Universidad de Chile. Facultad de Ciencias. Departamento de Química. Asignatura: Química Biológica (Laboratorio) (Laboratorio) Práctico: Efecto de la fuerza iónica. Precipitación por salazón y cuantificación de las Proteínas del suero sanguíneo. Efecto solubilizante del NaCl sobre las proteínas del suero sanguíneo. Fecha :
25 de abril de 2013.
Integrantes: Javier Valdebenito. Sebastián Romero.
Introducción Un aumento en la concentración de una sal estabiliza los grupos cargados de la proteína (electrolito multivalente) aumentando por lo tanto su solubilidad. Sin embargo, a concentraciones altas de sales neutras, disminuye la solubilidad de las proteínas. Esto se puede deber a que a estas concentraciones, se hacen más fuertes las interacciones proteína-proteína que las interacciones proteína-agua por la competencia de la sal y la proteína por las moléculas de agua, haciendo que precipite. Conocer la concentración de sal que permiten solubilizar una proteína puesto que generalmente las proteínas precipitan o se desnaturalizan si se disuelven en agua por lo que deben ser disueltas en soluciones salinas. El método de Biuret se basa en la formación de complejo de Cu +2 con 4 átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos de la proteína que da una solución violeta que absorbe a los 540nm. Este método permite conocer la concentración concentración de proteínas mediante espectrofotometría espectrofotometría UV.
Resultados y análisis de resultados Reacción de Biuret Con el reactivo de Biuret se reconocen proteínas y péptidos cortos con dos o mas enlaces peptídicos. Las proteínas son un una mezcla muy compleja de aminoácidos, aminoácidos, los que corresponden a la unidad básica de estas. Reacción de Biuret: Esta reacción se produce en compuestos que contengan 2 grupos carbamino (-CO-NH-) unidos a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno, y está diseñada para detectar la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos que tengan 2 o más enlaces peptídicos. La reacción se basa en la formación de un producto de color violeta que se genera por la coordinación entre los iones Cu +2 presentes en el reactivo de Biuret, y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que se encuentran como parte de los enlaces peptídicos.
En esta reacción, una proteína más un alcalino concentrado forman un Biuret, que corresponde a un complejo. El reactivo es una solución de CuSO 4 al 1% en solución acuosa alcalina (NaOH). Cuando el test da positivo, se forma un complejo coordinado entre los iones Cu +2 y los pares no coordinados del Nitrógeno presente en el enlace peptídico (-CO-NH-) que es de color violeta.
Curva de calibración: Para realizar la curva de calibración, se utilizó el método de Biuret. El reactivo de Biuret (1,5 g de CuSO 4 x 5H2O + 6 g tartrato de sodio y potasio tetrahidratado en 500 mL de agua más 300 mL de NaOH 10% y enrasar a 1 L) reacciona con el nitrógeno del enlace peptídico, específicamente el Cu de la solución, produciendo una coloración violácea. Se toman 4 mL del reactivo de Biuret, mL de patrón tal que la curva no supere los 7 mg/mL y el resto de volumen se completa con NaCl 0,5 M hasta un total de 6 mL. Los resultados de los cálculos se visualizan en la tabla 1.
Tubo Blanco A B C D E
Tabla 1: Cálculos para realizar la curva de calibración Volumen Volumen suero Volumen mg de proteínas reac. Biuret patrón NaCl 0,5 M a medir (curva) (mL) 10 mg/mL (mL) (mL) 4,0 0,0 0,0 2,0 4,0 0,1 1,0 1,9 4,0 0,2 2,0 1,8 4,0 0,3 3,0 1,7 4,0 0,5 5,0 1,5 4,0 0,7 7,0 1,3
Volumen total (mL) 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0
Luego, los tubos de ensayo se calentaron a 50 °C por 5 minutos y se midió la absorbancia a 540 nm. Los datos se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: Medición de curva a 540 nm. Concentración Tubo Proteínas Absorbancia (mg/6 mL) Blanco 0,0 0,000 A 1,0 0,182 B 2,0 0,296 C 3,0 0,408 D 4,0 0,485 D 5,0 0,570
Con los datos de la columna 2 y 3, se realiza el gráfico de la curva de calibración y su respectivo ajuste lineal.
Gráfico 1: Absorbancia v/s concentración de proteína y el ajuste lineal respectivo. Determinación de la concentración de proteínas de suero sanguíneo y del sobrenadante de la precipitación de la seroglobulina: Para determinar la cantidad de proteínas totales, se adicionaron 0,2 mL de muestra de suero sanguíneo a 4 mL del reactivo de Biuret y se completaron 6 mL de solución con 1,8 mL de NaCl 0,5 M y se siguió el mismo procedimiento que la curva de calibración antes de medir la absorbancia. Por otro lado, para precipitar la seroglobulina, se tomó 0,5 mL de suero y se adicionó 9,5 mL de una solución de (NH 4)2SO4. Se calentó a 37 °C, centrifugó y se tomó una alícuota de 2 mL del sobrenadante al cual se le agregaron 4 mL del reactivo de Biuret, y se siguió el mismo procedimiento que la curva de calibración antes de medir la absorbancia. Las mediciones de absorbancia se muestran en la tabla 3.
Tabla 3: Absorbancias de muestras de suero Muestra Absorbancia Suero total 0,309 Sobrenadante 0,148
Con los datos de las concentraciones obtenidos de la ecuación proporcionada por el gráfico se realizan los cálculos respectivos, dependiendo del tratamiento de la muestra, y se encuentra, finalmente, la cantidad de proteínas totales, seroalbúmina y seroglobulina que había en los 2 mL de muestra de suero. El resultado final se expresa en g/100 mL. Los resultados finales se muestran en la tabla 4. Tabla 4: Composición de proteínas del suero sanguíneo, en g/100 mL. concentración concentración concentración en 2 mL Fracción Absorbancia proteína (mg/6 mL) muestra (mg/2 (g/100 mL) mL) Suero total 0,309 2,18 65,4 3,27 Seroalbúmina 0,148 0,51 30,6 1,53 Seroglobulina 1,67 34,8 1,74
Fracción Suero total Seroalbúmina Seroglobulina *
concentración (mg/mL) 0,363 0,085 0,278
Proteína total (mg) 3,63 0,85 2,78
Porcentaje proteína (%) 100 23,42 76,58
La cantidad de seroglobulina se calcula por diferencia entre suero total y seroalbúmina.
Conclusión Se pudo obtener una curva de calibración mediante el método de Biuret para la determinación de la concentración proteínas en Suero Sanguíneo. Se pudo determinar la concentración de cantidades de proteínas totales, de Seroalbúmina y de Seroglobulina en una muestra de Suero Sanguíneo mediante el mismo método. Se logró utilizar la absorbancia de la solución de suero sanguíneo en medio salino y reactivo de Biuret para la obtención de la concentración de proteínas. Durante esta experiencia de laboratorio, se utilizó como disolvente una solución saturada de sulfato de amonio, cuyo papel consiste en precipitar proteínas solubles. Esto sucede porque el sulfato de amonio produce la competencia del agua, entre la disolución de esta sal o de las proteínas, causando que éstas últimas sean las que precipiten. También fue utilizada una solución de NaCl como disolvente, cuyas características tienen un efecto solubilizante sobre las proteínas del suero patrón, ya que al agregar este disolvente a la solución de proteínas, éstas tienden a solubilizarse. Pero, si aumentamos la concentración de NaCl, éstas no van a precipitar.
