Teknik isolasi Pengertian Teknik Isolasi Utami (2004: 14), Dalam suatu substrat atau media dapat tumbuh dari satu jenis mikroorganisme, dengan demikian lalu dikembangkan suatu teknik pemisahan yang disebut teknik isolasi, sehingga diperoleh atau biakan yang hanya terdiri dari satu jenis mikroorganisme saja yang disebut biakan murni. Populasi mikrobe di alam sekitar kita besar lagi komplek. Beratus-ratus spesies pelbagai mikrobe biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk saluran pencernaan dan kulit. Mereka terdapat dalam jumlah yang luar biasa besarnya. Sebagai contoh sekali bersin dapat menyebabkan dapat menyebabkan beribu-ribu mikroorganisme. Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagi habitat ini memerlukan teknik untuk pemisahan-pemisahan populasi campuran yang rumit ini, atau biakan campuran. Menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni berasal dari suatu populasi sel yang semuanya berasal dari sel induk Macam-macam Teknik Isolasi 1. Tektik Menggores (streak plate) Teknik menggores adalah apabila mikroorganisme berada dalam suatu suspensi atau suatu padatan, lalu dengan jarum inokulasi diambil dan digoreskan pada medium tertentu maka cara ini disebut cara menggores. 2. Teknik Menuangan (poured plate) Teknik menuang yaitu apabila mikroorganisme yang akan dipisahkan berada dalam satu suspensi, untuk memisahkan dituangkan kedalam medium tertentu maka disebut teknik menuang (Utami, 2004: 14). Menurut Ferdiaz (1988: 106), media ini berbeda dengan metode goresan karena agar steril yang akan diinoulaasikan masih dalam bentuk cair tetapi telah didinginkan sampai suhu 47 – 500 C. agar tersebbuut diggunakan untuk mengencerkan kultur dengan menggunakan loop kemudian dituangkan pada cawan petri. Apabila kita ingin menginokulasi biakan murni bakteri dari mulut kita, maka liur itu diinokulasikan sedikit saja pada medium yang cocok sedemikian rupa hingga sel-sel mirobe tumbuh terpisah-pisah pada medium tadi. Bahan yang diinukolasi pada medium itu disebut inokulum. Dengan menginokulasi bahan medium agar nutrien (“nutrient agar”) dengan metode cawan gores atau metode cawan tuang, sel-sel itu akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mirobe individu itu memperbanyak diri sedemikian cepatnya hingga di dalam waktu 18 sampai 24 jam terbentuk massa sel yang dapat dilihat dan dinamakan koloni. Koloni tampak oleh mata bugil. Setiap koloni yang berlainan dapat mewakili macam organisme yang berbeda-beda, setiap koloni agaknya merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme. Jika dua sel mikrobe pada inokulum asal terlalu berdekatan letaknya pada medium agar maka koloni yang terbentuk dari masing-masing sel
dapat bercampur denagn sesamanya, atau paling tidak bersentuhan, jadi masing sel dapat diamati itu bukanlah satu biakan murni (Pelczar, 1986: 85-87). Metode yang lebih langsung untuk mengisolasi mikroorganisme tunggal ialah dengan menggunakan alat manipulatormikro yang disebut kuarmikro (microscopic probe) untuk memindahkan satu sel dari suspensi zat alir sel (Pelczar, 1986: 85-87).
http://oikprinces.blogspot.com/p/teknik-isolasi.html
Teknik Pertumbuhan Mikroorganisme 1. Teknik Piringan Goresan (Streak plate method) Medium agar dicairkan, didinginkan pada suhu 45 C, dituang ke dalam cawan petri steril (cawan gelas dengan garis tengag tiga inci) dan dibiarkan sampai menjadi padat. Kemudian dengan kawat gelang menginokulasi yang penuh dengan biakan campuran (misalnya specimen ludah atau bahan lain), goresan dilakukan diatas permukaan agar. Ada beberapa metode penggorean yang berbeda, namun kesemua metode bertujuan untuk meletakkan sebagian besar organism pada beberapa goresan pertama. Apabila sebaran dilakukan dengan menggerakkan kawat gelang kian kemari dari satu bagian ke bagian lain. Cawan petri, bakteri yang tertinggal pada kawat gelang semakin berkurang. Jika dilakukan secara sempurna, goresan akhir akan meninggalkan bakteri individual cukup terpisah satu sama lain, sehingga setelah mengalami pertumbuhan, koloni yang berasal dari bakteri individual akan benar-benar terpisah satu sama lain. Kemudian koloni tunggal dapat ditinggalkan kemedium steril, dan akan tumbuhlah biakan murni. (Dwiyana, 2011) Ada beberapa teknik goresan yang biasa dipakai yaitu : A. Goresan Sinambung Seperti gambar di bawah ini :
B. Goresan T
Seperti gambar di bawah ini :
C. Goresan Kuadran (Streak quadrant) Seperti gambar di bawah ini :
2. Metode Tuang (pour-plate method) Terdiri atas penginokulasian biakan campuran kedalam tabung uji yang mengandung agar mencair yang telah didinginkan pada suhu 450c. isinya diaduk untuk memencarkan bakteri keseluruh medium. Campuran itu kemudian ditungkan kedalam cawan petri steril dan dibiarkan padat pertumbuhan koloni terjadi baik dalam medium tujuan pada kedua proses ialah untuk memisahkan bakteri satu sama lain sehingga sel-sel itu akan tumbuh menjadi koloni-koloni yang terpisah didalam medium yang padat. Kemudian dapat diambil sel-sel dari satu koloni untuk mendapatkan biakan murni. Dalam praktek, sering piringan kedua digores kembali dengan organism yang berasal dari koloni yang diidolasi untuk menjamin bahwa hasil yang diperoleh adalah biakan murni (Dwiyana, 2011). 3. Teknik Sebar (spread plate) Teknik isolasi dan mikroba dengan cara menyebarkan mikroba pada permukaan media yang akan digunakan (Trianda, 2011).
Menurut Hadioetomo (1993), ada dua metode yang dilakukan untuk memperoleh biakan murni yaitu : 1. Metode cawan gores Metode ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. 2. Metode cawan tuang Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan ( ±50oC ) yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umunya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung koloni terpisah di atas permukaan
ataupun di dalam agar. Metode ini memboroskan bahan dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi. Metode cawan gores memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme seperti yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan oleh para mahasiswa yang baru mulai mempelajari mikrobiologi ialah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan (Ratna, 1990). Menurut Dwidjoseputro (1980), sifat-sifat koloni yang tumbuh pada agar-agar lempengan, pada agar-agar miring dan pada tusukan gelatin adalah sebagai berikut : 1. Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat berbenang, tak teratur, serupa akar, serum kumparan. Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung, timbul membukit dan timbul berkawah. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelahbelah, ada yang bergerigi, ada yang berbenang-benang dan ada yang keriting. 2. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring. Sifat ini berkisar pada bentuk dan tepi koloni dan sifat itu dinyatakan dengan kata-kata seperti : serupa pedang, serupa duri, serupa tasbih, serupa titik-titik, serupa batang dan serupa akar. 3. Sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat mengencerkan gelatin. Karena itu, maka bentuk-bentuk koloninya juga berbeda-beda. Lagipula bentuk koloni yang tidak dapat mengencerkan gelatin. Bila dilihat dari samping koloni yang tidak mengencerkan gelatin dapat serupa pedang, tasbih, bertonjol-tonjol dan berjonjot. Jika bakteri mampu mengencerkan gelatin, maka bentuk koloninya dapat serupa kawah, serupa mangkuk, serupa corong, pundi-pundi dan berlapis. Setelah mikroba ditumbuhkan pada media agar tabung maupun cawan dan estelah inkubasi akan terlihat pertumbuhan bakteri dengan berbagai macam bentuk, ukuran, sifat, dan berbagai ciri khas yang lain. Ciri-ciri ini akan mengarahkan ke sifat-sifat mikroba tersebut pada media pertumbuhan, sehingga pengamatan morfologi ini sangat penting untuk diperhatikan (Ratna,1990). Bakteri yang memiliki flagella sering kali membentuk koloni yang menyebar terutama jika menggunakan lempengan agar basah, untuk mencegah menyebarnya koloni maka harus digunakan agar benar-benar kering (Djida, N., 2000). http://disachem.blogspot.com/2012/04/laporan-mikrobiologi-teknik-isolasi.html
a.1 Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut : Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas
permukaan agar yang telah memadat. Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik. Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.
a.2. Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC) Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi. Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate. http://widyasuryaningrum.blogspot.com/2012/04/teknik-isolasi-mikroba.html
Ada beberapa teknik inokulasi, diantaranya: a. Inokulasi dalam media cair Bila inokula dalam bentuk cair, inokulasi sebaiknya menggunakan pipet, sedangkan bila inokula berasal dari media padat, lebih baik menggunakan jarum Ose, dimana jarum Ose digunakan untuk mengambil bakteri kemudian di celupkan lalu dikocok ke dalam media cair hingga semua masa inokula masuk dan tersebar dalam media cair tersebut. b. Inokulasi dalam media padat Cara gores (streak Method) Bila media berupa agr miring, inokulasi dilakukan dengan cara goresan rapat memakai jarum Ose bundar, dimulai dari bagian bawah, di gores secara zig-zag berangsur-angsur hingga sampai bagian atas. Cara tusuk (stab Method) Bila media berupa agar tegak dalam tabung reaksi, inokulasi dilakukan dengan cara memasukkan jarum Ose bentuk lurus tepat pada poros tengah tabung sampai mendekati dasar tabunng, kemudian angkat perlahan. Cara Sebar (Spread Method)
Inokulasi pada media agar denan cara sebar di lakukan dengan cara menggoreskan jarum Ose bundar ke permukaan agar yang padat dalam cawan petri. Cara tuang (Pour Method) Inokulasi dengan cara tuang dilakukan dengan cara menuangkan sampel ke dalam media agar yang masih cair dalam cawan petri kemudian di homogenkan dengan cara menggoyangkan cawan petri tersebut. http://anggijoyjoy.blogspot.com/2012/10/teknik-dasar-menanam-dan-memindahkan.html
Metode Cawan Gores (Streak Plate) Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan membagi 3-4 cawan petri. Ose steril yang telah disiapkan diletakkan pada sumber isolat , kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan petri berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal disatu cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen. Setelah kering, ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan ke dua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores. Metode Cawan Sebar (Spread Plate) Teknik spread plate (cawan sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau menghapuskannya di atas media agar yang telah memadat, sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belom memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan agar. http://liajegeg2.blogspot.com/2012/11/laporan-isolasi-inokulasi_21.html
PEMBAHASAN Ketiga metode ini memiliki kekurangan dan kelebihan masing-masing. Misal untuk streak plate, metode ini dalam pelaksanaannya cukup sulit untuk dilakukan. Karena kita harus hati-hati dalam menggoreskan ose ke medium. Jika pada saat penggoresan, medium terluka akan mengacaukan data, kerena hasil isolasi sudah tidak akurat lagi, diragukan kevalidannya. Hasilnya diragukan karena, luka pada medium yang permukaan lebih rendah dari permukaan seharusnya dapat ditumbuhi mikrobia. Dan mikrobia tersebut dengan keberadaanya yang di bawah permukaan seharusnya, akan manimbulkan asumsi bahwa mikrobia tersebut juga bersifat mikroaerofilik. Padahal seharusnya sifat mikrobia tersebut adalah aerob. Tetapi selain kekurangan tersebut, metode ini memiliki kelebihan yaitu koloni yang dihasilkan adalah single koloni atau 1 koloni hanya dari 1 spesies saja. Selain itu kontaminan mudah dibedakan. Karena pada metode ini ose digoreskan dengan pola tertentu, maka koloni yang tumbuh diluar pola tersebut dapat dinyatakan sebagai kontaminan.
VI.
Metode pour plate, metode ini dilakukan dengan mengencerkan koloni bakteri lalu dituangkan kedalam cawan petri baru dtuangkan pula medium agar yang masih cair. Teknik ini akan menyebabkan mudah timbulnya spreader yaitu koloni yang berbeda saling menumpuk. Hal ini bisa dihindari dengan membuat koloni tersebut lebih encer lagi, sehingga pada saat dituang koloni yang ada hanya sedikit dan kemungkinan ada spreadpun dapat dikurangi. Kekurangan yang lain dari metode ini adalah kontaminan sulit dibedakan karena semuanya dituang secara homogeny. Hal ini dapat dihindari dengan selalu bekerja dengan teknik aseptis. Kelebihan dari metode pour plate adalah tekniknya mudah dilakukan. Dan, karena sampel dikocok homogen maka bakteri aerob maupun anaerob dimungkinkan dapat hidup. Metode surface plate, tentu saja metode ini dapat dilakukan untuk memisahkan mikrobia aerob dengan mikrobia yang lain. Karena jika dituangkan pada permukaan medium, bakteri yang paling diuntungkan adalah bakteri aerob. Tetapi metode ini memiliki kekurangan yaitu kontaminan sulit dibedakan, karena sampel diratakan pada seluruh permukaan. KESIMPULAN Ada beberapa metode untuk mengisolasi bakteri diantaranya metode streak plate, surface plate dan pour plate. Metode streak plate tekniknya sulit dilakukan namun kontaminan mudah dibedakan. Metode surface plate dapat digunakan untuk memisahkan mikrobia aerob dengan yang lain, tetapi kontaminan sudah dibedakan. Metode pour plate, mudah dilakukan dan dapat ditumbuhi mikrobia aerob maupun anaerob tetapi kontaminan sulit dibedakan.
Cara goresan (streak plate), prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horizontal di satu sisi cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores. Cara taburan atau tuang (pour palte), teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45 oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak begitu banyak mengandung oksigen. Metode cawan sebar (spread plate) Teknik spread plate (lempeng sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau mengapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan pour plate adalah, pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour plate
kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan media agar. http://teckhnologyproductagricultural.blogspot.com/2012/12/isolasi-pertumbuhan-mikroba.html
1. Beberapa Metode Dlam Teknik Inokulasi 1. Biakan Agar Cawan Kultur mikroba dibiakkan dengan cara menginokulasi pada agar cawan, dimana penyebaran kultur dilakukan dengan goresan diatas agar. Ada beberapa cara untuk menggoreskan kultur pada agar cawan yaitu: goresan lagsung, goresan kuadran, dan goresan radian. 2. Biakan Agar Tuang Digunakan untuk mengencerkan atau mengisolasi yang terdapat pada contoh. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, koloni akan tumbuh pada permukaan dan bagian bawah agar. 3. Biakan Agar Miring dan Agar Tegak Dapat dilakukan dengan cara menggoreskan secaa zig-zag pada permukaan agar miring menggunakan jarum ose yang bagian atasnya dilengkungkan. Car ini juga dilakukan pada agar tegak untuk meminimalisir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen. Usah mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkN dan untuk menanam suatu spesies terdapat baberapa cara, yaitu: Penanaman dengan penggoresan Penanaman lapangan Biakan agar tabung (Rusdimin, 2003) http://feni-mikrobiologi.blogspot.com/2010/12/desinfektan.html
