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INSTRUCTIVO
AISLAMIENTO DE ARN EN LEVADURAS
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1. OBJETIVOS
1.1 Aislar ARN a partir de levadura Saccharomyces cerevisae seca
2. INTRODUCCION
El ARN, a diferencia del ADN, se distribuye en toda la célula. La mayoría del ARN
se
encuentra
en
el
citoplasma
como
ARN
soluble
ribosomal,
pero
aproximadamente el 10% se encuentra en el núcleo y un poco cantidad se halla en las mitocondrias. Para que le ADN y ARN pueda ser analizados y estudiados por los diferentes métodos métodos propuestos, propuestos, es necesario que que previamente éstas macromoléculas sean aisladas de la estructura celular. Según el método de extracción, el método PLUMMER, el ARN se obtiene de un homogenizado de células de levaduras al cual se le agregará una solución de fenol concentrada. Esta solución de fenol concentrada rompe los enlaces de hidrógeno en la macromolécula, causando desnaturalización de la proteína. La suspensión turbia se centrifuga y aparecen dos fases: la fase inferior de fenol contiene ADN y la superior acuosa contiene carbohidratos y ARN. La proteína desnaturalizada se halla presente en ambas fases y puede removerse por centrifugación. El ARN se precipita luego con etanol. El producto obtenido no contiene ADN pero generalmente está contaminado con polisacáridos. Se puede obtener mayor purificación tratando esta preparación con amilasa. Para determinar la presencia de ARN extraído se puede utilizar métodos espectrofotométricos como la absorción ultravioleta (basado en el gran poder de absorción de los ácidos nucleicos en la región UV del espectro), ó métodos químicos colorímetros (basados en la capacidad de determinados compuestos para formar complejos carnogénicos al reaccionar con los ácidos nucleicos). La presente experiencia de laboratorio tiene como finalidad extraer o aislar ARN de células de Saccharomyces Saccharomyces cerevisae
“levadura de de pan o vino”. vino”. El reactivo de
orcinol, en presencia de cloruro férrico como catalizador, reacciona con furfural, formado por calentamiento de la pentosa con HCLcc, para dar un color verde
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AISLAMIENTO DE ARN EN LEVADURAS
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3. MATERIAL METODOS
3.1 Material Biologico: Levadura Saccharomyces cerevisae (10g de levadura seca)
3.2. Reactivos y soluciones Solución concentrada de fenol Acetato de potasio al 20% Alcohol etílico comercial Mezcla etanol:agua (3:1) Reactivo orcinol Agua destilada
3.3. Material y equipos de laboratorio Balanza y centrifuga Bagueta y gotero de punta fina Vaso de PP Pipetas Tubos de ensayos Baño maría
4.
PROCEDIMIENTO: 4.1.
AISLAMIENTO DE ARN
Suspender 10g de levadura seca activa en 40 ml de agua destilada a 37°C e incubar por 15 minuto a esta temperatura
Retira el beaker, agregar 5oml de solución concentrada de fenol (muy corrosivo) y agitar mecánicamente la suspensión durante 30 minutos a T° ambiente
Centrifugar en frio a 4000 rpm durante 10 minutos para romper la emulsión
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Con una pipeta de punta fina trasvasar cuidadosamente la capa superior acuosa a un tubo de ensayo y centrifugar en frio a 4000 rpm durante 10 minutos más para separar la proteína desnaturalizada
Medir el volumen de sobrenadante obtenido, trasvasar a un beaker de 100 ml y agregar acetato de potasio al 20% hasta obtener una concentración final de 2% (20g/L) de la sal
Precipitar el ARN añadiendo dos volúmenes de alcoholo etílico comercial. Lugo, colocar el sistema en hielo y dejarlo allí por una hora (este tiempo estará en función de una franca y mayor precipitación del ARN)
Separar el precipitado por centrifugación en frio a 3500 rpm por 5 minutos. Opcionalmente, se puede eliminar por decantación una cantidad prudencial del volumen total antes de centrifugar
Lavar el precipitado con 8ml de una mezcla etanol:agua (3:1), disolviendo con una bagueta y centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos
Lavar el precipitado con 8ml de etanol, centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos y eliminar el sobrenadante, el precipitado es ARN
4.2. EVALUACION DEL AISLAMIENTO DE ARN (REACCION DE ORCINOL) COMPONENTES (ml) Y PROCESO
Agua destilada Precipitado (ARN) Reactivo orcinol
SISTEMA (Tubos) 1
2
1
1
pizca
------
1
1
Calentar en baño de agua de ebullición por 5-10 minutos. Retirar los tubos y enfriar Agua destilada
2
2
Mezclar y observar una coloración verde la cual indica presencia de ARN
La intensidad del color verde estará expresada que tanto se ha aislado el ARN
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5.
ESQUEMA.
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6.
RESULTADO
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7.
DISCUSION.
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8.
CONCLUSION.
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9.
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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
10. CUESTIONARIO.
1.
¿Cuál es el efecto del fenol sobre las levaduras?
2.
¿Porqué se utiliza el acetato de potasio en la extracción del ARN?
3.
¿Cuál es el efecto del etanol en el proceso de extracción del ARN?
4.
¿Cuáles son los constituyentes del ARN?
5.
¿Porqué se emplea el reactivo de orcinol?
6.
¿Qué tipos de ARN conoces? Señale las características de cada uno de ellas
7.
¿Todos los organismos vivos presentan ARN?
8.
¿Cuál es el papel biológico del ARN?
9.
¿en qué se diferencia las moléculas de ARN de la ADN?
10. ¿A qué se debe la coloración verde luego de adiciona el reactivo de orcinol?
