BAB I PENDAHULUAN 1.1.Latar Belakang
Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau mencegah proses oksidasi. Zat ini secara nyata mampu memperlambat atau menghambat oksidasi zat yang mudah teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah. Antioksidan juga sesuai didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan penyakit, radikal bebas ini dapat berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor eksternal lainnya Radikal bebas adalah spesies yang tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dan mencari pasangan elektron dalam makromolekul biologi. Protein lipida dan DNA dari sel manusia yang sehat merupakan sumber pasangan elektron yang baik. Kondisi oksidasi dapat menyebabkan kerusakan protein dan DNA, kanker, penuaan, dan penyakit lainnya. Komponen kimia yang berperan sebagai antioksidan adalah senyawa golongan fenolik dan polifenolik. Senyawa-senyawa golongan tersebut banyak terdapat dialam, terutama pada tumbuh-tumbuhan, dan memiliki kemampuan untuk menangkap radikal bebas. Antioksidan yang banyak ditemukan pada bahan pangan, antara lain vitamin E, vitamin C, dan karotenoid. Secara sederhana antioksidan dinyatakan sebagai senyawa yang mampu menghambat atau mencegah terjadinya oksidasi. Antioksidan memiliki kemampuan dalam memberikan elektron, mengikat dan mengakhiri reaksi berantai radikal bebas yang mematikan. Antioksidan yang dipakai kemudian didaur ulang oleh antioksidan lain untuk mencegahnya menjadi radikal bebas (bagi dirinya sendiri) atau tetap dalam bentuk tersebut tetapi dengan strukturm. Sayur dan buah dikenal sebagai sumber vitamin dan mineral. Sayur dan buah juga mengandung fitonutrien yang bersifat antioksidan yang dapat membantu tubuh menangkal berbagai penyakit. Di negara kita mempunyai banyak jenis sa yuran yang dapat dimanfaatkan. Saat ini sayuran seperti brokoli, okra, kol brussel, paprika, lettuce, dan lain-lain, juga mudah ditemui di negara kita. Ditambah jenis-jenis lokal, banyak sekali sayuran yang dapat dimanfaatkan untuk menambah variasi resep. Kaya akan antioksidan yang dapat merangsang fungsi pankreas untuk menghasilkan insulin.
1.2.Tujuan
1. Memperlihatkan proses oksidasi senyawa fenol oleh Polifenol Oksidase (PPO) kentang 2. Mahasiswa mampu memperlihatkan efek antioksidan vitamin C terhadap oksidasi fenol PPO oleh kentang 3. Mahasiswa mampu memperlihatkan bahwa oksidasi minyak dapat menyebabkan ketengikan pada minyak 4. Mahasiswa mampu menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan biologis
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1.Uji Oksidase dalam Kentang dan Pengaruh Pemberia Vitamin C
Fenol atau asam karbolat atau benzenol adalah zat kristal tak berwarna yang memiliki bau khas. Rumus kimianya adalah C 6H5OH dan strukturnya memiliki gugus hidroksil (-OH) yang berikatan dengan cincin fenil. Kata fenol juga merujuk pada beberapa zat yang memiliki cincin aromatik yang berikatan dengan gugus hidroksil. Fenol memiliki kelarutan terbatas dalam air, yakni 8,3 gram/100 ml. Fenol memiliki sifat yang cenderung asam, artinya dapat melepaskan ion H+ dari gugus hidroksilnya. Pengeluaran ion tersebut menjadikan anion fenoksida C6H5O yang dapat dilarutkan dalam air.Dibandingkan dengan alkohol alifatik lainnya, fenol bersifat lebih asam. Hal ini dibuktikan dengan mereaksikan fenol dengan NaOH, di mana fenol dapat melepaskan H+. Pada keadaan yang sama, alkohol alifatik lainnya tidak dapat bereaksi seperti itu. Pelepasan ini diakibatkan pelengkapan orbital antara satusatunya pasangan oksigen dan sistem aromatik, yang mendelokalisasi beban negatif melalui cincin tersebut dan menstabilkan anionnya. Fenol didapatkan melalui oksidasi sebagian pada benzena atau asam benzoat dengan proses Raschig. Fenol juga dapat diperoleh sebagai hasil dari oksidasi batu bara. Fenol merupakan komponen utama pada antiseptik dagang, triklorofenol atau dikenal sebagai TCP (trichlorophenol). Fenol juga merupakan bagian komposisi beberapa anestitika oral, misalnya semprotan kloraseptik. Fenol berfungsi dalam pembuatan obat-obatan (bagian dari produksi aspirin, pembasmi rumput liar, dan lainnya). Fenol yang terkonsentrasi dapat mengakibatkan pembakaran kimiawi pada kulit yang terbuka. Fenol merupakan komponen utama pada anstiseptik dagang, triklorofenol atau dikenal sebagai TCP (trichlorophenol). Fenol juga merupakan bagian komposisi beberapa anestitika oral, misalnya semprotan kloraseptik. Fenol berfungsi dalam pembuatan obat-obatan (bagian dari produksi aspirin) pembasmi rumput liar, dan lainnya. Fenol yang terkonsentrasi dapat mengakibatkan pembakaran kimiawi pada kulit yang terbuka. Enzim merupakan protein yang dihasilkan oleh sel hidup yang bertindak sebagai katalis dalam reaksi kimia organik, yang dapat mengubah bahan sedangkan dia sendiri tidak mengalami perubahan. Enzim tersebut dapat terus bekerja setelah kematian organisme. Berkaitan dengan hal tersebut, kinerja fenol dalam enzim, telah dilaporkan oleh beberapa
peneliti dengan objek percobaan yang berbeda-beda. Sebagai senyawa aromatic, fenol -bila ingin dihilangkan keberadaanya-, dapat dihilangkan dengan menggunakan enzim extracellular peroksidase dengan pH optimal 7-8. Pada pH netral, proses tersebut meningkat, namun mengalami penurunan seiring dengan meningkatnya suhu dari 0 -30 C. Kentang (Solanum tuberosum ) mudah sekali mengalami pencoklatan (browning), bila penenganannya kurang baik , salah satu factor yang mempengaruhi adalah asam askorbat, tirosin, enzim polifenol oksidase dan oksigen yang tersedia. Reaksi pencoklatan dapat terjadi melalui dua proses yaitu proses pencoklatan enzimatik, disebabkan adanya enzim PPO dan tirosin yang berperan sebagai substrat sedangkan proses non enzimatis disebabkan karena reaksi Meillard, karamelisasi atau oksidasi asam askorbat (Richardson, 1983 dalam 18).Proses pencoklatan yang terjadi akan mengurangi kualitas produk dan menurunkan minat konsumen (Friedman,1990 dalam18). Proses pencoklatan sebenarnya dimulai dari kentang yang dikupas, dipotong-potong, oksidasi asam askorbat, senyawa phenol seperti senyawa tirosin sebagai substrat, akan dikatalisis enzim PPO menjadi quinon dan berpolimerisasi membentuk o quinon, sehingga menghasilkan warna kecoklatan. Penentuan asam askorbat dalam varietas kentang digunakan untuk proses penghambatan pencoklatan kentang atau proses browning (inhibitor),
karena
menurut
Mondy,1993,
asam
askorbat
dapat
menghambat
enzim PPO pembentuk melanin. Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau mencegah proses oksidasi. Zat ini secara nyata mampu memperlambat atau menghambat oksidasi, zat yang mudah teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah. Antioksidan juga didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan penyakit, radikal bebas ini dapat berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor eksternal lainnya. Radikal bebas adalah spesies yang tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dan mencari pasangan elektron dalam makromolekul biologi.Protein lipida dan DNA dari sel manusia yang sehat merupakan sumber pasangan elektron yang baik. Kondisi oksidasi dapat menyebabkan kerusakan protein dan DNA, kanker, penuaan, dan penyakit l ainnya. Komponen kimia yang berperan sebagai antioksidan adalah senyawa golongan fenolik dan polifenolik. Senyawa-senyawa golongan tersebut banyak terdapat dialam, terutama pada
tumbuh-tumbuhan, dan memiliki kemampuan untuk menangkap radikal bebas. Antioksidan yang banyak ditemukan pada bahan pangan, antara lain vitamin E, vitamin C, dan karotenoid. Antioksidan diharapkan aman dalam penggunaan atau tidak toksik, efektif pada konsentrasi rendah (0,01-0,02%), tersedia dengan harga cukup terjangkau, dan ta han terhadap proses pengolahan produk. Antioksidan penting dalam melawan radikal bebas, tetapi dalam kapasitas berlebih menyebabkan kerusakan sel. Berdasarkan asalnya, antioksidan terdiri atas antioksigen yang berasal dari dalam tubuh (endogen) dan dari luar tubuh (eksogen). Adakalanya sistem antioksidan e ndogen tidak cukup mampu mengatasi stres oksidatif yang berlebihan. Stres oksidatif merupakan keadaan saat mekanisme antioksidan tidak cukup untuk memecah spesi oksigen reaktif. Oleh karena itu, diperlukan antioksidan dari luar (eksogen) untuk mengatasinya Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan dibedakan menjadi antioksidan primer yang dapat bereaksi dengan radikal bebas atau mengubahnya menjadi produk yang stabil , dan antioksidan sekunder atau antioksidan preventif yang dapat mengurangi laju awal reaksi rantai serta antioksidan tersier. Mekanisme kerja antioksidan selular menurut Ong et al. (1995) antara lain, antioksidan yang berinteraksi langsung dengan oksidan, radikal bebas, atau oksigen tunggal; mencegah pembentukan jenis oksigen reaktif; mengubah jenis oksigen reaktif menjadi kurang toksik; mencegah kemampuan oksigen reaktif; dan memperbaiki kerusakan yang timbul. Antioksidan primer berperan untuk mencegah pembentukan radikal bebas baru dengan memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil. Contoh antioksidan primer, ialah enzim superoksida dimustase (SOD), katalase, dan glutation dimustase. Sedangkan, Antioksidan sekunder berfungsi menangkap senyawa radikal serta mencegah terjadinya reaksi berantai. Contoh antioksidan sekunder diantaranya yaitu vitamin E, Vitamin C, dan β-karoten. Dan Antioksidan tersier berfungsi memperbaiki kerusakan sel dan jaringan yang disebabkan oleh radikal bebas, Contohnya yaitu enzim yang memperbaiki DNA pada inti sel adalah metionin sulfoksida reduktase. 2.2.Uji Ketengikan Lemak
Reaksi oksidasi lemak/minyak merupakan reaksi yang terjadi jika ada kontak antara oksigen dengan minyak atau lemak. Reaksi ini mengakibatkan minyak atau lemak rusak yang
ditandai dengan bau tengik. Pada reaksi oksidasi lemak/minyak ini terjadi proses oksidasi asam lemak tidak jenuh yang akan menghasilkan peroksida
Contoh Reaksi Oksidasi Minyak/Lemak Untuk menghindari terjadinya oksidasi maka digunakan antioksidan. Antioksidan adalah bahan tambahan yang digunakan untuk melindungi komponen-komponen makanan yang bersifat tidak jenuh (mempunyai ikatan rangkap), terutama lemak dan minyak. Meskipun demikian antioksidan dapat pula digunakan untuk melindungi komponen lain seperti vitamin dan pigmen, yang juga banyak mengandung ikatan rangkap di dalam strukturnya. Mekanisme kerja antioksidan secara umum adalah menghambat oksidasi lemak. Untuk mempermudah pemahaman tentang mekanisme kerja antioksidan perlu dijelaskan lebih dahulu mekanisme oksidasi lemak. Oksidasi lemak terdiri dari tiga tahap utama yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi. Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal asam lemak, yaitu suatu senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak stabil dan sangat reaktif akibat dari hilangnya satu atom hidrogen (reaksi 1). Pada tahap selanjutnya, yaitu propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksi (reaksi 2). Radikal peroksi lebih lanjut akan menyerang asam lemak menghasilkan hidroperoksida dan radikal asam lemak baru (reaksi 3).
Inisiasi
: RH — - R* + H*
Propagasi
: R* + O2 —– ROO*
(1) (2)
ROO* + RH —– ROOH +R* (3) Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek seperti aldehida dan keton yang bertanggungjawab atas flavor makanan berlemak. Tanpa adanya antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan mengalami terminasi melalui reaksi antar radikal bebas membentuk kompleks bukan radikal (reaksi 4) Terminasi
: ROO* +ROO* — - non radikal
(reaksi 4)
R* + ROO* — - non radikal R* + R* —– non radikal Adanya ion-ion logam seperti besi, tembaga, iodium, dll, dapat mendorong terjadinya oksidasi lemak, pada uji ketengikan lemak ini digunakan kalium iodida, dimana minyak tidak jenuh yang mengalami oksidasi, ikatan rangkapnya dapat berubah menjadi peroksida lemak yang ditandai dengan terjadinya ketengikan. Ikatan rangkap akan mengadisi iodium (I 2) sehingga ikatan rangkap pada minyak hilang. Bersamaan dengan itu warna iodium pun akan hilang. 2.3.Uji Peroksida Lipid dalam Cairan Biologis
Lipid merupakan sekelompok senyawa heterogen, meliputi lemak, minyak, steroid, malam (wax), dan senyawa terkait, yang berkaitan lebih karena sifat fisiknya daripada sifat kimianya. Lipid memiliki sifat umum berupa : relative tidak larut dalam air, dan larut dalam pelarut nonpolar misalnya eter dan kloroform. Peroksidasi (auto-oksidasi) lipid yang terpajan oleh oksigen bertanggungjawab tidak saja terhadap pembusukan makanan (rancidity,tengik), tetapi juga kerusakan jaringan in vivo. Peroksidasi ini dapat menjadi penyebab kanker, penyebab peradangan, aterosklerosis, dan penuaan. Efek merugikan diperkirakan disebabkan oleh radikal bebas (ROO ® , RO® , OH® ) yang dihasilkan sewaktu terbentuknya peroksida dari asam lemak yang mengandung ikatan
rangkap yang diselingi metilen, yi, radikal bebas asam lemak yang terdapat pada asam lemak tidak jenuh ganda alami. Peroksidasi lipid adalah suatu reaksi berantai yang menghasilkan radikal bebas secara terus menerus dan peroksidasi lebih lanjut.
Proses keseluruhan dapat diperlihatkan sebagai berikut: 1. Inisiasi ROOH + logam
(n)+
ROO® + logam (n-1)+ + H+ X® + RH
R ® + XH
2. Propagasi R ® + O2
ROO®
ROO® + RH
ROOH + R ® , dst
3. Terminasi ROO® + ROO®
ROOR + O2
ROO® + R ®
ROOR
R ® + R ®
RR
Karena precursor molecular untuk proses inisiasi umumnya adalah produk hidroperoksida ROOH, peroksidasi lipid adalah suatu reaksi berantai yang berpotensi merugikan. Untuk mengendalikan dan mengurangi peroksidasi lipid, baik manusia dalam aktivitasnya maupun alam menggunakan antioksidan. Propel galat, hidroksianisol terbutilasi (BHA), dan hidroksitoluen terbutilasi (BHT) adalah antioksidan yang digunakan sebagai zat tambahan makanan. Antioksidan alami antara lain adalah vitamin E (tokoferol) yang larut lipid, dan urat serta vitamin C yang larut air. Betakaroten adalah suatu antioksidan pada PO 2 rendah. Antioksidan terbagi menjadi dua kelas : 1) antioksidan preventif yang mengurangi laju inisiasi reaksi berantai; dan 2) antioksidan pemutus-rantai yang mengganggu propagasi reaksi berantai diatas. Antioksidan preventif mencakup katalase dan peroksidase lain misalnya glutation peroksidase yang beraksi dengan ROOH; selenium yang merupakan komponen esensial glutation peroksidase dan mengatur aktivitasnya serta chelator ion logam, seperti EDTA (etilendiamintetraasetat) dan DTPA (dietilentriaminpentaasetat). In vivo, antioksidan pemutus rantai yang utama adalah superoksida dismutase yang bekerja dalam fase cair untuk mengakap radikal bebas superoksida (O 2); urat; dan vitamin E yang bekerja dalam fase lipid untuk menangkap radikal ROO ®
Peroksidasi juga dikatalisis in vivo oleh senyawa heme dan oleh lipoksigenase yang terdapat di trombosit dan leukosit. Produk lain auto-oksidasi atau oksidasi enzimatik yang penting secara fisiologis adalah oksisterol (dibentuk dari kolesterol) dan isoprostan (prostanoid).
Gambar diatas merupakan reaksi terjadinya peroksidasi lipid. Reaksi dimulai oleh suatu radikal bebaas yang sudah ada (X’), oleh sinar, atau oleh ion logam. Malondialdehid hanya dibentuk oleh asam lemak dengan tiga atau lebih ikatan rangkap dan digunakan sebagai ukuran peroksidasi lipid bersama dengan etana dari dua karbon terminal asam lemak ω3 dan pentane dari lima karbon terminal asam lemak ω6.
BAB III METODOLOGI PRAKTIKUM Praktikum Biokimia ―Antioksidan dan Oksidasi Biologi‖ dilakukan pada hari Jum’at, 16 Oktober 2015 di Laboratorium Biokimia Lantai 2 Gedung Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 3.1 Uji Oksidasi dalam Kentang
Bahan
:
Ekstrak Kentang
Larutan Fenol 1 %
Larutan Pirogalol
Larutan Vitamin C
Apel
Pisang
Air Jeruk
Aquadest
Peralatan:
Beaker Gelas
Pipet tetes
Pisau
Tabung Reaksi
Cara Kerja
: Tabung
Bahan
1
2
3
4
Ekstrak Kentang (mL)
5
5
5
5
Lar. Vitamin C
-
10 tetes
-
10 tetes
Lar. Fenol
10 tetes
10 tetes
-
-
Lar. Pirogalol
-
-
10 tetes
10 tetes
Masing-masing tabung di kocok dan diamati perubahan yang terjadi.
Tabung
Bahan
1
2
Potongan Pisang
1
1
Potongan Apel
1
1
Aquadest
5 Ml
5 mL
Air Jeruk
5 mL Lihat perubahan yang terjadi
3.2 Uji Ketengikan Lemak
Bahan
:
Minyak tanpa pemanasan
Minyak yang sudah dipanaskan
Cara Kerja
: Bahan Minyak tanpa pemanasan
Tabung 1
2
5 mL
Minyak yang sudah dipanaskan Tetes kan KI dan hitung jumlah tetesan KI yang digunakan.
5mL
3.3 Uji Peroksida Lipid dalam Cairan Biologis
Bahan
:
Hemolisat Darah
Larutan TBA 0,67%
Larutan TCA 10%
Cara Kerja
:
Bahan
Uji 1
Uji 2
Hemolisat darah (mL)
1
-
Larutan aquadest (mL)
1
1
Larutan TCA 10% (mL)
2
2
Sentrifugasi (4000 rpm) dan ambil supernatan Larutan TBA 0,67% (mL)
3
3
Didihkan 10 menit, setelah dingin lihat besar absorbansi dengan Spektrofotometer pada λ 532 nm
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil
4.1.1. Tabel Hasil Uji Antioksidan dan Oksidasi Biologi Uji
IA
Vit. C
1. Fenol
(Ekstrak
Kentang)
Keterangan
Coklat muda, end. Putih
2. Vit. C + Fenol
Merah muda terang, end. Putih
3. Lar. Pirogalol
Coklat
kehitaman,
end.
Putih 4. Vit. C + Pirogalol
Vit. C (Pisang, Apel)
Coklat susu, end. Putih
1. Air + Buah + Vit.C
Buah : Fresh, warna seperti semula (putih). 2. Air + Buah
Buah Coklat.
:
Berubah
menjadi
Minyak
1. Minyak Kelapa
6 tetes I2, warna jingga, stabil jika dikocok.
2. Minyak Jelanta
5 tetes I2, warna jingga sedikit coklat, stabil saat di kocok.
MDA
A = 0,557 MDA = MDA =
Ã
0,557 153000
MDA = 3,6448 x 10 -6 M/cm
4.2. Pembahasan
Pada praktikum Biokimia Klinis kali ini, kami melakukan uji Antioksidan dan Oksidasi Biologis. Beberapa uji yang dilakukan diantaranya Uji Oksidasi dalam Kentang dan Pengaruh Pemberian Vitamin C pada Buah, Uji Ketengikan Lemak dan Uji Peroksida Lipid dalam Cairan Biologis. Pada percobaan pertama, yaitu uji Oksidasi dalam kentang dan pengaruh pemberian vitamin C, kami menggunakan kentang, apel dan pisang sebagai bahan uji. Asam yang digunakan sebagai sumber vitamin C adalah jeruk nipis. Untuk uji Oksidasi dalam kentang kami akan melihat proses oksidasi senyawa fenol oleh folifenol oksidasi (PPO) dan penghambatan oksidasi fenol tersebut oleh PPO dengan penambahan vitamin C. Pertama-tama, kentang dikupas dan dicuci bersih. Setelah itu dipotong-potong dan di blender dengan aquadest secukupnya. Kemudian disaring dengan menggunakan kain dan diperoleh ekstrak kentang.Selanjutnya diambil masing-masing sebanyak 5 ml ekstrak kentang dan dimasukkan ke dalam empat buah tabung reaksi. Setelah diberi label, diberikan larutan Vit. C sebanyak 10 tetes ke dalam tabung 2 dan 4. Kemudian ditambahkan masing-masing 10 tetes larutan Fenol ke dalam tabung 1 dan 2, dan 10 tetes larutan Pirogalol ke dalam tabung 2 dan 4. Keempat tabung dikocok dan diamati warna yang terbentuk. Hasil menunjukkan bahwa adanya endapan putih pada keempat tabung. Pada tabung 1 (ekstrak kentang + fenol), warna yang terbentuk adalah coklat muda, ini menunjukkan adanya reaksi oksidasi senyawa fenol
oleh enzim yang dimiliki kentang yaitu PPO. Fenol diubah menjadi katekol oleh PPO, kemudian menjadi kuinon. Terbentuknya warna coklat muda tersebut dikarenakan adanya proses kondensasi pada reaksi tersebut. Pada tabung ke 2 (ekstrak kentang + fenol + vit. C) membentuk warna merah muda, warna coklat yang harusnya terbentuk dihambat oleh vitamin C (jeruk nipis). Pada tabung ke 3 (ekstrak kentang + pirogalol) warna larutan menjadi coklat kehitaman, hal ini menunjukkan bahwa telah terjadi perubahan pirogalol menjadi purpurogelin oleh enzim PPO. Dan tabung ke 4 (ekstrak kentang + pirogalol + vit. C) memberikan warna coklat susu, dikarenakan penghambatan vitamin C (jeruk nipis) sehingga purpurogalin tidak terbentuk. Selanjutnya yaitu uji pegaruh pemberian vit. C terhadap buah apel dan pisang. Buah dirajang halus kemudian di masukkan ke dalam dua gelas beaker atau botol jam yang berbeda. Masing-masing ditambahkan aquadest secukupnya. Salah satu gelas beaker ditambahkan vit. C (larutan jeruk nipis). Kemudian diamkan selama 30 menit. Hasil menunjukkan bahwa botol
jam berisi buah dan aquadest yang ditambah vitamin C memberikan warna buah yang fresh (tetap seperti semula). Sementara botol jam yang hanya berisi buah dan aquadest menunjukkan adanya perubahan pada warna buah, yaitu buah menjadi berwarna coklat. Hal ini menunjukkan bahwa pada buah + aquadest yang ditambah vitamin C, memperlihatkan adanya penghambatan proses oksidasi buah oleh vitamin C (jeruk nipis) yang berperan sebagai anti oksidan, sehingga buah terlihat fresh. Sedangkan buah yang hanya diberikan aquadest tanpa penambahan vit. C, mengalami perubahan warna menjadi coklat karena tidak ada yang dapat menghambat proses oksidasinya. Pengujian selanjutnya adalah uji ketengikan lemak. Pada praktikum kali ini, bahan yang digunakan adalah minyak baru (minyak jernih) dan minyak bekas pakai atau lebih sering kita kenal dengan minyak jelantah. Dan sebagai reagen uji digunakan Iodium (I 2). Minyak yang tidak jenuh memiliki ciri yang sangat spesifik. Minyak baru berwarna jernih, dan masih memiliki ikatan rangkap. Sedangkan pada minyak jenuh berwarna coklat jenuh, dan ikatan rangkapnya telah putus akibat pemanasan. Minyak tidak jenuh bila mengalami oksidasi, ikatan rangkapnya dapat berubah menjadi peroksida lemak yang ditandai dengan terjadinya ketengikan atau bau tak sedap. Ikatan rangkap akan mengadisi iodium (I 2) sehingga ikatan rangkapnya hilang. Bersamaan dengan itu warna Iodium akan hilang. Uji ketengikan lemak dilakukan dengan diambil masing-masing 5 ml di dalam dua tabung yang berbeda. Dan di teteskan Iodium ke dalam masing-masing tabung hingga warna jingga yang konstan. Hasilnya adalah pada tabung yang berisi minyak jernih diperlukan 6 tetesan Iodium
hingga warna jingga konstan. Dan tabung yang bersi minyak jelantah diperlukan 5 tetesan Iodium hingga warna jingga konstan. Hal ini disebabkan karena pada minyak jelantah, ikatan rangkapnya telah banyak terputus. Sehingga Iodium hanya mengadisi sedikit ikatan rangkap yang dimiliki oleh minyak jelantah. Pada minyak jernih, ikatan rangkap yang dimiliki masih sangat banyak. Sehingga butuh lebih banyak Iodium yang diperlukan untuk mengadisiikatan rangkap yang dimiliki minyak jernih. Pengujian yang terakhir adalah uji peroksida lipid dalam cairan biologis. Kita mengukur kadar peroksida lipid di dalam cairan biologis, cairan biologis yang digunakan adalah darah. Asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida lipid. PUFA (Poly Unsaturated Fatty Acids) pada manusia disintesis dari MUFA (Mono Unsaturated Fatty Acid ), melalui penambahan ikatan rangkap antara ikatan rangkap yang sudah ada (D9) dan gugus karboksil – menghasilkan asam lemak. Peroksidasi lipid adalah reaksi penyerangan radikal bebas terhadap asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) yang mengandung sedikitnya tiga ikatan rangkap. Reaksi ini dapat terjadi secara alami di dalam tubuh yang diakibatkan oleh pembentukan radikal bebas secara endogen dari proses metabolisme di dalam tubuh. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh radikal bebas seperti radikal anion superoksida, radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara berkesinambungan dapat dibuat oleh tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh dapat memulai suatu reaksi berantai yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini dihilangkan oleh radikal bebas lain dan oleh sistem antioksidan tubuh. Peroksidasi lipid merupakan proses yang bersifat kompleks akibat reaksi asam lemak tak jenuh jamak penyusun fosfolipid membran sel dengan senyawa oksigen reaktif (ROS), membentuk hidroperoksida. Pertama, ROS ialah senyawa turunan oksigen yang lebih reaktif dibandingkan oksigen pada kondisi dasar (ground state).Kedua, ROS tidak hanya terdiri atas molekul oksigen tanpa pasangan elektron seperti radikal hidroksil (·OH), radikal superoksida (·O2-), dan nitrit oksida (NO·), tetapi juga molekul reaktif yang memiliki electron berpasangan. Molekul oksigen yang memiliki electron berpasangan tersebut diantaranya, hidrogen peroksida (H2O2), asam hipoklorous (HOCl), dan anion peroksinit rit (ONOO-).3 Target utama peroksidasi oleh ROS adalah asam lemak tak jenuh majemuk (PUFA) dalam lipid membran. PUFA didegradasi oleh radikal-radikal bebas membentuk malondialdehid (MDA). Kadar MDA dalam serum berfungsi sebagai sebuah penanda kerusakan seluler akibat radikal bebas.
Peroksidasi lipid dapat menghasilkan oksigen tunggal, hidroperoksida dan epoksida lipid. Aldaheida yang dapat terbentuk pada peroksidasi lipid adalah malondialdehida (MDA) dan 4-hidroksinonenal (4-HNE). MDA adalah metabolit utama pada asam lemak arakidonat (20:4). Uji MDA (TBARS) digunakan untuk mengukur peroksidasi yang terjadi pada membran lipid. 4-HNE dihasilkan oleh arakidonat melalui autooksidasi. 4-HNE bereaksi dengan komponen seluler lebih kuat dibandingkan dengan MDA. Oleh karena itu 4-HNE lebih toksik dibandingkan MDA akan tetapi tidak reaktif dengan TBA. Peroksidasi lipid pada asam lemak tak jenuh rantai panjang. Hal pertama yang harus dilakukan adalah mengambil darah dari donor, dalam hal ini darah yang di ambil pada bagian lengan dengan volume pengambilan 2 ml untuk dua uji dan satu blanko. Pada uji 1 ditambah kan 1ml darah sedangkan blanko ditambahkan aquadest selanjutnya pada blanko ditambahkan TCA 10% penambahan TCA bertujuan agar protein yang terkandung dalam darah pada uji 1 mengalami presipitasi setelah di sentrifugasi pada 4000rpm. Presipitasi protein dilakukan karena kandungan protein yang terkandung dalam darah akan mengganggu penetapan kadar peroksida lipid. Mekanisme TCA 10 % sebagai agen presipitasi yakni ion negatif dari TCA akan bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan dalam kondisi asam hingga pH isoelektrik protein) hingga membentuk garam protein. Beberapa garam yang dihasilkan tersebut tidak larut dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk memisahkan protein dari larutan. . Umumnya agen presipitasi akan melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan adanya penambahan basa (membentuk protein yang bermuatan negatif atau anionic protein). TCA umumnya digunakan untuk protein protein yang telah berada dalam keadaan bebas pada filtrat darah dan pada pemeriksaan awal materi biologis. Selanjutnya setelah disentrifugasi pada 4000rpm dan supernatantnya diambil dan tambahkan larutan TBA 0,67% yang telah dipanaskan. Tujuan pemanasan adalah agar TBA segera bereaksi dengan supernatant dan memberikan warna merah yang menandakan bahwa mengandung malondialdehida (MDA). Selanjutnya didihkan selama 10 menit, dan setelah dingin dibaca pada panjang gelombang 532 nm.
Malonaldehida, 4-hidroksinonenal, dan heptanal,merupakan aldehida-aldehida hasil dekomposisi senyawa hidroperoksida, yang bereaksi dengan TBA dan menghasilkan warna merah. Warna merah tersebut menyerap cahaya ultraviolet pada panjang gelombang (λ) 532 nm. Kemampuan TBA bereaksi dengan aldehida atau keton, karena adanya atom karbon nomor 5 (C-5) TBA yang reaktif (Guzman-Chozas dkk., 1998).Rasio reaksi antara TBA dengan aldehida berbedabeda,misalnya rasio reaksi TBA dengan 2-heksenal adalah 1:1 dan rasio reaksi TBA dengan malonaldehida adalah 2:1 (Guzman-Chozas dkk., 1998). Ada tidaknya ikatan rangkap pada asam lemak dapat mempengaruhi hasil akhir oksidasi lemak. Kishida dkk. (1993b) menyatakan, bahwa oksidasi asam lemak tak-jenuh menghasilkan thiobarbituric acid reactive substances, sedangkan oksidasi asam lemak jenuh tidak menghasilkan thiobarbituric acid reactive substances. Uji TBA hanya mendeteksi MDA bebas dan mengukur jumlah MDA bebas dalam sistem lipid peroksidasi. Pada uji 1 menunjukkan warna merah muda yang bearti positif terkandung Malondialdehida. Malondialdehida merupakan proses akhir dari peoksidasi lipid. Sedangkan blanko tidak menunjukkan perubahan warna dan larutan blanko tetap bening. Pada pembacaan panjang gelombang 532 nm oleh UV VIS dilakukan secara triplo dan diperoleh kadar Malondialdehida (MDA) sebagai berikut. Absorban pertama bernilai 0,526. Absorban kedua bernilai 0,584. Dan absorban ketiga bernilai 0,563. Sehingga di dapatkan absorban rata-rata didapatkan 0,557. Dan absorban rata-rata dimasukkan ke dalam rumus perhitungan kadar MDA sehingga didapatkan kadar MDA senilai 3,6448 x 10 -6 M/cm.
BAB V KESIMPULAN
Kesimpulan dari hasil praktikum antioksidan dan Oksidasi Biologi yaitu: 1. Pada Oksidasi kentang dan pengaruh vitamin C, Kentang yang diberikan dengan fenol maupun pirogalol memiliki warna lebih cerah dibandingkan kentang yang hanya diberikan fenol atau pirogalol. 2. Buah pisang dan apel yang diletakkan didalam perasan air jeruk memiliki penampilan yang tetap fresh
dibandingkan dengan yang diletakan di dalam air. Buah yang
diletakkan didalam air menjadi berwarna kecoklatan 3. Vitamin C atau Asam Askorbat dapat menjadi antioksidan 4. Pada Ketengikan Minyak, Minyak kelapa membutuhkan lebih banyak iodin untuk memutuskan ikatan rangkapnya dibandingkan dengan minyak jelanta. Minyak Kelapa memiliki ikatan rangkap yang lebih banyak dibandingkan minyak jelanta. 5. Hasil Absorbansi MDA pada percobaan peroksida lipid dalam cairan biologis yaitu sebesar 0,557 dengan hasil kadar MDA sebesar 3,6448 x 10 -6 M/cm
DAFTAR PUSTAKA Guzman,Chozas dkk. 1998. ―The Thiobarbituric Acid (TBA) Reaction in Foods: A Review, Critical Reviews in Food Science and Nutrition‖. 38:4, 315-350 Elfita dkk,Lina. 2014. Penuntun Praktikum Biokimia Klinis , FKIK Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta www.Repositoryusu.ac.id diakses pada tanggal 17 Oktober pukul 17.00WIB Winarno, F. G. & T. S. Rahayu. 1994. Bahan Makanan Tambahan Untuk Makanan dan Kontaminan. Pustaka Sinar Harapan: Jakarta
