TUGAS BIOMOLEKULER
SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM
OLEH Ni Nyoman Trisna Dewi NIM: 1214068105 1214068105
PPDS I ILMU PENYAKIT SARAF UNIVERSITAS UDAYANA 2013
PENDAHULUAN Dampak dari bioteknologi yang tidak sedikit terhadap biologi modern terutama di bidang biologi molekuler dan genetika menyebabkan peneliti ingin menemukan hal baru yang lebih spesifik dalam hal sampel DNA. Kata ”polymorphism” sering digunakan oleh para ahli genetika modern. Secara umum sebuah lokus yang polimorfik adalah lokus yang memiliki alel atau varian yang sedemikian rupa sehingga varian yang paling umum di antara mereka terjadi dengan frekuensi kurang dari 99% dari total populasi. Bagaimana pun juga penggunaan polimorfisme dalam genetika modern memulai perkembangan dalam bidang fisiologi dan biokimia seperti pada protein isoform dan grup antigen dalam darah. Variasi variasi yang timbul telah diperkirakan berasal dari variasi pada sekuen DNA, yang dimana hal ini setelah dikonfirmasi menimbulkan banyak pertanyaan. Pertama, perubahan jenis apa yang terjadi pada genom sehingga dapat memberikan dampak variasi pada fenotip? Kedua, bagaimana variasi ini dapat dipertahankan? Ketiga, bagaimana bisa satu perubahan genom dapat memberikan variasi pada fenotip, dan keempat bagaimana suatu perubahan langsung memberikan variasi pada biokimia dan fenotip. Secara teori, jawaban dari pertanyaan ini tampaknya mudah, hanya dengan melakukan studi memeriksa hubungan varian DNA dengan varian fenotip individu dalam satu populasi yang sama atau di antara individu dari populasi yang berbeda. Namun ternyata hal ini sulit diterapkan karena perubahan varian sekuan DNA dapat melibatkan hanya satu pasang hingga ratusan pasang basa, selain itu kita belum tentu dapat langsung menentukan titik perubahan ini.
Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)
Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) memiliki definisi sebagai variasi dari sekuens DNA yang terjadi ketika nukleotida tunggal (A, T, C, atau G) di dalam sekuens genome berubah. Seperti contoh SNPs dapat merubah A AGCTAA menjadi ATGGCTAA. Perubahan SNPs ini terjadi paling sedikit 1% dari seluruh populasi. Pendapat ahli menyatakan SNPs ditemukan meningkat hingga 90% untuk semua variasi genetik manusia, kejadian tiap 100 sampai 300 basa diantara 3 juta basa genome manusia. Dua dari masing-masing tiga SNPs melibatkan perubahan sitosin (S) menjadi timin (T). SNPs ini dapat terjadi pada dua kode gen dan nonkoding regio genome. Banyak diantara SNPs tidak memiliki efek untuk fungsi sel dalam tubuh, akan tetapi peneliti percaya bahwa pada kondisi berbeda dapat menimbulkan penyakit pada manusia atau mempengaruhi respon tubuh manusia terhadap obat-obatan. Walau lebih dari 99% dari genome sekuens DNA manusia memiliki persilangan yang sama dalam suatu populasi,variasi di dalam sekuens DNA dapat memiliki efek yang besar dan proses bagaimana manusia merespon penyakit yang ditimbulkan, merespon kesehatan lingkungan yang dicemari oleh bakteri, virus, toxin, dan zat kimia serta obat-obatan dan terapi lainnya. Hal ini membuat SNPs memiliki
nilai
yang
berharga
untuk
penelitian
biomedikal
dan
untuk
mengembangkan produk farmasi atau diagnostik kedokteran. SNPs juga berevolusi secara stabil, dan tidak merubah banyak dari generasi ke generasi yang membuat SNPs mudah untuk ditelusuri dalam studi populasi. Sebelumnya SNP dikenal juga sebagai „restriction fragment length polymorphism (RFLP), karena pernah diteliti bahwa varian pada basa tunggal teridentifikasi pada titik ensim restriksi, dimana perubahan satu pasang basa dapat menyebabkan ada atau tidaknya titik restriksi. Sampai akhirnya ditemukan juga SNP tipe lain yang tidak secara langsung menciptakan atau menghilangkan titik restriksi. Beberapa penelitian menyampaikan bahwa SNP dapat ditemukan kira – kira setiap 0,3 – 1 kilobasa (kb) genom. Meskipun tidak dapat diketahui secara pasti lokasi dan jenis SNP nya. Namun satu hal yang dapat dipastikan bahwa frekuensi terjadinya SNP jauh lebih besar daripada jenis polimorfisme lain.
SNP adalah jenis yang paling umum dari variasi genetik dan dapat terjadi setiap 100 hingga 300 basa. Secara umum, SNP terjadi pada 1% populasi manusia. Dan sekitar 3-5% dari sekuen DNA individu yang dikodekan (ekson) untuk produksi protein, hanya sejumlah kecil SNP ditemukan berada di dalam ekson karena sebagian besar SNP ditemukan berada di luar ekson (intron). Keberadaan SNP pada daerah promoter, situs pemotongan pasca transkripsi pada coding region suatu gen, intron, dan non coding region lainnya menarik perhatian para peneliti karena SNP tersebut mungkin dapat merubah fungsi regulasi dan ekspresi suatu protein yang berasosiasi dengan suatu fenotip atau penyakit. Jenis polimorfisme lain merupakan akibat dari proses insersi dan delesi dari fragmen DNA. Tipe paling umum dari insersi dan delesi polimorfisme adalah adanya variasi jumlah dari pengulangan basa atau pola nukleotida pada regio genetik. Pengulangan pola basa dalam jumlah sekitar beberapa pasang basa sering disebut “minisattelites” sedangkan pengulangan dua, tiga, atau empat pasang basa disebut “microsattelite” atau dapat pula disebut sebagai “simple tandems repeat (STR)”. Polimorfisme berulang seperti di atas menghasilkan banyak variasi dalam suatu populasi, oleh karena itu sering disebut sebagai polimorfisme tingkat tinggi. Walau demikian SNPs dapat membedakan secara jelas karakter dari : predisposisi untuk suatu penyakit, dapat diasuransikan atau tidak, dan sering merupakan dasar diskriminasi dari stigma yang berbeda. Beberapa variasi dapat menyebabkan penyakit. SNPs yang seperti ini sangatlah jarang. SNPs dapat berfungsi sebagai marker genetik untuk sifat yang berbeda seperti : klinikal trial hubungan SNPs dengan efisiensi obat, klinikal trial hubungan adverse drug rections, dan konsumsi genomik yang berhubungan antara SNPs dengan banyak sifat atau ciri lainnya. TIPE SNPs SNP dapat terbagi menjadi tiga berdasarkan lokasinya yaitu pada regio coding , regio non-coding dan regio intergenic ( regio antara 2 gen ). SNPs pada regio coding terbagi lagi menjadi dua tipe : synonimous dan nonsynonymous. Dimana synonymous SNPs tidak memberikan efek pada sekuens protein, sedangkan nonsynomymous SNPs merubah sekuens asam amino dan merubah
sekuens protein. Nonsynonimous SNPs dibagi lagi menjadi dua yaitu : missense dan nonsense. Adapun beberapa nonkoding SNPs meliputi : 5‟ UTR , 3‟ UTR , introns, intergenic regions, pseudogenes, regulator mencakup splicing ,
regulasi
transkripsional ( promoter & tf binding sites), translational regulation (initiation or termination), regulatory miRNA target sites. Koding SNPs meliputi : synonymous SNPs (third position variation), replacement SNPs (change Amino acid), functional SNPs (acceptable amino acid replacement), non-functional SNPs (traits & diseases). Eric Green‟s View of SNPs(Director of NHGRI)
SNPs yang tidak terletak pada regio coding masih dapat memberikan efek pada penyambungan gen, transcription factor binding , degradasi mRNA, atau sekuen RNA lain. Contoh SNPs :
rs6311 dan rs6313 adalah SNPs pada gen HTR2A pada kromosom 13 pada manusia.
SNP pada gen F5 menyebabkan gangguan hiperkoagulasi dengan varian factor V Leiden.
rs3091244 adalah contoh SNP trialelik pada gen CRP pada kromosom 1 manusia.
TAS2R38 adalah kode untuk kemampuan merasakan PTC, dan mengandung sekitar 6 SNPs Kebaikan untuk SNPs diantaranya dapat menghasilkan PCR yang sangat
kecil dimana marker akan bekerja dengan kuat pada sampel DNA, lebih umum dalam mewakili suatu genome, terdapat ratusan multipel atau ribuan dalam satu lokus, proses sampel dapat terjadi lengkap secara otomatis dan tidak ada produk gagal. Selain itu hanya dibutuhkan alel yang sedikit pada tiap marker namun sudah informatif, genotip pada banyak SNPs dapat berada pada level yang sama dari informasi mengenai sampel DNA, dengan interpretasi mixture lebih susah dilakukan. Mengenai berapa banyak jumlah SNPs ada beberapa informasi dimana sejak tiap SNPs menjadi kurang informatif karena hanya memiliki dua alel sehingga dibutuhkan genotipe lebih dari SNPs untuk menyamai profil DNA secara khusus. SNPs ternyata membutuhkan frekuensi alel tertentu karena satu alel saja dari SNP bukan merupakan marker yang baik dan tiap orang akan menghasilkan informasi yang sama. Walau demikian SNPs yang berbeda akan bermanfaat pada populasi yang berbeda. Mengenai SNPs marker terdapat ribuan jenis yang sudah diketahui dengan pasti dan ada beberapa grup yang mengidentifikasi genotip SNPs, lokasinya di genome, dan rekuensi alelnya pada populasi yang berbeda.
KEPENTINGAN SNPs DALAM ANALISA GENETIK Variasi sekuen DNA pada manusia dapat mempengaruhi manusia dalam timbulnya penyakit, respon terhadap patogen, bahan kimia, obat – obatan, vaksin dan agen – agen lain. SNP memiliki banyak keuntungan dibanding polimorfisme jenis lain dalam diseksi genetik suatu penyakit dan dalam
penelitian yang
mengidentifikasi gen. Untuk selanjutnya akan dibahas lebih lanjut mengenai keuntungan – keuntungan SNPs dalam identifikasi gen dan pemetaan gen. Apabila ditemukan SNPs dalam frekuensi yang cukup banyak dalam suatu genom, maka dapat pula ditemukan gene dari suatu penyakit genetik. Atau dapat pula digunakan sebagai suatu tes yang secara langsung pada suatu genom apakan SNPs ini merupakan penyebab mutasi gen dalam suatu penyakit. SNPs ditemukan di dalam genom, dalam ekson, intron, regio intergenik dan lain lain. Karenanya, mereka lebih fisiologis dibandingkan polimorfisme jenis lain. Yang menarik dari hal ini adalah bagaimana subtitusi basa sederhana mampu menyebabkan suatu penyakit. Sebagian kecil SNP menjadi penanda biologis untuk penentuan suatu penyakit pada peta genom manusia karena SNP tersebut terletak pada gen yang ditemukan terkait dengan penyakit. SNP yang diasosiasikan dengan suatu penyakit dapat digunakan untuk mencari dan mengisolasi gen penyebab penyakit tersebut. Pola SNP di gen – gen target dari hasil studi perbandingan ntara kelompok kasus dan kontrol pada studi asosiasi dapat digunakan untuk merancang target terapi dan desain serta respon obat pada suatu populasi.
Penggunaan SNPs ; 1. Pemetaan penyakit kompleks dan asosiasinya, forensik dan inference sejarah populasi pada manusia 2. Penting
dalam
breeding programs.
Untuk
membantu
identifikasi
kesalahan genetik dan penyakit. Karena bentuknya yang biallelik, maka SNPs sangat mudah di identifikasi. 3. Identifikasi individu hewan dan analisa tetuanya atau tes paternitas 4. Identifikasi hibrid, contoh : spruce, dimana 2-4 SNPs, 96-100% mampu membedakan antar ketiga spruce 5. Ketahanan terhadap patogen 6. Asosiasinya dengan karakter ekonomis seperti gen yang terkait dengan pembentuan pati pada padi.
7. Pengetahuan yang cukup mengenai SNPs dapat membantu dalam farmakokinetik dan farmakodinamik suatu obat, misalnya bagaimana interaksi suatu abat dalam varian genetik individu yang berbeda. 8. Berbagai macam penyakit seperti cancer, AIDS, lepra, hepatitis, autoimun, neuropsikiatri, sickle cell anemia, thalassemia dan cystic fibrosis diyakini merupakan hasil dari SNPs, hal ini diharapkan dapat membantu dalam pengambangan pengobatan penyakit – penyakit tersebut. 9. SNPs tanpa efek signifikan pada fenotip dapat digunakan sebagai marker genetik dikarenakan jumlah dan kestabilan ketika diturunkan ke generasi berikutnya.
KEUNGGULAN PENANDA SNPs 1. Direct marker 2. Potensinya untuk membuat peta genetik yang mempunyai density yang tinggi (very high density genetics maps) 3. Tingkat mutasi yang rendah ( 10 -8 – 10-9 ) 4. Lebih stabil dan pewarisannya lebih tinggi dibandingkan SSR dan AFLP 5. Nomenklatur alel yang sederhana 6. Kemudahan untuk membaca datanya 7. Kemungkinan untuk automatisasi analisanya 8. Tipikalnya : bialelik marker sehingga individu yang lokus informasinya rendah dikompresi dengan banyak SNPs 9. Untuk 10 – 15 mikrosatelit lokus dibutuhkan 30 – 50 SNPs tergantung dari banyak nya alel atau + dibutuhkan 3x SNPs untuk setiap lokus mikrosatelit. 10. Biaya lebih rendah ( 5 – 10 kali lipat lebih rendah dibanding mikrosatelit ) 11. Volume, repeatability dan akurasi yang lebih tinggi dibandingkan mikrosatelit.
METODE ANALISA SNPs Cara pendeteksian dan penemuan SNP berkembang dengan cukup pesat karena didukung oleh kemajuan teknologi sekuensing, dan setelah dipetakannya seluruh sekuen DNA manusia pada tahun 2003 dalam Human Genom Project. Pemetaan seluruh sekuen manusia tersebut berdampak pula pada keberhasilan pemetaan sekuen sejumlah besar gen yang sebelumnya tidak diketahui. Teknologi pendeteksian SNP dalam genom manusia makin maju dengan adanya teknologi microarray. Microarray dapat digunakan untuk melihat kemiripan genotip pada kelompok orang yang terkena penyakit dan dapat menunjukkan secara akurat SNP, gen atau kelompok gen yang berasosiasi terhadap penyakit. Metode analisa SNP antara lain : 1. DNA sequencing , adalah suatu proses membedakan perintah masing – masing nukleotida dalam molekul DNA, yaitu adenin, guanin, sitosin dan timin. 2. Capillary
electrophoresis,
dikenal
juga
dengan
capillary
zone
electrophoresis (CZE ), digunakan untuk memisahkan spesies ionik dengan radius hidrodinamik. 3. Mass spectometry, adalah suatu teknik analisa yang memproduksi spektra ( singular spectrum) dari suatu molekul yang diambil dari sampel suatu material. Dapat digunakan untuk mengetahui komposisi elemen dalam suatu molekul. 4. Single strand conformation polymorphism (SSCP), suatu
metode
membedakan 2 sekuen DNA rantai tunggal yang memiliki panjang yang identik dengan cara eksperimental. 5. Analisa elektrokimia 6. Denaturasi HPLC dan gel electrophoresis. 7. Restriction
fragment
length
polymorphism,
suatu
teknik
yang
mengungkapkan variasi pada sekuen DNA homolog yang muncul dari lokasi ensim restriksi yang berbeda. 8. Analisa hibridisasi.
9. Terdapat beberapa metode lainnya untuk genotip SNPs yaitu: reverse dot blot, direct sequencing, HPLC genotyping, taqMan Assay, fluorescence Polarization (FP), Mass spec, Microchips, Pyrosequencing, Allel Specific hybridization, dan SnaPshot .
