TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
TIỂU LUẬN MÔN HỌC CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ ĐỀ TÀI:
“PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ VÀ ỨNG DỤNG”
HVTH: Nguyễn Thế Quân MSHV: 12144445 GVHD: TS. Huỳnh Khánh Duy
TPHCM, tháng 1 năm 2014 1
MỤC LỤC 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ KHÍ 1.1 Khái niệm và phân loại……………………………………………………………4 1.2. Vài nét lịch sử……………………………………………………………………...4 1.3 Cơ sở lý thuyết chung của sắc ký khí……………………………………………..4 1.3.1 Quá trình sắc kí…………………………………………………………...4 1.3.2 Các phương pháp tiến hành tách sắc kí…………………………………..5 1.3.4 Sự doãng rộng của pic và hiệu lực tách…………………………………11 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực tách của cột………………………...13 1.3.6 Độ phân giải của cột …………………………………………………….17 2. HỆ THỐNG SẮC KÝ KHÍ 2.1.Thiết bị……………………………………………………………………………20 2.2 Hệ thống cấp khí mang………………………………………………………….20 2.2.1 Hệ thống cấp khí mang…………………………………………………20 2.2.2 Khí mang………………………………………………………………..21 2.3 Hệ thống tiêm mẫu……………………………………………………………….22 2.3.1 Buồng tiêm dùng cho cột nhồi…………………………………………23 2.3.2 Buồng tiêm dùng cho cột mao quản…………………………………..23 2.4. Cột sắc ký……………………………………………………………………….25 2.4.1 Cột nhồi………………………………………………………………..26 2.4.2 Cột mao quản………………………………………………………….29 2.4.3 Pha tĩnh ………………………………………………………………..33 2.5 Lò cột ……………………………………………………………………………42 2.6. Đầu dò……………………………………………………………….………….44 2.6.1 Dectector dẫn nhiệt (thermal conductivity dectector)……………….45 2.6.2 Detector ion hóa ngọn lửa (flame-ionization detector) ……………..47 2.6.3 Detector cộng kết điện tử (electron capture dtector) ………………..49 2.6.4 Detector phát xạ nguyên tử (atomic-emission detector) ……………52 2.6.5 Detector quang kế ngọn lửa (flame photometric GC detector) …….53 2.6.6 Detector quang hóa ion (photoionization detector) ………………...54 2.6.7 Chemiluminescence Spectroscopy…………………………………..55 2.6.8 Detector Nitơ-photpho NPD …………………………………………56 2.6.9 Detector khối phổ…………………………………………………….57 2
2.6.10 Các thông số quan trọng của detector………………………………..59 2.7. Hệ thống ghi nhận và xử lý số liệu…………………………………………….61 3. TIẾN TRÌNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ 3.1 Xác định mục tiêu phân tích…………………………………………………...61 3.2 Chuẩn bị mẫu……………………………………………………………………62 3.3 Chọn Detector……………………………………………………………………62 3.4 Chọn cột………………………………………………………………………….63 3.5 Chọn phương pháp tiêm mẫu……………………………………………………64 3.6 Chương trình hóa nhiệt độ và áp suất…………………………………………..64 4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BẰNG GC 4.1 Phân tích định tính………………………………………………………………67 4.2 Phân tích định lượng…………………………………………………………….67 4.2.1 Một số nguyên nhân gây ra sai số…………………………………….68 4.2.2 Các phương pháp tính toán định lượng……………………………….68 5. ỨNG DỤNG CỦA GC 5.1 Ứng dụng của GC tại CASE ……………………………………………………70 5.2 Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ đầu dò Ion Trap(CASE)…………………71 5.2.1. Nguyên tắc hoạt động GCMS………………………………………..71 5.2.2. Cấu tạo đầu dò khối phổ đầu dò bẫy ion (Ion trap)………………..72 5.2.3. Ứng dụng hệ thống Thermo Polaris Q………………………………73 5.3 GCMS với độ phân giải cao (HRGC/HRMS)-CASE………………………….74 5.4 Xác định hàm lượng Diethylene Glycol, Ethylene Glycol có trong kem đánh răng bằng phương pháp GC-MS…………………………………………………………75 5.4.1 Mở Đầu………………………………………………………………75 5.4.2 Nội dung tiến hành………………………………………………….75 5.4.3 Kết Luận……………………………………………………………..80 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….81
3
1. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ KHÍ 1.1 Khái niệm và phân loại Sắc kí (IUPAC-1993): là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định. Sắc ký khí (GC- Gas Chromatography) là một phương pháp sắc ký mà pha động là chất khí hoặc ở dạng hơi và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong của cột tạo lớp màng phim mỏng. Cơ sở tách bằng sắc kí khí là sự phân bố của mẫu giữa hai pha: pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động là khí thấm qua toàn bề mặt tĩnh đó. GC chia làm 2 loại: -
Sắc kí khí-rắn(GSC- Gas Solid Chromatography): pha tĩnh là chất rắn. Chất rắn nhồi cột thường là silicagel, rây phân tử hoặc than hoạt tính. Cơ chế tách chủ yếu là hấp phụ.
-
Sắc kí khí-lỏng(GLC- Gas Liquid Chromatography): pha tĩnh là lỏng. Chất lỏng bao bọc quanh bề mặt một chất rắn trơ, gọi là chất mang, tạo nên một lớp phim mỏng. Cơ chế tách là sự phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏng.
Mỗi thành phần của hỗn hợp trong pha động khi đi qua pha tĩnh sẽ tương tác với pha tĩnh bằng ái lực, ái lực của mỗi chất với pha tĩnh là khác nhau, chất có cái lực yếu với pha tĩnh sẽ thoát ra khỏi cột trước và chất có ái lực mạnh với pha tĩnh sẽ ra khỏi cột sau. Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động. 1.2 Vài nét lịch sử 1905 Ramsey tách hỗn hợp khí và hơi dựa trên cơ sở hấp phụ của than hoạt tính. 1906 Tswett tách các sắc tố thực vật trên cột và gọi quá trình tách là ‘sắc kí’. 1941 Martin và Synge (giải thưởng Nobel) trình bày lý thuyết đĩa trong chưng cất và chiết suất ngược dòng. Trên cơ sở đó James và Martin đề xuất ra sắc kí khí-lỏng (1952). Từ đó đến nay GC ngày càng hoàn thiện. Đến năm 1968 đã có khoảng 18000 công trình về GC. Những năm gần đây được sự hỗ trợ của công nghệ điện tử và tin học, GC đạt được nhiều thành tựu hơn nữa. 1.3 Cơ sở lý thuyết chung của sắc ký khí 1.3.1 Quá trình sắc kí Sắc kí là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào tướng động được mang theo dọc hệ thống sắc kí (cột, bản phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp. 4
Pha động có thể là pha lỏng hoặc khí, pha tĩnh có thể là một lớp phim được phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn. Sự tương tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh. Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vận tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc kí. Kết quả là chúng được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh. Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn ra sau dưới dạng các đỉnh (pic) tách riêng rẻ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiến hành sắc kí và được hiển thị dưới dạng sắc kí đồ. Hình minh họa một quá trình tách một hỗn hợp đơn giản gồm hai chất A và B (lực tương tác với pha tĩnh của A < B) theo thời gian. Mẫu chứa A và B được tiêm vào cột. Khi cho một chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần của mẫu được hòa tan trong pha động được di chuyển tại phần đầu của cột (tại thời điểm t0). Ở đây các cấu tử A và B tự phân bố giữa hai pha. Tiếp tục cho pha động đi qua cột thì nó sẽ đẩy phần hòa tan này chạy xuống dưới và một sự phân bố mới giữa pha động và pha tĩnh sẽ xảy ra (thời điểm t1). Đồng thời sự phân bố giữa dung môi mới và pha tĩnh cũng diễn ra tại vị trí của mẫu lúc đầu. Việc thêm tiếp dung môi sẽ mang các phân tử hòa tan chạy xuống cột trong một loạt liên tiếp các chuyển biến giữa hai pha. Bởi vì sự di chuyển của chất tan chỉ xảy ra trong pha động, nên tốc độ trung bình của sự di chuyển chất tan phụ thuộc vào phần thời gian chất tan ấy nằm trong pha đó. Phần thời gian này là nhỏ đối với chất tan bị lưu giữ mạnh bởi pha tĩnh (cấu tử B trong ví dụ trên) và lớn đối với chất tan (cấu tử A) có sự lưu giữ trong pha động mạnh hơn. Sau một thời gian các phân tử chất A và B dần dần được tách khỏi nhau. Nếu đặt một detector có khả năng phát hiện được các chất tan (cấu tử A và B) tại cuối cột tách và tín hiệu của nó được vẽ lại như một hàm của thời gian (hoặc thể tích được thêm vào) thì một loạt pic đối xứng sẽ được ghi lại và được gọi là sắc kí đồ. Vị trí của các pic theo thời gian được dùng để nhận diện định tính và diện tích của peak được dùng cho phép phân tích định lượng của cấu tử đang xét.
5
Hình 1. Quá trình tách sắc kí trên cột của hai chất A và B 1.3.2 Các phương pháp tiến hành tách sắc kí Để thực hiện tách sắc kí người ta có thể sử dụng một trong ba phương pháp sau: 1.3.2.1. Phương pháp rửa giải Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi nhất trong các phương pháp sắc kí hiện nay. Một lượng nhỏ hỗn hợp mẫu được giới thiệu vào cột với pha động có ái lực với pha tĩnh bé hơn so với bất kì cấu tử cần tách có trong mẫu. Vì thế các cấu tử cần tách di chuyển với tốc độ chậm hơn so với chất rửa giải. Tốc độ này được xác định bởi ái lực tương đối của mỗi cấu tử lên pha tĩnh so với pha động, đó chính là hệ số phân bố K = Csp/Cmp. Ở đây Csp, Cmp là nồng độ của cấu tử đang xét trên pha tĩnh và trong pha động. Các cấu tử được rửa giải theo trật tự ái lực của chúng nhưng tốc độ di chuyển tương đối của chúng phụ thuộc vào tương tác 3 thành phần giữa chúng với pha động, với pha tĩnh và giữa pha động với pha tĩnh. Bởi vì các cấu tử được tách khỏi nhau với một vùng pha động ở giữa chúng nên phương pháp này được sử dụng trong các phép tách với mục đích phân tích. Pha động có thể không thay đổi thành phần dung môi trong suốt quá trình rửa giải; có thể thay đổi dung môi rửa giải sau một thời gian định trước (rửa giải theo từng giai đoạn); cũng có thể không thay đổi các dung môi tạo nên pha động nhưng thay đổi nồng độ của các thành phần có trong pha động sau một thời gian định trước (rửa giải gradient).
6
1.3.2.2. Phương pháp tiền lưu Hỗn hợp cần tách gồm các chất A, B và C được cho chảy liên tục vào phần trên của cột, trong đó A là cấu tử có ái lực yếu nhất với pha tĩnh. Do các cấu tử A, B và C bị lưu giữ trên cột, nên trước hết từ cột chảy ra chỉ có dung môi. A do có lực tương tác trên cột yếu nhất sẽ di chuyển xuống dưới còn các cấu tử có ái lực mạnh hơn A bị pha tĩnh giữ ở phần trên của cột. Do dung dượng có hạn của pha tĩnh nên khi vượt dung lượng này thì cấu tử A sẽ di chuyển dọc theo cột và ra khỏi cột ở dạng nguyên chất sau đó là hỗn hợp của các thành phần tiếp theo A+B rồi A+B+C. Phương pháp tiền lưu ít được dùng do không thực hiện được việc tách hoàn toàn các cấu tử, đặc biệt khi sử dụng sự tách sắc kí vào mục đích phân tích. 1.3.2.3. Phương pháp thế đẩy Mẫu được cho vào cột, dùng dung môi rửa giải có ái lực với pha tĩnh mạnh hơn bất kì một cấu tử nào của hỗn hợp tách để đẩy các cấu tử cần tách thoát ra khỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác yếu nhất với pha tĩnh, sau đó đến các cấu tử khác có ái lực với pha tĩnh tăng dần. Phương pháp này tạo nên các dải rửa giải không hoàn toàn được tách khỏi nhau: có dải thu được chất nguyên chất nhưng có dải giữa các dải nguyên chất thì gồm hỗn hợp của chúng. Trong thực hành phòng thí nghiệm để tách các hỗn hợp phức tạp người ta thường hay dùng hơn cả là phương pháp rửa giải.
Hình 2. Các phương pháp rửa giải, tiền lưu, thế đẩy
7
1.3.3 Đặc tính sắc kí của chất tan 1.3.3.1. Tính chất lưu giữ Tính chất lưu giữ phản ánh sự phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động và được biểu thị bằng các đại lượng thể tích lưu hay thời gian lưu. -
Thể tích lưu VR là thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan i từ thời điểm đưa mẫu vào, đi qua cột và đến detectơ (trên sắc kí đồ là điểm cực đại của peak).
-
Thời gian lưu tR là thời gian từ lúc chất tan i được nạp vào cột tách ở bộ phận tiêm mẫu cho đến lúc chất ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại.
Thể tích lưu có thể nhận được trực tiếp từ thời gian lưu tR trên sắc kí đồ bằng cách nhân với tốc độ thể tích dòng Fc (thể tích của pha động trên một đơn vị thời gian):
Tốc độ dòng được tính theo các thông số của cột như sau: -
dc là đường kính của cột,
-
L là chiều dài cột,
-
εt là độ rỗng toàn phần của chất nhồi cột (độ rỗng của chất nhồi cột biểu thị tỉ số thể tích kẽ hở của chất nhồi và thể tích khối toàn phần của nó: đối với chất nhồi rắn = 0.35 - 0.45, chất nhồi xốp = 0.70 - 0.90, cột mao quản = 1.0),
-
Vc là thể tích bên trong cột.
Tốc độ tuyến tính trung bình u của sự dịch chuyển chất tan là: Tốc độ tuyến tính trung bình u của pha động là: Ở đây tM hay to là thời gian không bị lưu giữ của chất tan (thời gian chất tan lưu trong pha động). Trong sắc kí khí, tM được lấy bằng thời gian cần thiết cho CH4 di chuyển đi qua cột. Tương ứng tM hay to có thể tích VM (hoặc Vo) biểu thị thể tích trống của cột (bao gồm cả thể tích của bộ phận tiêm mẫu (injector), thể tích các đoạn ống nối, thể tích rỗng của chính cột và thể tích detector). Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R hoặc thời gian lưu hiệu chỉnh t’R được cho bởi: V’R = VR –VM hoặc t’R = tR – tM (thời gian không bị lưu giữ của chất tan gần đúng được xem như là thời gian lưu của pha động).
8
Hình 3. Sắc kí đồ minh họa các thời gian lưu t (hoặc thể tích lưu) và độ rộng của đáy peak W của chất tan không bị lưu giữ M và của 2 chất bị lưu giữ 1 và 2 1.3.3.2. Hệ số phân bố K (Partition coefficient) Mỗi cấu tử hoặc chất tan được phân bố giữa 2 pha với một cân bằng được thiết lập và tất cả các quá trình tách sắc kí được dựa trên sự khác nhau về khả năng phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh. Khi chất tan đi vào hệ thống sắc kí, nó ngay lập tức phân bố giữa các pha động và pha tĩnh. Giả thiết nếu pha động dừng lại vào bất kì một thời gian nào, chất tan có một sự phân bố cân bằng giữa hai pha, và nồng độ của chất tan ở trong mỗi pha được cho bởi hệ số phân bố nhiệt động: Ở đây Cs và CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động tương ứng. Trường hợp khi K = 1 thì chất tan được phân bố bằng nhau giữa hai pha. Hệ số phân bố xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan (chính xác là tâm vùng) do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột. Đối với peak đối xứng, khi cực đại pic xuất hiện ở lối ra của cột, một nửa lượng chất tan đã được rửa khỏi cột trong thể tích lưu VR và một nửa còn lại được phân bố giữa thể tích pha động VM và thể tích pha tĩnh Vs: VRCM = VMCM + VsCs hay VR = VM + KVs
hay VR – VM = KVs
Phương trình này đúng với cột phân bố lỏng, còn đối với cột hấp phụ, Vs phải thay bằng Ss là diện tích bề mặt của chất hấp thụ. 1.3.3.3. Hệ số dung lượng k’ (The capacity factor) Hệ số dung lượng k’ là thông số thực nghiệm quan trọng trong sắc kí cột được sử dụng rộng rải để mô tả các tốc độ dịch chuyển của các chất tan trên cột. Cho một chất tan, hệ số dung lượng k’ được định nghĩa như là tỉ số mol chất tan trong pha tĩnh và số mol chất tan trong pha động: 9
Tỉ số VM/Vs được gọi là tỉ số thể tích pha Hệ số dung lượng còn được định nghĩa là tỉ số giữa thời gian của chất tan lưu lại trên pha tĩnh và thời gian cần để chất tan đó di chuyển trong pha động suốt chiều dài của cột nếu không bị lưu giữ tM. Khi k’ cho một chất tan nhỏ hơn 1 nhiều, sự rửa giải xảy ra rất nhanh nên việc xác định thời gian lưu là rất khó. Còn khi k’ khoảng 20 đến 30 thì thời gian rửa giải sẽ bị kéo dài. Vì vậy các phép tách nên được thực hiện ở những điều kiện mà các k’ của các chất tan nằm trong khoảng giá trị từ 1 đến 5. Giá trị k’ trong sắc kí khí có thể được thay đổi bởi việc thay đổi nhiệt độ và cách nhồi cột. Còn trong sắc kí lỏng, k’ thường được điều khiển để cho phép tách tốt hơn bởi thay đổi thành phần pha động và pha tĩnh. 1.3.3.4. Hệ số chọn lọc (The selectivity factor) Khả năng của một pha tĩnh tách 2 cấu tử A và B (B là cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn) được xác định bởi tỉ số phân bố tương đối của chúng và cũng là những hệ số lưu giữ của chúng đối với một pha tĩnh đã cho. Hệ số chọn lọc α là một hàm của sự lưu giữ tương đối của mỗi cấu tử trên pha tĩnh Hệ số chọn lọc của một cặp dải (pic) gần nhau là một hàm phụ thuộc vào loại pha tĩnh được sử dụng, pha động và nhiệt độ của cột. Để cho một sự tách được tốt thì α nên có gía trị lớn hơn 1. Hai chất cần tách càng tách ra xa khỏi nhau khi α càng lớn nhưng nếu quá lớn thì thời gian phân tích càng kéo dài, α nên trong khoảng từ 1,05 đến 2,0. 1.3.3.5. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ Tốc độ di chuyển của một dải chất tan qua một cột hay một đĩa sắc kí lớp mỏng phụ thuộc vào sự phân bố của các phân tử chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự phân bố hay sự lưu giữ là: -
Thành phần và tính chất của pha động
-
Kiểu và tính chất của pha tĩnh
-
Các lực tương tác các phân tử giữa các cấu tử của pha động và pha tĩnh
-
Nhiệt độ Hai yếu tố góp phần để tách tốt các hợp chất bởi sắc kí là: 10
Sự khác nhau về thời gian phân bố của chúng trong 2 pha: nếu sự khác nhau càng lớn thì sự tách chúng càng tốt. Độ doãng rộng của các pic nếu càng rộng thì sự tách chúng càng kém. 1.3.4 Sự doãng rộng của pic và hiệu lực tách 1.3.4.1. Mở đầu Hiệu lực của một cột tách chịu tác động bởi độ lớn của sự doãng rộng pic xảy ra khi một chất chuyển động dọc theo cột. Chất tan khi chạy dọc theo cột có khuynh hướng phân bố như một hình phân bố chuẩn Gaussian với độ lệch chuẩn σ. Nếu chất tan tiêu tốn nhiều thời gian khi dịch chuyển dọc xuống cột thì pic càng bị doãng rộng. Độ doãng rộng của một pic thường được biểu diễn thông qua các giá trị: -
W1/2 là độ rộng của của pic được đo ở ½ chiều cao của peak,
-
W là độ rộng của đáy pic được xác định tại hai điểm cắt của hai đường tiếp tuyến của hai bên thân pic với đường nền.
Hình 4. Sơ đồ của một dải chất tan và sự đánh giá của dải sắc kí đồ cho hiệu lực cột. 1.3.4.2. Sự khuếch tán Nguyên nhân chính dẫn đến sự doãng rộng của peak là sự khuếch tán. Hệ số khuếch tán D đo tốc độ J tại đó một chất di chuyển một cách ngẫu nhiên từ một vùng có nồng độ cao đến vùng có nồng độ thấp.
D là hệ số khuếch tán c là nồng độ x là độ dài di chuyển 11
Sự khuếch tán trong chất lỏng thấp hơn trong chất khí khoảng 104 lần, còn các phân tử lớn thì khuếch tán chậm hơn các phân tử nhỏ từ 10 đến 100 lần. Độ rộng của dải sắc kí do khuếch tán được biểu diễn qua phương trình sau:
c là nồng độ (mol/cm3), t là thời gian, x là khoảng cách di chuyển được dọc theo cột, D là hệ số khuếch tán, m là số mol chất tan dịch chuyển qua một đơn vị diện tích tiết diện ngang của cột. Phương trình trên cho biết độ lệch chuẩn của dải sắc kí: 1.3.4.3 Chiều cao đĩa lý thuyết H Chiều cao đĩa lý thuyết H là một hằng số giữa phương sai σ2 của dải chất tan và khoảng cách x mà nó di chuyển. Tên gọi này là từ lý thuyết chưng cất trong đó sự tách được thực hiện trong những giai đoạn rời rạc được gọi là đĩa tách. H = σ2/L
L là chiều dài của cột nhồi
Có thể giả định cột sắc kí được chia thành N phần mỏng hay N lớp hay N đĩa tách. Ở mỗi đĩa sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới (sắc kí là một quá trình động, thực ra pha động chảy liên tục và thời gian không đủ để thiết lập trạng thái cân bằng). Chiều cao của đĩa tách cũng được gọi là chiều cao đĩa lý thuyết. Mặc dù trong cột sắc kí không có các đĩa thực nhưng người ta vẫn sử dụng khái niệm này để chỉ mối quan hệ giữa độ rộng của dải sắc kí và khoảng cách dịch chuyển dọc theo cột sắc kí. Nếu chiều cao đĩa lý thuyết càng nhỏ (tức số đĩa lý thuyết càng nhiều) thì độ rộng hay sự doãng rộng của pic càng nhỏ. Khả năng tách các cấu tử của một hỗn hợp của một cột được cải thiện nếu giảm chiều cao một đĩa lý thuyết. Các chất tan khi dịch chuyển qua cùng một cột tách có chiều cao đĩa lý thuyết khác nhau bởi vì chúng có hệ số khuếch tán khác nhau. Chiều cao một đĩa lý thuyết khoảng từ 0.1 đến 1 mm trong sắc kí khí và khoảng 10 μm trong săc kí lỏng hiệu năng cao và nhỏ hơn 1μm trong sắc kí điện di mao quản. 1.3.4.3 Số đĩa lý thuyết N L là chiều dài cột, với tR là thời gian lưu của pic, 12
W là độ rộng của peak ở đáy, W1/2 là chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao từ đỉnh đến đáy pic. Công thức này được sử dụng để xác định thực nghiệm số đĩa lí thuyết của một cột tách. Hiệu lực của cột tách sẽ tăng lên khi số đĩa lí thuyết càng lớn và khi chiều cao đĩa càng nhỏ. 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực tách của cột 1.3.5.1 Ảnh hưởng của tốc độ của pha động Mức độ ảnh hưởng động học lên hiệu lực của một cột rõ ràng phụ thuộc vào độ dài thời gian của pha động tiếp xúc với pha tĩnh tức phụ thuộc vào tốc độ pha động. Nghiên cứu về hiệu lực cột nói chung được thực hiện bởi việc xác định chiều cao H như là một hàm phụ thuộc vào tốc độ pha động. Kết quả cho thấy cả sắc kí khí lẫn sắc kí lỏng đều có chiều cao đĩa lí thuyết đạt cực tiểu ở trong vùng tốc độ dòng thấp của pha động và nói chung tốc độ đó của sắc kí lỏng thấp hơn so với sắc kí khí. 1.3.5.2 Lí thuyết về sự doãng rộng peak Hơn 40 năm qua, rất nhiều công trình nghiên cứu về thực nghiệm lẫn lý thuyết về mối quan hệ định lượng để giải thích ảnh hưởng của các thông số như: vận tốc tuyến tính của pha động, hệ số khuếch tán trong pha động và trong pha tĩnh, tỉ số phân bố, đường kính của hạt nhồi, bề dày của lớp chất lỏng phủ trên hạt… đến chiều cao đĩa lý thuyết cho các loại cột khác nhau. Những yếu tố ảnh hưởng này được phản ánh qua phương trình của Van Deemter như sau: H A B/u CAu CMu H là chiều cao đĩa lý thuyết (cm); u là vận tốc tuyến tính của pha động (cm/s); A là hệ số mô tả ảnh hưởng đến H của sự khuếch tán xoáy; B là hệ số khuếch tán dài; Cs và CM là các hệ số chuyển khối của pha tĩnh và pha động.
13
Hình 5. Đường cong H-u (Van Deemter) cho một cột sắc kí khí 1.3.5.3 Sự khuếch tán xoáy Thành phần A mô tả sự khuếch tán xoáy của các cấu tử và các đường đi khác nhau của pha động chạy xuyên qua pha tĩnh được nhồi trong cột. Vì thế các cấu tử phải di chuyển với những khoảng cách đường đi khác nhau qua một đơn vị chiều dài của cột. Số hạng A độc lập với tốc độ của pha động nhưng phụ thuộc vào: Đường kính hạt nhồi trong pha tĩnh dp, Cách chúng được nhồi trong cột hoặc được phủ trên bản mỏng được biểu diễn qua λ là hàm số phụ thuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước của cột: A = λ.dp Một số phân tử chất tan có đường đi gần với thành cột sẽ di chuyển nhanh hơn so với những phân tử khác do ở đó mật độ nhồi tương đối thấp, tốc độ nhanh hơn. Các phân tử đi theo đường ngắn hơn được rửa giải ra trước những phân tử đi theo những đường quanh co dài hơn dẫn đến doãng rộng pic của mỗi chất tan. Một sự tách và độ rộng của pic tối thiểu sẽ đạt được nếu dùng các hạt nhồi có đường kính trung bình đủ nhỏ và được nhồi đồng thể vào trong cột. Tuy nhiên, hạt càng nhỏ thì áp suất cần để pha động dịch chuyển qua cột càng cao, đặc biệt sẽ gặp khó khăn để nhồi cột đồng thể. Trong sắc kí khí cột nhồi người ta nhồi cột với các hạt có kích thước tối ưu khoảng 0.15 μm. Trong sắc kí khí – lỏng khi sử dụng màng mỏng trên thành cột mao quản thì số hạng A = 0.
14
Hình 6. Ảnh hưởng của khuếch tán xoáy (a), khuếch tán dọc (b) sự truyền khối (c) đến phương trình Van Deemter. 1.3.5.4 Sự khuếch tán dọc Khuếch tán là quá trình chất di chuyển từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp hơn với tốc độ tỉ lệ với sự chênh lệch nồng độ và hệ số khuếch tán của chất đang xét. Trong sắc kí, khuếch tán dọc được dùng để mô tả sự khuếch tán diễn ra dọc theo trục của cột và song song với đường đi của pha động. Nó dẫn đến sự dịch chuyển của chất tan từ trung tâm nồng độ của một dải chất tan đến những vùng loãng hơn về hướng phía trước hoặc sau của dòng chảy. Khuếch tán dọc là một nguồn của sự doãng rộng của pic trong sắc kí khí do tốc độ khuếch tán cao trong pha khí. Hiện tượng này ít hơn trong sắc kí lỏng. Độ lớn của B trong phương trình Van Deemter được xác định phần lớn bởi hệ số khuếch tán DM của chất phân tích trong pha động và tỉ lệ thuận với hằng số này: B = 2γ. DM γ là hệ số trở kháng của chất nhồi cột đến khuếch tán dọc, DM là hệ số khuếch tán của chất tan trong pha động. Trong các cột mao quản thì γ có giá trị bằng 1 còn trong cột nhồi thì khoảng 0.7. B ảnh hưởng lớn trong phương trình V-D khi tốc độ pha động thấp nên trong sắc kí lỏng ảnh hưởng này ít hơn nhiều bởi vì pha động có tốc độ thấp hơn nhiều so với của sắc kí khí. 15
1.3.5.5 Sự truyền khối trong pha tĩnh Khi pha tĩnh là chất lỏng: hệ số truyền khối Cs tỉ lệ thuận với bình phương chiều dày của lớp phim trên bề mặt chất mang và tỉ lệ nghịch với hệ số khuếch tán Ds của chất tan trong lớp phim. Với lớp phim dày các phân tử chất tan phải di chuyển trung bình xa hơn để tiến đến bề mặt, và với hệ số khuếch tán nhỏ hơn, chúng sẽ di chuyển đến chậm hơn. Hậu quả là tốc độ truyền khối chậm hơn và chiều cao đĩa lý thuyết tăng lên. Khi pha tĩnh là một bề mặt rắn: hệ số truyền khối pha tĩnh Cs tỉ lệ thuận với thời gian được đòi hỏi cho những cấu tử bị hấp phụ hoặc giải hấp, hay tỉ lệ nghịch hằng số tốc độ bậc nhất của các quá trình này. Sự chuyển động của phân tử trong pha tĩnh tiêu tốn một thời gian dài hơn, trong khi những phân tử khác chuyển động về phía trước cùng với pha động, sẽ dẫn đến peak sẽ doãng rộng. Pha động đi qua cột càng nhanh và tốc độ truyền khối trong pha tĩnh càng nhỏ thì peak càng doãng rộng hơn. Khắc phục: những chất lỏng ít nhớt hơn có thể được chọn làm pha tĩnh để tăng hệ số khuếch tán. Có thể giảm chiều dày của pha tĩnh nhưng dung lượng của cột sẽ bị giảm xuống. 1.3.5.6 Sự truyền khối trong pha động Các quá trình truyền khối trong pha động rất phức tạp. Sự hiểu biết tốt về mặt định tính của những yếu tố từ nguyên nhân này tác động đến sự doãng rộng của pic dẫn đến sự cải thiện lớn lao trong tất cả các loại cột sắc kí. Hệ số truyền khối trong pha động CM: -
tỉ lệ nghịch với hệ số khuếch tán của chất tan trong pha động DM
-
tỉ lệ thuận với bình phương đường kính của hạt nhồi,
-
tỉ lệ thuận với bình phương của đường kính cột và tốc độ chảy của pha động.
Sự doãng rộng của dải trong pha động là do một phần vào số đông các đường đi nhờ đó một phân tử hoặc ion có thể tìm được cách của nó để đi qua cột nhồi. Trên bề mặt của pha tĩnh có thể chứa các lỗ khích thước khác nhau nên một số các phân tử chất tan có thể chuyển động vào ra các lỗ này dẫn đến sẽ bị chậm so với những phân tử khác. Các dòng chất lỏng của pha động ở gần các hạt chuyển động chậm hơn dòng chất lỏng ở giữa khoảng cách các hạt. Như vậy thời gian lưu trong cột cho các phân tử của cùng một chất cũng khác nhau. Các phân tử này đi đến cột qua những khoảng thời gian khác nhau dẫn đến sự doãng rộng pic. Ảnh hưởng này thỉnh thoảng được gọi là khuếch tán xoáy, độc lập với tốc độ của dung môi. 1.3.5.7 Các phương pháp giảm sự doãng rộng peak 16
Hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của cột là đường kính của các hạt nhồi và đường kính của cột: -
Nếu sử dụng các hạt nhồi có đường kính càng nhỏ thì càng giảm chiều cao đĩa lý thuyết.
-
Trong khi đó lợi dụng ảnh hưởng của đường kính cột, các cột ngày càng hẹp hơn được sử dụng trong những năm gần đây.
Với pha động khí, tốc độ của khuếch tán dọc có thể được giảm một cách đáng kể bởi hạ thấp nhiệt độ và như vậy làm giảm hệ số khuếch tán DM. Điều này dẫn đến chiều cao đĩa lý thuyết sẽ nhỏ hơn tại nhiệt độ thấp. Ảnh hưởng này không đáng kể trong trường hợp sắc kí lỏng bởi vì sự khuếch tán là đủ chậm nên sự khuếch tán dọc có ảnh hưởng rất nhỏ đến chiều cao đĩa lý thuyết. Đối với pha tĩnh lỏng, chiều dày của lớp chất lỏng hấp thụ nên càng mỏng càng tốt bởi vì Cs trong phương trình Van-Deemter tỉ lệ thuận với bình phương của đại lượng này. 1.3.6 Độ phân giải của cột (Column resolution) 1.3.6.1 Định nghĩa Trong sắc kí, độ phân giải Rs của hai pic được xác định như sau:
ΔtR và ΔVR là hiệu của thời gian hoặc thể t.
17
Hình 7. Sự phân giải peak Độ phân giải của một cột tách cho biết khả năng tách hai chất phân tích bởi cột. Nếu cột tách có độ phân giải khoảng 1.5 thì phép tách A và B gần như hoàn toàn (sự xen phủ chỉ còn khoảng 0.3%), trong khi nếu độ phân giải 0.75 thì không tách được còn độ phân giải bằng 1 thì sự xen phủ của hai pic còn khoảng 4%. Độ phân giải cho một pha tĩnh đã chọn có thể được cải thiện bởi tăng chiều dài của cột tách (tức tăng số đĩa l í thuyết N của cột tách) nhưng như vậy sẽ làm kéo dài thời gian phân tích. 1.3.6.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ phân giải Mối quan hệ giữa số đĩa lý thuyết và độ phân giải là:
18
Độ phân giải N là số đĩa lý thuyết, k’2 là hệ số dung lượng của cấu tử thứ hai Nếu số đĩa lý thuyết của 2 peak không giống nhau thì thay thế N bằng 1 2 N N và thay k’2 bằng k’av. Cải thiện Rs nhờ chiều cao đĩa lý thuyết Một chi tiết quan trọng trong phương trình trên là độ phân giải tỉ lệ thuận với N . Vì vậy nếu tăng gấp đôi chiều dài cột thì tăng độ phân giải lên 2 lần. Tuy nhiên khi tăng số đĩa lý thuyết lên do tăng chiều dài cột thì quá trình sắc kí phải tiêu tốn nhiều thời gian hơn trừ khi sự tăng số đĩa là do giảm chiều cao mỗi đĩa và không tăng chiều dài của cột, nhiệt độ của cột (cho trường hợp sắc kí khí) và chiều dày của lớp phim (cho sắc kí lỏng). Việc tối ưu hóa tốc độ pha động cũng có ích. Cải thiện Rs nhờ hệ số chọn lọc α Khi tăng α hay khi tăng tỉ số phân bố thì độ phân giải cũng tăng theo. Cách để thay đổi α là thay đổi pha tĩnh hoặc thay đổi cả pha tĩnh lẫn pha động trong sắc kí lỏng bởi vì thay đổi bản chất của các pha sẽ dẫn đến thay đổi α. Khi tỉ số phân bố =2 thì đảm bảo cho sự phân giải tốt. Tuy nhiên sự tối ưu này là cho một cặp cấu tử. Trong trường hợp hỗn hợp chứa nhiều cấu tử thì cần phải thay đổi k’ để có sự phân tách giữa các cấu tử. Trong sắc kí khí, giá trị tối ưu hóa của k’ có thể đạt được bằng chương trình hóa nhiệt độ còn trong sắc kí lỏng thì bằng chương trình hóa thành phần pha động tức thay đổi tỉ lệ giữa các dung môi của pha động. Cải thiện Rs nhờ hệ số dung lượng Thường sự tách có thể được cải thiện một cách đáng kể bằng việc thay đổi hệ số dung lượng k’. Nói chung, sự tăng giá trị k’ làm tăng độ phân giải. Để xác định khoảng tối ưu của giá trị k’, phương trình được viết dưới dạng:
Ở đây Q chứa phần còn lại của phương trình. Thường giá trị của k’ > 10 nên tránh vì dù tăng lên chút ít độ phân giải nhưng thời gian đòi hỏi cho sự tách tăng lên rất đáng kể. Giá trị tối ưu của k’ trong khoảng từ 1 đến 5.Cách dễ nhất để cải thiện độ phân giải là tối ưu hóa k’: -
Đối với pha động là khí, k’ thường có thể được cải thiện bởi sự thay đổi nhiệt độ. 19
-
Các phương pháp để giảm chiều cao của đĩa lý thuyết được đề cập bên dưới, bao gồm giảm kích thước hạt nhồi, đường kính của cột
2. HỆ THỐNG SẮC KÝ KHÍ 2.1 Thiết bị Hiện nay, hơn 30 nhà sản xuất cung cấp ra thị trường khoảng 150 mẫu khác nhau của thiết bị sắc kí khí. Trong thập niên 70, các bộ tích phân kế điện tử và xử lý số liệu dựa trên máy tính trở nên thông dụng. Thập niên 80 đã xuất hiện các thiết bị sắc kí khí với các thông số như nhiệt độ của cột, tốc độ dòng, tiêm mẫu, được điều khiển bằng máy tính với giá cả vừa phải; và có lẽ quan trọng nhất là sự phát triển của các cột có khả năng tách những mẫu phức tạp có chứa nhiều cấu tử trong một khoảng thời gian ngắn.
Hình 8. Sơ đồ khối của một máy sắc ký khí 2.2 Hệ thống cấp khí mang 2.2.1 Hệ thống cấp khí mang Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộ điều chỉnh áp suất (pressure regulators), các thiết bị đo áp suất (gauges), và thiết bị đo tốc độ dòng (flowmeter). Hệ thống khí mang còn chứa một hệ thống lọc phân tử để tách nước và các chất nhiễm bẩn khác. Tốc độ dòng được kiểm soát bởi các bộ điều chỉnh áp suất hai giai đoạn được lắp vào các bình chứa khí mang. Áp suất của khí vào thiết bị nằm trong khoảng từ 10 đến 50 psi để có tốc độ dòng từ khoảng 30 đến 150 ml/ph đối với cột nhồi và khoảng từ 1 đến 25 ml/ph đối với cột mao quản. Nói chung, nếu áp suất đi vào thiết bị không đổi thì tốc độ dòng sẽ 20
không đổi. Để đo tốc độ dòng khí người ta dùng thiết bị đo tốc độ dòng (flowmeter) với bọt xà phòng và đồng hồ bấm giây. 2.2.2 Khí mang Khí mang lý tưởng dùng cho sắc ký phải là khí trơ (He, Ar, N2, CO2 và H2), có độ tinh khiết cao. Độ giảm áp suất tỉ lệ với độ nhớt khí mang nên cần chọn khí mang có độ nhớt thấp cho cột mao quản và cột nhồi chặt. Bảng 1. Độ dẫn điện và độ nhớt của một số khí mang
Khí mang thường dùng là tùy thuộc vào detector sử dụng. Khi lựa chọn cần chú đến detector đang sử dụng như sau: -
Detector đo độ dẫn : khí mang có độ dẫn cao như H2, He. Khí He có ưu điểm không nguy hiểm.
-
Detector ion hóa ngọn lửa : khí mang N2 do rẻ và không nhuy hiểm nhưng trong trường hợp ghép nối với các thiết bị khác, ví dụ ghép nối với khối phổ phải dùng khí mang là He.
-
Detector cộng kết ngọn lửa thường dùng khí mang là N2. Đặc điểm một vài loại khí mang phổ biến:
He, Ar: là khí trơ hóa học rất thích hợp cho sắc kí ở nhiệt độ cao. Trong đó He là khí mang thông dụng nhất và thích hợp với hầu hết các detector dùng cho sắc ký khí. H2 : Hiệu suất tách lớn và thời gian phân tích ngắn, khi tăng tốc độ dòng lớn hơn nhiều tốc độ dòng tối ưu nhưng hiệu suất (chiều cao đĩa lý thuyết) giảm rất ít. Tuy nhiên dùng khí mang H2 khá nguy hiểm vì hydro có thể gây nổ khi tiếp xúc với oxy không khí, không dùng được cho detector khối phổ và là tác nhân phản ứng với các hợp chất không bão hòa trên bề mặt kim loại. Khí H2 khi sử dụng làm khí mang cần dùng khí nitơ làm khí bảo vệ thổi qua cột trước. Trong các phòng thí nghiệm người ta đã dùng phổ biến máy sản xuất khí hydro với công suất từ 125 ml/ph đến 225 ml/ph. Khi dùng H2 trong phòng thí nghiệm phải có mày dò chỗ hở H2 và cấm lửa. N2 : Hiệu suất tách tốt chỉ trong trường hợp nhiệt độ cột tách thấp và tốc độ dòng thấp. Giới hạn phát hiện đối với detector ion hóa ngọn lửa hơi thấp hơn He nhưng thời gian phân tích kéo dài hơn. Khí nitơ do không nguy hiểm, giá rẻ và dễ dàng làm tinh khiết nên N2 được dùng nhiều cho sắc kí khí. Cần chú ý là độ dẫn nhiệt 21
của N2 rất gần với độ dẫn của nhiều khí và nhiều chất hữu cơ nên có trường hợp peak sắc kí có thể bị ngược. Độ tinh khiết là yếu tố rất quan trọng của khí mang đối với sắc ký khí, tạp chất có trong khí mang như các hydrocarbon, oxy, nước... không chỉ làm tăng tín hiệu nhiễu đường nền mà còn ảnh hưởng đến detector và tương tác với pha tĩnh làm hỏng cột, do đó khí mang cần phải qua các bộ lọc để loại bỏ oxy, nước và vết các chất hữu cơ trước khi vào cột tách. Độ tinh khiết của khí mang tốt nhất phải lớn hơn 99,995%. Thiết bị sử dụng để cung cấp khí mang có thể là bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…). 2.3 Hệ thống tiêm mẫu (Sample Injection system) Có 2 cách đưa mẫu vào cột là tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (Autosampler) có hoặc không có bộ phận hóa hơi – headspace. Cách thông dụng nhất để đưa mẫu vào cột là sử dụng một bơm tiêm mẫu vi lượng (microsyringe) để tiêm một mẫu lỏng hoặc khí qua một đệm cao su silicon (septum) chịu nhiệt vào một buồng hóa hơi (injector). Buồng này được đốt nóng với nhiệt độ thích hợp và được nối với cột tách. Đối với các cột tách thông thường, cỡ mẫu thường thay đổi từ 1 vài đến 20μl. Cột mao quản đòi hỏi lượng mẫu đưa vào nhỏ hơn nên trong trường hợp này hệ thống chia dòng mẫu được thiết kế trong bộ tiêm mẫu được sử dụng để chỉ một phần nhỏ lượng mẫu được tiêm đi vào cột, phần còn lại được thải ra ngoài. Kỹ thuật sử dụng bơm tiêm: -
Hút dung dịch mẫu vào bơm tiêm và điều chỉnh dung dịch đến vạch rồi kéo ngược pittông ra sau để lượng mẫu đó chuyển hết vào thân bơm tiêm (đầu kim rỗng).
-
Sau khi xuyên kim qua lớp đệm cao su silic của injector để yên khoảng 3 đến 5 giây để kim được cân bằng nhiệt độ trong injector rồi mới đẩy pittong.
-
Cách này giúp tránh một số cấu tử khó bay hơi còn đọng lại ở đầu kim gây sai số khi địnhlượng những cấu tử này.
Buồng tiêm gồm có 2 loại cơ bản là buồng tiêm cho cột nhồi và buồng tiêm cho cột mao quản. Cấu tạo của chúng khác nhau chủ yếu về liner trong buồng tiêm. Với mỗi loại cột và kỹ thuật tiêm có 1 loại liner riêng tùy thuộc vào cơ chế hoạt động của buồng tiêm.
22
Cột mao quản
Cột nhồi
Hình 9. Hệ thống tiêm mẫu cho cột nhồi và cột mao quản 2.3.1 Buồng tiêm dùng cho cột nhồi: là buồng tiêm trực tiếp, cấu tạo khá đơn giản: mẫu được tiêm qua septum vào buồng tiêm, mà cụ thể hơn là liner. Ở đây mẫu phân tích được làm nóng, hóa hơi và được “cuốn theo” dòng khí mang đi thẳng vào cột. 2.3.2 Buồng tiêm dùng cho cột mao quản: chia làm 2 loại cơ bản dựa trên kỹ thuật tiêm -
Buồng tiêm chia dòng (split) /không chia dòng(splitless) Buồng tiêm trên cột (on-column)
23
a/ Tiêm chia dòng (split) /không chia dòng(splitless) là kỹ thuật tiêm phổ biến nhất và thích hợp nhất dùng cho cột mao quản nhằm làm giảm lượng mẫu đưa vào cột, đặc biệt là với những cột có đường kính trong rất nhỏ. Buồng tiêm ở chế độ chia dòng(split): Thích hợp cho mẫu có các cấu tử phân tích có nồng độ lớn hơn 0.1% mẫu. Với các phân tích có độ phân giải cao, các kết quả tốt nhất thu được khi cho lượng nhỏ nhất của mẫu (≤ 1μl) tiêm vào có thể được dò tìm khoảng ≤ 1ng cho mỗi cấu tử. Việc tiêm toàn bộ mẫu sẽ làm quá tải cột có đường kính 0.32 mm hoặc nhỏ hơn. Trong khi đó tiêm mẫu có chia dòng chỉ đưa vào cột khoảng 0.2 đến 2% lượng mẫu. Mẫu được tiêm nhanh (< 1s) qua lớp đệm cao su silic (septum) vào vùng hóa hơi của hệ thống tiêm mẫu (injector) được giữ ở nhiệt độ cao (ví dụ ở 350oC) để quá trình bay hơi mẫu được diễn ra nhanh. Dòng khí mang lôi kéo mẫu qua buồng trộn, ở đó có sự hóa hơi hoàn toàn và hòa trộn tốt. Tại điểm chia dòng, một phần nhỏ của hơi đi vào trong cột sắc kí còn phần lớn đi qua van chia dòng đến lỗ thông khí thải. Tỉ lệ của mẫu không được đưa vào cột được gọi là tỉ số chia dòng (split ratio) có giá trị từ 50:1 đến 600:1. Sau khi mẫu bị sục ra khỏi buồng tiêm mẫu (khoảng 30s), van chia dòng đóng lại và khí mang được giảm tương ứng. Một μl chất lỏng được tiêm vào sẽ tạo khoảng 0.5 ml thể tích khí và nhanh chóng làm đầy buồng tiêm mẫu. Vài khí có thể thoát ra trở lại theo đường của đệm cao su silicon. Các cấu tử có nhiệt độ sôi thấp sẽ thoát ra đầu tiên rồi đến các cấu tử có nhiệt độ sôi cao hơn. Nhiệt độ của buồng tiêm mẫu nên đủ lớn để giảm thiểu phần mất này của mẫu. Tuy nhiên nếu nhiệt độ quá cao, sự phân hủy mẫu có thể xảy ra. Trong suốt quá trình tiêm mẫu và sắc kí, có dòng khí 1ml/ph làm sạch lớp đệm cao su silicon để tách hơi mẫu dư và các khí thoát ra từ lớp đệm cao su này (septum purge). Buồng tiêm ở chế độ tiêm không chia dòng (splitless): Thích hợp cho phân tích lượng vết những cấu tử có nồng độ nhỏ hơn 0.01% mẫu và cách tiêm này có khoảng 80 % mẫu được đưa vào cột. Hệ thống tiêm mẫu tương tự như trường hợp tiêm mẫu chia dòng, nhưng ống thủy tinh trong buồng tiêm mẫu là thẳng, trống và không có buồng trộn mẫu. Một thể tích lớn (khoảng 2 μl) của dung dịch được pha loãng trong dung môi có nhiệt độ sôi thấp được tiêm chậm (khoảng 2s) vào trong ống thủy tinh của buồng tiêm mẫu với lỗ thoát chia dòng bị đóng. 24
Nhiệt độ của buồng tiêm mẫu cho chế độ không chia dòng giữ thấp hơn (khoảng 220oC) so với chế độ chia dòng vì mẫu bị lưu giữ lâu hơn trong buồng tiêm mẫu và tránh mẫu bị phân hủy nhiệt.
Hình 10. Hệ thống tiêm mẫu có chia dòng, không chia dòng và tiêm mẫu vào cột b/ Tiêm trên cột (on-column):Có thể dùng cho cột đường kính trong tương đối lớn 0,32 mm (wide-bore). Mẫu phân tích được tiêm trực tiếp vào cột mà không có sự hóa hơi ở buồng tiêm, do đó thành phần của mẫu vào cột ít thay đổi so với mẫu ban đầu và độ lặp lại cao. Tiêm trên cột hạn chế tối đa sự phân hủy và sự phân biệt các thành phần trong mẫu, nên được áp dụng cho phân tích các hợp chất không bền nhiệt, dễ bị phân hủy ở gần nhiệt độ sôi của nó và mẫu đa thành phần có khoảng nhiệt độ sôi lớn. Tiêm trên cột có thể gây quá tải cột, làm giảm hoạt tính của pha tĩnh và gây nhiễm bẩn cột do sự tích lũy của các hợp chất ít bay hơi, vì vậy không thích hợp với mẫu chứa các hợp chất có nhiệt độ sôi cao. Yêu cầu loại bơm tiêm chuyên dụng với đầu kim nhỏ để có thể đưa vào cột, buồng tiêm mẫu cũng phải được thiết kế đặc biệt, phải dùng cột có đường kính trong tương đối lớn. Dùng tiền cột không chỉ bảo vệ cột tách mà còn giúp cho việc tiêm mẫu dễ dàng hơn, tránh cho mẫu bị ngưng tụ trong cột, do đó làm giảm độ rộng của peak sắc ký. Hiện nay, buồng tiêm PTV (Programmable temperature vaporizing) là buồng tiêm lý tưởng với sự kết hợp của tất cả các loại buồng tiêm nói trên, bao gồm cả tiêm chia dòng/không chia dòng và tiêm trên cột. Buồng tiêm có thể thay đổi nhiệt độ, thời gian tiêm mẫu, lưu lượng khí chia dòng và khí làm sạch... Tuy nhiên cấu tạo, chương trình điều khiển khá phức tạp và phải tối ưu hóa nhiều thông số. 2.4 CỘT SẮC KÝ 25
Trong thực tế có nhiều dạng cột tách khác nhau nhằm thỏa mãn các mục đích phân tích. Nói chung, cột tách sắc kí cần thỏa mãn các yêu cầu sau: -
Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha động và pha tĩnh nhờ việc tối ưu hóa các thông số của phương trình Van Deemter.
-
Độ thấm cao tức có độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định.
-
Khả năng tải trọng cao của cột.
-
Có khoảng nhiệt độ sử dụng rộng và chịu được nhiệt độ cao.
Sắc ký khí sử dụng 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản. Tùy theo loại mẫu, độ phức tạp của mẫu và loại máy sắc ký mà chọn cột nhồi hay cột mao quản. Tùy theo loại cột tách sử dụng mà bộ phận tiêm mẫu (Injector) và đầu dò(Detector) cũng khác nhau.
Hình 11. Cột nhồi và cột mao quản 2.4.1 Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột.
Hình 12. Cấu tạọ của một số cột sắc ký Đường kính cột: 2-4mm (1/8 – ¼ inch). Chiều dài: 1-5m. Chất liệu: Thép không rỉ, thủy tinh Pyrex, Ni. 26
Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn được phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn là pha tĩnh. Chất mang rắn thường là diatomite đã được silan hóa để giảm liên kết hydro với các chất phân cực:
Kích thước hạt đồng nhất sẽ làm giảm chiều cao cột và tăng độ phân giải. Cở hạt nhỏ sẽ làm giảm thời gian cân bằng hòa tan nhờ vậy làm cải thiện hiệu quả của cột. Tuy nhiên, nếu kích thước hạt càng nhỏ thì càng ít không gian trống giữa các hạt và áp suất để ép pha động qua cột phải càng cao. Kích thước hạt được biểu diễn theo micromet hoặc cở mesh, tức là cỡ lưới mà hạt có thể đi qua hoặc bị giữ lại trên sàng. Ví dụ các hạt cở 80/100 mesh đi qua được cở sàng 80 mesh (170μm) nhưng không đi qua được cở 100 mesh (150 μm). Yêu cầu của chất mang rắn là không tham gia vào sự tách và có khả năng giữ được pha tĩnh (không ít hơn 10 %) Một số loại chất mang rắn: Có hai điều quan trọng cần chú ý khi chọn một chất mang là: cấu trúc và đặc tính bề mặt. -
Cấu trúc góp phần vào hiệu quả của chất mang, trong khi các đặc trưng bề mặt chi phối sự tham gia của chất mang vào kết quả của việc tách.
-
Các chất mang phải là các chất trơ về mặt hóa học với tất cả các loại mẫu. Nó nên có diện tích bề mặt lớn để pha lỏng có thể trải thành một lớp phim mỏng và cấu trúc bề mặt phải thích hợp để lưu giữ lớp phim mỏng đó. Tuy nhiên, diện tích bề mặt lớn không là điều đảm bảo cột hiệu quả.
Hầu hết các chất mang trong sắc ký cột nhồi được tạo từ diatomite. Loại chất mang đầu tiên dùng trong sắc ký khí do hãng Johns Manville chế tạo có tên thương mại là Chromosorb. Sau đây là một số loại chất mang thông dụng. Chromosorb A dùng ở qui mô điều chế, có khả năng giữ tốt pha lỏng (tối đa đến 25%), có cấu trúc khó bị phá vở và có bề mặt khá trơ. Thường được sản xuất ở kích thước 10/20, 20/30 và 30/40 mesh. Sử dụng cho những cột dài, chênh lệch áp suất thấp. Chromosorb G dùng để tách các hợp chất phân cực. Nhờ có diện tích bề mặt thấp, độ cứng, tỉ trọng cao nên nó được sử dụng cho các trường hợp tẩm pha lỏng hàm lượng thấp. Tẩm 5% trên Chromosorb G tương ứng với tẩm 12 % trên Chromosorb W.
27
Chromosorb P được chế tạo từ gạch chịu lửa C-22 có màu hồng (nên có kí hiệu P-pink) và tương đối cứng. Bề mặt ít hấp thụ hơn so với các loại Chromosorb khác, được dùng cho những việc tách hydrocacbon. Chromosorb W được chế tạo từ Celite 545, màu trắng và dễ vỡ hơn so với loại G. Bề mặt tương đối không hấp thụ và được dùng để tách các hợp chất hữu cơ phân cực. Có hai vấn đề chung của các chất mang: Thứ nhất, tương tác bề mặt chất mang (hấp phụ hoặc xúc tác) chính là nguyên nhân gây ra những peak có đuôi hoặc biến dạng. Chính những nhóm -OH hay oxit trên bề mặt chất mang là nguyên nhân của những tương tác đó. Có thể che các nhóm này bằng một lượng nhỏ pha lỏng phân cực. Nhưng cách tốt nhất hiện nay là silan hóa với các thuốc thử DMCS (dimethyl dichorosilan) hoặc HMDS (hexamethyl disilazane). Thứ hai, kích thước hạt càng nhỏ thì số hạng A trong phương trình Van Deemter càng nhỏ, nhưng sự chệnh lệch áp suất trong cột sẽ tăng vượt khỏi giới hạn làm việc thực tế. Hiệu suất cột chỉ có thể cải thiện nếu dùng các hạt có kích thước như nhau. Tỉ lệ phần trăm pha lỏng Lượng chất lỏng cần phải đủ để bao bọc các hạt bằng một lớp mỏng đồng nhất. Pha lỏng quá nhiều sẽ đọng lại ở những chỗ trống giữa các hạt làm giảm hiệu suất cột. Trên chất mang Chromosrb khi tỉ lệ pha lỏng lớn hơn 30% hiệu quả của cột giảm đi rất nhiều. Trước đây người ta hay tẩm 15-30% chất lỏng, nhưng hiện nay có khuynh hướng chỉ tẩm 2-10%. Vì thời gian lưu tỉ lệ với lượng pha lỏng trong cột nên phép phân tích càng nhanh khi cột có lượng pha lỏng phủ lên càng nhỏ. Khi tải chất lỏng quá thấp sẽ xuất hiện những tâm hấp phụ trên chất mang. Muốn tránh điều này cần phải dùng những chất mang trơ. Độ bay hơi của mẫu thử cũng phải tính đến khi chọn lượng pha lỏng. Các chất khó bay hơi như steroit cần phải được phân tích trong những cột có tải thấp (khoảng 3% hay thấp hơn). Các chất rất dễ bay hơi như các hydrocacbon nhẹ thì cần có cột tải cao (20-30%) vì lượng chất lỏng càng nhiều thời gian các chất có trong pha lỏng càng lâu, sự phân bố càng tốt. Mật độ nhồi Mật độ nhồi có một sự ảnh hưởng rõ rệt đến sự lưu giữ trên pha tĩnh. Pha tĩnh được phủ trên một chất mang trên cơ sở phần trăm trọng lượng, trong khi vật liệu nhồi được đặt trong cột trên cơ sở thể tích. Nếu mật độ nhồi của chất mang tăng lên, khối lượng tổng của pha tĩnh trong cột tăng lên. Chuẩn bị pha tĩnh và nhồi cột: 28
Tẩm pha tĩnh lên chất mang có nhiều cách, một trong số đó là dùng máy cất quay chân không. Lấy một lượng pha tĩnh tính toán sẵn hòa tan vào trong một dung môi thích hợp trong một bình đáy tròn, cho tiếp chất mang rắn với lượng tính toán thích hợp vào. Lắp bình vào máy cất quay. Quay bình cho đến khi dung môi bay hết. Đun nóng bình bằng cách thủy hoặc bằng đèn hồng ngoại. Lấy đoạn ống thẳng có chiều dài và đường kính mong muốn, nút một đầu bằng bông thủy tinh, đầu kia lắp một cái phểu, đổ đầy chất mang đã tẩm pha lỏng vào phểu. Lắc cột bằng máy lắc hoặc đập nhẹ vào cột đến khi không thấy giảm thể tích chất mang trên phểu nữa thì cột đã nạp đầy. Nút đầu còn lại bằng bông thủy tinh và cuộn ống lại cho thích hợp với lò ổn nhiệt của máy GC. Luyện cột: Cột cần phải đặt ít nhất 2 giờ ở 25 oC trên nhiệt độ tối đa mà cột sẽ sử dụng nhưng không được quá giới hạn trên của nhiệt độ bay hơi của pha lỏng. Một luồng khí mang nhỏ (5-10 ml/ph) được cho qua cột. Đầu ra của cột hở không nối với detector để tránh làm bẩn nó. Ưu điểm cột nhồi: Nạp mẫu đơn giản, độ chính xác cao. - Hệ số lưu trữ cao giúp peak đối xứng ngay cả khi nồng độ lớn và số đĩa lý thuyết hiệu dung cao. - Đường kính cột lớn nên ít chịu ảnh hưởng của tạp chất. - Mẫu không đòi hỏi phải tinh chế kỹ. - Mẫu thường bơm với thể tích lớn nên sai số giữa các lần bơm nhỏ (trong trường hợp bơm mẫu bằng tay) Nhược điểm cột nhồi: Cột nhồi thường dùng với các máy sắc ký khí thế hệ cũ hoặc các máy dành cho mục đích đặc biệt. Hiệu quả thấp do số đĩa lý thuyết thường nhỏ hơn 8000. Nhưng nếu tăng chiều dài cột quá dài có thể gây áp suất đầu cột quá lớn. Vì vậy mà cột không thể quá dài dẫn đến số đĩa lý thuyết nhỏ. -
Hiện nay có một số loại cột nhồi mới có đường kính nhỏ (< 1mm) cho phép nâng chiều dài cột lên vài chục mét. Cột này thường dùng trong một số loại ứng dụng đặc biệt mà cột mao quản không đáp ứng được, như trong các phép phân tích cần độ phân giải cao hoặc cơ chế hấp thụ đặc biệt; hoặc dùng trong phân tích khi nhiệt độ rất cao; hoặc tốc độ tăng giảm nhiệt độ rất nhanh. 2.4.2 Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong cột. Việc nạp mẫu khó khăn. Tuy nhiên tốc độ phân tách nhanh với số đĩa cực lớn (đến 300.000 đĩa) Đường kính cột: 0.1-0.5mm
Chiều dài cột: 10-30m. 29
Trong trường hợp cần tăng hiệu quả tách người ta có thể chế tạo các cột có chiều dài đến 100-150m. Chất liệu cột: Thủy tinh hoặc Fused Silica có tính bền vât lý rất cao và trơ về hóa học. Thủy tinh oxit tinh khiết nấu chảy có mức độ liên kết ngang cao hơn nhiều so với thủy tinh thường nên bền và chịu được nhiệt độ cao đến 350oC. Lực căng cao của ống thủy tinh cho phép chế tạo các cột có thành mỏng và dễ uốn. Các cột mao quản mở có lớp phim mỏng tráng trên thành ống cung cấp độ phân giải cao hơn, thời gian phân tích ngắn hơn và độ nhạy cao hơn cột nhồi nhưng chúng có dung lượng thấp hơn cho các mẫu. Cột mao quản mở hẹp cung cấp độ phân giải cao hơn cột mao quản mở rộng hơn nhưng chúng đòi hỏi áp suất cao hơn để hoạt động và có dung lượng cho mẫu nhỏ hơn. Lớp phim mỏng lỏng pha tĩnh dày khoảng từ 0.1 đến 5 μm trên bề mặt bên trong.Nếu giảm độ dày của lớp phim này sẽ làm tăng độ phân giải, giảm thời gian lưu và giảm dung lượng cho mẫu. Một loại khác là các cột mao quản có các hạt rắn chất mang phủ một lớp pha tĩnh lỏng được gắn trên bề mặt bên trong của cột. Bởi vì diện tích bề mặt của loại này tăng lên, cột này có thể xử lý những mẫu lớn hơn cột phủ lớp phim mỏng trên thành cột. Loại cột này là trung gian giữa cột mao quản phủ phim mỏng trên thành và cột nhồi.
Hình 13. Cột mao quản được làm bằng polyamide và fused silica
30
Hình 14. Minh họa cấu trúc bên trong của các cột nhồi và cột mao quản Cột mao quản được chia làm hai loại chính: WCOT (Wall Coated Open Tubular) PLOT (Porous Layer Open Tubular) Cột PLOT: Là cột trung gian giữa cột mao quản và cột nhồi nên thường dùng để thay thế cột nhồi do pha tĩnh giống hệt cột nhồi. Pha tĩnh là một lớp hạt xốp được phủ lên thành ống mao quản Fused Silica, có bề dày 5-50 µm. Cột WCOT: Tại thành ống mao quản Fused Silica được phủ trực tiếp một lớp pha tĩnh, lớp này thường ở dạng sệt gần như đặc nên cột WCOT là cột dùng trong sắc ký Lỏng-Khí.
31
Nếu pha tĩnh không gắn trực tiếp lên thành cột mà qua một lớp trung gian thì gọi là cột SCOT (Support Coated Open Tulular). Bề dày của lớp pha tĩnh quyết định hệ số lưu giữ và dung lượng mẫu của cột. Cột WCOT được chia làm 3 loại: -
Cột ống hẹp (Narrow bore): đường kính trong 0.05-0.1 mm và thường được dùng trong Fast-GC Cột thông thường (Coventional): đường kính trong 0.18-0.32 mm và thường được dùng trong các phép phân tích thông thường hiện nay. Cột ống rộng (Mega bore/Wide bore): thường được dùng với các máy GC đang sử dụng cột nhồi, do lượng mẫu và tốc độ dòng khí mang khá lớn. Bảng 2. So sánh cột nhồi và cột mao quản
Bảng 3. So sánh số đĩa lý thuyết trên đường kính cột.
Bảng 4. So sánh cột nhồi và cột WCOT Chiều dài cột nhồi là 2m. Chiều dài cột mao quản là 30m
32
Hình 15. Khả năng tách trên 3 cột (i) cột nhồi – 2m x ¼ inch; (ii) cột wide bore 10m x 0.53mm x 2.5um HP 50; (iii) cột narrow bore 25m x 0.25mm x 0.25um Cabowax -20M 2.4.3 Pha tĩnh Pha tĩnh chia làm 2 loại: pha tĩnh rắn và pha tĩnh lỏng. Hai loại hạt được nhồi vào trong cột, là chất hấp phụ (Adsorbent)và chất mang (Support) phủ pha tĩnh. Các hạt phải đồng nhất và thường có đường kính 30/40 Mesh hay 100/120 Mesh. Yêu cầu chung cho pha tĩnh là ít bay hơi, bền nhiệt, trơ về mặt hóa học. 2.4.3.1 Pha tĩnh rắn Pha tĩnh rắn cho cột nhồi: thường dùng là Diatomic, Molecular sieve, Prorapak, Chromosorb, Tenax…Pha tĩnh rắn có vài ưu điểm hơn pha tỉnh lỏng: -
Chất hấp phụ rắn bền và ổn định trong một khoảng nhiệt độ lớn. Không xảy ra hiện tượng chảy máu cột (Bleeding), đặc biệt là đối với các chất hâp phụ vô cơ và rây phân tử (Molecular Sieve) Tách rất tốt các Hydrocacbon nhẹ, các khí hiếm, khí trơ và các Alcol... 33
Pha tĩnh rắn cho cột PLOT: về căn bản giống như pha tĩnh trong cột nhồi. Tuy nhiên kích thước hạt nhỏ hơn (≤ 1µm) và có độ đồng nhất cao hơn nên dễ phủ lên bề mặt cột mao quản Fused Silica. S bề mặt và hệ số tải lớn (như cột nhồi) nhưng độ dài cột dài hơn nên hiệu quả tách, độ ổn định và độ lặp lại cao hơn cột nhồi. Đồng thời vho phép phân tích những hợp chất rất phân cực mà cột WCOT không phân tích được hoặc rất khó phân tích. Các chất hấp phụ thường sử dụng -
Alumina (Al2O3): Hoạt hóa ở 200°C – 1h, tách khí và các hyrocacbonđến C5, kích thước hạt: 100/120 mesh, kích thước lỗ xốp:1 Å - 100 Å. Silica (SiO2): dùng khi tách các khí có M nhỏ và các Hydrrocacbon nhẹ Bề mặt riêng750 m2/g, kích thước lỗ xốp trung bình: 22 Å Bề mặt riêng 100m2/g kích thước lỗ xốp trung binh: 300 Å.
Zeolite: Tách các khí có M nhỏ bằng phương pháp loại trừ (exclusion):Rây phân tử (molecular sieves).Các zeolite kí hiệu5A và 13Xthường được sử dụng để tách H2, O2,N2, CH4, CO, Ar, Ne… - Các hợp chất cao phân tử:là co-polymer của polystyrene và divinylbenzene, có bề mặt riêng lớn và độ xốp cao (macropore và micropore), tương tác đa dạng với các dung môi và chất tan tiếp xúc với nó 2 - Cacbon:Cacbon hoạt tính: bề mặt riêng ∼1000 m /g Cacbon Graphit: bề mặt riêng 5 - 100 m2/g Các chất mang sử dụng cho GLC: -
Celite (một dạng đặc biệt của khoáng diatomic), Celite nung, Celite nung hoạt hóa bởi Ag hoặc Au, các hạt vi cầu thủy tinh, polymer, teflon… - Biến tính Celite:Nung ở 900°C với Na2CO3 và trợ dung silica ⇒cristobalite, các vết kim loại tác dụng với Silica ⇒gây màu (hồng) cho vật liệu. - Vi cầu Polystyren Sử dung các nhóm Silanol (≡Si-OH) và dùng phương pháp tẩm (slurry method of coating) để chuyển chất hấp phụ lên chất mang -
Hexamethyldisilazane + ≡Si-OH ⇒gốc trimethylsilyl
34
Hình 16. Quá trình Silan hóa của chất mang pha tĩnh Biến tính bề mặt fused silica Độ phân cực (polar) của các gốc Silanol trên bề mặt -
Phân cực: -CN, -CO và –OH Không phân cực: Hydrrocacbon (dialkyl siloxane) Phân cực lớn: Polyester
Hình 17. Biến tính bề mặt fused silica
35
Hình 18. Các pha tĩnh thường sử dụng trong GLC Ảnh hưởng của độ phân cực của pha tĩnh đến thời gian lưu 2.4.3.2 Pha tĩnh lỏng Chủ yếu dùng cho cột WCOT. Những yêu cầu về pha tĩnh lỏng -
Một pha tĩnh lỏng lý tưởng cho sắc ký khí lỏng cần thể hiện độ chọn lọc và khả năng hòa tan của các cấu tử được tách và có khoảng nhiệt độ làm việc rộng.
-
Nó cũng phải bền hóa học và có áp suất hơi bão hòa thấp ở tại các nhiệt độ cao.
Nhiệt độ làm việc nhỏ nhất nên gần nhiệt độ phòng, ở đây chất lỏng pha tĩnh phải tồn tại ở dạng lỏng chứ không phải rắn. Khi chọn lựa pha tĩnh, một sự thỏa hiệp giữa lý thuyết và thực nghiệm phải được xem xét. Ví dụ theo phương trình Van Deemter thì hiệu quả tách của cột cao hơn nếu cột chứa pha tĩnh lỏng ít hơn so với cột như vậy chứa pha tĩnh lỏng nhiều hơn. Nhưng trong thực tế pha tĩnh lỏng phủ trên chất mang mỏng quá có thể tạo nên một sự che phủ không đầy đủ các vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang dẫn đến sự kéo đuôi của pic, khi đó cần tăng phần trăm của pha tĩnh lỏng trên chất mang. -
Các phép tách trong sắc ký khí lỏng là kết quả của những tương tác pha tĩnh hòa tan chọn lọc và sự khác nhau của hơi bão hòa của các chất tan. Lực tương tác chính chịu trách nhiệm trong tương tác của chất hòa tan với pha tĩnh là phân bố, cảm ứng, định hướng và tương tác cho nhận. Tổng của chúng được đo lường bởi “độ phân cực” của pha tĩnh đối với chất tan.
Trong sắc ký khí lỏng, khả năng chọn lọc của một cột chi phối khoảng trống giữa các peak và độ lớn cực đại của peak được tách. Sự khác nhau về độ chọn lọc là có ý nghĩa 36
vì chúng cho phép việc tách các chất tan có cấu trúc gần giống nhau bởi một pha tĩnh chọn lọc. Các thông số sau đây ảnh hưởng đến độ chọn lọc: -
Bản chất của pha tĩnh
-
Nồng độ của pha tĩnh
-
Nhiệt độ cột
-
Việc chọn lựa và xử lý sơ bộ chất mang rắn hoặc chất hấp phụ.
Một vài loại pha tĩnh lỏng thông dụng được liệt kê trong bảng và việc chọn pha tĩnh lỏng cho một đối tượng mẫu được dựa trên qui tắc “các chất càng giống nhau thì càng tan tốt vào nhau”. Cột không phân cực là tốt nhất cho mẫu phân tích không phân cực. Các cột có độ phân cực trung bình thì tốt cho mẫu phân cực trung bình và phân cực mạnh thì tốt cho mẫu phân cực mạnh. Ví dụ để tách ancol ta phải chọn pha lỏng phân cực như cacbowax-20, ngược lại để tách hidrocacbon no mạch thẳng phải sử dụng các pha lỏng không phân cực. Khi cột dùng nhiều bị lão hóa thì pha tĩnh bị đốt bay mất nên các nhóm silan (Si-OH) bị lộ ra và các peak bị kéo dài đuôi tăng lên. Nếu trong cột có oxi ở nhiệt độ cao cũng dẫn đến sự thoái hóa cột và pic bị kéo đuôi. Để giảm khuynh hướng pha tĩnh bị mất ở nhiệt độ cao, người ta gắn chúng vào bề mặt pha tĩnh silica bằng các liên kết cộng hóa trị. Người ta chia các pha lỏng và các đối tượng cần tách ra nhiều nhóm theo tính phân cực của phân tử như sau: Nhóm rất phân cực: H2O, glycol, glyxerin, poliphenol, axit dicacboxylic. -
Nhóm phân cực: ancol mạch thẳng, axit béo hữu cơ, phenol, amin bậc 1,2, hợp chất nitro và nitril có chứa hydro α.
-
Nhóm phân cực trung bình: ete, ankanal, ankanon, este, amin bậc 3, hợp chất nitro và nitril không chứa hidro α.
-
Nhóm ít phân cực: hidrocacbon thơm, anken, hidrocacbon đã bị halogen hóa một phần.
-
Nhóm không phân cực: ankan, thioankanol, sunfua, ankan đã bị halogen hóa.
Các loại pha tĩnh phổ biến nhất là Squalane, polysioxanes và polyethylene glycol. Trong đó, nhóm Methyl Silicone (hay Polydimethyl Siloxane) là quan trọng nhất và hay được sử dụng nhất. Squalane
37
Polysioxanes: là các pha tĩnh được sử dụng rộng rải nhất cho các cột sắc ký khí mao quản cũng như cột nhồi. Bởi vì cấu trúc của chúng có thể được gắn thêm một số loại nhóm chức đa dạng nên chúng thể hiện tính phân cực trong một dải rộng. Các loại silicon này là dạng gôm nhớt nên có thể phủ tốt trên silica và cũng thích hợp lý tưởng cho cột sắc ký mao quản.
Polydimethyl siloxane (R = CH4) là khung cơ bản cho việc tạo thành các pha tĩnh khác. Khi thay thế nhóm methyl bằng các nhóm khác sẽ dẫn đến sự thay đổi độ phân cực và khả năng tách. Phenyl – C6H5 Cyanopropyl – C3H3CN Trifluropropyl – C3H6CF3
38
Hình 19. Sắc ký đồ của một số cột mao quản với các pha tĩnh (a) Polydimethyl siloxane ; (b) 5(phenylmethyldimethyl) siloxane ; (c) 50(phenylmethyldimethyl) siloxane ; (d) 50%poly(trifluoropropyl-dimethyl siloxane) ; (e) polyethylene glycol ; (f) 50%poly(cyanopropyl-dimethyl) siloxane Polyethylene glycol Các pha tĩnh không chứa silicon được sử dụng rộng rải nhất là các polyethylene glycol. Chúng có sẵn trên thị trường với một khoảng rộng của trọng lượng phân tử như Carbowax 20M và Superox-4. Cấu trúc chung của một polyethylene glycol có thể được mô tả như sau: HO-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2-)n-O-CH2-CH2-OH Loại pha tĩnh lỏng này có độ phân cực cao, nhưng cũng có một vài hạn chế. Ví dụ Carbowax 20M có nhiệt độ làm việc cực đại khá thấp 225oC và nhiệt độ làm việc tối thiểu là 60oC. Hơn nữa, những lượng vết của oxi và nước có những ảnh hưởng không tốt trên các pha tĩnh lỏng nhưng đặc biệt không tốt cho carbowax 20M, làm tăng nhanh quá trình lão hóa của cột. Bảng 5. Một số pha tĩnh thường sử dụng trong sắc ký khí (Độ phân cực tăng dần)
39
Bảng 6. Một số pha tĩnh-Tên thương mại-Ứng dụng Pha tĩnh
Tên thương mại
Tính phân cực Ứng dụng
Cycloparafin
Squalane
Không cực
Polydimethylsiloxane OV-1,SE-30
Không cực
phân
Các ứng dụng thông thường của cột không phân phân cực; hydrocarbon; nhânthơm; dược phẩm ;steroid; PCB’s …
Poly(phenylmethyl dimethyl) siloxane(10% phenyl) Polyethylene glycol Poly(phenylmethyl OV-17dimethyl) siloxane(50% phenyl)
Các Hydrocarbon
OV-3, SE-52
Hơi phân cực
Axit béo đã ester hóa ; alkaloid; dượcphẩm; các hợp chất halogen hóa
Carbowax
Phân cực
Axit tự do; alcol; ether; tinh dầu;glycol
OV-17
Dược phẩm ; steriod; Phân cực trung thuốc bảo vệthực vật; bình glycol
Poly(dicyanoalkyldi OV-275 methyl) OV-275 siloxane
Phân cực cao
40
Axit béo chưa no nhiều nối đôi; axittự do; alcol
Ảnh hưởng của đường kính Ảnh hưởng của bề dày lớp phim Hình 20. Ảnh hưởng của đường kính cột và bề dày lớp phim Để nâng cao hiệu suất tách có thể: -
Lựa chọn pha tĩnh, chiều dài cột, đường kính cột…phù hợp với lượng mẫu, loại mẫu. Lựa chọn chương trình nhiệt độ phù hợp. Ghép nối hai hay nhiều cột có pha tĩnh khác nhau. Với những mẫu có thành phần phức tạp thì việc ghép nối cột vẫn thường được sử dụng. Những cột có đường kính không khác nhau nhiều có tểh ghép nối được với nhau. Nếu kết hợp với van chuyển cột tự động cũng cho phép chuyển cột trong quá trình phân tích.
41
Hình 21. 2.5 Lò cột và chương trình nhiệt độ (Column oven) Dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích
Hình 22. Lò cột Khi buồng tiêm được đặt ở nhiệt độ cao (vaporizing inlet), mẫu bay hơi nhanh và di chuyển đến cột, do đó thường gây ra độ lệch tương đối lớn về thể tích mẫu vào cột. Dù nhiệt độ cao của buồng tiêm giúp bảo vệ cột, tuy nhiên nó có thể làm phân hủy các chất kém bền nhiệt, phân biệt các chất có điểm sôi khác nhau trong mẫu, gây mất mẫu hay quá tải cột tách. Khi nhiệt độ của buồng tiêm được giữ dưới nhiệt độ sôi của dung môi khi tiêm mẫu (cool inlet), sau đó tăng dần và bắt đầu quá trình sắc ký sẽ làm giảm tối thiểu sự phân hủy, giảm sự phân biệt đối xử giữa các chất có mức độ hóa hơi khác nhau trong mẫu phân tích, đồng thời làm tăng độ nhạy và độ lặp lại của quá trình sắc ký khí. Để bảo đảm tính lặp lại của thời gian lưu thì cần phải ổn định nhiệt độ cột sắc ký (Column Thermostating)do đó lò ổn nhiệt (thermostating oven) là cần thiết. Tùy vào độ phức tạp các cấu tử ttrong mẫu mà có hai chế độ nhiệt trong lò là Isothermal và Temperature Programming Isothermal : đối với mẫu đơn giảnTopti.= f(Tsôi), Topti≥ Tsôi với RT= 2 – 30 phút Temperature Programming: đối với mẫu phức tạp. Việc tách các cấu tử dựa vào sự thay đổi của T sôi 42
Hình 23. Sắc ký đồ ở hai chế độ: Isothermal và Temperature Programming Chương trình nhiệt độ làm tăng khả năng tách của cột nhờ ngưng tụ rồi bốc hơi dung môi, từ đó giúp cải thiện:
Hệ số khả năng
và Độ phân giải
43
Hình 24. Các vùng có gia nhiệt của hệ GC 2.6 Đầu dò (Detector) Detector có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lượng không điện (trong trường hợp này là nồng độ của các chất được tách khỏi cột sắc ký) thành đại lượng điện và có chức năng phát hiện và đo độ lớn của các cấu tử khi ra khỏi cột sắc ký. Vì vậy detector quyết định một phần độ chính xác cũng như độ nhạy của phương pháp. Nguyên tắc hoạt động của các detector là dựa vào tính chất vật lí của các cấu tử như: tính chất hấp thụ và phát xạ ánh sáng, tính phân cực, tính khúc xạ, tính dẫn điện, dẫn nhiệt, khối lượng riêng… Bảng 7. Một số detector trong sắc ký khí Detector
Giới hạn phát Khỏang tuyến Độ nhạy A.s/g Áp dụng cho hiện tính
Dẫn nhiệt(TCD)
2,5.10-6
1:105
2000-9000
Kiểu dây
2,5.10-6
1:105
2000-9000 đối Sắc ký quá với benzen trình
1:2,5:104
15000 đối với Phân tích khí không khí
1:104
15000 đối với Phân tích khí heptan Khỏang nhiệt độ giới hạn
1:107
2.10-2 đối với Detector vạn cacbon năng cho tất
Kiểu nhiệt 2.10-6 điện trở Bán dẫn
1,2.10-7
Ion hóa ngọn 5.10-12 lửa (FID)
44
Tất cả các chất không làm hỏng dây nung
cả các chất có nhóm CH2 Cộng kết điện 2.10-14 tử (ECD)
1:103
40 đối lindan
Quang ngọn (FPD)
kế 10-8 đối với 1:102 và thấp lửa parathion hơn
Detector hóa heli
ion 5.10-13
với Đối với các chất có ái lực điện tử cao như các thuốc trừ sâu, diệt cỏ, hợp chất chứa nitơ, hợp chất dị nguyên Phát xạ tối ưu cho lưu hùynh ở 394mm và photpho ở 526mm
1:104
300
Phân tích lượng vết khí vô cơ, độ nhạy phụ thuộc vào độ tinh khiết của hem
1:103
1,5
1:105
1
Bao gồm tất cả các chất có năng lượng ion hóa nhỏ hơn 11,6eV
Detectorion hóa argon: - Dạng thường 4.10-11 - Dạng miniot 3.10-12 - Dạng triot
2.10
-14
1:10
6
15
2.6.1 Dectector dẫn nhiệt (thermal conductivity dectector)
45
Mẫu Nguồn cung cấp
Mẫu
Khuyếch đại
Dựa trên nguyên tắc cầu Wheatstone, đôi khi còn được gọi là Katharometer. Các điện trở của cầu bằng kim loại trơ, có độ dẫn nhiệt tốt, như: vàng, bạch kim, tungsteng. Cấu tử mẩu ra khỏi cột, đi vào một nhánh của cột. Khi có sự hiện diện của mẫu làm thay đổi nhiệt độ. Nhiệt độ của nó phụ thuộc vào độ dẫn nhiệt của chất khí bao quanh nó. Khi các phân tử hữu cơ thay thế chất khí mang thì tính đãn nhiệt của nó thay đổi do nhiệt độ trong các cấu tử tăng lên sẽ dẫn đến sự thay đổi trong điện trở. Dựa trên sự thay đổi điện trở của cầu, gây sự mất cân bằng trong mạch, tạo một tín hiệu dưới dạng mũi sắc ký. Khi mẫu ra khỏi cột tín hiệu biến mất. Detector TCD có thể thiết kế theo một số kiểu khác nhau. Trong đó có ba kiểu thường gặp là: tế bào dòng chảy, tế bào bán khuếch tán và tế bào khuếch tán.
Hình 25. Cấu tạo detector dẫn nhiệt A-kiểu tế bào dòng chảy B-kiểu tế bào bán khuếch tán C-kiểu tế bào khuếch tán
46
Loại A ít nhạy hơn cả, thời gian đáp ứng lâu, chỉ thích hợp cho sắc ký điều chế. Loại B, với thể tích tối thiểu 100µl được sử dụng phổ biến cho sắc ký cột nhồi. Còn loại C với giới hạn phát hiện 10-100µl có thể sử dụng cho sắc ký mao quản cột hở. Độ nhạy của detector TCD phụ thuộc vào hai yếu tố sau: -
Khả năng dẫn nhiệt của khí mang (các khí mang có độ dẫn nhiệt tốt như hydro, heli thường được ưu tiên sử dụng).
-
Độ nhạy tỷ lệ với dòng nuôi cầu. Cần lưu ý rằng dòng điện này điều chỉnh tùy thuộc vào loại và lưu lượng khí mang, nhiệt độ detector và nhiệt độ cột tách.
Với detector này, diện tích của các pic không chỉ phụ thuộc vào hàm lượng thể tích mà còn phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa độ dẫn nhiệt của cấu tử và của khí mang. Điều này lý giải tại sao phải dùng hệ số hiệu chỉnh trong phân tích định lượng. Đặc điểm: -
Đơn giản, dùng được các mẫu hữu cơ và vô cơ, không phân hủy mẫu.
-
Thời gian cho tín hiệu lớn và kém nhạy
2.6.2 Detector ion hóa ngọn lửa (flame-ionization detector):
Cách điện
Detector FID là một trong những detector có độ nhạy cao. Nguyên tắc làm việc của nó dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa của hydro đặt trong một điện trường khi có chất hữu cơ cần tách chuyển qua. Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ từ cột tách đi vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ 47
có oxy của không khí để tạo thành các ion trái dấu tương ứng. Cơ chế tạo thành ion trong trường hợp benzen như sau: C6H6
6CH
6CH + 3O2
6CHO+ + 6e
Các ion tạo thành được chuyển về các bản điện cực trái dấu nằm ở hai phía của ngọn lửa (thế hiệu giữa hai bản điện cực này khỏang 250-300V). Dòng ion được giảm áp trên một điện trở có chỉ số rất cao (108-1012Ω) và độ giảm hiệu điện thế này được khuếch đại và ghi lại trên máy tự ghi. Số lượng của ion tạo thành (chính là độ nhạy của detector) phụ thuộc vào các yếu tố sau: -
Cấu trúc hình học của detector
-
Tỷ lệ thành phần của hydro/không khí
-
Nhiệt độ của ngọn lửa.
-
Cấu trúc của các phần tử mẫu cần xác định
Hình 26. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của detector ion hóa ngọn lửa (FID) Các hợp chất hữu cơ được đốt cháy bằng ngọn lửa hydro/không khí tạo thành các ion. Khí mang từ cột sẽ được được trộn trước với hydro và đốt cháy bằng ngọn lửa ở buồng đốt. Một điện cực hình trụ đựợc đặt cách vài mm phía trên ngọn lửa để thu thập các ion sinh ra. Dòng ion này sẽ được đo bằng cách đặt một điện thế giữa đầu phun của ngọn kửa và điện hình trụ để hạn chế đến mức tối đa sự tái kết hợp của các ion, phải đặt điện thế chọn lọc vào vùng bảo hòa (vùng mà khi tăng điện thế sẽ không 48
làm tăng dòng ion) các tính hiệu tạo thành sẽ được khuếch đại bằng bộ khếch đại điện tử rồi qua bộ sử lý và ghi tính hiệu. Đặc điểm: -
Không bị ảnh hưởng bởi vận tốc khí mang.
-
Thời gian chi tín hiệu nhỏ hơn 0,1giây và có độ nhạy gấp 1000 detector TCD
-
Giới hạn phát hiện dưới 10-12g/s
-
Tuy nhiên cũng có những điểm bất lợi là phải dùng thêm hệ thống khí đốt, ngoài khí mang không được dùng khi mẫu có các khí như: SO2, CO2, H2O,NOx. Ngoài ra cấu tử mẫu bị phân hủy trong ngọn lửa nên không thể dùng trong trường hợp muốn cho cấu tử qua tiếp một thiết bị phân tích khác (thí dụ máy hồng ngoại)
-
Chỉ đáp ứng với các hợp chất hữu cơ, không có đáp ứng đối với các khí bền và nước.
-
Độ ổn định cao ít bị ảnh hưởng tới sự thay đổi nhiệt độ và tốc độ dòng.
-
Khỏang động học từ 106-107.
-
Nhiệt độ làm việc tới 4000C.
-
Phân hủy chất đòi hỏi 3 khí: khí mang, hydro, oxi
2.6.3 Detector cộng kết điện tử (electron capture dtector):
ECD sử dụng hoạt độ phóng xạ β phóng ra để ion hóa các khí mang và phát sinh ra dòng điện ở giữa cặp điện cực. khi những phân tử hữu cơ có chứa nhóm electron mang điện tích như: halogen, photpho và nhóm nitro đi qua detector, detector giữa lại một vài electron và làm biến đổi số đo của dòng điện giữa các điện cực. Detector gồm có điện trường, bên trong có nguồn phát tia β (do Ni63, được phủ bên ngoài tấm bạch kim hay titan), khí mang được dùng là Ar. Điện tử sơ cấp của tia β sẽ ion hóa phân tử khí mang làm bắn ra điện tử thứ cấp, tạo dòng điện trong 49
điện trường, phản ứng dây chuyền xảy ra. Khi có sự hiện diện của mẫu, thường là chất có độ âm điện cao, sẽ nhận điện tử thứ cấp, làm giảm cường độ dòng điện, tương ứng với sự xuất hiện mũi sắc kí Detector hoạt động dựa trên đặt tính của các chất có khả năng cột kết các điện tử tự do trong pha khí (trừ trường ngoại lệ của các khí trơ) khả năng cộng kết điện tử lớn hay nhỏ là phụ thuộc vào các hợp chất cần được phát hiện. Khả năng đó tương đối nhỏ đối với các hợp chất hdrocacbon no. Ngược lại, khi các hợp chất có chứa các nhóm chức hoặc đa liên kết (đôi hoặc ba) thì khả năng các điện tử sẽ tăng hẳn lên. Đặc biệt là nếu trong phân tử của hợp chất này có chứa các nguyên tử halogen (Cl, Br….) Bởi vậy, độ nhạy phát hiện của detector ECD rất đặc thù cho các nhóm chức và có thể dao động trong phạm vi khá rộng (1-106) Bộ phận chính của detector ECD là một buồng ion. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa, bắt giữa điện tử và tái kết hợp.
Hình 27. Detector cộng kết điện tử M: là phân tử khí mang, EC: và phân tử của chất có khả năng bắt giữ điện tử. Cũng chính vì khả năng bắt giữ điện tử (electron-capture) mà detector còn được gọi là detector bắt giữ điện tử. * Quá trình ion hóa: một nguồn tia phóng xạ được lắp sẵn trong detector, phát ra một chùm tia β- với tốc độ 108-109 hạt/s. Các hạt β- này sẽ ion hóa phân tử khí mang (M) tạo ra các ion dương của phân tử khí mang và điện tử tự do sơ cấp (e-). So với các điện tử của chùm tia β- các điện tử tự do này chậm hơn hẳn. Chúng được gia tốc nhờ một điện trường và được chuyển dịch về phía anôt. Tại đây chúng bị lấymất điện tích và qua đó cho dòng điện nền của detector. * Quá trình coäng kết điện tử các nguyên tử hoặc là phân tử của các chất (EC), sau khi rời bỏ cột tách, được đưa thẳng vào buồng ion cùng với khí mang. Tùy theo ái lực điện tử của các phân tử này, các điện tử tự do sơ cấp nói trên sẽ bị các phân tử đó bắt giữ và do vậy tạo ra các ion âm. 50
* Quá trình tái kết hợp: các ion âm được tạo ra như vậy sẽ kết hợp với các ion dương của phân tử khí mang để tạo thành các phân tử trung hòa. Như vậy do khả năng cột kết điện tử của chất cần phân tích, điện tử bị lấymất khỏi hệ và dòng điện nền bị giảm đi so với lúc chỉ có khí mang tinh khiết đi qua detector. Mức độ suygiảm của dòng điện nền trong thời điểm có chất đi qua được thể hiện bằng pic sắc ký của chất đó.
Lớp cách điện
Vỏ detector Tay đòn Kẹp lớn
ống hình trụ
Đầu nhận xung từ buồng detector
Độ nhạy của detector ECD phụ thuộc vào : -
Độ lớn của dòng điện nền
-
Mức năng lượng ái điện tử của chất cần phát hiện
-
Bản chất của khí mang
-
Điện thế được đặt vầo detector
Rõ ràng những chất có ái lực điện tử cao sẽ cho các tính hiệu mạnh, để tạo ra các điện thế cần thiết cho quá trình vận chuyển ion, có thể đặt vào detector thế một chiều không đổi hoặc là thế một chiều dưới dạng xung. Trong trường hợp sử dụng thế một chiều không đổi, vùng làm việc tối ưu của điện thế đặt vào detector phụ thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu và nhiệt độ của detector các giá trị này thường dao động giữ 1-30V. ngược lại, nếu sử dụng điện thế dạng xung khỏang làm việc tối ưu của detector sẽ không phụ thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu, mà chỉ phụ thuộc khỏang cách giữ các xung trong một điều kiện nhất định. Thông thường sử dụng thé hiệu một chiều gián đọan khỏang 50V, với độ dài xung từ 0,753µs và khỏang cách giữ hai xung 5-200 µs. Đặc điểm: -
Độ nhạy cao, nhất là khi mẫu thuộc các nhóm chức: halogenua, peroxid, quinon, nitro…Đặc biệt dùng phân tích thuốc sát trùng. 51
-
Nhưng để độ nhạy cao, phải dùng khí Ar (giá trị cao), vì N2 có độ liên kết khá bền nên khó tạo điện tử thứ cấp.
2.6.4 Detector phát xạ nguyên tử (atomic-emission detector):
Hình 28. Detector phát xạ nguyên tử Một trong những bổ sung mới nhất cho máy sắc kí khí là detector phát xạ nguyên tử (AED). Detector này khá đắt tiền so với detector GC nhưng nó có thế mạnh không thể thay thế được. Thật vậy, thay vì đo đơn giản pha khí cung cấp ( chứa cacbon) để tạo ra các ion trong ngọn lửa bằng detector ion hóa ngọn lửa. AED có thể thay đổi nền hiện tại vì sự bắt phần tử không phải điện tử của những điện tử nhiệt với electron bắt điện tử. AED có nhiều tính khó dùng hơn bởi vì nó dựa vào sự dò tìm của những phát xạ nguyên tử. Đây là loại hiện đại. Cấu tử ra khỏi cột được đưa qua trường plasma (tạo bởi heli) có năng lượng của bức xạ vùng vi sóng. Cấu tử mẫu nhận năng lượng, bị nguyên tử hóa và nguyên tử bị kích thích, do đó chúng có khả năng phát xạ. Cường độ phát xạ được ghi nhận và chuyển thành mũi sắc kí. Đặc điểm: -
Độ nhạy rất cao, thời gian phát xạ tính hiệu nhỏ.
-
Đặc biệt máy có thể ghi nhận đồng thời nhiều cấc tử.
-
Tuy nhiên chi phí phân tích rất cao vì phải dùng khí heli.
52
-
Thế mạnh của detector AED là nó có khả năng xác định những phát xạ nguyên tử của nhiều phân tử trong một phép phân tích Elute từ cột mao quản GC. Khi Elute ra khỏi cột mao quản, chúng được đưa vào trong một trường plasma (hoặc sự phóng điện) nơi mà cấu tử mẫu nhận năng lượng và bị kích thích bởi năng lượng từ plasma, do đó chúng có khả năng phát xạ. Máy tính có ghi lại cường độ phát xạ và chuyển thành mũi sắc kí.
2.6.5 Detector quang kế ngọn lửa (flame photometric GC detector) Lãnh vực
Xả khí máy lọc nhiệt
Cung cấp điện thế cao
máy lọc giao thoa Kim loại chịu nhiệt
Hình 29. Detector quang kế ngọn lửa Nguyên nhân để ta sử dụng detector GC nhiều hơn những loại detector khác trong biểu đồ khí cromate là do nó có độ nhạy cao và hiệu quả trong việc dò các hợp chất riêng biệt. Trong quá trình phân tích biểu đồ cromate đặc trưng. Chất định phân của sulfur hay phosphorus chứa hợp chất là nhân tố chính của detectỏ trắc quang ngọn lửa (FPD). Thiết bị này sử dụng những phản ứng quang hóa của những hỗn hợp này trong ngọn lửa hydrogen/không khí như là một nguồn của quá trình phân tích mà nó có quang hệ đặc biệt với những hợp chất chứa hai loại nguyên tử. Khi thích S2 thì tỏa ra hỗn hợp sunfur bước sóng cực đại của năng lượng tỏa ra được kích thích từ S2 có giá trị gần đúng 394nm. Năng lượng tỏa ra của hỗn hợp photphorus trong ngọn lửa được kích thích từ HPO (λmax=510-526nm) để độ nhạy máy đò của một hay nhiều hỗn hợp khác giống như nó giải hấp từ cột GC, một phễu lọc giao thoa được dùng giữa gọn lửa và ống phổ trắc quang (PMT) để phân tách vùng tỏa năng lượng. Việc cần xem lại ở đây là phễu lọc phải được chuyển đổi giữa vùng chạy của biểu đồ cromate nếu hỗn hợp khác của chúng có thể được đò. 53
Khí mang thóat từ cột được trôn với hydro và đi tới cuối ống. dòng không khí theo một đường khác và được trộn với hổn hợp Hydro – khí mang tại ống tạo ra ngọn lửa hydro. Khi mẫu cuốn theo khí mang, được đốt cháy bằng ngọn lửa hydro trong ống phát ra ánh sáng ở bước sóng nào đó. Ánh sáng phát ra bởi ngọn lửa hydro đi qua ống thạch anh để tránh cho bộ lọc quang và bộ nhân quang khỏi bị nhiễm bẩn bởi hơi và sản phẩm đốt cháy và đi đến bộ lọc quang. Bộ lọc cản chỉ cho ánh sáng có độ dài sóng đặc thù đi qua. Bộ lọc kiểu S 394nm được dùng để phát hiện các hợp chất chứa lưu hùynh và loại P 526nm dùng cho hợp chất chứa photpho.
Nếu những hợp chấc chứa lưu hùynh hoặc photpho có trong khí mẫu, chúng được đốt cháy trong ống, phát ra ánh sáng 394nm hoặc 526nm tương ứng. Chỉ có ánh sáng có độ dài sóng này mới qua được bộ lọc cản và bộ nhân quang. Cường độ của ánh sáng được chuyển thành tính hiệu thông qua bộ nhân quang. Tín hiệu này được khuếch đại trong điện kế và chuyển qua bộ xử lý số liệu. 2.6.6 Detector quang hóa ion (photoionization detector)
54
Cung cấp điện
Vỏ bọc cách ly chắn tia UV
Buồng gia nhiệt sự ion hóa
Cửa trong suốt cho UV đi qua Khí hoặc máy dò kết nối có thể tích nhỏ
Hình 30 Detector quang hóa ion (photoionization detector) Phản ứng sử dụng hơn một loại detector cho sắc phổ khí, nó đạt được độ nhạy cao nhờ hiệu quả của các hợp chất đặc biệt với kĩ thuật phân tích sắc phổ riêng biệt. Sự xác địnhcó chọn lọc của hydrocacbon thơm hoặc nhóm organo-heteroatom là công việc của đầu dò quang phổ PID. Thiết bị sử dụng năng lượng ánh sáng cực tím như phương tiện của kĩ thuật phân tích rừ cột GC. Các ion tạo ra từ quá trình này bởi tiến trình hoạt động của electron. Dòng điện phát ra được tập trung cho kĩ thuật phân tích. 2.6.7 Chemiluminescence Spectroscopy Tín hiệu
Cột mao quản từ sắc ký khí
máy bơm chân không
Hình 31. Chemiluminescence Spectroscopy
55
Sự phát quang bằng phản ứng hóa học, giống như nguyên tử phát ra quang phổ, dùng để định lượng sự phát quang từ những nguyên tử bị kích thích trong phép phân tích cô đặc, tuy nhiên không giống AES. Sự phát quang bằng phản ứng hóa học thường phát ra những phân tử mạnh để thay thế khi chúng bị kích thích, dãy ánh sáng được xác định bởi kĩ thuật bắt nguồn từ việc tạo ra phân tử, từ đơn giản đến phức tạp. Hơn nữa sự trắc quang bằng phản ứng hóa học có thể xảy ra bên trong pha lỏng hay pha khí. Trong khi đó AES gần như chính xác so với pha khí. Tuy nhiên sự phát quang bằng phản ứng hóa học trong pha lỏng đóng vai trò quan trọng trong kĩ thuật phân tích phòng thí nghiệm. Phương pháp này thường sử dụng với sắc kí lỏng. Chúng ta sẽ tập trung vào những phản ứng của sự phát quang bằng phản ứng hóa học ở pha khí với những chất cấu thành nên nó có phần đơn giản hơn. Những máy dò tìm này cũng được sử dụng như những máy dò tìm cho kĩ thuật phân tích thành phần các chất.Thế mạnh của phương pháp trắc quang bằng phản ứng hóa học trong đầu dò của bức xạ điện tử có tiêu chuẩn thấp. Vấn đề đầu tiên của loại hình phản ứng này là tạo ra năng lượng cần thiết, kích thích các electron lên mức năng lượng cao hơn, nhờ những chấn động và tình trạng xoay vòng (từ đó chúng bị phá hủy trạng thái này bằng sự phát xạ chứ không đơn giản như ánh sáng phát từ ngọn đèn hay tia laze. 2.6.8 Detector Nitơ-photpho NPD Detector NPD còn gọi là detector ion hóa ngọn lửa sử dụng muối kiềm hay detector nhiệt ion (AFID-Alkali flame ionization detector ), detector ion hóa nhiệt ngọn lửa (FTD- flame thermionic detector) detector này cho độ nhạy cao khi phân tích các hợp chất có chứa nitơ-photpho, phụ thuộc vào điều kiện phân tích nó tỏ ra rất hữu hiệu trong việc phân tích các dược phẩm, dư lượng của các hợp chất cacbamat và photphat sử dụng trong nông nghiệp và phân tích lượng vết các hợp chất chứa nitơ và photpho như nitrosamin, trimetylamin, acrylomitricl trong các chất tổng hợp nhân tạo. Mặt dù cơ chế phản ứng chính xác của detector này vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ nhưng có thể đưa ra một cơ chế phản ứng chấp nhận được như sau: Các hợp chât chứa nitơ đi ra từ cột sắc ký trở thành gốc CN*. Sau khi phân hủy nhiệt trên bề mặt kim loại kiềm nung đỏ gốc CN* kết hợp với các electron thóat ra từ bề mặt kiêm lọai kiềm nung đỏ (Rb) và trở thành ion CN-. Các ion này kết hợp với các nguyên tử hyro. Trong khi đó nguồn kiêm lọai kiềm (Rb) trở thành cation sau khi giải thóat các electron, tạo ra một dòng tập hợp và chuyển thành tín hiệu. Trong Detector ( NPD-17) nguồn ion là một kim lọai kiềm được phủ lên một dây palatin dạng xoắn ốc. nguồn này được nối với dòng Ac để nung nóng sợi palatin.
56
Mẫu chất rửa từ cột được tách ra khỏi miệng ống sau khi trộn với một lượng nhỏ hydro, tiếp xúc với nguồn kim lọai kiềm nung đỏ ở trên. Nhiều phản ứng diễn ra tại bề mặt và ở môi trường xung quanh. Phần mẫu được thóat ra ngòai qua trung tâm của bộ phận thu mẫu. 2.6.9 Detector khối phổ Máy khối phổ là một detector vạn năng cho phân tích định tính và định lượng các chất hữu cơ cả sắc ký khí lẫn sắc ký lỏng. Trong phương pháp khối phổ, các phân tử khí bị ion hóa (thường tạo cation) được tăng tốc trong một trường điện từ và sau đó được tách theo khối lượng của nó. Quá trình ion hóa thường cung cấp đủ năng lượng đến phân tử để phá vở nó thành những mảnh khác nhau. Một phổ khối là một biểu đồ cho thấy lượng tương đối của mỗi mảnh vở tạo ra từ detector khối phổ. Trong sắc ký khí mỗi pic của sắc kí đồ tương ứng với một chất phân tích đã được tách ra được nhận diện bởi một phổ khối. Hình là một phổ khối của hợp chất được nhận diện khi so sánh với thư viện phổ của những hợp chất đã biết. Trục hoành của phổ khối là m/z, khối lượng của ion chia cho điện tích của ion. Phần lớn các ion đều mang điện tích +1 nên m/z thường chính là khối lượng của ion (đ.v.C). Trục tung chỉ thành phần % tương đối của các ion so với ion có lượng lớn nhất được qui ước 100%. Trong phổ khối có một pic quan trọng của ion phân tử không bị phá vở thành các mảnh. Dựa vào tỉ lệ của các đồng vị của một nguyên tố trong tự nhiên, ta có thể nhận thấy tỉ lệ này xuất hiện trong phổ khối qua tỉ lệ của các ion phân tử của các đồng vị. Ví dụ ta có thể hiểu điều này trong phổ khối của 1-brombutan. Vì tỉ lệ của nguyên tố brom trong tự nhiên là 50.52% 79Br và 49.48% 81Br, peak tại m/z=136 của ion phân tử C4H979Br có cường độ lớn hơn một chút so với peak của ion phân tử tại m/z=138 của phân tử C4H981Br.
2.6.9.1Máy khối phổ nam châm hình quạt Nguyên tắc hoạt động với nguồn ion hóa bằng chùm electron
57
Các phân tử khí đi vào nguồn ion hóa bằng va chạm electron và bị bắn phá bởi các electron có năng lượng động học khoảng 70 eV. Năng lượng này đủ lớn để ion hóa các phân tử (M + e →M+ + 2e) và phá vỡ chúng thành những mảnh vỡ nhỏ hơn. Một thế hiệu dương nhỏ ở đĩa đẩy (repeller plate) đẩy những ion hướng về ống phân tích và một thế nhỏ ở các đĩa hội tụ ion (ion focus plates) gia tốc ion giúp các ion có vận tốc cao bị tống khỏi phần đáy của bộ phận này và đi vào ống phân tích. Ống phân tích (Analyser tube) được duy trì ở áp suất chân không cao (khoảng 10 Pa) để các ion chuyển động qua ống không bị lệch hướng bởi những va chạm với các phân tử khí pha động. -5
Các cation di chuyển qua ống phân tích chịu tác động của từ trường đặt vuông góc với hướng di chuyển của chúng. Trường này sẽ hướng các cation về detector đặt ở cuối ống phân tích. Một khe ở detector chỉ cho những ion trong một khoảng giá trị khối lượng nhỏ xác định tiếp cận detector. Các phân tử có khối lượng không phù hợp va phải các thành ống hoặc bị loại bỏ bởi khe thoát ion nên không vươn tới được detector. Tại bộ phận thu ion (ion collector), mỗi cation đến bị trung hòa bởi một electron. Dòng điện đòi hỏi để trung hòa chùm ion tỉ lệ với số lượng các ion đến bộ phận thu ion này. Phổ khối là một đồ thị cho thấy dòng điện như là một hàm của số khối được chọn bởi từtrường. Phương pháp ion hóa bởi tương tác electron (electron impact ionization) cho phổ khối có nhiều mảnh vở. Ion phân tử có thể có hàm lượng thấp thậm chí bị biến mất. Nếu phân tử lớn thì việc có quá nhiều mảnh vở sẽ làm cho việc giải thích phổ khối của nó gặp nhiều khó khăn. Trong trường hợp này các chương trình máy tính có thể được sử dụng để làm khớp phổ của chất chưa biết này với một phổ khối đã biết trong thư viện phổ lưu trong máy tính. Nguyên tắc hoạt động với nguồn ion hóa hóa học
58
Một kỹ thuật tinh tế sản sinh ra ít mảnh vở hơn là sự ion hóa hóa học (chemical ionization). Trong trường hợp này, nguồn ion hóa được đổ đầy metan ở áp suất khoảng 100 Pa. Các electron được cung cấp đủ năng lượng để chuyển CH4 đến những sản phẩm hoạt động khác:
là chất nhường photon khi tương tác với chất phân tích cho MH+ , thường là ion có hàm lượng lớn nhất trong phổ khối ion hóa hóa học metan (methane chemical ionization mass spectrum).
2.6.9.2Máy khối phổ tứ cực Máy khối phổ nam châm hình quạt thường ít được chọn để ghép nối với sắc kí bởi vì từ trường không thể thay đổi đủ nhanh để ghi phổ của những dải sắc kí hẹp. Loại được sử dụng phổ biến hiện nay để kết nối với sắc kí là máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer). Khi đó mỗi chất hòa tan trong cột sắc kí được tách được thể hiện dưới dạng pic. Chất đó được dẫn đến buồng ion hóa tương tác electron có áp suất chân không, tại đây các phân tử chất phân tích bị các electron được gia tốc bắn phá tạo các ion mảnh vở. Các ion này lại tiếp tục được gia tốc bởi một thế khoảng 5-15 V trước khi đi vào bộ tách theo khốilượng tứ cực (quadupole mass seperator). Bộ tách gồm 4 thanh kim loại song song với nhau, trong đó một cặp sẽ được áp vào một thế không đổi và cặp kia một thế hiệu dao động tần số radio. Từ trường được tạo ra làm lệch các hành trình phức tạp khi chúng di chuyển từ buồng ion hóa hướng đến detector và chỉ các ion nào có tỉ số khối lượng với điện tích (m/z) đã chọn trước mới tiếp cận với detector. Các ion khác va đập vào các thanh kim loại và bị mất trước khi vươn đến detector. Bằng việc thay đổi nhanh chóng thế áp vào, các ion có khối lượng khác nhau được chọn lọc để được tiếp cận với detector. Các bộ tách khối phổ tứ cực được quét đủ nhanh để ghi hai đến tám phổ trong một giây với khoảng 800 đơn vị khối. 2.6.10 Các thông số quan trọng của detector: Phân tích định tính trong sắc ký khí chỉ cần peak không bị biến dạng nhiều nhằm xác định chính xác đỉnh pic, còn trong phân tích định lượng thì yêu cầu đạt cao hơn như độ lặp lại, độ so sánh, độ chính xác. Để đáp ứng được các yêu cầu đó, cần phải đảm bảo sự ổn định đủ lớn các thông số detector: dòng điện nuôi mạch cầu, nhiệt 59
độ trong detector, tỷ lệ giữ khí đốt và khí mang cũng như thế phân cực khi dùng detector FID. Sự đáp ứng (độ nhạy thích ứng phụ thuộc vào chất) của một detector không được phụ thuộc qua về mặt kĩ thuật. Và điều quan trọng hơn cả đối với phân tích định lượng là độ tuyến tính của detector. Để nhận biết và xác định lượng vết thì sự “nhạy cảm” của detector là quyết định. Thể tích chết của detector: thể tích của loại detector nhạy cảm với nồng độ (TCD) trước hết phải được chứa đầy bởi hỗn hợp khí mang và mẫu, tức là trước khi xuất hiện cực đại của pic, được gọi là thể tích chết của detector. Nói cách khác, lẽ ra sau khi các cấu tử ra khỏi cột phải được chuyển ngay thành tính hiệu nhưng chúng phải được lắp đầy thể tích của chính bản thân detector rồi mới được phát hiện. Thể tích chết của detector cần phải được hạn chế đến cực tiểu nên độ lớn của detector được lựa chọn thích hợp với dòng khí mang thông thường. Chính vì vậy, detector TCD thông thường không được dử dụng cho sắc ký mao quản vì tốc độ dòng quá nhỏ. Gần đây dã chế tạo được detector TCD cực nhỏ thích hợp cho cột mao quản. Ngược lại, thể tích chết của loại detector phụ thuộc vào tốc độ khối (mass flow) thường rất nhỏ nên chúng rất thích hợp để áp dụng cho cột mao quản, ví dụ như FID và ECD. Thời gian đáp ứng là thời gian cần thiết để cho tín hiệu điện tương ứng với nồng độ nhất định trong pha khí được thiết lập. Thời gian này đối với detector FID là 0,001s và với detector TCD là 0,1s. Khỏang tuyến tính: đây là thông số quan trọng nhất để đánh giá chất lượng của bất kì một loại detector nào. Nó bao gồm phạm vi kể từ nồng độ lớn nhất (mà vẫn còn được ghi nhận trung thành với tỷ lệ chuyển hóa đại lượng không điện thành đại lượng điện) cho tới nồng độ nhỏ nhất vẫn còn phân biệt rõ ràng so với can nhiễu của đường nền. Khỏang tuyến tính của một detector được coi là lớn, nếu như: -
Can nhiễu đường nền nhỏ và do vậy khả năng phát hiện của detector này lớn.
-
Các lượng chất nhỏ nhất cũng như các lượng chất lớn nhất được phát hiện với “khả năng đáp ứng” (tỷ lệ chuyển hóa đại lương không điện thành đại lượng điện) như nhau.
Thông thường, khỏang tuyến tính của detector TCD là 104, còn khỏang tuyến tính của detector FID mở rộng tới 107. Do vậy, detector FID đặc biệt thích hgợp với phân tích lượng vết. Ngoài ba loại detector thông dụng kể trên, tùy theo nhu cầu cần thiết, còn có thể sử dụng các loại detector như: detector quang kế ngọn lửa (FPD) dùng để phát hiện 60
chọn lọc các hợp chất chứa lưu hùynh và photpho, detector ion hóa ngọn lửa muối kiềm (AFID) chọn lọc các chất chứa nitơ và photpho, detector điện hóa theo hiệu ứng Hall (HECD). 2.7. Hệ thống ghi nhận và xử lý số liệu Từ những tín hiệu được ghi nhận từ detector sẽ đi qua hệ thống khuyếch đại, sau đó qua hệ thống chuyển đổi tín hiệu, đưa tín hiệu vào máy tính. Ở đó ta có thể xử lý số liệu và xuất dữ liệu ra được.
Hình 32. Hệ thống ghi nhận và xử lý số liệu 3. TIẾN TRÌNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ Do có nhiều thông số ảnh hưởng đến quá trình sắc ký nên có thể gây khó khăn cho người mới bắt đầu làm phân tích sắc kí khí với một đối tượng cụ thể nào đó. Trật tự tiến hành phép phân tích GC cần xem xét theo thứ tự sau: Xác định mục tiêu phân tích Chuẩn bị mẫu Chọn detector Chọn cột Chọn phương pháp bơm mẫu Chương trình hóa nhiệt độ và áp suất 3.1 Xác định mục tiêu phân tích -
Mục tiêu của phép phân tích là phân tích định tính hay định lượng?
-
Có cần phải thực hiện một phép tách phân giải cao một cấu tử hoặc chỉ cần một phép tách có độ phân giải đủ tốt cho một phần nào đó thôi trong sắc ký đồ? 61
-
Có cần hy sinh độ phân giải để rút ngắn thời gian phân tích?
-
Cần phân tích định lượng chỉ một cấu tử hoặc nhiều cấu tử trong mẫu và có cần độ chính xác cao không?
-
Chất phân tích hiện diện trong mẫu ở nồng độ thích hợp hoặc cần có những kỹ thuật đặc biệt (cô mẫu và một detector rất nhạy) cho phân tích siêu vết.
3.2 Chuẩn bị mẫu: Các mẫu trong thực tế rất phong phú và thường có thành phần phức tạp: -
Có mẫu có hàm lượng tương tự nhau nhưng cũng có mẫu bên cạnh cấu tử chính mẫu còn chứa một số cấu tử với hàm lượng vết.
-
Có mẫu có các cấu tử với nhiệt độ sôi khác nhau trong một khoảng rộng.
-
Mẫu có thể ở dạng dung dịch nhưng cũng có ở dạng khí hoặc dạng rắn.
-
Mẫu chứa nhiều cấu tử phân cực hoặc chứa nhiều cấu tử ít hoặc kém phân cực.
-
Làm sạch mẫu
Chìa khóa để có một quá trình sắc ký thành công cho một mẫu phức tạp là cần phải làm “sạch” nó trước khi giới thiệu nó vào cột. Các phương pháp như vi chiết pha rắn, chiết lỏng - lỏng, chiết rắn - lỏng, sự giải hấp nhiệt các các cấu tử dễ bay hơi và nhiều phương pháp mới khác giúp cô lập những cấu tử cần phân tích trong mẫu phức tạp từ những chất cản trở. Các phương pháp này giúp cô lập và làm giàu các cấu tử cần phân tích đến mức độ có thể dò tìm được. Nếu ta không làm “sạch” mẫu thì sắc ký đồ thu được sẽ chứa một rừng các peak kém phân giải và các cấu tử không bay hơi sẽ còn giữ trong cột và phá hủy các cột đắt tiền. 3.3 Chọn Detector Vấn đề đặt ra là cần biết mọi thông tin trong mẫu hay chỉ cần một detector chuyên biệt dò tìm một hoặc một nhóm các cấu tử đặc biệt nào đó trong mẫu. Detector được sử dụng rộng rải nhất là detector khối phổ nhưng đắt tiền. Detector ion hóa ngọn lửa cũng là loại được dùng phổ biến nhất nhưng nó chỉ đáp ứng tốt cho hợp chất chứa mạch cacbon dài hoặc các hydrocacbon. Loại này không nhạy như detector bắt electron hoặc detector huỳnh quang. Detector ion hóa ngọn lửa đòi hỏi mẫu phải chứa lớn hơn 10 ppm chất cần phân tích cho phân tích tiêm mẫu chia dòng. Detector dẫn nhiệt là cách phổ biến nhất để dò tìm các chất nhưng nó không đủ nhạy cho những cột mao quản mở có độ phân giải cao. Các detector nhạy cho phân tích siêu vết chỉ đáp ứng với một loại hợp chất nào đó thôi. Ví dụ detector bắt electron là loại đặc biệt cho các hợp chất chứa halogen, cacbonyl lien hợp, nitril, và hợp chất nitro. 62
Nếu chỉ cần biết những thông tin định tính để nhận diện các chất rửa giải, các detector khối phổ và hồng ngoại là những chọn lựa tốt. Detector hồng ngoại giống detector đo độ dẫn nhiệt thường không đủ nhạy cho những cột mao quản mở. 3.4 Chọn cột Những chọn lựa chính là pha tĩnh, đường kính cột và chiều dài cột. Chọn pha tĩnh theo nguyên tắc các chất có cấu tạo càng giống nhau thì tương tác tốt với nhau. Các pha tĩnh không phân cực được sử dụng nhiều. Pha tĩnh có độ phân cực trung bình được sử dụng hầu hết những phép tách mà pha tĩnh không phân cực không thể. Đối với những hợp chất phân cực cao thì một cột phân cực mạnh là cần thiết. Các đồng phân quang học và những hợp chất có cấu trúc hình học gần giống nhau đòi hỏi những pha tĩnh đặc biệt cho phép tách này. Giữa đường kính cột và bề dày của lớp phim có mối quan hệ trong việc ảnh hưởng đến độ phân giải. Độ phân giải cao nhất có thể đạt được bởi những cột hẹp nhất với pha tĩnh mỏng nhất.Sự kết hợp này làm giảm thiểu độ trở kháng đối với sự chuyển khối (số hạn C trong phương trình Van Deemter) trong cả hai pha tĩnh và pha động nhờ vậy làm giảm chiều cao đĩa lý thuyết. Các cột hẹp và lớp phim mỏng đặc biệt thích hợp cho việc tách các hỗn hợp của các chất có nhiệt độ sôi cao nên bị lưu giữ quá mạnh trên các cột có lớp phim mỏng. Các thời gian lưu ngắn cung cấp những phép phân tích nhanh. Tuy nhiên, các cột hẹp có lớp phim mỏng có dung lượng mẫu rất thấp, đòi hỏi những detector có độ nhạy cao (detecter ion hóa ngọn lửa có thể không tương thích), không lưu giữ tốt những hợp chất dễ bay hơi và có thể chịu những ảnh hưởng do những vị trí hoạt động trên bề mặt có thể bị lộ ra. Các cột cở hẹp có lớp phim dày cung cấp một thỏa hiệp tốt giữa độ phân giải và dung lượng mẫu.Chúng có thể được sử dụng với nhiều detector (nhưng thường không phải các detector đo độ dẫn điện hoặc hồng ngoại) và với những hợp chất dễ bay hơi. Các thời gian lưu giữ dài hơn so với cột có lớp phim mỏng. Các cột cở rộng và có lớp phim dày được đòi hỏi cho việc sử dụng các detector đo độ dẫn điện và hồng ngoại. Chúng có dung lượng mẫu cao và có thể xử lý các hợp chất dễ bay hơi nhưng cho độ phân giải thấp và thời gian lưu giữ lâu. Nếu một cột chuyên biệt đáp ứng với hầu hết những yêu cầu đặt ra nhưng không cung cấp đủ độ phân giải thì cột dài hơn cùng loại có thể được sử dụng. Chiều dài gấp đôi của cột làm tăng gấp đôi số đĩa lý thuyết và theo phương trình tính độ phân giải thì làm tăng độ phân giải lên √2 lần. Điều này không phải là cách tốt nhất để tăng độ phân giải bởi vì nó làm tăng gấp đôi thời gian lưu.
63
Việc sử dụng một cột hẹp hơn hoặc lớp pha tĩnh mỏng hơn sẽ làm tăng độ phân giải mà không kéo dài thời gian lưu giữ. Việc thay đổi pha tĩnh làm thay đổi hoàn toàn sự lưu giữ tương đối của những hợp chất khác nhau (α trong phương trình…) và có thể phân giải các cấu tử đang quan tâm. 3.5 Chọn phương pháp tiêm mẫu Cuối cùng là làm thế nào để tiêm mẫu? Chế độ tiêm mẫu chia dòng: Tốt nhất cho những mẫu phân tích có nồng độ cao hoặc phân tích khí, nhưng phân tích định lượng có thể có các cấu tử khó bay hơi bị mất trong suốt quá trình tiêm mẫu. Tiêm mẫu chia dòng cung cấp độ phân giải cao và có thể xử lý những mẫu bẩn nếu nhồi vào ống trong bộ tiêm mẫu một chất hấp phụ thích hợp. Các hợp chất không bền nhiệt có thể phân hủy trong suốt quá trình tiêm mẫu ở nhiệt độ cao. Chế độ tiêm mẫu không chia dòng thích hợp cho những dung dịch rất loãng. Nó cung cấp độ phân giải tốt nhưng trong phân tích định lượng có thể có các hợp chất kém bay hơi bị mất trong quá trình tiêm. Nó tốt hơn chế độ tiêm mẫu chia dòng đối với những hợp chất có độ bền nhiệt trung bình bởi vì nhiệt độ tiêm mẫu hạ thấp hơn. Tiêm mẫu không chia dòng giới thiệu mẫu vào cột chậm vì vậy bẫy dung môi và bẫy lạnh được đòi hỏi. Các mẫu chứa mỗi chất phân tích ít hơn 100 ppm có thể được phân tích trong những cột có chiều dày lớp phim < 1μm với chế độ tiêm mẫu không chia dòng. Những mẫu có mỗi chất phân tích từ 100-1000 ppm đòi hỏi lớp phim dày hơn 1μm. Tiêm mẫu trên cột (on-column injection): Tốt nhất cho phân tích định lượng và cho những hợp chất kém bền nhiệt. Nó là một kỹ thuật có độ phân giải thấp và không thể sử dụng cho những cột có đường kính nhỏ hơn 0.25 mm. Nó có thể xử lý những dung dịch đặc cũng như loãng. 3.6 Chương trình hóa nhiệt độ và áp suất 3.6.1 Những thuận lợi của chương trình hóa nhiệt độ cột Cột sắc ký hoạt động ở nhiệt độ không đổi có một số điểm bất lợi: Nếu nhiệt độ được chọn quá thấp, những peak hòa tan đầu tiên sẽ có khoảng cách rất gần nhau, trong khi đó các cấu tử bị lưu giữ mạnh sẽ có các pic bị doãng rộng và nằm thấp. Ngoài ra nếu nhiệt độ cột hơi thấp thì thời gian phân tích sẽ tăng theo cấp số nhân. Khi phân tích hỗn hợp gồm các cấu tử có nhiệt độ sôi khác nhau nằm trong một khoảng hẹp thì việc chọn nhiệt độ cho cột ở chế độ không đổi không thực sự khó khăn. Tuy nhiên, đối với những mẫu phức tạp nhiều cấu tử có khoảng nhiệt độ sôi rộng thì không thể dùng chế độ nhiệt độ cột không đổi. 64
Nếu chọn nhiệt độ thích hợp cho các cấu tử có điểm sôi thấp thì các cấu tử có điểm sôi cao sẽ bị lưu giữ lâu trong cột tách dẫn đến pic của chúng bị doãng rộng. Ngược lại nếu thực hiện việc tách ở nhiệt độ cao thì các cấu tử có điểm sôi cao sẽ rửa giải nhanh và có độ phân giải tốt, nhưng các cấu tử có điểm sôi thấp thì bị tách chậm và có độ phân giải kém, thậm chí nhiều pic bị chập lên nhau. Những cấu tử lưu giữ mạnh có thể được nhanh chóng rửa giải nếu chọn nhiệt độ cao hơn và cũng cải thiện khả năng dò tìm chúng. Tuy nhiên, nếu làm như vậy thì các cấu tử cùng bị rửa giải tăng lên dẫn đến các pic cũng sít gần nhau và sẽ làm mất độ phân giải cho các peak ở đầu sắc ký đồ. Trở ngại này có thể được giải quyết trong GC bằng chương trình hóa nhiệt độ, ở đây nhiệt độ của cột trong lò được tăng dần tại một tốc độ tuyến tính suốt quá trình phân tích. Chương trình hóa nhiệt độ có một vài ưu điểm: Nó làm giảm thời gian tiến hành phân tích và cải thiện khả năng dò tìm của các cấu tử (peak sẽ nhọn hơn và có các dải cách đều nhau trong cả sắc ký đồ).Trong trường hợp các mẫu không biết thành phần hoặc mẫu phức tạp, những cấu tử có nhiệt độ sôi cao nếu ở điều kiện đẳng nhiệt có thể không rửa giải được hoặc không thể dò tìm, thì có thể thể hiện một thời gian lưu giữ thích hợp hơn. Chương trình hóa nhiệt độ cũng có thể giúp rửa sạch một cột bị nhiễm bẩn các cấu tử có nhiệt độ sôi cao trong những lần tiêm trước. Chương trình hóa nhiệt độ thường thiết lập nhiệt độ cho cột tách tương ứng với nhiệt độ của cấu tử có nhiệt độ sôi thấp nhất, thích hợp là dưới 90oC. Sau đó nhiệt độ được nâng lên theo tốc độ chọn trước cho đến nhiệt độ cuối cùng tương ứng với nhiệt độ của cấu tử có điểm sôi cao nhất. Khi nhiệt độ của cột tăng lên thì các cấu tử sẽ lần lượt tách khỏi cột vào thời điểm nhiệt độ của cột đạt đến nhiệt độ sôi của từng cấu tử. Có ba kiểu chương trình hóa nhiệt độ được sử dụng trong sắc ký khí: kiểu đường đạn (ballistic), kiểu tuyến tính và kiểu đa tuyến tính.
Chương trình kiểu đạn đạo diễn ra khi một lò (oven) được duy trì tại một nhiệt độ đà nhanh chóng thay đổi đến một nhiệt độ cao hơn (đường A), và thỉnh thoảng được sử dụng cho việc điều kiện hóa cột sắc ký khí rắn sau khi nó được sử dụng trong một thời gian dài. Tuy nhiên, một cột sắc ký được duy trì ở tại nhiệt độ cao sau đó nhanh chóng nâng nhiệt độ lên cao thì lớp phim pha tĩnh có thể bị phá hủy do bị sốc nhiệt. 65
Chương trình hóa nhiệt độ được sử dụng rộng rải nhất là kiểu tuyến tính (đường B). Bắt đầu từ nhiệt độ thấp và được duy trì đẳng nhiệt trong một khoảng thời gian nào đó, sau đó nhiệt độ trong lò chứa cột được tăng với một tốc độ tuyến tính đến một nhiệt độ cuối cùng được chọn sẵn. Nhiệt độ cuối cùng này cũng được duy trì trong một khoảng thời gian cụ thể nào đó. Nhiệt độ ban đầu và tốc độ tăng tuyến tính sau đó được xác định từ một phép phân tích thăm dò trước đó với ghi chú những nhiệt độ rửa giải. Sự chọn lựa những điều kiện ban đầu thích hợp sẽ cho phép việc tách những chất có nhiệt độ sôi thấp, trong khi đó nhiệt độ cuối cùng được chọn nên đủ lớn để rửa giải được nhiều hơn những cấu tử bị lưu giữ mạnh (lưu ý giới hạn nhiệt độ cao nhất của pha tĩnh). Kiểu đa tuyến tính được thực hiện trong một vài trường hợp để dò tìm hoặc tăng cường độ phân giải trong một phép tách, nhưng được sử dụng thông dụng hơn trong việc kết hợp với tiêm mẫu trên cột. Trong chương trình hóa nhiệt độ, nhiệt độ của một cột được tăng suốt quá trình tách để tăng áp suất hơi của chất hòa tan và nhờ đó giảm thời gian lưu của những cấu tử bị rửa giải chậm. Một ví dụ được trình bày trong hình 6. Tại nhiệt độ hằng định 150 oC, các hợp chất dễ bay hơi hơn xuất hiện gần nhau và các hợp chất ít bay hơi có thể thậm chí khôngbị rửa giải từ cột. Nếu nhiệt độ được cho tăng từ 50 oC đến 250 oC với tốc độ tăng 8oC/phút, tất cả các cấu tử được rửa giải và các peak xuất hiện khá đều. Cần tránh tăng nhiệt độ lên quá cao để ngăn sự phân hủy nhiệt của chất phân tích và pha tĩnh. Hiện nay, các máy sắc ký phần lớn đều được trang bị các bộ điện tử kiểm soát áp suất có thể chương trình hóa của các khí mang đi vào cột. Sự tăng áp suất vào cột làm tăng tốc độ pha động và nhờ vậy làm giảm thời gian lưu.
(a) tách đẳng nhiệt của các ankan tương tự ở 150oC. Cột 3% Apiezon-L on 100– 120 mesh VarAport 30. Khí mang helium ở 10 ml min–1. 66
(b) Mẫu và cột như (a) nhưng nhiệt độ tách được chương trình hóa cho thấy độ phân giải cao hơn và thời gian ngắn hơn. 4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BẰNG GC Áp dụng đối với các mẫu bốc hơi và ổn định nhiệt đến vài trăm °C Có khả năng phát hiện và phân tích rất nhiều chất và hỗn hợp Được ứng dụng rộng rãi để tách và xác định các cấu tử trong các mẫu từ nhiều chủng loại khác nhau Sắc ký khí kết hợp khối phổ 4.1 Phân tích định tính Trong phân tích định tính, hai detector có thể nhận diện các hợp chất là detector khối phổ và detector hồng ngoại chuyển hóa Fourier. Một peak có thể nhận diện bằng cách so sánh phổ của chúng với một thư viện phổ được lưu giữ trong máy tính. Một phương pháp kém tinh tế hơn là nhận diện thời gian lưu của một chất với thời gian lưu của chất đó trong một mẫu đã biết trước (mẫu chuẩn) trên các cột có độ phân cực khác nhau. Cách đáng tin cậy nhất là so sánh các thời gian lưu trong cùng một sắc kí đồ thu được bởi mẫu đã biết trước (mẫu chuẩn) được thêm mẫu cần dò tìm vào trong cùng một điều kiện sắc kí. Nếu như chất cần dò tìm trùng với chất có trong mẫu chuẩn thì pic của chất đó trong mẫu đã thêm sẽ có diện tích hay chiều cao tăng lên so với khi chưa thêm chất chưa biết vào. Sự nhận diện chỉ ở mức thăm dò khi thực hiện trên một cột, nhưng khẳng định hơn khi thực hiện trên một vài cột trên những loại pha tĩnh khác nhau. Trong hình cho thấy có thể nhận diện được các đỉnh 2,3,4,7 và 9 là metyl, etyl, npropyl, n-butyl, và n-amyl alcol. Cần chú rằng có thể có những chất khác nhau nhưng có thời gian lưu giống hoặc rất gần nhau. Vì vậy cần xác định trên nhiều pha tĩnh khác nhau hoặc sử dụng các detector khối phổ hoặc hồng ngoại để xác định.
Hình. Phân tích định tính bằng cách so sánh thời gian lưu với chất chuẩn 4.2 Phân tích định lượng 67
4.2.1 Một số nguyên nhân gây ra sai số Chuẩn bị mẫu: cũng như mọi phương pháp khác, mẫu đem phân tích được lấy mẫu sao đại diện đúng cho cả lô nguyên liệu hay sản phẩm. Các qui tắc lấy mẫu cần phải tuân thủ cho từng loại mẫu. Mẫu cần được làm sạch trước khi tiêm mẫu vào GC. Việc này nếu làm không tốt có thể gây nên mất cấu tử cần xác định. Tiêm mẫu: khi chất lỏng tiêm vào buồng tiêm mẫu thì nhiệt độ thiết lập nếu quá cao có thể gây nên sự phân hủy mẫu, hoặc mẫu có tham dự vào một phản ứng nào đó. Kỹ thuật tiêm mẫu cũng có thể gây sai số. Mẫu bị phân hủy hoặc bị hấp phụ: có nhiều trường hợp có sự phân hủy hoặc hấp phụ trong buồng tiêm mẫu, trong cột, trong detector có thể làm cho các pic đó không đại diện cho lượng của chúng có trong mẫu. Để khắc phục điều này ta nên dùng phương pháp lập đường chuẩn để biết diện tích hay chiều cao của pic có tỉ lệ tuyến tính với lượng mẫu đưa vào hay không. Đáp ứng của detector: mỗi detector đáp ứng khác nhau với các hợp chất khác nhau. Vì vậy cần biết rõ các hệ số đáp ứng này. Hơn nữa khi điều kiện làm việc thay đổi thì đáp ứng của detector cũng thay đổi. Trong GC có thể sử dụng phương pháp chuẩn nội để khắc phục điều này. Kỹ thuật lấy tích phân: trong GC có nhiều cách thiết lập quan hệ giữa thông tin nhận được từ pic sắc kí với hàm lượng của cấu tử: Đo chiều cao pic, dùng máy ghi và tích phân, cắt và cân giấy. Các cách này có thể có những sai số riêng trong quá trình xử lí. Ngày nay với sự ghép nối máy tính và các phần mềm hỗ trợ việc tích phân hóa diện tích các peak trở nên dễ dàng và thông dụng. Kết quả được báo cáo đầy đủ các thông tin của peak như chiều cao, diện tích, phần trăm trong mẫu … 4.2.2 Các phương pháp tính toán định lượng 4.2.2.1 Phương pháp chuẩn hóa diện tích Đây là phương pháp tính thành phần phần trăm của mẫu bằng cách đo diện tích từng peak trên sắc kí đồ. Theo cách này đem diện tích pic của chất quan tâm A cho tổng diện tích của các peak: %A = (diện tích peak A/tổng diện tích các peak)x100 % Khi phân tích thành phần có điểm sôi sát nhau của một dãy đồng đẳng, phương pháp này có thể dùng để tính tỷ lệ phần trăm khối lượng. Phương pháp này chỉ đúng nếu tất cả các cấu tử đều được rửa giải và đáp ứng của detector với mọi cấu tử là giống nhau. Nếu những điều kiện này thõa mãn thì đây là phương pháp nhanh và hiệu quả. 4.2.2.2. Phương pháp tính theo hệ số hiệu chỉnh Như đã biết detector đáp ứng khác nhau đối với các chất khác nhau. Vì vậy cần phải tính hệ số hiệu chỉnh. Nhờ hệ số này có thể tính được thành phần phần trăm của các cấu tử trong mẫu. 68
Cách xác định hệ số hiệu chỉnh: -
Tiêm dung dịch chuẩn đã biết nồng độ các cấu tử A, B, C… vào GC
-
Sắc kí đồ thu được có các pic phân giải hoàn toàn và diện tích thu được tương ứng
-
SA, SB, SC… tương ứng với các khối lượng trong mẫu mA, mB, mC…
-
Chọn một pic làm chuẩn ví dụ A có tỉ lệ SA/mA được gán giá trị FA = 1
-
Từ tỉ lệ SB/mB, SC/mC… suy ra FB, FC… 4.2.2.3. Phương pháp lập đường chuẩn:
Lập các đường chuẩn riêng rẽ đối với từng cấu tử trong hỗn hợp bằng cách tiêm những thể tích bằng nhau của một loạt dung dịch hỗn hợp chất chuẩn có nồng độ khác nhau. Như vậy một loạt các nồng độ của các chất chuẩn đã được phân tích và diện tích của chúng được xác định. Một đường chuẩn được dựng cho mỗi cấu tử với một trục nồng độ và trục kia là diện tích tương ứng để kiểm tra sự tuyến tính của đáp ứng của detector. Tiêm cùng thể tích của mẫu có các cấu tử cần phân tích và chạy sắc kí trong cùng điều kiện như khi chạy chuẩn. Từ các diện tích thu được của các cấu tử cần phân tích và đường chuẩn vừa thiết lập suy ra được nồng độ của chúng. 4.2.2.4. Phương pháp dùng chuẩn nội Phương pháp này còn được gọi là phương pháp chuẩn hóa tương đối hay gián tiếp. Để định lượng một cấu tử X ta cần phải chọn một chất chuẩn S sao cho: -
Nếu trộn lẫn X với S ta phải thu được 2 đỉnh riêng biệt trên sắc kí đồ.
-
Peak của X và S phải khá gần nhau.
Sau đó ta phải pha các hỗn hợp có tỷ lệ trọng lượng của X và S biết trước, chạy sắc kí, đo diện tích các peak, lập tỉ số diện tích tương ứng, cuối cùng lập đường chuẩn tương đối.
Sc/Ss là tỉ lệ diện tích của các cặp cấu tử cần xác định X và chất chuẩn nội 69
Wc/Ws là tỉ lệ trọng lượng của các cặp cấu tử cần xác định X và chất chuẩn nội Khi phân tích mẫu thật, ta cho một lượng biết trước chất chuẩn nội S vào mẫu rồi tiến hành sắc kí hỗn hợp. Từ tỉ lệ diện tích đo được, bằng đường chuẩn tương đối vừa dựng ta có tỉ lệ trọng lượng. Với trọng lượng chuẩn S thêm vào đã biết ta tính được trọng lượng của chất X. Phương pháp này có các ưu điểm: -
Không cần biết đến đáp ứng của detector
-
Không cần duy trì nghiêm ngặt các điều kiện tiến hành sắc kí vì những thay đổi được loại trừ theo cách tính tỷ số.
5. ỨNG DỤNG CỦA GC Cùng với sự phát triển của kỹ thuật sắc ký, sắc ký khí là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu khoa học đặc biệt trong lĩnh vực hóa học phân tích. Phương pháp sắc ký khí là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến trong việc phân tích các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi trong các loại nền mẫu. Một vài ví dụ: Ketones: polydiméthyl siloxane Alkaloïdes: 5% phenyl polydimethyl siloxane Steroïds: 50% phenyl polydimethyl siloxane Chlorinated Aromatics: 50% Trifluoropropyl polydimethyl siloxane Alcohols: Polyethylenglycol Esters: 50% Cyanopropyl polydimethyl siloxane 5.1 Ứng dụng của GC tại CASE Tại CASE, các hệ thống sắc ký khí của các hãng sản xuất thiết bị phân tích nổi tiếng như Shimadzu (GC 2010, GC 2010 Plus), Perkin Elmer, Varian (3800), Thermo Finnigan (Trace GC),… với các đầu dò như FID, ECD, NPD, FPD, TCD, MS có khả năng phân tích được các hợp chất hữu cơ có bản chất khác nhau. Các hệ thống GC đều có gắn các bộ phận chích mẫu tự động (Autosampler) và bộ phận hóa hơi (Headspace). Các hệ thống sắc ký khí với tất cả các loại đầu dò, CASE có thể phân tích được hầu hết các hợp chất thuốc trừ sâu họ Chlor (Aldrin, Eldrin,…), họ Phospho (Chlorpyriphos, Diazinon,…) họ Cúc (Cypermethrin, Deltamethrin,…), các loại thuốc diệt cỏ, diệt nấm trong các nền mẫu nông sản, thực phẩm, thủy hải sản, môi trường… phục vụ công tác an toàn vệ sinh cho các loại hàng hóa lưu thông trong nước và xuất khẩu. Phân tích các chỉ tiêu trong nước theo quy chuẩn của Bộ Y tế (QCVN 01:2009/BYT) và các quy chuẩn khác. 70
Phân tích dư lượng PCBs, PAHs, trong các nền mẫu thực phẩm, môi trường, nước,… theo yêu cầu của các cơ quan quản lý trong và ngoài nước. Phân tích các hóa chất POPs (Persistent Organic Pollutants) trong môi trường, thực phẩm,… Phân tích hơn 20 amino acid trong thực phẩm, phân bón, chế phẩm sinh học,… Phân tích mẫu bệnh phẩm, mẫu ngộ độc: Methanol, Trichloroacetic, Benzen, Toluen,… trong máu, nước tiểu. Phân tích BTX (Benzen – Toluen – Xylen) và một số hợp chất bay hơi khác trong không khí. Phân tích các hoạt chất, hương liệu trong dược phẩm,… theo các dược điển Anh (BP), Mỹ (USP), Nhật (JP), Châu Âu (EP), Việt Nam,… Phân tích thành phần acid béo, cholesterol, và các thành phần khác theo yêu cầu trong bảng giá trị dinh dưỡng (Nutrition Fact)… 5.2 Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ đầu dò Ion Trap(CASE) Hệ thống GCMS Thermo Polaris Q được kết hợp giữa máy sắc ký khí Ultra Trace GC và đầu dò khối phổ bẫy ion Polaris Q với hệ bộ phận bơm mẫu CompiPAL có khả năng phân tích nhận danh và định lượng nhiều loại hợp chất hữu cơ trong các nền mẫu khác nhau. 5.2.1. Nguyên tắc hoạt động hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GCMS – Gas Chromatography Mass Spectrometry) Tương tự như các hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ cũng bao gồm các bộ phận: nguồn cung cấp khí, lò cột, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dò, bộ phận ghi nhận tín hiệu, và bộ phận in dữ liệu phân tích; trong đó, đầu dò là đầu dò khối phổ.
71
Hình 33. Sơ đồ cấu tạo đầu dò khối phổ Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ. Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau (API, ESI hay APPI), sau đó các ion được ghi nhận bởi đầu dò 5.2.2. Cấu tạo đầu dò khối phổ đầu dò bẫy ion (Ion trap) Hệ thống GCMS Thermo Polaris Q bao gồm bơm chân không, bô bơm mẫu tự động (CompiPAL), máy sắc ký khí Trace GC Ultra, đầu dò khối phổ bẫy ion Polaris Q. Đầu dò Polaris Q gồm có bốn bộ phận chính như sau: Nguồn ion hóa tại áp suất khí quyển (API). Hệ quang học ion (ion optics). Bộ phân tích khối (mass analyzer). Hệ thống phát hiện ion (ion detection system)
72
Hình 34. Cấu tạo đầu dò khối phổ bẫy ion 5.2.3. Ứng dụng hệ thống Thermo Polaris Q -
Phân tích dư lượng PCBs, PAHs, trong các nền mẫu thực phẩm, môi trường, nước, … theo yêu cầu của các cơ quan quản lý trong và ngoài nước.
-
Phân tích các hóa chất POPs (Persistent Organic Pollutants) trong môi trường, thực phẩm,…
-
Phân tích các dư lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm, thủy hải sản như Trifluralin, Chlorpyrifos,… với khả năng phát hiện đáp ứng yêu cầu khắt khe của các nước Nhật, châu Âu,…
-
Phân tích các độc chất trong thực phẩm (3-MCPD, Histamin, Urea,…)
-
Phân tích các hormone tăng trưởng trong các nền mẫu thịt, thức ăn chăn nuôi như học beta-agonist (Clenbuterol và Salbutamol), Testosterol, DES,… hỗ trợ các cơ quan chức năng trong công tác kiểm soát chất lượng và bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm của các sản phẩm lưu hành trên thị trường.
Hình 35. Hệ thống GCMS Ion trap Thermo Polaris Q -
Phân tích các chất thuộc nhóm Phthalate (đặc biệt là DEHP) trong các nền mẫu thực phẩm, thôi nhiễm từ bao bì,… theo yêu cầu của Bộ Y tế và các cơ quan quản lý khác. 73
-
Phân tích Glyphosate trong các sản phẩm gạo trong việc kiểm soát chất lượng nông sản xuất khẩu sang châu Âu.
-
Phân tích các chất thuộc nhóm Nitroimidazole, thuốc diệt nấm (Propiconazole, Hexaconazole, Difenconazole) trong thủy sản, trái cây và các loại rau quả.
-
Phân tích 22 hợp chất amin thơm sinh ra do từ thuốc nhộm azo trong sản phẩm dệt may theo quy định của Bộ Công thương (QCVN 01:2010/BCT).
-
Phân tích nhận danh, định tính các tinh dầu và các hợp chất hữu cơ khác. …
5.3 Máy sắc ký khí ghép khối phổ với độ phân giải cao (HRGC/HRMS)-CASE CASE là một trong những phòng thí nghiệm đầu tiên trong cả nước được trang bị máy sắc ký khí ghép khối phổ độ phân giải cao (HRGC-HRMS) chuyên phân tích DIOXIN. Từ 1993, trong khuôn khổ chương trình hợp tác khoa học kỹ thuật Việt Nam – Pháp, trung tâm đã được phía Pháp viện trợ thiết bị HRGC-HRMS VG 70VSE của hãng MICROMASS (Anh). Máy có thể phân tích được hàm lượng siêu vết Dioxin phù hợp với tiêu chuẩn EPA 1613 của Mỹ ở độ phân giải 10.000, giới hạn phát hiện ở mức 0,5ppt . Đồng thời Pháp cũng hỗ trợ đào tạo chuyên viên về kỹ thuật phân tích và xử lý mẫu Dioxin tại Trung tâm phân tích Soleize-Lyon-Pháp và một kỹ sư điện tử chuyên về bảo trì và sửa chữa thiết bị. Điều đó đã giúp cho CASE có thể phân tích được Dioxin ngay từ những năm 1995.
Hình 36. Máy HRGC/HRMS Năm 2004, trước yêu cầu phải phân tích được cả 17 đồng phân PCDDs/PCDFs theo quy định của WHO, Trung tâm Dịch vụ Phân tích và Thí nghiệm được Ủy Ban Nhân Dân TP HCM đầu tư 6,7 tỷ đồng để trang bị một thiết bị mới: máy HRGCHRMS AutoSpec Ultima NT của tập đòan WATERS - Mỹ, thay cho thiết bị cũ nói trên đã xuống cấp. Đây là dòng máy thuộc thế hệ mới nhất của hãng WATERS, với hệ thống Autosampler GC PAL 98 vị trí. Chương trình hòan tòan tự động từ khâu tiêm mẫu đến tính tóan định lượng. Máy có thể đạt đến độ phân giải 80.000, định lượng được đồng 74
thời 17 đồng phân PCDDs / PCDFs trong mẫu vật ở mức giới hạn phát hiện 0,01ppt. Tất cả thao tác vận hành đều được kiểm soát bằng hệ thống máy tính với phần mềm Masslynx & Quanlynx. Hệ thống SIOS thu thập xử lý dữ liệu và kiểm sóat khối phổ được thực hiện thông qua máy IBM cực mạnh. Máy còn có chức năng tự động kiểm tra độ phân giải sau mỗi 12 giờ và tự động dừng phân tích nếu phát hiện độ phân giải giảm thấp hơn giới hạn cho phép. Trung tâm đã xây dựng được các quy trình phân tích Dioxin và Furan trên nhiều lĩnh vực về môi trường : đất, bùn trầm tích, nước sông ngòi, nước ngầm…; về thủy hải sản : tôm, cá, mực…; về nông sản thực phẩm : gạo, đậu, cà phê, sữa…đặc biệt là quy trình phân tích định lượng Dioxin trong mẫu bệnh phẩm : mô mỡ, huyết thanh, gan… Các quy trình này đã được tổ chức VILAS công nhận. 5.4 Xác định hàm lượng Diethylene Glycol, Ethylene Glycol có trong kem đánh răng bằng phương pháp GC-MS 5.4.1 Mở Đầu a/ Mục đích Phương pháp này được phát triển tại Trung tâm hóa học pháp lý (FCC) để kiểm tra kem đánh răng có chứa diethylene glycol (và một chất liên quan có độc tính tương tự, ethylene glycol) ở mức 1 mg/g (0.1% trọng lượng) và ở trên. b/ Mục tiêu Sử dụng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS). c/ Phạm vi Phương pháp này đã cho thấy rằng có khả năng phát hiện ra cả các phân tích ở mức 0.5 mg/g ở nhiều nhãn hiệu khác nhau của kem đánh răng. 5.4.2 Nội Dung tiến hành a/ Thiết bị và trợ cấp - Hệ thống Agilent 5975i GC-MS trang bị với 30 m Stabilwax (crossbond Carbowax) cột mao quản (hoặc tương đương) hay hệ thống phổ khối khác. - Máy ly tâm phòng thí nghiệm có khả năng áp dụng 5000 g với các ống ly tâm cỡ 15 mL. - Ống ly tâm polypropylene 15 mL có nắp vít. b/ Tác chất và chất chuẩn - Dung môi chiết: nước rồi đến acetonitrile - 1,3-Propanediol + Dùng như chất chuẩn trong nước. Điều chế một dung dịch có sẵn nồng độ 5.0 mg/mL trong 50% dung dịch nước với acetonitrile. 75
+ Thêm 0.050 mL dung dịch này vào 0.500 mL của mỗi mẫu chiết trong lọ autosampler trước khi phân tích. - Diethylene Glycol Điều chế dung dịch có sẵn 10.0 mg/mL trong 50% dung dịch nước với acetonitrile. - Ethylene Glycol Điều chế dung dịch có sẵn 10.0 mg/mL trong 50% dung dịch nước với acetonitrile. - Dung dịch hỗn hợp các chất chuẩn Pha trộn các chuẩn có sẵn với lượng bằng nhau. c/ Các yếu tố kiểm tra định lượng Một mẫu trắng gồm 10 mL dung dịch chiết được lấy thông qua toàn bộ quy trình kể cả việc thêm các chất chuẩn nội phải được ước lượng để bảo đảm rằng không nhiễm các tác chất hoặc từ những vật chứa. Điều kiện để hệ thống ở bước đầu của mỗi bộ mẫu bằng cách tiến hành hai mẫu tiêm với chuẩn cao. Một chuẩn thấp, có chứa mỗi chất phân tích ở mức 0.10 mg/mL, nên phải phân tích từ mẫu đầu tiên đến mẫu cuối cùng, thiết lập để thấy rằng độ nhạy cần thiết đạt tới của phương tiện. Một chuẩn cao ở mức 0.50 mg/mL mỗi chất phân tích được phân tích từ mẫu đầu đến cuối, thiết lập để cung cấp một cơ sở cho việc đánh giá bán định lượng và theo dõi lượng lắng suốt quá trình phân tích thiết lập các mẫu. Một mẫu kiểm tra được làm giàu gồm có một đại diện cho các loại mẫu đang được phân tích va nó đã được làm giàu thêm mỗi chất phân tích (tức là Diethylene glycol và ethylene glycol) ở mức 1 mg/g (hoặc 0.1 % trọng lượng). Phép phân tích mẫu này phải thể hiện rằng các chất có hiện diện. Phép phân tích này để minh chứng hiệu năng hệ thống có hiệu quả ở mức độ đề ra. d/ Quy trình - Chuẩn bị mẫu. Cân khoảng 1.0 g kem đánh răng cho vào ống ly tâm polypropylene 15-mL. Thêm 5 mL nước. Trộn đều để phân tán hoàn toàn toàn bộ mẫu. Sử dụng máy trộn xoáy (ví dụ Genie 2, Fisher Scientific) có thể hỗ trợ quá trình này. Bọt có thể được tạo thành. Sau đó thêm 5 mL acetonitrile trong hai phần chia với sự khuấy cẩn thận giữa mỗi lần thêm. Acetonitrile sẽ ngăn chặn sự tạo bọt. Ly tâm trong 10 phút ở 5000 g (xấp xỉ 6200 vòng/ phút) hoặc cao hơn. 76
Chuyển 0.50 mL của phần nổi mặt trên vào lọ nhỏ autosampler. Thêm 0.050 mL chuẩn nội (tức là 1,3-propanediol ở mức 5.0 mg/mL). Đem phân tích. - Các tham số công cụ Quy trình này đề nghị rằng GC được vận hành ở chế độ chia (20:1) để cải tiến hình dạng peak và giảm sự lặp các thành phần của mẫu trên hệ thống ghi phổ sắc. Các thông số kỹ thuật khi chuẩn bị máy GC Các điều kiện của GC Cột
Restek Stabilwax (30 m X 0.25 mm id X 0.25 µm df) with a 5 m retention gap (or equivalent)
Nhiệt độ vào
250 °C
Nhiệt chuyển dòng
250 °C
Chế độ tiêm
Chia dòng ‘split’ (20:1)
Lượng tiêm
1 µL
Dòng khí mang
He ở mức 35 cm/giây (cố định dòng)
Chương trình nhiệt
100°C (1 phút) đến 250°C ở mức 10°C/phút (giữ 4.00 phút) trong tổng thời gian chạy là 20 phút.
Sử dụng 50% dung dịch nước với acetonitrile ở các lọ rửa để làm sạch ống tiêm giữa các lần tiêm. Điều này loại bỏ phần còn lại của mẫu mà không tan trong các dung môi rửa khác. Điều này sẽ làm giảm các sai số khi tiêm mẫu. Lưu ý: Sự thay đổi tới chương trình nhiệt của GC có thể được dùng để khắc phục các hiện tượng nhiễu. Bổ sung đáng kể độ phân giải có thể đạt được bằng cách giảm độ dốc nhiệt độ trên các phần chia thích hợp của sắc phổ. Điều này sẽ thay đổi thời gian lưu cho các chất phân tích và chúng có thể cần được tái thiết lập. Các thông số kỹ thuật khi chuẩn bị chế độ MS Các điều kiện của MS (Chế độ scan đầy đủ) Điều chỉnh
Điều chỉnh tự động phổ chuẩn
Vùng scan
29 - 400 amu
Tốc độ mẫu
2 (tốc độ scan khoảng 4 scans/giây)
Ngưỡng
100
Sự trì hoãn dung môi
4 phút 77
230 °C (nguồn); 150 °C (Quad)
Nhiệt độ của MS
Các điều kiện của MS (SIM Mode) Điều này được cung cấp chủ yếu đối thông tin chỉ vì không chắc rằng SIM sẽ cần dược sử dụng. Có rất nhiều sự nhiễu có tiềm tàng với những ion khối lượng thấp. Những ion khối lượng cao hơn thì hữu ích hơn mặc dù, nói chung, sự nhạy cảm là tương đối thấp. Không có ion phân tử được quan sát đối với 1,2-propanediol, 1,3-propanediol, diethylene glycol hay glycerin. Selected Ions b
Start Time a (min)
Group
1
2
3
4
1,2-Propanediol
4.0
31 (11) c
43 (15)
45 (100)
61 (5)
Ethylene Glycol
6.6
31 (100)
33 (35)
43 (8)
62 (M) d (4)
1,3-Propanediol
7.5
31 (100)
43 (22)
57 (73)
58 (68)
Diethylene Glycol
9.0
31 (11)
45 (100)
75 (24)
76 (12)
Glycerin
12.0
31 (40)
43 (78)
60 (13)
61 (100)
a
Start Times có thể cần được điều chỉnh dựa trên thời gian lưu các chuẩn ở hệ thống. Dwell times có thể được điều chỉnh để đưa ra một thời gian vòng khoảng 4 scans/giây c Phần trăm sự dồi dào tương đối với sự chú ý tới sự phong phú cao nhất của ion. d M là ion phân tử. b
- Sự nhận ra peak: Thời gian lưu gần đúng của phép phân tích: Chất
Chú giải
Thời gian lưu (min)
1,2-Propanediol
6.4
Ethylene Glycol
6.8
1,3-Propanediol
8.4
Đây là một chất có quan hệ.
Chất chuẩn nội 78
Diethylene Glycol
10.4
Glycerin
13.7
Chất có thường thấy trong kem đánh răng.
Các điều này cần được xác thực trên hệ thống.
Hình 37.Sắc phổ đồ chuẩn biểu diễn phép phân tích được đề cập ở trên. - Làm giàu mẫu và điều chế hỗn hợp mẫu chuẩn. Một dung dịch hỗn hợp chuẩn cuối cùng được điều chế bằng cách trộn những phần bằng nhau của hai dung dịch chuẩn có sẵn để tạo thành một dung dịch 5.0 mg/mL ở mỗi phân tích. Sự điều chế chấm dứt (spike): Cân một phần 1.0 g kem đánh răng vào ống ly tâm 15-mL. Một phân tích trước đó, mẫu đại diện của sản phẩm được tìm thấy là nhiễm với các chất cần xác định có thể được sử dụng. Cách khác, chọn một trong các mẫu mà sắp phân tích và chấm dứt một phần chia của nó. Việc này sẽ phải được lặp lại với một mẫu khác nếu nó chỉ ra rằng việc phân tích mẫu này mà không làm giàu mẫu cung cấp cho chứng cứ của sự nhiễm. Thêm trực tiếp 200 µL dung dịch hỗn hợp chuẩn cuối cùng vào mẫu đại diện không bị nhiễm và tiến hành với phương pháp này. Kết thúc phải được quan sát để cung cấp một cơ sở cho việc trình bày rằng các mẫu cung cấp các tín hiệu dưới đây một ngưỡng nhất định có chứa ít hơn 1.0 mg/g của mỗi mục tiêu. Chuẩn cao: Pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn cuối cùng 0.5 mg/mL với 50% dung dịch nước và acetonitrile. Đặt 500 µL dung dịch này trong lọ nhỏ và thêm 50 µL dung dịch chuẩn nội. 79
Chuẩn thấp: Pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn cuối cùng 0.10 mg/mL. Đặt 500 µL dung dịch này trong lọ nhỏ và thêm 50 µL dung dịch chuẩn nội. Chọn một ion để dùng ước tính hàm lượng chất cần phân tích (chẳng hạn, m/z = 75 đối với diethylene glycol và m/z = 62 đối với ethylene glycol). Việc sử dụng chuẩn cao (0.50 mg/mL) mà chạy trên bộ mẫu ban đầu và chuẩn cao mà chạy trên bộ mẫu cuối, tính toán diện tích peak trung bình của ion được chọn. Áp dụng công thức sau: Nồng độ trong mẫu chiết (µg/mL) = [Diện tích (mẫu kiểm tra) / diện tích trung bình (mẫu chuẩn cao)]x 0.50mg/mL. Sau đó, Nồng độ trong mẫu (µg/g) = Nồng độ trong mẫu chiết (mg/mL) x 10.0 mL x [1 / trọng lượng mẫu (g)] Nồng độ trong mẫu (% trọng lượng) = Nồng độ trong mẫu (mg/g) x 1/10 Nếu diện tích peak mẫu chuẩn nội khác hơn 20% giữa mẫu kiển tra và mẫu chuẩn sau có điều chỉnh diện tích mỗi sự đáp trả phân tích bằng cách chia theo diện tích hợp nhất của chuẩn nội (sử dụng ion ở mức 58 amu). Sử dụng tỷ số này thay cho các vùng tổng hợp ở trên. Xem như phân tích lại nếu sự khác nhau là vô cùng lớn từ đó có thể cho biết ống tiêm bị tắt một phần hay vấn đề thuộc về công cụ khác. Cuối cùng, nếu tín hiệu từ các ion mẫu nhiều hơn 10 lần tín hiệu lớn hơn từ chuẩn cao, sau đó pha loãng phần chiết thêm để đưa nồng độ chất cần phân tích vào vùng của chuẩn cao. 5.4.3 Kết Luận Trong trường hợp các phân tích đã được quan sát trong mẫu kiểm tra đại diện đã được làm giàu ở mức 1,0 mg/g và không có tín hiệu phân tích đã được quan sát trong các mẫu ở mức độ đó mà đã được quan sát trong việc kiểm tra làm giàu mẫu, sau đó các mẫu không bị nhiễm với ethylene glycol hoặc diethylene glycol ở mức vượt quá 0,1% trọng lượng (tức là 1 mg/g). Nếu rõ ràng là một hoặc nhiều chất cần phân tích đang hiện diện trong mẫu (dựa trên các tiêu chí nhận dạng ở trên) và ở mức độ lớn hơn hoặc bằng 1.0 mg/g, sau đó kết quả sẽ được báo cáo như điều có thực. Đạt được một sự đánh giá bán định lượng của mục tiêu phân tích.
80
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chuyên đề sắc ký – TS Nguyễn Đình Lâm – Khoa Hoá ĐHBK Đà Nẵng 2. Cơ sở phân tích sắc ký khí – Thạc sĩ Bùi Xuân Vững 3. Nguyên lý hoạt động của một số detector trong sắc ký khí – ThS Lê Nhất Tâm – Khoa Hoá – ĐH Công Nghiệp TP.HCM 4. http://www.case.vn/vi-VN/87/details.case
81
