BACTERIÓFAGO M13 El fago M13 es un bacteriófago bacteriófago filamentoso filamentoso compuesto por una única molécula de ADN monocatenario circular la cual tiene aproximadamente 64! nucleótidos de long longititud ud"" esta esta molé molécul cula a se encu encuent entra ra encap encapsu sula lada da en una una cubie cubiert rta a prote proteic ica a formada por aproximadamente #! copias de la prote$na ma%or de recubrimiento &'( % encapuc)ada en los extremos por cinco copias de dos diferentes prote$nas de recubrimiento menores *&+( &6( &3,- .a prote$na de recubrimiento menor &3 permite /ue el fago se una a un receptor presente en la punta de los pilli pilli del del )ospedador Esc)eric)ia colicoli- .a infección con bacteriófagos filamentosos no es letal para las bacterias" sin embargo la infección causa placas turbias en los culti0os de E- coli- Aun/ue no se trata de un 0irus l$tico( si se )a obser0ado una dism dismin inuc ució ión n en la 0elo 0eloci cida dad d de repr reprod oduc ucci ción ón de las las célu célula lass infe infect ctad adas as-.os plsmidos plsmidos M13 M13 llamados fagémidos fagémidos son son utili2ados en numerosos procesos de recombinació recombinación n de ADN( % el 0irus )a sido estudiado estudiado por las posibles aplicaciones aplicaciones en nanoestructuras nanoestructuras % % nanotecnolog$a nanotecnolog$a de de los principios /ue dominan su proceso de encapsulamiento.a familia de los fagos filamentosos pertenece al género de los no0irus( /ue comprende compren de una serie de bacter bacteriófag iófagos os acoplados con el ADN en forma de simpl simple e cadena - .os fagos filamentosos infectan las cepas de E-coli /ue contengan el pls pl smi mido do co con nug ugat ati0 i0o o 5( a tr tra0 a0és és de su un uniión al ex exttre remo mo de dell pi pillus % su translocación al citoplasma de la célula- El ensamblae en la membrana de la célula de E-coli % la salida de las part$culas 0irales no causan la lisis celular o muer mu erte te de la ba bact cteri eriaa- .a .ass ba bact cteri erias as in infe fect ctad adas as co cont ntin inúa úan n 0i 0i0a 0as" s" au aun/ n/ue ue su 0elocidad de crecimiento decrece.os fagos filamentoso tienen una morfolog$a cil$ndrica de + nm de largo por 6( nm de dimetro( % su cpsida est formada ma%oritariamente por la prote$na p7 con alrededor de # ! copias por fago- En una de estas extremidades se encuentran tres o cinco copias de las prote$nas menores p7 % p8 - .as dos prote$nas prote$ nas forman uniones con las regiones correspondientes correspondientes de la prote$na p7.a región de p8 /ue llega )asta el extremo amino9terminal de la prote$na p7 tiene la función de estabili2ar estabili2ar esta estructura desde el interiorinterior- .as prote$nas p7 % p se encuentran en el extremo contrario de las prote$nas p7 % p8 en el fago:ada fago tiene copias de cada de una de estas prote$nas- .a prote$na p es responsable por la unión del fago al pilus de E-coli % as$ iniciar el proceso de infección de E-coli-
.os 0ectores con los fragmentos clonados en fusión con la prote$na p o p7 son transformados en células competentes de E- coli de la cepa ;<1 %a /ue produce pili por lo tanto puede ser infectada por el fago M13)ttp=>>p)agedispla%-es>tec)nologia9p)age9displa%>
Bacter Bacterióf iófago ago temper temperad ado o del género género INOVIRUS que infect infecta a a las entero enterobac bacter terias ias,, especialmente a la E coli Es un fago filamentoso constituido por una !ebra de "#N $ que es permutada circularmente
El M13 es un fago filamentoso- ?e trata de un 0irus en forma de )ilo *+ nm de longitud( con sólo + nm de dimetro,( con un ADN en forma de anillo de una única )ebra *también denominada )ebra @, % una cubierta proteica de #!1 subunidades proteicas idénticasEl bacteriofago M13 tiene una cpside de tipo filamentoso dentro de la cual se encuentra una molécula circular de ADN de )élice sencilla de 6-4 nucleotidos- Al igual /ue 81!4( también pasa por una forma replicati0a dúplex-
5ago filamentoso M13
Es/uema del bacteriofago M13
Azul: Proteína pIII; Marrón: Proteína pVI; Rojo: Proteína pVII; Verde: Proteína pVIII; Fucsia: Proteína pIX; Púrpura: ADN onocatenario!
*7irus ADN monocatenario,
5amilia=
no0iridae
<énero=
no0irus
Especie=
5ago M13 de Enterobacteria
Características del Fago M13: ¬ "ietría ¬ In+ectan ¬ Poseen
#elicoidal! $iene % n de di&etro ' (%) n de lon*itud!
a tra,-s del Pili! ./! coli D#0 α F12
DNA onocatenario circular .32!
¬ "e ¬ /l
+oran ciertos loops por apareaientos de 4ases copleentarias!
ciclo replicati,o es coplejo: ecaniso de 5IR5678 R8DAN$/!
¬ /n
al*unos casos puede inte*rarse en el *enoa 4acteriano!
¬ 9a'
solapaiento de *enes
¬ Durante
la replicación se +oran F8RMA" R/P7I5A$IVA" de dsDNA! /l DNA .2 producido puede utilizarse para sintetizar RNA! ¬ Puede
li4erarse de la c-lula sin lisarla produciendo +a*os continuaente!
¬ /ste
+a*o #a sido u' utilizado en
presión en ensa'os de uta*-nesis así coo en ensa'os de clonación de +ra*entos de *ran taa?o!
Estructura del fago: .a cubierta proteica del fago se encuentra formada primariamente por un ensamble de monómeros de una prote$na formada por aminocidos llamada p7 *o p',( la cual se encuentra codificada por el gen 7 *o g', en el genoma del fago- Bn fago M13 de tipo sil0estre emplea aproximadamente unas #! copias de la prote$na p' para formar la cubierta /ue( t$picamente( tiene aproximadamente + nm de longitud- ?in embargo( las dimensiones de la cubierta son flexibles % el número de monómeros de p' utili2ados para formarla se pueden austar para empacar correctamente el tamaCo del genoma de cadena simple /ue lo forma- &or eemplo( cuando el genoma del fago se muta para reducir el número de bases de ADN *de 6(4 b a ##1 pb,( 1 el número de copias de p' utili2adas para empacarlo se reduce a menos de 1( pro0ocando /ue la cubierta de p' se auste para acomodar el genoma reducido- Aparentemente existe una limitación en la capacidad del fago para contener material genético /ue est en torno al doble de su contenido normal de ADN- ?in embargo( la deleción del gen /ue codifica para la prote$na p3 del fago pre0iene /ue este pueda escapar de su )ospedador E. coli ( % en estas condiciones es posible encontrar dentro de la célula )ospedadora fagos con una longitud de entre 1 % # 0eces la longitud normal( part$culas 0$ricas /ue poseen 0arias copas del genoma del fagoExisten también otras cuatro prote$nas en la superficie del fago( dos de las cuales )an sido extensamente estudiadas- En uno de los extremos del filamento )a% cinco copias de la prote$na de superficie p8 *p+, % de su prote$na acompaCante p7 *p!, /ue se encuentra ms profundamente encla0ada en la cubierta proteica del fago- ?i fuera posible comparar a la prote$na p' con el material del cual est formada el asta del bastón /ue es el fago( entonces
p! % p+ forman el pomo /ue es posible 0er en las microfotograf$as- Estas prote$nas son mu% pe/ueCas( conteniendo 33 % 3# aminocidos respecti0amente( sin embargo es posible aCadir residuos a la porción terminal de cada una( %a /ue esta porción se encuentra presente en la parte exterior de la cubierta- En el otro extremo del fago )a% cinco copias de la prote$na p *p3, expuestas en la superficie % de la prote$na accesoria p7 *p6, la cual se encuentra un poco menos expuesta- Estas forman el extremo redondeado del fago % son las primeras prote$nas en interaccionar con el )ospedador E. coli en el momento de la infección- .a prote$na p3( es adems el último punto de contacto con el )ospedador cuando la part$cula 0iral abandona la superficie bacteriana-
Ciclo de vida: .as etapas generales del ciclo de 0ida 0iral son= infección( replicación del genoma 0iral( ensamble de nue0as part$culas 0irales( % liberación de la progenie de part$culas del microorganismo )ospedador-
Infección .os fagos filamentosos utili2an una estructura bacteriana conocida como pilus 5 para infectar a E. coli - .a prote$na p3 del extremo del fago se ancla a la prote$na ;o1A del pilus bacteriano permitiéndole al fago transferir su genoma )acia el citoplasma de la bacteria( donde las en2imas de la ma/uinaria metabólica bacteriana con0ierten el genoma formado por una cadena simple de ADN *llamada cadena positi0a o @,( en la forma replicati0a *5, de ADN doble cadena- Esta forma replicati0a sir0e adems de molde para la expresión de los genes 0irales-
Replicación del genoma El ADN de fago /ue entra en la célula es de cadena sencilla % se lo suele llamar F)ebra @F Apenas penetra en la célula( la AN polimerasa de la célula )ospedadora sinteti2a un cebador en el origen de replicación- .a ADN polimerasa de la célula )ospedadora empie2a a sinteti2ar la cadena complementaria /ue se denomina F)ebra 9F- :uando la &ol encuentra el cebador se disocia del ADN- .uego la ADN &ol con acti0idad exonucleasa Gelimina el cebador % llena la brec)a- 5inalmente la ligasa suelda los dos tramos de ADN recién sinteti2ados- .a s$ntesis de la cadena 9 da lugar a un ADN de doble cadena llamado Fforma replicati0aFDos productos de los genes del 0irus cumplen un rol cr$tico en esta etapa del ciclo de 0ida del fago= Estos son la prote$na p *p#, /ue es una endonucleasa % pro0oca una FmuescaF en el
genoma 0iral cuando se encuentra en su forma de doble cadena( para posibilitar la iniciación en la replicación de la cadena @ % permanece unida al fosfato en el extremo G deando el extremo 3G libre- ?in la presencia de p#( no se puede producir la replicación del fago- .as en2imas de la bacteria )ospedadora 0an completando las cadenas @ con su cadena complementaria formando de esta manera múltiples copias del ADN 0iral en su forma de doble cadena- .a prote$na p7 *p, compite con la formación de ADN de doble cadena secuestrando copias sencillas de la cadena @ formando un compleo nucleoproteico /ue ser0ir de núcleo para la formación de nue0as part$culas 0irales.a prote$na ep del )uésped es una )elicasa /ue a%uda a desenredar el ADN en el punto donde se encuentra la muesca- .a ADN &ol del anfitrión utili2a extremo 3G libre como un cebador para la s$ntesis de una nue0a )ebra @( mientras /ue la 0iea se /uita- Bna 0e2 completada la replicación se obtienen dos moléculas de ADN= una circular de doble cadena % una de cadena sencilla( sobre esta última actúa la prote$na p# soldando el extremo G% 3G por medio de una reacción de transesterificación recreando de esta forma una )ebra @- Este proceso continúa )asta /ue se empie2a a acumular p- Esta prote$na se une al ADN de cadena sencilla @ % e0ita /ue se siga replicandoExiste adems una prote$na adicional codificada por el genoma del fago( la p8 *p1,( /ue es importante para regular el número de genomas de doble cadena en el )ospedador bacteriano?in la prote$na p1 no se acumulan cadenas @- .o /ue resulta particularmente interesante con respecto a esta prote$na es /ue es idéntica a la porción carboxilo terminal de p#( %a /ue el gen /ue codifica para p1 se encuentra de )ec)o dentro del gen p# % la prote$na surge de una iniciación diferencial de la transcripción dentro del gen de p#- Esto )ace /ue la manipulación de p1 se encuentre inextricablemente unida a la manipulación de p# *un 0erdadero dolor de cabe2a desde el punto de 0ista de la ingenier$a, pero esto logra una estructura genética sumamente compacta % eficiente en la naturale2a-
Ensamble de las partículas virales .a maduración del fago re/uiere de las prote$nas p7 *p4,( p *p1, codificadas también en el genoma 0iral( % de la prote$na p8 *p11,- Esta última es una prote$na codificada por el mismo gen p( % es producto de un punto de iniciación de transcripción diferencial- En la membrana externa de la bacteria se ensamblan múltiples copias *generalmente entre 1# % 14, de p4 para formar una estructura estable con forma de barril- En forma similar un puCado de p1 % p11 * o 6 copias de cada una, se ensamblan en la membrana interna de la bacteria( % la e0idencia genética sugiere /ue las porciones : terminales de p1 % p11 interaccionan con la porción N terminal de p4 en el periplasma- Estas prote$nas en conunto( p1( p11( p4" forman un compleo en forma de canal a tra0és del cual el fago maduro es secretado de su )ospedador bacteriano-
Excresión &ara iniciar la secreción del fago( dos de las prote$nas menores de la en0oltura= p+ % p!( interactúan con el compleo formado por ADN monocatenario % p a la altura de la región del ADN llamada secuencia de empaque *también conocida como secuencia &?,- Entonces las prote$nas p /ue recubren la )ebra de ADN monocatenario son reempla2adas por las prote$nas p' /ue se encuentran empotradas en la membrana celular de la bacteria % el fago en crecimiento es F)iladoF al atra0esar el canal formado por p1( p11 % p4- Este proceso de reempla2o de p por p' explica la e0idencia de microfagos presentada anteriormente indicando como es /ue el tamaCo de la part$cula 0iral se encuentra determinado por el número de bases empacadas dentro del fago- Bna 0e2 /ue el ADN 0iral se encuentra completamente recubierto con p'( se finali2a la secresión aCadiendo los capuc)ones p3>p6 % el fago se desprende de la superficie bacteriana-
Replicación en E. coli Debao se listan los pasos in0olucrados en la replicación del fago M13 en el anfitrión E- coli•
.a cadena de ADN 0iral *@, entra al citoplasma-
•
.as en2imas bacterianas sinteti2an la cadena complementaria *9,-
•
.a ADN girasa( una topoisomerasa tipo ( actúa sobre el ADN de doble cadena % catali2a la formación de superenrrollamientos de ADN doble cadena-
•
El producto final es la forma replicati0a *5, parental de ADN-
•
Bna prote$na del fago( p( )ace una muesca en la cadena 5 *@,-
•
El extremo 3G9)idroxilo actúa como cebador en la creación de una nue0a cadena 0iral-
•
.a p forma cadenas circulares a partir de la cadena *@, 0iral-
•
?e produce un reser0orio de moléculas 5 de doble cadena como progenie-
•
.a cadena *9, de la 5 funciona como molde para la transcripción-
•
.os ANm son traducidos a prote$nas del fago-
•
.os d$meros p7 unen a las cadenas simples de ADN recién sinteti2adas( % pre0ienen la con0ersiónn de estas a ADN 5-
•
.a s$ntesis de ADN 5 continúa )asta /ue p7 alcan2a una concentración cr$tica
•
.a replicación del ADN cambia )acia la s$ntesis de ADN 0iral *@, de simple cadena-
•
?e forman estructuras de p79ADN de aproximadamente ' nm de longitud % ' nm de dimetro-
•
.os compleos p79ADN sir0en como sustrato para la reacción de ensamble del fago-
Fagos con de !" monocatenario# El fago M13 como $erramienta en biología molecular#
/l 4acterió+a*o M@ destaca entre los +a*os utilizados en 4iolo*ía olecular! "e trata de un +a*o de cadena sencilla circular! A di+erencia del +a*o λ este +a*o in+ectan cepas de /! coli a tra,-s del Pili por ello la cepa /! coli D#0 α F1 resulta un receptor idóneo! Dentro de los +a*os con ssDNA nos encontraos B +ailias: Ino,iridae .+a*o Claentoso M@ ue in+ecta /ntero4acterias 2 ' Micro,iridae ./ntero+a*o ΦX@E2! /l +a*o M@ es un 4acterió+a*o Claentoso de G))n de lon*itud ' %!0n de anc#o ue contiene una ol-cula de ADN circular
onocatenario de sentido positi,o encapsulado por HB)) copias de la proteína de la capside *p( &s cinco copias de proteinas enores! /l ADN se e>tiende en el interior a lo lar*o del eje lon*itudinal de la partícula! 7as proteínas enores est&n iplicadas en el inicio del ensa4laje ' esta4ilidad de la partícula! 7as proteínas *p ' *p% participan en la unión a la c-lula #u-sped!
5uando el +a*o M@ in+ecta a una c-lula 4acteriana la cadena sencilla .cadena 32 se replica ' produce una ol-cula de do4le cadena denoinada +ora replicati,a .RF2! 7as ol-culas RF pueden considerarse siilares a los pl&sidos pudi-ndose insertar DNA e>ó*eno en sitios de restricción únicos presentes en el DNA del +a*o! 5uando se reinsertan en c-lulas 4acterianas las ol-culas RF se replican ' producen cadenas sencillas .32 en las ue #a' una cadena del DNA insertado! 7a c-lula #ace salir los clones de DNA de cadena sencilla ue produce M@ ue pueden recuperarse ' utilizarse directaente para su secuenciación o coo olde para alteraciones utacionales de la secuencia clonada!
$a4i-n se utilizan otros 4acterió+a*os coo ,ectores entre los ue destaca el +a*o de cadena sencilla M@! 5uando M@ in+ecta a una c-lula 4acteriana la cadena sencilla .cadena 32 se replica ' produce una ol-cula de do4le cadena denoinada +ora replicati,a .RF2! 7as ol-culas RF pueden considerarse siilares a los pl&sidos pudi-ndose insertar DNA e>ó*eno en sitios de restricción únicos presentes en el DNA del +a*o! 5uando se reinsertan en c-lulas 4acterianas las ol-culas RF se replican ' producen cadenas sencillas .32 en las ue #a' una cadena del DNA insertado! 7a c-lula #ace salir los clones de DNA de cadena sencilla ue produce M@ ue pueden recuperarse ' utilizarse directaente para su secuenciación o coo olde para alteraciones utacionales de la secuencia clonada!
Muta*-nesis diri*ida! 7os a,ances en las t-cnicas de síntesis de DNA #an acelerado los pro*resos e>perientados en el estudio de las +unciones de las proteínas ' de la e>presión *-nica! 6na de las +oras &s e+ecti,a de estudiar la relación entre la estructura ' la +unción proteicas consiste en alterar una porción deterinada de la proteína ' o4ser,ar los ca4ios +uncionales ue se producen! 9asta #ace unos a?os esto se realiza4a ediante la odiCcación uíica de aino&cidos indi,iduales o ediante inducción de utaciones en el *en ue codiCca la proteína o4jeto de estudio! "in e4ar*o la odiCcación uíica de una proteína no siepre es especiCca 'a ue pueden ,erse alterados ,arios aino&cidos ' no sólo el ue se desea alterar; por otro lado #asta #ace unos a?os no siepre era posi4le producir la utación adecuada en la localización del *en ue se desea4a! /stas diCcultades #an sido superadas en los últios a?os *racias a la t-cnica de la uta*-nesis diri*ida; en ella se sintetiza un oli*onucleótido de unas B) 4ases ue contiene el ca4io de secuencia deseado! Posteriorente se perite ue dic#o oli*onucleótido alterado con la utación o4jeto de estudio #i4ride con una copia onocatenaria del *en sal,aje ori*inal copleto; posteriorente se apliCca el coplejo ediante P5R con lo ue la polierasa e>tiende el oli*nucleótido ' copia el resto del *en diana para producir una nue,a copia del *en con la
utación deseada! "i unios el *en a un +a*o de DNA onocatenario coo es el caso del +a*o M@ puede introducirse el *en utado en una 4acteria #u-sped ' clonarse con lo ue o4tendreos *randes cantidades de una proteína utante para el estudio de su +unción!
Virus M13 El 0irus penetra E. coli a tra0és del pilus( /ue posibilita el intercambio de ADN entre bacterias- M13 es mu% útil por la posibilidad de obtener ADN en forma de )ebras simples- .as )ebras simples de los genes clonados se necesitan especialmente para la secuenciación del ADN % la mutagenésis in vitro-
Mapa genético del fago M13
El ADN de M13 no se integra *como en el fago lambda, en el genoma bacterianoNo pro0oca tampoco la lisis de las células- .a bacteria crece % se di0ide( sin embargo( ms lentamente /ue las células no infectadas- .as células )ias liberan toda0$a fagos M13&or generación se originan aproximadamente mil nue0os fagos M13- &uesto /ue el )uésped no muere( se pueden culti0ar % cosec)ar fcilmente en grandes cantidades-
M13 como vecor !e clonación Dado /ue el ADN de M13 es monocatenario( este bacteriófago es un 0ector con0eniente para la clonación de ADN- .a longitud de su genoma no es fio % por lo tanto es capa2 de aceptar ADN extraCo sin comprometer la 0iabilidad del fago- Bn 0ector de clonación particular /ue explota el ciclo de 0ida del fago M13 se llama FfagémidoFEl fagémido es una molécula circular de ADN de doble cadena de plsmido /ue contiene un origen de replicación *ori 7, % el origen de replicación de M13 pero /ue no contiene los genes /ue codifican para las prote$nas estructurales del fago- En un fagémido se puede clonar una secuencia de ADN de interés /ue se desea /ue se exprese en una población de células mediante la explotación de la infección por fagos- Debido a /ue el fagémido contiene solo el origen de replicación de fago( es incapa2 de generar las prote$nas estructurales necesarias para el ensamblae del fago % para el empa/uetamiento del ADN dentro de él- &or esta ra2ón( se utili2a el fago auxiliar M13H!- Este fago contiene un origen de replicación % de codificación para todas las prote$nas estructurales necesarias para el montae de la forma infecti0a del fago- :uando las células /ue contienen el fagémido se superinfectan con M13H!( la
Oras invesi"aciones
Desde la aparición de la tecnolo*ía de desplie*ue en +a*os la 4úsueda e identiCcación de ol-culas de inter-s 4ioló*ico #a tenido un a,ance ininente! Dic#a tecnolo*ía +ue descrita ' desarrollada por ,ez priera por =eor*e P! "it# en @G(0 en la cual epleó +a*os Claentosos de /sc#eric#ia coli .M@ +d ' +@2 coo ,e#ículos para e>presar di,ersas proteínas o p-ptidos coo parte de las proteínas de su cu4ierta! /sta tecnolo*ía #a tenido un au*e u' iportante en las &reas de la inunolo*ía 4iolo*ía celular +aracolo*ía ' en la in,esti*ación de +&racos! 7a t-cnica es una #erraienta poderosa para identiCcar ' caracterizar interacciones de polip-ptidos reco4inantes con sus 4lancos de unión! "u aplicación potencial inclu'e la identiCcación de ol-culas líderes para su uso en terap-utica por ejeplo epítopes con potencial uso inuno*-nico para el desarrollo de ,acunas o anticuerpos 4loueadores% ! 7os 4acterió+a*os son ,irus ue in+ectan una ,ariedad de 4acterias *ra ne*ati,as usando el pili F coo receptor! /l *enoa total del +a*o consiste de @@ *enes! 6n +a*o ,ia4le e>presa cerca de B E)) copias de la proteína VIII .pVIII2 ' de tres a cinco copias de la proteína III .pIII2 en su con+oración estructural a4as son las proteínas de elección para e>presar en +usión a los *enes correspondientes de las proteínas reco4inantes de inter-s%0 .Fi*ura 02! No o4stante a últias +ec#as se #an epleado los *enes de las proteínas VI%% VII ' IX con *ran ->ito%E%(! 7os +a*os Fi*ura 0! Representación esue&tica de .a2 un +a*o sil,estre .42 un p-ptido desple*ado en la proteína III .pIII2 ' .c2 un p-ptido desple*ado en la proteína VIII .pVIII2 de un +a*o! Claentosos no desarrollan in+ección lítica en /sc#eric#ia coli pero si inducen un estado en el
cual la 4acteria in+ectada produce ' secreta partículas ,irales ,i-ndose atenuada la di,isión celular! /n una priera *eneración se o4tienen cerca de @))) partículas ,irales ' su4secuenteente por cada di,isión celular son li4eradas cerca de @)) a )) partículas%G al edio a tra,-s de la e4rana 4acteriana esto representa una *ran ,entaja 'a ue +acilita los procesos de puriCcación de las partículas ,iralesE)! Asiiso las nue,as INM6N878=A /N/R8MARJ8 AN$I56/RP8": PR8PI/DAD/" AP7I5A5I8N/" K P/R"P/5$IVA" B etodolo*ías proporcionadas por la in*eniería *en-tica tales coo la inclusión de p-ptidos etiueta +acilitan el proceso de recuperación de los anticuerpos reco4inantes ediante el siple epleo de la croato*ra+ía de aCnidadE@ EB ! #ttp:LLre,istas!uis!edu!coLinde>!p#pLre,istaedicasuisLarticleL,ieFileL@G((LB0 G
