CHRISTUS FACULDADE DO PIAUÍ - CHRISFAPI DEPTO. DE FISIOTERAPIA - BLOCO II DISCPLINA: MICROBIOLOGIA PROF: ETIELE ANDRA ANDRADE DE
TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAN
Waleska, Kamayo Elizete, Thiago, André
Piripiri – PI 31 de Agosto de 2012
- RESUMO Observar a coloração para determinar a qual grupo a bactéria pertencia foi um objetivo nesse experimento. Através de produtos químicos utilizados pode-se chegar à coloração desejada para que fossem notadas as bactérias. Alguns erros foram encontrados, mas, esclarecidos com um estudo aprofundado na produção deste relatório.
- INTRODUÇÃO Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes, cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gramnegativas baseando-se na composição da parede bacteriana, e permitindo determinar a morfologia e o tamanho das bactérias analisadas. O método coloração de Gram, é baseado na capacidade das paredes celulares bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta durante um tratamento com etanol-ocetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem. A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções prontamente observadas e caracterizadas como Grampositivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a analise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas permanentemente e preservadas como a documentação. O método consiste no tratamento de uma amostra contendo bactérias, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta, devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel (iodopararrosanilina), em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo violeta-iodo é removido descolorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros peptidoglicano tornando-as impermeáveis ao solvente; o corante é retido e as células permanecem coradas.
A etapa da descoloração é critica, pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário, é, portanto dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas, tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta-escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal-violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.
- OBJETIVOS Aprender a realizar a coloração de Gram e compreender porque determinadas bactérias se comportam como Gram positivas ou Gram negativas.
- PARTE EXPERIMENTAL - Material • material retirado da boca • iogurte • fermento Fleischmann (fermento biológico) ou fungo Saccharomyces cerevisiae • culturas bacterianas em caldo e em ágar nutriente • lâminas de vidro • alça de inoculação • cotonetes • reagentes para a coloração de Gram (violeta de genciana, lugol, álcool 95°,
fucsina ou safranina). • recipiente para a coloração de Gram
- PROCEDIMENTO 1 - Preparo dos esfregaços Para material em meio líquido (iogurte, fermento em água, cultura bacteriana em caldo). • Com auxílio da alça de inoculação previamente esterilizada, colocar 2 - 3
alíquotas da amostra em uma lâmina de vidro. • Espalhar bem sobre a superfície da lâmina, fazendo movimentos circulares.
Deixar secar ao ar. • Flambar a alça na chama do bico de gás antes de recolocá-la em seu lugar.
Para material em meio sólido (culturas bacterianas em placa) • Com auxílio da alça de inoculação, previamente esterilizada, colocar uma
gota de solução salina na superfície de uma lâmina de vidro. • Flambar a alça, deixar esfriar e coletar uma alíquota da cultura bacteriana. • Misturar na gota de solução salina, fazendo uma suspensão homogênea.
Deixar secar ao ar. • Flambar a alça na chama do bico de gás antes de recolocá-la em seu lugar.
Para material retirado da boca • Friccionar a superfície da mucosa oral com um cotonete estéril. Fazer um
esfregaço com o material coletado, na superfície de uma lâmina de vidro, com movimentos circulares. Deixar secar ao ar.
2 - Fixação dos Esfregaços • Após a secagem, fixar os esfregaços, passando as lâminas cerca de 3 vezes
sobre a chama do bico de gás. • Deixar esfriar e corar.
3 - Coloração de Gram • Colocar a lâmina no recipiente para a coloração de Gram. • Cobrir o esfregaço com solução de violeta de genciana. Aguardar 1 minuto e
desprezar o corante no recipiente. • Cobrir com lugol, aguardar 1 minuto, e desprezar o corante no recipiente.
• Inclinar a lâmina, gotejar álcool etílico a 95% até que não haja
desprendimento de corante. Lavar a lâmina rapidamente em água corrente. • Cobrir com fucsina ou safranina. Aguardar 30 segundos e lavar a lâmina.
Secar com papel toalha sem esfregar a lâmina. • Observar ao microscópio em meno r aumento e, a seguir, colocar 1 gota de
óleo mineral na lâmina e focalizar com objetiva de imersão. • Desenhar as bactérias observadas considerando o tipo de coloração (Gram +
ou -), a forma e o arranjo das células. • Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com papel absorvente.
- RESULTADOS E CONCLUSÕES Após o procedimento realizado, a lamina foi levada ao microscópio para a observação, onde notou-se uma cor rosa. Depois de ser observada atentamente por algumas vezes concluiu-se que as bactérias eram do tipo Gram-negativo. Conhecer sobre essa técnica foi de grande importância, pois incentivou mais ao estudo, viu-se que o com o descobrimento dessa técnica também trouxe informações até então desconhecidas e que auxiliará no andamento do curso.
- REFERENCIAS * PERAZZOLO, Luciane M. Biologia Celular, UFSC. Disponível em: www.liaaq.ufsc.br/aulas/Gram%20complemento.PDF
