BAB 1 PENDAHULUAN
Hepar merupakan organ yang dikenal pertama kali dipengaruhi oleh penyakit otoimun, yaitu sekitar tahun 50-an. Sekarang ini telah dikenal sekitar 80 penyakit yang berhubungan berhubungan dengan otoimun. Setelah lima dekade, perhatian klinis terhadap penyakit hepar otoimun semakin meningkat, pengetahuan tentang patogenesis, pemeriksaan laboratorium dan terapi juga semakin berkembang. (Invernizzi & Mackay, 2008). Hepatitis otoimun merupakan salah satu penyakit otoimun yang terjadi di hepar, pada umumnya bersifat progresif dan dapat terjadi pada semua umur (Invernizzi & Mackay, 2008). Penyakit ini ditandai oleh aktivitas penyakit yang berfluktuasi secara spontan, hipergamaglobulinemia, dan adanya otoantibodi dalam sirkulasi yang memiliki respons terhadap obat-obat immunosupresan. Pemeriksaan klinis ataupun biokimia secara tunggal belum ada yang dapat membuktikan adanya hepatitis otoimun (Teufel et al ., ., 2009). International Autoimmune Hepatitis Group pada tahun 1992 telah merekomendasikan sistem skoring untuk menegakkan diagnosis hepatitis otoimun, yang kemudian direvisi pada tahun 1999. Sensitivitas sistem skoring ini berkisar 97%-100% dan spesifisitasnya untuk mengeksklusi hepatitis C kronis antara 66%-92% (Teufel et al ., ., 2009). Pada tinjauan pustaka ini akan dibahas tentang hepatitis otoimun dan pemeriksaan otoantibodinya.
1
BAB 2 HEPATITIS OTOIMUN
2.1 Definisi
Hepatitis otoimun merupakan hepatitis kronis yang bersifat progresif, tidak diketahui penyebabnya dan dapat terjadi pada semua umur (Czaja, 1995). Karakteristik hepatitis otoimun ditandai dengan adanya tampilan hepatitis dan infiltrasi sel plasma portal pada pemeriksaan histologi, hipergammaglobulinemia dan otoantibodi (Czaja, 1995; Czaja & Carpenter, 1993). Hepatitis otoimun merefleksikan interaksi kompleks antara faktor pemicu, otoantigen, predisposisi genetik dan imunoregulator (Czaja & Donaldson, 2000; Czaja, 2001).
2.2 Epidemiologi
Hepatitis otoimun diderita oleh 100.000 – 200.000 200.000 orang di Amerika dan terhitung pada 2,6% penerima transplantasi di Eropa dan 5,9% di Amerika (Wiesner et al , 1998). Insiden rerata tahunan hepatitis otoimun pada orang kulit putih Eropa Utara adalah 1,9 per 100.000 penduduk penduduk dan angka prevalensinya 16,9 per 100.000 penduduk. Di Norwegia dan Swedia rerata insidennya adalah 1-2 1 -2 per 100.000 orang per tahun dan angka prevalensinya 11-17 per 100.000 orang per tahun (Boberg et al , 1998; Werner et al , 2008). Hepatitis otoimun secara predominan lebih banyak diderita oleh perempuan dibandingkan laki-laki (Rasio: 3,6:1) dan dapat menyerang semua umur (Czaja et al , 1998; Gregorio et al , 1997; Fainboim et al , 1994). Selain terjadi pada orang kulit putih di Eropa utara dan Amerika utara, hepatitis otoimun
2
juga telah tel ah dikenal pada populasi orang kulit hitam, Arab, Jepang J epang dan di berbagai belahan dunia lainnya (Casanova & Bruno, 1997; Vazquez-Garcia, 1998; AlKhalidi & Al-Muzairai, 1998; Seki et al , 1990).
2.3 Klasifikasi
Berdasarkan penanda immunoserologi, hepatitis otoimun dibagi menjadi 3 tipe. Tipe 1 dan 2 memiliki perbedaan gambaran klinis, sedangkan tipe 3 hampir sama dengan tipe 1 tetapi berbeda pada profil otoantibodi (Tabel 2.1) (Czaja & Manns, 1995). Tabel 2.1 Tipe Hepatitis Otoimun
Hepatitits Otoimun Tipe 2 Anti-LKM1
Tipe 3 Anti-SLA/LP
Otoantibodi pANCA, yang berhubungan Antiaktin, Anti-ASGPR
Anti-LC1, Anti-ASGPR
ANA,SMA, Anti-ASGPR
Onset umur
Semua umur
2-14 tahun
Semua umur
Penyakit imun yang biasanya terjadi bersamaan
Tiroiditis otoimun, colitis ulseratif, sinovitis
Vitiligo, DM tipe 1, tiroiditis otoimun, APS1
= Tipe 1
Faktor genetik
DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*1501, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB*1301
HLA-B14, HLADR3, C4A-QO, DRB1*07
Belum diketahui
Otoantigen
Belum diketahui
P-450 IID6 (CYP2D6), P-450 IA2 (APS1), P-450 IA6 (APS1)
tRNP (Ser)Sec
Pengobatan
Kortikosteroid
Kortikosteroid
Kortikosteroid
Ciri-ciri Karakteristik otoantibodi
Tipe 1 ANA, SMA
3
2.3.1
Tipe 1
Hepatitis otoimun tipe 1 ditandai dengan adanya antinuclear antibodies (ANA) dan/atau smooth muscle antibodies (SMA) (Czaja & Manns, 1995). Tipe ini merupakan tipe yang terbanyak dari penyakit ini terutama pada orang kulit putih Eropa bagian utara dan Amerika utara. Pasien dengan hepatitis otoimun tipe 1 ditemukan 70% adalah perempuan usia < 40 tahun dan lebih dari 30%-nya terjadi bersamaan dengan penyakit imun lain seperti tiroiditis otoimun, sinovitis, atau colitis ulseratif (Czaja, 1984). Antinuclear antibodies dan SMA bukan merupakan penanda yang spesifik untuk suatu penyakit, tetapi karakteristiknya masih penting karena menunjukkan adanya mekanisme patogen dan otoantigen. Antinuclear antibodies bekerja melawan beberapa antigen nuklear, termasuk histon, ribonukleoprotein, kompleks ribonukleoprotein dan sentromer (Czaja et al , 1994, 1995; Chen et al , 1998). Smooth muscle antibodies menunjukkan reaktivitas terhadap aktin dan komponen nonaktin (tubulin, vimentin, desmin dan skeletin) (Whittingham et al , 1966; Toh, 1979). Otoantibodi lain yang memiliki potensi untuk diagnostik maupun prognostik pada hepatitis otoimun tipe 1 adalah perinuclear antineutrophil cytoplasmicantibodies asialoglycoprotein
(pANCAs)
dan
antibodi
(anti-ASGPR). Perinuclear
terhadap
antineutrophil
reseptor cytoplasmic
antibodies ditemukan pada 50% - 90% pasien dengan hepatitis otoimun tipe 1 dan tidak ditemukan pada hepatitis otoimun tipe 2 (Zauli et al , 1997; Orth et al , 1997). Target otoantigen hepatitis otoimun tipe 1 ini masih belum diketahui. Reseptor asialoglycoprotein merupakan kandidat otoantigennya karena berada pada
permukaan
hepatosit,
menangkap
4
dan
memobilisasi
peptida
dan
menghasilkan antibodi yang biasa ditemukan pada hepatitis otoimun. Tetapi perkembangan uji komersial untuk anti-ASGPR masih sulit sehingga potensinya dalam diagnostik maupun prognostik belum terealisasi (McFarlane et al ,1984; Porallaet al , 1991; Treichel et al , 1990).
2.3.2
Tipe 2
Hepatitis otoimun tipe 2 ditandai dengan adanya antibodi terhadap mikrosom hepar-ginjal tipe 1 ( Liver — kidney microsome tipe 1 / anti-LKM 1) (Homberg et al , 1987). Antibodi ini bereaksi pada tubulus proksimal ginjal murine dan sitoplasma hepar murine (Czaja & Homburger, 2001). Hepatitis otoimun tipe 2 secara predominan terjadi pada anak-anak (umur 12-14 tahun). Diantara orang dewasa kulit putih di Amerika utara hanya 4% yang memiliki anti-LKM 1, berbeda dengan di Eropa 20% pasien dengan diagnosis hepatitis otoimun tipe 2 adalah orang dewasa. Basis georafis dan variasi etnik distribusi penyakit ini mungkin dapat mencerminkan perbedaan faktor etiologi dan/atau predisposisi genetik yang belum diketahui (Homberg et al , 1987; Czaja et al , 1992). Diantara ketiga tipe, hanya hepatitis otoimun tipe 2 yang memiliki target otoantigen yang jelas, yaitu cytochrome monooxygenase P-450 IID6 (CYP2D6) yang merupakan enzim penting dalam metabolisme obat (Alvarez et al , 1985; Manns et al , 1991). Antibodi terhadap LKM 1 bereaksi dengan epitop pada antigen rekombinan dan menghambat aktivitas enzim secara invitro (Manns et al , 1990).
5
Pasien dengan hepatitis otoimun tipe 2 memiliki frekuensi yang tinggi terjadi bersamaan dengan penyakit otoimun lain, terutama diabetes melitus tipe 1, vitiligo dan tiroiditis otoimun. Hepatitis otoimun tipe 2 biasanya juga memiliki otoantibodi terhadap organ spesifik seperti antibodi terhadap sel parietal, pulau langerhans dan tiroid (Homberg et al , 1987). Hepatitis otoimun tipe 2 ditemukan pada 15% pasien dengan otoimmune polyglandular syndrome type 1 (APS1). Sindroma ini ditandai dengan displasia ektodermal, candidiasis mukokutaneus dan kegagalan organ endokrin multipel (paratiroid, ovarium dan adrenal). Target otoantigen yang berhubungan dengan APS1 adalah P-450 IA2 dan P-450 IA6 (Clemente et al , 1997). Antibodi terhadap liver cytosol type 1 (Anti-LC1) terdapat pada pasien yang tidak memiliki anti-LKM1 dan dipertimbangkan sebagai marker tambahan untuk memperkuat diagnosis hepatitis otoimun tipe 2. Anti-LC1 dianggap penting untuk prognostik karena keberadaannya pada pasien berumur muda dengan inflamasi berat (Abuaf et al , 1992). Kadar anti-LC1 dalam serum berfluktuasi sesuai dengan aktivitas inflamasi berbeda dengan anti-LKM1, dan anti-LC1 mungkin nantinya berguna sebagai marker inflamasi hepatoseluler atau sebagai pemeriksaan otoantigen yang berhubungan dengan beratn ya penyakit (Muratori et al , 1998).
2.3.3
Tipe 3
Hepatitis otoimun tipe 3 merupakan bentuk yang paling sedikit ditemukan. Tipe ini ditandai dengan adanya antibodi terhadap soluble liver antigen/liver pancreas (anti-SLA/LP) (Manns et al , 1987). Antibodi ini memiliki spesifitas
6
yang tinggi pada hepatitis otoimun dan taget otoantigennya juga telah diidentifikasi yaitu suatu protein sitosolik dengan berat molekul 50 kD (Stechemesser et al , 1993). Identitas protein ini belum ditetapkan, tetapi mungkin bertanggung jawab terhadap transfer kompleks RNA untuk menyatukan selenosistein kedalam rantai peptida (Costa et al , 2000). Pasien dengan antiSLA/LP tidak dapat dibedakan dengan hepatitis otoimun tipe 1 dari segi umur, jenis kelamin, frekuensi dan respon terhadap terapi kortikosteroid. Keberadaan anti-SLA/LP tidak menggambarkan perbedaan secara klinis dan otoantibodi ini dapat menjadi marker subgrup pasien dengan hepatitis otoimun tipe 1 yang keadaannya berat dan/atau kecenderungan untuk relaps setelah kortikosteroid dihentikan dibandingkan dengan yang seronegatif anti-SLA/LP (Kanzler et al , 1999; Baeres et al , 2000).
2.4 Patogenesis
Secara konseptual patogenesis hepatititis otoimun dapat dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu adanya faktor pemicu, genetik dan mekanisme otoreaktivitas.
2.4.1
Faktor Pemicu
Faktor lingkungan yang diperkirakan dapat menginduksi hepatitis otoimun masih belum pasti termasuk virus. Penemuan molekul mimicry dari reaksi silang antara epitop virus dan antigen hepar menambah kepercayaan bahwa penyakit ini dipicu oleh virus. Ada beberapa bukti yang menunjukkan bahwa virus measles, virus hepatitis, cytomegalovirus, dan virus Epstein-Barr bertindak sebagai
7
inisiator pada penyakit ini. Bukti yang terbanyak adalah berhubungan dengan virus hepatitis (Huppertz et al , 1995; Vento et al , 1997). Obat-obatan seperti oxyphenisatin, methyldopa, nitrofurantoin, diklofenak, interferon, pemoline, minocycline dan atorvastatin dapat menginduksi kerusakan hepatoseluler yang menggambarkan hepatitis otoimun (Lewis et al , 1998). Minocycline dan atorvastatin yang juga dapat menginduksi sindrom otoimun lain, paling banyak dilibatkan sebagai faktor pemicu yang potensial untuk penyakit ini (Nietsch et al , 2000).
2.4.2
Faktor Genetik
Pengetahuan tentang faktor genetik pada hepatitis otoimun kebanyakan berasal dari penelitian terhadap gen HLA yang berada pada lengan pendek kromosom 6 major histocompatibility complex (MHC). major histocompatibility complex merupakan sistem genetik polimorfik sehingga banyak gen yang mungkin terlibat, tetapi gen HLA menunjukkan peran yang dominan sebagai faktor predisposisi terjadinya hepatitis otoimun (Donaldson, 2002). Hepatitis otoimun tipe 1 memiliki faktor predisposisi genetik yang dominan. Pada orang kulit putih di Eropa utara dan Amerika utara pada umumnya memili kerentanan pada gen DRB1, terutama alel DRB1*0301 dan yang kedua adalah alel DRB1*0401 tetapi alel ini dapat menjadi faktor risiko yang independen. Delapan puluh lima persen pasien hepatitis otoimun tipe 1 memiliki gen DRB1*0301, DRB1*0401, atau keduanya (Doherty et al , 1994; Strettell et al , 1997). Berbeda dengan populasi di Eropa dan Amerika, di Jepang ditemukan
8
rendahnya
prevalensi
DRB1*0301,
hepatitis
otoimun
pada
umumnya
berhubungan dengan HLA-DR4 (Seki et al , 1992). Pengaruh faktor genetik terhadap kerentanan, ekspresi dan kebiasaan pada hepatitis otoimun ini pada dasarnya belum bisa dipastikan. Hipotesis yang ada menunjukkan bahwa kerentanan berhubungan dengan urutan asam amino yang dikode oleh DRB1*0301 dan DRB1*0401 pada antigen-binding groove dari antigen MHC kelas II. Antigen ini mempresentasikan peptida antigenik kepada sel Th CD4, dan kemampuan kompleks ini untuk mengaktivasi imunosit memengaruhi kekuatan respon imun dan terjadinya penyakit (Czaja, 2001). Analisis variasi urutan asam amino yang dikode oleh alel yang rentan pada hepatitis otoimun menunjukkan risiko penyakit ini berhubungan dengan 6 asam amino yang berada pada posisi 67-72 rantai polipeptida DRB dari molekul MHC kelas II (Doherty et al , 1994; Strettell et al , 1997). Lisin pada posisi DRB71 yang berlokasi di pinggir antigen binding groove, merupakan titik kontak utama antara peptida antigenik, antigen binding groove molekul MHC kelas II, dan reseptor antigen sel T dari sel Th CD4. Banyak alel yang mengkode lisin pada DRB71, dan terdapat beberapa alel yang berkontribusi pada kerentanan penyakit dan dosis pengobatan. Pasien dengan 3 atau 4 alel yang mengkode lisin pada DRB71 memiliki respon yang lebih buruk terhadap terapi kortikosteroid dibandingkan dengan pasien dengan 1 atau tidak ada alel yang mengkode lisin pada posisi ini (Czaja et al , 1997). DRB1*1501 yang mengkode isoleusin untuk leusin pada posisi DRB67 memiliki efek proteksi terhadap hepatitis otoimun tipe 1 pada pasien kulit putih. Selain itu yang lebih penting adalah DRB1*1501 juga mengkode alanin untuk
9
lisin pada posisi DRB71. Alanin secara struktur berbeda dengan lisin, dan substitusi ini akan merubah karakteristik antigen binding dari MHC kelas II. Substitusi asam amino tunggal pada tempat yang kritis ini dapat memengaruhi terjadinya penyakit dan prognosis (Doherty et al , 1994; Strettell et al , 1997). Tidak semua pasien dengan hepatitis otoimun memiliki kerentanan alel yang sama, dan tidak semua pasien dengan kerentanan alel yang sama memiliki tampilan klinis sama (Czaja et al , 2001). Kerentanan alel pada orang Meksiko (DRB*0404), Jepang (DRB1*0405), dan amerika selatan (DRB*1301) berbeda dengan orang kulit putih Amerika utara dan Eropa utara. Temuan ini menghasilkan suatu hipotesis bahwa risiko penyakit berhubungan dengan urutan asam amino yang mengkode antigen binding groove MHC kelas II (Czaja et al , 2000). Hipotesis lain yang juga berkembang untuk mengevaluasi dasar perbedaan tampilan klinis dan prognosis menyatakan bahwa adanya faktor pendukung didalam maupun diluar MHC dapat memengaruhi terjadinya penyakit. Jenis kelamin
perempuan
contohnya
merupakan
contoh
pendukung
otoimun
nonspesifik yang mungkin dapat memengaruhi terjadinya penyakit melalui efek estrogen (Whitacre et al , 1999). Dasar kelainan genetik pada hepatitis otoimun tipe 2 masih belum sepenuhnya diketahui. Laporan terbaru menunjukkan terdapat hubungan dengan HLA-B14, HLA-DR3, dan C4A-QO, tetapi banyak penelitian baru-baru ini dengan menggunakan teknik resolusi tinggi berdasarkan DNA menggambarkan DRB1*07 sebagai faktor risiko pada pasien di Brazil dan Jerman (Bittencourt et al , 1999).
10
2.4.3
Mekanisme Otoreaktivitas
Ada 2 mekanisme yang mungkin menyebabkan terjadinya kerusakan sel hepar pada hepatitis otoimun. (1) Sel mediator sitotoksik mengalami diferensiasi untuk mengaktifkan sel Th CD4 menjadi limfosit T sitotoksik. Efektor ini kemudian menyebabkan terjadinya kerusakan sel hepar melalui pelepasan limfokin. Sitokin tipe 1 yang terutama terdiri dari
IL-2, IL-12, dan TNFα
mengatur respon ini. Percobaan dengan antigen yang disensitisasi, limfosit T sitotoksik spesifik dalam jaringan hepar pasien mendukung mekanisme ini (Lohr et al , 1991). (2) Peran sel mediator antibody-dependent cytotoxicity juga memungkinkan melalui rusaknya pengaturan produksi IgG oleh sel plasma yang menghasilkan kompleks antigen-antibodi pada membran permukaan hepatosit. Kompleks ini kemudian menjadi target reseptor Fc dari sel natural killer (sel NK) yang dapat menyebabkan sitolisis. Respon sitokin tipe 2 akan mengatur jalur ini, IL-4 dan IL-10 merupakan mediator utama. Hipotesis ini didukung oleh percobaan terhadap aggregat antigen-antibodi pada permukaan hepatosit dan ekspresi IL 10 yang berlebihan pada beberapa pasien (Czaja et al , 2000).
2.5 Gejala Klinis
Pasien hepatitis otoimun menunjukkan gejala klinis yang bervariasi dan tidak spesifik seperti letih, lesu, rasa tidak enak badan, anoreksia, mual, nyeri perut, gatal-gatal, dan atralgia yang melibatkan sendi-sendi kecil. Pemeriksaan fisik bisa tidak terdapat abnormalitas, tetapi bisa juga menunjukkan adanya hepatomegali, ikterik, dan gejala-gejala penyakit hepar kronis (Krawitt, 2006)
11
2.6 Diagnosis
Diagnosis hepatitis otoimun ditegakkan berdasarkan kelainan histologis, gejala klinis dan pemeriksaan laboratorium, seperti kadar globulin serum yang abnormal, dan ditemukannya satu atau lebih otoantibodi. Algoritma pemeriksaan otoantibodi pada hepatitis otoimun dapat dilihat pada Gambar 2.1 (Krawitt, 2006; Manns et al , 2010). Kriteria diagnostik untuk hepatitis otoimun dan sistem skoring diagnostik telah dibuat oleh Badan Internasional pada tahun 1992 (Tabel 2.2) dan direvisi pada tahun 1999 (Tabel 2.3). Kriteria klinis diagnosis cukup untuk membuat atau mengeksklusi diagnosis definitif atau kemungkinan hepatitis otoimun pada sebagian besar pasien. Sistem skoring yang telah direvisi dikembangkan sebagai alat penelitian untuk memastikan kesamaannya dengan penelitian populasi pada percobaan klinis, dan telah diaplikasikan secara diagnostik pada kasus-kasus yang tidak tercakup oleh kriteria deskriptif (Alvarez et al , 1999).
Tabel 2.2 Susunan Kriteria Diagnostik Kelompok Hepatitis Otoimun Internasional Ciri-ciri Definitif Kemungkinan Histologi hepar Tampilan hepatitis moderat = definitif atau berat dengan atau tanpa hepatitis lobular atau nekrosis bridging portal sentral, tetapi tanpa lesi bilier atau well defined granulomas atau perubahan mencolok lain yang menunjukkan etiologi berbeda
12
Biokimia serum
Terdapat abnormalitas pada = definitif, tetapi aminotransferase serum, konsentrasi Cu atau terutama jika alkali seruloplasmin serum fosfatase serum tidak pasien abnormal, meningkat. Konsentrasi alfa dengan syarat penyakit antitripsin, Cu, dan wilson sudah dieksklusi seruloplasmin serum dengan pemeriksaan normal yang tepat
Imunoglobulin serum
Total globulin serum atau γ globulin atau konsentrasi IgG > 1,5 kali batas atas normal
Terdapat peningkatan globulin serum atau γ globulin atau konsentrasi IgG diatas batas atas normal
Otoantibodi serum
Seropositif ANA, SMA, atau antibodi anti LKM 1 pada titer > 1:80. Titer yang lebih rendah (terutama anti LKM 1) mungkin signifikan pada anak. Seronegatif AMA
= definitif, tetapi titer 1:40 atau lebih. Pasien yang seronegatif untuk antibodi ini tetapi seropositif untuk antibodi spesifik lain dapat dimasukkan.
Marker virus
Seronegatif marker infeksi yang sedang terjadi untuk virus hepatitis A, B dan C
= definitif
Faktor penyebab lain
Rerata konsumsi alkohol < 25 g/hari. Tidak ada riwayat penggunaan obat hepatotoksik
Konsumsi alkohol < 50 g/hari dan tidak menggunakan obat hepatotoksik. Pasien yang mengkonsumsi alkohol lebih banyak atau yang menggunakan obat yang potensial hepatotoksik dapat dimasukkan, jika ada bukti jelas terjadinya kerusakan hepar terusmenerus setelah bebas dari alkohol atau penghentian obat. (Alvarez et al , 1999)
13
Tabel 2.3 Revisi Sistem Skoring Kelompok Hepatitis Otoimun Internasional Jenis Perempuan +2 HLA DR3 atau kelamin DR4
+1
Rasio ALP:AST (atau ALT
>3 <1,5
-2 +2
Penyakit imun
Tiroiditis, kolitis, dan lai-lain
+2
Kadar γ globulin atau IgG diatas normal
>2,0 1,5-2,0 1,0-1,5 <1,0
+3 +2 +1 0
Marker lain
Anti SLA, anti aktin, anti LC1, paNCA
+2
Gambaran histologis
Tampilan hepatitis
+3
Plasmasitik
+1
Rossete
+1
Tidak ada yang diatas
-5
Perubahan bilier
-3
Ciri lain
-3
Komplit
+2
Relaps
+3
Titer ANA, SMA, atau anti LKM 1
AMA Marker virus Obatobatan Alkohol
>1:80 1:80 1:40 <1:40 Positif Positif Negatif Ya Tidak <25 g/hari >60 g//hari
+3 +2 +1 0 -4 -3 +3 -4 +1 +2 -2
Respon pengobatan
Kumpulan skor sebelum pengobatan Diagnosis definitif > 15 Diagnosis mungkin 10-15 Kumpulan skor setelah pengobatan Diagnosis definitif > 17 Diagnosis mungkin 12-17 (Alvarez et al , 1999)
14
Gambar 2.1 Penggunaan Uji Serologi dalam Diagnosis Hepatitis Otoimun (Manns et al , 2010)
2.7 Terapi 2.7.1 Indikasi Terapi
Indikasi absolut dan relatif untuk pengobatan didasarkan pada pengalaman klinis dari percobaan pengobatan yang telah terkontrol (Tabel 2.2) dan pengamatan jangka panjang (Czaja, 1995). Pasien dengan penyakit berat berdasarkan indikasi klinis, laboratorium dan gambaran histologis memiliki prognosis yang buruk dan sangat membutuhkan pengobatan. Analisis retrospektif menunjukkan kemampuan bertahan hidup selama 3 tahun pada pasien dengan penyakit berat adalah sekitar 50%, dan kemampuan bertahan hidup 10 tahun hanya 10%. Penelitian prospektif menunjukkan bahwa mortalitas pada kelompok ini sebanyak 40% dalam 6 bulan (Summerskill, 1974). Berbeda dengan pasien penyakit ringan, kelompok ini memiliki harapan bertahan hidup normal selama 5 tahun, dan risiko terjadinya sirosis tidak lebih
15
dari 17% tanpa pengobatan. Pada pasien ini rasio keuntungan-kerugian terapi mungkin sangat rendah untuk membenarkan pemberian terapi (Schalm et al , 1977). Tabel 2.4 Indikasi Pengobatan Absolut
AST serum ≥ 10 kali batas atas normal AST serum ≥ 5 kali batas atas normal dan kadar γ-globulin ≥ 2 kali normal
Relatif Gejala (fatique, arthtralgia, ikterik)
Tidak Tidak ada gejala dan tampilan ringan atau hepatitis portal
AST serum dan/atau γ-globulin < kriteria absolut
Sirosis inaktif Sirosis inaktif dekompensata
Tampilan hepatitis Bridging necrosis atau multilobular nekrosis pada jaringan hepar *AST = aspartate aminotransferase
(Al-Khalidi & Czaja, 2001)
2.7.2 Regimen Terapi
Prednison secara tersendiri atau kombinasi prednison dosis lebih rendah dengan azathioprine efektif dalam pengobatan semua bentuk hepatitis otoimun (Tabel 2.3). Kedua regimen ini menginduksi remisi secara klinis, laboratorium dan gambaran histologis pada 65% pasien dalam 18 bulan. Harapan hidup pasien yang diterapi melebihi 80% setelah 20 tahun observasi dan tidak berbeda antara umur dan jenis kelamin dibandingkan dengan kontrol normal dari daerah geografis yang sama. Perkembangan menjadi sirosis terjadi pada 40% pasien dalam 10 tahun meskipun diterapi (Roberts et al , 1996). Pengobatan yang dianjurkan adalah prednison yang dikombinasi dengan azathioprine. Kombinasi ini menggunakan dosis prednison yang lebih rendah dan dihubungkan dengan rendahnya efek samping setelah terapi kortikosteroid.
16
Prednison tunggal digunakan pada pasien dengan penyakit berat, kehamilan, defisiensi tiopurin metiltransferase, atau keganasan aktif. Terapi ini juga dapat digunakan pada pasien dengan indikasi relatif yang mendapat pengobatan selama 6 bulan atau kurang. Transplantasi hepar dilakukan pada pasien dengan penyakit dekompensata yang sudah tidak respon terhadap terapi konvensional (Al-Khalidi & Czaja, 2001). Anjuran pengobatan untuk anak hampir sama dengan orang dewasa tetapi penetapannya tidak kaku. Prednison merupakan obat utama dan biasanya digunakan dosis 2 mg/kg BB/hari. Tappering regimens atau alternate-day schedules sering dilakukan mengingat efek kortikosteroid yang terhadap penutupan garis pertumbuhan, perkembangan tulang dan tampilan fisik pada anak (Roberts, 1995). Tabel 2.5 Regimen Terapi Regimen
Kombinasi Prednison (mg)
Azathioprine (mg) Prednison Tunggal (mg)
Dosis Harian 30 selama 1 minggu 20 selama 1 minggu 15 selama 2 minggu 10 untuk pemeliharaan 50 untuk pemeliharaan 60 selama 1 minggu 40 selama 1 minggu 30 selama 2 minggu 20 untuk pemeliharaan
* TMT = tiopurin metiltransferase
Kontraindikasi Relatif Sitopenia berat, defisiensi TMT, kehamilan, keganasan aktif
Obesitas, osteopenia, emosi yang labil, kecendrungan diabetes, hipertensi, menopouse, jerawat. (Al-Khalidi & Czaja, 2001)
2.7.3 Hasil Terapi
Terapi dilakukan sampai terjadi remisi, kegagalan pengobatan, respons tidak komplit atau terjadi keracunan obat (Tabel 2.4) (Czaja, 1994).
17
Tabel 2.6 Hasil Terapi dan Respons Hasil Definisi
Remisi
Respons
Gejala tidak ada, AST ≤ 2 kali batas normal, jaringan hepar normal, hepatitis portal, atau sirosis inaktif
Penghentian bertahap prednison sampai 6 minggu, periksa kadar AST serum, bilirubin dan γglobulin setiap 3 minggu selama 3 bulan, kemudian setiap 6 bulan selama 1 tahun, lalu setiap tahun
Pengobatan Kadar AST dan/atau gagal bilirubin > 66% dari nilai awal, peningkatan aktivitas histologis, dan/atau perburukan klinis selama terapi
Prednison 60 mg/hari, atau prednison 30 mg/hari dengan azathioprine 150 mg/hari selama minimal 1 bulan, kemudian kurangi dosis prednison 10 mg setiap bulan dan azathioprine 50 mg setiap bulan sampai kadar pemeliharaan didapatkan; 6-mercaptopurine 1,5 mg/kg BB/hari dapat digunakan untuk menggantikan azathioprine; transplantasi hepar jika terjadi dekompensasi secara klinis.
Respons tidak komplit
Tidak ada atau beberapa perbaikan pada klinis, laboratorium, dan gambaran histologis walaupun diterapi setelah 2-3 tahun
Pengurangan dosis prednison 2,5 mg/bulan sampai kadar terendah (≤10 mg/hari) yang memungkinkan untuk mencegah perburukan abnormalitas AST dan ALT serum
Keracunan obat
Obesitas atau perubahan Penurunan dosis 50%; penghentian kosmetik yang tidak bisa jika tidak ada perbaikan dengan ditoleransi, psikosis, penurunan dosis atau keracunan osteoporosis dengan gejala berat; pengobatan hanya dengan penyakit tulang, obat yang dapat ditoleransi; 6kecenderungan diabetes, mercaptopurine 1,5 mg/kg BB/hari atau tukak lambung selama mungkin lebih bisa ditoleransi terapi prednison; sitopenia daripada azathioprine. progresif, penyakit kolestasis hepar, mual dan muntah, keganasan, atau rash selama terapi azathioprine (Al-Khalidi & Czaja, 2001, Manns et al , 2010)
18
2.8 Relaps
Relaps ditunjukkan oleh timbulnya kembali aktivitas penyakit setelah penghentian obat dan ditandai oleh peningkatan kadar AST serum lebih dari 3 kali normal.
Penelitian
sebelumnya
menunjukkan
bahwa
tingkat
perubahan
konsentrasi AST serum sangat berhubungan dengan tampilan hepatitis pada pemeriksaan histologis (Czaja et al , 1981). Relaps biasanya terjadi pada 6 bulan pertama setelah penghentian terapi (50%), dan frekuensinya menurun dengan peningkatan lamanya waktu remisi. Kemungkinan terjadinya relaps setelah 1 tahun remisi adalah 8% (Al-Khalidi & Czaja, 2001). Pasien hepatitis otoimun yang relaps diberikan terapi ulang dengan jadwal pemberian obat seperti biasa. Kecepatan respon dalam memberikan pengobatan ulang dapat mengantisipasi relaps lebih lanjut dan biasanya pasien akan mengalami remisi kembali. Pasien yang pernah mengalami relaps cenderung untuk relaps kembali, sehingga keputusan penghentian pengobatan setelah terjadinya remisi kedua didasarkan pada rasio keuntungan-resiko relaps kembali dan pengobatan ulang (Czaja et al , 1981).
19
BAB 3 PEMERIKSAAN OTOANTIBODI
3.1 Pemeriksaan Anti Nuclear A nti body (ANA) 3.1.1
Teknik Indirek Fluoresen Antibodi (IFA) ANA/HEP-2 (Diagnostic
Otomation, 2010) 3.1.1.1 Prinsip Pemeriksaan
Uji ANA/HEp-2 merupakan kit yang sudah distandardisasi untuk mendeteksi adanya ANA pada serum manusia. Sistem ini bekerja pada substrat kultur sel dan goat anti-human immunoglobulin yang telah disesuaikan untuk penggunaan yang optimum dan pewarnaan yang non spesifik atau bebas. Reaksi terjadi dalam 2 langkah : 1. Interaksi pertama ANA pada serum pasien dengan substrat kultur sel. 2. Interaksi kedua adalah anti-human immunoglobulin yang telah dilabel dengan FITC dengan antibodi yang berikatan dengan substrat sel pada langkah pertama. 3.1.1.2 Spesimen
Serum yang fresh atau serum yang disimpan dengan ketentuan: pada suhu ruangan tidak lebih dari 8 jam, suhu 2-10 °C tidak lebih dari 48 jam, suhu -20 °C atau lebih rendah jika ditunda lebih dari 48 jam. Pembekuan dan thawing yang berulang sangat dihindari karena dapat menyebabkan hilangnya aktivitas antibodi dan dapat menimbulkan kesalahan pada hasil. 3.1.1.3 Alat dan Bahan
1.
Pipet kecil selogis, pasteur, kapiler atau otomatis
20
2.
Tabung pemeriksaan yang kecil, 13x100 mm atau yang sebanding
3.
Tempat pewarnaan
4.
Cover slips
5.
Ruang basah
6.
Aqua destilata
7.
Pipet 5 ml
8.
Pipet multi-channel (5, 10, 15, dan 195 ml)
9.
Tempat pembuangan reagen PBS dan konjugat
10. Piringan mikrotiter pengenceran sampel 11. Mikroskop fluoresen 3.1.1.4 Bahan yang telah disediakan
Reagen reaktif : 1. Goat anti-human immunoglobulin yang telah di label dengan fluorescein isothiocyanate (FITC) 2. Serum kontrol positif ANA 3. Serum kontrol negatif ANA 4. Evan blue counterstain 5. Slide substrat kultur sel ANA HEp-2 6. Diluent yang diformulasi untuk mengurangi pewarnaan non spesifik Reagen non reaktif 1. Phosphate-buffered-saline (PBS), pH 7,2 ± 0,2 2. Phosphate buffered glycerol (media penempelan) 3. Cover slips 4. Plate dilusi sampel untuk mempersiapkan pengenceran sampel
21
5. Pengering tinta 3.1.1.5 Penyimpanan
1. Slide substrat kultur sel disimpan pada suhu -20 °C - 8 °C 2. Goat anti-human immunoglobulin yang telah dilabel dengan FITC disimpan pada suhu 2-8 °C 3. Diluent disimpan pada suhu 2-8 °C 4. Phosphate-buffered-saline (PBS) disimpan pada suhu 2-25 °C (stabil sampai 30 hari jika disimpan pada suhu 2-8 °C) 5. Phosphate buffered glycerol disimpan pada suhu 2-8 °C 3.1.1.6 Kontrol Kualitas
1. Dilakukan setiap melakukan pemeriksaan, kontrol positif, kontrol negatif, dan buffer harus masuk. 2. Direkomendasikan untuk kontrol positif dan negatif dibaca lebih dahulu untuk mengevaluasi sampel pemeriksaan. Jika kontrol tidak tampak seperti yang telah dideskripsikan, hasil invalid. a. Kontrol negatif : ditandai dengan tidak adanya fluoresen spesifik dan pewarnaan latar belakang merah dari semua sel b. Kontrol positif homogen ditandai oleh fluoresen apple-green. 3. Kontrol tambahan dapat dilakukan, sesuai dengan protap daearah atau organisasi setempat. 3.1.1.7 Prosedur Pemeriksaan Persiapan Reagen
1. Phosphat-buffered-saline (PBS). Satu paket buffer dimasukkan ke dalam 1 liter aqua destilata, dicampur sampai semua garam larut.
22
2. Serum kontrol positif ANA (pengunaan sesuai paket) 3. Serum kontrol negatif ANA (penggunaan sesuai paket) 4. Konjugat goat anti-human immunoglobulin yang telah dilabel dengan FITC (penggunaan sesuai paket). Prosedur:
1. Pindahkan slide dari penyimpanan dan biarkan di suhu ruangan (20-25 °C). Lapisan pelindung di buka dan slide yang mengandung substrat kultur sel HEp-2 dikeluarkan. 2. Serum pasien disiapkan dengan pengenceran 1:40 dengan PBS (contoh: 10 ul sampel + 390 ml PBS) 3. Setiap well diberi identitas yang tepat dengan serum pasien dan kontrol 4. Jika sampel dititer, pengenceran serial dilakukan dengan PBS. 5. Slide diinkubasi dalam tempat yang lembab pada suhu kamar (20-25 °C) selama 30 menit. 6. Slide dipindahkan dari tempat yang lembab dan dibilas dengan PBS yang alirkan 7. Slide diletakkan dalam tempat pewarnaan dan dicuci dalam PBS dua kali dengan interval 5 menit, menggunakan pengaduk magnetik atau alat lain secara hati-hati. 8. Slide segera dikeluarkan dari PBS. Slide dibalikkan dan well dikunci. Noda slide pada sisi lain dibersihkan dengan kertas penyerap. 9. Pewarnaan evan blue ditambahkan 5-10 tetes kedalam tempat pewarnaan pada lima menit kedua pembilasan dengan PBS.
23
10. Slide segera diperiksa dengan mikroskop fluoresen. Jika pemeriksaan ditunda, tutup coverslip dengan cat kuku dan simpan dilemari es, tetapi sangat direkomendasikan agar slide diperiksa pada hari yang sama. 3.1.1.8 Interpretasi
1. Interpretasi hasil tergantung pada pola penelitian, titer otoantibodi, umur pasien. Pada umur tua khususnya perempuan ada kecenderungan titer otoantibodi rendah (<1:80) tanpa adanya penyakit otoimun secara klinis. Sebaliknya titer 1:20 pada umur muda mungkin menunjukkan penyakit dapat timbul dikemudian hari. 2. Titer < 1:40 dianggap negatif 3. Tes positif : suatu reksi positif ditandai dengan adanya pola pewarnaan inti apple-green. Pengeceran 1:40 berdasarkan intensitas pewarnaan, skala +1 sampai +4. Positif satu dianggap reaksi lemah dan +4 reaksi kuat. Semua serum positif pada pengenceran 1:40 harus dititer sampai pengenceran terakhir, contoh: 1:40, 1:80, 1:160 dan seterusnya. Titer terakhir merupakan pengenceran terakhir yang menghasilkan reaksi positif +1. 3.1.1.9 Hasil yang diharapkan
Nilai yang diharapkan pada populasi normal adalah negatif, tetapi pada individu yang terlihat sehat serumnya dapat mengandung ANA. Persentase ini meningkat sesuai umur terutama pada dekade ke-7 kehidupannya.
24
3.1.2 Teknik ELISA (Diagnostic Otomation, 2009) 3.1.2.1 Prinsip Pemeriksan
Sistem pemeriksaan ELISA ANA dirancang untuk mendeteksi antibodi IgG terhadap antigen nuclear yang biasa terdapat pada serum manusia. Well pada strip microwell plastik disensitisasi dengan absorpsi pasif antigen. Prosedur pemeriksaa terdiri dari 3 tahap inkubasi : 1. Serum yang diperiksa diinkubasi dalam microwell yang dilapisi antigen. Beberapa antibodi spesifik antigen pada sampel berikatan dengan antigen tidak bergerak. Plate dicuci untuk memisahkan antibodi yang tidak berikatan dan komponen serum lainnya. 2. Konjugasi peroksidae goat anti-human IgG ditambahkan ke dalam well dan plate diinkubasi. Konjugat akan bereaksi dengan antibodi tidak bergerak pada fase solid langkah 1. Well dicuci untuk membuang konjugat yang tidak bereaksi. 3. Microwell yang berisi konjugat peroksidase tidak bergerak diinkubasi dengan larutan substrat peroksidase. Hidrolisis substrat oleh peroksidase menghasilkan perubahan warna. Setelah beberapa waktu reaksi dihentikan dan intensitas warna larutan diukur secara fotometrik. Intensitas warna larutan tergantung pada konsentrasi antibodi dalam sampel. 3.1.2.2 Alat dan Bahan
ELISA microwell reader yang dapat membaca pada panjang gelombang 450 nm
Pipet dengan akurasi 10-200 ul
25
Pipet multichannel dengan akurasi 50-200 ul
Tempat reagen untuk pipet multichannel
Botol pencuci atau sistem pencucian microwell
Aqua destilata
Tabung 1 liter
Pipet serologis
Disposible pipette tips
Kertas pengering
Timer
Baskom pembuang dan desinfektan
Setiap kit mengandung : Plate Konjugat Kontrol positif Kalibrator Kontrol negatif Diluen sampel Larutan tetrametilbenzidin (TMB) Larutan stop Wash buffer concentrate
3.1.2.3 Kontrol Kualitas
1. Setiap melakukan pemeriksaan kalibrator dijalankan tiga kali, disamping blank, kontrol negatif dan kontrol positif
26
2. Hitung rerata ketiga well kalibrator. Jika ada dari tiga nilai memiliki perbedaan lebih dari 15% dari rerata, buang nilai tersebut dan hitung rerata menggunakan 2 well yang tersisa 3. Nilai rerata OD kalibrator dan nilai OD kontrol positif dan negatif harus masuk dalam rentang dibawah ini : Rentang OD Kontrol negatif
≤0,250
Kalibrator
≥0,300
Kontrol positif
≥0,500
a. OD kontol negatif dibagi rerata OD kalibrator harus ≤ 0,9 b. OD kontrol positif dibagi rerata OD kalibrator harus ≥ 1,25 c. Jika kondisi diatas tidak ditemukan pemeriksaan dianggap invalid dan harus diulang. 4. Kontrol positif dan negatif digunakan untuk melihat kerusakan reagen dan tidak menjamin ketepatan cut-off pemeriksaan. 3.1.2.4 Prosedur Umum
1. Pindahkan komponen dari tempat penyimpanan dan biarkan pada suhu kamar (20-25 °C) 2. Hitung jumlah microwell yang dibutuhkan. Sediakan 6 (1 untuk blank, 1 kontol
negatif,
3
kalibrator,
dan
1
kontrol
positif)
untuk
kontrol/kalibrator per setiap pemeriksaan. Periksa software dan reader yang sesuai dengan petunjuk kontrol/kalibrator. Kembalikan strip yang tidak digunakan tutup dan kembalikan pada suhu 2-8 °C.
27
3. Persiapkan pengenceran 1:21 (contoh: 10ul serum + 200ul diluen sampel) untuk kontrol negatif, kalibrator, kontrol positif dan setiap serum pasien. 4. Pada masing-masing well, tambahkan 100ul kontrol yang telah diencerkan, kalibrator dan sampel. 5. Tambahkan 100ul diluen sampel pada well A1 sebagai reagen blank. 6. Plate diinkubasi pada suhu kamar (20-25 °C) selama 60-65 menit. 7. Cuci microwell 5 kali. 8. Tambahkan 100ul konjugat pada setiap well, termasuk well reagen blank. 9. Inkubasi plate pada suhu kamar selama 30-35 menit 10. Cuci microwell seperti langkah 7 11. Tambahkan 100ul TMB pada setiap well, termasuk well reagen blank. 12. Inkubasi plate pada suhu kamar selama 30-35 menit 13. Stop reaksi dengan menambahkan 50ul larutan stop pada setiap well, termasuk well reagen blank. Sampel positif akan berubah warna dari biru menjadi kuning. Setelah penambahan larutan stop, letakkan plate beberapa waktu untuk memastikan sampel sudah tercampur rata. 14. Baca pada microwell reader dengan panjang gelombang 450nm dan ukur OD setiap well terhadap reagen blank. Plate harus dibaca dalam 30 menit setelah penambahan larutan stop. 3.1.2.5 Interpretasi
Nilai indeks atau OD ratio diinterpretasikan sebagai berikut :
28
Nilai Indeks atau OD Ratio Negatif
≤ 0,09
Equivokal
0,91-1,09
Positif
≥1,10
3.2 Pemeriksaan Smoothmuscle Antibody (SMA) Teknik Indirek Fluoresen Antibodi (IFA) (Diagnostic Otomation, 2010). 3.2.1 Prinsip Pemeriksaan
Sistem pemeriksaan bekerja pada substrat jaringan usus tikus dan konjugat anti-human immunoglobulin yang telah disesuaikan untuk pemakaian optimum pada pengenceran dengan pewarnaan latar belakang minimal. Reaksi terjadi dalam 2 tahap : 3.2 Langkah
pertama
melibatkan
interaksi
SMA
serum
pasien
dengan
smoothmuscle antigen dalam bagian basal lapisan muskularis ke mukosa glandular usus. 3.3 Langkah kedua adalah reaksi antara konjugat dan SMA yang berikatan dengan smoothmuscle antigen menghasilkan warna apple-green pada pemeriksaaan positif. 3.2.2 Bahan pemeriksaan
Reagen reaktif : 1. Slide substrat usus tikus 2. Goat anti-human immunoglobulin yang telah dilabel dengan FITC. 3. Serum kontrol positif SMA manusia 4. Serum kontrol negatif SMA manusia.
29
Reagen non reaktif : 1. PBS 2. Mounting media (buffer gliserol) 3. Delapan blotter dengan 6 lobang, dikunci ke well pada slide substrat. Bahan tambahan : 1. Pipet kecil serologis, pasteur, kapiler atau otomatis 2. Tabung pemeriksaan kecil 3. Rak untuk tabung pemeriksaan 4. Tempat pewarnaan 5. Ruang basah 6. Cover slips 7. Aqua destilata 8. Mikroskop fluoresen 3.2.3 Prosedur Pemeriksaan
Persiapan reagen : 1. PBS, pH 7,2 ± 0,2 : masukkan isi setiap paket buffer kedalam 1 liter aqua destilata. Campur sampai garamnya larut sempurna. 2. Serum kontrol positif SMA manusia : campur kembali dengan 0,5 mL aqua destilata. Hal ini menunjukkan pengenceran 1:20. Gunakan sebagai larutan kembali, jangan diencerkan lagi. 3. Serum kontrol negatif SMA manusia: campur kembali dengan 0,5 mL aqua destilata. Hal ini menunjukkan pengenceran 1:20, jangan diencerkan lagi.
30
4. Konjugat goat anti-human immunoglobulin yang telah dilabel dengan FITC: campur kembali dengan 3 mL aqua destilata. Prosedur: 1. Pindahan slide dari freezer dan biarkan mencapai suhu 20-25 °C. Buka bungkusan pelindung dan pindahkan slide yang mengandung substrat usus tikus. 2. Siapkan serum pasien pada pengenceran 1:20 dalam PBS 3. Identifikasi setiap well dengan kontrol dan serum pasien yang tepat 4. Berikan 1 tetes atau sekitar 0,02 mL serum pasien dan serum kontrol pada masing-masing well, jangan menyentuh bagian jaringan dengan tip pipet. 5. Inkubasi slide dalam ruang basah pada suhu 20-25C selama 30 menit 6. Ambil slide dari ruang basah dan buang kelebihan serum pada well dengan gentle, bilas slide dengan PBS lebih dahulu sebelum diletakkan pada tempat pencucian. Cuci slide segera sebanyak 2 kali dengan interval 5 menit dengan PBS yang berbeda. 7. Pindahkan slide dari PBS dan keringkan dengan kertas pengering. Direkomendasikan untuk meletakkan kertas pengering pada permukaan datar yang keras.
Letakkan slide substrat pada posisi terbalik diatas
pengering dan tekan bagian belakang slide. Jangan biarkan substrat slide terlalu kering pada waktu pemeriksaan. 8. Tambahkan 1 tetes konjugat anti-human immunoglobulin yang telah dilabel dengan FITC pada setiap well. 9. Inkubasi slide dalam ruang basah selama 30 menit pada suhu kamar. 10. Ulangi langkah 6
31
11. Ulangi langkah 7 12. Berikan 3-5 tetes mounting media pada setiap slide (antara well) dan coverslip. Periksa slide segera dengan mikroskop fluoresen. 3.2.4 Kontrol Kualitas
1. Kontrol positif, kontrol negatif dan buffer harus dijalankan pada setiap pemeriksaan. 2. Direkomendasikan untuk membaca satu kontrol positif dan negatif sebelum mengevaluasi hasil pemeriksaan. 3. Kontrol negatif ditandai dengan tidak adanya warna fluoresen yang tegas pada mukosa muskularis substrat usus tikus. 4. Kontrol positif ditandai dengan warna fluoresen apple-green pada miofilamen longitudinal, yang juga dikenal sebagai mukosa muskularis dari otot usus tikus. 5. Intensitas fluoresen yang terlihat mungkin bervariasi pada setiap mikroskop dan sistem filter yang digunakan. 3.2.5 Interpretasi Hasil
1. Titer kurang dari 1:40 dianggap tidak signifikan 2. Pemeriksaan positif: ditemukan warna fluoresen apple-green pada muskularis substrat usus tikus dengan pengenceran 1:40 berdasarkan skala +1 sampai +4. Skala +1 dianggap reaksi lemah dan +4 r eaksi kuat. 3. Semua serum positif pada pengenceran 1:20 harus dititer sampai pengenceran terakhir. Hal ini dilakukan dengan membuat pengenceran serial 1:40, 1:80, 1:160 dan seterusnya pada semua yang masih positif.
32
Hasil akhirnya adalah pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan reaksi warna apple-green positif. 3.2.6 Nilai Normal
Hasil yang diharapkan pada populasi normal adalah negatif pada pengenceran 1:20. Individu yang terlihat sehat dalam dekade ke-5 sampai 7 kehidupannya dapat memberikan hasil SMA positif.
3.3 Pemeriksaan anti LKM-1 dengan teknik ELISA (IBL International, 2008) 3.3.1 Prinsip Pemeriksaan
Sampel serum diencerkan 1:101 diinkubasi dalam microplates yang dilapisi dengan antigen spesifik. Antibodi pasien jika terdapat dalam spesimen akan berikatan dengan antigen. Fraksi yang tidak berikatan dibersihkan dengan pencucian pada tahap selanjutnya. Setelah itu anti-human immunoglobulin yang dikonjugasi dengan horsedish peroksidase diinkubasi dan bereaksi dengan kompleks antigen-antibodi sampel dalam microplates. Konjugat yang tidak berikatan dibersihkan pada tahap selanjutnya. Penambahan substrat TMB menghasilkan reaksi kolorimetrik enzimatik (biru), yang dihentikan dengan asam yang diencerkan (perubahan warna menjadi kuning). Tingkat pembentukan warna dari kromogen berfungsi menilai ikatan antara konjugat dengan kompleks antigenantibodi dan hal ini proporsional dengan konsentrasi awal antibodi pada sampel pasien. 3.3.2 Alat dan Bahan
1. Buffer sampel 2. Buffer wash
33
3. Kontrol negatif 4. Kontrol positif 5. Kalibrator (6 vial, 1,5 mL masing-masing 0, 3, 10, 30, 100, 300 U/mL) 6. Konjugat 7. Substrat TMB 8. Stop solution 9. Microtiterplate 10. Microtiter plate reader dengan filter pembacaan 450 nm dan filter referensi pilihan 620 nm (600-690 nm) 11. Glass ware 12. Test tube untuk pengenceran 13. Aqua destilata 14. Vortex mixer 15. Pipet dengan presisi (10, 100, 200, 500, 1000 uL) atau multi pipet 16. Alat pencuci microplates 17. Kertas pengering 3.3.3 Prosedur Pemeriksaan
Persiapan sebelum pemipetan 1. Encerkan reagen konsentrat: encerkan buffer sampel konsentrat 1:5, buffer wash konsentrat 1:50 dengan aqua destilata 2. Sampel: encerkan sampel serum 1:101 dengan buffer sampel, campur dengan baik 3. Washing : siapkan 20 mL buffer wash yang telah diencerkan per 8 well atau 200 ml untuk 96 well
34
Alur Pemerksaan: 1. Pipet 100 uL serum pasien yang telah diencerkan ke dalam microwell yang telah ditentukan 2. Pipet 100 uL kalibrator dan negatif dan positif kontrol kedalam well yang telah ditentukan 3. Inkubasi 30 menit pada suhu kamar (20-26 °C) 4. Cuci 3x dengan 300 uL buffer washing 5. Pipet 100 uL konjugat ke dalam masing-masing well 6. Inkubasi 15 menit pada suhu kamar 7. Cuci 3x dengan 300 uL buffer washing 8. Pipet 100 uL substrat TMB ke dalam masing-masing well 9. Inkubasi 15 menit pada suhu kamar, dalam ruang gelap 10. Pipet 100 uL stop solution pada masing-masing well 11. Inkubasi minimal 5 menit 12. Aduk plate secara hati-hati selama 5 detik 13. Baca absorbansi pada panjang gelombang 450 nm dalam 30 menit 3.3.4 Interpretasi Hasil
<15 U/mL Normal >15 U/mL Positif
35
3.4 Pemeriksaan anti-Soluble Liver Antigen (SLA) Teknik ELISA (IBL
International, 2012) 3.4.1 Prinsip pemeriksaan
Sampel serum diencerkan 1:101 diinkubasi dalam microplate yang dilapisi dengan antigen spesifik. Antibodi pasien jika terdapat dalam spesimen akan berikatan dengan antigen. Fraksi yang tidak berikatan akan dibersihkan pada tahapan selanjutnya. Setelah itu anti immunoglobulin manusia yang dikonjugasi dengan horsedish peroksidase diinkubasi dan bereaksi dengan kompleks antigenantibodi sampel dalam microplate. Konjugat yang berikatan dibersihkan pada tahap selanjutnya. Penambahan substrat TMB menghasilkan reaksi kolorimetrik enzimatik (biru), yang dihentikan dengan asam yang diencerkan (warna berubah menjadi kuning). Tingkat pembentukan warna dari kromogen berfungsi menilai ikatan antara konjugat dengan kompleks antigen-antibodi dan hal ini proporsional dengan konsentrasi awal antibodi pada sampel pasien. 3.4.2 Alat dan Bahan
1. Buffer sampel 2. Buffer wash 3. Kontrol negatif 4. Kontrol positif 5. Cut-off calibrator 6. Kalibrator (6 vial, 1,5 mL masing-masing 0, 3, 10, 30, 100, 300 U/mL) 7. Konjugat 8. Substrat TMB 9. Stop solution
36
10. Microtiterplate 11. Microtiter plate reader dengan filter pembacaan 450 nm dan filter referensi pilihan 620 nm (600-690 nm) 12. Glass ware 13. Test tube untuk pengenceran 14. Aqua destilata 15. Vortex mixer 16. Pipet dengan presisi (10, 100, 200, 500, 1000 uL) atau multi pipet 17. Alat pencuci microplates 18. Kertas pengering 3.4.3 Prosedur Pemeriksaan
Persiapan sebelum pemipetan 1.
Encerkan reagen konsentrat: encerkan buffer sampel konsentrat 1:5, buffer wash konsentrat 1:50 dengan aqua destilata
2.
Sampel: encerkan sampel serum 1:101 dengan buffer sampel, campur dengan baik
3.
Washing : siapkan 20 mL buffer wash yang telah diencerkan per 8 well atau 200 ml untuk 96 well
Alur Pemerksaan: 1. Pipet 100 uL serum pasien yang telah diencerkan ke dalam microwell yang telah ditentukan 2. Pipet 100 uL kalibrator atau cut-off calibrator dan negatif dan positif kontrol kedalam well yang telah ditentukan (Direkomendasikan untuk
37
memipet sampel, kalibrator duplo dan cut-off calibrator hanya digunakan untuk pemeriksaan kualitatif) 3. Inkubasi 30 menit pada suhu 20-32 °C 4. Cuci 3x dengan 300 uL buffer washing (yang telah diencerkan 1:50) 5. Pipet 100 uL konjugat ke dalam masing-masing well 6. Inkubasi 30 menit pada suhu 20-32 °C 7. Cuci 3x dengan 300 uL buffer washing 8. Pipet 100 uL substrat TMB ke dalam masing-masing well 9. Inkubasi 30 menit pada suhu 20-32 °C, lindungi dari cahaya 10. Pipet 100 uL stop solution pada masing-masing well 11. Inkubasi minimal 5 menit 12. Aduk plate secara hati-hati selama 5 detik 13. Baca absorbansi pada panjang gelombang 450 nm dalam 30 menit 3.4.4 Interpretasi
Kuantitatif: Normal
: <12 U/mL
Equivokal
: 12-18 U/mL
Positif
: >18 U/mL
Kualitatif: Negatif
: OD pasien < 0,8 x OD cut-off
Equivokal
: 0,8 x OD cut-off ≤ OD pasien ≤ 1,2 x OD cut-off
Positif
: OD pasien > 1,2 x OD cut-off
38
