Unique Origins and Bidirectional Replication (asal mula yang khas dan replikasi dua arah)
Percobaan Crains tidak membuktikan bahwa replikasi berasal dari tempat yang khas atau di tempat yang acak pada kromosom. Hasil itu juga belum bisa memberikan perbedaan antara yang unidireksional (satu arah) atau bidireksional (dua arah). Terdapat fakta b ahwa replikasi pada E. pada E. coli atau coli atau beberapa organisme lain diproses secara dua arah dari asalnya yang khas. Bakteriofag lamda atau faga λ (T2), adalah contoh virus virus yang berkembang di E. di E. coli yang coli yang memiliki kromosom yang berisi sebuah molekul DNA single linier yang panjangnya 17,5 µm. faga λ memiliki keunikan yaitu di dalamnya dalamn ya terdapat terdapat sebuah bagian untaian tunggal, panjangnya 12 nukleotida, di 5` akhir ada untaian yang saling melengkapi (kohesif atau untaian yang lengket). Akhir yang kohesif tadi bisa menjadi pasangan basa untuk membentuk ikatan hydrogen dengan struktur melingkar.Salah satu hal yang pertama kali terjadi setelah kromosom kromosom λ diinjeksikan ke sel inangnya adalah perubahan menjadi molekul sirkuler yang tertutup secara kovalen yang di katalisis oleh polinukleotida ligase, enzim yang berperan p enting dalam menutup untaian DNA dobel heliks yang terputus. Keistimewaan yang di tunjukkan oleh kromosom k romosom λ dari replikasi replikasi dua arah ini adalah adanya diferensiasi menjadi wilayah yang konsentrasi adenine dan timinn ya tinggi (“A(“A-T rich” regions) regions) dan wilayah dan jumlah guanine dan cytosine yang banyak. secara khusus kromosom lamda mengandung bagian yang sangat tinggi kandungan A-Tnya A-Tnya (“A(“A-T rich” cluster). Cluster A-T A-T itulah yang digunakan M. Schӧnes dan R. B. Inman untuk mendemonstrasikannya menggunakan teknik “pemetaan denaturasi”, bahwa replikasi kromosom lamda di inisiasi inisiasi di asal yang khas dan dip roses secara dua arah dari pada satu arah. Ikatan hydrogen dan ikatan hidrofobik yang menahan ikatan pelengkap susunan dobel heliks o akan terputus saat molekul DNA di arahkan ke suhu yang tinggi (100 C) atau pH yang tinggi (11,4). Proses itu dinamakan denaturasi. Molekul yang kaya akan A-T akan lebih mudah terdenaturasi dari pada molekul yang kaya akan G-C karena ikatan hidrogennya lebih sedikit. Saat kromosom lamda diarahkan ke pH 11,05 selama 10 menit di bawah keadaan normal, cluster A-T A-T terdenaturasi menjadi “gelembung denaturasi” yang berbentuk sirkulerdan di setiap ujungnya terdapat cabang (struktur berbentuk Y). Kedua cabang tersebut adalah percabangan replikatif yang bergerak secara berlawanan. Replikasi dua arah dari arah yang khas juga diterapkan pada beberapa organisme yang kromosomnya juga bereplikasi sebagai struktur yang linier. Replikasi dari kromosom milik faga T7, kolifaga kecil lainnya, dimulai di tempat yang khas di dekat salah ujungnya untuk
membentuk struktur “mata” dan diproses secara dua arah sampai salah satu percabangannya mencapai ujung yang terdekat replikasi dari struktur “bentuk Y” berlanjut hingga percabangan kedua mencapai ujung molekul yang lainnya, menghasilkan dua kromsom progeny. Organisme eukariot juga bereplikasi secara dua arah. Kromosom dari kolifaga P2 mereplikasi secara satu arah dari asalnya yang khas, walau memiliki kromosom lamda yang sirkuler. Pada beberapa organisme asal sekunder tidak aktif, dan akan aktif saat asal primer dari kromosom T7 di hapus (menghilang secara fisik dari kromosom).
DNA Polymerases and I n Vi tr o DNA Synthesizes (Sintesis DNA I n Vitro dan DNA Polimerase)
Sisntesis DNA secara In Vitro pertama kali dilakukan oleh Arthur Kornberg dan asistennya pada tahhun 1957. Kornberg berhasil mengisolasi sebuah enzim yang berasal dari bakteri E. coli (yang awalnya disebut DNA polymerase atau “Enzim Kornberg”. saat ini dikenal sebagai DNA polymerase I) yang mengkatalisis tambahan kovalen pada nukleotida dari rantai DNA yang sudah ada sebelumnya. Enzim itu membutuhkan masing-masing sebuah 5`-trifosfat dari ke 4 deoksiribonukleosida yang ada, yaitu: deoksiadenosin trifosfat (dATP), deoksitimidin trifosfat (dTTP), deoksiguanosin trifosfat (dGTP), dan deoksitidin trifosfat (dCTP). Enzim-enzim tersebut 2+ hanya aktif bila ada ion-ion Mg dan DNA yang sudah ada sebelumnya. DNA ini harus menyediakan DNA yang memiliki fungsi primer dan DNA yang memiliki fungsi template. 1. DNA primer. DNA polymerase I tidak dapat menginisiasi sintesis dari rantai DNA de novo. Dia memiliki sayarat yang mutlak yaitu hanya dapat menambahkan nukleotida ke ujung 3`hidroksil bebas pada rantai DNA yang sudah ada sebelumnya. DNA polymerase I mengkatalisis susunan dari jembatan fosfodiester diantara 3`-OH pada akhir rantai DNA primer dan 5`-fosfat pada deoksiribonukleotida yang baru masuk. Arah sintesis dari proses tersebut menjadi 5` 3`. 2. DNA template. DNA polymerase I tidak berisi untaian yang spesifik, maka enz im membutuhkan rantai DNA template yang urutan basanya sudah didikte, melalui syarat pasangan basa DNA, sintesis dari urutan basa yang saling membutuhkan sudah d i sintesis sebelumnya. Sejak percobaan Kornberg, banyak ilmuwan yang juga melakukan percobaan dengan menggunakan DNA polymerase dan di coba di berbagai macam organisme. Tiga DNA polymerase yang berbeda (I, II, dan III) sudah diidentifikasi dari bakteri E. coli dan B. subtilis. Selain itu juga ada DNA polymerase α,β, dan γ yang sudah diidentifikasi dari beberapa eukariotik. Dan ada polymerase δ yang baru-baru ini ditemukan, sebagai DNA polymerase ke empat.
Beberapa polymerase belum diketahui fungsi utamanya dengan jelas. Bagaimanapun pada E. coli dan B. sutilis polymerase III merupakan enzim replikatif utamanya dibanding pol ymerase I. Hal ini dibuktikan dari pelajaran tentang mutan, yang di sebut mutan template, yang disebabkan oleh pembentukan yang kurang sempurna di DNA polymerase I. Mutan template mereplikasi DNA mereka dengan kecepatan normal, namun kecepatan normal tersebut tidak cukup untuk memperbaiki kerusakan yang melibatkan DNA. Dari sini dap at diketahui bahwa fungsi utama DNA polymerase adalah untuk perbaikan DNA. Selain itu DNA polymerase juga bertanggung jawab dalam pemotongan RNA primer yang akan digunakan untuk mensintesis DNA. Fungsi dari Polimerase II belum jelas. Kemungkinan fungsinya ntuk mengambil alih tugas polymerase I dan polymerase III dalam mereplikasi DNA saat keduan ya tidak ada. Polymerase III memilikiperan yang penting dalam replikasi DNA, karena saat polymerase III yang tidak berfungsi di sintesis, sintesis DNA akan berhenti. Kebanyakan DNA polimerae prokariotik yang dipelajari sejauh ini tidak hanya menunjukkan aktifitas polymerase 5` 3`, tapi juga aktifitas eksonuklease 3` 5`. Kedua aktifitas tersebut terdapat pada protein makromolekul yang sama. Aktifitas eksonuklease 3` 5` mengkatalisis pemutusan nukleotida satu per satu di mulai dari akhir rantai polinukleotida 3`. Saat ada, aktifitas eksonuklease 5` 3` ditemukan di tempat dimana terdapat protein molekul yang berbeda sisi aktif yang mengkatalisis reaksi polymerase 5` 3` dan reaksi eksonuklease 3` 5`. Keduanya memiliki peranan yang penting untuk metabolisme DNA. Aktifitas eksonuklease 3` 5` dari DNA polimerase memiliki peran sebagai “proofreading” atau “editing” yang sangat penting. Saat disajikan dengan dengan DNA primer-template yang mengalami terminal mismatch eksonuklease dari polymerase memotong basa yang tidak berpasangan. Aktifitas eksonuklease 5` 3` dari DNA polymerase prokariotik juga memiliki fungsi yang penting dalam menghilangkan pecahan DNA yang rusak. Eksonukleas 5` 3` dari polymerase seperti DNA polymerase I E. coli juga berfungsi dalam penghilangan RNA primer dari DNA. Aktifitas nuclease 5` 3` ini tidak di temukan pada DNA polymerase eukariotik manapun. Pada eukariotik fungsi aktifitas eksonuklease 5` 3` dibantu DNA polymerase. Pertanyaan 1. Bagaimana proses terbentuknya cabang replikasi? Cabang replikasi terbentuk karena adanya enzim helikase yang memutus ikatan-ikatan hydrogen yang menyatukan kedua untaian DNA, untaian ganda terbuka menjadi dua cabang yang masing masing teridiri dari sebuah untaian tunggal DNA. 2. DNA polymerase apa saja yang berperan dalam proses “proofreading”? . Penelitian pada awal tahun 2010 pada sel jaringan ikat manusia menyatakan ada tiga jenis DNA polimerase yang terlibat dalam terjadinya pemotongan nukleotida, dalam rangka koreksi terhadap DNA, yaitu DNA polimerase δ, ε, dan κ
GENETIKA
LAPORAN PRAKTIKUM Makalah ini disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah Genetika yang dibimbing oleh Bapak Duran Corebima Aloysius
disusun oleh:
Kelompok 8 Offering C Elsa Dewi Nur Bawati
(120341421937)
Rianita Ulifianti
(120341421962)
UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI Februari 2014
