TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS PRINCIPIOS DE LA CROMATOGRAFÍA 1.- DEFINICIÓN cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas. Es un conjunto de técnicas t écnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
Keulemans ha definido la cromatografía como un método físico de separación en el cual los componentes a separar separa r se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye la fase estacionaria, de gran área á rea superficial, y la otra es un fluido (fase móvil) que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser un sólido o un u n líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte, de gran área superficial. La fase móvil es un fluido (puede ser gas, líquido o fluido supercrítico) que se usa como portador de la mezcla. En la cromatografía ocurren dos fenómenos muy importantes y que son prácticamente los rectores del proceso de separación: la adsorción y la absorción. La adsorción es la retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un sólido, quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. Esta retención superficial puede ser física o química. La adsorción a dsorción depende de la naturaleza de la substancia adsorbida, de la temperatura, de la naturaleza y estado de subdivisión del adsorbente, y de la concentración. La absorción es la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar químicamente con la misma.
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.- HISTÓRIA
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Aunque procesos parecidos ocurren en la naturaleza cuando disoluciones pasan a través de arcilla, rocas, etc... la cromatografía como tal adquiere importancia cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, tinta s, descubrió que los cationes orgánicos se separaban por migración cuando se depositaba una disolución que los contenía sobre un material poroso, como papel. En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía en columna para separar extractos vegetales coloreados, y a este proceso le dió el nombre de cromatografía. Pero el mayor desarrollo se produce p roduce en 1930 con Lederer cuando consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Posteriormente los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica, y obtienen el premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente. A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial de forma que en 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elución y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948. Al mismo tiempo la cromatografía se aplicaba en el campo ca mpo de la bioquímica, y así Martin consigue separar algunos aminoácidos a minoácidos acetilados.
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
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Tipos Fase móvil Fase estacionaria Cromatografía en Líquido ( moléculas de agua contenidas en la Líquido papel celulosa del papel ) Cromatografía en Líquido Sólido capa fina Cromatografía de Gas Sólido o líquido gases Cromatografía líquida Líquido Sólido o líquido en fase inversa (polar) (menos polar) Cromatografía líquida Líquido Sólido o líquido (menos en fase normal (polar) polar) Cromatografía líquida Líquido Sólido de intercambio iónico (polar) Cromatografía líquida Líquido Sólido de exclusión Cromatografía líquida Líquido Sólido de adsorción Cromatografía de Líquido Sólido fluidos supercríticos
1.- CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al 2O3), Sílica u Oxido de Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada fabricada en plástico o vidrio. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior superior de la l a columna. La migración de las sustancias de la l a mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ell as
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.- CROMATOGRAFÍA PLANA PLANA (Papel y capa fina) fina)
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Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La muestra para análisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la l a superficie superficie por la acción ac ción de fuerzas electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes adsorbentes más utilizados son gel de silica, alumina, tierra silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia : f 254 ó f366 La placa seca se coloca col oca en el tanque cromatográfico o cámara, en el cual debe encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil líquida).El eluente ascenderá o desplazara d esplazara por capilaridad en la placa y arrastrará los componentes componentes a lo largo de ésta produciendo ´manchasµ que representan representan a los componentes, la separación se da por migración diferencial, es decir que la fase móvil arrastra a las substancias apolares y aquellas más m ás polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separación. Posteriormente se evapora el el eluente y la placa se analiza por medio medio de métodos químicos químicos en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes fl uorescentes (Adición de Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de métodos físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible. El análisis es de tipo t ipo cualitativo, semicuantitativo semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen comparaciones visuales de color e intensidad intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa diámetro y comparación visual e intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentración conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisión a través de la sustancia y medidas de emisión o
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.- CROMATOGRAFÍA DE GASES
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Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es un G as (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyección, una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatógrama.
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componentes de la muestra a través de la columna, por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones interacciones con la muestra o la fase fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la detección y cuantificación de las sustancias, sustancias, midiendo conductividad conductividad térmica térmica y electronegatividad electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una señal tipo eléctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo permitiendo indicar el momento en que salen de la columna columna los componentes. La salida de la sustancia sustancia se registra en en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico.
.- CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
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La Fase Estacionaria es una resina resina de intercambio intercambio iónico que contiene grupos cargados
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grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la l a concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la l a proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración c oncentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración. c oncentración.