Titrasi Formal Asam Amino

PENENTUAN DERAJAT HIDROLISIS SUATU PROTEIN MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Oleh : I PUTU RAIWATA MERTANJAYA

(NIM: 0813031019)

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA SINGARAJA 2011

PENENTUAN DERAJAT HIDROLISIS SUATU PROTEIN MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Oleh: I Putu Raiwata Mertanjaya Jurusan Pendidikan Kimia, Undiksha

ABSTRAK Protein dapat dihidrolisis menjadi asam amino menggunakan enzim protease melalui titrasi formal asam amino. Penentuan salah satu gugus akan memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis suatu protein. Dalam titrasi ini, digunakan formaldehid yang bertujuan untuk membentuk dimetilol sehingga gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan mempengaruhi reaksi antara gugus karbonil (asam) dengan basa (NaOH) sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Selain itu, agar dapat bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium membuffer di daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif kuantitatif menggunakan menggunakan suatu indikator. Sehingga akan didapatkan kurva hubungan banyaknya larutan NaOH yang digunakan terhadap waktu. Berdasarkan kurva tersebut ditentukan slop dan tangen. Nilai tangen tersebut merupakan daya hidrolisis suatu suatu protein (gelatin). (gelatin). Derajat hidrolisis protein oleh enzim protease adalah 0,059. Kata-kata kunci : asam amino, formaldehid

ABSTRACT Proteins can be hydrolyzed into amino acids using the enzyme protease through formal titration of amino acids. Determination Determination of one group will give an indication indication to determine the degree of hydrolysis of a protein. In this titration, which aims to use formaldehyde formaldehyde to form f orm dimethylol dimethylol so that the amino group that has been tied does not affect the reaction between the carbonyl group (acid) with a base (NaOH) so that the end point of titration can be terminated properly. In addition, in order to react with an uncharged amino group allowing ammonium group buffering at a lower pH region and can be titrated at the end point quantitatively using an indicator. So that would be obtained curve number NaOH solution used with respect to time. Based on these curves are determined slope and tangent. Tangent value is the hydrolysis of a protein (gelatin). The degree of hydrolysis of proteins by protease protease enzyme is 0.059. 0.059. Key words: amino acids, formaldehyde

PENDAHULUAN

Protein merupakan senyawa organik kompleks yang mempunyai bobot molekul tinggi dan merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida (Tika, 2010). Bobot molekul protein sangat besar, tetapi hidrolisis asam semua protein menghasilkan sekelompok senyawa organik sederhana dengan bobot molekul rendah, yaitu α-asam α-asam amino. Molekul-molekul building block ini minimum mengandung satu gugus karboksilat dan satu gugus α-amino, α -amino, serta satu gugus rantai samping R yang berbeda. Protein dalam makanan bisa kita temukan dalam kacang-kacangan, telur, dan lain sebagainya. Salah satu contoh protein yang sering kita temukan dalam kehidupan sehari-hari adalah telur. Kandungan penyusun telur dalam dibagi menjadi protein putih telur dan protein kuning telur. Komposisi putih telur kandungan total protein 10-11% dasar basah, ovalbulmin 70% dari total protein, canalbumin 9% dari total protein, ovoummucoid 13% dari total protein. Sedangkan kuning kuning telur te lur terdiri atas hipovitelin dan hipotellenin . Protein dapat dipecah menjadi asam-asam amino melalui suatu cara yaitu dengan hidrolisis. Apabila suatu protein mengalami hidrolisis, maka asam-asam amino penyusunnya akan teruraikan. Hidrolisis protein dapat dilakukan dengan menggunakan enzim protease dari tripsin. Asam amino bebas yang dihasilkan dari hidrolisis ini apabila direaksikan dengan formaldehid berlebih akan membentuk derivat metilol. Reaksi ini menyebabkan asam amino +

bebas bentuk isoelektrik kehilahan satu proton dari gugus – NH NH3 (Tika, 2010). H3N+CHRCOO-

H2NCHRCOO - + H+

-

H2NCHRCOO + 2HCHO

(HOCH2)2NCHRCOO

-

(Tika, 2010).

Asam amino merupakan ion dipolar, yang pada umumnya mempunyai dua atau lebih pKa. Asam amino yang menyusun suatu protein tertentu, memiliki kadar asam amino yang tidak sama. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam amino tidak larut di dalam eter karena merupakan senyawa dipolar, dan dalam air menunjukkan struktur kutub ganda ( zwitter-ion zwitter-ion), yaitu: R

CH NH2

COOH

R

CH

COO-

NH3+

Gambar 1 . Struktur dipolar asam amino



(Nurlita, 2002). Pada gambar tersebut, gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion amonium, sedangkan gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai anion karboksilat. Struktur ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki titik leleh agak tinggi.

Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku sebagai asam dan mendonasikan protonnya pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat. Perilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut untuk asam amino dengan gugus amino dan satu gugus karboksil. R

CH

COOH

NH3+

Asam amino pada

HOH+

R

CH

COO COO-

NH3+

bentuk ion dipolar

pH rendah

HOH+

R

CH

COO-

NH2

asam amino pada pH tinggi

Gambar 2. Kesetimbangan asam amino pada berbagai pH Titrasi formal asam amino adalah metode penetapan asam amino berupa titrasi dengan larutan basa setelah ditambahkan larutan formaldehid untuk menghilangkan kebasaan gugus amino. Pada titrasi ini akan diperoleh kurva titrasi asam amino dari hasil hidrolisis protein menggunakan menggunakan enzim protease. Selama hidrolisis hidrolisis suatu protein, sejumlah gugus karboksil dan dan gugus amino terus bertambah. Penentuan secara kuantitatif salah satu gugus akan dapat memberikan indikasi untuk mengetahui mengetahui derajat hidrolisis hidr olisis dari suatu protein. zwitter-ion apabila suatu asam amino dalam larutan dititrasi dengan Menurut teori zwitter-ion

basa, ini berarti hidrogen dari gugus amonium yang dititrasi. Gugus amonium dari asam amino adalah buffer pada pH tinggi (di atas pH 11), karenanya tidak mungkin untuk mentitrasinya pada titik akhir suatu indikator. Hal yang sama terjadi karena gugus karboksil adalah buffer pada pH rendah, tidak mungkin juga untuk mentitrasinya dengan asam (Tika, 2007). Oleh karena itu, ditambahkan formaldehid pada larutan asam amino tersebut agar bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator. Reaksi yang terjadi dalam titrasi dengan d engan menggunakan formaldehid formaldehid merupakan reaksi pembentukan dimetilol. Dimana larutan protein yang telah dinetralkan dengan basa (NaOH), kemudian ditambahkan formaldehid sehingga membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan mempengaruhi reaksi antara karboksil (asam) dengan basa (NaOH), sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat, ditandai dengan perubahan warna larutan dari tidak berwarna menjadi merah muda yang tidak hilang selama 30 detik. Reaksi yang terjadi selama titrasi adalah sebagai berikut.

R

CH

C

NH2

O NaOH

R

OH

CH

O C

O-

NH3+

(pada pH netral) R

CH

O C

NH3+

O-

+ HCHO formalin

R

CH

H

N

O C OH CH2OH

HCHO R HOH2C

O

CH N

C OH CH2OH

dimethilol

R HOH2C

O

CH N

C

R

OH + NaOH CH2OH

O

CH

HOH2C

N

C O-Na+ CH2OH

Gambar 3. Reaksi asam amino dengan NaOH serta formaldehid Reagen yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelatin, yang merupakan produk alami yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin adalah protein larut dan bersifat gelling agent (bahan pembuat gel) atau sebagai ion gelling agent . Sumber bahan baku gelatin

dapat berasal dari tulang dan kulit sapi atau babi. Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi besar, protein dan 4-hidroksiresidu. Tipe strukturnya yaitu Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-4.Hyp-GlyPro. Struktur gelatin adalah sebagai berikut: O NH

CH CH3

C

O

O NH

CH2

C

N

C

O

O NH

CH

C

NH

CH2

C

O NH

CH CH2

CH2

CH2

C

C NH2

NH2+

N OH

CH2

NH

C

O

O-

CHO

NH CH2 C

O O

N C

Gambar 4. Struktur gelatin (Tika, 2010)

TUJUAN DAN MANFAAT Tujuan

Adapun tujuan dari percobaan ini adalah untuk (1) menghidrolisis protein dengan enzim protease dan menentukan derajat hidrolisisnya, (2) membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu, dan (3) membuat kurva mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino. Manfaat

Manfaat percobaan ini bagi praktikan adalah (1) mengetahui cara hidrolisis protein dengan enzim protease, (2) mengetahui cara menentukan derajat hirolisis protein oleh enzim protease, dan (3) memperkuat pemahaman tentang hidrolisis protein oleh enzim protease.

METODE Waktu dan Tempat

Percobaan ini dilakukan pada hari Rabu, tanggal 23 Maret 2011 dari pukul 08.0012.30 WITA, bertempat di Laboratorium Kimia Organik, Jurusan Pendidikan Kimia, Universitas Universitas Pendidikan Ganesha, Singaraja. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam percobaan ini dapat dilihat pada tabel berikut. Tabel 1. Alat dan Bahan Nama Alat

Jumlah

Nama Bahan

Jumlah

Gelas kimia 50 mL

1 buah

Larutan Gelatin

50 mL

Gelas kimia 100 mL

3 buah

Larutan NaOH 0,2 M

100 mL

Labu Erlenmeyer Erlenme yer

3 buah

Larutan HCl 0,1 M

50 mL

Buret 50 mL dan statif

1 set

Indikator PP

10 mL

Gelas ukur 25 mL

1 buah

Larutan Formalin

5 mL

Batang pengaduk

1 buah

Larutan Tripsin

20 mL

Kaca arloji arlo ji

1 buah

Aquades

500 mL

Termometer (100 C)

1 buah

NaOH 0,02 M

100 mL

Pemanas Listrik

1 buah

Pipet tetes

1 buah

Indikator universal universal

1 buah

o

Prosedur Kerja

Sebanyak 100 mL larutan gelatin disiapkan, dan ditambahkan 1 ml larutan PP dan larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes sampai warna merah muda timbul. Larutan HCl 0,1 M ditambahkan tetes demi tetes sampai tepat warna merah muda tadi hilang. Larutan gelatin direndam dalam inkubator air pada suhu 38 oC. Pada gelas kimia lain, sebanyak 25 mL larutan tripsin ditambahkan dengan beberapa tetes indikator PP dan tetes demi tetes larutan NaOH 0,2 M sampai warna merah muda timbul. Kemudian diteteskan larutan HCl 0,1 M sampai warna merah muda hilang. Larutan tripsin direndam dalam inkubator air pada suhu 38 oC selama beberapa menit. Larutan tripsin ditambahkan kedalam larutan gelatin kemudian diaduk secara perlahan. Sebanyak 10 mL dari campuran tersebut diambil dan dimasukkan kedalam labu erlenmeyer 100 mL (larutan ini digunakan sebagai kontrol atau waktu nol menit). Campuran dididihkan untuk merusak enzim dan setelah itu didinginkan. Sebanyak 15 mL formalin netral dan 3 tetes larutan pp ditambahkan. Pada interval waktu 15, 30, 60, dan 90 menit dari waktu nol dilakukan hal yang sama seperti pada kontrol. Titrasi dilakukan pada larutan tersebut dengan larutan NaOH 0,02 M sampai titik akhir titrasi yang ditandai dengan timbulnya timbuln ya warna merah muda.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Derajat hidrolisis protein (gelatin) oleh enzim protease dari tripsin dapat ditentukan dengan titrasi formal asam amino. Larutan gelatin ditambahkan larutan PP dan larutan NaOH 0,2 M. Penambahan larutan NaOH dihentikan ketika warna larutan telah menjadi merah muda yang ditimbulkan oleh adanya indikator PP dalam suasana basa. Tujuan penambahan NaOH adalah agar larutan gelatin bersifat basa. Kemudian larutan ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M sampai warna merah muda larutan hilang (pH 8,0). Pada pH 8,0 larutan gelatin akan mampu bereaksi dengan sempurna dengan enzim protease, yaitu tripsin. Pada pH 8 merupakan pH yang optimum bagi enzim untuk menghasilkan asam amino. Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap larutan enzim protease (tripsin), perlakuan. Tujuan menjaga pH larutan 8,0 adalah untuk mengaktifkan enzim tripsin dalam memecah protein (gelatin), karena tripsin bekerja efektif pada pH 7,7-8,0. Di samping itu, agar terjadi hidrolisis secara sempurna antara gelatin dengan tripsin, kedua larutan juga diinkubasi pada suhu 38 oC, karena enzim protease dapat bekerja optimal pada suhu ini. Larutan gelatin dan larutan tripsin kemudian dicampurkan dan larutan ditempatkan pada labu Erlenmeyer dan dimasukkan dalam inkubator air pada suhu 38 oC sehingga terjadi pemecahan protein menjadi asam amino. Campuran ini adalah kontrol dan waktu ke nol.

Pada

waktu ke nol, 15, 30,45, 60, 60, 75, dan 90 menit diambil sebanyak 10 mL mL larutan

(campuran gelatin dengan tripsin). Larutan itu didihkan pada masing-masing interval waktu yang bertujuan untuk merusak protein. Setelah didinginkan, larutan yang diperlakukan pada masing-masing interval waktu tersebut ditambahkan formaldehid (formalin) dan indikator PP kemudian dilakukan titrasi. Reaksi yang terjadi dalam titrasi dengan menggunakan formaldehid merupakan reaksi pembentukan dimetilol. Dimana, larutan protein yang telah dinetralkan dengan basa (NaOH), kemudian ditambahkan sehingga membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan mempengaruhi reaksi antara karboksil (asam) dengan basa (NaOH), sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Di samping itu, untuk memungkinkan gugus amonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir suatu indikator. Reaksi yang terjadi selama titrasi adalah sebagai berikut. R

CH

C

O NaOH

R

OH

NH2

CH

O C

NH3+

O-

(pada pH netral) R

O

CH

C

NH3+

O-

+

HCHO formalin

R

CH

H

N

O C OH CH2OH

HCHO R HOH2C

CH N

O C OH CH2OH

dimethilol

R HOH2C

CH N

O C OH + NaOH CH2OH

R HOH2C

CH N

O C O-Na+ CH2OH

Gambar 5. Reaksi asam amino dengan NaOH serta formaldehid Secara teoritis menurut teori zwitter-ion zwitter-ion , kalau suatu asam amino dalam larutan dititrasi dengan basa, ini berarti hidrogen dari gugus amonium yang dititrasi. Karena gugus amonium dari asam amino adalah buffer pada pH tinggi (di atas pH 11), karenanya tidak mungkin untuk mentitrasinya pada titik akhir suatu indikator. Hal yang sama terjadi karena gugus karboksil adalah buffer pada pH rendah, tidak mungkin juga untuk mentitrasinya dengan asam (Tika, 2007).

Dalam percobaan ini, larutan gelatin didegradasi dengan menggunakan enzim tripsin. Tripsin merupakan enzim proteolitik yang terdiri dari satu rantai polipeptida. Enzin ini akan mendegradasi gelatin menghasilkan asam amino penyusunnya. Reaksinya digambarkan sebagai berikut: O NH

CH

O

O

C

NH

CH2

C

C

N

O

O NH

CH3

CH

C

NH

CH2

O NH

C

CH

N OH

CH2

CH2

CH2

CH2

NH C

C

C NH2

CHO

O

CH2

O-

NH2+

NH

C

O O

N C

Gambar 6. Struktur Gelatin

O NH

CH

C

O

O

OH +

NH2

C

CH2

OH

+

NH2

C

O

OH

+

CH3

NH2

CH

C

O OH

NH2

+

CH2

CH2

C

CH2 NH C

NH2

NH2+ O

+

NH2

CH

C

OH

NH2

OH

+

+

CH2

O NH2

C

OH

CH2 C

CHO

NH

O CH2

OH

C

O

OH

Gambar 7. Asam-asam amino hasil pemecahan gelatin Reaksi degradasi diatas dapat terjadi apabila terjadi hidrolisis total dari asam amino tersebut. Pada tahap titrasi, indikator yang digunakan adalah PP. Titrasi formal ini hanya tepat untuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat untuk penentuan protein. Dalam titrasi ini secara teori, semakin lama reaksi antara gelatin dengan tripsin maka makin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi banyaknya asam

OH

amino yang konsentrasinya bertambah seiring dengan bertambahnya kontak antara larutan gelatin dan tripsin. Daya hidrolisis dapat ditentukan dengan membuat kurva hubungan antara volume NaOH yang dipergunakan dalam titrasi terhadap waktu. Berdasarkan kurva tersebut ditentukan slop dan tangen t angen.. Nilai N ilai tangen tersebut merupakan daya hidrolisis hidro lisis enzim tripsin. Tabel 2. Hubungan Waktu dengan Volume NaOH

Waktu (menit) (menit)

Volume NaOH 0,2 M (mL)

0

15,20

15

15,35

30

17,00

45

18,60

60

19,41

75

20,20

90

20,55

Hubungan antara volume NaOH yang digunakan dalam titrasi terhadap waktu dapat dilihat pada grafik berikut

Hubungan Waktu dengan Vo Volume lume NaOH ) 25 L m 20 ( M 2 15 0 , 0 H 10 O a N 5 e m u 0 l o V 0

y = 0.067x + 15.02 R² = 0.958

Series1 Linear (Series1)

20

40

60

80

100

Waktu (menit)

Gambar 8. Kurva Hubungan Waktu dengan Volume NaOH

Daya hidrolisis dari enzim tripsin dalam titrasi formal ini adalah: tg

20,55 15,20 



90

=

5,35 90

= 0,059 Karena 1 mL NaOH 0,1 N sama dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, maka: 0,02

X 

0,1 0,1 X X

1,4 

0,028



0,28mg

Jadi 1 mL larutan NaOH 0,02 N ekivalen dengan 0,28 mg nitrogen asam amino. 

Pada 0 menit, VNaOH = 15,20 mL, maka 15,20 x 0,28 = 4,2560 mg



Pada 15 menit, V NaOH = 15,35 mL, maka 15,35 x 0,28 = 4,2980 mg
















Waktu (menit) (menit)

Jumlah Nitrogen Asam Amino (mg)

0

4,2560

15

4,2980

30

4,7600

45

5,2080

60

5,4348

75

5,6560

90

5,7540

Kurva hubungan antara jumlah nitrogen asam amino terhadap waktu dapat dilihat pada grafik berikut.

Hubungan antara Waktu dengan mg Nitrogen Asam Amino ) 7.000 g m 6.000 ( o n i 5.000 m A 4.000 m a s 3.000 A n 2.000 e g o r t 1.000 i N g 0.000 m h 0 a l m u J

y = 0.018x + 4.207 R² = 0.958

Series1 Linear (Series1)

20

40

60

80

100

Waktu (menit)

Gambar 9. Grafik Hubungan Waktu dengan Jumlah Nitrogen Asam Amino

SIMPULAN

Titrasi formal asam amino dapat digunakan untuk menentukan derajat hidrolisis protein oleh enzim protease (tripsin). Derajat hidrolisis enzim protease adalah 0,059. Jumlah asam amino yang terurai bertambah sesuai pertambahan waktu, dibuktikan dengan meningkatnya meningkatnya penggunaan NaOH dalam t itrasi seiring pertambahan waktu.

DAFTAR PUSTAKA

Frieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II . Singaraja : IKIP N Singaraja. Redhana, I Wayan dan Siti Maryam. 2003. Penuntun Praktikum Biokimia . Singaraja: IKIP Negeri Singaraja. Tika, I Nyoman. 2007. Penuntun Praktikum Biokimia . Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha. -------. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia . Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha

Titrasi Formal Asam Amino

Recommend Documents