tp dosage de l'urée plasmatique

République algérienne démocratique et populaire. Université Djillali Liabes Faculté de Médecine Département de Pharmacie

TP N°03 Dosage l’urée plasmatique

Réalisée par: • GHERMI Mohamed. • BETTAYEB Mohamed Amine. • TAHRI Mahmoud. • CHAREF KHODJA Meriem. 4 ème année pharmacie G05. Année universitaire : 2008 / 2009

TP N 3

DOSAGE DE L’UREE PLASMATIQUE (AZOTEMIE)

L'urée, molécule très hydrosoluble, est la forme principale d'élimination des déchets azotés du métabolisme des protéines chez l'Homme. La détermination de l'urée dans le sang longtemps pratiquée pour évaluer la fonction rénale a été supplantée par celle de la créatinine. L'urée est le composé azoté le plus abondant de l'urine humaine. Son dosage dans l'urine est un témoin du métabolisme protidique permettant de comparer les pertes quotidiennes l'azote aux apports. Le dosage de l'urée dans le sang est généralement pratiqué en faisant appel à une méthode enzymatique (uréase).

I- Intérêt physiopathologique : L'urée est une molécule très hydrosoluble, électriquement neutre. C'est la forme principale d'élimination des déchets azotés du métabolisme des protéines chez l'Homme. La plus grande partie de l'ammoniac (NH3), produit dans le foie par la désamination des acides aminés, est transformée en urée (uréogenèse ou cycle de Krebs-Henseleit), au niveau du foie et du cerveau. L'urée est complètement filtrée par le glomérule et réabsorbée partiellement au niveau du néphron, de façon inversement proportionnelle au débit urinaire. L'urée est la première substance dont l'augmentation dans le plasma a été associée au «mal de Bright». À ce titre, elle fut longtemps utilisée pour apprécier la fonction rénale. La concentration de l'urée sanguine (ou urémie), correspond à un équilibre entre sa production, le volume de diffusion (correspond à l'eau totale, soit environ 60% du poids corporel), et son excrétion urinaire. Étant donné tous les facteurs extrarénaux susceptibles d'influencer l'urémie, pour évaluer la fonction rénale, le dosage de la créatinine dans le sang et dans l'urine lui a été préféré. De même, le calcul de la clairance de l'urée a été remplacé par celui de la clairance de la créatinine. L'urée est le composé azoté le plus abondant de l'urine humaine. Son dosage contribue à l'exploration de la fonction rénale, et chez le sujet sans affection hépatique ou rénale, il est un témoin du métabolisme protidique permettant de comparer les pertes quotidiennes d'azote aux apports prescrits et ainsi de suspecter une mauvaise observance à un régime ou un état hypercatabolique si l'excrétion d'azote est supérieure aux entrées. 1

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DOSAGE DE L’UREE PLASMATIQUE SMATIQUE (AZOTEMIE)

IIII- Métabolisme de l’urée (Cycle de l’urée) : L'ammoniaque, produit final du catabolisme protéique et toxique pour le système nerveux central, est éliminé de l'organisme par sa transformation en urée au niveau hépatique. Cette élimination ion est réalisée par une voie métabolique, le cycle de l'urée, constituée de six étapes enzymatiques réparties entre la matrice mitochondriale et le cytosol de la cellule hépatique, hépatique, ces 6 enzymes sont les suivants : N-acétylglutamate acétylglutamate synthase [NAGS], carbamylphosphate carbamylphosphate synthétase I [CPSI], ornithine transcarbamylase [OTC], argininosuccinate synthétase [ASS], argininosuccinate ate lyase [ASL], arginase [ARG]. [ARG] Certaines de ces enzymes peuvent se retrouver dans d'autres tissus; elles ont alors un autre rôle. Tout dysfonctionnement dysfonctionnement de cette voie métabolique entraînera l'apparition d'une hyperammoniémie. Celui-ci Celui ci peut être le résultat d'une mutation délétère touchant un gène codant pour une des enzymes impliquées ou d'une inhibition d'une des enzymes causée par l'accumulation l'accumulation d'un composé d'origine endogène (aciduries organiques) ou exogène (valproate). Dans le cas d'un dysfonctionnement d'origine génétique, il est important de caractériser précisément l'étape défectueuse dans un but thérapeutique et de conseil génétique. génétiq

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IIIIII- Dosages de l’urée dans l’organisme : 1- Etape prépré-analytique : a- Urée sanguine : L'urée étant très diffusible, sa concentration est identique dans le plasma et les globules rouges. Les résultats obtenus à partir du plasma, du sérum, ou du sang sont équivalents. Le prélèvement est de préférence effectué chez le sujet à jeun. Le sang est recueilli dans des tubes avec ou sans anticoagulant. Le fluorure de sodium est à éviter car il inhibe l'uréase utilisée dans les techniques enzymatiques contrairement à l'iodoacétate qui ne l'affecte pas. b- Urée urinaire : Le dosage est effectué, soit sur un échantillon des urines de 24 heures, soit sur une miction. Étant donné la consommation possible de l'urée par des germes possédant une uréase, les urines peuvent être conservées pendant 7 jours à+4°C ou 1 mois à -20°C.

2- Techniques de dosages : a- Techniques chimiques : Méthode à l’hypobromite de Na: Na: L'urée est traitée par une solution alcaline d'hypobromite de sodium, ce qui donne un dégagement d'azote qui est mesuré dans l'uréomètre et comparé à l'azote dégagé, dans les mêmes conditions, par une solution d'urée de titre connu. La défécation du sérum est effectuée par une solution d'acide trichloracétique. L'appareillage était représenté par l'uréomètre d'Yvon et une cuve à mercure. Cette technique, applicable aussi bien au sérum qu'à l'urine n'est plus utilisée depuis longtemps, mais c'est elle qui a donné le nom d'azotémie au taux d'urée dans le sang. Méthode à la diacétyl monoxime (DAM): L'urée réagit à chaud avec la DAM, en présence d'ions ferriques, pour former une coloration rose qui peut être sensibilisée et stabilisée par des adjuvants tels que le thiosemicarbazide, cette coloration peut être dosée par mesure de l’absorbance à 520 nm (dosage colorimétrique). Cette méthode est souvent utilisée après déprotéinisation, mais elle peut aussi être utilisée directement. La parfaite proportionnalité entre l'absorbance et le taux de l'urée autorise l'emploi de 2 ou 3 étalons seulement. 3


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DOSAGE DE L’UREE PLASMATIQUE SMATIQUE (AZOTEMIE) • •

Le seuil de détection est de 10 PP P Une courbe d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la concentration d’urée est tracée :

•

La courbe d’étalonnage de l’urée est une droite pour une gamme de concentrations comprise entre 0 et 30 ppb. La réaction chimique est la suivante :

•

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DOSAGE DE L’UREE PLASMATIQUE SMATIQUE (AZOTEMIE) •

Le facteur clé de ce dosage est la température de chauffage qui doit être rigoureusement identique et constante pour toutes les solutions étalons. étalons

Cette méthode est désormais abandonnée. b- Techniques enzymatiques : L'urée est principalement dosée par des méthodes basées basées sur l'action préliminaire de l'uréase suivie de réactions auxiliaires différentes. Les techniques enzymatiques utilisées par moins de 20% des laboratoires aboratoires il y a 30 ans sont aujourd'hui très largement majoritaires.

Uréase/glutamate déshydrogénase, mesure à 340 nm : Elles exploitent le schéma réactionnel suivant :

Dans les conditions opératoires choisies, la vitesse de disparition du NADH est proportionnelle à la concentration d'urée dans l'échantillon. La lecture est effectuée à 340 nm. Cette technique hnique peut être effectuée en cinétique ou en point final.

Technique électrochimique : L'uréase dégrade l'urée en NH4+ qui fait varier la conductivité. On mesure la cinétique de la variation de la conductivité avec une électrode sélective de conductivité.

Technique réflectométrique : Les plaques sont constituées de plusieurs couches réactionnelles sur un support en polyester. La méthode analytique est basée sur l'hydrolyse de l'urée en présence d'uréase pour donner de l'ammoniac et du gaz carbonique. Une réaction colorimétrique permet de déterminer par réflectométrie la concentration en ammoniac produit. Cette méthode analytique à l'avantage d'être spécifique, rapide et d'éviter l'utilisation de produits corrosifs ainsi que la déprotéinisation. 5


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Méthode colorimétrique colorimétrique de Berthelot : Les ions ammonium produits par l'action de l'uréase réagissent en milieu alcalin avec l'hypochlorite de Na, en présence de nitroprussiate de Na, pour former une monochloramine qui dans un 2ème temps réagit avec deux phénols pour former un indophénol responsable du développement de la coloration verte mesurée à 580nm.

Technique de référence : Une technique utilisant le couple uréase/glutamate-déshydrogénase a été proposée par le Center for Disease Control (CDC) comme technique de référence pour le dosage de l'urée sanguine.

IVIV- Application au TP (Echantillon N°105) : 1- Réactif : R1 : Nitroprussiate de Na (catalyeur) + Uréase. R2 : Hypochlorite de Na + NaOH. [Etalon] = 0,5 g/l. g/l

2- Echantillon : Sérum (N°105 N°105). N°105 Faire une dilution au 1/3. 1/3

3- Méthode et mode opératoire : La méthode utilisée est celle de la méthode colorimétrique de Berthelot. Les différentes étapes sont résumées dans le tableau suivant :

Eau distillée Etalon Echantillon R1

Blanc

Etalon

Echantillon

20 µl

/

/

/

20 µl

/

/

/

20 µl

2 ml

2 ml

2 ml

Laisser à T° ambiante pendant 10mn. R2

2 ml

2 ml

2 ml

Bien mélanger pendant quelques minutes puis lecture au spectrophotomètre à λ=580 nm. nm

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4- Résultats : Les résultats obtenus sont les suivants :

ETALON

ECHANTILLON

0,450

0,670

DO [Urée] =

[Urée] =

é

, ,

(dilution)-1

0,5 3

[Urée] ≈ 1 g/l ≈ 16,67 mmol/l. mmol/l

5- Interprétation des résultats : Avant tous, on citera les valeurs normales de l’urémie et celle de l’uréurie.

NouveauNouveau-né (< 4 jours) NouveauNouveau-né (> 4 jours) Nourrisson et enfant jusqu'à 5-6 ans Enfant de plus de 7 ans et adulte

Urémie N (mmol/l)

Urémie N (g/l)

1,5 - 8,0

0,09 - 0,48

1,0 - 4,2

0,06 - 0,25

1,6 - 6,5

0,10 - 0,40

2,5 - 7,5

0,15 - 0,45

En ce qui concerne le taux urinaire, les valeurs normales sont comprises entre 300 et 500 mmol/24 h (soit 18 à 30 g/24 h).

• Remarque : Dans les pays anglo-saxons, le dosage de l'urée dans les liquides biologiques est exprimé non par molécule d'urée mais par concentration d'azote uréique exprimée en g/L, qu'il faut multiplier par deux pour obtenir l'urée plasmatique en g/L.

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Interprétation : Les valeurs obtenues (16,67 mmol/l – 1g/l) sont supérieurs à (2x) les valeurs usuelles ce qui pourrait résulter de deux mécanismes essentielles que sont : Par défaut d'excrétion rénale : L'hyperurémie est alors nette, souvent supérieure à 16 mmol/L. Elle est accompagnée d'une baisse de l'élimination urinaire de l'urée. Ce défaut d'excrétion (insuffisance rénale) peut avoir plusieurs origines : - Origine prérénale : il peut s'agir d'une oligurie que l'on rencontre dans les insuffisances cardiaques ou les cirrhoses ascitiques, ou d'une déshydratation extracellulaire due à une fuite hydrosodée consécutive à une diarrhée et/ou des vomissements. - Origine rénale : les néphropathies aiguës (glomérulonéphrites, pyélonéphrites), ou chroniques entraînent l'installation d'une insuffisance rénale de façon brutale ou progressive. - Origine post-rénale : l'insuffisance rénale est liée à la présence d'une obstruction au niveau de l'appareil urinaire (c'est le cas, par exemple, d'un cancer ou d'un adénome prostatique). Par formation excessive d'urée : Un régime trop riche en protéines, ou un hypercatabolisme protidique (fièvres et infections aiguës, dénutrition associée à une myolyse importante, ou traitement par des corticoïdes) sont à l'origine d'une augmentation de l'urée sanguine, qui s'accompagne, la fonction rénale étant normale, d'une augmentation parallèle de son excrétion urinaire.

Autres variations : Variations physiologiques : • Les variations de l'urée dans les liquides biologiques sont très dépendantes des apports alimentaires. • Les nouveau-nés de plus de 4 jours et les nourrissons présentent des concentrations d'urée plasmatiques inférieures d'environ 40% par rapport aux concentrations observées chez les adultes. • Les valeurs élevées observées à la naissance correspondent à l'épisode d'insuffisance rénale néonatale. • La concentration d'urée dans le sang augmente avec l'âge. Ainsi, après 50 ans une urémie à 8 mmol/L n'est pas considérée comme pathologique. • Chez la femme, l'urémie est inférieure de 25% à celle de l'homme.Elle est abaissée au cours de la grossesse, du fait de l'augmentation de l'espace liquidien.

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DOSAGE DE L’UREE PLASMATIQUE (AZOTEMIE) Diminution de l’urémie : Elle ne s'observe que rarement : • Dans les carences importantes en protéines alimentaires (ou les malabsorptions digestives). • Dans les insuffisances hépatiques graves avec un effondrement • de l'uréogenèse. • En cas de déficit enzymatique au niveau du cycle de l'uréogenèse. Dans tous les cas, l'excrétion urinaire de l'urée est abaissée.

V-

Applications pratiques : 1- Intérêt de la mesure conjointe de l'urée et la créatinine sanguine : Le dosage de l'urée en pratique clinique n'a d'intérêt qu'associé à celui de la créatinine dans le cas d'une insuffisance rénale dont on souhaite savoir si elle est fonctionnelle ou organique. En effet, le rapport urée/créatinine plasmatique molaire normal est d'environ 50. Lorsque ce rapport U/C plasmatique devient supérieur à 100, l'élévation disproportionnée de l'urée sanguine par rapport à celle de la créatinine doit faire rechercher soit une hyperproduction d'urée, soit une insuffisance rénale fonctionnelle (l'urée, petite molécule facilement diffusible est réabsorbée passivement dans la médullaire rénale dans toutes les situations à débit urinaire faible).

2- Intérêt du dosage de l'urée urinaire La mesure de la concentration peut servir au diagnostic différentiel entre une insuffisance rénale organique et une insuffisance rénale fonctionnelle. De plus, elle permet de calculer l'osmolarité des urines et son rapport avec l'osmolarité du plasma. La mesure de l'excrétion uréique urinaire des 24 heures permet d'évaluer l'observance d'un régime protidique prescrit. Ce recueil devra être validé par la comparaison avec la créatininurie des 24 heures. Un apport protidique normal se situe entre 1 et 2 g/kg/24 h, ce qui correspond, pour un sujet de 60 kg, à 335 à 670 mmol d'urée excrétée par 24 heures.

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