PEMBUATAN PETA RESTRIKSI DNA PLASMID I. Tujuan Mahasiswa dapat menentukan peta restriksi DNA plasmid. II. Dasar Teori Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang biasa dimiliki oleh bakteri dan terletak di luar DNA kromosom pusat sehingga sifatnya independen dan tidak diatur oleh kromosom pusat. Tidak semua bakteri memiliki plasmid. Plasmid memiliki kandungan base pair yang lebih kecil dibandingkan dengan DNA kromosomal dan berbentuk sirkular. Ukuran dari plasmid bervariasi dari 1- lebih dari 400 kilo pasangan basa (kbp). Dalam satu sel ada terdapat ratusan plasmid. Jenis DNA ini sering digunakan untuk keperluan transformasi organisme dalam bioteknologi. Dalam keperluannya di dalam bidang bioteknologi, plasmid memiliki peran sebagai kendaraan bagi fragmen DNA asing untuk bisa masuk ke dalam suatu sel sehingga bisa didapatkan mikroorganisme rekombinan. Plasmid yang dimasukkan umumnya diberi marker, marker yang umum adalah gen antibiotik. Plasmid mengandung setidaknya 1 DNA sequence yang berfungsi sebagai ORI,yang memungkinkan DNA plasmid diduplikasi secara independent dari DNA kromosomal (Anonim,2006). Secara kasar proses penyiapan plasmid untuk transformasi ini, mula-mula plasmid dipotong dan fragmen DNA asing kemudian disisipkan ke dalam plasmid pada bagian yang terpotong tersebut. Selanjutnya backbone
plasmid ’disambung’ kembali atau yang lebih
dikenal dengan peta restriksi. Peta restriksi merupakan gambaran hasil potongan DNA plasmid, ketika plasmid dipotong dengan enzim restriksi tertentu. Peta ini penting, terutama dalam pengaturan konstruksi plasmid yang akan digunakan dalam rekayasa genetika. Ada beberapa cara untuk membuat peta restriksi DNA plasmid. Cara pertama adalah dengan mengetahui urutan DNA plasmid secara keseluruhan, lantas menggunakan sisi pemotongan enzim restriksi tertentu, kemudian akan dapat disusun peta restriksi suatu plasmid. Cara kedua adalah dengan cara memotong langsung plasmid menggunakan beberapa enzim restriksi dan merekonstruksi plasmid yang telah dipotong tersebut. Enzim restriksi (atau endonuklease restriksi) adalah jenis enzim yang dapat memotong DNA double helix. Enzim ini memutuskan ikatan peptide DNA tersebut tanpa merusak basa-
basa nitrogennya. Enzim ini dapat ditemukan pada bakteri E.Coli yang melalui penelitian merupakan respon pertahanan bakteri tersebut dari serangan virus. Enzim restriksi mengkatalis atau memotong kedua strand DNA pada specific site yang disebut sebagai recognition site. Biasanya recognition site ini panjangnya 4-8 base pairs DNA. Terdapat kurang lebih 100 enzim restriksi yang berbeda untuk memotong pada recognition site.
Gambar 1 : Pemotongan DNA Plasmid dengan Sticky end pada Restriction Site Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi
endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan (gambar 2).
Gambar 2. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease
tipe I, II, dan III. Contoh enzim restriksi endonuklease tipe II adalah EcoRI. Enzim EcoRI diisolasi dari E. coli dan memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5’- GAATTC-3’(Hirma et al, 2008). Ada 2 jenis pola pemotongan plasmid, yaitu sticky end dan blunt end. Enzim restriksi memotong rantai DNA dengan sticky ends yang dapat cocok dan kemudian melekat pada rantai sticky ends rantai DNA yang lain yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Kemudian DNA ligase merekatkan potongan DNA yang sticky ends. Dan untuk memudahkan proses seleksi, pada plasmid juga ditambahkan marker yang bisa berupa gen resisten antibiotik ataupun gen fluorescence. Hal ini sering digunakan sering digunakan dalam memproduksi senyawa seperti insulin dan interferon atau dapat juga digunakan untuk memotong gen dalm sel atau organisme untuk mendapatkan keuntungan tertentu (Hirma et al, 2008). Pada umumnya molekul DNA memiliki recognition site yang spesifik. Enzim endonuklease restriksi yang digunakan dalam percobaan ini adalah Pst I yang berasal dari Providencia stuartii dan HindIII yang berasal dari Haemophilus influenzae Rd(1). Enzim
Recognition site
Cut
Pst I
5'CTGCAG 3'GACGTC
5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5'
Hind III
5'AAGCTT
5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'
3'TTCGAA
Pada percobaan ada dua tahap yang akan dilakukan yaitu memotong DNA plasmid dengan enzim restriksi (Pst I dan Hind III), serta melakukan elektroforesis untuk melihat hasil dari pemotongan DNA plasmid apakah proses isolasi yang dilakukan telah berhasil atau tidak. Pada restriksi DNA plasmid, Sebelum plasmid dipotong dengan enzim restriksi endonuklease, ke dalam tabung eppendorf berisi larutan plasmid ditambahkan ditambahkan : ddH 2O, RE buffer (restriction endonucleases buffer), BSA buffer (bovine serum albumin), dan enzim restriksi yang diinginkan. RE buffer yang ditambahkan, sesuai dengan namanya, digunakan untuk mempertahankan pH, dan menciptakan lingkungan yang ionic strength yang cocok dengan enzim bersangkutan (spesifik untuk setiap enzim). Walaupun demikian, kegunaan
utama dari buffer adalah mengatur pH. Aktivitas dari enzim dapat dipengaruhi oleh suhu dan pH. Karena itu, pemberian pH yang optimum untuk memaksimalkan kerja enzim sangatlah penting. Sedangkan BSA buffer memiliki peran sebagai stabilisator bagi enzim restriksi serta mencegah terjadinya adesi antara enzim dengan dinding tabung reaksi (eppendorf dalam kasus ini). BSA tidak akan berpengaruh pada enzim yang tidak membutuhkan stabilisator. Jadi, penambahan BSA tidak akan menimbulkan efek yang buruk pada reaksi yang terjadi. Setelah
penambahan
reagen-reagen ini, barulah enzim endonuklease restriksi
ditambahkan, baik secara tunggal maupun campuran. Lalu, dilakukan inkubasi pada suhu yang sesuai. Yang dimaksud dengan suhu yang sesuai di sini adalah suhu di mana enzim endonuklease restriksi yang digunakan memiliki aktivitas optimum. Setiap enzim memiliki suhu optimumnya sendiri. Suhu ini biasa berhubungan erat dengan suhu tempat hidup organisme dari mana enzim endonuklease restriksi yang bersangkutan berasal. Suhu 37oC dipilih dalam percobaan ini karena enzim endonuklease restriksi yang digunakan berasal dari organisme mesofilik. Seperti yang telah dikemukakan sebelumnya, aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH dan suhu. Inkubasi tidak boleh dilakukan terlalu lama karena dapat terjadi reaksi pemotongan berlebihan oleh enzim yang tidak diharapkan. Enzim restriksi endonuklease yang digunakan juga tidak boleh melebihi konsentrasi konsentrasi tertentu ( >100 U/ug dari DNA ). Keberadaan enzim yang terlalu pekat dalam tabung reaksi dapat mengakibatkan terjadinya star activity, dimana enzim endonuklease restriksi memotong pada sequence yang tidak spesifik atau abnormal. Berikut ini beberapa faktor faktor lain yang menyebabkan terjadinya star activity : ♥
Tingginya pH (>8)
♥
Rendahnya ionic strength (<25 mM), biasa terjadi jika tidak dilakukan penambahan buffer
♥
Konsentrasi gliserol > 5 %
♥
Keberadaan pelarut organik seperti etanol dalam reaksi.
Terjadinya star activity ditunjukkan oleh adanya smear pada hasil elektroforesis.
Dalam percobaan ini, untuk pengecekan keberhasilan isolasi dan untuk melihat hasil pemotongan plasmid dengan enzim endonuklease restriksi digunakan teknik elektroforesis. Arti kata “elektroforesis” mengarah ke electromotive force (EMF) yang digunakan untuk mendorong atau menarik molekul-molekul di dalam matriks gel dengan cara meletakkan molekul-molekul yang ingin diseparasi itu ke dalam sumur-sumur di dalam gel dan mengalirkan arus listrik ke dalamnya. Molekul-molekul akan bergerak di dalam matriks dengan kecepatan yang berbeda-beda dan akan mengarah ke katoda jika molekul itu bermuatan positif dan mengarah ke anoda jika molekul itu bernuatan negatif. Gel pada elektroforesis adalah suatu matriks yang berfungsi untuk menseparasi molekul-molekul yang bersangkutan. Pada sebagian besar kasus, gel yang digunakan untuk elektroforesis merupakan crosslinked polymer yang komposisi dan porositasnya disesuaikan berdasarkan berat dan komposisi sampel. Jenis gel yang sering digunakan adalah agarosa dan polyacrylamide. Pada percobaan ini, gel yang
digunakan adalah agarosa. Berikut adalah struktur dasar polimer linear dari agarosa :
Gambar 2 : Struktur gel Agarosa Elektroforesis gel merupakan teknik analisis yang penting dan sering dipakai dalam bidang biokimia serta biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi, yaitu memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis). Dalam elektroforesis, agarosa biasa digunakan untuk memisahkan DNA atau RNA berukuran besar (lebih dari beberapa ratusan basa). Adapun kemampuan gel untuk menseparasi fragmen-fragmen DNA dengan ukuran yang
berbeda-beda
terletak
pada
frictional drag (sentuhan atau interaksi antar sesuatu dengan yang lainnya). Elektroforesis
gel agarosa dapat digunakan untuk memisahkan molekul DNA yang bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik DNA akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan cara membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel ditambahkan larutan ethidium bromide dalam pembuatannya. EtBr yang berikatan dengan DNA di dalam gel agarosa akan berpendar ketika divisualisasi dengan lampu UV 254 nm. Hal ini dikarenakan radiasi sinar UV akan diserap oleh DNA dan energinya akan ditransmisikan ke EtBr sehingga EtBr yang berikatan dengan DNA dapat berpendar. Ketika medan listrik dinyalakan melalui gel, DNA yang bermuatan negatif bermigrasi dari anoda ke katoda. Tingkat laju migrasi dari DNA dapat diukur dari beberapa faktor yaitu : a.
Ukuran molekul DNA Semakin besar molekul DNA maka proses migrasi semakin lambat. Hal ini disebabkan karena DNA yang ukurannya besar sulit untuk menembus pori-pori gel agarose.
b.
Konsentrasi agarosa Semakin tinggi konsentrasi agarose maka laju migrasi semakin kecil karena konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan pori-pori gel semakin kecil.
c.
Konformasi DNA Konformasi DNA ada 3 yaitu superhelix sirkular(bentuk I), sirkuler terbuka (bentuk II) dan linier (bentuk III). Tingkat mobilitas dari ketiga bentuk ini berbeda-beda tergantung dari kondisi yang ada (tegangan listrik, kekuatan ionik, buffer,dsb). Pada beberapa kondisi, DNA superhelix bisa bermigrasi lebih cepat daripada DNA sirkuler. Pada kondisi lain bisa sebaliknya. Etidium bromide juga berpengaruh pada konformasi DNA, makin banyak etidium bromide yang ditambahkan, besar DNA superhelix meningkat sehingga laju migrasi menurun. Pada titik kritis, penambahan EtBr menyebabkan DNA superheliks berada pada kecepatan minimum. Jika ditambah lagi maka DNA superhelix dapat menjadi kompak dan mobilitasnya meningkat drastis. Bentuk II dan III yang berubah atau menurun secara bertahap seiring proses penetralan muatan DNA oleh eter.
d.
Tegangan yang digunakan Pada tegangan rendah, laju pergerakan fragmen DNA linier harus sesuai dengan tegangan yang diberikan. Oleh karena itu ketika medan listriknya meningkat, maka pergerakan d DN berukuran besar akan meningkat dengan cepat. Namun jika tegangannya ini dinaikkan maka pemisahannya semakin tidak efektif. Untuk mendapatkan fragmen DNA yang lebih besar dari 2 kb maka harus menggunakan tegangan tidak lebih dari 5 V/cm.
e.
Arah medan listrik Molekul DNA yang lebih besar dari 50-100kb panjangnya akan berpindah dengan laju yang sama jika tegangan listriknya selalu konstan. Jika tegangan listrik diubah secara periodik, DNA dipaksa untuk mengubah jalur. Karena molekul DNA berukuran lebih besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk kembali ke bentuk semula. PFGE dapat digunakan untuk memisahkan sejumlah besar DNA.
f.
Komposisi basa dan suhu Kelakuan DNA ketika di elektroforesis pada gel agarosa tidak terlalu dipengaruhi oleh komposisi basa DNA atau suhu ketika gel tersebut bergerak. Pada gel agarosa, kecepatan pergerakan fragmen DNA yang berbeda ukuran relatif tidak berubah antara 4 – 300C. Secara umum gel agarosa bergerak pada suhu ruang. Walaupun begitu gel yang berisi kurang dari 0.5% agarosa, gel agarosa yang mudah meleleh pada suhu rendah cenderung mudah rusak dan gel tersebut akan memiliki hasil terbaik pada 40C ketika gel lebih kuat.
g.
Adanya Intercalating Dyes Etidium bromide, pewarna flourosence yang digunakan untuk mendeteksi DNA pada agarose dan gel polyacrylamide dapat mengurangi mobilitas elektroforesis dari DNA linear sekitar 15%. Pewarna tersebut melekat antara pasangan basa, memperpanjang lengan dari DNA linear dan DNA sirkuler yang terbuka dan membuatnya semakin kaku.
h.
Komposisi buffer elektroforesis Mobilitas elektroforetik dari DNA dipengaruhi dari komposisi dan kekuatan ionik dari buffer elektroforesis. Tanpa adanya ion, konduktifitas listrik kecil dan migrasi DNA sangatlah pelan. Dalam buffer dengan kekuatan ionik yang kuat, konduktifitas listrik sangat efesien dan sejumlah besar panas terbentuk. Dalam kasus terburuk maka gel akan meleleh dan DNA terdenaturasi.
III. Alat dan Bahan Alat- alat yang digunakan : •
Tabung eppendorf
•
Parafilm
•
Tip putih
•
Satu set peralatan elektroforesis horisontal
•
Mikropipet 1-10 μL
•
Satu set peralatan pembuatan gel agarosa
•
Erlenmeyer
•
Isolasi
•
Mikrosentrifuge
•
Beaker glass
Bahan – bahan yang digunakan: •
Sampel DNA plasmid
•
ddH2O
•
RE, BSA, TAE buffer
•
Enzim Restriksi (Pst I dan Hind III)
•
EtBr
•
EDTA
•
Marker
IV. Cara Kerja 1. Membuat mastermix dengan komposisi sebagai berikut: Single Digest (pemotongan dengan salah satu enzim, Pst I atau Hind III) Sampel A: Sampel B: ddH2O 15,5µl ddH2O 14,5µl Buffer 2 µl Buffer 2 µl Enzim 0,5 µl Enzim 0,5 µl Double digest (pemotongan dengan kedua enzim, Pst I + Hind III) Sampel A:
Sampel B:
ddH2O 15µl Buffer 2 µl Enzim 0,5 µl 2. Menambahkan sampel DNA plasmid.
ddH2O Buffer Enzim Untuk sampel
14µl 2 µl 0,5 µl A, ditambahkan DNA plasmid 2µl,
sedangkan untuk sampel B, ditambahkan DNA plasmid 3 µl. 3. Menginkubasi campuran dalam water bath 37 oC selama 1 jam. 4. Setelah inkubasi, melakukan elektroforesis agarosa untuk melihat pola hasil potongannya.
V. Hasil Percobaan Tidak muncul band
Pst I Hind III
marker
campuran
Band dari kelompok 7
Well Marker Pst I Hind IIICampuran
1 2
1 2 12
3
4
VI. Perhitungan
cm
panjang
log bp
(x) 2.25 2.4 2.6 2.8 3
(bp) 10000 8000 6000 5000 4000
(y) 4 3.90309 3.77815 3.69897 3.60206
3.2 3.4 3.65 4 4.5 5.25 5.8 6.5 7.5
3500 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250
3.54407 3.47712 3.39794 3.30103 3.17609 3 2.87506 2.69897 2.39794
A = 4.522183884 B = -0.29049316 R2 = 0.975531886 Persamaan linear : Y = 4.522183884 + (-0.29049316)x Jarak migrasi potongan plasmid (cm) kelompok 7 Enzim
Pst I
Hind
Band 1 Band 2 Band 3 Band 4
2.8 3.35
III 2.8 3.95
Campuran 3.35 3.95 4.1 6.0
Setelah dimasukkan ke dalam persamaan linear Ukuran plasmid (bp) Pst I 5114.498 3540.233
Hind III 5114.498 2369.932
Campuran 3540.233 2369.932 2143.689 601.485
Jarak migrasi potongan plasmid (cm) kelompok kami Enzim
Pst I
Hind III
Campuran
Band 1 Band 2 Band 3 Band 4
2.8 3.35
2.8 3.95
-
Setelah dimasukkan ke dalam persamaan linear Ukuran plasmid (bp) Pst I 5114.498 3540.233
Hind III 5114.498 2369.932
Campuran -
VII. Pembahasan Pada percobaan kali ini praktikan ditujukan agar dapat menentukan peta retriksi dari DNA plasmid. Peta restriksi adalah gambaran struktural informasi DNA yang diperoleh melalui proses pemotongan DNA tersebut dengan menggunakan enzim restriksi. Peta restriksi biasanya dibuat dengan menggunakan lebih dari 1 jenis enzim restriksi (Mapping Multiple Cutters). Enzim restriksi yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah Pst I dan Hind III Berdasarkan dari data hasil perhitungan yang kami dapat, dapat ditentukan band-band hasil pemotongan dari masing-masing enzim restriksi ataupun campuran keduanya, yaitu: Pst I
5114.498 bp
Hind III
Campuran
5114.498 bp
3540.233bp
3540.233bp 2369.932 bp
2369.932 bp 2143.689 bp
601.485 bp
Berikut adalah gambar dari peta retriksi DNA plasmid sampel A : Pst I
2369.932 bp
3540.233 bp
Hind III 601.485 bp Pst I
2143.689 bp Peta restriksi DNA plasmid sampel A ini
Hind III dibuat berdasarkan hasil percobaan dari
kelompok 7, karena data hasil percobaan yang kami dapat berbeda pada well ke-3 dimana tidak ditemukan adanya band sama sekali. Untuk well ke-1 dan ke-2 pemisahan band sudah bisa dikatakan sama.. Tidak ditemukannya band pada well ke-3 ini bisa disebabkan oleh konsentrasi atau jumlah dari DNA plasmid yang terlalu sedikit, sedikitnya jumlah DNA plasmid bisa disebabkan karena kesalahan sewaktu load ke dalam well (ada sebagian yang tertarik lagi ke micropipet, ataupun ada juga yang keluar dan tersebar di TAE buffer di luar well). Lalu pada sampel B juga tidak ditemukan adanya band-band hasil pemotongan dari enzim restriksi, baik pada enzim restriksi Pst I, Hind III, maupun campuran keduanya. Hal ini juga bisa disebabkan sedikitnya jumlah DNA plasmid karena kesalahan praktikan dalam load sampel. Selain itu bisa juga disebabkan adanya star activity akibat kesalahan praktikan dalam memipet sehingga praktikan memasukkan enzim endonuklease restriksi dalam jumlah berlebih, hal ini menyebabkan plasmid terpotong-potong menjadi ukuran yang lebih kecil dari seharusnya sehingga dapat bergerak lebih cepat dibandingkan marker nya (keluar dari gel agarosa). Kemungkinan penyebab lainnya bisa dikarenakan rusak atau terdegradasi nya DNA oleh nuklease, ataupun bisa juga disebabkan oleh pada saat diinkubasi pada suhu 370C ada sebagian air dalam buffer yang menguap sehingga menyebabkan kekuatan ionik dari buffer menurun. Selain itu semua, juga ada hal yang perlu diperhatikan yaitu tegangan saat elektoforesis tidak
boleh terlalu tinggi dan waktu elektroforesis tidak boleh terlalu lama, karena itu semua juga turut mempengaruhi ada atau tidak nya band pada hasil pengamatan. VIII. Kesimpulan Peta restriksi adalah gambaran struktural informasi DNA yang diperoleh melalui proses pemotongan DNA tersebut dengan menggunakan enzim restriksi. Peta restriksi biasanya dibuat dengan menggunakan lebih dari 1 jenis enzim restriksi (Mapping Multiple Cutters). Enzim restriksi yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah Pst I dan Hind III. Untuk pembuatan peta restriksi dapat digunakan suatu metode di mana pemotongan dilakukan dengan enzim secara individu dan secara campuran. Dengan demikian kita akan mendapatkan band-band hasil pemotongan enzim secara individu dan data pemotongan dari campuran enzim. Potonganpotongan band tersebut yang nantinya akan disusun menjadi peta restriksi, berikut gambar peta restriksi DNA plasmid sampel A : Pst I
2369.932 bp
3540.233 bp
Hind III 601.485 bp Pst I
2143.689 bp
Hind III
Daftar Pustaka 1. [Anonim,2006] http://www.britannica.com/EBchecked/topic/463593/plasmid (diakses 25
September 2010) 2.
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/E/Enzymes.html#lysozym (diakses 25 September 2010)
3. http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Restriction_Map/restriction_map.ht
m (diakses 25 September 2010) 4. Hirma, Ratna Dwi; Hariyati; Yuniati, Afrina. (2008).
http://23bios1unsoed.files.wordpress.com/2008/11/k04-td-04-b1j006019.pdf (diakses
27
September 2010) 5. http://biotech.biology.arizona.edu/labs/DNA_isolation_plasmid.html (diakses 27 September
2010). 6. http://www.chembuddy.com/?left=pH-calculation&right=pH-buffer-capacity
(diakses 27
September 2010). 7. http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Restmap.html (diakses 27 September 2010). 8. http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/cuteffects.html (diakses 27
September 2010). 9.
http://www.cinnagen.com/Loading_Buffer.htm (diakses 27 September 2010).
10. Fatchiyah,Ph.D, Gel Elektroforesis (http://inherent.brawijaya.ac.id/biomol/materi/midterm/GEL%20ELEKTROFORESISfat.doc) (diakses 27 September 2010).
