TEMA TEMA 49: TÉCNIC TÉCNICAS AS ANALÍT ANALÍTICA ICASS RELACI RELACIONA ONADAS DAS CON LAS PROTEÍNAS 1. Introducción Las proteínas son polímeros de aminoácidos. En las proteínas podemos encontrar hasta veinte tipos diferentes de aminoácidos. Las proteínas se diferencian entre sí según el tipo, número y secuencia de aminoácidos que forman el esqueleto esqueleto del polipéptido. Como resultado, tienen tienen diferentes estructuras estructuras moleculares moleculares y propiedades físico-químicas. físico-químicas. Las proteínas son componentes importantes importantes de alimentos para una serie de razones diferentes. Son una fuente importante de energía, así como de aminoácidos esenciales (lisina, triptófano, metionina, leucina, isoleucina y valina). Muchas proteínas son enzimas que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones bioquímicas. A continuación veremos las principales técnicas analíticas empleadas empleadas en el estudio de la concentración total, el tipo, la estructura molecular y propiedades funcionales de las proteínas. 2. Determinación de la concentración de proteína total 2.1. El método Kjeldahl Por lo general se considera que es el método estándar para determinar la concentración de proteína. proteína. Debido Debido a que el método método de Kjeldahl Kjeldahl no mide el contenido contenido de proteínas proteínas directamente directamente un factor un factor de de conversión (F) es necesaria para convertir la concentración concentración de nitrógeno medidos medidos a una concentración concentración de proteínas. proteínas. Un factor de conversión conversión de 6,25 (equivalente a 0,16 g de nitrógeno por gramo de proteína) se utiliza para muchas aplicaciones, sin embargo, esto sólo es un valor medio, y cada proteína tiene un factor de conversión diferentes, diferentes, dependiendo dependiendo de su composición de aminoácidos. aminoácidos. El método de Kjel Kjelda dahl hl conv conven enie ient ntem emen ente te se pued puedee divi dividi dirr en tres tres etap etapas as:: la dige digest stió ión, n, la neutralización y titulación. 6.2.1.1. Principios La digestión La muestra de alimento a analizar se pesa en un matraz de digestión y digerido por calentamiento en presencia de ácido sulfúrico (un agente oxidante que digiere los alim alimen ento tos) s),, sulf sulfat atoo de sodi sodioo anhi anhidr droo (par (paraa acel aceler erar ar la reac reacci ción ón al aume aument ntar ar la temper temperat atura ura de ebull ebullic ición ión)) y un cata catali lizad zador, or, como como el cobre, cobre, seleni selenio, o, ti titan tanio, io, o el mercurio (para acelerar acelerar la reacción). La digestión digestión convierte cualquier cualquier nitrógeno en los los alimentos (excepto los que se encuentra en forma de nitratos o nitritos) en amoniaco, y otras materias orgánicas de C0 2 y H 2 0. El gas de amoníac amoníacoo no es liberado liberado en una solución ácida debido a que el amoniaco es en forma de ion amonio (NH 4 +) que se une a los iones de sulfato (SO 4 2 -) y por lo tanto permanece en solución: N (alimentos) (NH4) 2 SO 4 (1) Neutralización
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Después de la digestión se ha completado el matraz de digestión está conectado a un matraz receptor por un tubo. La solución en el matraz de digestión se hace entonces alcalinos mediante la adición de hidróxido de sodio, que convierte el sulfato de amonio en gas amoníaco: (NH 4) 2 SO 4 + 2 NaOH 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4 (2) El gas amoniaco que se forma se libera de la solución y se mueve fuera del matraz de digestión y en el matraz de recepción - que contiene un exceso de ácido bórico. El bajo pH de la solución en el matraz receptor convierte el gas amoníaco en el ion amonio, y al mismo tiempo convierte el ácido bórico para el ion borato: NH 3 + H 3 BO 3 (ácido bórico) NH 4 + + H 2 BO 3 - (ion borato) (3) Valoración El contenido en nitrógeno entonces se calcula mediante una valoración de amonio borato forma con el ácido sulfúrico o clorhídrico estándar, utilizando un indicador adecuado para determinar el punto final de la reacción. H 2 BO 3 - + H + H 3 BO 3 (4) La concentración de iones hidrógeno (en moles) requerido para alcanzar el punto final es equivalente a la concentración de nitrógeno que estaba en el alimento original (ecuación 3). La siguiente ecuación se puede utilizar para determinar la concentración de nitrógeno de una muestra que pesa gramos m con una x M solución de ácido HCl para la valoración: (5) Donde s V y V b son los volúmenes de valoración de la muestra y en blanco y 14 gramos es el peso molecular de nitrógeno N. Una muestra en blanco por lo general corrió en el mismo tiempo que el material que está siendo analizada para tener en cuenta el nitrógeno residual que puede estar en los reactivos utilizados para llevar a cabo el análisis. Una vez que el contenido de nitrógeno se ha determinado que se convierte en un contenido de proteínas utilizando el factor de conversión: Proteína = F% N. 6.2.1.4. Ventajas y desventajas Ventajas. El método de Kjeldahl es ampliamente utilizado a nivel internacional y sigue siendo el método estándar para la comparación con otros métodos. Su universalidad, alta precisión y buena reproducibilidad han convertido en el principal método para la estimación de la proteína en los alimentos. Desventajas. No da una medida de la proteína verdadera, ya que todo el nitrógeno en los alimentos no es en forma de proteínas. proteínas diferentes necesitan diferentes factores de corrección debido a que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. El uso de ácido sulfúrico concentrado a las altas temperaturas supone un riesgo considerable, al igual que el uso de algunos de los posibles catalizadores La técnica es mucho tiempo para llevar. 6.2.2. Mayor Dumas método Recientemente, una técnica instrumental automatizado se ha desarrollado que es capaz de medir rápidamente la concentración de proteínas de muestras de alimentos. Esta técnica se basa en un método descrito por primera vez por un científico llamado Dumas más de un siglo y medio hace. Se está empezando a competir con el método de
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Kjeldahl como el método estándar de análisis de las proteínas de algunos alimentos debido a su rapidness. 6.2.2.1. Principios generales Una muestra de masa conocida se quema a una temperatura alta (900 ° C) en la cámara de la presencia de oxígeno. Esto conduce a la liberación de CO 2, H 2 O y N 2. El CO 2 y H 2 O se eliminan al pasar los gases en columnas especiales que absorberlos. El contenido de nitrógeno se mide haciendo pasar los gases restantes a través de una columna que tiene un detector de conductividad térmica en el extremo. La columna de ayuda a separar el nitrógeno de cualquier residuo de CO 2 y H 2 O que han permanecido en la corriente de gas. El instrumento se calibra mediante el análisis de un material que es puro y tiene una concentración de nitrógeno conocidos, tales como EDTA (= 9,59% N). Así, la señal del detector de conductividad térmica se puede convertir en un contenido de nitrógeno. Al igual que con el método de Kjeldahl es necesario para convertir la concentración de nitrógeno en una muestra de ese contenido, utilizando los factores de conversión adecuados que dependen de la secuencia de aminoácidos de la proteína precisa. 6.2.2.2. Ventajas y desventajas Ventajas: Es mucho más rápido que el método de Kjeldahl (menos de 4 minutos por cada medición, en comparación con 1.2 horas para Kjeldahl). No necesita productos químicos tóxicos o catalizadores. Muchas muestras se pueden medir de forma automática. Es fácil de usar. Desventajas: Alto costo inicial. No da una medida de la proteína verdadera, ya que todo el nitrógeno en los alimentos no es en forma de proteínas. proteínas diferentes necesitan diferentes factores de corrección debido a que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. El tamaño de la muestra hace que sea difícil obtener una muestra representativa. 6.2.3. Los métodos que utilizan espectroscopía UV-visible Un número de métodos se han ideado para medir la concentración de proteína, que se basan en la espectroscopia UV-visible. Estos métodos de utilizar la capacidad natural para absorber las proteínas (o dispersión) la luz en la región UV-visible del espectro electromagnético, o química o modificar físicamente de las proteínas para hacerlas absorber (o dispersión) la luz en esta región. El principio básico detrás de cada una de estas pruebas es similar. En primer lugar una curva de calibración de absorbancia (o turbidez) en comparación con la concentración de proteínas se prepara a partir de una serie de soluciones de proteínas de concentración conocida. La absorbancia (o turbidez) de la solución que se analiza se mide en la misma longitud de onda, y su concentración de proteína determina a partir de la curva de calibración. La principal diferencia entre las pruebas son los grupos químicos que son responsables de la absorción o dispersión de la radiación, por ejemplo, los enlaces peptídicos, aromáticos grupos secundarios, grupos de base y agregados de proteínas. Algunos de los comúnmente utilizados UV-visible la mayoría de los métodos para la determinación del contenido en proteínas de los alimentos se destacan a continuación: 6.2.3.1. Principios Medición directa a 280 nm
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Triptófano y tirosina absorben la luz ultravioleta fuertemente a 280 nm. El contenido de tirosina y triptófano de muchas proteínas se mantiene bastante constante, por lo que la absorbancia de las soluciones de la proteína en 280 nm puede ser utilizado para determinar su concentración. Las ventajas de este método son que el procedimiento es sencillo de realizar, que no es destructiva, y no reactivos especiales se requieren. La principal desventaja es que los ácidos nucleicos también absorben fuertemente a 280 nm, por lo que podría interferir con la medición de la proteína si están presentes en concentraciones suficientes. A pesar de ello, se han desarrollado métodos para superar este problema, por ejemplo, midiendo la absorbancia a dos longitudes de onda diferentes. Método de Biuret A-violáceo color violeta se produce cuando los iones de cobre (Cu 2 +) interactúan con los enlaces peptídicos en condiciones alcalinas. El reactivo de biuret, que contiene todos los productos químicos necesarios para llevar a cabo el análisis, se pueden adquirir comercialmente. Se mezcla con una solución de proteínas y luego se deja reposar durante 15-30 minutos antes de que se lee la absorbancia a 540 nm. La principal ventaja de esta técnica es que no hay interferencia con materiales que absorben a menores longitudes de onda, y la técnica es menos sensible al tipo de proteína, ya que utiliza la absorción de participación de los enlaces peptídicos que son comunes a todas las proteínas, en lugar de los grupos secundarios específicos. Sin embargo, tiene una sensibilidad relativamente baja en comparación con otros métodos visible-UV. Método de Lowry El método de Lowry combina el reactivo de biuret con otro reactivo (el Ciocalteau fenol reactivo Folin-), que reacciona con los residuos de tirosina y triptófano en las proteínas. Esto le da un color azulado que puede ser leído en alguna parte entre 500 750 nm en función de la sensibilidad necesaria. Hay un pequeño pico alrededor de 500 nm que se pueden utilizar para determinar las altas concentraciones de proteínas y un gran pico alrededor de 750 nm que se pueden utilizar para determinar las proteínas bajas concentraciones. Este método es más sensible a bajas concentraciones de proteínas que el método de biuret. Métodos de tinción Un exceso conocido de una carga negativa (aniónicos) colorante se agrega a una solución de proteína cuyo pH se ajusta de modo que las proteínas tienen carga positiva (es decir,
6.2.3.2. Ventajas y desventajas Ventajas: UV-visible técnicas son bastante rápidos y simples de realizar, y son sensibles a concentraciones bajas de proteínas. Desventajas: Para la mayoría de las técnicas visible-UV, es necesario utilizar la dilución y las soluciones transparentes, que no contienen sustancias contaminantes que absorben o dispersan la luz en la misma onda que la proteína que se analiza. La necesidad de soluciones transparentes significa que la mayoría de los alimentos deben someterse a cantidades significativas de preparación de la muestra antes de que puedan ser analizadas, por ejemplo, la homogeneización, extracción por solvente, centrifugación, filtración, que puede ser lento y laborioso. Además, a veces es difícil de extraer cuantitativamente las proteínas de determinados tipos de alimentos, especialmente después de haber sido procesada de manera que las proteínas se agregan o enlaces covalentes con otras sustancias. Además, la absorción depende del tipo de proteínas analizadas (diferentes proteínas tienen diferentes secuencias de aminoácidos). 6.2.4. Otras Técnicas Instrumentales Hay una gran variedad de diferentes métodos instrumentales disponibles para la determinación del contenido de proteína total de productos alimenticios. Éstos se pueden dividir en tres categorías diferentes de acuerdo a sus principios fisicoquímicos: (i) la medición de propiedades físicas a granel, (ii) medición de la absorción de la radiación, y (iii) la medición de la dispersión de la radiación. Cada uno de los métodos clásicos tiene sus propias ventajas y desventajas, y la variedad de alimentos a los que se puede aplicar. 6.2.4.1. Principios La medición de propiedades físicas a granel Densidad: La densidad de una proteína es mayor que la de la mayoría de los componentes de otros alimentos, y así se produce un aumento en la densidad de un alimento que aumenta su contenido de proteínas. Así, el contenido de proteínas de los alimentos puede ser determinada mediante la medición de su densidad. Índice de refracción: El índice de refracción de una solución acuosa aumenta la concentración de proteínas aumenta y por lo tanto las mediciones de RI puede ser usado para determinar el contenido de proteína. La medición de la adsorción de las Radiaciones UV-visible: La concentración de proteínas se puede determinar midiendo la absorbancia de la radiación ultravioleta-visible (véase más arriba). Infrarrojos: técnicas de infrarrojo se puede utilizar para determinar la concentración de proteínas en muestras de alimentos. Las proteínas absorben IR natural debido a las vibraciones características (estiramiento y flexión) de determinados grupos químicos a lo largo de la columna vertebral del polipéptido. Las mediciones de la absorción de la radiación en ciertas longitudes de onda por lo tanto puede ser utilizado para cuantificar la concentración de proteína en la muestra. IR es particularmente útil para en-línea de análisis rápido del contenido de proteínas. También requiere la preparación de muestras poco y no es destructiva. Sus principales desventajas son su alto costo inicial y la necesidad de calibración amplia. •
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Resonancia Magnética Nuclear: espectroscopía de RMN se pueden utilizar para determinar la concentración total de proteínas de los alimentos. El contenido de proteína se determina midiendo el área bajo un pico en un turno de espectros de RMN químicas que corresponde a la fracción proteica. Medida de la dispersión de la radiación De dispersión de luz: La concentración de agregados de proteínas en solución acuosa se puede determinar utilizando técnicas de dispersión de la luz debido a la turbidez de una solución es directamente proporcional a la concentración de los agregados presentes. la dispersión por ultrasonidos: La concentración de agregados de proteínas también se puede determinar utilizando técnicas de dispersión por ultrasonidos, porque la velocidad ultrasónica y la absorción de la ecografía se relacionan con la concentración de agregados proteicos presentes. 6.2.4.2. Ventajas y desventajas Algunos de estos métodos instrumentales tienen grandes ventajas sobre las otras técnicas mencionadas anteriormente, ya que no son destructivas, requieren poca o ninguna preparación de la muestra, y las mediciones son rápidas y precisas. Una desventaja importante de las técnicas que se basan en mediciones de propiedades físicas de la mayor parte de los alimentos es que una curva de calibración debe estar preparado entre la propiedad física de interés y el contenido de proteína total, y esto puede depender del tipo de proteína y la comida la matriz que se encuentra dentro. Además, las técnicas basadas en las mediciones de las propiedades físico-químicas a granel sólo se puede utilizar para analizar los alimentos con composiciones simples relativamente. En una comida que contiene muchos componentes diferentes, cuya concentración puede variar, es difícil separar la contribución que hace la proteína a la medición global de la de los otros componentes. 6.2.5. Comparación de los métodos de Como científicos alimentos que a menudo se puede estar en una posición donde tenemos que elegir una determinada técnica para medir la concentración de la proteína de un alimento. ¿Cómo decidir qué técnica es la más apropiada para nuestra aplicación en particular? Lo primero que debe determinar es cuál es la información va a ser utilizado para. Si el análisis se llevará a cabo con fines oficiales, por ejemplo, legales o de los requisitos de etiquetado, es importante utilizar un método reconocido oficialmente. El método de Kjeldahl, y cada vez más el método de Dumas, han sido autorizados oficialmente para una amplia gama de aplicaciones en alimentos. En contraste, sólo un pequeño número de aplicaciones de la espectroscopia de UV-visible han sido reconocidas oficialmente. A efectos de control de calidad, a menudo es más útil contar con medidas rápidas y sencillas de contenido de proteínas y por lo tanto las técnicas de IR son los más adecuados. Para los estudios fundamentales en el laboratorio, donde las proteínas puras se han analizado, las técnicas de espectroscopía visible-UV se prefieren a menudo porque dan mediciones rápidas y fiables, y son sensibles a concentraciones bajas de proteína. Otros factores que pueden tener que tener en cuenta son la cantidad de preparación de la muestra requerida, su sensibilidad y su velocidad. El Kjeldahl, Dumas y los métodos de IR requieren de preparación de muestras muy poco. Después de una muestra •
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representativa de los alimentos ha sido seleccionado por lo general se puede probar directamente. Por otra parte, la UV-visible-varios métodos requieren una preparación extensa muestra antes del análisis. La proteína debe ser extraída de los alimentos en una solución diluida transparente, que generalmente implica mucho tiempo de homogeneización, extracción, filtración de disolventes y los procedimientos de centrifugación. Además, puede ser difícil de aislar por completo algunas proteínas de los alimentos, ya que están fuertemente ligados a otros componentes. Las diversas técnicas también tienen sensibilidades diferentes, es decir, la menor concentración de proteínas que pueden detectar. Los métodos UV-visible son los más sensibles, siendo capaz de detectar concentraciones de proteína tan bajas como 0,001% en peso. La sensibilidad de los Dumas, Kjeldahl y métodos de IR es de alrededor de 0,1% en peso. El tiempo requerido por el análisis, y el número de muestras que se pueden ejecutar al mismo tiempo, son también factores importantes a considerar al decidir qué técnica de análisis a utilizar. técnicas de infrarrojos son capaces de un análisis rápido (menos de 1 minuto) de la concentración de la proteína una vez que han sido calibrados. El instrumental moderno método de Dumas es totalmente automático y se puede medir la concentración de proteínas de una muestra en menos de 5 minutos, en comparación con el método de Kjeldahl que toma entre 30 minutos y 2 horas para llevar a cabo. El UVvisible-varios métodos oscilan entre un par de minutos a una hora (dependiendo del tipo de colorante que se utiliza y cuánto tiempo se tarda en reaccionar), aunque tiene la ventaja de que muchas muestras se pueden ejecutar simultáneamente. Sin embargo, suele ser necesario para llevar a cabo la preparación de muestras amplias antes del análisis con el fin de obtener una solución transparente. Otros factores que pueden ser importantes al seleccionar una técnica apropiada son: el equipo disponible, facilidad de uso, la precisión deseada, y si la técnica no es destructiva. 6.3. Separación y Caracterización de la proteína En la conferencia anterior, las técnicas utilizadas para determinar la concentración total de proteína en un alimento se discutieron. Los analistas de alimentos se han interesado también en el tipo de proteínas presentes en un alimento, ya que cada proteína tiene única y fisicoquímicas propiedades nutricionales. tipo de proteína es determinada generalmente por la separación y aislamiento de las proteínas individuales de una mezcla compleja de proteínas, de modo que puedan ser posteriormente identificado y caracterizado. Las proteínas son separadas en la base de las diferencias en sus propiedades fisicoquímicas, como el tamaño, la carga, las características de la adsorción, la solubilidad y estabilidad térmica. La elección de una técnica de separación adecuada depende de una serie de factores, incluyendo las razones para llevar a cabo el análisis, la cantidad de muestra disponible, la pureza deseada, el equipo disponible, el tipo de proteínas presentes y el costo. Métodos de gran escala están disponibles para los aislamientos de crudo de grandes cantidades de proteínas, mientras que los métodos de pequeña escala están disponibles para las proteínas que son caras o sólo están disponibles en pequeñas cantidades. Uno de los factores que deben ser considerados durante el proceso de separación es la posibilidad de que el nativo de la estructura tridimensional de las moléculas de proteína puede ser alterado. Un conocimiento previo de los efectos de las condiciones ambientales en la estructura de la proteína y las interacciones es extremadamente útil cuando la selección de la separación técnica más apropiada. En primer lugar, porque ayuda a determinar las condiciones más adecuadas a emplear para aislar una proteína particular de una mezcla de proteínas (por ejemplo, pH, fuerza iónica, temperatura, etc disolvente.), Y en
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segundo lugar, porque puede ser importante para elegir las condiciones que se no afectan negativamente a la estructura molecular de las proteínas. 6.3.1. Métodos basados en diferentes características de solubilidad Las proteínas se pueden separar por explotar las diferencias entre su solubilidad en soluciones acuosas. La solubilidad de una molécula de proteína está determinada por su secuencia de aminoácidos, ya que esto determina su tamaño, forma, hidrofobicidad y la carga eléctrica. Las proteínas pueden ser selectivamente precipitado o solubilizado mediante la alteración del pH, fuerza iónica, constante dieléctrica o la temperatura de una solución. Estas técnicas de separación son los más sencillos de utilizar, cuando grandes cantidades de muestra están involucrados, porque son relativamente rápido, barato y no son particularmente influenciada por otros componentes de los alimentos. A menudo se utilizan como el primer paso en cualquier proceso de separación debido a que la mayoría de los materiales contaminantes se puede quitar fácilmente. Ensanchamiento Las proteínas se precipitan a partir de soluciones acuosas, cuando la concentración de sal supera un nivel crítico, lo que se conoce como la salazón de espera, ya que toda el agua es "obligado" a las sales, y por tanto no disponibles para hidratar las proteínas. Sulfato de amonio [(NH 4) 2 SO 4] se usa comúnmente, ya que tiene un agua de alta solubilidad, aunque otras sales neutras también puede ser utilizado, por ejemplo, NaCl o KCl. En general, un procedimiento de dos pasos se utiliza para maximizar la eficiencia de separación. En el primer paso, la sal se añade a una concentración por debajo de las necesarias para precipitar la proteína de interés. La solución se centrifuga para eliminar las proteínas que son menos solubles que la proteína de interés. La concentración de sal es luego aumentó a un punto justo por encima de la necesaria para causar la precipitación de la proteína. Esto precipita la proteína de interés (que pueden ser separados por centrifugación), pero deja más proteínas solubles en la solución. El principal problema de este método es que las grandes concentraciones de sal contamine la solución, que debe ser removido antes de la proteína puede ser resolubilzed, por ejemplo, mediante diálisis o ultrafiltración. La precipitación isoeléctrica El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH donde la carga neta de la proteína es cero. Las proteínas tienden a agregarse y precipitar a su pI porque no hay repulsión electrostática mantenerlos separados. Las proteínas tienen diferentes puntos isoeléctricos por sus secuencias de aminoácidos diferentes (en relación por ejemplo, números de grupos aniónicos y catiónicos), y por lo tanto pueden ser separados por el ajuste del pH de una solución. Cuando se ajusta el pH a la pi de una proteína particular, se precipita dejando a las otras proteínas en solución. Solvente Fraccionamiento La solubilidad de una proteína depende de la constante dieléctrica de la solución que lo rodea, porque esto altera la magnitud de las interacciones electrostáticas entre los grupos de cargos. Como la constante dieléctrica de una solución reduce la magnitud de las interacciones electrostáticas entre los acusados aumentos de las especies. Esto tiende a reducir la solubilidad de las proteínas en solución, ya que son menos ionizado, y por lo tanto la repulsión electrostática entre ellos no es suficiente para evitar la agregación. La constante dieléctrica de las soluciones acuosas se puede reducir mediante la adición de disolventes orgánicos solubles en agua, como el etanol o acetona. La cantidad de disolventes orgánicos necesarios para causar la precipitación 8
depende de la proteína y por lo tanto las proteínas se pueden separar en esta base. La cantidad óptima de disolventes orgánicos necesarios para precipitar una proteína varía de 5 a 60%. fraccionamiento solvente se realiza generalmente a 0 º C o menos para evitar la desnaturalización de proteínas causada por el aumento de la temperatura que se producen cuando los solventes orgánicos se mezclan con agua. La desnaturalización de las proteínas contaminantes Muchas proteínas se desnaturalizan y precipitado de la solución cuando se calienta por encima de cierta temperatura o mediante el ajuste de una solución a pH muy ácido o básico. Las proteínas que son estables a altas temperaturas o en los extremos de pH son más fáciles de separar por esta técnica debido a contaminación de las proteínas puede ser precipitada, mientras que la proteína de interés se mantiene en solución. 6.3.2. Características de separación por adsorción de diferentes cromatografía de adsorción consiste en la separación selectiva de los compuestos por adsorción-desorción en una matriz sólida que se encuentra dentro de una columna a través del cual pasa la mezcla. La separación se basa en las afinidades diferentes de diferentes proteínas de la matriz sólida. Afinidad y cromatografía de intercambio iónico son los dos principales tipos de cromatografía de adsorción de uso general para la separación de las proteínas. La separación puede llevarse a cabo utilizando una columna abierta o de alta presión de cromatografía de líquidos. Cromatografía de intercambio iónico cromatografía de intercambio iónico se basa en la adsorción reversible-desorción de iones en la solución de un cargo o matriz polimérica sólida red. Esta técnica es la técnica de cromatografía de uso común para la mayoría de separación de proteínas. Una carga positiva de la matriz se llama un intercambiador de aniones, ya que se une iones cargados negativamente (aniones). Una carga negativa de la matriz se llama un ion de gato intercambiador porque se une iones cargados positivamente (cationes). Las condiciones (pH y fuerza iónica) se ajustan a favor de la máxima unión de la proteína de interés para la columna de intercambio iónico. La contaminación de proteínas se unen con menos fuerza y por lo tanto pasan más rápidamente a través de la columna. La proteína de interés se eluye con otra solución tampón que favorece la desorción de la columna (, diferentes por ejemplo, pH o fuerza iónica). Cromatografía de afinidad cromatografía de afinidad utiliza una fase estacionaria que consta de un ligando unido covalentemente a un soporte sólido. El ligando es una molécula que tiene un único y reversibles afinidad altamente específicos para una proteína en particular. La muestra a analizar se pasa a través de la columna y la proteína de interés se une al ligando, mientras que las proteínas contaminantes pasan directamente a través. La proteína de interés como a continuación se eluyó con una solución tampón que favorece la desorción de la columna. Esta técnica es el medio más eficaz de separar una proteína individuales de una mezcla de proteínas, pero es el más caro, debido a la necesidad de tener columnas con ligandos específicos vinculados a ellos. Tanto de intercambio iónico y cromatografía de afinidad se usan comúnmente para separar las proteínas y aminoácidos en el laboratorio. Se utilizan con menos frecuencia para las separaciones comerciales porque no son adecuados para la rápida separación de grandes volúmenes y son relativamente caros. 6.3.3. Separación Debido a las diferencias de tamaño 9
Las proteínas también pueden ser separados de acuerdo a su tamaño. Normalmente, los pesos moleculares de las proteínas varían de cerca de 10.000 a 1.000.000 daltons. En la práctica, la separación depende de la radio de Stokes de una proteína, en lugar de hacerlo directamente en su peso molecular. El radio de Stokes es el radio promedio de una proteína que tiene en la solución, y depende de su estructura de tres dimensiones moleculares. Para las proteínas con el mismo peso molecular aumenta el radio de Stokes en el siguiente orden: compacto
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6.3.4. Separación por electroforesis Electroforesis se basa en las diferencias en la migración de las moléculas cargadas en una solución cuando un campo eléctrico se aplica a través de ella. Puede ser utilizado para separar las proteínas en función de su tamaño, forma o carga. Para no desnaturalizar la electroforesis En la electroforesis no desnaturalizante, una solución tamponada de proteínas nativas se vierte sobre un gel poroso (por lo general, el almidón de poliacrilamida o agarosa) y se aplica un voltaje a través del gel. Las proteínas se mueven a través del gel en una dirección que depende del signo de su carga, ya un ritmo que depende de la magnitud de la carga, y la fricción de su movimiento: Las proteínas pueden ser cargados positiva o negativamente en la solución en función de sus puntos isoelectic (pI) y el pH de la solución. Una proteína tiene carga negativa, si el pH está por encima de la PI, y con carga positiva si el pH está por debajo del pI. La magnitud de la carga y la tensión aplicada se determinará en qué medida las proteínas migran en un tiempo determinado. Cuanto mayor sea el voltaje o la mayor carga sobre la proteína más se moverá. La fricción de una molécula es una medida de su resistencia al movimiento a través del gel y está determinado en gran medida por la relación entre el tamaño efectivo de la molécula, y el tamaño de los poros en el gel. Cuanto menor sea el tamaño de la molécula, o cuanto mayor sea el tamaño de los poros en el gel, menor será la resistencia y por lo tanto más rápido se mueve una molécula a través del gel. Geles con la porosidad diferentes se pueden comprar de proveedores de productos químicos, o compuesto en el laboratorio. Poros más pequeños tamaños se obtienen mediante una mayor concentración de reactivo del cross-linking para formar el gel. Los geles pueden estar contenidos entre dos placas paralelas, o en tubos cilíndricos. En la electroforesis no desnaturalizante de las proteínas nativas están separados sobre la base de una combinación de su carga, tamaño y forma. La desnaturalización de la electroforesis En desnaturalizar las proteínas electroforesis se separan principalmente en su peso molecular. Las proteínas se desnaturalizan antes del análisis mediante la mezcla con mercaptoetanol, que rompe los enlaces disulfuro y dodecilsulfato sódico (SDS), que es un surfactante aniónico que hydrophobically se une a moléculas de proteínas y hace que se desarrollan debido a la repulsión entre la carga negativa de surfactante cabeza de los grupos. Cada molécula de proteína se une aproximadamente la misma cantidad de las existencias por unidad de longitud. Por lo tanto, la carga por unidad de longitud y la conformación molecular es aproximadamente similar para todas las proteínas. Como las proteínas viajar a través de una red de gel son principalmente separados sobre la base de su peso molecular debido a que su movimiento depende del tamaño de la molécula de proteína en relación con el tamaño de los poros en el gel: proteínas más pequeñas moviéndose más rápidamente a través de la matriz que las grandes moléculas. Este tipo de electroforesis que comúnmente se llama de sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida-sulfato, o SDS-PAGE. Para determinar hasta qué punto las proteínas se han movido un medio de seguimiento se agrega a la solución de la proteína, por ejemplo, azul de bromofenol. Este colorante es una carga pequeña molécula que migra por delante de las proteínas. Después de la electroforesis de las proteínas se completa se hacen visibles al tratar el gel con un tinte de proteínas tales como azul brillante de Coomassie o tinción de plata. La movilidad relativa de cada banda de proteínas se calcula: 11
Electroforesis se utiliza a menudo para determinar la composición proteica de los alimentos. La proteína se extrae de los alimentos en solución, que se separa mediante electroforesis. SDS-PAGE se utiliza para determinar el peso molecular de una proteína mediante la medición de R m, y luego se compara con una curva de calibración producidos con proteínas de peso molecular conocido: una parcela de registro (peso molecular) en contra de la movilidad relativa es generalmente lineal. electroforesis desnaturalizante es más útil para la determinación de pesos moleculares de electroforesis no desnaturalizante, porque la fricción con el movimiento no depende de la forma o la carga original de las moléculas de proteína. Isoelectroenfoque electroforesis Esta técnica es una modificación de la electroforesis, en los que las proteínas son separadas por la carga en una matriz de gel que tiene un gradiente de pH a través de ella. Las proteínas migran hacia el lugar donde el pH es igual a su punto isoeléctrico y luego dejan de moverse porque ya no son cargos. Este método tiene una de las resoluciones más altas de todas las técnicas que se utilizan para separar las proteínas. Los geles están disponibles que cubren un rango de pH estrecho (2-3 unidades) o un amplio rango de pH (3-10 unidades) y un tanto, debe seleccionar un gel que es más adecuado para las proteínas están separados. Electroforesis de dos dimensiones Isoelectroenfoque y SDS-PAGE se pueden utilizar juntos para mejorar la resolución de mezclas complejas de proteínas. Las proteínas se separan en una dirección sobre la base de carga usando la concentración isoeléctrica y, a continuación en una dirección perpendicular sobre la base de tamaño mediante SDS-PAGE. 6.3.5. Amino ácido Análisis análisis de ácido amino se utiliza para determinar la composición de aminoácidos de las proteínas. Una muestra de la proteína hidrolizada por primera vez (por ejemplo, utilizando un ácido fuerte) para liberar los aminoácidos, que luego son separados mediante cromatografía, por ejemplo, de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o de absorción.
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