MODULO I Año
Biología Molecular de la Piel
Carrera de Especialización en Dermatología Autor: Dr. Ramiro E. Lorente
Directora: Prof. Dra. Ana María Lorenz
“…the minute you let her under your skin then you begin to make it better…” Paul McCartney
Ilustración de tapa: Microfotografía electrónica de una Célula de Langerhans
MODELOS DE ANIMALES TRANSGÉNICOS.. ...... 36 RATONES TRANSGÉNICOS.... ........ ........ ....... ...... .....37
CONTENIDO
CONCLUSI CONC LUSIONE ONES S... ....... ....... ....... ........ ....... ..... .. 39
“…THE MINUTE YOU LET HER UNDER UNDE R YOUR SKIN SKI N... ...... ...... ...... ..... ..... ..... ....2
AGRADECI AGRAD ECIMIEN MIENTOS TOS ... ...... ..... .... .... .... .... ....40 BIBLIOGR BIBL IOGRAFÍA AFÍA ... ....... ....... ...... ...... ...... ..... ..... .....41
THEN YOU BEGIN TO MAKE IT BETTER…” ....... ............. .......... ........ ........ ........ ....... ... 2 PAUL MCCART MC CARTNEY NEY ... ....... ....... ....... ....... ...... .....2 CONTENIDO ....... ............ ......... ........ ........ ........ ...... ..3 INTRODUC INTR ODUCCION CION ... ...... ....... ........ ....... ..... ..... ..... ....4 HISTORIA DE LA BIOLOGIA MOLECULAR.... ........ ........ ........ ........ ....... ...... ...... ... 5 LA PIEL: PIE L: BIOLOGÍ BIO LOGÍA A MOLECULAR MOLE CULAR . 9 EPIDERMIS............... ......................... .................... ............9 LA MEMBRANA BASAL.... ........ ........ ........ ........ ....... ... 16 UNIONES INTERCELULARES.... ........ ........ ........ ...... .. 18 CÉLULAS NO KERATINOCÍTICAS DE LA EPIDERMIS....... ............. ........... ........ ........ ........ ........ ......20 DERMIS.......... .................... .................... ................. ....... 23 PROTEÍNAS DE LA MATRIZ EXTRACELULAR.. .23 COMPONENTES CELULARES DE LA DERMIS. .25 HIPODERMIS....... .............. .............. .............. ............ ..... 26 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR UTILIZADAS EN DERMATOLO DERMA TOLOGÍA GÍA... ...... ...... ...... ...... ..... ..... ..... .. 28 PROCESAMIENTO DEL TEJIDO... ...... ...... ...... ...... .....28 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. 29 SECUENCIAMIENTO DE ADN .. ..... ..... .... ..... ..... .... .. 30 TRANSCRIPCIÓN - REVERSA PCR (RT-PCR) ............... ........ .............. .............. .............. ............ ......... ......31 WESTERN BLOT....... .............. .............. .............. .........32 MICROARRAY ............. ...... ............... ............ ........ ....... ... 33 PROTEÓMICA CON ESPECTROMETRÍA DE MASA 35
REFERENCIAS REFERENCI AS BIBLIOGRÁFICAS BIBLIO GRÁFICAS 42
comenzó a llam lamarse biólogo molecular:
INTRODUCCION El térmi término no Biolog Biología ía Molec Molecula ularr fue introducido por Warren Weaver que se dese desemp mpeñ eñab aba a como como Direc Directo torr de la Sección de Ciencias Naturales de la Fundac Fundación ión Rockef Rockefell eller er en un report reporte e de 1938: “...y gradualmente está llegando una nueva rama de la ciencia – Biología Molecular – que está comenzando a dejar al descubierto muchos secretos concernientes a la unidad fundamental de la célula viviente….donde técnicas moder modernas nas están están siendo siendo usadas usadas para para inv investi estig gar cada cada vez mas detal etalle les s minú inúsculos los de ciertos procesos vivientes”1; Tambié También n podem podemos os citar citar la opinió opinión n que W. Astbur Astbury y tiene tiene sobre sobre biolog biología ía molecular: "... "...no no tant tanto o una una técn técnic ica a como como un enfoque, un enfoque desde el punto de vista de de las llamadas llamadas ciencia ciencias s básica básica con la idea principal de la búsqueda por debajo de las manifestaciones a gran escala de la biología clásica para el plan molecular correspondiente. Le preocupan particularmente las formas de las las molé oléculas ulas biol bioló ógica gicas s y es predom predomina inante nteme mente nte tridim tridimens ension ional al y estr estruc uctu tura rall - lo que que no sign signifi ifica ca,, sin sin embargo, que no es más que un refinamiento de la morfología - debe indagar al mismo tiempo en la génesis y función”2; Una mejor mejor explic explicaci ación ón acerca acerca del orig origen en del del térm término ino,, vien viene e de lo que que dice ice Fran rancis Crick ick sobre porqu rque
a
sí
mism ismo
“…m “…me vi forz forzad ado o a mi mism ismo a llama llamarme rme biólog biólogo o molec molecula ularr porqu porque e cuando un clérigo igo inq inquisi isidor me preg pregu untó ntó ace acerca rca de lo que había abía hecho, me cansé de explicarle que era una mezcla de cristalógrafo, biofísico, bioquímico y genetista, una explicación que que en cada cada caso caso enco encont ntra raba ba muy muy 3 difícil de entender…” . El Huma Human n Geno Genome me Proje Project ct da la sigu iguiente definició ición n de biol iología molecular: “Es el estudio de la estructura estructura,, función función y composic composición ión de moléculas biológicamente importantes”4. Este trabajo se ocupará primero del desarrollo de la biología molecular, y luego en describir la estructura de la piel haciendo énfasis en los componentes moleculares de importancia.
HISTORIA DE LA BIOLOGIA MOLECULAR Al principio del siglo XX el campo de la gené genétic tica a esta estaba ba regu regula lado do por por las las leyes Mendelianas Mendelianas de Segregac Segregación ión y de Segregaci Segregación ón Independi Independiente ente5, pero los procesos de reproducción génica, mutación y expresión eran desc descon onoc ocid idos os.. Thom Thomas as H. Morg Morgan an crea crea un equipo equipo de invest investiga igació ción n que toma a la mosca de la fruta Drosophila) (Drosophila) como modelo para estudiar la relación entre los genes y los cromosomas en el proceso hereditario6,7. Un estudiante de Morgan, Hermann J. Müller, reconoce en los genes las bases para la vida, y direcciona su trabajo para investigar su estructura, descubre que los rayos x tení tenían an efec efecto tos s muta mutagé géni nico cos s en la mosca Dros rosophila y utiliz liza este fenómeno para estudiar el tamaño y naturaleza de los genes. A pesar de los grandes avances de Müller, este reconoce que no puede extender su invest investiga igació ción n al nivel nivel de explic explicar ar las prop propie ieda dade des s fund fundam amen enta tale les s de los los genes y sus acciones. En un ensayo publicado 1936 dice: “El genetista por sí mismo es inútil para analizar nuevas propiedades (en los genes). Aquí los físicos, así como los químicos deben dar dar un paso paso aden adentr tro. o. ¿Qui ¿Quién én será será voluntario para hacerlo?.8. En la sigu iguien iente déca écada mucho cho físico físicos s famoso famosos s mostra mostraron ron atenci atención ón por la biología, biología, más específic específicamen amente te por la herencia biológica, en 1944 el
is life?” (¿Qué es la vida?)9, proponiendo de una manera entusiasta como la física cuántica podría explicar la estabilidad, incluso la mutabilidad de los genes genes10, redu reducí cía a los los gene genes s a la fís física ica espec peculan lando con crist ristal ales es aperiódicos involucrados en la codific codificaci ación ón de la heren herencia cia.. Muchos Muchos científicos jóvenes físicos y biólogos se vieron vieron fuertemen fuertemente te influenciad influenciados os por este este libr libro, o, llev lleván ándo dolo los s a cons consid ider erar ar nuevas direcciones en la investigación, lo que que años años más más tard tarde e tend tendría ría gran gran influencia en la Biología Molecular.
Otro físico famoso interesado por la biología era Max Delbrueck discípulo del del físi físico co cuán cuántic tico o Neil Neil Börh Börh,, quie quien n como su maestro buscaban en contraparte con Schödinger no buscaban explica icar los procesos biológicos reduciéndolos a fenómenos físico físicos s sino sino enten entendie diendo ndo como como cada cada disc discip iplin lina a podí podía a comp comple leme ment ntar ar a la otra.
Figura 1 – Max Delbrueck y Salvador Luria Delb Delbru ruec eck k visi visitó tó el labo labora rato tori rio o de moscas de Müller, pero considero que la Drosophila era demasiado compleja para descifrar los mecanismos de auto reproducc reproducción ión (característ (característica ica única única de los seres vivos) y prefirió utilizar a los bacteriófag bacteriófagos os (bacteriop (bacteriophage hages) s) como como obje objeto to de inve invest stig igac ació ión, n, crea creand ndo o al
Salv Salvad ador or Luri Luria a “The “The Phag Phage e Grou Group” p” marcando un punto muy importante en el desarrollo de la biología molecular. En un famoso experimento llevado a cabo por Hershey, A.D. y Marta Chase prue prueba ban n que que los los gene genes s no esta estaba ban n comp compue uest stos os por por prot proteí eína nas s sino sino por por 11 ácido desoxirribonucleico . Delbrueck facilitaba la colaboración entr entre e biólo iólog gos y fís físicos icos pero ero era era esquiv esquivo o a los detall detalles es químic químicos os que tendían puentes entre las dos disc discip ipli lina nas. s. Fue Fue Linu Linus s Pauli auling ng un cole colega ga de Delb Delbru ruec eck k del del Cal Cal Tech Tech quien al contrario de este utilizó sus conocimien conocimientos tos en química química estructural estructural para para estu estudi diar ar la estr estruc uctu tura ra de las las macr macrom omol oléc écul ulas as.. Su trab trabaj ajo o en la teórica de los enlaces químico facilitó el entendimi entendimiento ento sobre la estabilidad estabilidad de gran grande des s macro acrom moléc olécul ulas as.. Este Este concepto abarca tanto a las proteínas como a los ácidos nucleicos y era un requ requis isit ito o para ara poder oder estu studia diar su estructura. Pauling utilizo cristalografía por rayos x y sumado a la construcción de model odelos os a esca escala la,, desc descub ubre re la estructura alfa helico icoida idal de las proteínas y eventualmente propone un modelo para la estructura del ADN12. James James Watso Watson n era un estudi estudiant ante e de Luria del “Phage Group” que reconoció la necesi necesidad dad de utiliza utilizarr crista cristalog lograf rafía ía para poder llegar a la estructura del ADN, ADN, y Fran Franci cis s Cric Crick k un físi físico co que que insp inspir irad ado o por por Erwi Erwin n Schr Schröd ödin inge gerr se volvo hacia la biología y contribuyo en la teoría de la cristalografía por rayos x. Estos dos científicos coincidieron en el Laboratorio Cavendish de la Universidad de Cambridge y trabajaron en conjun junto utili ilizando datos de crist rista alogr lograf afía ía de rayos ayos x de ADN
aport portad ado os por por Mauric urice e Wilk ilkins ins y Rosalind Franklin del King's College de Londres para crear un modelo de la estr estruc uctu tura ra helic helicoid oidal al dobl doble e del del ADN ADN que fue fue fina finalm lmen ente te public blicad ada a en 13 1953 , lo que trajo aparejado el comi comien enzo zo del del peri period odo o clás clásic ico o de la Biología Molecular.
desa desarr rrol ollo lo de nuev nuevas as técn técnic icas as de biología molecular.
Figura Figura 2 – James James Watson y Franci Francis s Crick
Figura 3 - César Milstein
Ya con la estructura del ADN en la mano, los biól iólogos molecular lares centraron su atención en dilucidar los mecanismos de la función y rep reprod roducción ión genética ica. Se puso énfa énfasi sis s en trat tratar ar de secu secuen enci ciar ar el código código genético. genético. Los primeros primeros pasos pasos fuer fueron on secu secuen enci cian ando do prot proteí eína nas s la primera fue la de Insulina a final de los años ’50, y durante las dos décadas siguie siguiente ntes s se fueron fueron desar desarrol rollan lando do y mejorando técnicas de secuenciación. Además de las técnicas de secuenciación, hubo aportes importantísimos desde la inmunología con con el desa desarr rrol olllo de antic ticuer uerpos pos monoclonales, (trabajo que le valió el prem premio io Nobe Nobell a Césa Césarr Mils Milste tein in en 1984 1984), ), de ines inestim timab able le valo valorr para para el
Con el desarrollo de la técnica de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa en Inglés) hacia 1985 por Kary Kary Mullis Mullis14, se dio impulso a un programa desarrollado por el Departamento de Energía y el Instituto Nacional de Salud de los EEUU para secu ecuencia nciarr el genom enoma a humano ano y estudiar el impacto de la radiación de las bombas de Hiroshima y Nagasaki sobr sobre e el geno genoma ma huma humano no.. De éste éste proyecto derivo el más conocido como “El Proye Proyecto cto Genoma Genoma Humano Humano”, ”, que se vio envuelto en muchas contr ontrov over ers sias ias entr entre e el cons onsorcio rcio internacional de centros de secuenciación y las compañías privadas avocadas a la misma tarea en una espec especie ie de carrer carrera a genéti genética. ca. La secu secuen enci cia a del del geno genoma ma en brut bruto o fue fue
publicada hacia 200115, marcando un ante antes s y un desp despué ués s en la biol biolog ogía ía molecular.
LA
PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
La piel humana está dividida en dos capas primarias, la epidermis o capa externa y la dermis o capa capa intern interna. a. Estas dos capas están separadas por una una estru estruct ctur ura a llam llamad ada a membrana basal . Debajo de la dermis hay una capa de tejido conectivo laxo, llamada hipodermis o tejido celular subcutáneo, subcutáneo, que se continúa en profundidad con la capa capa de teji tejido do gras graso. o. La piel piel de un adulto promedio cubre aproximadamente aproximadamente un área de 2 m2. Desde el nacimiento a la madurez, el área de la piel se extenderá siete veces. Puede llegar a pesar hasta el 15% del peso total del cuerpo adulto 16, es el órga órgano no más gran grande de,, y reci recibe be hasta un tercio de la volemia. La piel constituye una barrera contra el medio ambiente al mismo tiempo contribuye a mante mantener ner la homeos homeostas tasis is del medio medio interno. Es un órga rgano capaz de auto autore rege gene nera rars rse, e, y pued puede e sopo soport rtar ar agre agresi sion ones es mecá mecánic nicas as y quím químic icas as,, hast hasta a un cier cierto to lími límite te.. Su espe espeso sor r puede uede varia ariarr desd esde 0,5 mm en la membrana timpánica a 0,6 mm en la planta de los pies.
Epidermis La epidermis es la capa mas exte extern rna a de la piel piel,, es avas vascular ular y deriva del ectodermo embrionario. Es una capa relativamente uniforme en espesor y tiene entre 75 y 150µm, except excepto o en palma palmas s y planta plantas s donde donde tien tiene e entr entre e 0,4 0,4 y 0,6 0,6 mm. mm. La capa capa epidérmica se encuentra en constante
renovación en un ciclo que dura entre 26 y 45 días, se produce una renovación total de la epidermis cada aproximadamente 2 meses. La
↑ Figura 4 - Corte Histológico de piel humana de la zona interescapular ↓ Figura 5- Corte Histológico de piel humana de la Palma de la mano, (se observa capa córnea más gruesa y compactada)
epid epider erm mis cons consti titu tuy ye un epitel itelio io escamoso estratificado compuesto por keratinocitos y la dividimos en 5 capas: estr estrat ato o córn córneo eo,, lúci lúcido do,, gran granul ulos oso, o, espino inoso y capa basal o stratum germinatuvm. germinatuvm.
El estrato córneo El estrato córneo, es la capa superficial y está compuesta de células muerta ertas s kera eratini tiniz zadas das llam lamadas das corn corneo eoci cito tos. s. Está Está comp compue uest sto o por por células muertas dispuestas en capas fina finas s apil apilad adas as y está están n llen llenas as en un 80% de keratina de ahí el nombre de keratinocitos, rodeadas de una matriz extracelular lipídica, y tienen la función
de barrera de la epidermis. La reg regulación ión de la permeabilid ilida ad, descamac descamación, ión, actividad actividad antimicrob antimicrobial, ial, exc exclus lusión ión de tox toxinas inas y abs absorció rción n selectiva, están a cargo de la matriz extracelular. La resistencia mecánica, hidratación, promotores de inflamación media mediados dos por citoki citokinas nas,, y protec protecció ción n del daño por radiación UV, son provistas por los corneocitos. En condiciones normales el estrato córneo está compuesto de keratinocitos completamente dife iferenciad iados. Las células las más superficiales son descamadas por los traumas mecánicos y químicos de la vida ida diari iaria a y en part parte e debido bido a la degradación ión proteolít lítica de los los desmosomas. La keratina es una fibra dura, insoluble, resistente a cambios de pH y a la digestión enzimática de tripsina y pepsina. Se han identificado 54 genes funcionales de keratina, que codifican para 34 tipos de keratina epiteliales y 17 pilosas. Mutaciones a nivel de estos genes se traducen en múltiples enfermedades.
El estrato lúcido El estr estrat ato o lúci lúcid do se encue ncuent ntra ra direct directam ament ente e por debajo debajo del del estrat estrato o córneo. Esta capa puede encontrarse en áreas donde la piel es gruesa como en palm palmas as y plan planta tas, s, y pued puede e esta estar r ausente en piel fina como la de los párp párpad ados os.. Pued Puede e tene tenerr entre entre una una y cinco cinco célula células s de espeso espesor, r, los límite límites s celulares son difíciles de distinguir en el micr micros osco copi pio o de luz. luz. Es una una capa capa transicio icion nal donde hay enzimas lisoso lisosomal males es activa activas s que degra degradan dan el núcleo núcleo y las organel organellas las antes de de que las células pasen al estrato córneo.
El estrato granuloso El estrato granuloso se encuentra por debajo del estrato córneo o del estrato lúcido cuando este está presente. Las célu célula las s en ésta ésta capa capa tien tienen en núcl núcleo eo activo. El nombre deriva de los gránulos gránulos de keratohial keratohialina ina contenido contenidos s en las células de esta capa compuestos principalmente de profil profilagg aggrin rina, a, filame filamento ntos s interm intermedi edios os de keratina, y loricrina. En ésta capa comienza a formarse la envoltura de las células cornificadas. La
Tabla 1 - Expresión de genes de keratina y enfermedades asociadas
profilaggrina polimérica se convierte en filaggrina en un proceso dependiente de Ca. Los monómeros de filaggrina agregan keratina para formar macrofilamentos, la filaggrina luego es degradada, quedando macrofilamentos de keratina. La loric ricrina ina es una proteína rica en cisteína que constituye el principal componente de la envoltura cornificada que se une a estructuras desmo desmosom somale ales. s. Esta Esta proteí proteína na junto junto con involucrina, cystatina A, proteínas pequ pequeñ eñas as rica ricas s en prol prolin ina a (SRP (SRP1, 1, SRP2, y cornifina), elafina, envop envoplak lakina ina son son subse subsecue cuente nteme mente nte cruzadas en la membrana plasmática por por las las tran transg sglu luta tami mina nasa sas s tisula tisulare res s (TG (TGM1 y TGM3 principalme lmente) formando la envoltura de los corneocitos. ↓ Figura 6 - Ictiosis Laminar
Mutaciones en los genes que codifican para las diferentes proteínas mencionad mencionadas as producen producen trastornos trastornos en la normal queratinización por ejemplo: muta mutaci cion ones es en el gen gen que que codi codifi fica ca TGM1 están involucradas en casos de Ictiosis Laminar; mutaciones en el gen filaggrina que codifica están invo involu lucr crad adas as en caso casos s de Ictiosis Vulgar ; muta utacio ciones nes en el gen que codifica loricrina están involucradas en casos de Síndrome de Vohwinkel con Ictiosis y pseudoainhum. pseudoainhum.
↓ Figura 7 - Pseudoainhum
También hay situaciones donde la alteración no está en la formación sino en la produc producció ción n de autoan autoantic ticuer uerpos pos dermatitis por ejemplo en la herpetiforme exis existe ten n anti anticu cuer erpo pos s contra la TGM3. ( ↓Figura 8) 8) .
↓Figur a 8 -
Tabla 2 - Enfermedades resultantes de la alteración de los desmosomas
Dermatitis Herpetiforme
Las células células de esta esta capa capa tambié también n contienen gránulos pequeños llamados cuerpos de Odland. En realidad ya son numerosos en las células de la parte supe superi rior or del del estr estrad ado o espi espino noso so,, y se ubican en la periferia celular a medida que que pasan pasan el estr estrat ato o granu granulo loso so.. Vier Vierte ten n su cont conten enid ido o lipí lipídi dico co en el medio extracelular, contribuyendo a la función de barrera y cohesión celular en la capa córnea.
El estrato espinoso El estra strato to espino pinoso so es la capa apa deb debajo ajo del estra trato granu ranulo los so. El nombre deriva por la configuración en espí espícu cula las s que que tien tiene e las las estr estruc uctu tura ras s citoplasmáticas de las células de esta capa que constituyen los desmosomas caract caracterí erísti stica ca sobres sobresali alient ente e de esta esta capa. Los desmosomas (↓ ( ↓ Figura 9↓ Figura 10,↓ Figura 11) estás constituidos por una parte intracelular denominada placa y una parte core. La extrac extracelu elular lar denom denomina inada da core. placa contiene los polipé ipéptido idos plakoglobina, plakoglobina, desmo desmopla plakin kina a 1 y 2 , keratocalmina, keratocalmina, desmoyokina, desmoyokina, y plakofilina y el core contienen glicoproteínas transmembrana que son desmogleína 1 y 3, y desmocolinas 1 y 2 que son parte de la familia de cadherinas que que se enca ncarga rgan de la adhesión en la porción extracelular, y son dependientes de Ca. La importancia del calcio como mediador
de la adhesión queda demostrada en dos condiciones que exhiben discohesión epidérmica característica, la enfermedad de Darier (↓ Figura 14) 14) o keratosis folicular y Hailey-Hailey (↓ Figura 12) 12) o pénfigo crónico benigno familiar . Amba Ambas s enfe enferm rmed edad ades es son son pro produc ducidas idas por mutaci tacion ones es en lo gene genes s que que regu regula lan n el tran transp spor orte te de calcio, el SERCA2 (sarco++ endoplasm endoplasmatic atic reticulum reticulum Ca ATPasa type 2 isoform) en la enfermedad de Darier 17 y el ATP2 ATP2C1 C1 (ATP (ATPas asa, a, Ca++ tra transpo nsport rtin ing g type type 2C, 2C, member ber 1) regulador de la concentración citoplasmática de calcio en la enfermedad de Hailey-Hailey. ↓ Figura 9 - Desmosoma en esquema
nuev nuevo o ARNm ARNm para para ésta éstas s kera kerati tina nas, s, excepto en alteraciones hiperproliferativas. ↓ Figura 10 Proteínas desmosomales
↓ Figura 11 - Microfotografía electrónica. Desmosoma
Las células en esta capa comienzan a sint sintet etiz izar ar gran grande des s cant cantid idad ades es de keratina K1/K10 que se agrega a la K5/K14 que todavía está presente de la capa capa basa basal, l, pero pero no se sint sintet etiz iza a
En estados hiperproliferativos como psor psoria ias sis, is, kerat eratos osis is actíni tínica cas s, y repara reparació ción n de herida heridas s la síntes síntesis is de kera kerati tina na K1/K K1/K10 10 así así como como el ARNm ARNm para éstas sufren downregulation, y se favore favorece ce la síntes síntesis is y traduc traducció ción n del ARNm para keratina K6/K16. El ARNm para K6/K16 está normalmente presente en la epidermis pero solo es traducido cuando hay una estimulación de la proliferación. La alteración de las proteínas que componen los
↓ Figura 12 - Hailey-Hailey
desmo desmosom somas as se traduc traducen en en varias varias ↓ Figura 13 - Keratodermia estriada
enfermedades como se expone en la tabla 2.
El estrato basal El estrato basal es la capa interna de la epider epidermi mis. s. Está Está compue compuesta sta de una capa simple de células mitóti mitóticam cament ente e activa activas. s. Estas Estas célul células as responden a varios factores como la matriz riz extracelular lar, factores de crecimiento, hormonas, y vitaminas. El metabolismo de la piel está mediado por glucosa, y la utilización de esta por parte de la piel es comparable a la del músculo. músculo. Una vez vez q la célula célula deja deja la capa basal esta comienza una migración hacia arriba que dura entre 2 y 3 semanas, le toma aproximadamente 14 días en moverse desde la capa basal al estrato córneo y otros 14 días pasar a la parte superior del estrato córneo y descamar.
↓ Figura 14 - Enfermedad de Darier
Las células pluripotenciales (stemlike cells) epidérmicas comp compre rend nden en apro aproxi xima mada dame ment nte e un 10% del total de células basales. Estas célu célula las s tien tienen en un cicl ciclo o celu celular lar muy muy lento y cuando se dividen las células hijas hijas que se difere diferenci nciará arán n a medid medida a que se mueven hacia la capa córnea son llamadas llamadas “células “células amplificad amplificadoras oras trans transit itor orias ias”” (↓ Figura 16), éstas constituyen el 50% de la población de keratinocitos basales. Una parte de la población de células madr madre e pued puede e ser ser enco encont ntra rada da en las criptas epidérmicas de las crestas de la dermis y en el bulbo de los folículos pilosos. Las células en división pasan por el ciclo celular y la fase G1 es acortada en esta estado dos s como como la repa repara raci ción ón de heridas. El ciclo celular normal de un kerati keratinoc nocito ito es de alrede alrededor dor de 300 300 horas pero puede ser tan corto como 36 horas en ciertos estados patológicos como la psoriasis
↓ Figura 15 - Psoriasis
Las stem cell y las células ampl amplif ific icad ador oras as trans transito itoria rias, s, tiene tienen n ambas capacidad para división celular lim limitad itada a o cont contin inúa úa,, y son son las las que que tienen más probabilidad de residir el tiempo suficiente en la piel para sufrir modificaciones genéticas que lleven a desarrollar cáncer de piel. El uso de células madres provenientes de la capa basal de la piel es un área de creciente investigación y desarrollo18.
↓ Figu Figura ra 16 - Esqu Esquem ema. a. Célu Célula las s Amplificadoras
La membrana basal La zona de membrana basal o unión derm dermoo-e epidé pidérm rmic ica, a, cons consti titu tuy ye la inte interf rfac ace e entr entre e derm dermis is y epid epider ermi mis. s. Está dividida en dos zonas llamadas lámina lúcida y lámina lámina densa densa, según su densidad en la microscopía electrónica. La principal función reside en servir de anclaje entre la dermis y la
↑ Figura 17 - Esquema de la matriz de la membrana basal epider epidermis mis y provee proveerr resist resisten encia cia ante ante fuerza fuerzas s cizall cizallado adoras ras extern externas. as. Sirve Sirve como soporte de la epidermis, determina la polaridad de crecimiento, dirige la organización del citoesqueleto en las células basales, provee señales de desarro desarrollo llo,, y actúa actúa como como barrer barrera a semipermeable. La membr membrana ana basal basal está está forma formada da por las interacciones específicas entre las proteínas, proteínas, laminina, colágeno tipo IV , nidogen, nidogen, y perlecam. perlecam. Tamb Tambié ién n
encontramos fibronectina, y glicosaminoglicanos. glicosaminoglicanos. Encont Encontram ramos os una menor menor cantid cantidad ad de colágeno tipo VII , pero éste juega un papel importante en el anclaje de células a la lámina densa. Pued Puede e ser ser divi dividi dida da en tres tres rede redes s supramoleculares: el complejo hemidesmosoma-filamento de anclaje, la membrana basal propiamente dicha, y la fibrillas de anclaje. El rol crítico de ésta región de mantener la integridad estr estruc uctu turral de la piel, iel, se pone one de mani manifi fies esto to con con el gran gran núme número ro de mutaciones en los componentes de la unión unión dermo dermoepi epidér dérmic mica a que causa causan n enferm enfermeda edades des ampol ampollos losas as como como por ejemplo el colágeno tipo VII. Estas son agru agrupa pada das s de acue acuerd rdo o al grad grado o de escisión dentro de la unión dermoepidérmica, por ejemplo la más superficial es la “epidermólisis bullosa sim simple” ple” dond donde e hay hay esci escisi sión ón de los los kerati keratinoc nocito itos s basale basales; s; “epide “epidermó rmólis lisis is bullosa de la unión” escisión entre la lámina lúcida y la lámina densa y la “epidermólisis bullosa distróficas” que es la más profu rofund nda a donde onde exis existe te escisión entre la sublámina densa y los filamentos de anclaje.
Uniones Intercelulares Adem Además ás de los los desm desmos osom omas as ya descriptos, hay otros tipos de uniones intercelulares, que no tan solo contribuyen a la interacción mecánica, sino ino que son resp respon onsa sab bles les de la intera interacci cción ón bioquí bioquímic mica a y de señale señales s entre células. Estas uniones uniones incluyen incluyen Unione Uniones s ocluye ocluyente ntes s (tight (tight), ), unione uniones s adhe adhere rent ntes es (adh (adher eren ens) s),, y unio unione nes s GAP.
Uniones adherentes uniones Las ← Figura 19 - Ecadherinas. Unión Ca de de end ndie ient nte e adherentes están constituidas por estructuras transm transmem embra brana, na, que se asocian con el esquel esqueleto eto de actina actina,, parte de la red de filamentos de los keratinocitos. Los componentes transmembrana están cons consti titu tuíd ídos os por por Ecadher cadherina ina,, que forma formas s interac interaccio ciones nes adhesivas hemofílicas calcio dependiente con la E-cadherina de la
↓ Figura 20 - Esquema. Uniones gap
célula adyacente. El anclaje principal a citoesqueleto de actina es mediante αcatenina además de otros componentes como p120ctn, βcate cateni nina na,, plak plakog oglo lobi bina na,, α-act α-actin inin ina, a, vinc inculina ina, VASP (va (vasodila ilatador stimulated phosphoprotein). No se han han identi identific ficado ado derma dermatos tosis is asociadas asociadas a anormalida anormalidades des primarias primarias en la estructura de los componentes de las uniones adherentes, aunque la plakoglobina, asociada a una mutación en la enfermedad de Naxos, también es componente de los desmosomas. desmosomas. ↓ Figu gura ra 18 - Microfot fotografí rafía a electrónica. Uniones gap
Uniones gap niones nes gap gap comprenden Las unio grup grupos os de cana canale les s inte interc rcel elul ular ares es,, conoc onocid ido os com como cone conexo xon nes, que que directamente forman conexiones entre
el citoplasma de keratinocitos adya adyace cent ntes es (tam (tambi bién én pres presen ente tes s en otras células). Hay descriptas cerca de tre trece conex nexina inas difer iferen ente tes s en el humano humano.. Los conexo conexones nes se origin originan an mediante el ensamblaj laje de seis cone conexi xina nas s dent dentro ro del del com complej plejo o de Gol Golgi que que son son tra transpo nsport rta adas das a la membr embran ana a plas plasm mátic tica, don donde se asoc asocia ian n con con otro otros s cone conexo xone nes s para para formar la unión gap. Las uniones gap pueden ser homotípicas o heterotípicas dependiendo del tipo de conexinas. La formación y estabilidad de las uniones gap están reguladas por la quinasa de proteína C, Src quinasa, concentración de Ca, Ca, calm calmod odul ulin in,, AMPc AMPc,, y el pH loc local. al. Med Median iante las las unio unione nes s gap, ap, células vecinas comparten metabolitos de bajo peso molecular (<1000 Da) e inte interc rcam ambi bian an ione iones, s, esto esto perm permit ite e la coordinación intercelular y uniformidad. Altera Alteració ción n en genes genes que codif codifica ican n para para conexi conexinas nas,, están están implic implicado ados s en vari varias as form formas as de quer querat atod oder ermi mias as y pérdida de la audición. Hay geno genode derm rmat atos osis is espe especí cífi fica came ment nte e asoc asocia iad das a conex nexinas inas,, com como el síndrome de Vohwink inkel, formas autosómica autosómicas s dominant dominantes es y recesivas recesivas de eritro eritroker kerato atoder dermia mias, s, síndro síndrome me de Clouston, Clouston, y síndrome síndrome KID (queratitis (queratitis,, ictiosis, deafness [sordera]).
Uniones ocluyentes uniones ocluyentes Las intercelulares constituyen los mayores reguladores de la permeabilidad en el epitelio simple y están presentes en la piel con un rol clave manteniendo la func funció ión n de barr barrer era a de la piel piel.. Está Están n constituidas por proteínas transmembrana e intracelulares como
occludina, molécula de unión adhesiva, y caludinas. caludinas. Adem Además ás del del control de la perme rmeabilida idad, las unio unione nes s oclu ocluye yent ntes es,, cont contri ribu buye yen n al mantenimiento de la polaridad celular. Las claudi claudinas nas tendrí tendrían an la capaci capacidad dad para regular la permeabilidad epidérmica ya sea con la formación de uniones oclusivas o mediante la unión directa a ciertos factores de transcripción. La asociación con otros factores de transcripción como Kruppel like like fact factor or 4 (Klf (Klf4) 4),, o enzi enzima mas s como como Transglutaminasa 1, que son conocidos reguladores de la permeabilidad al producir los enlaces cruz ruzados en las las proteínas de la envoltura de los corneocitos, no está del todo establecida, pero en ratones donde se produce la ablación genética de claudina 1, o Klf4 o transglutaminasa 1, muestra patrones similares en la alteración de la barrera epidérmica. Esto sugiere que para un correcto control de la permeabilidad de la piel, además de las uniones ↓ Figura 21 - Esquema. Unión ocluyente
ocluye ocluyente ntes s en la capa capa granul granulosa osa se necesita una correcta organización de la envoltura de los corneocitos en la capa córnea.
pesar del color de piel, un melanocito cada 36 células basales aproximadamente.
↓Figura 22 - Esquema. Proteínas de unión ocluyente
No se han asociado dermatosis con anormalida idades prim rimarias ias en las las proteínas de las uniones oclusivas, sin emba embarg rgo, o, se ha nota notado do expr expres esió ión n anor anorma mall de algu alguno nos s comp compon onen ente tes s como la ocludina en derm dermat atos osis is infl inflam amat ator oria ias s como como la psor psoria iasi sis. s. (↓ Figura 15) 15)
Células no keratinocíticas de la epidermis. Los melanocitos son son célu célula las s dend dendrí ríti tica cas s deri deriva vada das s de la cres cresta ta neural neural sintet sintetiza izador doras as pigme pigmento ntos s que resi reside den n prin princi cipa palm lmen ente te en la capa capa basal. Bajo el microscopio de luz, son reconocidas por su citoplasma pálido, núcleo ovoide, y el color de melanosomas llenos de pigmento, que son son la orga organe nell lla a dist distin intiv tiva a de esta estas s célula células. s. Los melan melanoc ocitos itos ya pueden pueden ser detectados el piel a los 50 días de gestación y bajo condiciones normales no se divi divide den. n. En la piel piel norm normal al,, el número de melanocitos es el mismo a
↑ Figura 23 – Melanocito. Tinción para tirosinasa Las Las dend dendri rita tas s de los los melan melanoc ocit itos os son las respon responsa sable bles s de distri distribui buirr el pigmento a un gran número de keratin keratinoci ocitos tos.. La princi principal pal difere diferenci ncia a entre la piel clar lara y oscura es la cantidad y distribución de los mela melano noso soma mas s y la acti activi vida dad d de los los melanocitos. La func funció ión n de los los mela melano noci cito tos s se pone pone de mani manifi fies esto to en pato patolo logí gías as vitíligo, donde se produce una como el vitíligo, deplec depleción ión de melan melanoci ocitos tos por acción acción autoinmune.
↓ Figura 24 - Vitiligo
Otros desórdenes de la pigm igmentación ión son causados por defe defect ctos os en la mela melano nogé géne nesi sis, s, que que puede estar en la síntesis de melanina, producción ión de melanosomas, y transporte de melanosomas y transf transfere erenci ncia a a los kerati keratinoc nocito itos. s. La interacción entre melan lanocitos y keratinocitos es crítica para la homeo omeost stas asis is y dife difere ren nciac ciació ión n del melanocito, influyendo en la proliferación, dendricidad y melan laniza ización. El estudio de los melanocit melanocitos os ha crecido crecido notableme notablemente nte sobre todo como parte del estudio de los melanomas, donde se han descub descubier ierto to nuevos nuevos mecan mecanism ismos os de supervivencia tumoral, con prometedoras implicancias 19 terapéuticas. célu lula las s de Me Merk rkel el, son Las cé mecanoreceptores de adaptación lenta tipo tipo 1, loca localiz lizad ados os en siti sitios os de alta alta sens sensib ibil ilid idad ad táct táctil. il. Está Están n pres presen ente tes s entr entre e los los kera kerati tino noci cito tos s basa basale les s en regi region ones es part partic icul ular ares es del del cuer cuerpo po,, incluyendo piel cubierta de pelos y en
piel piel sin sin pelo pelos s de los dedo dedos, s, labi labios os,, cavidad oral, y la hoja externa de los folí folícu culos los pilos pilosos os.. Al igua iguall que que otra otras s célula células s no kerati keratinoc nocíti íticas cas las célula células s de Merkel tienen un citoplasma pálido en las tinciones.
↑Figura Figura 25 - Carcin Carcinoma oma de célula células s de Merkel. Marcado hinmunohist hinmunohistoquími oquímico co mostrando mostrando patrón patrón punteado perinuclear característico.
↑Figura Figura 26 - Carcin Carcinoma oma de célula células s de Merkel. Muestra rápido crecimiento. Nódulo violáceo en dedo del pie. Los marcadores inmu inmuno nohi hist stoq oquí uími mico cos s incl incluy uyen en K8, K8, K18, K19, y K20 péptidos de keratina. K20 está restringido a las células de Merkel en la piel así que se considera el marcador más confiable. Ultraestruc Ultraestructuralm turalmente ente son fácilmente fácilmente reconocibles por los gránulos densos, lim limitad itados os por por memb embrana rana,, que se coleccionan en oposición al aparato de
Golgi y próximos a una neurita amie amieli lini niz zada. ada. Esto Estos s grán gránul ulos os son son similares a los encontrados en neur neuron onas as y cont contie iene nen n sust sustan anci cias as simil imilar are es a neuro eurotr tran ans smisor isores es y marcadores de células neuroendocrinas, incluyendo metaen metaencef cefali alina, na, péptid péptido o vasoac vasoactiv tivo o intestinal, enolasa neurona-específica, y sinaptofisina. Las células de Merkel pueden sufrir transformación orig origin inan ando do neop neopla lasi sias as (car (carc cinom inoma a neur neuroe oend ndoc ocri rino no prim primar ario io)) que que son son particularmente agresivos y difíciles de tratar.
la epid epider erm mis. is. A raíz raíz de su func funció ión n esta estas s célu célula las s está están n impl implic icad adas as en mecanismos patológicos como dermatitis dermatitis de contacto, contacto, leishmani leishmaniasis asis cutánea, e infección por HIV. Las célula células s de Langer Langerhan hans s están están reducidas en la epidermis de pacientes con cierta ciertas s condic condicion iones es patoló patológic gicas as como psoriasis, sarcoidosis, y dermatitis de contacto. Su func funcio iona nali lida dad d se ve afec afecta tada da por por la radiación UV, especialmente la UVB. Po r su efectividad como presentadora de antígenos y esti estim mulac lación ión de linfo infoc cito itos, está stás células están siendo estudiadas como vehíc ehícul ulos os para para el trat tratam amie ient nto o de tumo tumore res s y el desa desarro rrollo llo de vacu vacuna nas s 20,21 anti-tumorales.
Figura 27 - Célula Célula de Langerhans Langerhans en epidermis.
Célula ulas s de Lan Langer gerhan hans s Las Cél son células dendríticas procesadoras y pres presen enta tado dora ras s de antí antíge geno nos s de la epidermis. Aunque no son exclusivas de la epidermis representan del 2% al 8% del total total de célula células s epidér epidérmic micas. as. Se encuentras comúnmente en posi posici ción ón supr supra a basa basal, l, pero pero pued pueden en estar estar distri distribui buidas das por la capa capa basal, basal, espisona, o granulosa. Se tiñe iñen pálid lidamente en los preparados hist istológ lógico icos, y tienen un núcleo leo com complej plejo. o. El citop itopla lasm sma a cont contie iene ne estruc estructur turas as caract caracterí erísti sticas cas llama llamadas das grán gránul ulos os de Birb Birbec eck k . Su función principal es tomar muestras y presentar antígenos a las células T de
↑ Figura 28 - Microfotografía electrónica de una Célula de Langerhans en epidermis. Flechas indican Gránulos de Birbeck. En recuadro se puede apreciar la forma en “raqueta”, las flechas curvas indican la fusión tipo “cierre” de la parte vesicular. N indica el núcleo
Dermis La derm dermis is está está con constit stitui uid da por por elem elemen ento tos s teji tejido do cone conect ctiv ivo o fibr fibros oso, o, fila filame ment ntos oso, o, y difu difuso so,, que que sopo soport rta a redes vasculares y nerviosas, apéndices epidérmicos y muchos tipos de célu célula las s incl incluy uyen endo do fibro fibrobl blas asto tos, s, macr macróf ófag agos os,, mast mastoc ocito itos, s, y célu células las trans transit itor orias ias del del sist sistem ema a inmun inmune. e. La dermis forma la mayoría de la piel y la provee provee de flexib flexibilid ilidad, ad, elasti elasticid cidad, ad, y resi resist sten enci cia a a la tens tensió ión. n. Prot Proteg ege e el cuerpo cuerpo de traum traumatis atismo mos s mecán mecánico icos, s, retiene agua, colabora en la termorregulación e incluye receptores para estímulos sensoriales. La dermis interactúa con la epid epider erm mis en el mant manten enim imie ient nto o de ambas capas, colaborando durante el desa desarr rrol ollo lo y la morfo orfogé géne nesi sis s de la unión dermoepidérmica, y l os apéndices apéndices epidérmico epidérmicos, s, e interactúan interactúan en la remodelación de la piel luego de una injuria. La dermis puede ser dividida en dos regiones principales, la dermis papilar superior, y la la dermis reticular inferior . Estas regiones pueden ser identificadas en los cortes histológicos ya que difieren en la organización del tejido, la densidad celular y la distribución de vasos y nervios. La derm dermis is papi papila larr coli colind nda a con con la epidermis, moldea su contorno, y tiene usualmente el doble del espesor de la dermis dermis.. La dermis dermis reticu reticular lar forma forma el grueso de la dermis. Está compuesta princi principal palme mente nte por fibras fibras colág colágena enas s gru gruesa esas, orga rganiz nizadas adas in gran grande des s hace aces de fibr fibras as entre ntrete teji jida das s, con ramas de fibras elásticas rodeando los hace haces. s. En la piel piel norm normas as,, las las fibr fibras as elás lástica icas y los los haces colágenos
aumentan de tamaño progresivamente hacia la hipodermis. El plexo subpapilar, es un plano horizontal de vaso vasos, s, marca arcand ndo o el lími límite te entr entre e la dermis papilar y la dermis reticular. El lími límite te infe inferi rior or de la derm dermis is reti reticu cula lar r está definido por la transición de tejido cone conect ctiv ivo o fibr fibros oso o a teji tejido do cone conect ctiv ivo o adiposo en la hipodermis.
← Figura 29 Estructura heli helico coid idal al tripl triple e del colágeno.
Proteínas de la matriz extracelular Colágeno El colágeno es la principal proteína estructural encontrada en la dermis y es secretada por fibroblastos dérmicos como procolágeno, que se transforma en colágeno en el medio extracelular por acción de las enzimas ADAMTS-2, 3, y 4 (a desintegrin and a metalloproteinase with thrombospondin repeats)22 actuando como proc proco olag lagenoeno-NN-p prote rotein inas asa a y por BMP1/Tolloi loid-like family ily (bone morph rphogen ogene etic tic prot prote ein 1; Tollo olloid id iden identi tifi fica ca orig origin inal alme ment nte e la mism misma a enzima en la Drosophila) actuando en el lado C terminal (↓ (↓ Figura 32). 32). Una
actividad defectuosa en las procolageno-N-N-proteinasas, se encuentran en el síndrome de EhlersDanl Danlos os VIIc VIIc (↓ Figu Figura ra 30), 30), con una fragilidad extrema de la piel.
↓ Figura Figura 30 - Síndrom Síndrome e de Ehlers Ehlers-Danlos
los los encon ncontr tram amos os asoc asocia iado dos s a los los costados de los formadores de fibras principales como monómeros, extendiéndose en la matriz circundante asociá asociándo ndose se con con los proteo proteoglic glicano anos, s, ayud ayudan ando do a rela relaci cio onar nar las las fibr fibras as colágenas con los demás componentes de la matriz extracelular. ↓ Figu Figura ra 32 - Ensa Ensamb mbla laje je de las las fibras de colágeno
El prin princi cipa pall tipo tipo de colá coláge geno no que que encontramos en la piel es el colágeno tipo I, uno de los tipos de colágeno El colágeno proporciona a la piel su form formad ador ores es de fibr fibras as,, repr repres esen enta ta fuerza, para darse una idea, el alrededor del 77% al 85% del colágeno colágeno es el que le proporciona al presente. El colágeno tipo III, también cuero de vaca su fuerza y durabilidad. form formad ador or de fibr fibras as repr repres esen enta ta casi casi Los aminoácido idos que forma rman al todo el colágeno restante. Los colágeno son prolina, glicina, colágenos tipo V y VI, también pueden hidroxiprolina, e hidroxiglicina. estar estar presen presente te en pequeñ pequeña a cantid cantidad. ad. Elastina Los colágenos tipo IX y XII, no son formadores de fibras por sí mismos, y ↓ Figura 31 - Comparación entre la fibra de colágeno y la elastina.
La elas elastin tina a es la prot proteí eína na que que le propor proporcio ciona na a la piel piel su elasti elasticid cidad. ad. Esta previene a la piel de ser permanentemente permanentemente remodelada. La elastina al igual que el colágeno (↓ Figura 31), es una proteína formadora de fibras y tiene una gran cant cantid idad ad de glic glicin ina a y prol prolin ina a en su composición pero carece de grandes cantidades de hidroxiprolina. Las fibras de elastina forman estructuras similares a un resorte que permite ser estirada y luego retornar a su forma original. La cantidad de elastina en la piel representa menos del 2% de su peso seco. Alter lterac acio ione nes s en los los genes nes que codi codifi fic ca para ara elast lastin ina a da lug lugar a laxa. fenotipos de cutis laxa.
Proteoglicanos y glicosaminoglicanos Los Proteoglicanos y glicos glicosami aminog noglic licano anos s (PGs (PGs y GAGs), GAGs), constituyen la sustancia basal , que se encuentra encuentra entre las fibras colágenas colágenas y elas elastin tina. a. Dent Dentro ro de esta estas s cate catego gorí ría a están incluido el condrotitín sulfato y dermat dermatán án sulfat sulfato o (versi (versica can, n, decori decorin, n, biglycan), condrotitín sulfato y derm ermatán atán sulfat lfato o prot prote eogli oglic cano anos (syndecan, (syndecan, perlecan), perlecan), y condroitín condroitín-6-6sulfato sulfato proteoglica proteoglicanos. nos. Aunque Aunque estas proteínas proteínas solo representan representan cerca del 0,2% del peso seco de la dermis, estas moléculas son muy importantes ya que son capaces de retener 1000 veces su volumen en agua, y tienen un rol muy importante en la hidratación de la piel determinando su volumen y compresibilidad. También encontramos en la dermis acido hialurónico que es mucho más abundante en la piel fetal donde facilita
la migr migrac ación ión celu celula lar. r. Este Este mate materia riall puede asociar factores de crecimiento y facilita la conexión celular con otros materiales de la matriz extracelular.
Componentes celulares de la dermis Los compo componen nentes tes celula celulares res de la dermis son fibroblastos, macrófagos, y mast mastoc ocit itos os.. Son Son enco encont ntra rado dos s más frecuentemente alrededor de la región papilar y rodeando los vasos del plexo subpapilar. También podemos enco encont ntra rarl rlos os en la derm dermis is retic reticul ular ar entre las fibras colágenas. Los fibroblastos son son célu célula las s mesenquimáticas que migran a través del del teji tejido do y son son resp respon onsa sabl bles es de la síntesis y degradación de los componentes fibrosos y no fibrosos de la matriz proteica y de algunos factores solubles. Los fibroblastos proveen de un marco estructural ral a la matriz riz extracelular a la vez que promocionan la inter nterac acc ción ión dermormo-e epidé idérmic rmica a media mediante nte la síntes síntesis is de media mediador dores es solubles. Juegan un rol importante en la reparación de heridas y cicatrización dond donde e aume aument ntan an su prol prolif ifer erac ació ión n y actividad sintética. ↓ Figura 33 - Fibroblastos
Los macrófagos , monocito itos y células dendríticas dérmicas, sistem ema a de célu célula las s consti constituy tuyen en el sist fagocíticas mononucleares en la piel. Figura Figura 34 - Macrófa Macrófago go fagocit fagocitand ando o bacterias (en amarillo)
Los macrófagos derivan de prec precur urso sore res s en la médu médula la ósea ósea,, se difere diferenc ncian ian en monoc monocito itos s circul circulant antes es en el torrente sanguíneo, luego migran a la piel para diferenciarse en macrófagos. Estas células son fago fagocí cíti tica cas, s, proc proces esan an y pres presen enta tan n antígenos, son microbicidas, tumo tumori rici cida das, s, secr secret etan an fact factor ores es de crecimiento, citoquinas y otras molé molécu cula las s inmu inmuno nom modul odulad ador oras as,, y están involucradas en la reparación de heridas y remodelación de tejidos. Los mastocitos son célula lulas s secret secretora oras s espec especial ializa izadas das que en la piel están presentes en gran densidad en la dermis papilar, cerca de la unión derm dermoe oepi pidé dérm rmic ica, a, y alre alrede dedo dorr de vasos sanguíneos y nervios del plexo subpailar. También son comunes en la grasa subcutánea. Los mastocitos son identificad identificados os histológic histológicamen amente te por un núcleo oval y redondeado y por abundantes gránulos oscuros citoplasm citoplasmático áticos. s. La superf superficie icie de de los mastocitos está cubierta con fibr fibron one ectin ctina a que que pro probab bablem lemente nte asegura a la célula a la matriz de tejido conect conectivo ivo.. En deter determin minado ados s estado estados s
de activación pueden volverse hipe hiperp rpro roli life fera rati tivo vos s e hipe hiperp rpla lasi sico cos s (mas (masto toci cito tosi sis) s).. Los Los mast mastoc ocito itos s son son responsables les de la reacción de hipersensibilidad inmediata en la piel y en el mantenimiento de estados inflamatorios subagudos y crónicos. ↓ Figura 35 - Urticaria
Sin Sinteti tetiz zan y secr secret etan an grá gránulo nulos s carg cargad ados os de hist histam amin ina, a, hepa hepari rina na,, triptas triptasa, a, quimas quimasa, a, carbox carboxipe ipepti ptidas dasa, a, factor quimiotático neutrofilico, y factor quimiotáctico eosinofílico anafiláctico.
Hipodermis El tejido de la hipodermis aísla al cuerpo, sirve como reserva energética, amortigua y protege la piel y facilita su movilidad sobre las estructuras subyacen subyacentes. tes. Tiene efecto efecto cosmético cosmético mold moldea eand ndo o el cont contor orno no corp corpor oral al.. El lími límite te entr entre e la derm dermis is reti reticu cula larr y la hipodermis, es una transición abrupta del del teji tejido do con conectiv ctivo o fibr fibros oso o de la dermis al tejido adiposo de la hipodermis. A pesar de la separación “anató “anatómic mica”, a”, las dos region regiones es están están estr estruc uctu tura ralm lmen ente te y func funcio iona nalm lmen ente te cone conect ctad adas as por por una una red red de vaso vasos s y nervios y la continuidad de apéndices
crecimiento activo pasan la dermis y se extienden en la grasa subcutánea, y las glándulas sudoríparas apócrinas y écrinas, están normalmente confin confinada adas s a esta esta profun profundid didad ad de la piel. Los adipocitos de la hipodermis están organizados en lóbulos definidos por por sept septos os de tejid tejido o cone conect ctiv ivo, o, que que contienen los vasos, nervios y linfáticos. ↓ Figura 36 Adipositos Subcutáneos
La síntesis y acumulación de grasa es continua ya sea median iante la acumulación de lípidos dentro de los adipocitos, proliferación de adipositos existe existente ntes, s, o media mediante nte la recluta recluta de nuev uevas célu élulas las del del mesé esénquim quima a indiferenciado. La hormona leptina, secretada por los adip dipocito citos, s, pro provee vee una señal eñal de retroa retroalim liment entaci ación ón de larga larga durac duración ión regulando la masa grasa. Los niveles de lept leptin ina a son son más más elev elevad ados os en los los adip adipos osit itos os subc subcut után áneo eos s que que en los los mesentéricos, sugiriendo un rol del a leptina en el control de la distribución de los adipositos. La importancia de la grasa subcutánea se pone de manifiesto en los pacientes con síndrome de Werner (defecto molecular en la enzima RecQ
subcutánea está ausente en áreas de lesi lesión ón ósea óseas, s, o con con escl escler erod oder ermi mia, a, donde la grasa subcutánea es reem reempl plaz azad ada a por por teji tejido do cone conect ctiv ivo o fibr fibros oso. o. Esta Estas s regi region ones es tien tiende den n a desarrollar úlceras crónicas. La piel de pacientes con esclerodermia es tensa y dolorosa.
Técnicas de biología molecular utilizadas en dermatología Los avances en biología molecular están cambiando rápidamente nuestro conoci conocimie miento nto sobre sobre la biolog biología ía de la piel y sus enfermedades. El aumento de información se tra trasla slada en nuevo evos diag iagnósti óstico cos s moleculares que están transformando la práctica clínica de la dermatología. Pero hay que usarlos de una manera prudente.
En este este capí capítu tulo, lo, se prof profun undi diza zara ra sobre las técnicas de biología mole molecu cula larr útil útiles es en derm dermat atol olog ogía ía.. Como enfermedad modelo utilizaremos el melanoma. Se discutirá el rango de técnicas disponibles por el derma dermatól tólogo ogo para para elucid elucidar ar las bases bases moleculares del melanoma, para luego realiz realizar ar un trata tratamie miento nto efect efectivo ivo.. Se estu estudi diar ara a las las técn técnic icas as de biol biolog ogía ía molecular que permiten analizar ADN, ARN ARN y prot proteí eína nas s de las las célu célula las s del del melanoma melanoma.. Luego, Luego, se analiz analizaran aran las posibles terapias genéticas. Todo esto contribuirá con importante información para el pronóstico, consejo terapéutico y screening a futuro del melanoma.
Procesamiento del tejido Para determinar los cambios moleculares producidos que llevaron a la formación de un melanoma, primero hay que terminar como se procesara la muestra elegida la obtención obtención de de ADN, ARN o proteínas.
El mela melano noma ma extr extraí aído do pued puede e ser proc proces esad ado o de cuat cuatro ro form formas as diferentes. (↓ (↓ Figura 37) 37) 1. El tejido en fresco puede ser colocado en un medio de cultivo y las células del melanoma pueden ser cultivadas en una incubadora. Estas Estas célu célula lass perm permit iten en obte obtene nerr más células que las de la muestra origin original al y expon exponerla erlass a distin distintas tas condiciones.
↓ Figura 37 - Procesamiento de una
2. Procesar el tejido fresco con búfere búferess y reacti reactivos vos para para extrae extraerr ADN, ARN y proteínas de toda la masa tumoral y en calidad elevada.
3. El tejido puede ser fijado en formol (para microscopia óptica) o en glutaraldehido (para micros microscop copia ia electr electróni ónica) ca) y luego luego ser analizado histológicamente en disti stintas formas, inclu cluyendo tinciones de rutina, inmunohistoquímica o hibridación in situ. 4. La muestra puede ser cong congel elad ada a para para una una extr extrac acci ción ón diferida del ADN, ARN o proteínas. Tam Tambi bién én nos nos permi ermite te obten btener er cortes para el estudio histológico. Otra tra opció pción n es usar usar micro disección por captura laser (LCM) para aislar células individuales del melanoma para su posterior análisis a partir de un preparado histo stológico ico visualizado en el microscopio. (↑ (↑ Figura 38) 38) Lueg Luego o de la extr extrac acci ción ón del del ADN, DN, ARN o prot roteínas del melanoma, queremos detectar las posibles les mutaciones en proto-oncogenes o en genes supresores de tumores resp respon onsa sabl bles es de la neop neopla las sia. ia. Por Por ejemplo, suponiendo que es conocido en el melanoma la mutación del gen “toomuchsun”, para obtener solo este
gen del total del ADN, podemos utilizar la técnica ica de biol iología molecular lar Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) que nos permitirá aislar el gen busca buscado do y ampli amplific ficar ar la cantid cantidad ad del del mismo para hacerlo medible. El ADN amplificado por PCR que contiene el gen, puede ser clonado en plásmidos bacteriales para una fácil manipulación y lueg luego o ser secue cuencia nciado do usan usando do téc técnica nicas s de sec secue uen nciaci iació ón por fluorescencia automatizada (Fig. 4.4). En base a los resultados de la secuenciación, sobremos si la mutación se encuentra presente en el gen gen toom toomuc uchs hsun un en el tum tumor bajo bajo estudio.
Reacción en Cadena de la Polimerasa Objeti Objetivo vo de la técnic técnica: a: ampli amplific ficar ar una porción específica de ADN
Requerimientos: se necesita conoce conocerr la secuen secuencia cia especi especific fica a del ADN problema (al menos las porciones finales)
Conceptos sobresalientes
Cadenas Cadenas cortas cortas de ADN llamadas oligonucle oligonucleótido ótidos, s, son diseñadas diseñadas para hibridarse con una secuencia especifica de ADN.
Método
La Los Los ceba cebado dore res s (pri (prim mers) ers) son son doble olig oligo onucle ucleót ótiidos dos dise iseñado ñados s para ara cadena de ADN puede ser separada hibridarse hibridarse en secuencia secuencias s específicas específicas en cade cadena nas s únic únicas as aume aument ntan ando do la situadas en los extremos del ADN de temp temper erat atur ura a (des (desna natu tura rali liza zaci ción ón); ); (↓ interés. Estos cebadores son Figura 40) 40) aumentando la temperatura agregados a una mezcla, junto con los nuev nuevam amen ente te,, la cade cadena na únic única a pude pude desoxinucleótidos trifosfato (dATP (A), unir unirse se (hib (hibri rida dar) r) a sec secuenc uencia ias s de dTTP (T), dGTP (G) and dCTP (C) ) ↓pFigura 39 de ADN nucleótidos com lementa ria-sSecuenciamiento , el ADN problema, proble ma, ADN polimerasa polimerasa automático formando una dobpor le fluorescencia cadena ↓ Figura 40 - Esquema de la reacción nuevamente (re naturalización). en cadena de la polimerasa (PCR) Durante el proceso de hibridación, los nucleótidos A de una cadena, se termoestable y buffer. unen nen con los los nuc nucleót leótid ido os T de la La mezc mezcla la se colo coloca ca en en tubos tubos de cadena complementaria, mientras que PCR en un termociclador, que los nucleótidos C se unen a los controla la temperatura de la reacción nucleótidos G y viceversa durante varios ciclos
↑ Figura 38 - Captura por Microdisección Láser
Durante cada ciclo se realizan los siguientes pasos: 1. Desnaturalización 2. Hibridación del cebador 3. Elon Elonga gaci ción ón de la cade cadena na de ADN ADN a partir del primer 4. Repetición del ciclo completo 30 a 40 veces- (↓ ( ↓ Figura 40) 40)
Secuenciamiento de ADN Objetivo de la técnica: Determinar la secuencia u orden de los nucleótidos (AGCT). Requerimientos: El ADN a secuenciar puede ser el producto de una PCR o ADN clonado presente en plásmidos.
Conceptos sobresalientes El méto método do de “ter “termi mina naci ción ón de la
La incorporación de un dide idesoxin oxinu ucleót leótid ido o en la cade adena naciente de ADN termina su extensión, lo que produce varios fragmentos de ADN de longitud variable. Mediante electroforesis, se separan los los dife difere rent ntes es frag fragme ment ntos os de ADN ADN según su tamaño.
Método Un ceba cebado dorr se hibr hibrid ida a al ADN ADN a sec secuenc uencia iarr y la ADN ADN polim olimer eras asa a sintetiza una segunda cadena complementaria. La síntesis de la segunda cadena es interrumpida al azar por la incorporación de nucleótidos análogos marcados con fluorescencia (did (dides esox oxin inuc ucleó leótid tido o ddAT ddATP, P, ddGT ddGTP, P, ddCTP, ddCTP, ddTTP) ddTTP).. Los Los fragme fragmento ntos s de ADN que presen presentan tan este este nucleó nucleótid tido o anál análog ogo o en su extr extrem emo o pued pueden en ser ser identificados ya que cada uno de los 4 didesoxinu didesoxinucleót cleótido ido está marcado marcado con un fluorocromo distinto. Los Los distin distinto tos s frag fragme ment ntos os de ADN ADN son separados mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida El fluoro fluorocr crom omo o pres presen ente te en cada cada fragmento de ADN es leído a través de un dete detect ctor or de fluo fluore resc scen enci cia a e indi indica ca el orde orden n de la secu secuen enci cia a de ADN. Una vez determinada la existencia de la mutación en el gen bajo estudio, se puede determinar si esta influye en el nivel de mRNA y de prot roteínas dentro dentro de la célul célula. a. Para Para el anali analizar zar ARN, primero primero se lo debe debe convert convertir ir en ADN usando la técnica de Transcripción Reversa (RT). Luego, el ADN ple ntario ntario (cADN) (cADN) de
ser amplifi ificado median iante PCR. Además esta técnica permite moni monito tore rear ar la cant cantid idad ad de produ product cto o formado en cada ciclo de amplificac amplificación, ión, y es conocida conocida también como PCR cuantitativa en tiempo real.
Transcripción - reversa PCR (RT-PCR) Obje Objeti tivo vo de la técn técnic ica: a: Ampl Amplif ific icar ar ARN mensajero (mARN) por PCR. El ARNm es convertido primero en ADN comple complemen mentar tario io y luego luego se amplif amplifica ica por PCR la región especifica a niveles detectables. Requerimie Requerimientos: ntos: El material material puede puede ser ARN celular celular total (incluyend (incluyendo o ARN ribos ribosom omal, al, ARN ARN de trans transfe fere renc ncia ia y ARN mensajero) o ARN purificado.
Conceptos sobresalientes Para Para faci facili lita tarr el estu estudi dio o del del ARN, ARN, primero se debe convertir el ARN en ADN ADN comp complem lemen enta tario rio por por medi medio o de una una enzi enzim ma llam llamad ada a tran transc scri ript ptas asa a reversa (es una enzima ADN polimerasa dependiente de ARN).
Método La tran transc scri ripc pció ión n reve revers rsa a pued puede e convertir mARN en cADN a través de tres métodos diferentes, dependiendo de los los ceba cebado dore res s util utiliz izad ados os para para el paso inicial. (← (← Figura 41) 41) 1. Cebadores hexamericos al azar, que contie contienen nen 6 nucleó nucleótid tidos os (6-mer (6-mer)) que que con contien tiene en tod todas las posi osible bles combinaciones de dA, dG, dC y dT. Esto Estos s ceba cebado dore res s se hibr hibrid idar aran an a la secuencia complementaria correspondiente en el ARN molde.
2. Cebado Cebadores res de oligo oligonuc nucleó leótid tidos os que contienen solo dT e hibridan en la cadena complementaria de dA nucleó nucleótid tidos os presen presentes tes en el extrem extremo o de las moléculas de ARNm (cola poli A) 3. Cebador que solo hibrida en una secuencia especifica de mARN Lueg Luego o que que obte obtene nemo mos s cADN cADN,, se agregan los cebadores que se hibridaran a una secuencia específica que permitirá la amplificación por PCR. Para Para medir medir las proteí proteínas nas produc producto to del gen mutado, se utiliza la técnica de West Wester ern n Blot Blot (Fig (Fig.. 4.6), 4.6), tamb tambié ién n cono conoci cida da com como Imun Imunob oblo lot, t, ya que que util utiliz iza a anti anticu cuer erpo pos s para para dete detect ctar ar la prot proteí eína na de inte interé rés. s. Adem Además ás esta esta técnica nos permite medir el tamaño
de la proteína y revelar si se presenta en distintas formas.
Western Blot Objetivo de la técnica ica: medir el tam tamaño año y la cant cantid idad ad de prot proteí eína nas s presentes en la muestra Requerimientos: anticuerpos específicos para la proteína de interés
Conceptos sobresalientes Anticuerpos policlo iclon nales les que reaccionan a varios epitopes de una prot proteí eína na anti antigé géni nica ca son son obte obteni nido dos s inyectando la proteína en un animal y aislando los anticuerpos de la fracción de las inmunoglobulinas del suero. Anticu Anticuerp erpos os monoc monoclon lonale ales s que reaccionan a un solo epitope de una prot proteí eína na anti antigé géni nica ca son son obte obteni nido dos s inmunizando a un ratón con el antíge antígeno, no, luego luego se unen unen los linfoc linfocito itos s reacti reactivo vos s del ratón ratón en una una líne línea a celu celula larr de un miel mielom oma a para para crea crearr célu célula las s que produc producirán irán antic anticuer uerpos pos indefinidamente. U n
← Figura 41 – Transcriptasa Inversa Una tran transc scri ript ptas asa a inve invers rsa a pued puede e A- Una conv conver erti tirr a cDNA cDNA del del mRNA mRNA de tre tre maneras maneras diferentes diferentes,, dependien dependiendo do del primer utilizado para la etapa inicial RT: (1) cebadores cebadores aleatorios aleatorios hexameric hexamericos, os, (2) (2) olig oligo o dT prim primer ers, s, y (3) (3) prim primer er específicos del gen. Después de que el ARNm ARNm se ha conv conver erti tido do a cDNA cDNA,, lo primer primerss que se puede pueden n hibrid hibridar ar con secuencias específicas son añadidos amplificación por PCR se lleva a cabo. PCR en tiem tiempo po real real es capa capazz de B- PCR medi medirr con con prec precis isió ión n la cant cantid idad ad de producto de PCR de forma continua (eje y) después de cada ciclo (eje x). Cada trazado línea representa la cantidad de presente del producto de PCR en una muestra diferente. En las muestras que
anticuerpo secundario es utilizado para detectar el anticuerpo anticuerpo primario primario unido a la proteína de interés. Los anticuerpos pueden ser visualizados al agregarles fluo luorescencia o una enzima que produzca luz o color a través de una reacción enzimática.
expresan en forma incorrecta (disminuida o aumentada) comparándolas a células normales (← (← Figura 43) 43) Esta poderosa técnica, utiliz liza secuencias de olig ligonucleótidos representando miles de genes que son desarr desarroll ollado ados s en un chip chip;; luego, luego, el mARN de los melanomas y los de los melanocit melanocitos os normales normales es separado separado y conver convertid tido o en sondas sondas marca marcadas das que son hibridadas en los chips. El nivel de hibridación de los oligonucleótidos de un gen dado indica cuanto mARN de ese gen está presente. presente. La ventaja ventaja de esto es la posibilidad de analizar en forma cuantitativa el nivel de expresión de miles de genes de una sola vez.
Microarray Objetivos: Analizar la expresión de mARN de miles de genes en un solo experimento ↑ Figura 42 - Western Blot
Método Una mezcla de proteínas solubilizadas es separada en un gel de poliacrilamida y transferida electroforéticamente a una membrana. Esta se coloca en un buffer que contiene el anticuerpo. Los anticuerpos que se unieron son luego detectados a través de técnicas cromogenicas o por quimioluminiscencia. quimioluminiscencia. (↑ Figura 42) 42) Para Para invest investiga igarr los cambio cambios s en la expresión génica de todos los genes de células tumorales como el mela melano noma ma,, se util utiliz iza a la técn técnic ica a de Micromatriz o Microarray. Con ella se puede conocer cuales les genes se
Requerimientos: ARN total o mARN Conceptos sobresalientes
Hibridación a ADN. Se utiliza el mism mismo o prin princi cipi pio o de hibr hibrid idac ació ión n que el aplicado en PCR, excepto que muchos genes diferentes son evaluados evaluados simultáneam simultáneamente. ente. El ADN es químicamente sintetizado en la superficie de miles de puntos específicos. (← (← Figura 43). 43). Si las las célul células as están están expr expresa esand ndo o ARNm del gen correspondiente, el ARNc se hibridara en el lugar y generara una señal cuya inte intens nsid idad ad será será en rela relaci ció ón al nivel de expresión.
Método
ARN ARN es con convert vertid ido o en cAD cADN median mediante te transc transcrip ripció ción n reversa reversa.. La transcripción in vitro del cADN se realiza con nucleótidos marcados con biotina dando como resultado cARN marcado (← Figura 43). 43). Las moléculas de cARN marcado son hibridadas a pequ pequeñ eño os frag fragm mento entoss de ADN ADN presentes en un chip. El chip es teñido con estreptavidina ficoer ficoeritr itrina ina;; la estrept estreptavi avidin dina a se une a la biotina del cARN y la fico ficoer erit itri rina na gener enera a una una señ señal fluoresecente. Generalmente, los patrones de expresión génica de dos muestras
son comparados, normal vs tumor, tratado vs no tratado. Alternativamente, los olig oligon onuc ucle leót ótid idos os del del micr microa oarr rray ay pueden utilizarse. (← (← Figura 43). 43). Usando esta posibilidad, el ARN es directamente marcado con fluo fluore resc sceí eína na o con con nucl nucleó eóti tido doss radioactivos y son hibridados a los oligonucleótidos en un portaobjetos o en una membrana. Cuando se usan sondas radi radioa oact ctiv ivas as,, las las mues muestr tras as son son hibridadas en microarrays sep separad arados os.. Si las las muest uestra rass de mARN a comparar son marcadas con fluorocromos distintos, las 2 muestra muestrass pueden pueden ser hibrid hibridada adass en el mismo array en forma simultánea. Un scanner mide la intensidad de la señal de cada punto y un software dete determ rmin ina a cual cuales es gene geness están sobre o subexpresad sados en una mues muestr tra a comp compar arad ada a con con la otra. Para Para realiz realizar ar el análisi análisiss comparativo de miles de genes diferentes, se utiliza un poderoso soft softwa ware re.. Este Este soft softwa ware re puede comparar resu result ltad ados os de múlt múltip iple less experimento experimentoss o grupos grupos de resultados de acuerdo a la expresión génica. Agregado al uso de micromatrices para
analizar todo el ARNm producido por una célula, se puede estudiar todas las proteínas producidas en ellas. El termino Proteómica representa a todas las proteínas producidas dentro de una células en un momento dado. La espect espectrom rometr etría ía de masa masa es una una técn técnic ica a que que nos nos perm permit ite e el estu estudi dio o de la Prot Proteó eómi mica ca,, que que prov provee ee de medi medici cion ones es con con gran gran precisión de la masa de proteínas ← Figura 43 - Arrays de Ácidos Nucleicos.
medi median ante te la ioni ionizzació ación n de las mismas y la medición de la acel aceler erac ació ión n de las las part partíc ícul ulas as a través de un tubo hacia un detector en el lado opuesto.
↑ Figu gura ra 44 - Prote oteómi ómica espectrometría de masa
con
También se puede utilizar matri atrice cess de prote roteín ínas as,, donde onde anticuerpos específicos son inmovilizados en un portaobjetos o memb membra rana na.. Este Este arra array y pued puede e anal analiz izar ar mezc mezcla lass comp comple leja jass de
proteínas mediante la captura y la detección especifica de proteínas.
Proteómica con Espectrometría de Masa Objetivo de la técnica: La Proteómica representa a todas las proteínas celulares que son expresadas en condiciones particulares. Req Requeri uerimi mien ento tos: s: mez ezcl cla a de prot proteí eína nass celu celula lare ress o pépt péptid idos os derivados de esas proteínas, son purificados de una población celular definida. Conceptos sobresalientes
La esp espectr ectro ometr metría ía de masa asa puede medir con gran precisión el tamaño o la masa de proteínas, péptidos o fragmentos de péptid péptidos os median mediante te la ioniza ionizació ción n de los mismos con carga positiva y luego ser medir el tiempo que necesitan los iones para moverse a través de un tubo hacia el detector. (TOF – tiempo de vuelo) (↑ Figura 44) 44) La masa de los péptidos ioni ionizzadas adas se corr correl elac acio iona na con con precisión con el tiempo de vuelo, pépt péptid idos os pequ pequeñ eños os se muev mueven en más rápido (menor TOF) que los péptidos mayores (mayor TOF) Método
El primer paso es disminuir la compleji ejidad de la mezcla cla de prot proteín eínas as o pépt péptid idos os celu celula lare res, s, previa previamen mente te a la espect espectrom rometr etría ía de masa. Los 2 métodos principales para separar proteí proteína/ na/pép péptid tidos os son median mediante te
electro electrofor foresis esis bidime bidimensio nsional nal y la cromatografía liquida. En la electroforesis bidime bidimensio nsional nal,, las proteí proteínas nas son primero separadas según su punto isoeléctrico (primera dime dimens nsió ión) n);; lueg luego o se las las sepa separa ra aun más según su tamaño en un gel gel de poli poliac acril rilam amid ida a (seg (segun unda da dimens dimensión ión), ), donde donde las proteí proteínas nas más pequeñas corren más rápido en el gel gel que que las las mayo mayore res. s. Las Las prot proteí eína nass prese present ntar aran an un luga lugarr únic único o en el gel gel que que puede uede ser ser físicamente removido y ser analizado mediante espectrometría de masa. La cromatografía liquida puede usar sarse también para ara sep separar proteínas mientras transcurren a través de columnas que contienen dist distin into toss tipo ipos de resi resina nas. s. Las proteínas son separadas en función de su hidrofobicidad (cromatografía de fase reversa), carga eléctrica (cromatografía de intercambio catiónico/aniónico) y tamaño (cromatografía de exclusión molecular).
Luego de separar las proteínas, se reali realiza za la espec espectr trom omet etrí ría a de masa masa.. Prim Primer ero o se ioni ioniza zan n las las proteínas con carga posit sitiva usan usando do láser láseres es o ioni ioniza zaci ción ón por por electrospray y nanospray. Basados en el tiempo de vuelo del ion cargado, la espectrometría de masa asa pued puede e medir edir la rela relaci ció ón masa/carga de cada péptido. Con la ayuda de poderosa rosass computadoras y softwar ware de
bioinformática, se puede medir la relación masa/carga, que permite la identi identific ficació ación n de la secuenc secuencia ia de un péptido y a la proteína que contiene a este péptido.
Modelos de animales transgénicos Lueg Luego o de habe haberr iden identi tifi fica cado do diferentes genes que se asocian por ejemplo al desarrollo de melan elanom oma, a, se podr podrán án util utiliz izar ar modelos animales para probar si caus causan an cán cánce cer. r. Estos Estos est estud udio ioss nos permi ermiti tirá rán n inv invest estigar igar los los mecanismos de la carcinogénesis y demostrar que ese gen mutado es capaz de producir una neoplasia. Los modelos animales más usados para el estudio del cáncer son los ratones ratones transgénicos transgénicos y los ratones “knock-out”. Los Los raton ratones es tran transg sgén énic icos os son son normales excepto que cada célula cont contie iene ne el nuev nuevo o gen gen que que nos nos interesa. El gen a ser estudiado, en micro inyectado en un ovulo de ratón fecundado, que se integrara en forma aleatoria en el genoma del ratón y que estará presente en todas las células del mismo. (↑ (↑ Figu Figura ra 45) 45) Aunque el gen se encuentra presente en cada célu célula la,, su expr expres esió ión n pued puede e ser ser limi limittada ada a tejid ejido os espe especí cífi fico coss usando promotores/ estimuladores que solo se expresen en determinados tejidos. Los promotores/ estimuladores son la porción del
gen (que usualmente se encu encuen entr tra a en el ext extrem remo 5´ o upstream de la región codificante) que que inic inicia ia o reg regula ula el nivel ivel de expresión del ARNm. Los promotores/ estimuladores que aseguraran qué genes son expresados sólo sólo en melano lanoc cito itos inclu ncluir iría ía los promotores del gen relacionadas a la síntesis de melanina, como la tirosinasa.
Ratones Transgénicos Objetivo:
modelos
de
ratones
transgénicos permiten a los investigadores estudiar lo s efectos de un transgen (gen de interés) en una célula, en un tejido o en todo el animal. El transgen puede ser expresado en forma selectiva en tipo particular de célula o tejido usando un promotor/es promotor/estimul timulador ador que regula regula la expr expresi esión ón géni génica ca en ese ese tipo tipo específico de células. Requerimientos: Un transgen o gen de interés rés, cuya función biológica se quiera caracterizar en un modelo animal (ej. El gen toomuchsun); Una región reguladora (promotor/e r/esti stimulador) que expr expres esar ara a en form forma a selec selecti tiva va el transg transgen en en un tejido tejido especí específic fico o (ej. Melanocitos) Tec Tecno nolo log gía apro aprop piada iada para ara crear un ratón transgénico. Conceptos sobresalient sobresalientes es
Lueg Luego o de la inye inyecc cció ión n de un gen gen en un ovul ovulo o fecu fecund ndad ado o de ratón o en una célula embrionaria,
el transgen se integra en el genoma al azar. (↑ (↑ Figura 45). 45). A medida que las células embr embrio iona nari rias as se divi divide den n y dan dan lugar al desarrollo de un ratón, el transgen integrado estará pres presen ente te en todo todoss los los tipo tiposs de células, tejido y órganos del ratón. La expr expres esió ión n de este este tran transg sgen en sol solo ocurrirá donde la regi egión promotor/estimulador es activa. Cualquier fenotipo que desar esarro roll lle e el rat ratón, ayu ayudara ara a ente entend nder er los los efec efecto toss biol biológ ógico icoss del gen bajo estudio. Método
Se construye un transgen, definido como el gen más la región reguladora (promotor/enhancer) que es preparado para la inyección. El transgen en micro inyectado en óvulos fertilizados y se integra en el genoma, generalmente en un sitio único. Estos Estos óvul óvulos os fecu fecund ndad ados os son son luego implantados en una madre rece recept ptor ora, a, quie quien n lueg luego o pari parirá rá a
ratones “precursores” heterogéneos. Se habla de ratón “heter “heterogé ogéneo neo”” porque porque el gen se encuentra solo en uno de los dos cromosomas pares Los Los rato ratone ness prec precur urso sore ress son son cria criado doss rato ratone ness nor norma male less no no tran transg sgén énic icos os.. La prog progen enie ie será será tanto transgénicos y no transgénicos heterocigotos según las leyes mendelianas. Para obtener solo ratones homo homoci cigo goto toss que que cont conten enga gan n el transge sgen en ambos pares de cromosomas, dos ratones heterocigotos son son cruzado ados. Ratones transgénicos homocigotas tendrán el doble de la dosis de transgen que llevara a feno fenoti tipo poss dife difere rent ntes es y a efec efecto toss bio biológ lógico icos dist distin inttos que que a los los ratones heterocigotos.
Conclusiones El campo de la biología molecular crece a pasos agigantados. En la actualidad no hay prác prácti tica cam mente ente ning ningun una a disc discip ipli lina na biológica que no se haya visto beneficiada con los nuevos conocimientos que va aportando, a la vez que nos obligan a cambiar nuestro enfoque y llevar nuestro nuestro razonamiento hacia el nivel molecular. Es imprescindible que el dermatólogo de hoy tenga incorp incorpora orados dos conoci conocimie miento ntos s básico básicos s de biol biolog ogía ía molec molecula ular, r, ya que que de lo contrario no podrá estar a la altura no tan sólo de las nuevas técnicas diagnósticas y de investigación sino de los nuevos nuevos tratam tratamien ientos tos que se van van imponiendo a medida que la biología molec molecula ularr descub descubre re los mecani mecanismo smos s moleculares de las enfermedades que vemos día a día. En la práctica médica diaria y más aún en la derm ermato atologí logía a, don donde la obse observ rvac ació ión n cons consti titu tuye ye la base base del del proceso diagnóstico, cuando estudiamos estudiamos una lesión macroscóp macroscópica ica en un pac pacient iente e, pensa ensan ndo en las las posi posibl bles es caus causas as,, sin sin darn darnos os cuen cuenta ta nos nos trasl traslad adam amos os al nive nivell mole molecu cular lar teorizando que interacciones moleculares estarán implicadas en lo que que obse observ rvam amos os y dec decidim idimos os que que técnicas de biología molecular podríamos aplicar para establecer un diagnóstico, implementar un tratamiento, y mejorar el pronóstico.
Tal Tal vez vez el estu estudi dio o de la biol biolog ogía ía mole molecu cula larr pued pueda a ser ser “opc “opcio iona nal” l” en otras ramas de la medicina pero para el derm dermat atól ólog ogo, o, debe debe cons consid ider erar arse se como la membrana basal desde donde crec crece e y se dife difere renc ncia ia su form formac ació ión n como especialista.
Agradecimientos A Piwi (por aguantarme el mal humor, por darme amor) A Augusto, a Francisco, a Nacho (por darme tres razones para seguir) A mi Madre (sobran razones) A la Prof. Dra. Constanza E. Lorente (por su valioso asesoramiento) asesoramiento) A mi Familia (porque es la única que tengo) A la Prof. Dra. Ana María Lórenz (por darme la oportunidad de formarme en dermatología, por siempre tratar de inspirar a sus alumnos) A la Dra. María Elena Ricaud (por la paciencia) A los Sres. Docentes de la carrera (por la falta de mezquindad al compartir sus conocimientos) Al Sr. José Luis Carrazana, Secretario Secretario de la Cátedra de Dermatología (por su siempre buena disposición)
Bibliografía 1. Fitzpatrick’s Dermatology in General Medicine, Seventh Edition Vol. 1 & 2. Ed. McGrawHill Medical 2008. 2. Bolognia: Dermatology, 2 nd
ed. Vol 1. Ed. Mosby Elsevier 2008. 3. Biología Molecular de la Célula. Alberts, Bruce y col. Tercera Edición. Ed. Ediciones Omega , Barcelona, 1996. 4. Molecular Biology of the
Cell, Alberts, Bruce y col. Fourth Ed. GarlandScience, 2002. 5. Rook's textbook of
dermatology, 7 th Ed. Chapter 3 - Anatomy and Organization of Human Skin - J.A. McGrath, R.A.J. Eady & F.M. Pope, 2008, Wiley-Blackwell 6. Molecular Biology of the
Gene, 5th Ed. James Watson y Col. Pearson Education Inc. 2004 7. Collagen – Structure and
Mechanics , Ed. Springer Science , 2008 8. Dermatopathology, Werner Kempf and col. Ed. Steinkopff Verlag – Springer Science, 2008
9. Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine. 16 Vol. Wiley 2006
Handbook of 10. Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, Second Edition, CRC PRESS 2004 Histología de Di Fiore, 11. Ed. El Ateneo, 2001 Biología Molecular: La 12. Nueva Frontera, Eduardo Cadenas, Universidad de Alicante, 1986 La Biología Molecular y la Investigación en Dermatología, Orozco Topete, Rocío. Revista de Investigación Clínica. Vol. 55, Nº 2 - MarzoAbril 2003:168-171 13.
Molecular Cell Biology, Lodish and col. 5 th Edition Freeman, 2003 14.
Skin Cancer, Second Edition, Schwartz R.A., Blackwell Publishing 2008 15.
The Skin as a Model for Cell and Gene Therapy. Jorcano, JL Ciemat, Proyecto Genoma España. 2006 16.
Color Atlas and Synopsis of Clinical Dermatology. Fitzpatrick, TB and col. McGraw-Hill 1997. 17.
Referencias Bibliográficas
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Rees, Mina, “Warren Weaver, A biographical Memoir” National Academy of Sciences – Washington DC, 1987 Astbury, W.T. (1961) Nature, 190:1124 Stent, Gunther S. (1969), The Coming of the Golden Age: A View of the End of Progress, Garden City, New York: American Museum of Natural History Press Human Genome Project Information. Department of Energy USA www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/glossary/glossary_m.shtml Mendel, Gregor. Experiments in plant hybridization. (1865). Read at the February 8th, and March 8th, 1865, meetings of the Brünn Natural History Society (Original en alemán: Mendel, Gregor. 1866. Versuche über Plflanzenhybriden. Verhandlungen des naturforschenden Vereines in Brünn, Bd. IV für das Jahr 1865, Abhandlungen, 3–47) Morgan, Thomas H., Alfred H. Sturtevant, Hermann J. Muller, and C. B. Bridges (1915), The Mechanism of Mendelian Heredity , New York: Henry Holt and Company Morgan, Thomas H. (1926), The Theory of the Gene , New Haven: Yale University Press Hermann J. Muller (1936), “Physics in the Attack on the Fundamental Problems of Genetics”, Scientific Monthly , 44: 210–214 Erwin Schrödinger. What is life? The Physical Aspect of the Living Cell. Based on lectures delivered under the auspices of the Dublin Institute for Advanced Studies at Trinity College, Dublin, in February 1943 Schroedinger, Erwin (1944), What is Life?, Cambridge, UK: Cambridge University Press Hershey, A. D. and Martha Chase (1952), “Independent Functions of Viral Protein and Nucleic Acid in Growth of Bacteriophage”, The Journal of General Physiology , 36: 39–56 Pauling, Linus and Robert B. Corey (1953), “A Proposed Structure for the Nucleic Acids”, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) , 39: 84–97 Watson, J. D. and F. H. C. Crick (1953a), “A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid”, Nature, 171: 737–738. Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, and Norman Arnheim (1985), “Enzymatic Amplification of Beta-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia”, Science, 230: 1350–1354. Venter, J. Craig et al. (2001), “The Sequence of the Human Genome”, Science, 291: 1304–1351 Annette Wysocki y col. in Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, 2nd Edition. Volume 13:219 Edited by Robert A. Meyer, Copyright 2005 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim De la Torre Fraga, C., “Enfermedad de Darier segmentaria tipo 2”, Med Cutan Iber Lat Am 2009;37(6):262-265 Jorcano, José Luis (2006), “The skin as a model for cell and gene therapy”, Ciemat, Proyecto Genoma España. Rabinovich GA y col. Targeted inhibition of galectin-1 gene expression in tumor cells results in heightened T cell-mediated rejection; A potential mechanism of tumor-immune privilege. Division of Immunogenetics, Hospital
20
21
22
de Clinicas José de San Martín, Buenos Aires, Argentina. Cancer Cell. 2004 Mar;5(3):241-51 A. Camporeale, A. Boni, G. Iezzi, E. Degl'Innocenti, M. Grioni, A. Mondino, and M. Bellone, Critical Impact of the Kinetics of Dendritic Cells Activation on the in Vivo Induction of Tumor-specific T Lymphocytes, Cancer Res., July 1, 2003; 63(13): 3688 - 3694. Stoitzner P, Pfaller K, Stössel H, Romani N (2002) A Close-Up View of Migrating Langerhans Cells in the Skin. J Invest Dermat 118: 117-125. Porter S, Clark IM, Kevorkian L, Edwards DR (2005) The ADAMTS metalloproteinases. Biochem J 386: 15–27.
