Bloque II
QBI 2011 BLOQUE 2
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Bloque II
CATALISIS BIOLÓGICA: ENZIMAS 1-
Para sobrepasar la barrera energética entre reactivos y productos, se debe proveer energía para que la reacción comience. Esta energía se denomina:
a) Energía de activación c) Energía de reacción e) Energía potencial
b) Energía de iniciación d) Energía cinética
2- Las enzimas: a) Están Están comp compues uestas tas primar primariam iament entee de poli polipép péptid tidos, os, que son políme polímeros ros de amin amino o ácidos ácidos.. b) b) Pued Pueden en unir unirse se a grupo gruposs prost prostét étic icos os tales tales como como ione ioness metáli metálico coss que part partic icip ipan an en las reacciones enzimáticas. c) Se un unen al sus sustrat trato o en en los los siti sitio os act activ ivos os d) Todos dos lo los est estam amen ento toss son son cier cierto toss
3- ¿Cuál/es de los siguientes estamentos acerca de la velocidad de una reacción no son ciertos? a) La velo elocida cidad d de reac reacci ció ón es la velo velocida cidad d a la cual cual la reac reacci ción ón pro proced cede hacia acia el equilibrio. b) b) La velo veloci cida dad d de reacc reacció ión n esta esta gobe gobern rnad adaa por por la barre barrera ra de ener energí gíaa entr entree reac reacti tivo voss y productos c) Las Las enz enzim imas as pued pueden en acele acelera rarr la velo veloci cida dad d de de una una reacc reacció ión n d) La velo veloci cida dad d de de reacc reacció ión n no no es es sen sensi sibl blee a la la tem tempe perat ratur uraa e) Ninguno
4- Muchas enzimas se inhiben irreversiblemente por iones de metales pesados (Hg 2+, Cu2+ o Ag+), los que reaccionan con los grupos sulfhidrilos esenciales para formar mercáptidos: Enz----SH + Ag+
Enz----S----Ag + H+
La afinidad de Ag + por los grupos sulfidrilos es tan grande que la Ag + puede ser utilizada para titular los grupos –SH cuantitativamente. A 10 ml de una solución 1 mg/ml de enzima pura se le agregó una cantidad suficiente de AgNO3 para inactivar completamente la enzima. Se utilizaron un total de 0.342 umoles de AgNO 3. Calcule el peso molecular mínimo de la enzima. Por qué el valor obtenido de esta forma es el PM mínimo?
5- La actividad enzimática de la lisozima es óptima a pH 5,2. El sitio activo de la lisozima contiene dos amino ácidos esenciales para la catálisis: Glu35 y Asp52. Los valores de pK a de los grupos R carboxilos de estos dos residuos son 5,9 y 4,5, respectivamente. Cuál es el estado de ionización (protonado o deprotonado) de cada residuo al pH óptimo de la lisozima? En función del estado de ionización de estos dos residuos explique el perfil de actividad-pH que se muestra.
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Bloque II
6- Una mutación produce un cambio de Ala a Val en el interior de una proteína, y esto conduce a la pérdida de actividad. Sin embargo, la actividad se recupera cuando una segunda mutación en otra posición cambia una Ile por Gly. Cómo puede esta segunda mutación restaurar la actividad? 7- Aunque habitualmente se utilizan métodos gráficos para una determinación precisa de los parámetros cinéticos, estos valores pueden ser estimados simplemente por observación de los valores de V0 para diferentes concentraciones de sustrato. a- Estime, sin hacer cálculos ni gráficos, el valor aproximado de V max y K m para una reacción enzimática de la que se obtuvieron los siguientes datos:
[S] (M) 2,5 x 10 -6 4,0 x 10 -6 1 x 10 -5 2 x 10 -5
V0 (µM/min) 28 40 70 95
[S] (M) 4 x 10 -5 1x 10-4 2 x 10 -3 1 x 10 -2
V0 (µM/min) 112 128 139 140
b- Determine gráficamente los valores de Km y Vmax.
☺8- Dibujar en un mismo gráfico las curvas de tiempo que corresponden a los puntos A, B y C de la curva v = f([S]) que se muestra. Justificar.
☺9- Sea la reacción enzimática: E + S ⇔ ES ⇔ E + P, siendo K = 0.2mM. m
Suponiendo que la enzima no se inactiva durante la incubación, dibujar en un mismo gráfico las curvas de tiempo correspondientes a las siguientes situaciones: a- [S]= 0,2M b- [S]= 0,03M
[E]= E1 [E]= E
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c- [S]= 0,03M
[E]= E1/2
d- [S]= 2 x 10 -4M
[E]= E1/2
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10- Una determinada cantidad de enzima cataliza, en 15 minutos, la conversión del 0,5 % del sustrato, cuando la concentración es 0,2M. La misma cantidad da, en el mismo tiempo, 1 % de conversión cuando la concentración de sustrato es 100 mM. La mitad de la concentración de enzima cataliza la conversión del 25 % del sustrato, en el mismo tiempo, cuando su concentración es 1 mM. ¿Cuál es, aproximadamente, la K m de la enzima? Rta: K m: 1mM
☺11- Una reacción enzimática E + S ⇔ ES ⇔ E + P tiene una V
= 20 µm/h (aparición de producto), cuando la concentración de proteínas es 0,2 mg/ml (la concentración de proteínas es una medida de la concentración de enzima). a- ¿Cuánto producto aparecerá en 30 minutos con una concentración de proteínas de 0,3 mg/ml, siendo iguales las restantes condiciones?, ¿Por qué? b¿Cuánto aparecerá en 6 horas?, ¿Por qué? c- ¿Se pueden asegurar los resultados en (a) y (b)?, ¿Qué limitaciones tienen dichos cálculos? Rta: a) 15 µmoles, b) 180 µmoles m
12- Se detectó una determinada actividad enzimática en extractos de hígado y cerebro. Para dilucidar si la actividad detectada era atribuible a la misma enzima o a especies distintas, propias de cada órgano, se llevaron a cabo estudios cinéticos con distintos sustratos. Uno de los sustratos, ensayado en idénticas condiciones – que incluían 0,1 ml de extracto de cada órgano- presentó las siguientes velocidades iniciales: Concentración del sustratod (µmol/ml) 1 2 5 10
velocidad (µmol P / min x ml ext) hígado cerebro 0,14 0,085 0,23 0,140 0,39 0,230 0,50 0,300
¿Qué características de la enzima pueden ser determinadas a partir de estos datos?, ¿cuáles de ellas son de interés en la relación con la cuestión de la identidad de ambas actividades?, ¿qué explicaciones encuentra para las diferencias halladas? ¿Qué experiencias sugiere para confirmarlas? 13- En el gráfico que se muestra a continuación, la razón por la cual la curva alcanza un plateau es: a) El sitio activo de la enzima está saturado con sustrato. b) Hay un inhibidor competitivo presente c) Hay un inhibidor no competitivo presente v d) Todo el sustrato se ha convertido en producto.
[S]
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☺14- La reacción enzimática A
B es inhibida por la sustancia X. Los estudios cinéticos de dicha inhibición dieron los resultados siguientes:
abcd-
[A] mM
[X] mM
10 10 5 5 2,50 2,50 1,25 1,25
0 10 0 10 0 10 0 10
[B] (mM) 10 min 20 min 0,33 0,18 0,25 0,12 0,17 0,08 0,09 0,05
Calcular la Km para A. Calcular la V m para las condiciones del estudio. Indicar que tipos de inhibidor es X. Calcular la Ki.
0,65 0,35 0,51 0,24 0,34 0,17 0,18 0,09 Rta: a) 4,76 mM b) Vm: 0,045 mM/min Vm(i): 0,024 mM/min. c) Ki: 11,43 mM.
☺15- En el gráfico la curva A fue obtenida a una concentración de enzima de 0,2 mg/ml; la B con [E] = 0,4 mg/ml, y la C fue obtenida con [E] = 0,2 mg/ml en presencia de 5 mM de un inhibidor.
a) Dibujar las curvas P = f (t) correspondientes a los puntos 1 a 6. Indicar claramente los cambios de escala. b) Trazar las curvas V -1 en función de [S] -1 correspondientes a las curvas A, B y C. c) Calcular el Ki e indicar qué tipo de inhibidor se trata. Rta: K i: 1,67 mM.
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☺16- Trabajando con una enzima mikaeliana se obtuvo el siguiente diagrama Vo vs. [S]:
1- Una parte del diagrama se realizó con una concentración de enzima = [E]1 y una concentración de inhibidor [I]1. 2- Otra parte se obtuvo con una concentración de enzima = [E]1 y una concentración del inhibidor = [I]1x5. 3- El segmento restante se obtuvo con una concentración de enzima = [E]1x1,5 y una concentración de inhibidor = [I] 1. Indique en qué condiciones (1, 2, 3) se obtuvieron los segmentos A-B, C-D y E-F, justificando su respuesta e indicando de que tipo de inhibidor se trata.
17- Indique a cuáles puntos (A, B, C, D, E y F) del gráfico v vs [S] corresponden cada una de las curvas (1, 2, 3, 4, 5 y 6) del gráfico P vs t. Justifique su respuesta.
☺18- La enzima X cataliza la reacción A
B, su comportamiento es michaeliano y la
K m es 1 mM. Se ensayaron distintos volúmenes de distintas diluciones de la solución A, de la cual lamentablemente, no se conocía la concentración. La mezcla de reacción contenía, además del sustrato, 2 ml de buffer Ω 40 mM pH 7,5 y 0,8 ml de un sobrenadante de 100000g que contenía 25 mg/ml de proteína. El volumen de reacción fue de 5 ml (se obtuvieron completando con H 2O destilada). Aprovechando que el compuesto B absorbe a 550 nm (coeficiente de extinción molar = 10 6), fue medida la absorbancia a esa longitud de onda a distintos tiempos directamente en le tubo de reacción.
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Ensayo n° 1 2 3 4 5 6 7
sustrato (A) dilución
D.O. 550 volúmen
----------------1/10 1/10 1/100 1/100 1/100
0’ 1 0,5 1 0,5 1 0,5
0,1
10’
0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,130
20’
30’
0,430 0,427 0,430 0,378 0,267 0,211 0,160
0,760 0,754 0,706 0,656 0,433 0,322 0,191
1,090 1,080 1,009 0,933 0,600 0,433
aDetermine las concentraciones de buffer Ω , sustrato y proteína en cada uno de los ensayos. bCalcule la cantidad de producto formado en 20’ en el ensayo 5. ¿Cuánto producto se hubiera formado con la misma [A] y en el mismo tiempo con una concentración de proteínas, en el ensayo de 10 mg/ml. cCalcule la Vmax, expresada en umoles de B/ 10’ (para un vol. de reacción de 5 ml), y la K m, expresada en µmoles de A ( en el mismo volumen de reacción), para una concentración de proteínas de 8 mg/ml. Rta: a) Buffer: 16 mM; proteína; 4 mg/ml; sustrato: 1) 100 Mm 5) 1mM 2) 50 mM 6) 0,5 mM 3) 10 mM 7) 0,1 mM. 4) 5 mM b) Producto (20’, 5): 1,66 x 10 -3 µm; Producto (20’, 10 mg/ml): 4,15 x 10 -3 µm c) Vmax: 3,3 x 10 -3 µm/10’; K m = 1 mM.
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☺19- Se está estudiando en hojas y semillas de arroz, la actividad enzimática que cataliza la reacción S P. En un primer experimento, se midió actividad enzimática en ambos tejidos, utilizando distintas concentraciones de S y se determinó su desaparición midiendo la absorbancia a 510 nm (coeficiente de extinción molar de S= 10 5) directamente en el tubo de reacción. La mezcla de reacción contenía, además de extracto y sustrato S, buffer HEPES pH7.5 20 mM. El volumen de reacción fue de 5 ml. NOTA: La absorbancia detectada a 510 nm es únicamente debida al sustrato; ninguno de los reactivos utilizados ni el producto absorben a esa longitud de onda. Experimento Nº 1
Ensayo Nº
Ext. Hoja ml
Ext. Semilla ml
Abs 510 nm 0`
10`
1 2 3 4
0.5 0.5 0.5 0.5
---------
1.003 0.502 0.249 0.152
0.753 0.322 0.124 0.068
0.503 0.142 0.004 0.000
0.253 0.002 0.002 0.003
5 6 7 8
---------
0.5 0.5 0.5 0.5
1.001 0.500 0.251 0.151
0.846 0.386 0.177 0.098
0.692 0.280 0.103 0.046
0.541 0.171 0.029 0.000
20`
30`
a-Confeccione un protocolo de trabajo para realizar el experimento anterior especificando: volumen de sustrato, buffer, extracto y agua para cada ensayo, teniendo en cuenta los siguientes datos: Solución madre de buffer: 50 mM Solución madre de S: 100 μM b- Utilizando los datos del experimento Nº 1 determine los parámetros cinéticos correspondientes a las reacciones enzimáticas de hoja y semilla. ¿Cree que se trata de la misma enzima? Justifique. En un segundo experimento, se determinó la actividad enzimática presente en extractos de hoja, adicionando extracto de semilla previamente calentado a 100 ºC durante 5 min. Para este ensayo, se emplearon 0.8 ml de extracto de hoja (el mismo extracto que se utilizó en el experimento 1) y se midió la actividad enzimática agregando 0.5 ml del extracto de semilla calentado, utilizando las mismas concentraciones de sustrato que en el experimento 1 y el mismo volumen de reacción. A partir de estos datos, se calculó una Vmáx= 0.58 ± 0.05 µM/min. c-¿Con qué objeto cree que se realizó el segundo experimento? ¿Qué puede concluir a partir de éste resultado? d- ¿Cuál cree que será el valor de Km obtenido en el segundo ensayo? Justifique.
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ENZIMAS: Problemas opcionales I- Se estudió el efecto de dos inhibidores A y B (A permeable, B impermeable a membranas biológicas) sobre la actividad de una enzima, unida a membrana, en vesículas microsomales de riñón. Los estudios cinéticos realizados arrojaron los siguientes resultados: Sustrato (mM) 0,20 0,50 1,0 2,0 5,00
Sin inhibidor 16,67 33,33 50,00 66,67 83,33
Velocidad inicial (ηmol/min) Con inhibidor A (6µM) B (6µM) 6,25 16,50 14,29 33,33 25,00 49,70 40,00 66,60 62,50 83,00
Posteriormente se extrajo la enzima de la membrana y se estudió el efecto del inhibidor B sobre su actividad.
Sustrato (mM) 0,20 0,25 0,33 0,50 1,00 2,00 2,50 3,33 4,00 5,00
Velocidad inicial (nmol/min) Sin inhibidor 16,67 20,00 24,98 33,33 50,00 66,67 71,40 76,92 80,00 83,33
Con inhibidor B (6uM) 4,68 5,77 7,60 10,70 20,40 34,48 40,00 47,60 52,60 58,80
a) Interprete los resultados obtenidos en cada experimento con respecto a la inhibición por A y B. b) ¿Qué puede concluir acerca de la localización del sitio activo de esta enzima unida a membrana? Justifique. c) ¿Qué tipo de inhibidor es B? Justifique.
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Bloque II
II- Dada la siguiente reacción enzimática S
3P + Q, se obtuvieron las siguientes curvas:
- La curva 1 se obtuvo utilizando 2 concentraciones de sustrato (S1 y S2) siendo S2 = 2S1. la mezcla de reacción contenía además, buffer borato 40 mM pH 7,5 y 3 mg/ml de proteína.
- Para la curva 2 se utilizó una concentración de sustrato inicial (S3)= 20 mM. - La acción del inhibidor (I), se ensayó con dos concentraciones de sustrato: [S]= S2 (curva 1) [S]= S3 (curva 3) - Luego de transcurridos 30 minutos de reacción con una concentración de sustrato inicial =S1, la velocidad se mantuvo constante. A partir de ese momento se diluyó la mezcla de reacción 1/500 manteniendo constantes las concentraciones de buffer y enzima (curva 4). Calcule: a) las constantes de Michaelis Menten b) ¿cuál es la concentración de sustrato S1? c) ¿qué tipo de inhibidor es I? Justifique. De ser posible calcule K i, K mi y Vmi. Rta: a) Km: 59 mM; b) S1: 49,2 M; c) K mi: 143 mM, Vmi: 3.6 µM/min.
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Bloque II
III- A partir de una solución de enzima pura, que cataliza la reacción S
P, se realizaron ensayos de actividad manteniéndose la dilución de la enzima y la temperatura constantes y variando el pH del medio de incubación. Se obtuvieron los siguientes resultados: [S]
µmoles de P/ min . mg de enzima
(mM)
pH 5
pH 6
pH 7
pH 8
2 5 10
9,1 17,9 26,3
14,3 25,0 33,3
8,3 16,7 25,0
7,2 14,7 22,7
a) Explique cuál es el efecto del pH sobre la actividad de esta enzima. Justifique su respuesta. b) ¿Qué concentraciones de sustrato debería utilizarse para alcanzar una velocidad inicial de 10 umoles de P/min.mg de enzima a pH 5 en condiciones similares a las empleadas para elaborar la tabla? c) ¿Cuál será la velocidad máxima a pH 8 si se empleara el doble de concentración enzimática que la empleada en la confección de la tabla? Justifique su respuesta. Rta: b) [S]= 2,5mM c)Vmax = 74 µmoles/min.mg enzima.
IV- Diseñe un experimento que permita determinar: a) si una enzima sigue una cinética de Michaelis-Menten. b) si un inhibidor es competitivo o no competitivo.
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Bloque II
ESTRUCTURA DE HIDRATOS DE CARBONO 1- a) La lactosa es un disacárido de la leche. Muchas personas no pueden ingerir leche porque no pueden digerir la lactosa. Aquéllas personas que son intolerantes a la lactosa (tienen un defecto en la lactasa, la enzima que hidroliza la lactosa) , acumulan la lactosa en el lumen del intestino delgado porque no existe un mecanismos de transporte para el disacárido. ¿Por qué la lactosa no puede atravesar la membrana de las células epiteliales del intestino en ausencia de un sistema de transporte? b) Ud. decide estudiar más en profundidad esta enzima y ver si es capaz de clivar otro disacárido como la maltosa (maltosa = glucosa + glucosa). Ud determina que la lactasa no puede hidrolizar la maltosa, y por el contrario, la maltosa muestra cierto grado de inhibición sobre la habilidad de la lactasa de hidrolizar la lactosa. ¿Es la maltosa un candidato mas probable para ejercer una inhibición competitiva o no competitiva? Justifique. c) Para confirmar su hipótesis, se llevó a cabo un estudio cinético con los siguientes resultados:
[Lactosa] moles/litro 0.3 x 10 -5 0.5 x 10 -5 1.0 x 10 -5 3.0 x 10 -5 9.0 x 10 -5
Velocidad (moles/min) Sólo lactosa Lactosa + maltosa 10.4 14.5 22.5 33.8 40.5
4.1 6.4 11.3 22.6 33
Grafique 1/V en función de 1/S. Los gráficos ¿confirman o contradicen su hipótesis?
2- Una muestra de glucógeno tiene un peso molecular promedio de 8 x 10 6. Mediante el análisis con ácido periódico se determino que el número de residuos de glucosa en los extremos no reductores es el 8% del total de glucosas. Con β -amilasa se hidroliza el 45% de la molécula. Calcular: a) Número total de glucosas por molécula de glucógeno. b) Micromoles de grupos reductores por kg. de glucógeno. c) Número total de glucosas que hay en las ramas exteriores. d) Longitud promedio de cada rama externa.
Rtas: a) 49.383 glucosas c) 22.222 glucosas
b) 125 µ moles/kg de glucógeno d) 5.61 glucosas/rama exterior
3- La amilosa es un glucano α (1-4) lineal. 5 ml de una alícuota de una solución de amilosa 125 mg/ml fue tratada con periodato produciendo 172.5 µ g de ácido fórmico. Calcular el PM de esa amilosa Decir qué compuestos y en qué cantidad se producen al tratar 10 ml de dicha solución con agua de bromo, metilación exhaustiva y posterior hidrólisis. Rta: 5 x 105 g/mol.
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Bloque II
4- Se sacrificó un ratón para analizar el contenido de glucógeno de su hígado (peso hígado=1.5 g). Se preparó un homogenato 1:4 en agua destilada. Luego del aislamiento se obtuvo una solución de glucógeno de 6 ml que proviene de todo el hígado. Se tomaron 0,5 ml de esa solución y se diluyeron hasta 2 ml durante la hidrólisis y neutralización. Se efectuó la reacción de Somogy-Nelson sobre varias alícuotas, según el esquema de la tabla. Tubo nº 1 2 3 4 5 6
Glucosa (1mM) (ml) -0.1 0.3 0.5 ---
Muestra (ml) Agua (ml) ----0.04 0.08
2 1.9 1.7 1.5 1.96 1.92
Abs -0.054 0.145 0.250 0.080 0.165
a) Confeccione la curva estándar. b) Indique si las alícuotas utilizadas para determinar el contenido de glucógeno son las adecuadas. Justifique. c) Exprese los resultados obtenidos en: g de glucógeno en el hígado y en g de glucógeno/100 g de hígado. d) Calcule el nº promedio de restos de glucosa por molécula de glucógeno.(PM= 3 x 106) Rtas: c)
15,7 mg total en hígado 1.046 g/100 de hígado 4 d) 1.8 x 10 glu / mol de glucógeno
5- Un polisacárido de alto peso molecular y estructura desconocida fue sometido a metilación exhaustiva e hidrólisis. El análisis de los productos reveló tres azúcares metilados: 2,3,4-tri-Ometil-D-glucosa, 2,4-di-O-metil-D-glucosa y 2,3,4,6-tetra-O-metil-D-glucosa, en una relación 20:1:1. ¿Cuál es la estructura del polisacárido?
☺6- Se aisló un compuesto bacteriano partiendo de 300 gramos de peso fresco de células, que se homogeneizaron con 200 ml de buffer fosfato y se llevaron a 10% de TCA final. Se centrifugó y al sobrenadante (250 ml) se lo deshidrató con alcohol 95%, sal y calor. Se centrifugó nuevamente y el precipitado se solubilizó en 3 ml de agua destilada. Se realizaron los siguientes estudios: a) 0.4 ml de la muestra se trataron con H 2O/Br 2, metilación exhaustiva e hidrólisis y se identificaron y cuantificaron los productos: Acido 2, 3, 4, 5 tetrametil-O-glucónico .............................................0,282 µ moles 2, 3, 4 trimetil-O-glucopiranosa ...................................................... 1.918 µ moles 3, 4 dimetil-O-glucopiranosa ........................................................... 0.580 µ moles 2, 3, 4, 6 tetrametil-O-glucopiranosa .............................................. 0.850 µ moles
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Bloque II
b) A 0.5 ml se los trató con una solución de α (1-6) glucosidasa (exoglucosidasa). Después de una incubación prolongada se liberaron 3.177 µ moles de glucosa. Sabiendo que el PM del compuesto es aproximadamente 2100. i. Proponga tres estructuras posibles, justificando su respuesta. ii. Calcule los mmoles de polisacárido por gramo de peso fresco bacteriano iii. Calcule los mmoles de ácido periódico gastados si se hicieran reaccionar totalmente 0.5 ml de muestra, y los mmoles de ácido fórmico que se producirían en dicho tratamiento. Rta:i) 7 x 10-3 µ moles polis/g peso fresco ii. 9.05 µ moles periodato; 4.87 µ moles fórmico.
☺7-
Un grupo de investigadores que está estudiando la cadena glicosídica de una glicoproteína, aisló un oligosacárido unido a un péptido por el aminoácido asparagina. Para su análisis el glucopéptido fue sometido a distintos tratamientos: Tratamiento con glicosidasas * Enzima Moles de azúcar obtenidos/mol de glicopéptido Galactosa Manosa Glucosa ---1) α -manosidasa 0.97 --2) β -galactosidasa --0.9 3) α -glucosidasa -0.87 -4) α -manosidasa (después de 3) 0.93 -2.1 5) β -galactosidasa + α -glucosidasa -1.8 -6) α -manosidasa (después de 5) -0.82 1.81 7) β -manosidasa + α -glucosidasa (después de 6) *todas las glucosidasas son tipo exoglucosidasas, incapaces de romper enlaces glicosídicos si los monosacáridos específicos se encuentran unidos por dos o más enlaces glicosídicos. Metilación exhaustiva, hidrólisis, separación, identificación y cuantificación de los metil derivados después de distintos tratamientos con enzimas. Tratamiento previo a la metilación
Moles de O-metil derivados obtenidos/mol de glicopéptido Galactosa Manosa (2,3,4,6) (2,3,4,6) (3,4,6)
Glucopéptido sin tratar
β -galactosidasa y después α glucosidasa β -galactosidasa + α glucosidasa + α -manosidasa
(2,4)
Glucosa (2,3,6) (2,3,4) (2,3,4,6)
0.97
0.09
2.00
0.91
1.02
1.87
1.02
--
2.03
0.1
0.88
--
1.88
--
--
1.00
0.09
--
--
1.92
--
Obtenga la estructura del polisacárido que deduzca de estos resultados, justificando su respuesta (esquema indicando el nombre del azúcar y el tipo de enlace)
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Bloque II
Metabolismo energético: Los problemas propuestos para contribuir al conocimiento y comprensión del metabolismo energético de células animales y vegetales se han organizado en cuatro guías que se detallan a continuación. Finalizada cada una de ellas se recomienda al estudiante integrar los conceptos aplicados con los utilizados previamente dentro del bloque. Para realizar esta integración se propone seguir el esquema de las figuras 1 y 2.
Conocimientos y conceptos a utilizar para la resolución de las guías de problemas: a- Estructura de Hidratos de carbono: métodos para su análisis b- Enlaces de alta energía: ATP, transporte de electrones: fosforilación oxidativa, fotosíntesis: Fase lumínica y fase oscura c- Ciclo de Krebs: reacciones de oxidorreducción y coenzimas de nicotinamida, localización y función biológica. Termodinámica, sistemas acoplados d- Glucólisis y Gluconeogénesis: regulación, balance energético. Figuras 1, 2 y 3obtenidas de “Molecular Cell Biology” Albert y col.
Figura 1
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Bloque II
Figura 2
Figura 3
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Bloque II
GLUCÓLISIS: Descripción, la vía, destinos del piruvato, rendimiento energético, regulación de la glucólisis 1-Tomando la ruta anabólica y catabólica de glucosa a piruvato indicar: a.- Si son químicamente distintas b.- ¿Cómo se regulan? c.- ¿Cuál es su localización? d.- Calcule su gaste energético.
2- Un homogenato de hígado se centrífuga a 105.000 xg durante 1 hora. Se separan el pellet y el sobrenadante y se incuban separadamente con glucosa. En un tercer tubo se incuba una alícuota del homogenato inicial. Calcular el número de moles de ATP que se pueden obtener por la oxidación de un mol de glucosa en cada tubo.
☺3- ¿Qué procesos se llevan a cabo y cuál es el rendimiento energético, cuando se agregan para su oxidación los siguientes sustratos a las preparaciones que se indican más abajo? I- PIRUVATO II- NADH+H III- GLICEROL a- homogenato de hígado cuidadosamente preparado. b- Fracción del mismo que sedimenta a 10.000 xg. c- Sobrenadante de 100.000 xg
4- Considere la siguiente interconversión que ocurre en la glucólisis Fructosa-6-fosfato
glucosa-6-fosfato K´eq = 1.97
a) b)
¿Cuál es el ∆ G°´ para la reacción (a 25°C)? Si la concentración de fructosa-6-fosfato se ajusta a 1.5 M y la de glucosa-6-fosfato a 0.5 M, ¿cuál es el ∆ G? c) ¿Por qué ∆ G°´y ∆ G son diferentes?
5- Suponga que Ud. descubre una mutante de levadura cuya vía glicolítica es más corta por la presencia de una nueva enzima que cataliza la reacción:
Gliceraldehído-3-fosfato + H2O + NAD+
3-fosfoglicerato + NADH + H+
Aunque en esta mutante la glucólisis es más corta, ¿cómo se verá afectada la producción anaeróbica de ATP? ¿Y la producción aeróbica?
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Bloque II
6- Durante la actividad intensa, el tejido muscular demanda grandes cantidades de ATP comparado con el resto de los tejidos. En los músculos de las patas de los conejos o en los músculos involucrados en el vuelo de muchas aves, este ATP se produce casi exclusivamente por fermentación láctica. El ATP se produce en la fase final de la glicólisis por dos reacciones enzimáticas, catalizadas por las fosfoglicerato quinasa y la piruvato quinasa. ¿Si el músculo esquelético no tuviera lactato deshidrogenasa, podría llevar adelante es intensa actividad física?
☺7- Un cultivo de levaduras es suplementado con [U-
14
C]-glucosa para examinar la producción de CO2 bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Los valores obtenidos se graficaron en función del tiempo. 14
a) ¿Qué rutas metabólicas convierten glucosa en CO2? b) Asumiendo que en el tiempo cera hay un bajo nivel de nutrientes, ¿cuál es el estado energético de las células? ¿Qué pasa con las concentraciones de ATP y AMP relativas? c) ¿Cuáles son los puntos de control de la glucólisis? d) ¿Cómo pueden las células producir ATP metabolizando glucosa? e) ¿Por qué la velocidad de producción de CO2 disminuye con el tiempo? f) Por qué puede producirse CO 2 bajo condiciones anaeróbicas? (cuando el ciclo de Krebs no puede funcionar) g) ¿Qué enzimas convierten piruvato a etanol en las levaduras? h) La glucosa produce 2 moléculas de CO 2 por fermentación alcohólica, mientras que bajo condiciones aeróbicas pueden producirse teóricamente 6 moléculas de CO 2. ¿Por qué se produjo más CO 2 bajo condiciones anaeróbicas? i) ¿Cuál es la función de la fermentación alcohólica? j) ¿Por qué hay que agregar fosfato inorgánico en estas incubaciones?
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Bloque II
☺8- La glucólisis es la ruta metabólica que permite la conversión de glucosa en piruvato. G°'y G (los G fueron determinados A continuación se muestran los valores de en base a las concentraciones intracelulares de los sustratos de cada una de las reacciones) a- Indique si las reacciones 6 y 7 están termodinámicamente favorecida en condiciones estándar y en las condiciones fisiológicas utilizadas para el cálculo de G. Proponga una justificación para las diferencias observadas entre ambas condiciones. b- Sabiendo que las concentraciones de ATP y ADP citoplasmático asociadas a los G mostrados en la tabla son cercanas a 1.5mM y 0.5 mM valores de respectivamente y la de glu-6-P es aproximadamente 0.1mM, estime la concentración de glucosa que harían que la glucólisis estuviera termodinámicamente desfavorecida (Considere que se conservaron todas las concentraciones de los metabolitos involucrados detectadas durante la determinación de G). G°' G Reaccion# Enzyme c- Compare el rendimiento (kJ/mol) (kJ/mol) energético (moles de 1 Hexokinase -16.7 -33.5 ATP) y el poder reductor 2 Phosphoglucoisomerase +1.7 -2.5 (NADH) de la ruta 3 Phosphofructokinase -14.2 -22.2 glucolitica en condiciones 4 Aldolase +23.9 -1.3 de aerobiosis y 5 Triose phosphate isomerase +7.6 +2.5 anaerobiosis. 6
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
+12.6
-3.4
7
Phosphoglycerate kinase
-37.6
+2.6
8
Phosphoglycerate mutase
+8.8
+1.6
9
Enolase
+3.4
-6.6
10
Pyruvate kinase
-62.8
-33.4
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Bloque II
CICLO DE KREBS: Reacciones de oxidorreducción y coenzimas de nicotinamida, localización y función biológica. Rendimiento energético, regulación, rutas biosintéticas 1- Las coenzimas de nicotinamida sufren reacciones de óxido-reducción reversibles con sustratos específicos en presencia de las deshidrogenasas adecuadas. El anillo de nicotinamida es la porción de la coenzima involucrada en la reacción redox; el resto de la molécula sirve para el reconocimiento y unión de la deshidrogenasa. Para cada una de las siguientes reacciones, determine si el sustrato ha sido oxidado o reducido o si su estado de oxidación no ha cambiado. Para aquéllos sustratos que han sufrido cambios redox, indicar cuál es la coenzima encesaria (NAD+, NADH).
O CH3 – C – H Etanal
EtOH Etanol OH O O3PO – CH2 – CH – C – O – PO 3= 1,3 - bifosfoglicerato O
=
CH3 – C – COO Piruvato
-
O OOC– CH2 – C – COO Oxalacetato
O CH3 – C – CH 2 – COO- + H+ AcetoAcetato
OH O O3PO – CH2 – CH – C – H + HPO4= Gliceraldehído - 3P O
=
CH3 – C – H + CO2 Acetaldehido OH OOC – CH2 – C – COO H Malato
-
O CH3 – C – CH 3 + CO2 Acetona
2- En la última reacción del ciclo del ácido cítrico, el malato es deshidrogenado para regenerar el oxalacetato necesario para la entrada del acetil-CoA vía la reacción de la citrato sintetasa. ∆ G°’= 30 kJ/mol L-Malato + NAD+ oxalacetato + NADH + H+
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Bloque II
a) Calcule la constante de equilibrio para la reacción a 25 °C. b) La medida de la concentración de L-malato en la mitocondria de hígado de rata es aproximadamente de 0.20 mM cuando [NAD +]/[NADH] es 10. Calcule la concentración de oxalacetato a pH 7 en la mitocondria.
Rta:a) 5.51 10-6 b) 0,11 M 3- Calcular el ∆ G fisiológico de la reacción de la isocitrato deshidrogenasa a 25°C y pH 7, sabiendo que: [NAD +]/[NADH] = 8; [∝-oxoglutarato] = 0.1 mM; [isocitrato] = 0.02 mM; suponer condiciones estándar para el CO 2 (∆ G°’= -2,1 Kcal/mol ). Esta reacción es un sitio probable de control metabólico? ¿Por qué? 4- El citrato se forma por la condensación de acetil-CoA con oxalacetato. En mitocondrias de corazón de rata a pH 7 y 25°C, la concentración de reactantes y productos son: oxalacetato 1 uM; acetil-CoA 1 uM; citrato 220 uM y CoA 65 uM. Sobre la base de estas concentraciones y el valor del cambio de energía libre estándar para la reacción de la citrato sintetasa (-32.2 kJ/mol), determine la dirección del flujo de metabolitos a través de la reacción de la citrato sintetasa en la célula. Explique.
☺5- La respiración celular puede estudiarse utilizando mitocondrias aisladas y midiendo el consumo de oxígeno bajo diferentes condiciones. Si se agrega malonato de sodio 0.01 M a mitocondrias respirando activamente utilizando piruvato como combustible, la respiración se detiene rápidamente y se acumulan intermediarios metabólicos. a) ¿Cuál es la estructura de los intermediarios que se acumulan? b) Explique por qué se acumulan. c) Explique por qué se detiene el consumo de oxígeno. d) Krebs halló que la inhibición del ciclo del ácido cítrico por malonato podía ser contrarrestada elevando la concentración de oxalacetato. Explicar el mecanismo de este proceso . 6- Aunque el oxígeno no participa directamente en el ciclo del ácido cítrico en la célula, el ciclo sólo opera en presencia de oxígeno. ¿Por qué? 7- El malonato es un inhibidor competitivo del succinato en la reacción de la succinato deshidrogenasa. Dibujar las gráficas que se obtendrían al representar 1/v en función a 1/ [succinato] para tres concentraciones diferentes de malonato. Indicar las líneas correspondientes a [malonato] baja, media y alta.
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Bloque II
TRANSPORTE DE ELECTRONES: fosforilación oxidativa y fotosíntesis Potencial redox, donores y aceptores de electrones (NADH y FADH), formación del gradiente de protones, inhibidores del transporte electrónico, desacoplantes, fosforilación oxidativa, ATP sintetasa, acoplamiento y control respiratorio.
1- Si se aíslan mitocondrias y se colocan en un buffer de bajo pH ellas comienzan a fabricar ATP. ¿Por qué?
☺2- El grado de reducción de cada transportador en la cadena respiratoria está determinado por las condiciones existentes en la mitocondria. Para cada una de las condiciones que se indican a continuación, prediga el estado de oxidación de cada transportador en la cadena respiratoria (ubiquinona y citocromos b, c 1, c y a + a 3).
a) b) c) d)
Abundante abastecimiento de NADH y O 2 pero con el agregado de cianuro. Abundante abastecimiento de NADH pero O 2 agotado. Abundante abastecimiento de O2 pero NADH agotado Abundante abastecimiento de NADH y O2.
☺3- La energía libre requerida para la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi es de 30.5 kJ/mol cuando los reactivos y productos están a una concentración 1M (estado estándar). Debido a que en condiciones fisiológicas las concentraciones de ATP, ADP y Pi no son 1 M, la energía libre requerida para sintetizar ATP en condiciones fisiológicas es diferente al ∆ G°´. a) Calcule la energía libre requerida para sintetizar ATP en los hepatocitos humanos cuando las concentraciones de ATP, ADP y Pi son 3.5, 1.5 y 5 mM, respectivamente. b) Un adulto normal de 68 kg requiere una ingesta diaria de 2000 cal (8.36 kJ). El alimento es metabolizado y la energía libre es utilizada para la síntesis de ATP. Asumiendo que la eficiencia de conversión del alimento en ATP es del 50 %, calcule el peso de ATP utilizado por un adulto en un día. ¿Qué porcentaje del peso del cuerpo representa? Aunque los adultos sintetizan grandes cantidades de ATP diariamente, el peso del cuerpo no cambia significativamente durante este período. Explique esta aparente contradicción.
☺4- En mitocondrias normales la velocidad del transporte electrónico está íntimamente acoplada a la demanda de ATP. En estas condiciones, el número de moléculas de ATP producidas por átomo de oxígeno consumido (relación conocida como P/O), cuando el NADH es el dador de electrones, es aproximadamente 3. a) Prediga el efecto de concentraciones relativamente bajas y altas de un agente desacoplante sobre la velocidad de transporte electrónico y sobre la relación P/O. b) La ingestión de desacoplantes causa el incremento de la temperatura corporal. Explique este fenómeno en términos moleculares. ¿Qué ocurre con la relación P/O? c) El dinitrofenol se prescribía como droga para reducir el peso corporal. ¿Cómo esta droga, en principio sirve para ese objetivo? El DNP dejó de utilizarse con ese fin debido a varias muertes producidas después de su uso. ¿Por qué el DNP puede producir la muerte?
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Bloque II
5- Relacionar los compuestos con su actividad: (1) rotenona, (2) dinitrofenol y (3) antimicina A. (a) inhibe la fosforilación oxidativa cuando el sustrato es piruvato pero no cuando es sustrato es succinato. (b) inhibe la fosforilación oxidativa cuando el sustrato es piruvato o succinato. (c) permite que el piruvato se oxide en las mitocondrias, incluso en ausencia de ADP. NOTA: La rotenona y el amital inhiben el transporte electrónico a la NADH deshidrogenasa; la antimicina A inhibe el complejo citocromo bc1 y el cianuro, la azida y el monóxido de carbono, inhiben la citocromo oxidasa.
6- Explicar por qué: (a) las partículas submitocondriales de las cuales se ha extraído la F 1 son permeables a los protones. (b) la adición de oligomicina a partículas submitocondriales exentas de F1 disminuye varias veces esta permeabilidad.
☺7- Tanto la oligomicina como el cianuro inhiben la fosforilación oxidativa, cuando el sustrato es piruvato o succinato. El dinitrofenol puede usarse para distinguir entre estos dos inhibidores. ¿Por qué?
8- ¿Por qué la oxidación de succinato a fumarato está asociada a la producción de sólo dos ATPs durante la fosforilación oxidativa, mientras que la oxidación de malato a oxalacetato está asociada a la producción de tres ATPs?
9- Compare la producción de ATP en cloroplastos y mitocondrias. - ¿Qué enzima sintetiza ATP en ambas organelas? - ¿Cuál es la orientación de F0 y F1 en cada caso? - ¿Los electrones son transferidos al ATP? - ¿Qué es el gradiente de protones o el ∆ pH? -¿De qué moléculas provienen los protones en mitocondrias y cloroplastos? - ¿Qué compartimiento celular se acidifica durante el transporte electrónico? 10- ¿Dónde se llevan a cabo las reacciones de la fase lumínica y oscura de la fotosíntesis? Indique las diferencias entre plantas verdes y bacterias.
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Bloque II
☺11- Con el fin de estudiar el flujo de electrones en membranas se aislaron cloroplastos y mitocondrias y se incubaron en buffers adecuados dentro de una celda polarográfica que permite cuantificar el contenido de O2 en la solución. Los reactivos indicados se agregaron en los tiempos señalados y se observó su efecto sobre la concentración de O 2.
Figura 1 A
Figura 2 B
C
O2
B
O2
seg
seg
A, B y C representan luz, oxalacetato y nigericina aunque no necesariamente en ese orden. a. Proponga una correspondencia para los mismos e identifique la figura obtenida en la incubación con cloroplastos. Justifique. b. Proponga un reactivo cuyo efecto sea similar al del oxalacetato. Justifique c. ¿Cuánto se modificó la velocidad de transporte de electrones en mitocondrias en presencia de nigericina? d. Prediga las modificaciones en la concentración de ATP asociadas a los gráficos de las figuras 1 y 2. e. El herbicida diquat tiene un potencial redox de - 0.4 volts. ¿Cuál es el estado redox de la plastocianina en presencia del herbicida? f. ¿Cómo se modificarían las curvas de las figuras 1 y 2 si se usan lisados mitocondriales y cloroplásticos en lugar de las organelas intactas?
☺12- Cuando una suspensión de algas verdes se ilumina en ausencia de CO
y luego se incuba con 14CO2 en oscuridad, el 14CO2 se convierte en 14C-glucosa durante un corto período. ¿Cuál es el significado de esta observación en relación al proceso de fijación de CO2 y cómo se relaciona con las reacciones lumínicas de la fotosíntesis? ¿Por qué la conversión de 14CO2 en 14C-glucosa se detiene después de un corto período? 2
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Bloque II
GLUCONEOGÉNESIS: Descripción, gasto energético, transporte de oxalacetato, activación de la piruvato carboxilasa, regulación recíproca de la glucólisis y gluconeogénesis, el ciclo de Cori
VÍA DE LAS PENTOSAS FOSFATO: Descripción, principales reacciones, regulación
METABOLISMO DEL GLUCÓGENO: Función, degradación, síntesis
☺1- En un laboratorio dedicado al estudio del metabolismo del glucógeno en hígado de ardilla, se detectaron dos cepas con menor contenido del mismo en iguales condiciones.
Cepa mg glucógeno / hígado A 5.2 2.4 B C 2.3 (Nota: la cepa A es considerada normal) Se ensayó entonces la capacidad de síntesis de glucógeno en homogenatos de hígado de cada una de las cepas, mediante la incorporación de glucosa radiactiva antes de realizar un precipitado con TCA.
Cepa Radiactividad incorp. / 10' A 10180 B 9870 C 10240 Se sabía por datos anteriores que en el sistema degradativo de glucógeno en estas cepas sólo pueden existir diferencias con respecto a la enzima amilasa. Se ensayó entonces, la actividad de esta enzima en homogenatos de hígado y con la enzima purificada de los mismos.
Cepa
Actividad u.a./homogenato u.a./ug enzima
A B C
70 172 168
5 5 12
Nota: u.a. = unidades arbitrarias a- Indique las diferencias halladas entre las cepas B y C con respecto a la A. b- Interprete los resultados explicando a qué podrían deberse las diferencias halladas. c- Señale qué experiencias deberían realizarse para corroborar o decidir entre su(s) interpretación(es).
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Bloque II
2- Es posible obtener síntesis neta de glucosa a partir de piruvato si el ciclo del ácido cítrico y la fosforilación oxidativa están totalmente inhibidas? 3- Aunque los animales no pueden sintetizar glucosa a partir de acetil-CoA, si se administra a una rata acetato marcado con 14C, algo de marca radiactiva aparecerá en el glucógeno extraído de sus músculos. ¿Por qué? 4- Las actividades metabólicas relativas en un organismo de la glucólisis + el ciclo del ácido cítrico frente a la ruta de las pentosas fosfato + gluconeogénesis, pueden medirse comparando las velocidades de producción de 14CO2 por administración de glucosa marcada con 14C en el C(1) con la de la glucosa marcada en el C(6). ¿Por qué? 5- La Vmax de la glucógeno fosforilasa de músculo es mucho mayor que la de hígado. Discutir el significado funcional de este fenómeno. 6- Explicar las consecuencias que produce la enfermedad de von Gierke (los pacientes son deficientes en la enzima glucosa-6-fosfatasa). 7- Calcular el costo energético en número de ATPs para convertir la G6P citosólica en glucógeno y nuevamente en G6P, es decir, el costo energético que supone almacenar la glucosa en forma de glucógeno. ¿Qué fracción del número máximo de ATPs que se producen por el catabolismo completo de la G6P a CO 2 representa este costo?
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Bloque II
PROBLEMAS DE PARCIALES 1) Llega a la guardia de un hospital un paciente alcoholizado con deficiencias nutricionales. Se le inyecta glucosa por via intravenosa y finalmente el paciente muere por acidosis. Se le hicieron estudio en sangre de las actividades de diversas enzimas del metabolismo de hidratos de carbono, como la piruvato deshidrogenasa (PDH), gliceraldehído 3-P deshidrogenasa (G3PD) y piruvato kinasa (PK) y se la compararon con valores normales. Prediga como estarían los valores (aumentados o disminuidos) de estas enzimas en el paciente. Justifique. ¿Cuál sería el defecto enzimático que le produjo la muerte? ¿Cuál sería el compuesto que generó la acidosis?
2) Se están estudiando las características respiratorias de un alga para analizar su proliferación. Para ello se la cultiva en oscuridad o luz continua en medio mínimo durante una semana. Luego se mide la velocidad de variación del tenor de oxígeno en el medio en presencia o ausencia de varios inhibidores utilizando un electrodo de O 2 por 10 min. Paralelamente se somete a los mismos tratamientos a un cultivo de células de ratón. Los resultados obtenidos son los siguientes:
A 100
n i m / 2 O e d s e l o m n
-100
B
ninguno
Cianuro de K
Rotenona
Paraquat
Medida de variación de tenor de oxígeno en medio de cultivo. A: algas verdes crecidas en oscuridad (barras negras) o luz (barras blancas) B: células de hígado de ratón crecidas en condiciones semejantes. En ambos casos el tenor de oxígeno fue medido por 10 min con un electrodo de oxígeno. Cianuro de Potasio: inhibe al Complejo IV de la cadena de electrones mitocondrial
100
n i m / 2 O e d s e l o m n
-100
Rotenona: inhibe al Complejo I Paraquat: Inhibe al fotosistema I de la cadena de electrones cloroplástica
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Bloque II
1-Explique brevemente cada caso 2-Cuál es la razón del consumo de oxígeno medido con cianuro en algas crecidas en oscuridad? Por qué no es igual en las células de ratón? 3-Por qué considera que aumenta la evolución de oxígeno incubando con cianuro o rotenona? 4-Cuál sería el experimento que prueba que su suposición es correcta?
3) Se está estudiando la capacidad fotosintética de una bacteria recientemente identificada. Para ello se la compara con la capacidad fotosintética de Synechocystis sp. , una cianobacteria de referencia. Se midió el tenor de oxígeno en el medio donde cercen ambas bacterias con un electrodo de oxígeno durante 10 min. en oscuridad y en presencia de luz. Los resultados fueron los siguientes:
A
B
100 o n e í g x o e d r o n e T % Figura 1: medición del tenor de oxígeno a través del tiempo en A: cianobacterias Synechocystis sp. B: bacteria fotosintética recientemente descubierta. A los 10 min se dio un impulso de luz contínua durante otros 10 minutos.
Luego se incuba a estas bacterias con medio de cultivo sin azúcares y burbujeado con dióxido de carbono marcado con el isótopo radioactivo del oxígeno 18O en erlenmeyers con agitación y luz continua. Se mide luego de 30 min. en un contador de centelleo el medio líquido, extractos de ambas bacterias y el aire. 1-Interprete los gráficos del Figura 1 2-Cuál podría ser la explicación del comportamiento de la bacteria nueva? 3-Cómo podría verificar que su interpretación es correcta? 4-En el segundo experimento, en qué muestra piensa que encontrará marca radioactiva en cada caso? justifique.
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