Microbiologie
Efectuati si colorati un frotiu din cultura bacteriana/produs patologic (colectie purulenta) Se folosesc lame de sticla noi, dezinfectate, degresate cu alcool, uscate si flambate. Efectuarea frotiurilor se face cu ansa. Se urmareste obtinerea unui frotiu subtire, intr-un singur strat. In cazul efectuarii unui frotiu din produs patologic, acesta poate fi solid sau lichid. Daca este solid, precum o colectie purulenta, se foloseste ansa bacteriologica pentru incarcarea cu produs a lamei. In caz de produs patologic lichid, intai se centrifugheaza si apoi se recolteaza din sediment si se realizeaza frotiul. Etalarea se mai poate realiza si cu pipeta. Tehnica efectuarii frotiurilor cuprinde mai multe etape: 1. Etalare – Se foloseste o lama de sticla noua, degresata, dezinfectata si uscata. Ansa bacteriologica se arde pana la incandescenta, apoi se incarca bucla cu produs sau cultura bacteriana si se descarca pe suprafata lamei, in centrul ei, dupa care se etaleaza produsul sub forma de spirala, in sens centrifug. 2. Uscare – Se aseaza lama cu fata in sus, langa becul de gaz. Uscarea se face la temperatura camerei. Aceasta nu se forteaza, deoarece uscarea brusca la temperatura ridicata altereaza structurile celulare bacteriene. 3. Fixare – Se face dupa ce preparatele sunt uscate. Aceasta etapa are doua roluri, de a mari aderenta preparatului pe suprafata lamei si de a pastra intacta structura celulara a microorganismului. Prin fixare are loc coagularea proteinelor. Fixarea se realizeaza fie prin caldura (trecerea lamei prin flacara), fie utilizand fixatori chimic (ex.: alcool metilic sau etilic, amestecuri alcool-eter sau alcool-fenol). 4. Colorare – Prin colorarea frotiurilor au loc interactiuni fizico-chimice intre coloranti si componentele celulare. Rezultatul Rezultatul colorarii depinde de structura chimica a colorantului, dar si de compozitia chimica a componentelor structurale celulare, precum si de natura solventilor, temperatura la care se face colorarea, si valoarea pH- ului. Printre colorantii uzuali se numara cristalul violet, violetul de gentiana, fuxina bazica, albastrul de metilen, verdele malachit sau albastrul de toluidina. Exista mai multe metode de colorare – simple, duble sau speciale (pentru structuri precum spori, capsule, cili, flageli).
Colorati prin metoda Ziehl-Neelsen un frotiu din sputa sp uta Aceasta metoda de colorare se foloseste pentru evidentierea germenilor acido-alcoolo-rezistenti care apartin genului Mycobacterium, anume speciile tuberculosis, avium, bovis si leprae. Principiu – Se bazeaza pe rezistenta Mycobacteriilor la decolorarea cu acizi minerali diluati si alcool, dupa colorare cu fucsina fenicata fenicata Ziehl. Mecanismul colorabilitatii este urmatorul urmatorul – patrunderea fucsinei
fenicate Ziehl in interiorul bacteriei si legarea colorantului de acidul micolic (din invelisul peptidoglicolic) al peretelui celular prin legaturi stabile confera suprafetei celulei caractere hidrofobe. Se pare ca Mycobacteriile patogene sunt mai bogate in acid micolic (mai rezistente la decolorare, deci mentin culoarea rosie pe frotiu) decat cele nepatogene- saprofite (contin putin acid micolic in perete, nu rezista la decolorare, apar albastri pe frotiu – ex.: Mycobacterium smegmatis). Reactivi:
Fucsina fenicata Ziehl 1% Decolorant combinat acid clorhidric 3mL - alcool etilic 96%/97mL Albastru de metilen 1
Microbiologie Tehnica de lucru – Frotiul uscat si fixat la caldura se acopera cu fucsina fenicata Ziehl 1%, timp de 10
minute. In acest interval de timp, se incalzeste dosul lamei cu flacara becului Bunsen pana la emisia de vapori (nu se fierbe!!!), de 3 ori. Daca se evapora fucsina, se poate completa. Apoi se raceste lama la temperatura camerei. Dupa racire se spala cu apa de la robinet, se decoloreaza cu amestec acid-alcool timp de 2-3 minute si se recoloreaza din nou prin acoperirea frotiului cu albastru de metilen 1%, timp de 1 minut. Ulterior lama se spala inca o data cu apa de la robinet, se usuca si se examineaza la microscopul optic, utilizand obiectivul cu imersie. Interpretare – Bacilii acido- alcoolo- rezistenti (BAAR) apar rosii pe fondul albastru. Ceilalti germeni si
elementele tisulere (celule epiteliale, PMN, limfocite, fibrina) apar colorate in albastru. La un frotiu din sputa unui pacient cu tuberculoza bacilii sunt dispusi in funie rasucita, datorita unui factor de virulenta numit cord-factor.
Insamantati un produs patologic pe o placa Petri cu geloza in vederea izolarii germenilor Insamantarea si izolarea germenilor are drept scop obtinerea unor populatii microbiene suficiente cantitativ pentru identificare biochimica sau antigenica, evitarea contaminarii produsului cu agenti straini si izolarea fiecarei tulpini microbiene. Insamantarea se realizeaza in conditii de riguroasa sepsie. Ansa bacteriologica se sterilizeaza la becul de gaz pana la incandescenta. In cazul unui produs patologic ce a fost transportat la laborator intr-un recipient steril, se scoate dopul acestuia, se trece gatul recipientului prin flacara si se ia cu ansa o portiune de inocul, apoi se flambeaza din nou recipientul si se inchide dopul. Daca produsul patologic a fost prelevat cu un tampon steril, atunci se descarca de pe acesta direct pe placa Petri prin rasucire. In ambele cazuri, urmatoare etapa este de dispersie a produsului patologic. Cu ansa incarcata se t raseaza pe suprafata mediului striuri ce apar sub forma unui poligon neinchis cu 5-6 laturi. Dupa descarcarea fiecarei laturi, ansa se sterilizeaza prin incalzire pana la incandescenta si se incarca din nou cu produs. In locul ultimei laturi, se traseaza linii in zig-zag de la marginea placii Petri spre centru, cu scopul de a se obtine in aceasta zona colonii izolate. Ulterior, in functie de aspectul coloniei izolate se pot observa caracterele de cultura ale speciei respective, inclusiv daca este virulenta sau nu.
Caracterizati comportamentul biochimic al unei enterobacterii insamantata pe medii diferentiale Familiei enterobacteriilor ii apartin genurile Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Yersinia si Proteus.Caracterele biochimice servesc la identificarea bacteriilor, in functie de unele enzime pe care le detin. Caracterul biochimic reprezinta comportamentul metabolic al unor bacterii in functie de mediul pe care au fost insamantate.
2
Microbiologie Medii multitest:
TSI (three sugars and iron) – Panta contine lactoza si sucroza. Fermentarea unuia dintre aceste doua zaharuri (de obicei lactoza) determina virarea culorii din rosu in galben, datorita acidifierii mediului. Coloana contine glucoza si tiosulfat de sodiu ca sursa de sulf. Fermentarea glucozei determina producerea de CO 2, ce se evidentiaza sub forma bulelor, iar producerea de H 2S determina virarea culorii coloanei spre negru. MIU (mobilitate, indol, uree) – Dupa o perioada de incubare de 24 ore, turbiditate in jurul liniei de intepare indica mobilitatea speciei bacteriene respective. Producerea ureazei, ce descompune ureea, determina virarea culorii mediului din galben in rosu-violet. Productia de indol poate fi pusa in evidenta utilizand cateva picaturi de reactiv Kovacs sau o hartie de filtru imbibata cu acesta si plasata in eprubeta. Aparitia culorii violet pe hartia de filtru sau sub forma unui inel la suprafata mediului este un rezultat pozitiv.
Mediu diferential Simmons Citrate – Contine citrat si ioni de amoniu. Bacteriile capabile de a utiliza citratul ca unica sursa de carbon si ionii de amoniu ca unica sursa de azot determina alcalinizarea mediului, cu virarea culorii de la verde la albastru. Mediu diferential AABTL (albastru de brom timol si lactoza) – Fermentarea lactozei determina acidifierea mediului si virarea culorii de la albastru la galben.
Genul Escherichia Salmonella Shigella Klebsiella (pneumoniae) Yersinia Proteus Enterobacter
Fermentarea lactozei +
TSI Producerea de gaz +
+
+ +
+
+ +
MIU Producerea Mobilitate Producerea Descompunerea de H2S de indol ureei +/- (depinde + de tulpina) + + +/- (sonnei) + + -
+ +
+ +/-
Simmons Utilizarea citratului -
+ +/-
Descrieti aspectul culturii bacteriene pe medii solide; semnificatie In functie de dimensiuni, contur, consistenta, transparenta, aspectul suprafetei, pigment, aderenta la mediu etc., coloniile bacteriene pot fi:
Colonii tip S (smooth) – rotunde, bombate, lucioase, cu suprafata neteda si marginile regulate. Sunt caracteristice bacteriilor patogene. Colonii tip R (rough) – plate, uscate, cu suprafata rugoasa si marginile neregulate, aderente de mediu, aglutineaza spontan. Sunt caracteristice pentru germeni degradati, cu modificari antigenice, de virulenta. Exista trei specii bacteriene care fac exceptie, crescand sub forma de
3
+ +
+/-
Microbiologie
colonii R pentru tulpini patogene: Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae si Bacillus anthracis. Colonii tip M (mucoide) – foarte mari, lucioase, cu suprafata neteda si aspect uleios,. Sunt caracteristice pentru bacteriile incapsulate. Colonii untoase – rotunde, bombate, mate, cu suprafata neteda, marginile regulate si consistenta cremoasa. Sunt uneori pigmentate si sunt caracteristice pentru levuri. Colonii pufoase – retea de filamente (hife) aeriene, caracteristice fungilor filamentosi
Tot pe medii solide se poate observa fenomenul de invazie – cresterea se exprima printr-un strat continuu, sub forma unor valuri succesive. Fenomen este caracteristic pentru Proteus spp.
Antibiograma difuzimetrica – principiu, interpretari Principiu – Un inocul standardizat al tulpinii testate este insamantat intr-un gradient discontinuu de
concentratii ale medicamentului antimicrobian realizat fie in placi cu mediu agarizat, fie in mediu cu bulion nutritiv. Dupa incubarea adecvata este urmarita concentratia minima inhibitorie(CMI). Metoda – Pe mediul solid (ex.: agar Müller-Hinton) se insamanteaza tulpina bacteriana care urmeaza a fi testata. Acest procedeu se realizeaza cu ajutorul tamponului de vata steril imersat in suspensia bacteriana etalonata. Se inlatura excesul de lichid prin presare si se descarca tamponul in striuri paralele pe toata suprafata mediului succesiv in trei directii. O alta metoda este cea prin inundare a placii si extragerea excesului cu o seringa sterila. Apoi se lasa placile timp de 3-5 minute pentru absorbtia inoculului. Urmeaza uscarea placilor insamantate la temperatura camerei timp de 5-15 minute. Discurile se depun pe placa in momentul cand nu mai exista lichid pe suprafata mediului. Discurile cu antibiotic se depun la o distanta de 15 mm de marginea placii si se pastreaza o distanta de 30 mm intre centrele a 2 discuri vecine. Dupa repartizarea discurilor se incubeaza imediat la 37oC timp de 16-18 ore. Antibiograma difuzimetrica Kirby-Bauer este standardizata conform CLSI/ EUCAST. Apoi se masoara zona de inhbitie, luand in calcul si diametrul discului. Dupa masurarea zonei de inhibitie se compara diametrele citite cu diametre standard in functie de antibiotic, cantitatea de antibiotic din comprimat, specia bacteriana testata, din tabele standard. Interpretare – Rezultate calitative: Sensibil - categoria implica faptul ca infectia poate fi tratata cu agentul antimicrobian, in doza indicata tipului de infectie Intermediar – include agenti antimicrobieni cu CMI apropiate de nivelurile serice obtinute in urma administrarii dozelor terapeutice. Astfel, antibioticul respectiv poate fi eficace daca se concentreaza la locul infectiei sau daca se poate administra in cantitati mai mari decat in mod obisnuit. Rezistent – tulpinile nu sunt inhibate de nivelurile de antibiotic realizate dupa administrarea dozelor terapeutice. Astfel, acestea nu au aplicabilitate clinica.
Standardizarea testelor: Inoculul – Acesta trebuie sa aiba o turbididate corespunzatoare 0,5 unit. McFarland (densitatea
trebuie sa fie de 150 000 000/ml). Se face comparatie fata de un etalon sau se masoara prin spectrofotometrie. Se realizeaza incubare timp de 2-6 ore la 37oC. Substantele antimicrobiene – Acestea sunt alese dupa standardele a una din urmatoarele doua asociatii, CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) sau EUCAST (European Committee on Antibiotic Susceptibility). Substantele trebuiesc pastrate la 2-8 oC sau congelate. Mediul – Acesta trebuie sa fie agar Müller-Hinton, la un pH de 7,2-7,4, steril, turnat in placi Petri perfect plate, intr-un strat de 4mm grosime. Mediul poate fi conservat maxim 7 zile. 4
Microbiologie
Reactia ASLO – principiu, interpretare Principiul reactiei – Este o reactie antigen-anticorp.Anticorpii antitoxici antistreptolizina O sunt pusi in
evidenta pentru diagnosticul infectiilor streptococice. Streptolizina O este o enzima produsa de streptococi, care lizeaza hematiile. Punerea in contact a anticorpilor din serul pacientilor ASLO cu streptolizina O duce la neutralizarea activitatii sale hemolitice. In acest scop, intr un sir de eprubete se pun ser de cercetat in dilutii succesive, streptolizina O si hematii, folosite ca indicator. In practica se fac 3 determinari si se urmareste curba anticorpilor. Se folosesc 5 t uburi care contin cantitate standard de streptolizina O, hematii si dilutii din serul pacientului: 1/100, 1/250, 1/500, 1/800, 1/1250. Interpretare – Reactia negativa este data de prezenta hemolizei, indicand absenta anticorpilor ASLO,
astfel ca ciclul litic al SL O asupra hematiilor nu este anihilata. Reactia pozitiva este evidentiata prin absenta hemolizei si indica prezenta anticorpilor ASLO (se formeaza butoni de hematii). Ultima eprubeta unde nu apare hemoliza indica prezenta anticorpilor ASLO. Normal tr ebuie sa fie mai mic de 200 U ASLO. ASLO se foloseste pentru diagnostic si pentru monitorizarea tratamentului. Majoritatea bolnavilor prezinta o crestere a tritrului antristreptolizinei O (ASLO), iar reactia de punere in evidenta este ASLO. Titrurile de pana la 200 de U ASLO/mL de ser sunt considerate normale. Valoarea crescuta a ASLO se mentine in mod normal 3-5 saptamani de la debutul infectiei streptococice. Persistenta anticorpilor in titruri inalte timp indelungat sugereaza hipersensibilitate la antigenele streptococice, urmata de instalarea complicatiilor poststreptococice. Titrurile normale ASLO se situează între 166-200 u/ml. Ele variaza in functie de varsta, arie geografica,
sezon. Astfel, sub varsta de 14 luni o infectie streptococica nu determina cresterea ASLO, iar sub 2 ani cresterile raman nesemnificative. In infectiile cutanate titrul ASLO este normal. Titrul ASLO > 200 u/mL da informaţii despre:
O infectie streptococica in antecedentele recente ale pacientului, cand se inregistreaza creşterea in dinamica a titrului. Dupa o angina streptococica, titrul ASLO creste in 2-3 saptamani, atinge nivelul maxim la 5 saptamani si scade apoi lent, pana la 6-12 luni (în cazul în care boala se vindecă).
Instalarea sau agravarea unei complicatii poststreptococice Eficienţa tratamentului – Antibioticoterapia instituita precoce face ca titrul ASLO sa creasca mai putin, iar corticoterapia determina revenirea mai rapida la valori normale. In infectiile streptococice netratate, titrurile ating valori maximale (pana la 2500 u/mL). Starea de purtator sanatos
Reactia de aglutinare pe lama – Salmonella, Shigella Principiu – Reactia de aglutinare pe lama este o reactie de tip antigen-anticorp a carei rol este de a
permite identificarea antigenica a unor izolate cu semnificatie clinica, prin confirmarea genului si speciei. Metoda – Pe o lama de sticla curata si degresata se pune o picatura de solutie ce contin anticorpi
specifici genului sau speciei a carui prezenta se doreste evidentiata. Pe urma se preleva cu ansa bacteriologica dintr-o colonie izolata, suspecta de a fi microorganismul in cauza, si se depune in picatura
5
Microbiologie de solutie, dupa care se amesteca usor. Lama se roteste de cateva ori, pentru a facilita amestecarea. Dupa un minut se observa si se interpreteaza rezultatul. Interpretare – Testul pozitiv este dat de aglutinare evidenta (formarea de grunji in suspensie clara) in
intervalul de 1 minut. Lipsa aglutinarii reprezinta testul negativ. Salmonella – Identificarea se face in functie de antigenul somatic O, alcatuit din fractiuni antigenice. Prin
studiile de cross-absorbtie s-au individualizat 67 de structuri antigenice diferite care sunt folosite pentru identificare serologica. Microorganismele din genul Salmonella prezinta si antigene flagelare H, proteine labile termic situate la nivelul cililor. Se cunosc peste 50 de antigene H care pot de asemenea sa fie subtipate ca antigene partiale. Asadar, exista peste 2300 serotipuri diferentiate pe baza antigenelor somatice O şi flagelare H.Deoarece unele serotipuri de Salmonella pot trece de la fenotipuri mobile la fenotipuri imobile, acestea pot exprima antigene H diferite. In functie de aceste doua tipuri de antigene a fost creat sistemul de clasificare Kaufman and White. Shigella – Antigenul somatic O sta la baza impartirii îin 4 grupe antigenice si subdiviziunii acestora în
serotipuri:
Grupul A: Shigella dysenteriae (12 serotipuri) Grupul B: Shigella flexneri (6+2 serotipuri) Grupul C: Shigella boydii (18 serotipuri)
Grupul D: Shigella sonnei (1 serotip care prezintă 2 faze antigenice S şi R)
Astfel, in cadrul reactiei de aglutinare pe lama pentru identificarea serotipului de Shigella, se utilizeaza initial seruri polivalente, pentru identificarea grupului, apoi seruri monovalente, pentru identificarea serotipului din cadrul grupului.
Testul ELEK – principiu, interpretare Principiu – Este o metoda ce permite depistarea capacitatii toxigene a unei specii de Corynebacterium dyphteriae. In cazul in care tulpina este toxigena, toxina va difuza in mediu, iar dupa unirea cu anticorpul
antitoxina, complexele Ag-Ac vor da nastere unor linii de precipitare. Metoda – Intr-o cutie Petri ce contine un mediu simplu se asaza o hartie de filtru imbibata in solutie ce
contina anticorpi antitoxina difterica. Dupa doua ore, timp in care anticorpii difuzeaza in mediu, se insamanteaza in mediu, perpendicular pe hartia de filtru, o tulpina de C.d. toxigena, ce serveste drept martor pozitiv, una de C.d. netoxigena, ca martor negativ, si tulpina de cercetat, formandu-se astfel o serie de striuri perpendiculare pe hartia de filtru. Placa Petri se incubeaza la 37 oC timp de 48 ore si se urmareste zilnic aparitia precipitatului. De-a lungul liniilor de insamantare apare cultura bacteriana. Interpretare – Din cultura de C.d. toxigena, toxina difterica difuzeaza in mediu. Unirea dintre antigen si
anticorp duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipita, iar in mediu vor aparea linii de precipitare in unghiurile dintre cultura si hartia de filtru. In cazul in care apar linii de precipitare in unghiurile dintre cultura de cercetat si hartia de filtru, respectiva tulpina este toxigena. Reactia va fi negativa pentru martorul negativ si tulpinile de cerecetat netoxigene. 6
Microbiologie
Reactia de fixare a complementului Principiu – Reactia de fixare a complementului se bazeaza pe proprietatea sistemului COMPLEMENT de
a se fixa pe complexul imun Ag-Ac. Se evidentiaza prezenta unor anticorpi specifici in serul pacientului prin punerea serului in contact cu antigene cunoscute, elemente ale sistemului complement si un indicator de hemoliza. Tehnica – Serul de cercetat se va mentine 30 minute la 56°C, pentru inactivarea complementului propriu.
Reactia de fixare a complementului are loc in 2 etape:
In prima etapa se pun in reactie complementul, serul de cercetat si antigenul cunoscut. Exista doua posibilitati: o In serul de cercetat exista anticorpi specifici, rezultand un complex Ag-Ac pe care se va fixa complementul o In serul de cercetat nu exista anticorpi specifici, nu se formeaza complexul Ag-Ac, iar complementul ramane liber In a doua etapa se introduce in reactie sistemul hemolitic indicator (format din hematii si anticorpi anti-hematie). Din nou, exista 2 rezultate posibilite: o Complementul nu este liber, nu are loc hemoliza o Complementul se fixeaza pe sistemul hemolitic, lizeaza hematiile si observam aparitia hemolizei
Interpretare – Initial se verifica rezultatele aparute pentru martori. In t ubul martor pentru complement
trebuie sa fie hemoliza, la fel ca si in tubul martor pentru ser sigur negativ. In tuburile martor sigur pozitiv si martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie sa fie hemoliza. In tuburile cu serul de cercetat, daca apare hemoliza, inseamna ca nu exista Ac iar testul este negativ (lichidul din tub va avea un aspect rosu, limpede). Testul este pozitiv atunci cand in tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliza, iar hematiile se depun formând un “buton” in partea inferioara a tubului (in serul de cercetat exista anticorpi).
Exudatul faringian – mod de recoltare, insamantare, interpretare Recoltare – Recoltarea trebuie facuta cat mai aproape de debutul bolii, inaintea administarii de
antibiotice. Exudatul faringian se recolteaza dimineata, inainte ca pacientul sa manance, inainte de a se spala pe dinti sau de a face gargarisme cu substante antiseptice. Se respecta conditiile de asepsie si antisepsie in recoltarea produsului patologic, folosindu-se echipamentul de protectie pentru prevenirea contaminarii personalului de laborator. Se deprima baza limbii cu un apasator steril, dupa care se sterg cu tamponul amigdalele si peretele posterior al faringelui, vizand zonele inflamate sau ulcerate si depozitele purulente. Cand exista membrana falsa, aceasta trebuie desprinsa la periferie si apoi se tamponeaza mucoasa subiacenta. Atat la introducerea cat si la scoaterea tamponului din gura se evita atingerea cu baza limbii sau palatul moale. Se recolteaza doua tampoane, unul pentru efectuarea frotiului si unul pentru insamantarea pe mediu de cultura.
7
Microbiologie Transport – Tamponul de exudat faringian trebuie examinat in maxim 3 ore de la recoltare. Daca nu se
poate respecta acest termen, atunci este necesara imersia si transportul tamponului in bulion de conservare. Insamantare – Se insamanteaza probele pe mediu cu geloza sange. Se ruleaza toate fetele tamponului
pe un cardan al placii si se epuizeaza apoi inoculul cu ansa bacteriologica in celelalte trei cadrane. Prin inteparea mediului cu ansa la sfarsitul epuizarii fiecarui cadran se creeaza conditii microaerofile care protejeaza de oxidare streptolizina O. Se incubeaza aerob, timp de 24 ore la 37oC, cu prelungirea timpului la 48 ore daca la prima citire lipsesc coloniile beta hemolitice. Interpretare – Se examineaza placile si se urmaresc coloniile mici (0.5-1mm in diametru), rotunde,
bombate, lucioase, cu margini regulate, inconjurate de o zona larga de β-hemoliza, acestea fiind colonii de streptococi patogeni β-hemolitici, producatori de streptolizina S (oxigen-stabila). In absenta coloniilor β-hemolitice se urmareste cu atentie zona de hemoliza din jurul punctelor de intepare a mediului. Daca la acest nivel constatam hemoliza β se impune repicarea culturii din profunzimea intepaturii cu incubare anaeroba a culturii, deoarece poate fi o tulpina de S. pyogenes producatoare exclusiv de streptolizina O.
Urocultura – mod de lucru, insamantare, interpretare Recoltare – Se face toaleta locala cu apa si sapun. Urina se recolteaza in jet mijlociu intr-un recipient
steril cu gat larg. Se recolteaza prima urina de dimineata sau la cel putin patru ore de la ultima mictiune,inaintea inceperii tratament cu antibiotice. Transport – Se face in maxim o ora. Insamantare – Utilizand anse din platina calibrate 0,001mL si 0,01mL, dintr-un volum foarte mic de
suspensie bacteriana, se preleva si se epuizeaza pe doua placi cu mediu agarizat (una cu fiecare ansa), in scopul de a se dezvolta cat mai multe colonii posibil. Astfel, se poate realiza o aproximare economica si satisfacatoare clinic a numarului de bacterii in probele de urina. Suspensia se omogenizeaza cu grija, dupa care se imerseaza ansa si se executa cateva miscari pe verticala. Ansa se retrage cu viteza moderata. Descarcarea anselor se face in striu pe unul din diametrele placii, dupa care se epuizeaza imediat inoculul pe toata suprafata placii in striuri stranse perpendiculare pe striul de descarcare. Se folosesc medii MacConckey sau geloza sange. Se incubeaza placile aerob la 37 oC, iar a doua zi se numara coloniile de la suprafata placilor. Placa cu agar sange favorizeaza dezvoltarea unei game largi de bacterii, in special cele gram pozitive care sunt inhibitate pe mediul slab selectiv pentru bacilli gram negative sau tulpini exigente nutritiv. Se inregistreaza rezultatele dupa ordinul de marime al bacteriuriei. Interpretare – Cuantificarea numarului de colonii se face inmultind numarul de colonii de pe o placa cu
100 sau 1000, in functie de ansa utilizata. Pentru a se putea face interpretarea, identificarea izolatelor trebuie facuta pana la nivel de gen, si cand exista diferente semnificative ale senibilitatii la antibiotice intre speciile unui gen, de specie.
8
Microbiologie Izolarea unei singure bacterii, intr-un numar de peste 100.000 colonii (sau UFC – unitati formatoare de colonii) per mL, este un rezultat pozitiv pentru o infectie a tractului urinar la barbati. La femei, aceasta valoare are predictie pozitiva numai de 0.80, repetarea rezultatului pe a doua proba crescand predictia la 0.95. Izolarea unei singure bacterii in numar de 10.000 UFC/mL necesita epetarea analizei pentru bacili Gramnegativi, dar se considera pozitiv pentru levuri si stafilococi coagulazo-negativi. Izolarea a doua sau trei bacterii in numar de peste 100.000 UFC/mL necesita repetarea analizei. Un numar de 1.000 UFC/mL se considera rezultat negativ.
Coprocultura – mod de lucru, insamantare, interpretare Recoltare – Din scaunul emis spontan se recolteaza portiuni cu mucus si sange. Tamponul rectal, care se
introduce in sfincterul anal 1,5 cm, este utilizat in cazul suspiciunii infectiilor cu Salmonella sau Shigella. Sonda Nelaton se foloseste pentru a recolta de la nivelul colonului sigmoid. Recoltarea se face in recipient steril, iar cantitatea recoltata este de 5-10g. Transport – Se face in maxim o ora. Daca nu se poate respecta acest termen, se utilizeaza mediul special
de transport Cary-Blair, in care enterobacteriile patogene pot supravietui pana la 48 ore. In cazul Vibrio Cholerae, se foloseste apa peptonata alcalina ca si mediu de transport. Insamantare – Se face in trei medii diferite:
Bulion selenit MacConkey XLD sau ADCL
Se insamanteaza intotdeauna fragmentele sugestive ale materiilor fecale, anume cele cu mucus, puroi. Se insamanteaza initial pe bulionul selenit, mediu de imbogatire in special pentru Salmonella spp. Eprubeta se incubeaza timp de 18-24 ore la 35-37oC, iar a doua zi se insamanteaza din bulionul selenit pe MacConkey si ADCL. Interpretare:
MacConkey: Coloniile lactozo-pozitive – 1-3 mm, roz-rosii, cu sau fara halou opalescent, de tip S sau o M (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter) o Coloniile lactozo negative – 1-2 mm, necolorate, transparente (Salmonella, Proteus, Shigella) ADCL – Majoritatea bacteriilor lactozo-pozitive sunt inhibate. Pot aparea tardiv colonii de dimensiuni mici, rosii, de tip S. Daca se produce H2S, centrul coloniei este negru (Salmonella – toate speciile in afara de S. typhi ).
9
Microbiologie
Diagnosticul de laborator in infectiile produse de Staphylococcus aureus Examen microscopic – S. aureus = coci Gram-pozitivi, dispusi izolat, in perechi (diplo), in lanturi scurte
sau in gramezi (ciorchine – greaca: staphylos = ciorchine, kokkos = graunte). Asezarea in gramezi se datoreaza faptului ca diviziunea are loc in toate cele trei planuri, iar celulele fiice raman alipite. Sunt imobili (toti cocii sunt imobili) si nesporulati. Caractere de cultura:
Cresc pe medii uzuale, fiind neprententiosi la cultivare (non-fastidiosi) dar halofili Facultativ anaerobi pH de 7,0-7,5 Temperatura de 37oC (sunt mezofili) Cultura apare la 18-24 ore de la insamantare In bulion genereaza turbiditate uniforma In mediu geloza-sange, stafilococii se evidentiaza prin hemoliza totala (β) cumulata, iar S. Aureus se evidentiaza mai departe prin pigmentul caracteristic, auriu In medii selective cu caracter diferential isi manifesta proprietatile specifice: Mediu Chapman – prin concentratia crescuta de NaCl (7,5%), mediul selecteaza o stafilococii, iar S. aureus degradeaza manitolul, ceea ce duce la acidifierea mediului si virarea culorii indicatorului de pH (rosu fenol) spre galben o Mediu de geloza salina cu galbenus de ou (GGO) – prin concentratia crescuta de NaCl (7,5%), mediul selecteaza stafilococii, iar S. aureus degradeaza lecitina, ceea ce duce la formarea unui halou opac in jurul coloniilor In mediul geloza sange se formeaza colonii netede, tip ”S”, cu un diametru de 2-3mm, opace, bombate, netede, uneori lucioase, cu margini regulate, pigmentate galben-auriu. Datorita invechirii mediului si deshidratarii acestuia, colonii de bacterii patogene pot capata aspect rugos cu trecerea timpului. DDx intre stafilococi si streptococi se face in functie de tipul de hemoliza. Stafilococul formeaza colonii mari inconjurate de zone mici de hemoliza, fara margini bine definite, pe cand streptococul formeaza colonii mici inconjurate de zone mari de hemoliza, cu margini bine definite.
Caractere biochimice:
Testul catalazei – Se efectueaza pe placa. Se pune o picatura de apa oxigenata pe placa, iar apoi
in aceasta se depune un inocul prelevat cu ansa bacteriologica dintr-o colonie izolata. Reactia pozitiva va determina formarea de bule. Testul catalazei este folosit ca DDx intre stafilococi, care sunt cu totii catalazo-pozitivi, si streptococi, care sunt catalazo-negativi. Testul coagulazei – Se poate efectua in eprubeta sau pe placa. In eprubeta se pune plasma, iar pe placa se pune o picatura de plasma. Pe urma se depune un inocul prelevat cu ansa bacteriologica dintr-o colonie izolata. In ambele cazuri, reactia pozitiva va determina formarea unui cheag. S. aureus este coagulazo-pozitiv si se diferentiaza de celelalte specii ale genului Staphylococcus prin producerea unei coagulaze libere. Coagulaza este o proteina extracelulara 10
Microbiologie
ce se combina cu protrombina gazdei, formand un complex numit staphylotrombina, care transforma fibrinogenul solubil in fibrina insolubila ce formeaza o r etea in jurul bacteriilor, izolandu-le de celule cu rol fagocitar implicate in raspunsul imun al organismului. Evidentierea acesteia se realizeaza optim prin testu coagulazei efectuat in eprubeta. Testul dezoxiribonucleazei – Se efectueaza in mediu agarizat ce contine ADN. Aparitia unei zone mai deschise la culoare in jurul coloniei reprezinta o reactie pozitiva, respectiva producerea de ADN-aza de catre S. aureus. Fermentarea manitolului – Capacitatea S. aureus de a fermenta manitolul, cu eliberarea de acid, se poate pune in evidenta in mediul Chapman solid, in care S. aureus degradeaza manitolul, ceea ce duce la acidifierea mediului si virarea culorii indicatorului de pH (rosu fenol) spre galben.
Diagnostic serologic – Alfa-hemolizina (toxina α) este o proteina sintetizata si secre tata de S. aureus sub
forma monomerica, ce se uneste in mediul inconjurator cu sase alti monomeri pentru a forma un heptamer la suprafata celulelor gazda. Acest heptamer prezinta in centru un por, iar formarea mai multor astfel de pori pe suprafata unei celule duce la moartea acesteia. Diagnosticul serologic consta in examinarea serului extras de la pacient pentru depistarea anticorpilor anti-stafilolizine- α. Un titru mai mare de 2 UI/mL apare in caz de infectii profunde sau cronice. Antibiograma – Antibiograma se efectueaza pe mediu simplu, geloza Müller-Hinton. Utilizand un disc ce
contine 100µg Furazolidon, se poate face DDx in micrococi si stafilococi:
Diametrul zonei de inhibitie < 15mm – micrococ Diametrul zonei de inhibitie > 15mm – stafilococ
Diagnosticul de laborator in faringita streptococica Faringita streptococica este cauzata de streptococul de grup A, β-hemolitic, anume Streptococcus pyogenes.
Examen microscopic – Streptococii piogeni sunt coci Gram-pozitivi sferici, dispusi in lanturi scurte sau
perechi, imobili, capsulati si nesporulati. Caractere de cultura – Pe geloza-sange streptococul de grup A dezvolta colonii mici (diametrul în jur de
0,5mm), transparente sau translucide, bombate, cu zona largă de hemoliză clară de tip β, ce depăseşte de 2-4 ori diametrul coloniei. Privite la lupă, aceste colonii pot prezenta 4 aspecte. Aceste colonii pot fi de tip M (mucoide), deoarece in cultura proaspata, S. pyogenes prezinta capsula. Sunt facultativ anaerobi. In bulion glucozat sau bulion-ser formeaza depozit la fundul si pe peretii tubului. Caractere biochimice:
Identificarea grupului – se face prin testul sensibilitatii la bacitracina. Este o metoda simpla, larg
utilizata, care diferentiaza streptococii de grup A, sensibili, de restul grupurilor rezistente la bacitracina. Diagnostic serologic – Se face reactia ASLO.
11
Microbiologie
Antibiograma – In cazul izolarii streptococilor de grup A, antibiograma nu este necesara, deoarece pana
in prezent nu s-au semnalat tulpini rezistente la penicilina. Pacientii alergici la penicilina pot fi tratati cu eritromicina. După identificarea serogrupului A prin testul la bacitracina, examenul bacteriologic se considera incheiat şi se poate elibera buletinul de analiza cu rezultatul definitiv.
Diagnosticul de laborator in pneumonia pneumococica Pneumonia pneumococica este cauzata de Streptococcus pneumoniae. Examen macroscopic – Este util in pneumonii, deoarece sputa are un aspect ruginiu caracteristic. Examen microscopic – S. pneumoniae= coci gram pozitivi, lanceolati, dispusi in lanturi scurte sau perechi
izolate (diplo, pe ax longitudinal – aspectul caracteristic), incapsulati. Au aspect caracteristic, ca doua flacari de lumanare care se ating cu bazele. Se observa si prezenta polimorfonuclearelor. Caractere de cultura – Izolarea se face pe geloza-sange iar incubarea, de preferinta, in atmosfera de 5%
CO2 (sunt microaerofili), la 37°C, timp de 24 ore. S. pneumoniae necesita medii imbogatite cu sange, ser, lichid de ascita sau glucoza, fiind oarecum fastidios (nu se dezvolta pe medii simple). In mediile lichide tulbura omogen mediul. Pe geloza-sange pneumococul capsulat dezvolta colonii mici, netede, mucoide (tip M), cu diametrul în jur de 1 mm, cu zona de liză α în jur (hemoliza α genereaza o zona de culoare verde in jurul coloniei respective, datorita sintezei de peroxid de hidrogen, care o xideaza hemoglobina, transfomand-o in methemoglobina). Coloniile tinere sunt bombate, dar prin invechire se aplatizeaza si au centrul deprimat (aspect crateriform) datorita elaborarii de autolizine. Aceste aspecte culturale (cu exceptia proprietatii autolitice) se intalnesc şi la streptococii viridans, ceea ce impune efectuarea testelor de diferentiere (DDx este necesar intre S. pneumoniae si S. viridans). Tulpinile necapsulate formeaza colonii de tip R. Doar tulpinile capsulate sunt patogene, iar in cazul acestora, capsula este comuna unei perechi sau unui lant scurt de pneumococi. Caractere biochimice:
Testul la optochin – Se repica in striuri dese pe o placa cu geloza-sange cateva colonii izolate din
tulpina de cercetat. In mijlocul ariei insamantate se depune un m icrocomprimat de optochin. Se incubeaza 24 ore la 37°C. Testul este pozitiv (germenii sunt sensibili la optochin) daca in jurul microcomprimatului de optochin cultura este inhibata pe o arie de m inimum 20mm. Este un test foarte specific, care diferentiaza pneumococii (sensibili) de streptococii viridans (rezistenti la optochin). Biloliza (solubilizarea prin bila sau saruri biliare) – Se insamanteaza tulpina de cercetat in doua eprubete cu bulion glucozat. A doua zi se adauga intr-o eprubeta 1 mL bila sau 1 mL saruri biliare (dezoxicolat sau taurocolat de Na 10%), iar in cealalta eprubeta ser fiziologic (tub martor). Dupa o ora de incubare la termostat se compara cele douaeprubete. Daca in bulion s-au dezvoltat pneumococi, tubul in care s-au adaugat saruri biliare se va limpezi, comparativ cu martorul care ramane opac. Bila sau sarurile biliare favorizeaza elaborarea autolizinelor, care vor determina liza pneumococilor. ÎIn cazul streptococilor viridans, testul este negativ. Acest test se utilizeaza
12
Microbiologie
pentru a diferentia S. pneumoniae de alti streptoc oci α-hemolitici, care nu sunt lizati in prezenta bilei. Elaborarea enzimelor zaharolitice(descompunerea glucozei si inulinei) – Inulinele reprezinta un grup de oligozaharide ce contin fructoza. Fermentarea inulinei reprezinta un caracter biochimic important, util in diferentierea pneumococilor de Streptococcus viridans, care produce pe geloza-sange acelasi tip de hemoliza α dar nu fermenteaza acest zahar. S. pneumoniae fermenteaza si glucoza, aceasta fiind principala sa sursa de energie. Fermentarea zaharurilor duce la acidifierea mediului, iar aceasta modificare de pH este de obicei evidentiata prin utilizarea unor indicatori a caror culoare vireaza (ex.: rosu fenol -> galben).
Diagnostic serologic – Identificarea tipului serologic se poate face fie direct din produsul patologic (daca
acesta este lichid), fie din cultura de 10-14 ore in mediu lichid (dar pe medii speciale pe care pneumococul poate sintetiza capsula). Se utilizeaza reactia de aglutinare pe lama prin tehnica de “umflare a capsulei” (capsule swelling – Quellung reaction). Pe o lama se pun îin contact o picatura din cultura de cercetat sau produs patologic şi o picatura din serul specific de tip. Operatia se repeta pentru fiecare ser de tip. Apoi se adauga cate o picatura de albastru de metilen la fiecare amestec Ag-Ac. Dupa 10 minute se examineaza la microscop, utilizand obiectivul cu imersie. Acolo unde tipul antigenic intalneste serul omolog, se observa aglutinarea pneumococilor si prezenta unei capsule bine delimitate, mult marita comparativ cu celelalte seruri.
Diagnosticul de laborator in meningita meningococica Examen direct – Examenul microscopic al frotiului colorat Gram evidentiaza coci gram-negativi, reniformi
(aspect de rinichi sau boaba de cafea), dispusi in diplo, cu fetele aplatizate sau concave alipite. Ocazional formeaza tetrade. Meningococii sunt imobili, iar fiecare pereche este inconjurata de o capsula comuna. Caractere de cultura – Neisseriile sunt bacterii strict aerobe. N. meningitidis este foarte fastidios – are
nevoie, in vederea izolarii, de medii de cultura imbogatite cu hemina, extract de levura si autolizat de ficat (mediul Hyl – hemoglobin, yeast, liver) sau de medii selective (mediul Thayer-Martin – agar-chocolat ce contine un amestec antibiotic care inhiba dezvoltarea altor microorganisme, acesta fiind compus din vancomicina, ce omoara microorganismele gram-pozitive, colistina, ce omoara majoritatea microorganismelor gram-negative, cu exceptia neiseriilor, si nystatin, ce omoara majoritatea levurilor). Cresterea este influentata negativ de uscaciune si de prezenta acizilor grasi. Temperatura optima de incubare este de 35-37°C. Atmosfera umeda suplimentată cu 3-10% CO2 este necesara cresterii. Coloniile apar în 24-48 ore. Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1mm, transparente, nepigmentate. Tulpinile capsulate (A, C) formează colonii de tip M (mucoide). Caractere biochimice: Catalazo-pozitiv Testul oxidazei – Meningococul produce citocrom c-oxidaza, enzima ce catalizeaza transferul de
electroni de la donori precum NADH catre acceptorul final, care de obicei este oxigenul. Se utilizeaza hartie de filtru impregnata cu un compus cu rol de indicator redox, sau o solutie ce contin acel indicator. Compusul este incolor in stare redusa si capata o culoare albastru inchis cand este oxidat. In cazul testului oxidazei, compusul functioneaza ca si donor de electroni, el fiind oxidat de catre enzima elaborata de meningococ. Aparitia unei culori albastre indica o 13
Microbiologie reactie pozitiva. In cazul testului efectuat cu solutia, se pun cateva picaturi de solutie pe o lama, dupa care se preleva cu ansa bacteriologica dintr-o colonie izolata si se depune pe lama. Fermentarea zaharurilor – Este utila pentru a face DDx intre N. meningitidis si n. gonorrhoeae – meningococul fermenteaza glucoza si maltoza, gonococul doar glucoza. Diagnostic serologic – Pe baza structurii chimice a capsulei, meningococii se impart in 13 serogrupe, tulpinile incapsulate apartinand serogrupelor A, B, C, Y şi W135 fiind cel mai frecvent asociate infectiilor
epidemice. Determinarea serogrupului se face de obicei prin reactii de aglutinare pe lama. Exista posibilitatea efectuarii de teste imunologice (de tip latex-aglutinare, contraimunoelectroforeză) direct din produsele patologice (LCR, sange, urina). Acestea sunt folosite pentru detectarea antigenului de suprafata, specific de grup, ceea ce permite un diagnostic etiologic mult mai rapid, dar nu se vor substitui culturii si examenului microscopic.
Diagnosticul de laborator in tuberculoza pulmonara Tuberculoza pulmonara este o afectiune cauzata de infectia cu Mycobacterium tuberculosis. Examen direct – Deoarece avem de-a face cu un bacil acido-alcoolo-rezistent, frotiul se coloreaza prin
metoda Ziehl-Neelsen. Se observa bacili fini, usor incurbati, cu dimensiuni de 2-5µm, colorati in rosu, pe un fond albastru. Pe frotiul din cultura, tulpinile patogene se dispun in siruri paralele, alcatuind corzi, datorita unui factor de virulenta ce leag a bacteriile intre ele, numit „cord factor”. Caractere culturale – Se cultiva lent, intrucat timpul de generatie este de 20 ore. Este un germen aerob,
se dezvolta la 36°C si necesita medii de cultura speciale. Cel mai utilizat este mediul Loewenstein-Jensen, care contine ou, cartof, asparagina, glicerina, saruri minerale si verde de malachit. Coloniile de M.t. pe acest mediu sunt de tip R si au aspect conopidiform fiind uscate, zbarcite, rugoase, de culoare crem-bej. In mediu lichid, creste sub forma unei membrane groase, cu multe pliuri, care se ridica pe peretele flaconului de cultura. Caractere biochimice: Produce acid nicotinic Nitrat-reductaza-pozitiv – Testul se efectueaza in tub, intr-un mediu de test ce contine nitrat de
potasiu. Daca microorganismul respectiv produce nitrat-reductaza, va transforma nitratul de potasiu in nitrit, iar acesta va reactiona la randul sau cu alte substante din mediu, formand un compus de culoare rosie. Aparitia acestei culori reprezinta o reactie pozitiva. Catalazo-pozitiv Ureazo-pozitiv
14
