Sop Kalibrasi HPLC Agilent :)

LPKL - SMAKBO

DEPARTEMEN PERINDUSTRIAN REPUBLIK INDONESIA PUSAT PENDIDIKAN DAN PELATIHAN INDUSTRI

SEKOLAH MENENGAH ANALIS KIMIA BOGOR LABORATORIUM PENGUJIAN KIMIA DAN LINGKUNGAN

SOP KALIBRASI HPLC AGILENT 1100

Kode Dok. Revisi Tgl Terbit Halaman

SOP-LPKL– 01 0 01 April 2009 1 dari 6

DAFTAR ISI 1. Tujuan 2. Ruang Lingkup 3. Tanggung Jawab 4. Prosedur 5. Dokumentasi 6. Peraturan lain yang terkait 7. Sumber 8. Lampiran

Disusun oleh,

Diperiksa oleh,

Disahkan oleh,

Supriyono

Sofyan Sauri

Hadiati Agustine

LPKL - SMAKBO





SOP-LPKL– 01 0 01 April 2009 dari 6

1. Tujuan Untuk menjamin bahwa kalibrasi dilakukan sesuai dengan prosedur sehingga hasil kalibrasi yang diperoleh dapat dipertanggung jawabkan ketepatan dan kebenarannya. 2. Ruang Lingkup SOP ini berlaku untuk kalibrasi HPLC AGILENT 1100 di Laboratorium Pengujian Kimia dan Lingkungan, SMAK Bogor

3. Tanggung Jawab Manager Teknis - Menjamin bahwa prosedur cara kalibrasi HPLC AGILENT 1100 ini harus dibuat. Analis

-

Melakukan cara kalibrasi HPLC AGILENT 1100

4. Prosedur

4.1

Quaternary Pump

4.1.1

Tes kebocoran pada 350 bar dengan solvent methanol

1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5

1.2.6

1.3.2

Lepaskan tubing pada outlet pump. Tutup outlet pump dengan ‘Column end Plug”. Max Pressure Limit sebesar 350 bar. Set flow rate 0.2 ml/menit., jalankan pump. Pump akan berhenti secara automatis bila tekanan telah mencapai 350 bar. Amati tekanan pada 1 menit setelah pump berhenti. Tekanan tidak boleh turun lebih kecil dari 310 bar. Buka Reference Valve untuk menghilangkan tekanan. Bila pump gagal, amati apakah ada kebocoran pada setiap sambungan, seal plunger dan lakukan perbaikkan atau pergantian spare part bila diperlukan, lalu ulangi test kebocoran ini.

Tes akurasi flow rate dengan solvent methanol

4.1.2.1

4.1.2.2

4.1.2.3 4.1.2.4

Ganti “column end plug” pada outlet pump dengan ss tubing. Arahkan tubing kedalam labu ukur 25 ml, set flow rate pada Pump A sebanyak 5 ml/menit. Dengan menggunakan stop watch, catat waktu yang diperlukan untuk menampung 25 ml, lalu set flow rate 0 ml/menit. Arahkan tubing kedalam labu ukur 10 ml, set flow rate Pump A sebanyak 1 ml/menit. Dengan menggunakan stop watch, catat waktu yang diperlukan untuk menampung 10 ml , lalu set flow rate 0 ml/menit.. Arahkan tubing kedalam labu ukur 10 ml, set flow rate Pump A sebanyak 0.5 ml/menit. Dengan menggunakan stop watch, catat waktu yang diperlukan untuk menampung 10 ml , lalu set flow rate 0 ml/menit.

LPKL - SMAKBO




4.1.2.5



Hitung Akurasi Flow Rate dengan rumus = 1/3 { (A/300) + (B/600) + (C/1200)} X 100 % dimana : A = Penyimpangan waktu (dalam detik) dari waktu 5 menit B = Penyimpangan waktu (dalam detik) dari waktu 10 menit B = Penyimpangan waktu (dalam detik) dari waktu 20 menit Akurasi flow rate harus < 3 %

4.1.2.6 Lakukan hal yang sama untuk pump B, C, dan D 1.3.3

Tes Akurasi komposisi Gradient 4.1.3.1

4.1.3.2 1.4.3 1.4.4 1.4.5

Siapkan Erlenmeyer 500 ml dan isi dengan methanol yang telah disaring dengan filter 0.45 µ , masukkan selang pump A kedalam Erlenmeyer tersebut. Siapkan Erlenmeyer 500 ml dan isi dengan larutan Propyl Paraben dalam methanol dengan konsentrai 10 mg/ml, masukkan selang pump B kedalam Erlenmeyer tersebut. Lakukan priming untuk kedua solvent tersebut. Sambungkan tubing outlet injector ke detector (tanpa column dan pre column). Atur set up pump sebagai berikut: No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1.4.6 1.4.7 1.4.8 1.4.9

Time 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 25.00

Flow %A %B 2.00 100 0 2.00 90 10 2.00 80 20 2.00 70 30 2.00 60 40 2.00 50 50 2.00 40 60 2.00 30 70 2.00 20 80 2.00 10 90 2.00 0 100 2.00 100 0 2.00 100 0 Tabel Akurasi komposisi Gradient

Klik detektor VWD - Klik Set up VWD Signal - Set wavelength = 257 nm Klik Run Control Klik Sample Info lalu isikan nama sampel dan nama file sebagai. Lakukan injeksi Methanol, tunggu hingga 25 menit.

Curva * 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11

LPKL - SMAKBO




1.4.10



Setelah didapat kromatogram, lakukan integrasi dengan parameter sebagai berikut :

Minimum Area Minimum Height Peak Width

0 0 Di set sehingga satu level diwakili oleh suatu puncakl ( ada RT-nya) Peak Treshold Di set sehingga satu level diwakili oleh suatu puncakl ( ada RT-nya) Pada Integration Event, lakukan Force Baseline by Time mulai 0.0 menit sampai 25 menit 1.4.11 1.4.12 1.4.13 1.4.14

1.4.15

4.2

Temperatur Accuracy 2.1

2.2 2.3

2.4 4.3

Cetak kromatogram dengan menggunakan reporting method yang ada kolom peak heightnya. Masukkan nilai peak height tiap level yang menyatakan komposisi persen B. Bagi peak height tiap peak dengan peak height dari peak yang mewakili 100 % B. Kurangkan hasil pembagian tersebut dari 1/100 nilai % B yang diwakilinya. Nilai maksimum dari hasil pada step 4.1.3.14 adalah persentase akurasi komposisi. Nilainya harus < 0.5 %

Ganti “column end plug” pada outlet pump dengan ss tubing. Set flow rate 2 ml/min. Set suhu 36oC Arahkan tubing ke termometer dan setelah suhu stabil, catat hasil yang ditunjukkan termometer. Selisih suhu maximum 2oC

DETEKTOR VWD

3.1

Test Linearity Absorbance Detector.

4.3.1.1 Siapkan Standard caffeine dalam air dengan konsentrasi : 5 mg/l , 25 mg/l, 125 mg/l, 250 4.3.1.2 4.3.1.3 4.3.1.4 4.3.1.5 4.3.1.6 4.3.1.7 4.3.1.8

3.2

mg/l dan beri label masing-masing larutan # 1 sampai # 4. Set panjang gelombang = 272 nm. Pasang kolom ODS STR-II 250L x 4.0mmI.D, mobile phase aquabidest 85% acetonitrile 15%, flow rate 0.8 ml/min, suhu kolom 36oC Injekkan masing-masing standard dan print hasil kromatogramnya Hitung Sensitivity dengan cara membagi pembacaan Absorbance dengan konsentrasi larutan masing-masing dan catat pada kolom sensitivity. Hitung % RSD dari kolom sensitivity. Hasilnya harus lebih kecil dari 5 %. Buat kurva kalibrasi yang menghubungkan Konsentrasi dengan area Hitung nilai korelasinya, nilai minimalnya adalah 0.99900

Noise, Pressure, Temperature Stability

LPKL - SMAKBO






4.3.2.1 Pasang kolom ODS STR-II 250L x 4.0mmI.D, mobile phase aquabidest 100%, flow rate 1.0 ml/min, suhu kolom 36oC 4.3.2.2 Set panjang gelombang = 254 nm. Stop time 10min 4.3.2.3 Run method tanpa menginjek apapun dan print hasil kromatogramnya. 4.3.2.4 Amati nilai Wander dan drift pada kromatogram, nilai Wander (mAU) maximum 0.2 mAU dan nilai drift maximum 0.5 mAU/h. 4.3.2.5 Untuk temperature stability, nilai selisih temperature maximum 0.5oC. 4.3.2.6 Sedangkan untuk pressure stability, nilai selisih maximum 5% 4.4

OVERALL SYSTEM PERFORMANCE (HPLC dengan Detektor UV/Vis)

4.4.1

Bahan yang diperlukan

4.4.1.1 Methanol . 4.4.1.2Milli-Q Water. 4.4.1.3Methyl Paraben. 4.4.1.4 Propyl Paraben. 4.4.1.5Kolom ODS STR-II 250L x 4.0mmI.D. 4.4.2

4.4.3

Overall Method Parameter Column

ODS STR-II 250L x 4.0mmI.D

Mobile phase

60/40 methanol/air

Flowrate

1 ml/min

Wavelength

254 nm

Sample

0.05 mg/ml methyl dan Propyl Paraben

Injection Volume

20 µ l

Penyiapan Fasa Gerak

4.4.3.1Untuk membuat 500 ml methanol/H2O 60/40, tambahkan 300 ml methanol kedalam 200 ml air, aduk sampai homogen. 4.4.4

Penyiapan Sample

4.4.4.1Buat “Stok Solution” Methyl Propyl Paraben ( dicampur), sehingga konsentrasinya 0.5 mg/ml

4.4.4.2Untuk membuat konsentrasi 0.05 mg/ml, pipet 1 ml “Stok Solution” dan masukkan kedalam labu ukur 10 ml dan add sampai dengan tanda dengan menggunakan fasa gerak.

LPKL - SMAKBO



SOP KALIBRASI HPLC AGILENT 1100 4.4.5



Melakukan enam (6) kali injeksi

4.4.5.1 Siapkan fase gerak methanol di pump A dan air di pump B. Atur perbandingan fase gerak methanol/air 60/40 4.4.5.2Alirkan Fasa gerak dengan flowrate 1.0 ml/min selama 1 jam hingga output detector stabil. 4.4.5.3Lakukan injeksi 20 µ l sample sebanyak 6 kali. 4.4.5.4 Catat area dan retention time untuk tiap peak dari setiap injeksi. 4.4.5.5Hitung % RSD retention time dan area atau amount, menggunakan propyl paraben untuk perhitungan. 4.4.5.6 Presisi untuk area atau amount harus < 1.0 % RSD. 4.4.5.7 Presisi untuk retention time harus < 1.0 % RSD. 5.

Dokumentasi : Hasil Kalibrasi alat ini didokumentasikan atau dicatat pada lembaran Calibration report.

6.

Peraturan Terkait : - CPOB

7.

8.

Sumber 7.1 Operating Instruction from EMPOWER 7.2 Operating Instruction from AGILENT 1100 Lampiran 8.1 Kromatogram standard caffeine 8.2 Kromatogram standard metil propil paraben 8.3 Kromatogram noise

Sop Kalibrasi HPLC Agilent :)

Recommend Documents