enzime de restricţie se poate prestabili lungimea lanţului transcris şi se pot obţine lanţuri ARNm transcrise de lungimi prestabilite. b.2.2.Transcrierea bidirecţională cu ajutorul vectorului bidirecţional cu doi promotori (φ SP6 şi φ T7). Vectorul bidirecţional este format din ADN plasmidic, φ SP6, zona MCS şi φ T7 (vezi fig. 137). Cei doi promotori dirijeajă transcrierea în două sensuri opuse. Prin introducerea şi înglobarea într-un vector de transcriere bidirecţională a unui dublu lanţ ADN (de exemplu, ADNc între două segmente de MCS şi după linearizarea vectorului), se poate stabili de la început care din cele două lanţuri ADNc va fi transcris în ARN. Fiecare din cele două polimeraze necesare pentru transcrierea respectivului lanţ ARN şi anume, SP6 – ARN polimeraza şi T7 - ARN polimeraza , se leagă specific doar de promotorul corespunzător. După linearizare, în funcţie de enzima de restricţie folosită, cât şi de ARN-polimeraza utilizată pentru transcriere, se va sintetiza ARN sau ARN antisens.

275

Într-un dublu helix ADN: - un lanţ ADN este complementar cu ARNm de origine utilizat pentru sinteza ADNc; - al doilea lanţ conţine aceleaşi secvenţe de nucleotide ca şi ARNm de origine. Prin transcrierea: - primului lanţ ADN, rezultă ARN sens identic şi cu acelaşi sens ca şi ARNm de origine; - celui de-al doilea lanţ ADN, rezultă ARNm antisens = complementar faţă de ARNm de origine: Acest ARN antisens se mai notwează ARNc (complementar) şi are sensul invers decât ARNm sens (normal). Probele de ARN obţinute în maşini de gene cât şi prin metoda transcrierii cu ajutorul vectorilor fagici, pot fi marcate direct în soluţia de sinteză cu ajutorul nucleotidelor marcate (vezi „Marcarea”). Probele de lanţ unic ARN astfel obţinute şi marcate se utilizează ulterior în reacţii de hibridare, ca sonde genetice. B. Marcarea Se face pe un sungur nucleotid, cu o substanţă care îl face vizibil din punct de vedere biochimic sau imunohistochimic. a. Marcarea radioactivă Se face cu radioizotopi 3H,35S, 125I, 32P.La alegerea izotopului trebuie ţinut cont de timpul de înjumătăţire (timp necesar pentru ca substanţa radioactivă să se descompună în proporţie de 50%). Astfel, timpul de înjumătăţire pentru : 3 H este de 12,35 ani; 35 S este de 87,4 ani; 125 I este de 60 de zile; 32 P este de 14,3 zile. Atomul radioactiv introdus în probă prin dezintegrare va emite radiaţii β care vor fi evidenţiate la autoradiografie (impresionarea plăcii Roentgen la iluminarea cu radiaţii u.v.). Timpul de expunere a filmului la u.v. va fi diferit în funcţie de izotopul folosit: - pentru hibridarea Blotting se foloseşte proba marcată cu 32P; - pentru hibridarea in situ se foloseşte proba marcată cu 3H. În ultima vreme există tendinţa ca substanţele radioactive să fie abADNonate din cauza efectului lor nociv asupra organismului şi înlocuirea lor cu substanţe neradioactive. b. Marcarea neradioactivă Se face în două etape: Etapa I – marcarea probelor cu biotină (cel mai frecvent), bromdeoxiuridină, digoxigenină. Etapa II – probele marcate sunt evidenţiate prin intermediul legării markerului de avidină (glicoproteină din ou)/streptovidină (sintetizată din ciuperca Streptomyces avidinii) şi anticorpi antimarker (de exemplu, antibiotina) marcaţi cu fluorocrom. Etapa I Markerul (biotina) se leagă printr-un lanţ de legare numit spacer de baza uracil din nucleotid. Acest braţ de legare va uşura şi legarea ulterioară a biotinei de proteinele avidină/streptovidină, în etapa II. În mod normal uracilul se înglobează numai în ARN, nu şi în ADN, dar în condiţii de laborator, prin intermediul spacer-ului de la biotină se pot realiza două tipuri de legături: - legătura cu nucleozidul natural; - legătura cu nucleozidul artificial. De exemplu: Bio – UTP; Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat Bio – dUTP; Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat. Pentru aceste structuri se folosesc în laborator trifosfaţii nucleozidelor. ATP-ul din nucleotidele ADN este transportor de energie pentru metabolismul celular. 276

Atât Bio – UTP, cât şi Bio – dUTP sunt derivate biotinate ale dezoxiuridin – trifosfstului şi , respectiv ribouridin – trifosfatului şi vor fi înglobate în locul dezoxitimidin – trifosfatului şi, respecti în ARN, în locul rbouridin – trifosfatului. În momentul hibridării cu segmente ADN ţintă, nucleotidele cu uracil se împerechează, pe lanţul complementar de ADN ca şi pe lanţul ARN, tot cu un nucleotid cu adenină. Etapa a II-a Probele de mai sus biotinate se evidenţiază prin legarea biotinei de avidină/streptovidină sau anticorpi antibiotină marcaţi cu fluorocrom.Biotina prezintă o mare afinitate pentru avidină. Legătura bitină + avidină este foarte puternică şi aproape ireversibilă. Din cauza unor reacţii nespecifice se preferă streptovividina în locul avidinei. În final, pentru a se evidenţia prezenţa complexului molecular hibrid biotină – avidină/streptovidină, acesta este marcat prin diferite metode. C. Înglobarea nucleotidelor marcate în sonda genetică Se realizează prin: a. Metode enzimatice b. Metode chimice. a. Metode enzimatice Înglobarea nucleotidelor marcate radioactiv sau neradioactiv se face cu ajutorul unei reacţii enzimatice, în prezenţa ionilor de Mg++. I. Nick - translaţia Cea mai folosită metodă pentru marcarea sondelor este Nick-translaţia (translaţia prin tăiere). În această metodă se folosesc două enzime: ADN-aza I şi ADN – polimeraza I. ADN- aza I este o enzimă de restricţie extrasă din pancreas de bou; ea taie legăturile fosfodiesterice de ADN unic sau dublu lanţ; nu atacă ARN şi acţionează în prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++ (fig. 149).

Fig. 149 - Acţinea ADN- azei I pe dublul lanţ ADN îm prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++ ADN- polimeraza I (polimeraza Kornberg) este izolată din E. coli, are acţiune polimerazică 5' > 3', fixează nucleotidul ADN la capătul liber 3' (mai scurt) al moleculei ADN parţial dublu lanţ, în funcţie de complementaritatea faţă de nucleotidele de pe lanţul matriţă corespunzător (fig. 150). ADN – polimeraza I are şi o acţiune exonucleazică în ambele sensuri: 5 ' > 3' şi 3' > 5' ; această acţiune apare doar când în cursul sintezei unui ADN sunt introduse nucleotide false (fig. 151).

Fig. 150 - Acţiunea 5 ' > 3' polimerazică a ADN- polimeraza I

277

Fig. 151 - Acţiunea exonucleazică în ambele sensuri ale ADN – polimerazei I. Astfel, după încorporarea nucleotidelor marcate, dublul lanţ ADN este denaturat (cele două lanţuri sunt separate); se vor obţine fragmente de lanţuri unice ADN marcate de diferite lungimi şi cu diferite secvenţe de baze (sonde genetice) (fig.152). Fig. 152 - Schema Nick – translaţiei (după Hermaun , 1991). II. Oligomarcare (RADNom Priming, RADNom Priming Oligolabelling,FeinbergVogelstein Technik) Spre diferenţa de “nicktranslatie”, in oligomarcare se folosesc drept matriţe lanturi unice de ADN rezultate dintr-o denaturare prealabila a unui lanţ ADN. Se foloseşte enzima Klenow Polimeraza care reprezinta un fragment de ADNpolimeraza. Klenow Polimeraza poseda activitate 5’ – 3’, si 3’- 5’ exonucleazica (dar nu prezinta activitate 5’- 3’ exonucleazica). Se mai utilizează un amestec de hexanucleotide (oligonucleotide sintetizate cu ajutorul unei maşini de gene ); ele sunt structuri formate fiecare sir cate sase nucleoide care contin practic toate combinaţiile de secvenţe nucleotidice posibile, reprezentate de nucleotide ADN marcate (.) cît şi nemarcate (o), aflate de obicei in proporţie de la 1 la 3. Numele metodei de RADNom Priming derivă de la utilizarea drept primeri a hexanucleotidelor cu secvenţe întamplătoare (randomized primer). 278

III. Marcare terminala a lanturilor ADN (Endlabelling). Pot fi marcate capetele 3’ si 5’ ale moleculei ADN şi ARN. Spre diferenţa de primele doua metode (1 şi 2), prin care sunt marcate moleculele de ADN probe (sonde genetice), în aceasta a treia metoda marcare se face numai la capetele moleculei ADN-proba rezultata ;de aceea, sensibilitatea moleculei de ADN rezultata prin această metoda este mult mai mică.Acest tip de marcare se efectueaza atat pe ADN unic lanţ cît şi dublu lanţ.Exista mai multe metode de marcare terminală. Marcarea terminală 3’ a ADN:se face cu ajutorul enzimei transferaza terminala*. Această enzimă, în cazul de faţă, catalizează fixarea nucleotidului pe capatul 3’-OH liber al moleculei ADN unic (sau dublu lanţ). Enzima nu are nevoie de nici o matriţa; va rezulta deci un ADN lanţ unic cu un capat 3’-OH liber (şi respectiv un ADN cu un capat format dintrun lanţ 3’-OH care atârna în afara). În aceasta metoda se foloseşte doar un singur nucleotide ADN marcat (de exemplu, cu biotina): dezoxiribouridinbiotinat (Bio-dUTP). Acest Bio-dUTP este legat prin acţiunea transferezei terminale de capetele 3’-OH ale unei molecule ADN dublu lanţ, deci pe fiecare din cele două lanturi, la capetele 3’-OH formînd o coada cu acelaşi nucleotide pe ambele lanturi ale dublului lanţ ADN (dar la capetele opuse). Lungimea acestei cozi este dependenta de concentraţia cationilor de Co++si de concentraţia nucleotidelor. Cu ajutorul enzimei transferaza terminala se poate,de asemenea, ataşa, unei molecule dublu lanţ ADN , o coada cu nucleotide nemarcate,care conţin toata timina.Dupa denaturarea şi hibridicarea unei asemenea “probe marcate”, această coada cu timina poate fi evidenţiată indirect prin fixarea, în cursul hibridizarii, a unei cozi cu adenina marcata cu biotin ape lanţul ADN proba (adenine se va fixa prin complementaritate pe coada de timina). În cazul acestei hibridizari, lanţul cu coada de timina reprezinta secvenţa ţinta, iar cel cu coada de adenine, secvenţa proba.. b) Metode chimice Reprezinta o marcare directa a acidului nucleic. ƒ 1. Marcarea cu fotobiotină. Un asemenea tip de marcare este bazat pe legarea biotinei printr-un braţ de legare chimică, de acidul nucleic, pe o grupare chimica activate in prezenţa luminii (iluminare foarte scurta). Se formeaza o legatura stabile între biotina şi acidul nucleic (lanţ unic sau dublu). ƒ 2. Marcarea cu acridin oraj. Prin cuplarea între acridinester şi acidul nucleic se produce o legatură de chemoluminiscenta care eliberează lumina.

12.4. CLONAREA ADN – ului Clona bacteriana reprezinta un grup de celule bacteriene identice din punct de vedere genetic, care provin dintr-o singură celula bacteriană.Clonarea se poate realiza prin încorporarea (printr-o tehnică de recombinare ADN) a unui fragment de ADN străin într-un vector care ulterior este introdus şi multiplicat într-o celula gazdă. În biologia moleculară, clonarea semnifică obţinerea unei culture de celule dintr-o celulă unică, astfel încat sa se obţină populaţie uniforma din punct de vedere genetic. ================================================================== *Dezoximetil-nucleotid-terminal-transferaza; această enzimă se foloseşte şi în experienţe de clonare pentru obţinerea capetelor franjurate ale fragmentelor ADN

279

A. Etapele principale ale metodei de clonare Sunt urmatoarele: ƒ extragerea unui fragment ADN, prin taierea ADN genomic, cu ajutorul enzimelor de restricţie; ƒ introducerea fragmentului ADN într-un vector; ƒ introducerea vectorului recombinant (plasmid care a înglobat fragmentu ADN străin) în celula gazdă; ƒ selectarea celulelor bacteriene care conţin vectorul recombinant. Clonarea ADN se recomADNă atunci cADN este necesară izolarea şi multiplicarea unui segment de ADN (dintr-un genom). În majoritatea experimentelor de clonare, se folosesc celule bacteriene de E.coli. 1.Extragerea unui fragment ADN. Se lucreaza pe celule de Esch.coli.Se folosesc enzime de restricţie de tip sticky* şi un plasmid care poarta doua gene (markeri de rezistenţa la doua antibiotice: ampicilina şi tetraciclina). În scopul eficienţei de clonare: a) pentru a împiedica circularizarea vectorului ADN străin, trebuie îndepartate grupările fosfat de la extremitaţile 5’ ale moleculei deschise de ADN a vectorului, cu ajutorul fosfatzei alcaline.În acest fel, vectorul nu se va mai circulariza. Fosfataza alcalina se obţine din celule de Esch.coli sau celule de intestine de oaie; b) pentru a permeabiliza membrane celulei bacteriene la respectivul plasmid vector, celula bacteriana trebuie tratata cu soluţie CaCl2 pentru a devenit compententa; c) având in vedere faptul ca celulele bacteriene poseda sisteme care protejează celula de pătrunderea unui ADN străin, se folosesc pentru clonari celule bacteriene mutante (celule cu system de apărare mult diminuat). 2.Introducerea vectorului recombinant in celula gazda (competenta) Acest fenomen reprezinta procesul de trasformare. În soluţia nutritive în care se găsesc celulele bacteriene, sincron cu multiplicarea celulelor bacteriene, se produce şi multiplicarea vectorilor recombinanti incorporate. Ţinând cont de faptul că atît plasmidul cît şi fragmentele ADN au locuri (situs-uri) de tăiere complementare, atunci cînd vectorul deschis şi segmnetul ADN străin vor veni in contact, din zonele sticky, se vor lipi şi va rezulta lanţul ADN recombinant (fragmentul ADN a devenit inclus in vector). De obicei, pe plasmidul iniţial care poarta rezistenţa la antibiotice (tetra şi ampicilina) se incorporeaza fragmentul ADN străin pe locul unuia din cei doi markeri, eliminADN markerul respective(de obicei se elimina gena tetra şi ramane cea pentru ampicilina in momentul taierii lanţului ADN de atre enzimele de restricţie. 3.Testarea celulor bacteriene supuse procesului de transformare. Aceasta testare se face cu scopul de a controla daca celula bacteriana a incorporate respectivul plasmid recombinant. În acest sens, bacteriile transformate (cele care au primit vector+ADN) se testeaza pe un mediu de cultura cu ampicilina; vor supravieţui numai acele celule bacteriene care au caştigat rezistenţa la ampicilina, prin acceptarea plasmidului recombinant, purtatorde gena pentru ampicilina (rezistenţa la ampicilina). Din aceste bacterii cu vectori recombinant, însămînţate pe mediu de cultura cu ampicilina vor creşte colonii bacteriene, din care fiecare va reprezenta o clonă. 4. Selectarea celulelor bacteriene purtătoare de vector recombinant. Selectarea acestor celule purtătoare de plasmid cu ADN străin încorporate şi diferenţierea lor de celule (clone) fără ADN străin se face prin însămînţare, prin replica

280

plating, a coloniilor bacteriene pe un mediu cu tetraciclina; pe acest mediu vor supravieţui doar clonele care nu conţin nici un fragment de ADN străin (celule rezistente la tetraciclina). Tip sticky=enzime care taie cele două lanţuri ale helixului dna în mod franjurat datorită faptului ca şi-au pastrat gena purtatoare de aceasta rezistenţă (este vorba de plasmidul “gol” fără ADN străin ataşat), în timp ce clonele care au pierdut gena de rezistenţa la tetra (în momentul legării plasmidului de ADN STRĂIN), prin formarea unui plasmid recombinant, nu cresc pe acest mediu. Abia din acest moment se poate studia mai departe clona care conţine fragmentul ADN dorit, printr-o tehnică de hibridizare speciala, şi anume prin hidibridizare colonială. B. Biblioteca genomica ADN (secvenţe de exoni+introni) Dacă genomul unui organism este secţionat cu enzime de restricţie, iar diferite fragmente de ADN sunt clonate (în celule bacteriene), se va obţine un numar de clone corespunzADN diferitelor amestecuri (vector plasmidic+segment ADN). Totalitatea acestor clone rezultate din genomul unui organism iniţial reprezintă biblioteca genomica ADN. Acest mod de clonare, care duce la formarea unei biblioteci genomice ADN prin tăierea genomului (cu ajutorul enzimelor de restricţie) potrivit principiului întamplării şi prin unirea fragmentelor rezultate, reprezinta tehnica “împuşcarii” (shotgun). Clona ADN genomica a unuia şi aceluiaşi organism este totdeauna identical şi independenţa de tipul celular, deoarece toate celulele aceluiaşi organism posedă o înzestrare genetică identical.Din aceasta biblioteca se obţin secvenţe ADN necesare pentru tehnica de hibridizare; acestea vor fi folosite drept secvenţe ADN cu rol complementar (cu secvenţe ADN cunoscute), in vederea identificarii unor fragmente ADN noi, necunoscute, a caror secvenţe nucleotidice trebuie cercetare şi identificate. Clonele genomice ADN vor conţine atat secvenţe de introni, cît şi exoni, corespunzătoare genomului celulei respective de origine. Clonele din biblioteca genomica ADN se folosesc pentru: - cercetarea structurii complete a genelor; - cercetarea structurii exonilor şi intronilor; - cercetarea secvenţelor reglatoare. C. Biblioteca ADNc (ADN copie dupa matriţa de ARNm matur) Reprezintă doar o informaţie pură formată numai din secvenţe de exoni.Spre diferenţa de biblioteca genomica ADN, care rezultă din clonarea de fragmente ADNc se sintetizează artificial în laborator, pe o molecula de ARNm matur, drept copie complementară (în prezenţa enzimei reverstranscriptaza). Produsul acţiunii acestei enzime va fi o molecula mixta (hibrid): ARNm-ADNc. Din acest hibrid, lanţul dublu ADNc se va forma din acest lanţ unic ADNc, prin doua posibilităţi: în prezenta ADN-polimerazei (Klenow= ADN-polimeraza I extrasa din celula de Esch.coli); în vectori; vectorii recombinaţi(vector+ lanţ unic ADNc) vor determina ulterior formarea de clone bacteriene ADNc. În timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate celulele aceluiaşi organism, clonele ADNc sunt diferite pentru diferitele tipuri de celule ale aceluiaşi organism.În fiecare tip de celule, aceluiaşi tip de ADN genomic îi corespund alte gene active (exoni), ceea ce înseamnă ca în fiecare tip de celule poate apare un alt tip de ARNm matur, astfel încat, aceluiaşi organism, biblioteca ADNc rezultata variaza de la un tip celular la altul. Clonele din biblioteca ADNc se folosesc în special în scopul analizei directe a secvenţelor de baze care codifica un anumit aminoacid sau produsul proteuc final (codificat de respectivul fragment ADNc). Secvenţa clonelor ADNc este studiată în special prin experimentele de hibridizare. Astăzi, în terapia bolilor tumorale se intrevede posibilitatea identificarii şi distrugerii tintite a anumitor molecule ARNm, care induc translaţia informaţiei pentru sinteza unor substanţe oncogene. 281

Cu ajutorul experientelor de clonare s-a reuşit citirea de secvenţe de ADN de pe lanţul ADN al genomului unui organism.Pasul urmator îl reprezintă obţinerea unor modificariale acestor segvente ADN, cu ajutorul unor tehnici de inginerie genetică (procese artificiale de recombinare ADN), cît şi introducerea acestor segmente astfel modificate de ADN în celule sau organisme, unde aceste modificări urmeaza a se exprima.

12. 5. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) A fost numită de Lederberg, în 1993, “instrumental pentru democratizarea biologiei moleculară”.Această reacţie dă posibilitatea ca dintr-o mixture de ADN să poata fi “pescuită” o singura moleculara de ADN, şi aceasta sa fie ulterior amplificata enzimatic, cu mijloace tehnice relative simple. Spectrul de aplicabilitate al PCR este foarte larg: de la medicina judiciara, diagnosticarea bolilor genetice pînă la “vanarea” şi identificarea de noi virusuri şi studii de ecologie şi arheologie (studiul ADN-ului) din fosile. PCR este folosită pentru cercetarea unor cantităţi foarte mici de ADN dintr-un produs biologic. Avantajele acestei reacţii sunt urmatoarele: fiind foarte sensibilă, reacţia poate pune în evidenta chiar şi prezenţa unei singure molecule de ADN, in probele de cercetat (produs biologic), deoarece reacţia ofera posibilitate multiplicarii (clonarii) ADN-ULUI chiar şi in afara celulei vii; reacţia permite chiar şi multiplicarea unei singure secvenţe de ADN. Astăzi exista masini automate (Thermai Cycler) pentru realizarea unor asemenea reacţii repetate; o multiplicare suficienta de secvenţe de ADN este reprezentata de minimum 25 de cicluri de multiplicare; într-o masina automata se desfaşoara 30 de cicluri într-un interval de 4 ore. A. Principiul reacţiei. Se foloseşte drept matriţa un ADN monocatenar. În condiţii de laborator în vitro, pe acest lanţ unic de ADN se poate sintetiza un lanţ complementar cu ajutorul ADN-polimerazei şi în prezenta unui oligonucleotid (15-20 nucleotide) primer (armorsa). Pentru a porni sinteza noului lanţ ADN pe un lanţ ADN matriţa, ADN-polimeraza necesită prezenta pe matriţa a unui oligonucleotid primer cu capatul 3’-OH liber; la acest capăt urmeaza a se fixa nucleptidele ADN care vor forma noul lanţ. B. Efectuarea reacţiei PCR poate porni de la punctul a sau b. a. ADN genomic dublu lanţ (de cercetat) izolat din celule şi tăiat în fragmente cu ajutorul enzimelor de restricţie corespunzătoare; b. Lanţ unic de ADNc, sintetizat în prealabil prin trascriere inverse a ARNm. La capatul 3’ al lanţului ADNc se ataşeaza o coada de nucleotide-guanina cu ajutorul enzimei trasferaza terminala.Urmeaza desfaşurarea PCR cu doi primeri diferiţi utilizaţi simultan, câte unul corespunzator pentru fiecare lanţ ADN (rezultat din ADN-ul dublu lanţ denaturant). Dintre cei doi primeri, primul primer este nucleotide-timina, al doilea primer este nucleotide-citozina. Etapele reacţiei; ƒ denaturarea ADN-ului genomic (izolat din celule) dublu lanţ sau ADNc (sintetizat cu ajutorul unei molecule de ARNm) la temperature înalta (95 grade C).Acest ADN conţine secvenţe care urmeaza a fi multiplicate (amplificate); ƒ dupa scăderea temperaturii se adaugă primerul în exces. În aceste condiţii fixarea primerului pe ADN-ul unic lanţ reprezintă un proces de hibridizare ce are loc la temperature scăzuta (36-65 grade C). Primerul delimiteaza capatul iniţial al fiecarei din cele doua secvenţe ADN unic lanţ (rezultate din denaturarea ADN-ului dublu lanţ) de multiplicat. Adaosul de primer se face în exces, pentru a se obţine o hibridizare primer 282

lanţ unic de ADN şi nu o hibridizarea între lanţurile unice de ADN rezultate din denaturare. ƒ reacţia de sinteza a noului lanţ ADN cu ajutorul ADN-polimerazei, în prezenta celor 4 tipuri de nucleotide ADN (adenine/timin/guanine/citidin deoxi-nucleozid trifosfat) pornind de la locul de fixare a primerului. ADN-polimeraza se leagă de capatul 3’ al primerului şi sintetizează noul lanţ în direcţia 5’->3’, folosind drept matriţa segmentul ADN lanţ unic de amplificat.Primerul va fi încorporate în noul lanţ de ADN format.În acest fel lanţul de ADN este dublat şi, o data cu acesta, un ciclu de PCR este terminat. ƒ începe un nou ciclu cu denaturarea de aceasta dată a ADN-ului dublu lanţ nou sintetizat (în treapta anterior anterioara); mai departe, acest nou ciclu si acest ADN nou-sintetizat (prin sinteza mijlocita de ADN-polimeraza); ƒ cu fiecare nou ciclu ( de denaturare/sinteză a ADN-ului) va fi dublata cantitatea de ADN rezultata din ciclul anterior. Pentru sesizarea eventualelor erori sau neajunsuri ale reacţiei PCR, se recomandă; - repetarea de mai multe ori a respectivei reacţii pentru aceeaşi probă; - reacţia PCR sa fie însoţită, de fiecare dată, de controale negative. C. Polimeraza utilizată în PCR. În anii 1980, se folosea ADN-polimeraza Klenow (fragment de ADN-polimeraza I de la e. coli); fiind termolabila, această enzima a fost apoi înlocuită cu o ADN-polimeraza ternostabilă, izolată de la o bacterie termifila Thermus acquaticus. Aceasta ADN-polimeraza a fost numită Taq-polimeraza. Taq-polimeraza este stabila până la 95 grade C. La fiecare nou ciclu al PCR se adaugă Taq-polimeraza proaspătă.Optimum de activitate al acestei enzime este la 75-80 grade C; această activitate scade cu 50% la 60 grade C şi cu 90% la 37 grade C. Dacă pentru PCR denaturarea ADN-ului se face la 95 grade C, noul adios de Taqpolimeraza declanşeaza de fiecare dată ciclu următor de sinteza ADN. În acest fel, se poate efectua reacţia în care toţi reactivii se pun de la început în recipient I până la sfarşitul reacţiei nu mai trebuie adaugate noi cantităţi. Utilizarea Taq-polimeraza a făcut posibilă automatizarea totala a acestei produceri în maşinile Thermal Cyclers. În condiţii normale, cu ajutorul Taq-polimerazei se pot efectua consecutive 40 de cicluri PCR, obţinându-se o amplificare ADN de ordinal 10 la puterea 6-10 la puterea 7. Dacă se urmareşte o amplificare ADN mai mare decât cea corespunzatoare la 40 de cicluri PCR, trebuie începuta o noua serie de cicluri, cu ajutorul ADN-ului amplificat, obţinut şi diluat de 1000-10000 de ori. În acest fel, cu ajutorul a doua serii câte 40 de cicluri PCR, se poate obţine o amplificare de 109 a cantitaţii de ADN. Pentru o multiplicare sufienta de secvenţe ADN sunt necesare 2530 de cicluri de reacţii automatizate, care se efectuează, dupa cum am mai arătat, în aproximativ 4 ore. D. Amplicabilitatea practica a PCR-ului. Produsele ADN obţinute prin PCR sunt separate electroforetic în funcţie de dimensiuni, sub forma de benzi, în gelul de electroforeza, iar apoi benzile sunt făcute vizibile, în lumina U.V. prin tratarea prealabilă a gelului cu etidiumbromid. Apoi se realizeaza hibridizarea ADN-ului cu sonde genetice specifice prin metoda Souther Blotting. PCR are un spectru de aplicabilitate foarte larg. a) În diagnosticul medical. În acest scop. ADN-ul extrage din celule proaspat lizate şi din celule fixate şi inglobate în parafina. ADN-ul astfel extras este supus reacţiei polimerazei în lanţ şi apoi analizat cu ajutorul sondelor genetice prin reacţia de hibridizare. PCR este utilizat în: diagnosticul bolilor ereditare (fibroza chistica, anemia Cooley, distrofia musculara Duchenne, fenilcetonuria). Diagnosticul bolilor ereditare, graţie PCR-ului, se poate face şi prenatal, în făt, prin determinarea ADN-ului din celulele trofoblastice; prin aceasta metoda se poate face 283

determinarea prenatal pentru sexul copilului şi se poate pune şi diagnosticul unei eventuale boli genetice. În urma recoltarii de lichid amniotic este supus determinarii cu ajutorul PCRului sau al anticorpilor monoclonali, în acest fel fiind posibila determinarea de defecte genetice cromozomiale, metabolice (enzimopatii). diagnosticul bolilor infecţioase. Diagnosticul infecţiei HIV cu ajutorul PCR-ului se poate face în stadiile prococe ale infecţiei, prin identificarea prezentei acidului nucleic viral în sânge (şi anume acidul nucleic viral fixat în genomul celulei limfocitare umane), atunci când toate celelalte reacţii serologice sunt înca negative.PCR poate da un rezultat precoce pozitiv chiar şi în prezenţa unei singure celule infectate cu HIV ( din materialul de cercetat ). Introducerea diagnosticului rapid al infecţiei HIV prin PCR este astazi absolut necesara în practică, în special în investigarea donatorilor de sânge şi de organe. Pentru diagnosticarea infecţiei HIV într-o encefalita declanşată de acest virus, nu este necesara o proba de ţesut cerebral, ci este suficienta doar o proba de LCR. În general, pentru un diagnostic prin PCR, recoltarea de probe reprezinta un stres minim pentru bolnav; în acest caz se folosesc drept probe; spalatura bucala (cu celule epiteliale), epitelii de fir de par, probe uscate de sânge. PCR mai este utilizat în diagnosticul urmatoarelor boli infecţioase: hepatita virala, infecţia cu virus herpes simplex, virus Epstein-Barr,virus papollima, Mycobacterium tbc., Pneumocistis carinii, Neisseria meningitides, Clostridium difficile. Recent, cu ajutorul reacţiei PCR au fost efectuate studii genetice asupra tulpinei de Vibro cholerae grup 0139 (izolata pentru întaia oara, pe glob, în 1992-1993, în Bengal), reuşind sa se demonstreze ca această tulpina ar reprezenta rezultatul unor modificări genetice suferite de tulpina Vibrio cholerae grup 01 biotip eltor, prin deletia, de pe ADN-ul cromozomial, a unui segment de 22 kb, concomitant cu inserţia unui segment nou de 35 kb. PCR este utilizat şi în identificarea unor germeni microbieni ramaşi până astăzi necultivabili, de exemplu în boala Whipple. Boala Whipple a fost semnalată pentru întâia oara în anul 1907; este primul exemplu din partologia umană în care s-a emis ipoteza prezenţei posibile a unei bacterii necultivabile, imposibil de identificat prin posibilitaţile clasice cunoscute. S-au postulat apoi şi alte boli de etiologie posibil microbiana fara a fi însa posibilă evidenţierea prezenţei unor microorganisme, probabil microbiană fără a fi însa posibilă evidenţierea vizuală, în aceste cazuri fiind necesare alte metode decât cultivarea pe medii de cultura, pentru detectarea şi identificarea agenţilor patogeni. Noile metode îşi au rădăcinile în filogenetica moleculara. Boala whipple se manifesta clinic prin astralgii migratorii, febra, dureri abdominale, diaree, pierderi în greutate, apariţia în ganglionii mezenterici de infiltrate macrofagice proeminente, depozite de grasime. b. În medicina judiciară PRR este folosit pentru evidenţierea identităţii unui fir de părsau a unei cantităţi foarte mici de sânge sau spermă. Astăzi PCR poate fi folosită în combinaţie cu metoda fingerprinting în aceleaşi scopuri. c. În studii ecologice Cu ajutorul PCR s-a reuşit evidenţierea unui număr de microorganisme în probe de pământ şi apă; au fost analizate microorganisme care până astăzi nu au putut fi cultivate pe medii de cultură, cât şi microorganisme de sol care au suferit în timp modificări genetice. d. În arheologie PCR a fost utilizată până în prezent şi pentru analiza ADN provenit din mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani.

284

12. 6. SECVENŢIEREA ADN- ului Analiza structurii ADN a început o dată cu anii '70, cu ajutorul metodei de secvenţiere ADN şi de analiză a secvenţelor nucleotidice din aceste structuri. Acest studiu a fost posibil datorită folosirii enzimelor de restricţie (endonucleaze), care pot tăia moleculele de ADN în fragmente de cîteva sute până la câteva mii de perechi de baze. Aceste fragmente obţinute pot fi apoi separate electroforetic şi analizate. La Los Angeles şi la Heidelberg există în prezent bănci de date în care au fost strânse toate secvenţele ADN cunoscute până în prezent. Genomul multor virusuri a fost total secvenţiat. În 1995 a fost terminată secvenţierea completă a primului genom bacterian, cel de Haemophilus influenzae, urmat la scurt timp de cel de Mycoplasma genitalium. Curând vor fi terminate şi secvenţierile complete ale genomurilor bacteriene Escherichia coli, Bacillus subtilis, Methanobacterium thermoautotrophicum. La drojdii (drojdia de bere – Saccharomyces cerevisiae), a fost secvenţiat pentru prima dată un cromozom, şi anume cromozomul III, dovedindu-se că conţine 315 357 perechi de nucleotide şi 200 de gene; la această analiză s-a lucrat trei ani în 35 de laboratoare din lume. Cu ajutorul acestei proceduri s-au obţinut informaţii şi asupra materialului genetic inclus în cele 23 de perechi de cromozomi umani, şi anume: - locul relativ al genelor pe cromozomi; - identificarea unuio număr de gene; - cauzele unor boli genetice. În prezent este în curs de desfăşurare proiectul de cercetare asupra genomului uman, genom care conţine circa trei miliarde de perechi de bze (50 000 – 100 000 de gene). Astăzi se ştie că doar 3 % din genomul uman reprezintă gene funcţionale (exoni), restul de 97 % din genom reprezintă doar „balast genetic” a cărui semnificaţie este încă necunoscută. A. Principiu Secvenţierea ADN (sequencing) înseamnă tăierea lanţului ADN în secvenţe şi analiza ulterioară a secvenţelor de baze nucleotidice din aceste fragmente. Prin descifrarea acestor secvenţe de baze se poate ajunge la delimitarea genelor şi la stabilirea secvenţelor de aminoacizi codificate de o singură genă. Ca urmare, analiza secvenţială a ADN-ului şi, indirect, cea a proteinelor corespunzătoare pot furniza date cu privire la conformaţia proteinei, funcţiei proteice, înrudirii dintre proteine, cât şi asupra bolilor produse prin mutaţii. Secvenţierea ADN este o variantă a tehnicii de recombinare ADN cu ajutorul căreia se poate stabili secvenţa de baze din molecula ADN. Condiţia de baza pentru realizarea acestei secvenţieri este prezenţa unui număr suficient de copii ale moleculei de ADN. Acest lucru se poate realiza prin clonarea ADN sau prin metoda PCR. B. Metode Pentru secvenţiere se folosesc două metode: a. Metoda enzimatică; tehnica Sanger (Chain Termination Tehnique). b. Metoda chimică; tehnica Maxam- Gilbert ( de obicei combinată cu metoda Sanger). a. Metoda enzimatică Tehnica Sanger Principiu: se determină secvenţele de baze nucleotidice pe copia de acid nucleic şi prin complementaritate se deduce secvenţa de baze de pe lanţul de acid nucleic de origine. Etapele reacţiei: lantul dublu de acid nucleic (AN) aste adus la forma de AN unic lanţ; pe lanţul unic AN se fixează un primer (moleculă starter sau amorsă). Acest primer ste un oligonucleotid scurt, preparat semiautomat prin tăiere, cu ajutorul enzimelor de restricţie, a unui fragment ARN. Primerul este stfel selectat încât capătul 3' să se

285

potrivească prin complementaritate, într-un punct, pe lanţul ADN de cercetat. Acest primer este înglobat într-un vector sau secvenţă cunoscută; are loc sinteza lanţului ADN complementar (după modelul matriţei AN) în prezenţa celor patru dezoxinucleotid trifosfaţi (dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dintre care unul este marcat, a unui didezoxinucleotid trifosfat (ddNTP) şi a ADN-polimerazei I sau reverstranscriptazei; sinteza lanţului ADN se va opri acolo unde în locul unui dNTP se va îngloba un ddNTP corespunzător. În acest punct se va opri reacţia polimerazei. Această reacţie de sinteză a ADN-ului se va desfăşura în patru variante, în fiecare din variante fiind marcat altul din cele patru dNTP-uri; cele patru molecule de ADN dublu lanţ obţinute sunt denaturatze prin căldură; lanţul de acid nucleic nou sintetizat cu un nucleotid marcat este separat prin gel elecroforeză; în locul marcării radioactive, fiecare bază este colorată cu altă substanţă fluorescentă. Apoi se face citirea bazelor colorate de pe gelul de electroforeză prin autoradiografie. b. Metoda chimică Tehnica Maxam-Gilbert Spre deosebire de tehnica Sanger, unde determinarea secvenţelor se face pe lanţul copie, prin tehnica Maxam-Gilbert determinarea secvenţelor se face pe lanţul de acid nucleic de origine. Tehica se bazează pe o modificare chimicăaunei baze şi o tăiere specifică la nivelul altei baze (de exemplu adenina), de pe molecula ADN. Aceste reacţii au loc pe lanţul ADN originar. În ultimii ani, în S.U.A. în laboratoarele de Genetică ale Universităţii Berkeley, s-au realizat aparate automate pentru citirea secvenţelor de baze nucleotidice din acizii nucleici cu viteza de 7 000 – 8 000 secvenţe de baze pe zi.

12.7. FINGERPRINTING GENOMIC (amprente de ADN) a. Principiu Pe baza analizelor de secvenţiere a ADN-ului, s-a demonstrat că fiecare individ este caracterizat printr-un fingerprinting genomic (un pattern individual al regiunilor hipervariabile din ADN-ul genomic, şi anume de pe zona ADN- urilor minisatelizate). Genomul uman conţine trei miliarde de perechi de nucleotide, dintre care: ƒ 70 % reprezintă secvenţe unice identice la toţi indivizii; ƒ 30 % reprezintă secvenţe repetitive, şi anume: - înalt repetitive 7 – 10 %; aceeaşi secvenţă de 300 perechi de nucleotide se repetă de 30 000 – 1 milion de ori dispersat, pe toată lungimea genomului; - gene structurale pentru sinteza de ARNt, ARNr şi histone; - zona spacer ce conţine gene criptice (silenţioase); - ADN-uri satelite înalt repetitive, netranscriptibilr, necodificatoare de proteine. ƒ 20 – 30 % moderat repetitive, fiecare secvenţă cu câteva sute până la 6 000 de perechi de nucleotide se repetă în 20 – 30 000 de copii. b.Tehnica RFLP Cu ajutorul acestei tehnici se pun în evidenţă zonele de ADN variabil de la individ la individ. Aceste tipare de fragmente de ADN individual sunt reprezentate de o amprentă RFLP specifcă ( polimorfismul de lungime al fragmentelor de restricţie). Pentru determinarea acestor tipare individuale, se izolează ADN-ul genomic din celulele unui organism (diferite ţesuturi, rădăcini ale firului de păr, sânge, salivă, spermă). Tehnica RFLP cuprinde următoarele etape: - ADN-ul extras este supus acţiunii enzimelor de restricţie; - Fragmentele de ADN (dublu catenar) sunt supuse migrării bidimensionale într-un gel denaturat (conţinând un agent chimic denaturat ca ureea, concentraţie 5 %); 286

-

Benzile de ADN unic lanţ obţinute în gel sunt supuse colorării cu etidiumbromid; Benzile ADN sunt vizualizate prin transiluminare la u.v. Această tehnică evidenţiază atât prezenţa/asenţa fragmentelor de restricţie, cât şi polimorfismul de lungime al respectivelor fragmente. Determinarea RFLP pentru organismele eucariote, inclusiv omul, are semnificaţie, în mod deosebit, în cazul urmăririi transmiterii la descendenţi, a informaţiei genetice parentale (prin compararea fringerprint- urilor între generaţii). În cazul examinării singulare ( a informaţiei genetice per individ), se preferă metoda Southern Blotting a cărei capacitate discriminatorie este considerată mai bună.

c.Tehnica AFLP Această tehnică ce combină principiul analizei RFLP cu cel al reacţiei PCR înalt specifică, detectează numai prezenţa sau absenţa fragmentelor de restricţie, dar nu face şi analiza polimorfismului de lungime a fragmentelor. Tehnica este considerată astăzi metoda universală pentru determinarea prezenţei/absenţei unei anumite amprente de ADN în orice sursă de origine bacteriană, vegetală, animală sau umană. d.Aplicaţii ale metodei amprentelor ADN În medicina judiciară: - în criminalistică; urmărirea criminalului poate fi condusă în funcţie de urmele găsite: amprente individuale prezente în resturi de piele, păr, sânge, spermă. Dacă materialul genetic se află în cantitate foarte mică, se recurge la PCR pentru amplificarea cantităţii de ADN; - diagnosticul paternităţii; având în vedere că variaţiile de ADN- urile minisatelite se moştenesc după legile mendeliene, metoda amprentelor ADN este utilă pentru dovedirea unei înrudiri (amprenta genetică diferă de la individ la individ, se potriveşte în mare parte la rude şi este identică la gemenii univitelini); În medicina clinică - în boli genetice; în analiza de likage şi determinarea instabilităţii genetice; - în oncologie; pentru diagnosticul midificărilor genetice din celulele tumorale de la persoane cu carcinom mamar (se prepară şi se compară amprente de ADN din celulele tumorale/elemente figurate sanguine cu condiţia ca în proba de sânge să nu existe celule modificate oncogen; - urmărirea epidimiologică a circulaţiei agenţilor infecţioşi pentru determinarea patternurilor RFLP la virusuri şi tulpini bacteriene; - stabilirea interrelaţilor virale şi bacteriene pe bază de amprente ADN, în vederea încadrării taxonomice a unor noi agenţi infecţioşi; - prin introducerea tehnicii de fracţionare a segmentelor de restricţie şi separării acestora în gel cu gradient denaturat, se va putea, în viitor, măsura frecvenţa mutaţiilor în genomul uman,se va putea analiza instabilitatea genomului şi a relaţiei acestuia cu senescenţa şi neoplazia, se vor putea realiza analize de linkage şi cartare de noi gene implicate în boli genetice; În biologie - stabilirea paternităţii unor păsări de pradă ale căror ouă au fost clocite de părinţi adoptivi; - stabilirea de relaţii genetice între diferite specii pe baza structurii ADN-ului, acest criteriu fiind superior celui al sistematizării de până în prezent, efectuat pe bază simplelor caractere morfologice; - stabilirea polimorfismului genetic în interiorul aceleiaşi specii (de exemplu, heterozigoţii); - pe baza existenţei RFLP-urilor au fost amplificate şi analizate secvenţe nucleotidice din fragmente ADN provenite de la specii dispărute; În arheologie - s-a analizat ADN-ul provenit de la mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani (prin clonare şi secvenţierea unor fragmente ADN de circa 3400 de baze).

287

Capitolul 13 BIOSENZORII

13.1. Biosenzorii – sisteme de coantificare a informaţiilor viului Problema biosenzorilor este un capitol al biotehnicilor de cea mai mare importanţă –mai ales în ultimii ani—dar şi extrem de complicată şi vastă. De curând, cercetătorii şi tehnicienii cu preocupări în acest domeniu au propus chiar o diferenţiere semantică a acestor sisteme de cuantificare a informaţiilor ce pot fi obţinute în diferitele funcţiuni ale lumii viului. Astfel, a fost propusă o terminologie care să se refere la traductori pentru toate sistemele de înregistrare şi prelucrare a informaţiei ca utilizări şi în biologie; senzori biologici – pentru sistemele naturale ale fiinţelor vii (organe de simţ: văz, auz, pipăit etc.) iar termenul de biosenzori să fie atribuit generic oricărui sistem simplu sau mixt (natural sau construit de om) care să înregistreze la nivel micro informaţia circulantă într-un sistem viu. Domeniile de studiu primar pentru a cunoaşte sau a fabrica aceşti biosenzori sunt biochimia, biofizica şi biocibernetica, precum şi alte ştiinţe antecesoare acestora, inclusiv microtehnologiile speciale din domeniul micromecanicii şi microelectronicii. Ţinând seama de complexitatea acestei problematici, precum şi de evidenta dezvoltare a domeniului biosenzorilor şi a aplicaţiilor acestora în biotehnologii, ne-am propus enumerarea principalelor tipuri de biosenzori moderni şi tradiţionali: - senzori piezoelectrici, potenţiometrici, amperometrici, electrochimici; - senzori enzimatici amperometrici (monoenzimatici şi dienzimatici, mono- şi multi strat): metabolici, pentru glucoză, galactoză, gluconat, lactat, piruvat, alcooli, fenoli, amine, coresterol, acizi nucleici, aminoacizi etc.; - senzori care au la bază reacţii de tip imunitar: cu dispozitiv membranar, cu pierdere de reacţii, imunosenzori optici; - senzori cu receptori. Dintre aplicaţiile biosenzorilor, enumerăm: - utilizarea biosenzorilor pentru laboratoare clinice şi chimice; - monotorizarea permanentă a pacienţilor cu senzori implantaţi; - inregistrarea glucozei în sânge; - măsurarea de ureii din rinichiul artificial; - analiza produselor alimentare; - controlul proceselor în industria microbiologică şi în protecţia mediului. Determinarea selectivă şi cu sensibilitate mare a unui număr crescut de combinaţii are o deosebită importanţă, atât pentru cercetare, cât şi pentru diferite ramuri ale economiei, de exemplu supravegherea producţiei în industia chimică şi alimentară. În domeniul medical, această metodă este de neînlocuit în stabilirea diagnosticului bolnavilor. De asemenea, în biotehnologie este necesară, printre altele, pentru analiza componentelor mediilor de cultură. O dată cu progresele remarcabile din domeniul analiticii instrumentale, de exemplu cromatografia gazoasă, cromatografia fluxului de lichid (fluidităţii) la presiuni ridicate, măsuri spectrometrice şi spectroscopia absorbţiei atomice, în combinaţie cu microelectronica, s-a ajuns la obţinerea unei înalte selectivităţi în microanalitică. Aceste metode sunt, datorită costurilor ridicate, implementate doar în cadrul laboratoarelor. Cu toate acestea, dezvoltarea măsurătorilor de investigaţie selective şi uşor de manevrat reprezintă o problemă cheie a analiticii. 288

Într-o primă parte dorim să facem o analiză a unor probleme şi în acelaşi timp un studiu paralel care să, includă date ştiinţifice de activitate relatate de specialişti care au lucrat nemijlocit la această problemă. Ne bazăm, în realizarea calitativă a analizei şi sintezei propuse, pe experienţa didactică şi de cercetare dar şi pe o bogată bibliografie adunată în timp, cu precădere în ultimii 7-8 ani.

13.2. Impactul informaţional al biosenzorilor Ştim din ce în ce mai exact felul în care sistemul genetic stochează şi distribuie informaţia, sistemul neuro-endocrin crează şi manipulează informaţia, sistemul imunologic prelucrează şi utilizează informaţia, într-un cuvânt, pe măsură ce timpul se desfăşoară iar numărul populaţiilor biologice creşte, se eliberează în proporţie geometrică informaţia care caracterizează dinamica atât a. sistemelor vii cît şi a celor considerate neînsufleţite. Se creează fireşte, necesitatea recepţionării cât mai complete şi mai exacte a acestei forme de existenţă a universului, recepţionată de om drept componentă a tetradei care descrie o formă de echilibru substanţă-energie-informaţie-timp.Tot atît de firesc, apare interesul omului pentru abţinerea unor captatori cît mai fideli ai informaţiei primite de la diferite sisteme vii sau nevii, nevoia de a avea senzori sensibili şi fiabili pentru orice demers în domeniul cunoaşterii. Dacă cu mulţi ani în urmă, senzorii îmbrăcau forma instrumentaţiei utilizată în laboratoare pentru cercetări experimentale, în prezent aria preocupărilor în vederea obţinerii unor date dinamice în studiul proceselor a conturat în profunzime imaginea despre utilitatea şi importanţa senzorilor. Cercetările de bionică au adus noi clarificări privind simularea şi extrapolarea senzorilor naturali (din organele de simţ) cu posibilităţi de utilizare nu numai în biomedicină dar şi în dirijarea unor procese industriale. Dezvoltarea roboticii a crescut şi mai pregnant importanţa senzorilor, în vederea dotării roboţilor cu asemenea capacităţi de orientare şi de lucru. Senzorii optici bazaţi pe microcamere TV au fost suplimentaţi cu sisteme de recunoaştere a formelor şi imaginilor albnegru şi color precum şi cu analizori termici. O altă serie de aparate au fost concepute pentru prevenirea incendiilor sau decelarea fenomenelor de poluare sau de toxicitate în mediul înconjurător. Dezvoltarea automaticii a solicitat intens crearea unor noi sisteme de culegere rapidă a informaţiei. Aceste preocupări, departe de a rezolva toate problemele, au creat o serie de noi întrebări atât la nivelul utilizatorilor cât mai ales a specialiştilor. Iată succint, spre exemplificare, câteva din acestea. - Informaţia este delimitată strict şi poate creşte prin adiţionare sau este holografică? - Semnalele conţin informaţie. Sunt suport al informaţiei sau sunt catalizatori ai informaţiei cognoscibile? - Emiterea sau culegerea informaţiei este uniformă sau periodică? Acţiunea sa asupra receptorilor este ritmică sau continuă? - Natura este mai bogată astăzi în informaţie liberă, circulantă, decât acum 1 milion de ani? - Raportul dintre cantitatea totală de informaţie existentă şi utilizată este constant? - Creşterea utilizării informaţiei şi necesitatea cuprinderii sale de către sistemul nervos uman, poate genera, peste anumite limite, o patologie specifică? - Impactul psihologic între necesitatea şi obligaţia de a consuma mereu mai multă informaţie şi nevoia de adaptare a omului la lumea informaţională, creează noi probleme? Lista acestor întrebări poate continua iar răspunsurile sunt departe de a fi complete. Dacă în domeniul tehnologiilor se pare că eforturile pot fi suficient determinate, în domeniul cunoaşterii biologice şi medicale curiozitatea şi motivaţiile sunt din ce în ce mai puternice, ceea ce i-a făcut pe mulţi să afirme că secolul următor va fi secolul biologiei. Ştiinţa şi industria computerelor a făcut un mare pas înainte când pe lângă hard-ware şi soft-ware a adăugat brain-ware. 289

Această triadă deschide de pe acum posibilităţi nebănuite puterii de calcul şi stocare în informatică. Modelul biologic pătrunde impetuos în tehnică. Cu puţin timp în urmă au apărut primele biocipuri. Acum ele se perfecţionează rapid, apărând noi componente având ca suport materia vie. S-a născut un nou domeniu, biosenzorii - bioizi din ce în ce mai perfecţionaţi. Ca în orice domeniu, culegerea şi prelucrarea informaţiei se face etapizat pe mai multe nivele structural-energetice, intensitatea semnalelor şi informaţiilor culese fiind în funcţie de capacitatea receptorilor de a vehicula pe canalele specifice fluxul informaţional. În acest context, senzorii construiţi de om se supun legilor naturale descrise de chimiafizică, fiind de fapt modele ale aplicaţiilor curent utilizate de cercetările biofizice. Fiabilitatea lor este relativ mare dar aproape în totalitate determinată de tehnologiile utilizate. În ceea ce priveşte senzorii naturali biologici (tactili, vizuali, auditivi etc.), calitatea informaţiei prelucrate este dependentă de structura anatomo-fiziologică, de sensibilitatea şi modelele fixate repetitiv pe sistemele de memorare ale organismelor vii. Condiţionarea genetică joacă un rol determinant în acest caz. Dacă ne referim la achiziţiile dobândite în cadrul dezvoltării ontogenetice şi filogenetice, gradul de diferenţiere a prelucrării şi utilizării semnalelor din mediul intern şi extern este diferit în funcţie de complexitatea organismului studiat, pe scara biologică. La om, integrarea psiho-neuro-endocrino-imunologică complică procesul de înţelegere al mecanismului şi modului de acţiune selectiv a senzorilor biologici. Cu toate acestea, cercetarea ştiinţifică actuală încearcă să elucideze separat sau integrat modul de acţiune al circulaţiei pe canale informaţionale a vectorilor semnalelor stimulatori sau inhibitori la nivelul diferitelor verigi biocibernetice. Variaţia rapidă, în timp a acestor fluxuri informaţionale constituie un impediment destul de serios al cunoaşterii reale, în timp util, a principalelor căi şi modele reale în care selecţia informaţională acţionează. Pe măsură ce coborâm la nivele de organizare mai profunde, cantitatea de informaţie deşi aparent scade, este mult mai densă, dar diferenţiat, cuantificarea energeticoinformaţională este mai greu de realizat pentru cercetători. În aceste situaţii aparatura de măsurare întâmpină greutăţi din ce în ce mai mari începând cu selecţia semnalului din zgomotul de fond şi înlăturarea bruiajelor şi până la obţinerea unor valori individualizate care pot fi interpretabile sau pot constitui valori de referinţă. Fără îndoială că natura a creat o multitudine de biosenzori care rezolvă pe plan biologic aceste probleme. Tehnologia din momentul de faţă nu este însă suficientă pentru a ne oferi rezolvări concrete şi acest fapt face să considerăm că elaborarea şi cunoaşterea biosenzorilor se află încă în domeniul pionieratului. În momentul de faţă, sunt întreprinse cercetări aprofundate privind reglarea schimburilor la nivelul membranelor celulare, al modului de acţiune al microbiocurenţilor, a electricităţii „chimice" a enzimelor de restricţie şi recombinare, a cunoaşterii algoritmului de modificare a raporturilor de electroliţi şi a pompelor ionice, a biocomunicării şi modificarea câmpurilor ce acţionează în sfera biologicului, a efectelor de fineţe din interacţiunea macrocosmos şi microcosmos. Mintea umană încearcă un efort de autodepăşire în înţelegerea unor variante noi matematico-logice de utilizare de noi limbaje, utilizând probabilităţi neinvestigate încă, în efortul de a depăşi experimentalul posibil şi în speranţa de a deschide noi ferestre în domeniul cunoaşterii.

13.3. Metodologia de cercetare a proprietăţilor senzorilor biologici Sensibilitatea oricărui sistem de măsură este condiţionată în mare măsură de calitatea traductoarelor utilizate. Traductoarele clasice (cele inductive, capacitive, rezistive etc.) au intrat în competiţie cu o nouă clasă de traductoare, traductoarele biologice. Utilizarea unui organism viu sau a unei 290

porţiuni din acesta (ţesut, celulă, enzimă), în scopul obţinerii unor informaţii asupra mediului înconjurător nu este o idee nouă. Ea a apărut pe la începutul secolului, prin cercetările efectuate de exemplu, de fizicianul C. Bose, dar a căpătat o dezvoltare explozivă doar în ultimii ani, când tehnica de calcul şi progresele tehnologice au permis-o. Deşi rezultatele obţinute au depăşit faza de laborator, extinderea pe scară largă a acestor senzori este încă limitată, atât de considerente de ordin tehnologic, cât şi de dificultăţile pe care aceşti senzori le pun în faţa cercetătorilor privind stabilitatea şi reproductibilitatea semnalelor preluate. Tendinţa de abordare globală a interacţiunilor unui biosenzor cu mediul înconjurător,în sensul deschiderilor şi intra-deschiderilor pe care o manifestă, se loveşte de cele mai multe ori de o inconsecvenţă în metodologia experimentală în care metodele clasice nu sunt organic integrate cu cele noi apărute. Majoritatea studiilor efectuate asupra utilizării senzorilor biologici în măsurătorile fizice, vizează îmbunătăţirea performanţelor aparatelor de măsură, în sensul creşterii-sensibilităţii şi selectivităţii faţă de mărimile măsurate. Substratul biologic utilizat este de cele mai multe ori o parte specializată dintr-un sistem viu, fapt ce determină o reducere a interacţiunilor pe care partea o are în cadrul întregului, şi deci, permite abordarea mai simplă a metodelor de interpretare. În momentul de faţă numeroase măsurători din domeniul chimiei beneficiază de aceasta categorie de traductoare. Tehnologia actuală permite izolarea unor enzime şi implementarea lor în sisteme de măsurare oferind acestora sensibilitate şi selectivitate ridicată, răspuns la stimul uşor de recunoscut, la un preţ de cost scăzut. Preluarea unor semnale electrice de la părţi ale unui organism viu, deşi beneficiază de avantajul selectivităţii specifice unui organ specializat, ridică o serie de probleme, cum ar fi tehnica de prelevare fără traume esenţiale, asigurarea condiţiilor de viaţă pe durata cât mai lungă a porţiunii prelevate, tehnica de implementare a electrozilor şi natura materialului din care se execută aceştia, în vederea reducerii perturbaţiilor în funcţionarea porţiunii prelevate. Chiar dacă se asigură toate condiţiile de mai sus partea prelevată nu va beneficia de interacţiunea sa cu întregul sistem, motiv pentru care răspunsul obţinut poate fi diferit sau deformat. De exemplu, se cunoaşte că răspunsul electric al unei fibre nervoase este diferit la măsurătorile în vitro faţă de cele „in vivo”. Din acest motiv se consideră o variantă posibilă de utilizare ca senzor biologic a unui organism întreg, ,problema revenind în a se determina zona sau punctele de măsură şi metodologia de interpretare a rezultatelor în funcţie de tipul şi de natura interacţiunii urmărite a se măsura. Dacă se ţine seama de necesitatea imobilizării pe durata măsurătorilor a organismului viu, se poate aprecia că planta poate răspunde cel mai bine acestei cerinţe (imobilizare naturală).

13.4. Aparatura de măsurare Cunoaşterea influenţei aparaturii de măsura asupra senzorului biologic este esenţială în sensul reproductibilităţii măsurătorilor efectuate. Ea trebuie judecată prin prisma caracteristicii puternic neliniare a interfeţei organism-mediu, majoritatea măsurătorilor implicând aplicarea,pe suprafaţa organismului viu a unor electrozi şi conectarea acestora la un sistem electronic de măsurare. Mergând mai spre concret, se constată, de exemplu, că membranele biologice (i) prezintă o caracteristică neliniară a curbelor tensiune-curent. Caracteristica măsurată scoate în evidenţă două aspecte deosebite: asimetria (valorile curentului în cele două sensuri nu sunt egale pentru o aceeaşi tensiune aplicată); prezenţa unor zone de rezistenţă negativă (fig.153).

291

Fig. 153 Curba caracteristică tensiune – curent Cercetările efectuate asupra utilizării plantelor ca senzori biologici au scos în evidenţă o dinamică a acestor curbe, în special în sensul variaţiei zonei de rezistenţă negativă. De asemenea sa constatat existenţa pe suprafaţa frunzelor a unor puncte de rezistenţă electrică scăzute, asemănătoare prin modul de identificare cu punctele de acupunctură. Spre deosebire de acestea ele sunt grupate în zone pe suprafaţa frunzei, neidentificându-se o lege de amplasare.

13.5. Posibilităţi de folosire a biosenzorilor în biotehnologie Procesele biotehnologice sunt folosite tot mai des în practică pentru a obţine produse utile. Pot fi realizate noi industrii de înaltă eficienţă, dar pentru aceasta este necesară o reglare sigură a sistemelor folosind modele matematice adecvate şi o informaţie cât mai completă asupra lor. Dacă practic mărimile fizice pot fi măsurate cu succes, în schimb parametrii chimici intercelulari sunt mai dificil de măsurat; biodetectorii (biosenzorii) trebuie să rezolve această problemă. Biosenzorul poate fi definit ca dispozitiv (de regulă electronic) ce foloseşte molecule de interes biologic pentru a detecta molecule specifice. Poate consta dintr-un biocatalizator imobilizat şi dintr-un aparat fizico-chimic care transformă informaţia chimică într-un semnal electric. O primă clasificare a unor biosenzori: - senzori enzimatici; - senzori microbieni; - imunosenzori (ca antigeni şi anticorpi); - senzori ca organite celulare. Senzorii enzimatici conţin o enzimă determinată, care este imobilizată după o tehnică convenabilă şi un senzor fizico-chimic corespunzător. Enzima reacţionează selectiv cu substratul său, măsurându-se astfel concentraţia de substrat. Stabilitatea enzimei este foarte importantă pentru realizarea măsurătorilor. Imobilizarea de enzime şi celule pe purtător s e face cu metode fizice şi chimice. Prin metode chimice se realizează legătura covalentă între e n z i m a şi substrsatul solid. Imobilizarea este ireversibilă. În cazul metodelor fizice imobilizarea este reversibilă. Sunt folosite membranele semipermeabile, mai ales la construirea biosenzorilor electrochimici. În prezent, din circa 2000 de enzime, numai 30 sunt de interes comercial. Î n j u r de 500 sunt oxidoreducătoare, catalizând reacţii c u cedare de electroni; sunt cunoscute circa 50 de oxidaze, folosite în tandem cu electrodul Clark pentru măsurători amperometrice de concentraţii pentru diferite substanţe. În biofermentoare folosirea biosenzorilor este dificilă din motivul c ă nu pot fi sterilizaţi termic ş i chimic, nici cu radiaţii şi n i c i printr-un alt procedeu. Din aceste motive, nu sunt direct folosibili î n aceasta arie tehnologică. De asemenea, stabilitatea electrozilor enzimatici 292

nu este suficientă pentru măsurători de lungă durată. Inhibitorii din substratul de fermentaţie induc erori mari de măsurare. Senzorii microbieni constau din microorganisme imobilizate într-un suport poros; aceste microorganisme conţin enzime de interes. Senzorii microbieni construiţi pe un principiu electrochimic pot fi împărţiţi astfel: - senzori cu determinarea amperometrică a activităţii respiratorii; - senzori cu determinarea amperometrică sau potenţiometrică a metaboliţilor (substraturi electroactive). O clasificare a biosenzorilor după metoda folosită în prelucrarea informaţiei prelevate de aparate fizico-chimice ar putea fi următoarea: - biosenzori bazaţi pe metode electrochimice; - biosenzori cu procese de combustie; - biosenzori electromagnetici; - biosenzori optici; - biosenzori electronici. Biosenzorii electrochimici au la bază un electrod chimic selectiv. Se determină selectiv o substanţă care apare în reacţia biochimică. Dăm ca exemplu electrodul de glucoză (fig. 154).

Fig. 154 - Schema unui biosenzor electrochimic cu electrod de glucoză 1 – catod; 2 – anod; 3 – membrană de acetat de celuloză; 4 – membrană cu enzimă imobilizată; 5 – membrană de policarbonat. Glucoza difuzează prin membrane (5) cu grosimea de 5 µm şi cu p o r i de 0,03 µm care blochează enzime ş i coloizi care ar deranja zone de reacţie. Când glucoza ajunge în stratul de mijloc se formează H202, proporţional cu viteza de difuzie a glucozei. H202 difuzează la anod şi acolo are l o c reacţia (1). A treia pelicula este o membrană de acetat de celuloză c a r e lasă s ă treacă uşor H202 dar reţine reductori. Curenţii de semnal obţinut de la traductor sunt proporţionali cu concentraţia de glucoză din probă. Sistemul de reacţii se poate schematiza astfel: (1) H202→2H+ +O2 + 2ē (2) 2AgCl + 2ē→2Ag + 2Cl(3) 4Ag + 4Cl- + 02 + 2H20→4AgCl + 40H(4) β+ D-glucoza + 0 2 glucozooxidaza glucono-&-lactoză +H202 Substrat +enzimă ↔ produs+ enzimă oxidată Enzima oxidată + intermediar ↔ enzime + intermediar oxidat + profoni Reacţia la electrod este : Intermediar oxidat ↔intermediar + electroni Ex. de intermediari : (C9H5)2Fe, (OH3C5H4)2Fe, (HOOC C5H4)FeC5H5.

293

Biosenzorii microbieni, folosesc un electrod Clark pentru p02 p r i n c a r e se determină amperometric activitatea respiratorie a microorganismului folosit. În figura 155 este prezentată schema unui electrod de glucoză microbian bazat pe determinarea amperometrică a activităţii respiratorii a celulelor imobilizate de Pseudomonas fluorescens. Fig. 155 - Schema unui electrod de glucoză microbian. 1 – electrod de pO2; 2 – membrană de teflon; 3 – membrană calogenică cu bacterie. Glucoza şi O2, intră în metabolismul bacteriei. Se măsoară consumul de oxigen care este direct legat de concentraţia de glucoză. Timpul de răspuns este destul de lung (circa 10 min). Precizia măsurării este bună, nefiind supărătoare interferenţele cu alte glucide sau aminoacizi. Pentru acest tip de senzori a fost elaborată o metodă în impulsuri, timpul de măsurare scăzând la circa 30 s. Biosenzorii cu produs secundar de combustie se bazează pe măsurarea unei substanţe eliberate într-un proces biochimic enzimatic. Substanţa eliberată este proporţională cu cantitatea de reagent. Ca exemplu, poate fi dat termistorul enzimatic şi microbial (fig. 156). Corpul este prezentat de un calorimetru adiabatic în flux. Prin el trece o soluţie tampon, adusă cu o pompă peristaltică cu 0,5-4 ml/min. Trecând prin schimbătorul de căldură aceasta se încălzeşte până la o temperatură dată. Când într-o astfel de soluţie se adaugă şi proba (0,1-1 ml), în tubul de curgere cu enzima imobilizată sau microorganisme are loc reacţia biochimică. Ca rezultat are loc o cedare de căldură proporţională cu concentraţia de substanţă. Se obţine o diferenţă de temperatură t2 – t1 între temperatura iniţială constantă t1 ─ t2, ca urmare a procesului din tub. Fig. 156 - Termistor enzimatic 1 – termostat; 2 – schimbători de căldură; 3 – termistori; 4 – tub de curgere; 5 – enzimă imobilizată. Metoda se foloseşte pentru măsurători continue. S-au construit termistori enzimatici pentru măsurători de concentraţii în cazul acidului ascorbic, etanol, glucoză, lactoză, penicilina, zaharoză, trigliceride, uree. Biosenzorii electromagnetici au o înaltă sensibilitate şi siguranţă analitică, dar din cauza complexităţii, au încă o aplicabilitate redusă (ex. spectrometrie de masă cu enzime pentru glucoză, glutamat, L-aminoacizi). Biosenzorii electronici utilizează tehnici de imobilizare enzimatică şi microelectronică şi este o direcţie de perspectivă în ce priveşte crearea unor dispozitive de biosenzori miniaturali, foarte sensibile şi multifuncţionale. Tranzistorii cu efect de câmp fac obiectul unor intense activităţi de investigare. Aceşti tranzistori absorb ioni din soluţie prin învelişul ionoselectiv modificând curentul prin tranzistor. 294

Biosenzorii optici s-au dezvoltat sub forma senzorilor ce au la bază reacţii imunitare. Se foloseşte semnalul optic ce apare în timpul reacţiei antigen─ anticorp. Spectroscopia convenţională nu este aplicabilă în acest caz. Senzorii de acest tip au aplicaţii în medicină, independent de, faptul că încă nu s-a atins sensibilitatea determinarilor radioimunologice. În figura 157 se arată schematic senzorul enzimatic electronic cu structura de tranzitor cu efect de cîmp iar în figura 158 este reprezentată schema pe măsură cu un astfel de senzor, precum şi dependenţa curentului prin sursă în funcţie de pH. Cu enzimă imibilizată pe stratul izolator de pe poarta tranzistorului cu efect de cîmp s-a realizat un biosenzor pentru măsurarea ureii, aceticolinei, glucozei etc.

Fig. 157 - Senzor electronic cu enzimă cu structură de tranzistor cu efect de câmp

Fig. 158 - Schema de măsură cu senzorul electronic de măsură şi dependenţa curentului de pH-ul soluţiei. 1 – apă cu temperatura constantă; 2 – probă; 3 – electrodul Ag - Ag Cl (pastă); 4 – tranzistor cu efect de câmp; 5 – înregistrator. Avantajele biosenzorilor electronici sunt că pot fi combinaţi senzori pentru mai mulţi componenţii, au dimensiuni mici şi uşurinţa, de a fi legaţi la aparatura de măsură. Vor fi realizaţi în număr mare în viitor. Se combină cu măsurătorile de pH, O2, C02, potenţial redox şi glucoză. Probleme importante pune structura capacitivă: membrana izolator - poartă. În privinţa perspectivelor folosirii biosenzorilor în controlul şi reglarea proceselor de fermentaţie, până în 1975 au apărut 120 de patente de biosenzori (50% electrochimici). Avantajele se bazează pe: - enzimele imobilizate, microorganismele au acţiuni selective; bună sensibilitate; pot masura concentraţii foarte mici de substrat organic; aparatura nu este foarte complicată; semnalul de ieşire este electric; sunt uşor de indus, nu au implicaţii asupra purităţii optice a probei măsurate. Pot fi folosiţi la reglarea proceselor de fermentaţie. Dezavantajele biosenzorilor pot fi rezumate astfel: - nu sunt sterilizabili nici termic, nici chimic; - au stabilitate scăzută (mai cu seamă pentru cei enzimatici); - biocatalizatorii sunt greu de pregătit; - apar erori din cauza inhibitorilor catalizatorilor; - după datele fvrnizate de literatura de specialitate aceşti senzori se folosesc mai cu seama în laborator; - există problemele de preţ privind aparatura, sensibilitate şi selectivitatea; - cea mai mare problema este cea legată de sterilizare.

295

BIBLIOGRAFIE 1. ALBERTS B., and col., 1989 – Molecular biology of the cell, General Publishing Inc., New York. 2. ALBERTS B., BRAY D., HOPKIN K., 2004 - Biologie moléculaire de la cellule, Flammarion Médecine-Sciences, Paris. 3. ANDREICUT S, BECUS, M, 1985 - Biologie Celulara, Indrumator de Lucrari Practice si demonstratii, Litografia IMF, Tg Mures. 4. ANTOHI S., GAVRILĂ L., 1983 – Progrese în genetica moleculară, Ed. Ştiinţifică şi Pedagogică, Bucureşti. 5. ATANASIU L., 1990 – Utilizarea fotosintezei ca sursă alternativă de energie, Biotehnologii moderne, ED. Tehnică, Bucureşti. 6. BARABAS N., PRISECARU MARIA., 1999 - Histologie vegetala, Ed. Emil Borcea, Bacau, 1999, 150 p. 7. BEHNKE H. D., and col., 1993 – Progress in botany, ed. Springer-Verlang, Heidelberg. 8. BENGA G., 1985 - "Biologia celulară şi moleculară", Ed. Dacia, Cluj-Napoca. 9. BERCEANU ST., PĂUNESCU E., 1981 – Biologia şi patologia imunităţii, Ed. Acad. Române. 10. BOGDAN C., 1988 - Elemente de geriatrie practică. Ed. Medicală, Bucureşti. 11. BUCUR GH., 1987 – Boli dermatovenerice, Ed. Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti. 12. CACHIŢĂ-COSMA D., 1987 – Metode in vitro la plantele de cultură, Ed. Ceres, Bucureşti. 13. CAJAL N., 1990 – Tratat de virusologie medicală, vol. I, 407 – 413, Ed. Medicală, Bucureşti. 14. CHIRICUŢĂ, 1984 – Cancerologie generală, Ed. Medicală, Bucureşti. 15. CÎRLAN V.M., 2001 – Clonarea animalelor şi consecinţele clonării, Ed. Junimea, Iaşi. 16. CORMARK H. D. , 2003 - Esential Histology and Citology, Philadelphia. 17. COTRUTZ C., 1994 - Manual de Lucrari Practice de Biologie Celulara, Ed. Tehnica Chisinau. 18. CRISTEA T.O., GHICA M., PRISECARU M.,- Variatia randamentului de micropropagare “in vitro”determinate de influenta genotipului la varza alba pentru capatana-Brassica oleracea L.,forma alba,U.S.A.M.V.,Iasi,Lucr,St.,anulXLVIII vol.I, (48),seria Horticultura, Ed.Ion Ionescu de la Brad,I.S.N.N. 1454-7376, 2005, p.191-196. 19. CRISTEA TINA OANA, AMBARUŞ SILVICA, MARIA PRISECARU, FALTICEANU MARCELA, 2008 - Effect of „in vitro” plant growth regulators over the meristematic and mitotic activity at different genotypes of CAPSICUM ANUUM L.. U.Ş.A.M.V. Iaşi, Simpozionul ştiinţific international ″Horticultura, stiinta, diversitate, armonie″, Facultatea de Horticultură Iaşi, 29 – 31 Mai 2008 Lucrări ştiinţifice, Seria Horticultură, Editura “Ion Ionescu de la Brad ”, I.S.S.N. 1454 – 7376, p. 201-206. 20. CRISTEA TINA OANA, SILVICA AMBĂRUŞ, MARCELA FALTICEANU, MARIA PRISECARU, 2007 - Studies concerning the utilisation of “in vitro” micropropagation in the conservation process of some valuable genotypes of pepper - Capsicum anuum L., U.Ş.A.M.V. Iaşi, Lucrări ştiinţifice, Anul L, Vol. I (50) Seria Horticultură, Editura “Ion Ionescu de la Brad”, I.S.S.N. 1454 – 7376, p. 439-444. 21. CRISTEA TINA OANA, SILVICA AMBĂRUŞ, MARIA PRISECARU, 2008 Cytogenetic Effects Induced by „In Vitro” Cultivation of Shoot Tips at Capsicum Anuum L., Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară, Bucureşti, Lucrări ştiinţifice UŞAMV Bucureşti, seria V, vol. LI, ISSN 1222-5312, p. 50-55. 296

22. CRISTEA TINA OANA, 2008 - Utilizarea biotehnologiilor vegetale în ameliorarea plantelor, Ed. Vicovia, Bacău, ISBN: 978-973-1902-09-8. 23. CRUCE M., 2002 - Biologie Celulara si Moleculara, Ed. Aius Craiova. 24. DARNELL J., and col., 1990 – Molecular cell biology, Sc.Am.Books, New York. 25. DĂNĂILĂ L., PAIS V., 1988 – Ateroscleroza cerebrală din sistemul carotidian, Ed. Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti. 26. DICULESCU I., ONICESCU D., BENGA G., POPESCU L. M., 1983 - "Biologie celulară", Ed. Did. şi Ped., Bucureşti. 27. DICULESCU I., ONICESCU DOINA, BENGA GH., POPESCU L. M., 1987 – Histologie medicală, Ed. Medicală, Bucureşti. 28. DIMOFTACHE C., JERMAN SONIA, 1993 – Biofizică medicală, partea a III-a Biofizică celulară, Ed. Cerma, Bucureşti. 29. DUDAN R., VIKI ALLAN, KREIS T., 1991 – Trends in Cell Biology, 1, 15-19. 30. DUMITRU I.F., 1980 – Biochimie, Ed. Did. şi Ped., Bucureşti. 31. FRASINEL N., VERDES D., 1994 - Biologie Celulara si Moleculara, Ed. Mirton, Timisoara. 32. GAVRILĂ L., AGRIPINA LUNGEANU, ROGOZ I., 1989 – Citogenetică moleculară şi evoluţionistă, Ed. Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti. 33. GAVRILĂ L., DABALĂ I., 1981 – Descifrând tainele eredităţii, vol. I, II, Ed. Dacia, Cluj-Napoca. 34. GENEVES L., 1972 – Biologie cellulaire, tome I, II, Dunod, Paris. 35. GHEORGHE BENGA, 2005 - Introducere în Biologie Celularã şi Molecularã, Ed. Medicalã Universitarã, Cluj-Napoca. 36. GHERMAN I., 1994 – Bazele celulare ale creşterii, diferenţierii, îmbătrânirii, degenerescenţei şi morţii celulare, pag. 93, în: Curs de Biologie celulară, Universitatea Ecologică, Bucureşti. 37. GHIORGHIŢĂ G., PETRESCU NICUŢĂ D., 2005 – Biotehnologiile azi, Ed. Junimea, Iaşi. 38. HAENEY M., 1985 – Introduction to Clinical Imunology, Butterworths Update Publications, London &. 39. IONESCU-VARO M., DIMITRIU G., DELIU C., 1981 - "Biologie celulară", Ed. Did. şi Ped., Bucureşti. 40. ISRAIL A. M., 2000 - "Biologie moleculară - prezent şi perspective" Ed. Humanitas, Bucureşti. 41. LODISH H., 2005 - Biologie moléculaire de la cellule, De Boeck Université, Paris. 42. LODISH H., BERK A., ZIPURSKY S., MATSUDAIRA P., BALTIMORE D., DARNELL J., 1999 - Molecular Cell Biology, 4ed., New York, W. H. Freeman & Co. 43. KAPLAN J. C., 1990 - Biologie Moleculaire et medicine, Flammarion, Paris. 44. KARP G., 2004 - Biologie: cellulaire & moléculaire, De Boeck Université, Paris. 45. KLEMPERER W., 1992 – Intermolecular interactions, Science, 257, 887-888. 46. M. PRISECARU, R. VOICU, A. IOSOB, Observations on the embryonic development of Triturus/Lissotriton vulgaris L., Studii şi Cercet. Ştiinţ.,seria Biologie animală, 15, p.56 – 67, 2008. 47. MACOVSCHI E., 1984 – Concepţia biostructurală şi teoriile moleculare ale materiei vii, Ed. Şt. şi Enciclop., Bucureşti. 48. MAILLET M., 2002 - Biologie cellulaire, Masson, Paris. 49. MIXICH F., ARDELEAN A., 2002 - Principii fundamentale de biologie moleculara, Ed. Med. Univ. Craiova. 50. MURRAY A: W., 1992 – Cell-cycle checkpoints and feedback controls, Nature, 359, 599-603. 51. NEACŞU C., 1982 – Informaţia biologică, Ed. Şt. şi Enciclop., Bucureşti. 297

52. PALADE G. E., 1975 – Science, 189, 347. 53. PĂIŞ V., 1995 - "Biologie şi patologie celulară şi moleculară", Ed. Romfel, Bucureşti. 54. POLLARD Th. D., 2004 - Biologie cellulaire, Elsevier SAS, Paris. 55. POLLARD T., EARNSHAW W., 2002 - Cell Biology, Elsevier SAS, Paris. 56. POPA L., REPANOVICI R., 1982 – Tehnologia ADN recombinant (Inginerie genetică), Ed. Şt. şi Enciclop., Bucureşti. 57. POPA L., REPANOVICI R., 1992 – Acizii nucleici, Ed. Acad. Române, Bucureşti. 58. POPESCU-VIFOR S., şi col., 1980 – Genetica şi eredopatologie, Ed. Did. şi Ped., Bucureşti. 59. PRISECARU M, GHIORGHITA G, MIHU G, NICUTA D, CRISTEA O,-Production of haploid plants by in vitro anther and ovule culture of Brassica, Ed.Corson,Genetics and evolutions,2000,vol IV,Iasi,p.169-178. 60. PRISECARU M, MIHU G,CRISTEA O.T.,-Studiu comparative privind iducerea plantelor haploide la Brassica oleracea L.,utilizand culturile de antere si ovare “in vitro”,U.S.A.M.V.,Iasi,Vol.”Simpozionul aniversar “50 de ani de la infiintarea Fac. De Horticultura Iasi,2002,I.S.S.N.1454,p.68-74 61. PRISECARU M,,GHIORGHITA G.,-Influenta tipului de explant asupra capacitatiide regenerare din embrioni somatici la Triticum aestivum L.,Bul.Soc.Nat.Biol.Cel.,A XIV-a Ses.St.anuala,Oradea,1996,p.223. 62. PRISECARU M,CRISTEA O.T.,MIHU G.,-The preservation of some valuable genotypes of Brassica –white cabbage-by “in vitro” microclonation,Studii si Cer.de Biol.Univ., Bacau, 2005,10,p.195-197. 63. PRISECARU M,CRISTEA O.T.,-The stimulation of the gynogenetic development to Bete vulgaris L.,by the pollination of the embryo sac with irradiated pollen.Sudii si Cercet.de Bio.,V,2001,Bacau,p.15-18. 64. PRISECARU M,MIHU G.CRISTEA O.T.-Obtaining the haploid plants to Lycopersicn esculentum L.,through “in vitro” androgenesis and gynogenesis,St.si Cerc.de Biol.,vol.XIV,2000, p.23-27. 65. PRISECARU M.,CRISTEA O.T.,GHICA M.,-Studies concerning the behaviour of some tomato (Lycopersicon esculentum Mill.)genotypes to “in vitro”anther and ovule culture.Univ.de St.Agron.si Med.Vet.,Bucuresti,2001, Lucrari St., seria V, anul XLIV; Horticultura, p.19-23. 66. PRISECARU M.,GHIORGHITA G.,- Organogeneza indirecta la sfecla de zahar (Beta vulgaris L.), St.Cerc. Biol. ,Seria Biol.Veget.,1995, p.81-84. 67. PRISECARU M.,GHIORGHITA G.,-Studiul histologic in calusul de grau (Triticum aestivun L.) obtinut prin culturile embrionilor imaturi “in vitro”.Bul.Soc.Nat.Biol.Cel., A XIV a Ses.St.anuala,Oradea,1996, p.222. 68. PRISECARU MARIA, GHIORGHITA G., 2002 – Haploidia experimentala in contextul biotehnologiilor moderne. Editura Tehnica Bucuresti, 192p. 69. PRISECARU MARIA, VOICU ROXANA, RĂDUCANU DUMITRA, PRISECARU FLORIAN, 2008 - Ecotoxicologie – Curs universitar, Ed. „Alma Mater”, Bacău, ISB 70. PRISECARU MARIA., 1994 - Cito-histo-embriologie vegetala. I. Citologie,Tipografia Univ. Bacau, 1994, 225 p. 71. PRUCE M. E., DICKINSON A. G., 1987- Journal of General Virology, 68, 79-89. 72. RAICA MARIUS, Citologie Clinica, Timisoara, 2001. 73. RAICU P., 1991 – Genetica, Ed. Did. Şi Ped., Bucureşti. 74. RUSU V., BARAN T., BRĂNIŞTEANU D.D., 1991 – Biomembrane şi patologie, vol.2, Ed. Medicală, Bucureşti. 75. SASSON A., 1993 – Biotehnologii şi dezvoltare, Ed. Tehnică, Bucureşti. 76. SLAYTER E. M., 1992 - Electronic Light Microscopy, Cambridge, UK.

298

77. STRACHAN T., READ A.P., 1999 - Human Molecular Genetics, 2ed. Oxford, UK, BIOS Scientific Publishers Ltd. 78. TOLEDANO A., LOPEZ g. MARIA, 1987 – The cell membrane: esential element in the chemistry of life. Current topics in Science an medicine vol.1, Merck. 79. VOICULEŢ N., PUIU L., 1997 - "Biologia moleculară a celulei", Ed. All, Bucureşti. 80. WILSON J., HUNT T., 2004 - Biologie moléculaire de la cellule: livre d'exercices, Flammarion Médecine-Sciences, Paris.

299