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1 – FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
PORTARIA N.º 518, DE 25 DE MARÇO DE 2004. Estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências.
NORMA DE QUALIDADE DA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO CAPÍTULO II DAS DEFINIÇÕES Art. 4.º Para os fins a que se destina esta Norma são adotadas as seguintes definições:
potável – água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos, físicos, I - água potável químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde; II - sistema de abastecimento de água para consumo humano – instalação composta por conjunto de obras civis, materiais e equipamentos, destinada à produção e à distribuição canalizada de água potável para populações, sob a responsabilidade do poder público, mesmo que administrada em regime de concessão ou permissão; III - solução alternativa de abastecimento de água para consumo humano – toda modalidade de abastecimento coletivo de água distinta do sistema de abastecimento de água, incluindo, entre outras, fonte, poço comunitário, distribuição por veículo transportador, instalações condominiais horizontais e verticais; IV - cont control rolee da qu qual alid idad adee da ág água ua para para cons consum umoo hum human anoo – conj conjun unto to de at ativ ivid idad ades es exercidas de forma contínua pelo(s) responsável(is) pela operação de sistema ou solução alter alterna natitiva va de ab abas astec tecim imen ento to de ág água, ua, de desti stina nadas das a veri verififica carr se a ág água ua fo forn rnec ecid idaa à população é potável, assegurando a manutenção desta condição; V - vigilância da qualidade da água para consumo humano – conjunto de ações adotadas continuamente pela autoridade de saúde pública, para verificar se a água consumida pela população atende a esta Norma e para avaliar os riscos que os sistemas e as soluções alternativas de abastecimento de água representam para a saúde humana; VI - coliformes totais (bactérias do grupo coliforme) – bacilos gram-negativos, aeróbios ou anae anaeróbi róbios os fac facult ultati ativos vos,, não formad formadores ores de esp esporos oros,, oxi oxidas dase-ne e-negati gativo, vo, cap capaze azess de
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desenvolver na presença de sais biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produção de ácido, gás e aldeído a 35,0 ± 0,5ºC em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima ß-galactosidase. A maioria das bactérias do grupo coliforme pertence aos gêneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vários outros gêneros e espécies pertençam ao grupo; VII - coliformes termotolerantes – subgrupo das bactérias do grupo coliforme que fermentam a lactose a 44,5 ± 0,2ºC em 24 horas; tendo como principal representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal; VIII - Escherichia coli – bactéria do grupo coliforme que fermenta a lactose e manitol, com produção de ácido e gás a 44,5 ± 0,2ºC em 24 horas produz indol a partir do triptofano, oxidase negativa, não hidrolisa a ureia e apresenta atividade das enzimas ß-galactosidase e ß-glucoronidase, sendo considerado o mais específico indicador de contaminação fecal recente e de eventual presença de organismos patogênicos;
MEIO DE CULTURA Caldo Lauril Sulfato Triptose Aplicação: Meio para determinação de coliformes pelo método dos tubos múltiplos, teste presuntivo (SILVA, 2005). COMPOSIÇÃO TRIPTOSE___________________________20,0 g LACTOSE____________________________5,0 g FOSFATO MONOPOTÁSSICO___________2,75 g FOSFATO DIPOTÁSSICO______________2,75 g NaCl________________________________5,0 g LAURIL SULFATO TRIPTOSE___________0,1 g ÁGUA DESTILADA____________________1 L pH 6,8 ± 0,2 – 121ºC/15 min Fonte: SILVA, 2005
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TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS A técnica de tubos múltiplos é um método de análise quantitativo que permite determinar o Número Mais Provável (NMP) dos microorganismos alvo da amostra, através da distribuição de alíquotas em uma série de tubos contendo um meio de cultura diferencial para crescimento dos
microorganismos alvo. A
determinação do número de
microorganismos é baseada no princípio de que, uma amostra líquida, pode ser separada por agitação, resultando numa suspensão em que as células estejam uniformemente distribuídas. A combinação de tubos com crescimento positivo ou negativo, após a incubação permite estimar, por cálculo de probabilidade, a densidade original dos microorganismos na amostra (SILVA, 2005).
TECNOLOGIA DE SUBSTRATO DEFINIDO O Colilert utiliza tecnologia de substrato definido [Defined Substrate Technology (DST)] para detecção de coliformes totais e E. coli em água. À medida que os coliformes se reproduzem no Colilert, eles utilizam ß-galactosidase para metabolizar o indicador de nutriente ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo. O
E. coli utiliza
ß-glucuronidase para
metabolizar MUG e criar fluorescência. Já que a maioria dos não coliformes não conta com estas enzimas, eles não podem se reproduzir e interferir. Os poucos não coliformes que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz especificamente formulada do Colilert. Esta abordagem diminui a incidência de falso-positivos e falso-negativos.
Figura 1: reação cromogênica e fluorogênica Fonte: IDEXX, 2011.
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2 – OBJETIVO
Este relatório tem por objetivo analisar, detectar e quantificar a presença/ausência do Grupo Coliforme seja eles, Termotolerantes ou Totais em uma amostra de Água Mineral envasada da Marca Água Crim utilizando a técnica do número mais provável (NMP) e pelo método americano – Colilert – Tecnologia do Substrato Definido (TSD).
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3 – MATERIAIS E REAGENTES
MATERIAIS
Estufa para crescimento microbiano (BOD);
Saco estéril coletor para amostra;
Estantes para tubos de Ensaio;
Capela de Fluxo Laminar;
Proveta de 100 mL;
Tubos de Duhram;
Tubos de Ensaio;
Pipetas Graduadas;
Papel Madeira;
Barbante;
Erlenmeyer;
Autoclave;
Banho Maria;
Pera.
REAGENTES
Caldo Lauryl Sulfato Triptose (LST);
Água mineral.
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4 – PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
MÉTODO DO NMP – SÉRIE DE 5 TUBOS PREPARO DO MEIO DE CULTURA Caldo LST Com Concentração Tripla Pesou-se 5,87 g de LST sólido e homogeneizou-se em 55 mL de água destilada, aqueceu-se para melhor diluição do sólido. Cálculo LST 35,60 g --------------------------- 1000 mL de água
3 · X--------------------------------- 55 mL de água X = 5,87 g de LST sólido ESTERILIZAÇÃO Transferiu-se o caldo LST com concentração tripla para 5 tubos de ensaio, em seguida esterilizou-se na estufa por 15 minutos à 121ºC juntamente com as pipetas, os tubos de ensaio e Erlenmeyeres. INOCULAÇÃO 1ª ETAPA: TESTE PRESUNTIVO Higienizou-se a capela de fluxo laminar com álcool 70%, Transferiu-se a amostra da garrafa de água mineral para uma proveta de 100 mL, Pipetou-se 20 mL da amostra de água e transferiu-se para cada tubo contendo 10 mL de caldo LST com concentração tripla homogeneizou-se, sendo 5 amostras para o teste presuntivo com tubos de Duhram invertido. Em seguida incubou-se a 35ºC por 24-48 horas.
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Figura: Caldo LST e amostra 2ª ETAPA: CONFIRMATIVO
2.1 – Coliformes Totais Adiciona-se 1 mL das amostras com resultado positivo em quantidades de tubos de ensaio referente a quantidade de tubos positivos contendo 9 mL de caldo Verde brilhante. Incuba-se a 35ºC por 24-48h.
Figura: Caldo Verde Brilhante e amostra
2.2 – Coliformes termotolerantes (E. COLI) Adiciona-se 1 mL das amostras com resultado positivo em quantidades de tubos de ensaio referente a quantidade de tubos positivos contendo 9 mL de caldo EC. Incuba-se a 35ºC por 24-48h.
Figura: Caldo EC e amostra
MÉTODO AMERICANO – COLILERT – TECNOLOGIA DO SUBSTRATO DEFINIDO Coletou-se 100 mL da amostra em um saco estéril, em seguida adicionou-se o conteúdo de uma ampola contendo quantidade pré-distribuída do meio de cultura, disponível comercialmente e já esterilizado. Incubou-se a 35ºC por 18 horas.
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5 – RESULTADOS E DISCURSSÕES Após o período de 48h depois da incubação não ocorreu à formação de gás indicando resultado negativo para o teste presuntivo de coliformes. Porém para um resultado confiável e conclusível é necessário à realização do teste em triplicata. Com o resultado negativo do teste presuntivo não foi necessário à realização do teste confirmativo. O método americano após 18 horas mostrou-se negativo, confirmando o
resultado negativo do teste presuntivo com LST.
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6 – CONCLUSÃO
Com este experimento foi possível concluir que a água mineral analisada atende aos parâmetros microbiológicos de potabilidade e que não oferece riscos à saúde, o que foi confirmado pelos métodos do NPM e Colilert com o resultado negativo para presença de coliformes, porém para um resultado mais confiável ou para que se possa emitir um laudo é necessário à realização do teste em triplicata.
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7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Coordenação-Geral de Vigilância em Saúde Ambiental. Portaria MS n.º 518/2004 / Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, Coordenação- Geral de Vigilância em Saúde Ambiental – Brasília: Editora do Ministério da Saúde, 2005. 28 p. – (Série E. Legislação em Saúde). Disponível em: < http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/portaria_518_2004.pdf > Acesso: 17 de junho de 2011. SILVA, N.,
et al .
Manual de métodos de análise microbiológica da água. São Paulo:
livraria Varela, 2005.
Método
Colilert:
Tecnologia
de
Substrato
Definido.
Disponível
em:
<
www.idexx.compubwebresourcespdfen_uswater6406300l.pdf> Acesso: 17 de junho de 2011. SANT’ANA, A. S., et al . Qualidade Microbiológica de Águas Minerais, 2007.
