Acta Pharmaciae Indonesia 1(1) 32-35
Aktivasi Fagositosis Makrofag Menggunakan Ekstrak N-heksan Daun Lidah Buaya (Aloe vera) Activation Macrophage Phagocytosis Using N-Heksan Extract Aloe vera ABSTRAK
Rehana, Eka Prasasti Nur Rachmani, Iskandar Sobri Jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu – Ilmu Kesehatan UNSOED e-mail:
[email protected]
Kata kunci: Lidah buaya Fagositosis in vitro Keywords: Aloe vera Phagocytosis in vitro
Jus lidah buaya (Aloe vera) terbukti secara klinis meningkatkan sistem kekebalan tubuh yang ditandai degan meningkatnya jumlah sel T CD4+ yang berfungsi mengaktivasi fagositosis makrofag terhadap HIV yang sudah berikatan dengan antiretrovirus. Penggunaan daun lidah buaya dalam bentuk segar mudah ditumbuhi mikroorganisme .. Upaya yang dapat dilakukan untuk mengatasi hal tersebut adalah menyari zat-zat yang berpotensi sebagai imunomodulator menggunakan pelarut organik. Penelitian ini bertujuan mengetahui adanya peningkatan aktivitas dan kapasitas fagositosis sel makrofag yang diinduksi ekstrak n-heksan daun lidah buaya. Penelitian ini merupakan eksperimental laboratorium. Penyarian dilakukan dengan metode maserasi menggunakan metanol 99% dilanjutkan ekstraksi menggunakan n-heksan sehingga diperoleh 1,244 gram ekstrak n-heksan. Uji aktivasi fagositosis makrofag dilakukan secara in vitro dengan pembanding ekstrak phyllantus niruri. Kemampuan aktivasi fagositosis makrofag dinyatakan dalam nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis. Hasil penelitian menunjukan ekstrak n-heksn 125 dan 250 ppm dapat meningkatkan aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag meskipum belum menunjukan perbedaan yang bermakna secara statistik. Aloe vera fresh juice is clinically proven to enhance the immune system marked by increase in the number of CD4+ T cells that function activates macrophage phagocytosis against HIV that has been bonded to antiretroviral. The use of aloe vera leaves in fresh form easily overgrown microorganisms, so that form can not be developed on an industrial scale. That problem can be solved by quote immunomodulatory potential substance use organic solvents. The objective of this study was to determine the increase in phagocytosis activity and capacity of macrophages induced n-hexan extract of aloe vera. This is a laboratory experimental study. Extraction was done by maceration method using 99% methanol followed by extraction with n-hexane to obtain 1.244 grams of n-hexan extract. Activation of macrophage phagocytosis ability assay using in vitro method by comparison phyllantus niruri extract. Activation of macrophages phagocytosis ability was expressed as phagocytosis activity and capacity. The results showed 125 dan 250 ppm of n-hexan extracts can enhance macrophage phagocytosis activity and capacity whereas statistically not significant.
Pendahuluan Lidah buaya (Aloe vera) merupakan tanaman yang mudah tumbuh di negara tropis seperti Indonesia (Jatnika, 2009). Uji klinik yang dilakukan pada 29 orang yang positif terinfeksi HIV menunjukan konsumsi jus yang mengandung 500 gram daun lidah buaya segar dengan frekuensi pemberian sekali dalam sehari sebagai tambahan dalam terapi HIV selama 180 hari meningkatkan sistem kekebalan tubuh dengan naiknya jumlah sel limfosit T CD4+ dan berkurangnya replikasi HIV yang ditandai dengan turunnya jumlah
antigen P24 (Pulse and Uhlig, 1990). Imunomodulator merangsang tubuh memproduksi sel T CD4+ yang berfungsi mengaktivasi fagositosis makrofag terhadap HIV yang sudah berikatan dengan antiretrovirus (Bratawidjaja, 2002). Penggunaan daun lidah buaya dalam bentuk segar mudah ditumbuhi mikroorganisme. Upaya yang dapat dilakukan untuk mengatasi hal tersebut adalah menggunakan pelarut organik untuk menyari zat-zat yang berpotensi sebagai imunomodulator.
32
33
Rehana, E. P. N. Rachmani, I. Sobri
Daun lidah buaya mengandung berbagai senyawa organik polar dan semipolar yang dapat tersari pada maserasi menggunakan metanol yang perlu diteliti aktivitas imunomodulatornya. Penelitian ini menguji kemapuan ekstrak metanol daun lidah buaya dalam mengaktivasi kemampuan fagositosis sel makrofag, melalui pengujian aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag. Penelitian ini bertujuan mengetahui adanya peningkatan aktivitas dan kapasitas fagositosis sel makrofag yang diinduksi ekstrak n-heksan daun lidah buaya. Bahan dan Metode Pengambilan sampel Sampel daun lidah buaya diambil dari kelurahan Pabuaran kecamatan Purwokerto Utara, Kabupaten Banyumas, Jawa Tengah. Determinasi sampel Determinasi tanaman lidah buaya dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Determinasi dilakukan untuk memastikan bahwa sampel yang diambil merupakan daun lidah buaya. Ekstraksi sampel Daun lidah buaya dicuci bersih dan dibebaskan dari pengotor – pengotor yang ada. Daun lidah buaya yang sudah dicuci bersih dipotong tipis-tipis. Kemudian dikeringkan menggunakan oven pada suhu 70 oC. Simplisia tersebut kemudian diblender hingga menjadi serbuk kering. Sebanyak 48,49 gram serbuk kering direndam menggunakan 250 mL metanol 99% selama 24 jam. Setelah 24 jam perendaman, filtrat disaring menggunakan corong Buchner lalu ditampung sedangkan ampasnya direndam kembali selama 24 jam dalam metanol dengan volume yang sama. Proses perendaman dan penyaringan diulang hingga 3 kali. Semua filtrat yang diperoleh dicampur dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 65oC dengan kecepatan 30 rpm sehingga diperoleh 80mL ekstrak cair pekat. Sebanyak 80 mL ekstrak metanol ditambah 80 mL nheksan pa kemudian dikocok dan dibiarkan terpisah sempurna membentuk dua lapis cairan yaitu fase metanol pada lapisan bawah dan fase n-heksan pada lapisan atas. Fase metanol dicuci lagi menggunakan n-
heksan dengan cara yang sama sebanyak 2 kali lagi. Fase metanol dikumpulkan menjadi satu kemudian diuapkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 65oC dengan kecepatan 30 rpm sehingga diperoleh 1,244 gram ekstrak n-heksan. Pembuatan ekstrak n-heksan 125, 250, dan 500 ppm Sebanyak 10,3 mg ekstrak n-heksan dilarutkan dalam 50 µL DMSO kemudian ditambah 53 µL RPMI 1640 – FBS sehingga diperoleh ekstrak n-heksan dengan konsentrasi 100.000 ppm. 22 µL fraksi 100.000 ppm ditambah 4378 µL RPMI 1640 – FBS sehingga diperoleh ekstrak n-heksan 500 ppm. Fraksi 500 ppm diencerkan 2 kali sehingga diperoleh ekstrak n-heksan 250 ppm. 2,2 mL fraksi 250 ppm ditambah 2,2mL RPMI 1640 – FBS sehingga diperoleh ekstrak n-heksan 125 ppm. Pembuatan suspensi Phyllantus niruri 125 ppm 5,5 µL suspensi Phyllantus niruri 5mg/mL ditambah 2145 RPMI 1640 – FBS sehingga diperoleh suspensi 125 ppm. Pembuatan suspensi sel makrofag Mencit dimatikan menggunakan eter atau dislokasi leher. Mencit diletakan pada posisi terlentang, kulit bagian perut dibuka dan selubung peritoneumnya dibersihkan dengan alkohol 70%. Sebanyak 10 ml medium RPMI 1640 diinjeksikan secara intra peritoneal menggunakan spuit 27G. Kemudian dibiarkan selama 3 menit sambil ditekan – tekan perlahan supaya medium menyebar ke seluruh bagian peritoneal dan sel makrofag terbentuk. Cairan peritoneum diaspirasi dengan cara menekan organ dalam dengan 2 jari kemudian cairan diambil menggunakan jarum spuit 25G secara intra peritoneal pada bagian yang tidak berlemak dan jauh dari usus. Aspirat yang diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 750 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit. Endapan disuspensikan dalam medium RPMI 1640-FBS. Sebanyak 10 µL suspensi sel diteteskan ke dalam haemositometer kemudian dihitung jumlah sel pada 5 bilik. Kepadatan sel dihitung dengan rumus: Jumlah sel/mL = (Σ sel bilik A + Σ sel bilik B + Σ sel bilik C + Σ sel bilik D)/4 x 5 x 104. Diperoleh kepadatan 7,75 x 106 sel/ml. Sebanyak 1,620 mL suspensi sel diencerkan menggunakan medium RPMI 1640-FBS sehingga
Acta Pharmaciae Indonesia 1(1) 32-35
diperoleh 5 mL suspensi sel dengan kepadatan 2.500.000 sel/mL
menjadi semakin besar dan proses maserasi menjadi lebih efektif.
Uji fagositosis makrofag
Metabolit yang terkandung dalam simplisia disari menggunakan metanol 99%. Metanol dipilih sebagai penyari dikarenakan polaritasnya berada ditengah – tengah sehingga dapat menyari metabolit yang relatif polar maupun non polar. Filtrat yang diperoleh dipekatkan terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi menggunakan n-heksan. Pemekatan dimaksudkan untuk meningkatkan efektifitas pemisahan mengingat metanol dapat melarutkan senyawa polar dan non polar, pada konsentrasi rendah senyawa non polar dapat larut dalam n-heksan dan metanol tetapi pada konsentrasi yang lebih tinggi akan larut dalam n-heksan. N-heksan dipilih sebagai pencuci karena tidak dapat campur dengan metanol.
Suspensi sel dikultur pada sumuran microplate 24 yang sudah dilapisi cover slips bulat, setiap sumuran berisi 200µL (500.000 sel). Sel diinkubasi dalam incubator CO2 5% pada suhu 37°C selama 30 menit. Kemudian ditambah 0,8 mL medium RPMI 1640-FBS dan inkubasi dilanjutkan selama 21 jam. Inokulum dicuci menggunakan medium RPMI 1640 sebanyak 2 kali kemudian ditambah : 1) 1 mL ekstrak n-heksan dengan konsentrasi 500 ppm; 2) 1 mL ekstrak n-heksan dengan konsentrasi 250 ppm; 3) 1 mL ekstrak n-heksan dengan konsentrasi 125 ppm; 4) 1 mL ekstrak Phyllantus niruri dalam RPMI 1640-FBS dengan konsentrasi 125 ppm pada kelompok kontrol positif; 5) 1 mL RPMI 1640-FBS pada kontrol negatif. Semua kelompok diinkubasi pada kondisi yang sama selama 4 jam. Inokulum dicuci 2 kali menggunakan medium RPMI 1640. Setiap sumuran ditambah 200 µL suspensi lateks dalam RPMI 1640 - FBS dengan kepadatan 2,5x107/mL atau 5x106 sumuran, kemudian diinkubasi lagi selama 30 menit. Inokulum dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali kemudian dibiarkan kering pada suhu ruang. Masing – masing sumuran difiksasi dengan metanol absolute selama 30 detik. Metanol dibuang dan inokulum dibiarkan kering. Masing – masing sumuran diwarnai dengan larutan Giemsa 10 % selama 20 menit. Hasil pewarnaan dicuci 2 kali dengan aquadest. Cover slips diangkat dan dikeringkan pada suhu ruang. Sel makrofag yang telah terwarnai oleh giemsa akan berwarna merah berbentuk menyerupai monosit jika sel dalam keadaan dorman, berbentuk amoeboid jika sel dalam keadaan aktif dan adanya badan inklusi jika sel telah memfagositosit lateks. Jumlah sel dihitung menggunakan mikroskop dengan perbesaran 400 kali. Pengujian dilakukan dalam 3 kali pengulangan. Selanjutnya dihitung aktivitas dan kapasitas fagositosit dari tiap – tiap perlakuan. Hasil dan Pembahasan Daun lidah buaya dideterminasi untuk memastikan kebenaran taksonominya, selanjutnya dikeringkan pada suhu 70°C. Pengeringan dilakukan pada suhu tersebut bermaksud untuk menghindari tumbuhnya mikroba jika dikeringkan pada suhu ruang dan mengghindari rusaknya metabolit jika dikeringkan pada suhu diatas 70°C. Simplisia kering diserbukan supaya luas permukaan kontak simplisia dengan pelarut maserasi
Ekstrak n-heksan dikeringkan menggunakan rotary evaporator pada 65°C dengan kecepatan 30 rpm sehingga diperoleh 1,244 gram ekstrak n-heksan berupa ekstrak kental berwarna hijau kehitaman. Ekstrak kental yang diperoleh diuji aktivitas dan kapasitas fagositosisnya menggunakan metode in vitro. Dalam metode ini sel makrofag diinkubasi terlebih dahulu selama 30 menit dan 21 jam dalam incubator CO2 5% pada suhu 37 oC dengan tujuan untuk mengadaptasikan sel dari kondisi in vivo di dalam peritoneal mencit menjadi kondisi pengujian in vitro. Sel makrofag diaktivasi dengan ekstrak metanol dengan konsentrasi 125, 250 dan 500 ppm dengan pembanding Phyllantus niruri sebagai imunomodulator alami yang terbukti secara klinis berpotensi imunomodulator mengandung zat aktif tanaman tersebut. Makrofag aktif ditantang dengan lateks beads untuk melihat kapasitas fagositosisnya. Lateks beads dipilih sebagai makanan makrofag dikarenakan bentuknya homogen dan sangat jelas terlihat pada hasil pewarnaan menggunakan giemsa. Sel yang telah diwarnai akan berwarna merah keunguan terdiri atas vakuola dan inti sel. Inti sel lebih menyerap warna sehingga warnanya lebih pekat daripada vakuola. Sel berbentuk bulat jika dalam keadaan dorman dan berbentuk tidak beraturan jika dalam keadaan aktif. Lateks beads akan berwarna lebih pekat dan mengkilap (Ellis, 2007). Ekstrak n-heksan 125 dan 250 ppm dapat meningkatkan aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag meskipun belum menunjukan perbedaan yang bermakna secara statistik pada taraf kepercayaan
34
35
Rehana, E. P. N. Rachmani, I. Sobri
95%. Ekstrak n-heksan 500 ppm menurunkan aktivitas fagositosis karena banyaknya sel yang lisis (Mayer, 2008), sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui dosis optimum yang dapat meningkatkan aktivitas dan kapasitas fagositosis
makrofag. Optimasi dosis pemberian ekstrak n-heksan dapat dilakukan pada kisaran dosis 250 hingga 500 ppm.
vakuola
Inti sel vakuola
Inti sel
lateks
Gambar 1 Makrofag dorman
Gambar 2 Makrofag aktif
Tabel 1 Aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag Kelompok
Aktivitas Fagositosis Makrofag (%)
Kapasitas Fagositosis Makrofag
Kontrol Positif Kontrol Negatif N-heksan 125 ppm N-heksan 250 ppm N-heksan 500 ppm
31,34436 21,42995 23,02774 25,32903 17,48340
75,66445 75,10504 98,53325 128,57620 130,07945
Simpulan Ekstrak n-heksan 125 dan 250 ppm dapat meningkatkan aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag . Daftar Pustaka Baratawidjaja, K.G., 2002, Imunomodulasi dalam : Imunologi dasar, Edisi 5, Jakarta, Balai Penerbit FKUI:372-390. Ellis, R., 2007, Giemsa’s Staining Protocol for Tissue Sections, IMVS Division of Pathology Queen Elizabeth Hospital. Jatnika, A., Saptoningsih, 2009, Meraup Laba dari Lidah Buaya, Jakarta, Agro Media Pustaka:126.
Mayer, G., 2008. Innate (Non-Spesifik) Immunity. Microbiologi and Biology online. The Board of Trustees of the University of South Carolina. Pulse, T.L., Uhlig, E.A., 1990, Significant Improvement in a Clinical Pilot Study Utilizing Nutritional Supplements, Essential Fatty Acids and Stabilized Aloe Vera Juice in 29 HIV Seropositive ARC and Aids Patients, Journal of Advancement in Medicine 3(4):116. Palungkun, R., 1999, Sukses Beternak Cacing Tanah Lumbricus rubellus, Penebar Swadaya, Jakarta.
