EXPERIMENTO 6 PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LISOZIMA PRESENTE EN LA CLARA DE HUEVO
REQUISITOS Repasar los principi pr incipios os de cromatografía de intercambio iónico, electroforesis, influencia del pH y espectrofotometría
OBJETIVOS Purificar la enzima lisozima a partir de la clara de huevo por cromatografía de intercambio iónico, basándonos en su punto isoeléctrico, purificación mediante electroforésis en geles de poliacrilamida y determinación de la actividad act ividad enzimática por espectrofotometría.
1. FUNDAMENTO Entre las proteínas de la clara de huevo la lisozima es la única que presenta un punto isoeléctrico pH 9,5 por esta razón es fácilmente separable separable del resto de las proteínas de la clara de huevo, a un pH entre 9,5 y 10 es la única que posee una carga neta positiva, por lo tanto, los intercambiadores aniónicos dejaran libre esta enzima o los intercambiadores catiónicos se ligaran a ella. Nosotros seguiremos la purificación basados en este principio, para luego efectuar una electroforesis vertical en geles de poliacrilamida. Cuando comprobemos el recorrido de las bandas originadas por las proteínas presentes en cada fracción (de F0 a F4) contra las bandas de las proteínas comerciales con peso molecular (PM) conocido, podemos verificar el grado de purificación de la fracción que contiene la enzima ya que presentara una banda nítida y con el mismo PM de la lisozima comercial.
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También, podemos establecer el PM aproximado de las otras proteínas presentes en las fracciones restantes, y así comprobar si la purificación mediante columnas de intercambiadores iónicos fue eficiente. La enzima lisozima es una hidrolasa que cumple funciones de protección antibacteriana en nuestro organismo, ya que hidroliza el enlace glucosídico de los polisacáridos que forman las paredes celulares de las bacterias, por esta razón, al provocar la lisis del microorganismo Micrococus lisodeikticus ,
la suspensión bacteriana se aclara (pierde turbidez) permitiendo
medir la actividad enzimática siguiendo el declive de la absorbancia a 450 nm.
2. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO: 2.1.
Materiales equipos y reactivos
La clara de un huevo da aproximadamente 20 mg de enzima. Lisozima comercial 2 g de CM-Celulosa 2 g de DEAE-Celulosa Glicina 0,1 M en tampón de NaOH pH 10,0 Glicina 0,1 M en tampón de NaOH pH 10,0 con 0,5 M de NaCl Centrifuga Columna de 1 cm de diámetro x 25 cm de largo Reactivos para calcular la concentración de proteínas por el método de Lowry Espectrofotómetro Tampón fosfato 0,1 M pH 6,24 20 mg de M. lisodeikticus comercial Equipo de electroforésis Soluciones para electroforésis (ver método) Agitador rotatorio
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2.2. PROCEDIMIENTO 2.2.1. Protocolo para la Purificación de la Enzima (columna de CM-Celulosa) Filtrar 5 mL de clara en gasa, medir y diluir 5 veces con tampón de glicina 0,1 M en NaOH pH 10
F0 = Medir 1 mL de esta muestra donde están todas las proteínas Pesar 2 g de CM-Celulosa en un vaso de precipitado y mezclar 15 min. para adsorber la lisozima
Centrifugar la suspensión por 5 min. a 1.500 g
F1 = Medir 3 mL de sobrenadante donde están todas las proteínas menos la lisozima
F2 = Medir 3 mL de sobrenadante (pocas proteínas)
En el sedimento de celulosa está la lisozima Lavar con 10 mL de tampón de glicina y centrifugar como anteriormente
Resuspender el sedimento en 10 mL del mismo tampón y llenar la columna de 1cm Eluir con el tampón glicina hasta no encontrar más proteínas (Biuret, ver método)
F3 = Medir 3 mL del eluato de la columna negativo para Biuret (muy pocas proteínas)
Eluir la lisozima de la columna con el tampón glicina que contiene 0,5 M de NaCl
F4 = Medir 3 mL del eluato de la columna positivo para Biuret (lisozima pura)
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2.2.2. Determinación de la concentración de proteínas por el método de Lowry 2.2.2.1. Soluciones: Solución A: Na2CO3 2% en NaOH 0,1N Solución B1: CuS04 1% en H2O Solución B2: Tartrato de sodio-potasio 2% en H2O Solución Folin diluida 1:1 con H2O Solución C: B1 + B2 + A (1:1:100) Solución de albúmina (Patrón) 1 mg/mL. 2.2.2.2.
Procedimiento de la curva patrón:
Solución Albúmina (mL) 0 0,025 0,05 0,1 0,15 0,2
Muestra Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5
H2 O (mL)
Solución A (mL)
*
Solución Folin (mL)
**
0,6 0,575 0,55 0,5 0,45 0,4
3 3 3 3 3 3
* * * * * *
0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
** ** ** ** ** **
DO 750nm
* Luego de añadir la solución A esperar 10 minutos ** Después de añadir la solución Folin esperar 30 minutos 2.2.2.3.
Determinación de la concentración de proteínas en la muestra problema:
Muestra Fracciones
Sustancia problema (mL) 0,1
H2 O (mL)
Solución A (mL)
*
Solución Folin (mL)
**
0,5
3
*
0,3
**
DO 750nm
* Luego de añadir la solución A esperar 10 minutos ** Después de añadir la solución Folin esperar 30 minutos 2.2.3. Determinación cualitativa de proteínas mediante la reacción de Biuret Prepare CuSO4 al 0,5 % y NaOH al 10 %. Coloque 0,5 mL en un tubo y 0,5 mL de NaOH al 10 % agite y añada 4 gotas del CuSO4 al 0,5 %, agitando después de cada adición. La aparición de un color violeta indica la presencia de proteínas al formarse un complejo de coordinación entre el Cu y las uniones peptídicas. 4
2.2.4. Determinación de la Actividad de la Lisozima 2.2.4.2.
Disuelva 20 mg de M. lisodeikticus en 100 mL de tampón fosfato pH 6,24.
2.2.4.3.
Prepare los tubos suficientes, incluyendo el blanco. La actividad enzimática en
cada una de las fracciones se detectará mediante el declive de la absorbancia a 450 nm en el espectrofotómetro. 2.2.4.4.
Bajo estas condiciones estándar 1 unidad es definida como la actividad causada a
450 de 0,001 g en 1 min.
2.2.4.5.
Efectúe los cálculos y escriba sus resultados en una tabla.
PROCEDIMIENTO: MUESTRA TAMPÓN FOSFATO TAMPÓN FOSFATO + (mL) MICROORGANISMO (mL)
H2O (mL)
FRACCIONES (mL)
3 Blanco 2 1 Control 2 1 F0 2 1 F1 2 1 F2 2 1 F3 2 1 F4 Medir la absorbancia cada 15 min. hasta obtener la misma lectura, a una D.O. de 450 nm. Actividad Enzimática = Lectura Inicial-Lectura final = X Tiempo Actividad Específica de la Enzima =
X mg de proteínas
3. AUTO-EVALUACION 3.1 Consulte sobre las propiedades líticas de la enzima, su sustrato, clasificación. 3.2 Diseñe un protocolo para intercambio con DEAE-Celulosa. 3.3 ¿Cómo cree Ud. que se pudo determinar el punto isoeléctrico de la lisozima?, diseñe un protocolo para llegar a determinarlo
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