CURVA DE CRECIMIENTO
I.
INTRODUCCIÓN Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetría mide la entidad de luz transmitida por la suspensión, mientras que la medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometría. Por estos procedimientos se puede estimar el número de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. El espectrofotómetro es el aparato apar ato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. el egida. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica e inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. Normalmente la multiplicación bacteriana no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta última es directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión. La relación entre la transmitancia y la absorbancia se expresa matemáticamente de la siguiente manera: Absorbancia = 2 - log % de transmitancia Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelómetro. Para el manejo práctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy útil el uso de matraces con brazo lateral, ya que permite la realización de medidas sin necesidad de tomar muestras del cultivo, evitando así el riesgo de contaminación por la manipulación.
II. OBJETIVOS 1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano. 2) Realizar una curva de multiplicación bacteriana.
Práctica 9: Curva de crecimiento
III. FUNDAMENTO TEÓRICO Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la célula aumentan en cantidad, en la mayoría de organismos el crecimiento continuo hasta que la célula se divide en dos nuevas células, proceso denominado fisión binaria. Cada una de las células hijas recibe, un cromosoma completo, copias de todas las macromoléculas, monómeros e iones inorgánicos. El intervalo para la formación de dos células a partir de una se llama generación y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación,na entre los microorganismos, algunos crecen rápidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros requieren de una a tres horas, otros de varias horas o incluso días.
3.1. CURVA DE CRECIMIENTO Si se inocula un medio liquido con células microbianas, procedentes de un cultivo que ha crecido a saturación, en el que se ha determinado el número de células variables por minuto periódicamente y trazamos una gráfica de ello, se obtiene una curva de crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases fundamentalmente y son las siguientes: 1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptación, los microorganismos se encuentran desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados hasta alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se reinicie. 2. Fase Exponencial.- Llamada fase logarítmica, es consecuencia de la división celular y las nuevas células crecen en progresión geométrica, se sintetiza nuevo material celular a velocidad constante aumentando la masa en forma exponencial. 3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos metabólicos tóxicos. Aquí cesa el crecimiento de una población. 4. Fase de Declinación.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con el microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel sostenido. Fases de Crecimiento Latencia
Exponencial
Estacionaria
Rezago Adaptación
Logaritmo Divisón celular Crecimiento
Nutrientes se agotan Acumulan metabolitos tóxicos Sesa crecimiento
Muerte Declinación
1
9,0 s o m l si n
m/ gr b
s a
8,0 le
o 0
L
o
g
1
Viables
ia
Turbidez (densidad óptica)
0,75 n
e
D s a
id
0,5 v
ó
d p
7,0 ti c a
0,25
6,0
5,0
0,1 Tiempo
Práctica 9: Curva de crecimiento
IV. PARTE EXPERIMENTAL 4.1 MATERIALES Y REACTIVOS -
Cubres Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo Cubetas Caldo Luria Bertani estéril Jeringa descartable de 10 cc. Contómetro
Equipo -
V.
Mechero Bunsen Estufa de incubación a 37ºC Microscopio Espectrofotómetro
METODOLOGIA 5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO Curva de Crecimiento.- Las células que están creciendo en un cultivo discontinuo (en un matraz en agitación) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento: una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las células en fase de latencia, que proceden de una alícuota de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida. Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo rápido. La duración de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y genotipo del inóculo, de la temperatura, de la concentración en nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la aireación, y de la concentración de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo. Una vez que las células empiezan a crecer rápidamente, se dice que han entrado en la fase de crecimiento logarítmica (log) o exponencial. En este estadio las células crecen rápidamente, y a diferencia de las células de las fases de latencia y estacionaria, la mayoría de las células se hallan en el mismo estado fisiológico. La velocidad de crecimiento durante la fase log depende del nivel de nutrientes y de la aireación de cultivo. La constante de velocidad de crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicación o tiempo de generación). Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo y se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el cultivo a la fase estacionaria. En la fase estacionaria las células no están todas en el mismo estado fisiológico; algunas todavía se están dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morirse. Pero la población total se mantiene constante. Conforme se agota la mayor parte de
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los nutrientes, el número de células que mueren sobrepasa al número de células que se producen, y el cultivo entra en la fase de muerte.
Realización (Fig. 1) (Todas las maniobras que se describen a continuación se deben realizar en condiciones de esterilidad en las proximidades del mechero.) 1. Añadir solución salina estéril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 mi) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación. 2. Tomar 0.5 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz con 50 ml de Caldo Luria Bertani estéril. 3. Incubar el matraz en un baño termostatado a 37 ºC, con agitación (200 rpm). 4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540 nm). Ajustar el espectrofotómetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo Caldo Luria Bertani estéril antes de cada medida. 5. Recoger alícuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubación y colocadas en refrigeración hasta su lectura 6. Dibujar una curva de multiplicación con los datos obtenidos, colocando en el eje de abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.
Práctica 9: Curva de crecimiento
Práctica 9: Curva de crecimiento
VI. RESULTADOS Tabla N.1: Recopilación de Datos Muestra
Tiempo
Absorvancia
1
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210
0.075 0.082 0.095 0.108 0.126 0.196 0.280 0.344 0.390 0.461 0.428 0.434 0.432 0.440 0.452
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Grafica 1: Absorvancia vs. Rango de tiempo 0.500
0.450
0.400
0.350
A I 0.300 C N A V 0.250 R O S B0.200 A 0.150
0.100
0.050
0.000 0
50
100
150
TIEMPO (MIN)
200
250
Práctica 9: Curva de crecimiento
VII. OBSERVACIONES
Cuanto mayor pasaba el tiempo, se observaba que el cultivo tenía mayor turbidez
En la gráfica se puede distinguir, las fases de crecimiento de la Escherichia Coli
Grafica 2: Fases de crecimiento de la E. Coli 0.500 0.450 0.400 0.350 a i c n a v r o s b A
FASE ESTACIONARIA
FASE EXPONENCIAL
0.300 0.250 0.200
FASE LAG
0.150 0.100 0.050 0.000 0
50
100
150 Tiempo (min)
200
250
Práctica 9: Curva de crecimiento
CUESTIONARIO: 1. ¿Por qué se calibra el espectrofotómetro a 100% de transmitancia con medio de cultivo estéril?
Porque con este medio sin inoculo la muestra no presenta turbidez y es transparente lo que determina un estado inicial donde la luz emitida no es absorbida por la muestra, sino únicamente por el medio Cuando el medio no contiene aun al microorganismo se considera un estado cero, por tanto al calibrar el espectrofotómetro con el medio únicamente, los valores de absorbancia registrados solo considerará a los microorganismos 2. ¿Por qué motivo puede ser de alguna forma útil conocer la curva de multiplicación de una bacteria?
Para conocer los tiempos en que dura cada una de las etapas del crecimiento de un microorganismo, reconocer los periodos de Acostumbramiento, de crecimiento, estacionario y el periodo de muerte; para nuestro caso solo se puede identificar las fases de acostumbramiento y de crecimiento Estos datos se pueden utilizar en el control de un análisis de este mismo microorganismo, ya sea de control de crecimiento para aprovechar su velocidad de multiplicación, o también para conocer la velocidad de infección que puede producir 3. Identificar en la gráfica las fases del desarrollo microbiano.
Grafica 3: Fases de crecimiento de la E. Coli 0.500 0.450 0.400
FASE EXPONENCIAL
0.350 a i c n a v r o s b A
FASE ESTACIONARIA
0.300 0.250 0.200
FASE LAG
0.150 0.100 0.050 0.000 0
50
100
150 Tiempo (min)
200
250
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VIII.CONCLUSIONES Se realizó la curva “Absorbancia vs tiempo” identificando las etapas de crecimiento microbiano de la E. Coli. La Absorbancia mide la turbidez en que tiene el cultivo, la turbidez indica la cantidad de microorganismos presentes.
IX. BIBLIOGRAFÍA CRECIMIENTO BACTERIANO - Benintende, Silvia y Sanchez, Cecilia Microbiología Agrícola
Cátedra
–
REPRODUCCIÓN Y CRECIMIENTO MICROBIANO – Universidad Central de Venezuela MICROBIOLOGIA INUSTRIAL – Dictado de clases – Ing. Marcia Quequezana
