TÉCNICAS ESPECTROMÉTRICAS

TÉCNICAS ESPECTROMÉTRICAS: Las Las técn técniicas cas espe espect ctro romé métr triicas cas se basa basann en la inter nterac acci ción ón de las las radia adiaci cion ones es electromagnéticas con la materia. Las principales técnicas espectrométricas empleadas en la actualidad en los laboratorios de bioquímica clínica son: La espectrometría de absorción molecular en el ultravioleta y en el visible La fluorimetría La turbidimetría La nefelometría La luminometría La espectrometría de absorción atómica La espectrometría de emisión atómica

Naturaleza de la radiación electromagnética  La radiación electromagnética es una forma de energía radiante; se representa como un campo eléctrico y otro magnético situados en fase y con oscilaciones sinusoidales en ángulo recto un campo respecto al otro y, a su vez, con la dirección de propagación; se propaga por lo tanto en forma de ondas. n este fenómeno ondulatorio se definen:

Longitud de onda !":  se define como la distancia entre ! má"imos de un ciclo completo del movimiento movimiento ondulatorio; ondulatorio; esta distancia distancia se e"presa, seg#n el $istema $istema %nternacional de &nidades &nidades '$%( en nanómetros 'nm ,)*  m(; otras unidades ya obsoletas son: ángstrom '-( y milimicra 'm(; la relación entre estas medidas es: +

)nm / )m / )* - / )* m. +

#recuencia $":  es el n#mero de oscilaciones 'ciclo( que una partícula realiza en una unidad de tiempo, generalmente un segundo 'ciclos por segundo(; es la inversa de la longitud de onda.

$ % c&!

siendo c / velocidad de la luz

0ero es que además la luz está formada por fotones, o paquetes discontinuos de energ'a ; la energía de un fotón depende de su frecuencia y de su longitud de onda:

E % ()$ E % () c&!

siendo v / frecuencia y 1 / constante de 0lanc2

0or 0or lo tant tantoo la relación  entre entre la la longitud de onda * la energ'a   de una radiación electromagnética es in$er+a : cuanto mayor es la longitud de onda, menor es la energía; por e3emplo, la radiación &4 a !** nm posee mayor energía que la radiación infrarro3a a 56*. La relación de la longitud de onda con la frecuencia y con la energía de radiación es inversa, por lo que que las radiacione+ m,+ energética+ , las las más penet penetran rante tes, s, son a su vez las de ma*or -recuencia y menor longitud de onda 

$e denomina e+.ectro electromagnético  al con3unto de radiaciones electromagnéticas, y se 1a di$idido en varias regione+ o /anda+ e+.ectrale+ caracterizadas por determinados parámetros de longitud de onda, frecuencia etc.

E+.ectro electromagnético RA0IACIONES EM

Longitud de onda nm"

7ayos gamma

)*  +)* +6

7ayos 9

+8

)*  +)* +8

)

<ravioleta

!**+8*

Luz 4isible

8*+5*

%nfrarro3o

5*+6*.***

icroondas

)*  +)* 




=)*



l o3o 1umano responde a la radiación electromagnética entre los 8* y los 56* apro"imadamente, pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestra limitación, y permiten la medida de radiaciones de longitudes de onda mayores '%7( y menores '&4(. La luz solar, o la luz emitida por un filamento de tungsteno, es una mezcla de radiaciones de distinta longitud de onda que al o3o 1umano se reconoce como 1/lanca2, es decir, e+ una  radiación .olicrom,tica . n la región visible, la luz se descompone en colores y sus complementarios:

0e+com.o+ición del e+.ectro $i+i/le * ultra$ioleta en colore+ * +u+ com.lementario+

Longitud de onda  nm( )*+!!* !!*+8?*

Nom/re de la  región

Color a/+or/ido

&4 corto &4

Color com.lementario o de la  +olución >o visible >o visible

++ ++

8*+?8*

4isible

4ioleta

?8*+?6

4isible

?6+666

-zul

4isible

666+@**

4isible

@**+@6*

4isible

@6*+5*

4isible

-marillo verdoso

>aran3a 7o3o

-marillo 4erde

7o3o

-marillo

-zul -zul verdoso 4erde azulado

l color que presentan los distintos ob3etos o soluciones se debe a la interacción de la radiación policromática 'luz blanca( con ellos. &n ob3eto o solución está formada por partículas que absorben radiaciones de determinada longitud de onda y no absorben otras, que son las que pueden verse, denominándose color com.lementario) 0or e3emplo, si una solución absorbe luz entre ?8* y ?* nm 'azul(, tendrá un color amarillo, por tanto, el amarillo es el color complementario del azul. n consecuencia, una solución que se observa de un color determinado al o3o 1umano, deberá ser iluminada para las mediciones fotométricas con un 1az de luz del color que se absorbe; por e3emplo una solución de color ro3o se irradia con luz de apro"imadamente 6** nm.

#enómeno+ de interacción entre luz * materia  Auando se produce una interacción entre un 1az de luz y la materia, se producen, entre otros, fenómenos de absorción o emisión energética.

3)4 Proce+o de a/+orción: Auando una partícula que se encuentra en Bestado de reposoC o Bestado fundamentalC, interacciona con un 1az de luz, absorbe energía, y pasa a lo que se denomina Bestado e"citadoC. n la partícula se producen cambios que dependen de las características de la propia partícula 'tipo de enlaces, etc( y de la energía 'D( de la luz que interacciona. La partícula en estado e"citado tiende a regresar espontáneamente a su estado fundamental, desprendiendo la energía absorbida en forma de calor. - E 1.v

-F

*

-   E calor *

$iendo: -  / absorbente en estado fundamental -F / absorbente en estado e"citado 1.v / energía del fotón absorbido '1 / cte de 0lanc2 y v / frecuencia de la radiación( *

Aada especie absorbente 'cromógeno( tiene lo que se llama un Bespectro de absorción característicoC, ste espectro representa la relación entre la longitud de onda incidente y la absorbancia que representa una solución de la especie, en condiciones definidas de traba3o. -l gráfico que resulta de representar en un e3e de coordenadas absorbancia 'ordenadas( frente a la D 'abscisas(, es a lo que llamamos e+.ectro de a/+orción Los espectros de absorción son de utilidad para:

$eleccionar la D más adecuada para una medida cuantitativa 'D a la que la absorción es má"ima(.
5)4 Proce+o de emi+ión: -lgunos compuestos tienen la propiedad, tras ser e"citados, de retornar a su estado fundamental, produciendo una emisión de energía radiante. La luz emitida se puede medir, y ello constituye el principio de algunas técnicas, como la fotometría de llama 'emisión atómica( o la
++++++++= -F

)

+++++++=

- E 1.v *

!

$iendo: -  / absorbente en estado fundamental -F / absorbente en estado e"citado 1.v  / energía de e"citación 1.v  / energía de emisión. *

) !

E6.licación: n los átomos, los electrones ocupan alrededor del n#cleo determinados niveles energéticos, que definen orbitales característicos para cada tipo de átomo. &n átomo en estas condiciones, se encuentra en su Bestado fundamentalC o de menor energía, su configuración electrónica es estable y tiende a mantenerla o a recuperarla si esta 1a sido alterada. n el caso de la radiación correspondiente a la banda espectral del &4 yGo del visible, la radiación absorbida tiene la energía suficiente como para producir el desplazamiento de los electrones de enlace a posiciones más energéticas y por tanto, menos estables, denominados Bestados e"citadosC. Los átomos tienden a estar en el estado de mayor estabilidad que coincide con el estado fundamental o menos energético, por lo que los electrones al volver total o parcialmente a este estado en el proceso denominado Brela3aciónC, la energía que fue previamente absorbida, es reemitida en forma de radiación electromagnética, cuya D está íntimamente ligada a la cantidad de energía incidente. ste fenómeno es la base de técnicas espectroscópicas de análisis como la absorción, la absorción atómica, la emisión, la fotometría de llama 'emisión atómica(, la fotoluminiscencia 'fluorescencia y fosforescencia(, la nefelometría, la turbidimetría, etc.

ESPECTRO#OTOMETR7A 0E A8SORCI9N MOLECLAR: La espectrofotometría de absorción consiste en la medición de la radiación que llega a un detector tras producirse un fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia absorbente. n química clínica, el material en estudio es generalmente una solución, y las medidas se 1acen ordinariamente dentro del espectro comprendido entre los !!* y ** nm. s aplicable tanto para análisis cualitativos como cuantitativos.

Le*e+ de a/+orción

Auando un 1az de luz de intensidad I; incide sobre una cubeta cuadrada que contiene una solución coloreada que absorbe luz a una determinada D, se produce en la solución un proceso de absorción, y el 1az de luz que sale después de atravesar la cubeta tiene una intensidad menor, I+ 0ara evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta y considerar así sólo la absorción del compuesto de interés, 1ay que 1acer una primera medida con una Bsolución de referenciaC o B/lanco C, que contiene todos los posibles compuestos que participan en la lectura, menos el compuesto a medir. Hodas las medidas que se 1agan a continuación serán referidas a esta medida inicial. $e define tran+mitancia  a la relación entre la luz incidente y la luz transmitida:

T % I &I +

o

I el porcenta3e de transmitancia:


o

n la práctica se emplea, en lugar del valor de transmitancia, el de a/+or/ancia '-(, ya que la relación entre la concentración de una solución y su transmitancia es inversa y logarítmica, mientras que la relación entre la absorbancia y concentración es directamente proporcional.

A % 4 log I &I  % 4 log T % log 3&T  / log )**GJH / log )**+logH +

o



A % 5 =log
$i representamos gráficamente en un e3e de coordenadas la relación entre la absorbancia y concentración y el JH y la concentración observamos que al aumentar la concentración del compuesto absorbente en solución, más luz es absorbida y menos transmitida. n los aparatos que se usan 1oy en día, las lecturas de JH son transformadas en absorbancias y presentadas así al operador, pero no 1ay que olvidar que la absorbancia no es en sí misma medible, sino que se obtiene por un cálculo matemático a partir de los datos de transmitancia que mide el sistema fotométrico. La relación entre las cantidades de absorbente en una solución y el grado en que esta solución absorbe la luz, se encuentra regida por las Le*e+ de a/+orción . La Le* de 8eer  indica que la concentración de la sustancia es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida. La fórmula matemática establece la relación entre el grado de absorbancia de una solución y otras ! variables: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el 1az de luz recorre a través de la solución. $eg#n esta ley, la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz:

A % a)/)c $iendo: - / absorbancia a / coeficiente de absorción 'es una cte relacionada con la naturaleza del soluto( b / longitud del paso de la luz en centímetros 'en la cubeta(; su valor está estandarizado en ) cm para todos los espectrofotómetros c / concentración del absorbente

l coeficiente de absorción 'a( se denomina coe-iciente de e6tinción molar , representado con el símbolo > cuando las unidades de b son centímetros y las de c son molesGlitro; es constante para un compuesto dado cuando se fi3an condiciones de D, pK, solvente, temperatura, y otros factores; sus unidades son ) G mol . cm. n la práctica el significado del coeficiente de e"tinción molar es el siguiente: cuanto mayor sea  en una sustancia, mayor será la absorbancia de ese compuesto y por tanto, mayor será la sensibilidad del método que lo emplea.

C,lculo de concentracione+ La Ley de Meer tiene una aplicación práctica para averiguar la concentración de una sustancia de interés en una solución basándose en la relación lineal entre absorbancia y concentración; así podemos conocer la concentración de una sustancia de ! maneras: 0or comparación con una solución conocida 0or la curva de calibración

Por com.aración con una +olución conocida: $i tenemos ! soluciones, 0 'problema( y $ 'estándar de concentración conocida(, podemos establecer la siguiente relación matemática entre ellas:

A& A % C& C S

.

+

C % C  ) A & A

.

.

+

.

+

$iendo: - / absorbancia de la solución estándar -/ B B B B problema A / concentración de la solución estándar A / B B B B problema Aonocemos el valor de C+ y por la analítica los valores de A+ * A. ; con estos datos calculamos el cociente C+&A+ estableciendo así el valor de un   -actor , que es constante, y que multiplicado por las absorbancias de sucesivos problemas que se ensayen en la misma serie, nos dará el valor de las concentraciones de estas soluciones problema. s

p

s

p

C  % C  & A  ) A  % # ) A .

+

+

.

.

siendo < / factor de calibración

/" Cur$a de cali/ración: s la representación gráfica en un e3e de coordenadas de absorbancia 'ordenadas( frente a concentración 'abscisas(. l método de traba3o con curva de calibración consiste en ensayar varias  +olucione+ de concentracione+ conocida+ , determinar sus absorbancias y a continuación construir la curva de calibración 'que debe ser una recta(, representando las concentraciones frente a absorbancias gráficamente; en la construcción de la curva se emplean un mínimo de 8 puntos y a continuación se traza una línea recta que se apro"ime a ellos lo más posible. &na vez ensayadas las +olucione+ .ro/lema , su concentración se averigua por interpolación de las absorbancias de las soluciones problema en la recta de calibración. stas ! formas de traba3o sólo son válidas si el cromógeno obedece la Ley de Meer, y tanto las soluciones estándar como los problemas son leídas en idénticas condiciones.

n toda determinación fotométrica se debe conocer la   linealidad , que es el inter$alo de concentracione+ del cromógeno entre las cuales e"iste una relación lineal entre la concentración * la a/+or/ancia , es decir, se cumple la Ley de Meer. Cuando la concentración del cromógeno en la solución +o/re.a+a lo+ l'mite+ de linealidad , la Ley de Meer de3a de cumplirse, convirtiéndose la recta de la gráfica en una curva a partir de ese punto de concentración; la lectura de una absorbancia fuera de los límites de linealidad, se traduce en una concentración falsamente ba3a de cromógeno; ante esta situación, (a* ?ue diluir la mue+tra  para que su concentración entre dentro de los límites de linealidad.

0e+$iacione+ de la Le* de 8eer $on desviaciones producidas en la linealidad de la relación entre concentración y absorbancias; la recta se curva antes de su límite de linealidad. 0ueden causarlas diversos factores: $e miden concentraciones muy elevadas de cromógeno La radiación incidente no es monocromática La absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto La luz es transmitida por otros mecanismos 'luz errática, o luz monocromática que llega al detector( Los lados de la cubeta no son paralelos $i 1ay interferentes 'otros cromógenos absorben también a esa longitud de onda( $i e"iste fenómeno de fluorescencia

Longitud de onda nominal de un (az de luz:  es la D en la que se 1alla el má"imo de intensidad de luz. $e emplea para definir los filtros. l grado de monocromaticidad de un monocromador puede variar. n los monocromadores, la rendi3a de entrada enfoca la luz sobre el prisma o red de difracción sobre el cual será dispersada y la rendi3a de salida determina el anc1o de banda de la luz que será seleccionada del espectro de dispersión; aumentando el anc1o de la rendi3a de salida, el anc1o de la banda de la luz emergente se 1ace más amplio, con lo cual aumenta la intensidad de la energía, pero disminuye la pureza espectral.

Cur$a+ de cali/ración:   se construyen ensayando soluciones de distintas concentraciones conocidas 'patrón o estándar( y estableciendo para cada una de ellas su absorbancia a una determinada D. Auando se traba3e con una curva de calibración, cualquier cambio en el aparato, o en los reactivos con que se fabricó, requieren la construcción de una nueva curva.

Em.leo de -actore+ de cali/ración:  otra forma de traba3o es emplear factores de calibración; se 1allan comparando concentraciones y absorbancias de estándar y problema.

A e+t,ndar % a . / ) c e+t,ndar A .ro/lema % a ) / ) c .ro/lema C .ro/lema % A .ro/lema ) C e+t,ndar A e+t,ndar

A e+t,ndar C e+t,ndar A .ro/lema C .ro/lema 

C e+t,ndar&A e+t,ndar  es constante, es el factor de calibración Aualquier cambio en las condiciones de traba3o 'reactivos, a3ustes del aparato, etc( requiere el cálculo de un nuevo factor de calibración.

Ti.o+ de an,li+i+ e+.ectro-otométrico+ n el laboratorio de análisis clínicos al unirse la muestra biológica con los reactivos comerciales, se desencadenan una serie de reacciones que dan lugar a un cambio apreciable y mesurable por el equipo instrumental gracias al cual, se puede obtener información sobre la presencia, ausencia, concentración, cantidad yGo actividad del analito.

A@8@C

0@E

$iendo - / muestra M y A / reactivos comerciales

Colorimétrico+: $e denominan así las reaccione+ anal'tica+ ?ue +e miden em.leando longitude+ de onda dentro del $i+i/le . La ma*or'a  de las sustancias no son coloreada+  y por tanto no absorben luz en la región &4+visible, debido a que no tienen grupos cromóforos en su estructura química; entonces, debe realizarse alguna estrategia con tal de poder analizar espectrofotométricamente estas sustancias. La estrategia consiste en introducir e+tructuralmente a e+ta+ +u+tancia+ no coloreadas los gru.o+ cromó-oro+  que no poseen; de esta forma estas sustancias +e tran+-ormar,n en otra+ coloreada+ , que absorberán luz y podremos analizarlas en el &4+visible por espectrofotometría: una forma de 1acerlo consiste en 1acer reaccionar la sustancia no coloreada con un reactivo específico, de forma que el producto que se obtenga sea coloreado y a1ora sí absorba en el &4+visible, de esta forma podrá ser leído en el espectrofotómetro:

Mue+tra

@

Reacti$o

'$ustancia no coloreada( N O P gGdl

Producto coloreado

específico

Aoncentración

lectura -bsorbancia 'spectrofotómetro(

sta técnica se denomina técnica colorimétrica y consiste en la determinación por colorimetría de la concentración de una sustancia o bien el producto de su reacción con un reactivo específico. La absorbancia del producto obtenido es proporcional a la concentración de la sustancia en la muestra. 0ara determinar la concentración se pueden emplear patrones acuosos y la siguiente e"presión:

C

.ro/lema 

% C

.atrón

) A

.ro/lema 

A

.atrón

ya que suelen ser, por lo general, reacciones colorimétrica+ a .unto -inal , pero también pueden ser colorimétrica+ * cinética+ , por lo que se emplearía la siguiente e"presión:

C  

.ro/lema 

% C

.atrón

) B0O B0O

.ro/lema  .atrón

https://docs.google.com/document/d/1IStRYXgU2LMyemg7GI0enuSYG!ec"#$oc%L&L$YeI/ed't(pl')1 Curso 2012-13. Ciclo Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Fundamentos y tcnicas de an!lisis bio"uímico. Tema 2. Técnicas espectrométricas