LABORATORIO Nº 6 EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN DE COLESTEROL INTRODUCCIÓN Los lípidos comprenden una amplia gama de compuestos químicos insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos (éter, acetona, cloroformo, benceno, etc.). Los lípidos presentes en las estructuras biológicas generalmente se encuentran asociados a otras biomoléculas como proteínas e hidratos de carbono. Por otra parte, aunque los lípidos se consideran sustancias hidrofóbicas o apolares, presentan diferente grado de polaridad. Los triglicéridos totalmente apolares, no tienen ningún grado de interacción con el agua, en tanto que los fosfolípidos son moléculas bipolares e interactúan con el agua formando monocapas, bicapas y micelas. El colesterol es también una molécula bipolar debido al grupo OH unido a su anillo esteroidal, pero es de menor polaridad que un fosfolípido. El colesterol se encuentra libre o como colesterol esterificado con ácido graso, siendo este último menos polar. Así por ejemplo la acetona extrae principalmente triglicéridos y colesterol, ya que los fosfolípidos, más polares, son poco solubles solubles en acetona. Por lo tanto, cualquier cualquier método de extracción de lípidos requiere utilizar mezclas de solventes orgánicos que permitan solubilizar todos los lípidos y precipiten proteínas e hidratos de carbono para su mejor separación. Aprovechando la solubilidad solubilidad diferencial de los lípidos se puede realizar una extracción fraccionada fraccion ada con distintos solventes, lo que permite la separación de los diferentes lípidos. El colesterol es un compuesto de origen animal, cuyo contenido varía de organismo a organismo, pero se encuentra principalmente como colesterol esterificado, asociado a proteínas celulares o como lipoproteínas en la circulación. En este trabajo práctico estudiaremos el contenido de colesterol en una muestra biológica, yema de huevo de gallina. La yema representa entre el 30-40% del peso total del huevo, con alrededor 6 y 6,5 g de lípidos totales. La determinación del colesterol se realiza por métodos químicos y enzimáticos. Los métodos químicos utilizan una mezcla de sales férricas, ácido acético y ácido sulfúrico (reactivo de Liebermann-Burchard), que en presencia de colesterol dan origen a un producto coloreado estable, cuya concentración se puede determinar por lectura a 540nm en un espectrofotómetro. Los métodos enzimáticos (menos corrosivos) usan la enzima colesterol oxidasa, la que en presencia de O 2 oxida colesterol colestero l generando H2O2. En presencia de una peroxidasa, fenol y aminoantipirina, el H 2O2 origina un producto rojo, cuya concentración es proporcional al contenido de colesterol y que se lee a 500nm.
En este trabajo práctico se determinará el colesterol por un método químico y se realizará la extracción con una mezcla de acetona: éter (1:1).
OBJETIVOS 1. Conocer métodos generales de extracción de lípidos. 2. Comprender las propiedades fisicoquímicas de los lípidos involucradas en la extracción con solventes orgánicos. 3. Conocer métodos de identificación de colesterol en muestras biológicas
ACTIVIDADES Experimento I: Extracción de colesterol 1. Tome 2 vasos de precipitado de 100ml y rotúlelos con las letras H1 y H2. Agregue aproximadamente 0,3g de yema de huevo a cada uno de los vasos (tome un vaso prepesado). Agregue a ambos vasos 10ml de mezcla acetona: éter (1:1) y agite con varilla de vidrio por 5 minutos. 2. Vacíe el contenido de los vasos a tubos de centrifuga, tapar con tapón de goma y centrifugue por 5 minutos a 3.000rpm. Sacar los tubos con cuidado para no remover el contenido. El sobrenadante será utilizado para la medición del colesterol.
Experimento II: Determinación de colesterol total. 1. Rotule 2 tubos de ensayo (1 y 2) y adicione a cada uno de ellos 0,5ml de sobrenadante anterior y evapore a sequedad en un baño termoregulado a 60 °C. 2. Agregue 0,5ml de cloroformo a cada tubo (1 y 2). En este momento incluir un tubo blanco que contiene 0,5ml cloroformo. 3. Agregar 2ml de ácido sulfúrico concentrado (H 2SO4 conc) por la pared del tubo. Tapar bien con tapa de goma, mezclar suavemente a homogeneidad y esperar 5 minutos. 4. Determine la absorbancia de cada tubo, leyendo en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm, utilice el tubo blanco para calibrar el equipo a cero. Anote sus resultados. 5. En base a sus resultados determine el contenido de colesterol en miligramos/gramo de yema de huevo y por yema entera. Para ello realice los cálculos correspondientes. 6. Compare sus datos con la información de sus compañeros. Discuta todas las posibles causas de variación.
Soluciones y materiales: 1. Huevos enteros (se ocupará la yema como fuente de colesterol) 2. Mezcla Acetona – Eter (1:1 v/v) 3. Solución de Colesterol 0,5mg/ml. 4. Ácido sulfúrico concentrado. 5. Papel Parafilm. 6. Baño termoregulado a 60°C. 7. Baño termoregulado a 100°C 8. Tubos de centrifuga y centrifugue. 9. Gradilla con tubos de ensayo. 10. Pipetas graduadas de 5 ml. 11. Pipetas Pasteur con bulbo. 12. Vasos de precipitado de 100 mL 13. Peras de gomas y pro-pipetas. 14. Cinta para rotular. 15. Varillas para agitación. 16. Bagueta 17. Balanza 18. Agitador de tubos 19. Agua destilada.
