UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS FACULTAD DE MEDICINA LICENCIATURA MÉDICO CIRUJANO
1° B T. L. LETICIA GARCÍA GÓMEZ
PRACTICA No. 3 FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS Y DIALISIS (MÉTODO DE DACIE Y LEWIS)
OBJETIVOS. Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: 1.- Explicar en qué consiste el fenómeno de la osmosis 2.- Deducirá el movimiento del solvente cuando se utilizan soluciones de diferente concentración, separadas por una membrana semipermeable. 3.- Valorará el grado de hemólisis que sufren los glóbulos rojos cuando se ponen en contacto con soluciones salinas de diferente concentración.
HIPÓTESIS Al cambiar la concentración del medio donde se encuentran los eritrocitos, éstos deberán sufrir cambios en su estructura, como es la plasmólisis(disminución del volumen interno) cuando el medio es hipertónico y la turgencia (aumento del volumen interno) cuando el medio es hipotónico.
INTRODUCCIÓN. Las membranas celulares cumplen muchas funciones: sirven de límite a la célula y permite un intercambio de materiales entre la célula y los líquidos que la rodean. El proceso de selección es sumamente refinado para que solo pasen los materiales apropiados; esta selección se logra por transporte activo y por la naturaleza de las membranas, de modo que solo permiten el paso de ciertas células; por esto las membranas se les consideran semipermeables. Las membranas permiten el paso de moléculas de agua; pero no de los solutos de cualquier tipo. Si se usa una membrana para separar una solución diluida de otra concentrada, se registrará un flujo neto de solvente hacia el lado mas concentrado, el sistema se mueve para igualar las concentraciones. Cuando las concentraciones lleguen a ser iguales ya no se registra un flujo neto de solvente en ningún sentido a través de la membrana. Al flujo neto del solvente que va de la solución diluida (o solvente puro), hacia la mas concentrada, atravesando una membrana semipermeable lo conocemos con el nombre de osmosis, y a la presión que hay que ejercer sobre la solución concentrada, para mantener el equilibrio en la diluida, se la llama presión osmótica. La presión osmótica es directamente proporcional al número de partículas en solución. Cuando un liquido tiene la misma concentración de partículas que el plasma, se le llama isosmotico o isotónico; las soluciones con mayor concentración de partículas son hipertónicas y las que tienen menor concentración, son hipotónicas. El termino osmolaridad se refiere a la concentración molar de solutos que ejercen una presión osmótica.
FUNDAMENTO. Si se colocan glóbulos rojos normales en soluciones hipotónicas, con menor concentración de solutos, con respecto al interior de la célula estos sufrirán un
aumento de volumen interno ya que la membrana del eritrocito es semipermeable y dejará pasar por efecto osmótico, agua del exterior al interior hasta llegar un momento en el cual el eritrocito se lisara (hemólisis) con la siguiente liberación de hemoglobina al exterior de la célula. Por este experimento podemos darnos cuenta de lo que sucederá si administramos a un paciente soluciones hipotónicas con respecto al plasma en cantidad considerable. Por esta razón se hace énfasis en la osmolaridad de las soluciones administradas a un paciente para reponer el volumen perdido. La solución isosmótica (isotónica) con el plasma es la solución de Cloruro de Sodio al 0.89 % Cuando un líquido tiene la misma concentración de partículas que el plasma, se le llama isosmótico o isotónico; las soluciones con mayor concentración de partículas son hipertónicas y las que tienen menor concentración, son hipotónicas. El término osmolaridad se refiere a la concentración molar de solutos que ejercen una presión osmótica.
Una de las principales funciones del cuerpo de los animales es el mantenimiento de la isotonicidad del plasma sanguíneo, es decir un medio interno isotónico. Esto elimina los problemas asociados con la pérdida o ganancia de agua desde y hacia las células. Estamos hablando por supuesto de la homeostásis.
MATERIAL. Material de vidriaría Espectrofotómetro digital Centrífuga clínica Muestra de sangre con anticoagulante (EDTA) Solución salina al 1 % amortiguada con fosfato a pH 7.4
Pipeta de 0.2 mL Pipeta pasteur.
MÉTODO. 1.- Obtener una muestra de 2 mL de sangre y recibirla en un tubo con una gota de EDTA. 2.- Preparar la siguiente serie de soluciones de Cloruro de Sodio. TUBOS 1 Sol. NaCl 1% pH 7.4 0 (mL) H2O Destilada ( mL) 5 Mezclar por inversión LA concentración % 0 del NaCl en cada tubo es: Sangre total con 0.05 EDTA. (mL) Mezclar por inversión
2 0.5
3 2.0
4 2.3
5 2.5
6 3.0
7 4.3
8 4.5
9 5.0
4.5
3.0
2.7
2.5
2.0
0.7
0.5
0
0.10
0.40
0.46
0.5
0.60
0.89 0.90 1.0
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
3.- Utilizando la pipeta Pasteur, agregar a cada tubo una gota de sangre (Equivalente a 0.05 mL), dejándola caer lentamente. 4.- Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. 5.- Mezclar y centrifugar 5 minutos a 2000 rpm 6.- Extraer el sobrenadante de cada tubo, pasándolo a un tubo de ensaye grande y leerlo en el espectrofotómetro longitud de onda a 520 nm. usando el tubo No 7 como blanco. El orden de la lectura será del tubo No 7 al tubo No 1. El grado de hemólisis en cada tubo es determinado por la cantidad de Hemoglobina libre en el sobrenadante.
MÉTODO: DIÁLISIS. P. ALBÚMINA
AGUA DESTILA DA
REALIZAR: En una bolsa de diálisis (celofán), colocar solución hipotónica y sangre incubar durante 15 min. Y observar sus eritrocitos al microscopio.
RESULTADOS. En los sujetos normales se obtiene una curva sigmoidea simétrica. El extremo inferior de la curva corresponde a l comienzo de la hemólisis, la porción media corresponde a la salida de hemoglobina en gran cantidad y el extremo superior a la hemólisis total. Un aumento de la fragilidad osmótica desplaza la curva hacia la derecha, mientras que una disminución la desplaza hacia la izquierda. Se ha sugerido que los dos parámetros más significativos son:
La concentración de la solución salina en la cual se obtiene 10 % de hemólisis. La concentración de la solución salina que produce 90% de hemólisis.
Normalmente se obtiene un 10 % de hemólisis a una concentración de solución salina que varia de 0.48% a 0.44% mientras que el 90 % del hemólisis se produce a una concentración que va de 0.40 % a 0.36 %. La relación entre la concentración de la solución salina y el porcentaje de hemólisis en condiciones normales es la siguiente: SOLUCIÓN SALINA % 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.85
% HEMÓLISIS 97-100 90-99 50-95 5-45 0-6 0
La fragilidad osmótica de los eritrocitos se incrementa en algunos padecimientos como esferocitosis congénita, anemia hemolítica adquirida, enfermedad hemolítica del recién nacido debido a la incompatibilidad ABO; y puede estar disminuida en talasemia, anemia de células falciformes, ictericia y anemia por deficiencia de fierro.
RESULTADOS (Equipo 4) 1. Calcular los valores de hemólisis % en los tubos por una regla de tres.
Tubo 1
Lectura espectrofotómetro 0.463
al Porcentaje 74.55
Concentración de NaCl (%) 0
0.621 0.591 0.211 0.004 0.001 0 0.013 0.016
2 3 4 5 6 7 8 9
100 95.17 33.97 0.64 0.16 0 2.09 2.57
0.1 0.4 0.46 0.5 0.6 0.89 0.9 1
Realizar una curva de fragilidad graficando el porcentaje de hemólisis en las ordenadas contra la concentración de solución salina en las abscisas. Graficar los valores obtenidos.
-
120
100
s i s i l ó m e h e d e j a t n e c r o P
80
60
40
20
0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
-20
[NaCl]
2. Investigar los estudios que realizan en el laboratorio para diagnosticas las enfermedades antes mencionadas y los valores normales o de referencia (normales)
ESFEROCITOSIS CONGÉNITA: - Frotis sanguíneo - Nivel de bilirrubina (0-0.3 mg/dL) - Biometría hemática - Prueba de Coombs (ausencia de aglutinación es lo normal) - Conteo de reticulocitos
1.2
ENFERMEDAD HEMOLÍTICA POR INCOMPATIBILIDAD ABO DEL RECIÉN NACIDO: - -
Bilirrubina Oxígeno en la sangre Biometría hemática Electroforesis de hemoglobina Creatinina sérica Potasio sérico Examen de depranocitos
ICTERICIA: -
Frotis sanguíneo Biometría hemática Electroforesis hemoglobínica (muestra una forma anormal de la hemoglobina)
ANEMIA DE CÉLULAS FALCIFORMES: - -
Biometría hemática Reticulocitos Nivel de bilirrubina Determinación del grupo sanguíneo
TALASEMIA: -
Fragilidad osmótica (valor negativo es considerado normal)
Bilirrubina en orina Bilirrubina en sangre Examen de isoenzimas de la fosfatasa alcalina.
ANEMIA POR DEFICIENCIA DE HIERRO: - Hematocrito (Hombres 40.7-30.3%, mujeres 36.1-44.3%) - Concentración de hemoglobina (Hombres 13.8-17.2g/dL, mujeres 12.115.1g/dl) - Biometría hemática (fórmula roja):
3. Dibujar grafica de color los tubos obtenidos antes y después de la centrifugación.
DISCUSIÓN En los resultados se puede observar que conforme la concentración de cloruro de sodio aumentaba, el porcentaje de hemólisis es menor, puesto que el valor de la concentración era cada vez más cercano al 0.89%, que es la concentración del suero fisiológico. En los textos se refiere que la hemólisis es un fenómeno que se produce al colocar a los eritrocitos en un medio hipotónico, puesto que éstos comienzan a absorber agua y llega un momento en el que estallan dejando salir la hemoglobina. La gráfica obtenida es muy parecida a la descrita por las notas, una sigmoidea simétrica, se observa que a concentración de 0.85% el porcentaje de hemólisis es cero, pues fue la solución utilizada como blanco, además de que es una concentración muy parecida a la del suero fisiológico. El mayor porcentaje de hemólisis es a la concentración de 0.1% de NaCl, un dato que fue obtenido experimentalmente. Muchos de los datos obtenidos se ven ligeramente alterados, lo que puede ser causa de un mal manejo de volúmenes al momento de hacer las disoluciones, aunque, por lo general, la idea general de hemólisis es bastante evidente. Lo más evidente es que a una concentración de 0% la hemólisis sea 100%, puesto que los eritrocitos comienzan a absorber agua sin ningún límite hasta que revientan. Cuando la concentración va más allá de los 0.85 también se observa cierto grado de hemólisis, aunque no tan grande como a la concentración antes descrita. CONCLUSIONES
Se puede concluir que la hemólisis va a ser mayor cuando la concentración de cloruro de sodio sea menor a 0.89%. Es importante el manejo de volúmenes para este tipo de pruebas donde el volumen es determinante de la concentración.
CUESTIONARIO OSMOLARIDAD 1.- ¿Qué es un eritrocito, tamaño, forma, ciclo de vida, función etc.? Son los diminutos corpúsculos que confieren a la sangre su color rojo. Se desarrollan en médula ósea como células verdaderas pero, antes de entrar en la circulación expulsan su núcleo y pierden la capacidad de síntesis de proteínas. Tienen como función primordial el transporte de oxígeno de los pulmones a los tejidos y dióxido de carbono de los tejidos a los pulmones. Tiene forma de disco bicóncavo de unos 7.5 micrometros de diámetro y 1.9 micrometros de grosor. 2.- ¿Definir es la Presión osmótica? Es la presión que debe aplicarse a una solución para detener el flujo neto de disolvente a través de una membrana semipermeable. 3.- ¿Qué es la concentración osmolar? Es la concentración de partículas osmóticamente activas en solución expresada en términos de osmoles de soluto por litro de solución. 4.- ¿Qué es una solución isotónica, hipertónica, hipotónica? Las disoluciones isotónicas son aquellas donde la concentración del soluto es la misma ambos lados de la membrana de la célula, por lo tanto, la presión osmótica en la misma disolución isotónica es la misma que en los líquidos del cuerpo y no altera el volumen de las células. Una solución hipotónica es aquella que tiene menor concentración de soluto en el medio externo en relación al medio citoplasmático de la célula . Una solución hipertónica es aquella que tiene mayor concentración de soluto en el medio externo, por lo que una célula en dicha solución pierde agua (H 2O) debido a la diferencia de presión, es decir, a la presión osmótica , llegando incluso a morir por deshidratación. La salida del agua de la célula continúa hasta que la presión osmótica del medio externo y de la célula sean iguales. 5.- ¿Cuál es la diferencia de las soluciones anterior? La solución isotónica tiene la misma concentración que el medio interno de la célula, la hipotónica tiene menor concentración de solutos que el medio interno y la hipertónica tiene una mayor concentración de soluto. 6.- ¿Qué es un osmol? Es el número de moles de un compuesto químico que contribuyen a la presión osmótica de una disolución. 7.- ¿Qué papel juega la presión osmótica en el organismo humano?
Gracias a ella se puede conservar el equilibrio entre el medio externo e interno de las células, lo cual es de vital importancia. Cuando este equilibro se ve alterado se producen patologías importantes.
8.- ¿Por qué las soluciones tiene diferente concentración, pasa igual en el organismo? Porque va a depender del tejido que circunden, por ejemplo, una solución cerebral necesita una gran cantidad de sales disueltas. 9.- ¿Cuáles son las soluciones ISOTONICA y que se encuentran en la venta? Cloruro de sodio al 0.89% (suero fisiológico) Gatorade (bebida rehidratante) Sueros orales, como SUEROX, ELECTROLIT, entre otros. 10.- ¿Qué efecto ejerce en los ERITROCITOS? En una solución fuertemente hipotónica, la membrana se estira y se vuelve permeable o se rompe, permitiendo que se escape la hemoglobina, queda entonces una membrana vacía que se denomina fantasma eritrocitario, fenómeno conocido como hemólisis. En soluciones moderadamente hipertónicas, los eritrocitos se aplanan pero no modifican su forma, asumiendo una forma espinosa, por lo que se les denomina eritrocitos crenados.
BIBLIOGRAFÍA http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/001298.htm http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003641.htm http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000530.htm http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003344.htm http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000587.htm http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000584.htm http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000527.htm BLOOM, Fawcett, Tratado de histología, Ed. Interamericana, 11 edición, 111-113
