Otet

MINISTERUL EDUCAŢIEI, CERCETĂRII ŞI INOVĂRII UNIVERSITATEA DUNĂREA DE JOS – GALAŢI FACULTATEA ŞTIINŢA SI INGINERIA ALIMENTELOR DOMENIUL INGINERIE INDUSTRIALĂ

REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT BIOTEHNOLOGII DE ÎMBUNĂTĂŢIRE A RANDAMENTULUI ÎN ACID ACETIC LA FERMENTAREA DIFERITELOR MEDII DE CULTURĂ

Conducător ştiinţific: Prof.dr.ing. BANU Constantin Autor: TARHON Maria Cristiana

GALAŢI 2009

1

STRUCTURA TEZEI DE DOCTORAT Teza de doctorat conţine 187 de pagini, din care partea documentară reprezintă 40 de pagini, iar partea exprimentală este prezentată în 144 de pagini. Lucrarea conţine 41 de figuri şi 81 de tabele. Adiţional, sunt redate 12 imagini foto, prezentate în anexe. Pentru elaborarea tezei s-au utilizat 63 de referinţe bibliografice.

2

Mesaj de mulţumire Prin acest mesaj vreau să mulţumesc tuturor celor care m-au susţinut moral sau profesional pe tot parcursul desfăşurării tezei de doctorat. Mulţumesc d-lui profesor Banu Constantin că a fost de acord să mă înscriu la dumnealui la doctorat. Mulţumesc domnilor profesori de la Facultatea SIA din Galaţi că m-au primit cu mult drag în „familia“ lor. Mulţumesc d-nei profesor Oancea Ioana că m-a îndrumat în „arta de a vedea ceea ce nu se vede cu ochiul liber“ – microbiologia, în izolarea, identificarea şi „botezarea“ bacteriile acetice. Mulţumesc domnului Lupu Cicerone, directorul Fabricii de oţet - Târgu Bujor, care mia permis accesul în fabrică şi realizarea experimentului industrial pe unul din acetatoarele fabricii. Mulţumesc părinţilor mei că m-au înţeles şi au acceptat plecarea mea de acasă pentru a mă împlini profesional. Mulţumesc soţului meu care m-a susţinut şi ajutat de câte ori am avut nevoie de el. Mulţumesc celor care m-au ajutat şi vreau să ştie că atunci când vor avea nevoie de mine voi fi acolo mereu...

Ing. Garnai (Tarhon) Maria Cristiana

0

CUPRINS 1. INTRODUCERE .......................................................................................................................................... 1 2. IMPORTANŢA CERCETĂRII ....................................................................................................................... 1 3. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE LUCRĂRII ....................................................................................................... 1 PARTEA I - STUDIU DOCUMENTAR 1. STUDIU DOCUMENTAR PRIVIND OBŢINEREA OŢETULUI 1.1. Materii prime folosite în industria oţetului............................................................................................... 2 1.2. Nutrimente folosite la fabricarea oţetului ................................................................................................ 2 1.3. Bacterii acetice – caractere morfofiziologice ....................................................................................... 3 1.4. Biochimismul fermentaţiei acetice ........................................................................................................ 4 1.5. Factorii care influenţează fermentaţia acetică ........................ .............................................................. 5 1.6. Procedee de obţinere a oţetului .............................................................................................................. 6 1.7. Factorii care influenţează calitatea oţetului ........................................................................................... 7 1.8. Tipuri de oţet de fermentaţie şi caracteristici compoziţionale ............................................................ 7 PARTEA a II-a - REZULTATELE CERCETĂRII EXPERIMENTALE 2. MATERIALE, METODE ŞI APARATURĂ UTILIZATE ÎN CERCETĂRILE EXPERIMENTALE EFECTUATE ÎN CONDIŢII DE LABORATOR ......................................................................................................................... 8 2.1. Materiale ................................................................................................................................................. 8 2.2. Metode de analiză.................................................................................................................................. 8 2.3. Aparatură utilizată în experimentări .................................................................................................... 9 3. ANALIZA FIZICO-CHIMICĂ A MATERIILOR PRIME UTILIZATE ÎN PREPARAREA MEDIILOR DE CULTIVARE A BACTERIILOR ACETICE.......................................................................................................... 9 3.1. Materii prime şi auxiliare ...................................................................................................................... 9 3.2. Metode de analiză................................................................................................................................ 10 4. OBŢINEREA CULTURILOR DE BACTERII ACETICE ............................................................................. 10 4.1. Izolarea şi obţinerea în culturi pure a bacteriilor acetice din vin şi cidru ..................................... 10 4.2. Verificarea purităţii culturilor pe baza observaţiilor macro şi microscopice................................ 10 4.3. Teste biochimice de identificare a bacteriilor acetice şi stabilirea apartenenţei în clasificare .. 11 4.4. Concluzii............................................................................................................................................... 11 5. ACTIVITATEA FERMENTATIVĂ ŞI EFICIENŢA CULTURILOR DE BACTERII ACETICE SUB INFLUENŢA PRINCIPALILOR FACTORI (materii prime, concentraţia alcoolică, aciditatea, temperatura, SO2, pH-ul) şi a materiilor auxiliare (extract de drojdie, extract de porumb şi diferite amestecuri de săruri) .............................................................................................................................................................. 12 5.1. Cercetări privind utilizarea ca materie primă a alcoolului de fermentaţie în tehnologia de obţinere a oţetului ........................................................................................................................................... 12 5.2. Cercetări asupra utilizării vinului ca materie primă în tehnologia oţetului - în mod singular şi în asociere cu alcool de fermentaţie.................................................................................................................. 19 5.3. Experimente privind studiul fermentaţiei acetice în vin roze şi roşu - cu diferite tulpini de bacterii acetice................................................................................................................................................. 22 5.4. Influenţa unor săruri de amoniu folosite singular sau mixt în diferite medii de cultivare a bacteriilor acetice ............................................................................................................................................ 24 6. EXPERIMENT INDUSTRIAL ÎN SISTEM CU ACETATOR FRINGS ......................................................... 27 6.1. Pregătirea inoculului de bacterii acetice ......................................................................................... 27 6.2. Rezultatele cercetării industriale...................................................................................................... 29 7. PROIECTAREA ŞI STABILIREA PARAMETRILOR DE FUNCŢIONARE A UNEI INSTALAŢII DE PRODUCERE A OŢETULUI ÎN SISTEM SUBMERS....................................................................................... 33 7.1. Prezentarea instalaţiei de laborator cu funcţionare în sistem submers ...................................... 33 7.2. Funcţionarea instalaţiei de laborator............................................................................................... 33 7.3. Rezultate experimentale .................................................................................................................... 33 8. CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI............................................................................................ 36 BIBLIOGRAFIE................................................................................................................................................. 40 ANEXE .............................................................................................................................................................. 42

1

INTRODUCERE Oţetul este un produs al fermentaţiei acetice cunoscut încă din antichitate. Din cele mai vechi timpuri grecii, indienii, babilonienii, perşii obţineau oţet din vin, bere, struguri, curmale şi alte fructe. Cu toate acestea, natura procesului de obţinere a oţetului începe a fi cunoscut abia în anul 1837 de către Kutzing, care emite ipoteza transformării alcoolului în acid acetic prin intermediul microorganismelor. Mai târziu (1864 - 1868) Pasteur, este cel care confirmă această ipoteză şi totodată descrie agentul de fermentare sub termenul de „Micoderma aceti”. [35]

IMPORTANŢA CERCETĂRII S-a realizat o cercetare ştiinţifică în ceea ce priveşte stabilirea unor variante tehnologice de obţinere a oţetului pe cale fermentativă, în mod cât mai eficient sub raportul randamentului, utilizând alcoolul etilic dublu rafinat şi vinul, materii prime de care se dispune în ţara noastră. În România oţetul se obţine din vin sau din vin în amestec cu alcool etilic dublu rafinat (din cereale) şi apă. Luând în considerare faptul că ţara noastră nu duce lipsă de alcool de fermentaţie (spirt) şi, în plus, gradul alcoolic al spirtului este mai ieftin decât al vinului, am considerat că interesează şi studiul obţinerii oţetului din alcool rafinat - folosit ca materie primă în mediu de fermentare îmbogăţit cu substanţe nutritive.

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE LUCRĂRII Scopul lucrării de doctorat „Biotehnologii de îmbunătăţire a randamentului în acid acetic prin fermentarea diferitelor medii de cultură” este acela de a izola cele mai performante tulpini de bacterii acetice şi de a optimiza condiţiile de lucru în vederea obţinerii unui produs de calitate superioară, care să corespundă normelor europene. Pentru atingerea scopului menţionat ne-am propus realizarea următoarelor obiective: 9 Analiza materiilor prime utilizate: - analiza vinului; - analiza spirtului; - analiza apei potabile folosite la diluarea spirtului (alcool etilic rafinat); 9 Izolarea şi păstrarea în cultură pură a tulpinilor de bacterii acetice selecţionate; 9 Identificarea tulpinilor de bacterii acetice selecţionare; 9 Determinarea potenţialului fermentativ al tulpinilor de Acetobacter izolate; 9 Utilizarea tulpinilor de bacterii acetice selecţionate pentru obţinerea oţetului în sistem static şi dinamic; 9 Analiza oţetului ca produs finit.

2

PARTEA I – STUDIU DOCUMENTAR CAPITOLUL I. STUDIU DOCUMENTAR PRIVIND OBŢINEREA OŢETULUI 1.1. Materii prime folosite în industria oţetului Oţetul de fermentaţie, după felul materiei prime folosite la fabricarea lui, poate fi oţet din: - vin, vin pichet, cidru de mere; - alcool etilic diluat (cu 10–12% alcool) obţinut din melasă, cereale, cartofi etc.; - diverse soluţii alcoolice obţinute prin fermentaţia alcoolică a unor: sucuri de fructe (pere, smochine, piersici, caise, curmale, ananas) sau materii prime amidonoase; - miere (hidromel); - must de malţ. Fiecare ţară foloseşte în fabricarea oţetului materia primă de care dispune. Totuşi, se poate sublinia, că vinul, cidrul, spirtul (la care se adaugă nutrimente) şi berea sunt considerate materiile prime de bază pentru industria oţetului, deoarece conţin toate substanţele necesare dezvoltării şi multiplicării bacteriilor acetice într-o formă uşor asimilabilă. În Franţa, Italia, Spania vinul reprezintă principala materie primă în fabricarea oţetului, aşa cum cidrul este materia primă pe care se bazează producţia de oţet din S.U.A., sau aşa cum malţul şi berea reprezintă materia primă în Anglia. Materia primă folosită în industria oţetului trebuie să nu conţină inhibitori şi, prin compoziţia sa, să furnizeze bacteriilor acetice elementele plastice şi catalitice indispensabile înmulţirii şi realizării biochimismului fermentaţiei acetice. [37] Condiţia esenţială a obţinerii oţetului este ca materia primă să conţină alcool etilic. Aceste materii prime se pot folosi individual sau în amestec, cu sau fără adaos de apă. Concentraţia de alcool etilic din soluţia hidroalcoolică se reglează între 3,5 – 17%, în funcţie de tăria acetică ce urmează să fie obţinută şi randamentul de conversie corespunzător tehnologiei folosite, corelat şi cu capacitatea fermentativă a culturii de bacterii acetice utilizate.[11]

1.2. Nutrimente folosite la fabricarea oţetului Pentru desfăşurarea fermentaţiei acetice în bune condiţii, bacteriile acetice au nevoie, pe lângă alcool etilic şi oxigen, de nutrimente secundare şi de factori de creştere. În cazul în care oţetul se obţine din vin, prezintă mai puţină importanţă suplimentarea plămezii cu factori nutritivi, deoarece vinul asigură necesarul în azot, fosfor, substanţe nutritive. În condiţiile în care oţetul se obţine din spirt diluat în amestec cu vin, sau numai din spirt diluat, devine o necesitate a se îmbogăţii mediul alcoolic cu substanţe nutritive (săruri, vitamine), care să permită o bună dezvoltare a bacteriilor acetice, asigurându-se astfel o viteză de fermentare convenabilă şi un randament sporit în acid acetic. În scopul suplimentării plămezilor cu substanţe nutritive se pot folosi diverse săruri (şi anume fosfaţi şi sulfaţi) ca: (NH4)2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, (NH4)2SO4, care se pot folosi separat sau asociate, în proporţie de 0,2 – 0,5 g/l. De asemenea, plămezile pot fi optimizate în ceea ce priveşte conţinutul în substanţe nutritive şi prin adaos de autolizat de drojdie, extract de malţ sau extract de porumb. Ca sursă de azot bacteriile acetice pot să folosească sărurile de amoniu, aminoacizii (valină, alanină, izoleucină, cisteină, histidină, prolină) şi peptonele, iar ca nutrienţi, care se

3

pot întâlni mai mult sau mai puţin şi în unele surse organice, se utilizează extractul de drojdie sau de porumb. Extractul de porumb este subprodus al fabricării amidonului, care rezultă prin concentrarea apei de înmuiere a boabelor de porumb înainte de măcinare. Se foloseşte şi in industria antibioticelor. [24] Nevoia faţă de factori de creştere variază de la o tulpină la alta, astfel bacteriile acetice sunt auxotrofe faţă de vitaminele: acid para-aminobenzoic, niacină (B3), tiamină (B1), acid pantotenic (B5) (vitamine ale grupului B).[37]

1.3. Bacterii acetice – caractere morfofiziologice Bacteriile acetice sunt bacterii strict aerobe, nesporulate, Gram – negative, grupate în perechi sau lanţuri, cu dimensiuni variabile (0,5 – 0,8) – (0,9 – 4,2) μ m. Pot fi mobile sau imobile, cu cili polari sau peritrichi. Acetobacter suboxydans prezintă cili dispuşi lofotrichi, cu lungimea de 4,5 μ m, ca şi Acetobacter melanogenum. De asemenea, specia Acetobacter aceti prezintă cili monotrichi, cu lungimea de 11,7 μ m. În mediu acid, în timp, pot să apară forme de involuţie, ramificate, care îşi pierd capacitatea de reproducere. Majoritatea au formă de bastonaşe drepte sau curbate. Cele din vin prezintă o uşoară gâtuire. Unele specii au posibilitatea de a forma zooglee (Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides). În medii lichide (în cultură staţionară) se dezvoltă sub forma unui voal fragil, care pe măsura creşterii în dimensiuni se ridică pe pereţii vasului (Acetobacter ascendens, Acetobacter aceti). S-a observat că puterea de acidifiere a bacteriilor este cu atât mai mică, cu cât voalul este mai gros şi mai afundat în lichid. Alte specii, cum sunt Acetobacter xylinum şi Acetobacter xylinoides, formează un strat gelatinos de natură β - glucanică (în vinul oţeţit sau în oţet), care blochează circuitul normal al aerului în cazul fermentatoarelor cu talaş cu consecinţe nedorite. [25] Pe medii de cultură solide, bacteriile acetice formează (în funcţie de natura lor) colonii cu aspect diferit, netede sau cutate, umede sau uscate, de culoare albă, alb-roz, brune. Bacteriile acetice sunt mezofile (temperatura optimă de dezvoltare este de 22-33oC, în funcţie de specie) şi produc fermentaţia acetică într-un domeniu larg de temperatură (1040oC). Temperatura minimă de dezvoltare pentru majoritatea bacteriilor acetice este de 10oC, însă sunt şi specii care se pot dezvolta la 6-7oC. Temperatura maximă de dezvoltare pentru cele mai multe bacterii acetice este în jur de 40oC, cu menţiunea că sunt şi cazuri de excepţie. Spre exemplu, Acetobacter xylinum se dezvoltă şi la 50oC, iar Acetobacter industrium se dezvoltă numai până la temperatura de 28oC. Bacteriile acetice au o termorezistenţă scăzută în mediu lichid, cu pH acid, inactivarea lor având loc într-un minut la 60oC ; în timp ce bacteriile reţinute pe suporturi solide (doage de lemn) sunt inactivate la temperaturi mai ridicate (100oC). [6] Bacteriile acetice sunt tolerante la acid şi concentraţii de până la 2o acetice activează creşterea celulară. Rezistenţa la acid acetic se poate explica prin aceea că membrana acestor bacterii are un conţinut ridicat în acizi graşi saturaţi, motiv pentru care este relativ impermeabilă la acidul acetic, care se găseşte sub formă nedisociată în mediile fermentate industrial. Valoarea optimă de pH pentru creşterea bacteriilor acetice este de 5,5; iar pH-ul limită se situează la nivel de 2,5. Bacteriile acetice au un echipament enzimatic complex, în care sunt prezente dehidrogenaze foarte active, localizate în sistemele membranare cuplate cu lanţul citocromic, enzime ale ciclului Krebs, care le permite oxidarea a circa 80 de produşi (alcooli, glucide, acizi organici), printre care şi acidul acetic. La oxidarea acidului acetic participă unele specii de bacterii din genul Acetobacter, producătoare de acid acetic (Acetobacter aceti, Acetobacter liquefaciens, Acetobacter

4

pasteurianum, Acetobacter hansenii). Aceste bacterii posedă toate enzimele care participă la ciclul acizilor tricarboxilici. Acidul acetic inhibă oxidarea sa de către bacteriile acetice la concentraţii mai mari de 8o acid acetic şi la pH = 3,0. Dintre sursele de carbon utilizate preferenţial, alcoolul etilic este oxidat la acid acetic, iar glucoza la acid gluconic şi acid 5-cetogluconic. Bacteriile din genul Gluconobacter utilizează ca principale surse de carbon: glucoza şi etanolul. Bacteriile din genul Acetobacter folosesc ca surse de carbon: etanolul, lactatul, hexozele şi glicerolul. Bacteriile din genul Acetobacter pot să oxideze şi acetalii la CO2 şi H2O, când alcoolul etilic a fost consumat din mediu, pentru că alcoolul etilic inhibă activitatea enzimelor de oxidare a acetalului. Ca sursă de azot bacteriile acetice pot să folosească sărurile de amoniu, aminoacizii (valină, alanină, izoleucină, cisteină, histidină, prolină), peptonele şi alte surse de azot organic, cum sunt extractul de drojdie, de carne sau de porumb. [28] Nevoia faţă de factori de creştere variază de la o tulpină la alta, astfel bacteriile acetice sunt auxotrofe faţă de vitaminele: acid para-aminobenzoic, niacină, tiamină, acid pantotenic şi faţă de alte vitamine din grupului B. Bacteriile sunt răspândite, în natură, pe produsele vegetale (fructe, frunze, flori) si transportul lor este favorizat de insecte (musculiţa de oţet: Drosophilla) şi nematode (Anquillula aceti). [12]

1.4. Biochimismul fermentaţiei acetice Reacţia generală a fermentaţiei acetice este următoarea: CH3 - CH2 - OH + O2 → CH3 - COOH + H2O + ATP 46

32

60

18

(1)

Din ecuaţia generală rezultă că, sub acţiunea bacteriilor acetice, alcoolul este oxidat în acid acetic, fără a trece prin faza intermediară de aldehidă acetică. În realitate, în urma cercetărilor întreprinse de Dupny P. şi Maugen J. (1962), s-a demonstrat experimental că la fermentaţia acetică se formează ca produs intermediar acetaldehida, fapt dovedit prin adaos în mediu de fermentare a sulfitului sau bisulfitului de calciu, care blochează transformarea acetaldehidei în acid acetic: OH CH3

C

O + Ca (HSO3)2 H

CH3

C

-

SO3 Ca++

H

(2) Produsul format nu este oxidat de bacteriile acetice şi se acumulează în mediu, fermentaţia acetică blocându-se. [32] Mecanismul fermentaţiei acetice implică participarea unor dehidrogenaze care au drept cofactor NADP. Hidrogenul format este transferat de enzimele catenei respiratorii celulare pe oxigenul molecular provenit din aerul folosit pentru oxigenarea substratului. În acest fel, în mediu se acumulează acid acetic, viteza de conversie a alcoolului etilic în acid acetic depinzând de specia de bacterie acetică, natura substratului, nivelul de aprovizionare cu oxigen şi de temperatura la care are loc fermentarea. Viteza de conversie scade odată cu acumularea acidului acetic în mediul de fermentaţie. [29] În figura 1. se prezintă mecanismul biochimic al fermentaţiei acetice. După Riberau Gayon şi colaboratorii (1975) alcool - dehidrogenaza are pH optim la ~ 5, iar aldehid - dehidrogenaza are pH optim la ~ 6. Se consideră că există şi o cale colaterală de transformare a acetaldehidei printr-o reacţie de disproporţionare: CH3 C

O H

+ CH3 C

O H

+ H2O

CH3 C

O OH + CH3 CH2 OH

(3)

5

Etanolul format în cazul prezentat în relaţia (3) se poate oxida din nou conform schemei din figura 1 (anexa 1). Proporţia de acid acetic care se formează pe această cale colaterală în raport cu calea principală nu este cunoscută până în prezent. C H

C H 2 a lc o o l e tilic

3

O H N A D P

+

a lc o o l d e h id ro g e n a z a +

N A D P H + H

C H

O

C

3

H

a ld e h id a a c e tic a

2 H

2

O

h id ra ta z a

C H

3

H O H O H

C

a ld e h id a a c e tic a h id r a ta ta N A D P

+

a ld e h id d e h id ro g e n a z a

N A D P H + H

C H

2

N A D P

C O O 3 a c id a c e t ic

H

+

2 N A D P H 2

F A D H

2

2 F A D

2

+

O H

O

2

2

O

4 H

+

O H

+

4 F e

+ +

- c ito c r o m

2 O

-

4 F e

O

+ + +

- c ito c r o m

2

Fig. 1. Biochimismul fermentaţiei acetice

1.5. Factorii care influenţează fermentaţia acetică Factorii mai importanţi care influenţează fermentaţia acetică se referă la: compoziţia chimică a substratului, temperatura de fermentare, aciditatea iniţială a substratului alcoolic, concentraţia în alcool a substratului fermentativ, numărul de bacterii acetice inoculate în substrat, aerarea substratului, concentraţia în acid acetic acumulat în substratul ce fermentează, prezenţa agenţilor dăunători. [3]

6

1.6. Procedee de obţinere a oţetului Tehnologia de fabricare a oţetului nu diferă esenţial în funcţie de substratul alcoolic folosit (vin sau soluţie hidro-alcoolică preparată din spirt). În figura 1.a. este prezentată schema tehnologică generală de fabricare a oţetului de fermentaţie din materii prime amidonoase şi zaharoase. Operaţiile importante care implică aspecte biotehnologice se referă la prepararea substratului pentru fermentaţia alcoolica, fermentaţia acetica a substratului hidroalcoolic si maturarea, în special, în cazul oţetului de vin şi de fructe. [6], [42] În figurile 1.b. şi în 1.c. sunt prezentate schemele tehnologice de fabricare a oţetului din vin şi respectiv , din spirt. Materii prime amidonoase: orz, orez, porumb, cartofi, etc. Zaharificare (enzime din malţ sau mucegai)

Materii prime zaharoase: mere, banane, ananas, etc. Extracţie, presare

struguri,

Glucide fermentescibile (zaharoza, maltoza, glucoza, fructoza) Fermentaţie alcoolica Saccharomyces cerevisiae C6H12O6

2 C2H5OH + 2 CO2

Condiţii anaerobe Alcool etilic

C2H5OH + O2

Acetificare bacterii acetice

CH3 COOH + H2O

Oţet Fig. 1.a. Schema tehnologică generală de obţinere a oţetului de fermentaţie din materii prime amidonoase şi zaharoase Vin alb Aerare puternică pentru desulfitare (în cazul vinului sulfitat)

Introducerea vinului în acetatorul umplut cu talaş şi îmbibat cu oţet fin Acetificare la 28...32oC până la un conţinut rezidual de 0,2% alcool etilic Oţet brut Filtrare Pasteurizare / răcire

Maturare (învechire) Filtrare Îmbuteliere Depozitare

Fig. 1.b. Schema tehnologică de obţinere a oţetului din vin în acetatoare cu talaş

7

Glucoză

Apă

Oţet de 7o

Alcool etilic (96o)

Nutrimente

Inocul dintr-o şarjă anterioară 20%

Acidifiere soluţie Diluare cu apă până la 12 % alcool etilic Pregătirea substratului hidroalcoolic Fermentare la 30oC până la un nivel rezidual de 0,2 % alcool etilic în acetator pregătit în prealabil Maturarea oţetului 7 zile Clarificare prin filtrare Îmbuteliere Depozitare Fig. 1.c. Schema tehnologică de obţinere a oţetului din spirt

Procedeele de realizare a fermentaţiei acetice diferă între ele în funcţie de viteza de formare a acidului acetic şi implicit în funcţie de modul de aerare, şi pot fi clasificate în două categorii: • procedee lente; • procedee rapide. Procedeele lente pot fi: de tip clasic şi de tip Orleans. Procedeele rapide pot fi: a) procedee la care contactul soluţiei alcoolice cu aerul se face prin distribuirea soluţiei respective pe o coloană de umplutură inertă; b) procedee submerse. [1], [3], [6].

1.7. Factorii care influenţează calitatea oţetului Factorii care influenţează calitatea oţetului sunt următorii: - maturarea; - clarificarea; - pasteurizarea. [ 62]

1.8. Tipuri de oţet de fermentaţie şi caracteristici compoziţionale Influenţa procesului tehnologic asupra calităţii oţetului de fermentaţie nu este neglijabilă şi în anumite cazuri (oţetul balsamic) este extrem de importantă. Cu toate acestea, cel mai important factor este materia primă. În funcţie de natura materiei prime, există câteva tipuri distincte de oţet, enumerate în continuare: oţetul din vin[50], oţetul din fructe[27], oţetul din orez, oţetul din must de bere, oţetul din spirt, oţetul din zer, oţetul balsamic [16], [17], oţetul de Filipine, oţetul Thai. [35], [6] Indicii compoziţionali ai oţetului variază foarte mult în funcţie de materiile prime folosite şi tehnologia adoptată (tabelul 1) – Anexa 1.

8

PARTEA a II-a – REZULTATELE CERCETĂRII CAPITOLUL II. MATERIALE, METODE ŞI APARATURĂ UTILIZATE ÎN CERCETĂRILE EXPERIMENTALE EFECTUATE ÎN CONDIŢII DE LABORATOR 2.1. Materiale Studiul s-a efectuat pe următoarele materii prime: - vin alb – de la Societatea "Vinificaţie şi Băuturi" S.A. Galaţi.” ; - vin roze – de la Societatea "Vinificaţie şi Băuturi" S.A. Galaţi; - vin roşu – de la Societatea "Vinificaţie şi Băuturi" S.A. Galaţi; - alcool etilic concentrat care a fost diluat cu apă distilată până la obţinerea diferitelor concentraţii . Materiile auxiliare folosite au fost: - apa potabilă şi apa potabilă sterilizată; - nutrimenţi: extractul de drojdie, extractul de porumb, diferite săruri (fosfaţi sau sulfaţi).

2.2. Metode de analiză Pentru atingerea obiectivelor stabilite şi rezolvarea tematicii tezei de doctorat, s-a impus utilizarea unor metode de analiză microbiologice, senzoriale, fizico-chimice şi biochimice. Pentru realizarea analizelor materiilor prime am utilizat STAS - urile din domeniu, astfel: - SR 184 – ALCOOL ETILIC ŞI BĂUTURI ALCOOLICE, Analiza senzorială; - STAS 184/2–87 – ALCOOL ETILIC ŞI BĂUTURI ALCOOLICE, Determinarea concentraţiei alcoolice; - STAS 184/2/A1 – ALCOOL ETILIC ŞI BĂUTURI ALCOOLICE, Determinarea concentraţiei alcoolice; - STAS 6182/1-79 – VIN, Determinarea acidităţii totale; - STAS 6182/2-86 – VIN, Determinarea acidităţii volatile; - STAS 6182/6-70 – VIN, Determinarea concentraţiei alcoolice; - STAS 6182/8-71 – VIN, Determinarea densităţii; - STAS 6182/9-80 – VIN, Determinarea extractului sec total; - STAS 6182/10-71 – VIN, Determinarea fierului; - STAS 3001-91 – APĂ POTABILĂ, - STAS 6322-61 – APĂ POTABILĂ, Determinarea culorii; - STAS 6324-61 – APĂ POTABILĂ, Determinarea temperaturii, mirosului şi gustului; - STAS 157-86 – OŢET ALIMENTAR; - SR EN 13188 – OŢET.PRODUS FABRICAT DIN LICHIDE DE ORIGINE AGRICOLĂ. DEFINIŢII, PRESCRIPŢII, MARCARE.

Metode de studiu a microorganismelor în stare colorată În această direcţie s-au avut în vedere următoarele: a) obţinerea şi studiul preparatelor umede; b) tehnici de evaluare a numărului de microorganisme; c) tehnici de studiu şi identificare a microorganismelor.[23], [24], [29] Teste de diferenţiere a speciilor de bacterii acetice Diferenţierea diferitelor specii de bacterii acetice s-a făcut pe baza unor teste fiziologice şi biochimice, şi anume: reacţia catalazei, producţia de acid acetic, proprietatea de a metaboliza acidul lactic, puterea cetogenă, formarea de acid gluconic, asimilarea NH3 în prezenţa alcoolului etilic, oxidarea 2,3 butandiolului în acetoină, producerea de celuloză (mucilagii) [8], [2]

9

2.3. Aparatură utilizată în experimentări Aparatura utilizată în experimentări a fost următoarea: microscop de laborator tip “ML-4M”; microscop cu aparat foto-color încorporat; set “Multi 350i” dotat cu pH-metru şi oxi-metru; alcoolmetrul “Dujardin-Salleron”; spectofotometru”DR/2010”; pompă de aer”Resun-AC 9601”; pompă de recirculare a lichidului “AquaEL-tip FAN-mini”; etuvă electronică „Stericell cu înregistrator” (utilizată pentru sterilizarea ustensilelor de laborator); autoclav tip „Autoclave AE 75 DRY cu înregistrator”; balanţă analitică. Pentru desfăşurarea în bune condiţii a activităţii de cercetare a mai fost nevoie de sticlărie şi ustensile de laborator, de asemenea şi de trusa de colorare Gram.

CAPITOLUL III. ANALIZA FIZICO-CHIMICĂ A MATERIILOR PRIME UTILIZATE LA PREPARAREA MEDIILOR DE CULTIVARE A BACTERIILOR ACETICE 3.1. Materii prime şi auxiliare În experimentele de laborator efectuate, ca şi în cele industriale, am folosit ca materii prime vinul alb, roze şi vinul roşu (tabelul 3.1.), alcoolul rafinat (spirt) (tabelul 3.2.) în amestec cu apa şi cu adaos de nutrimenţi (tabelul 3.3). [19] Tabelul 3.1. Caracteristicile fizico-chimice ale vinului-materie primă Materia primă Vin alb Vin roşu Vin rose

Caracteristicile materiei prime Aciditate g ac. acetic / 100 ml

Alcool, % vol

pH

0.6 2 0,7

8 9 6,0

4,05 4,27 4,30

SO2 total, mg/l 33,6 -

liber, mg/l 19,2 -

Antociani mg/100 ml 81,75 20,00

Tabelul 3.2 Caracteristicile fizico-chimice ale alcoolului etilic Proprietăţile fizico-chimice Conţinut alcool etilic Metanol Alcool izo-propilic Compuşi carbonilici Aciditate în acid acetic Alcalinitate

Valorile % vol. min. 94 % vol. max. 0,1 % vol. max. 0,003 % max. 0,05 % max. 0,005 % max. 0,0003

Tabelul 3.3 Caracteristicile fizico-chimice ale extractului de porumb (Ep) Proprietăţile fizico-chimice Substanţa uscată Cenuşa Azot proteic Azot aminic Acid lactic Dioxid de sulf Fier Cupru

Valorile 48% > 20% (faţă de S.U.) Min. 42% Min. 2,5% 6,46% 0,2% 0,05% 0.012%

Principalele caracteristici ale extractului de drojdie (Ed) folosit ca supliment nutritiv în fermentaţia acetică sunt prezentate în continuare: preparat pulbere, foarte higroscopic, care trebuie păstrat bine închis şi la temperaturi mai mici de 30oC; se dizolvă în alcool sau în apă deionizată (3 – 10 g/l) şi rezultă o soluţie clară cu pH = 6,6± 0,2; sursă naturală de vitamina B complex. Firme producătoare: „Difco Laboratories”–Detroit Michigan SUA; „Merck” Darmstadt, ş.a. [22]

10

3.2. Metode de analiză Analizele efectuate pentru: stabilirea principalelor caracteristici ale materiilor prime, în scopul izolării şi selecţiei de material biologic (bacterii acetice), pentru urmărirea dinamicii fermentaţiei acetice realizată cu diferite tulpini de bacterii acetice şi pentru caracterizarea produsului finit a oţetului, sunt de natură microbiologică, biochimică, senzorială şi fizicochimică. Pentru analiza materiilor prime care se referă la densitate, concentraţie în alcool, aciditate, extract, conţinutul în SO2, în fier, am consultat şi aplicat STAS - urile din domeniul „Alcool etilic – băuturi alcoolice”. Determinările menţionate au fost efectuate în laboratoarele de chimie, microbiologie şi biochimie din cadrul Facultăţii de Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor. [15], [19], [20]

CAPITOLUL IV. OBŢINEREA CULTURILOR DE BACTERII ACETICE 4.1. Izolarea şi obţinerea culturilor pure de bacterii acetice din vin şi cidru Pentru a dispune de materialul biologic, respectiv de bacteriile acetice necesare în scopul realizării temei de doctorat, am căutat şi izolat bacterii acetice din diferite probe de vin şi cidru, cu aciditate volatilă crescută, provenite din judeţele Galaţi, Buzău şi Dâmboviţa. În scopul izolării de culturi pure de bacterii acetice am practicat tehnica cunoscută de izolare prin metoda de răspândire, folosită pe scară largă prin diluarea în medii lichide şi prin diseminarea mecanică a celulelor pe suprafaţa mediilor solide (mustul de malţ agarizat (cu 6% extract refractometric, 4% alcool şi 0,2% acid acetic). În cercetarea de laborator am folosit în special metoda scarificată. Culturile pure obţinute au fost studiat macro - şi microscopic, examinând preparate microscopice umede şi uscate, colorate simplu şi Gram. [8] Culturile formate din bastonaşe mai mici sau mai mari, din celule izolate sau dispuse în perechi ori lanţuri, care în urma colorării diferenţiate Gram s-au comportat ca bacterii Gramnegative (caracteristic pentru bacteriile acetice), au rămas în continuare în atenţia noastră. [16] Odată cu examinarea acestor culturi s-a avut în vedere şi eventualul caracter de ascensiune pe pereţii vasului. Pe lângă examenul direct microscopic al culturilor, presupuse ca bacterii acetice, s-a urmărit şi creşterea acidităţii ca efect al activităţii acestor bacterii, în comparaţie cu aciditatea probei de mediu nutritiv martor, neînsămânţată. Din culturile cu bacterii Gram-negative şi cu aciditate crescută, s-au efectuat reînsămânţări, pentru a dispune de aceste bacterii în culturi pure. [15]

4.2. Verificarea purităţii culturilor pe baza observaţiilor macro - şi microscopice După izolarea bacteriilor acetice cu ajutorul mediilor lichide alcoolice, am verificat puritatea culturilor obţinute, prin însămânţări pe medii de cultură solide (formate din must de malţ cu 4% alcool, 0,2% acid acetic şi 1,5-2% geloză). Alcoolul a fost adăugat odată cu repartizarea în cutii Petri sterile a mediului de cultură fluidificat şi răcit la 35 – 40oC. Însămânţarea din culturile izolate, pe mediul alcoolic solid, s-a realizat utilizând metoda de însămânţare scarificată. Cu firul metalic steril al ansei, încărcat cu celule, s-au trasat striuri astfel încât pe mediile din cutiile Petri să se însămânţeze cât mai puţine celule, care să rămână ataşate de mediu şi cât mai izolate (figura 4.1).

11

Figura 4.1 După termostatarea cutiilor Petri cu medii de cultură însămânţate, timp de 4 – 5 zile, la temperatura de 25 – 30oC (practic după dezvoltarea coloniilor), s-au făcut repicări în medii nutritive din coloniile cele mai izolate. Asupra coloniilor s-au făcut constatări privind aspectul, culoarea, consistenţa, şi anume dacă aspectul este neted, lucios sau mat, umed sau uscat şi zbârcit, de consistenţă cremoasă, mucilaginoasă, de culoare albă, cremă, roză sau neagră.

4.3. Teste biochimice de identificare a bacteriilor acetice şi stabilirea apartenenţei filogenetice Luând în considerare datele rezultate din aceste teste şi interpretând rezultatele obţinute după indicaţiile înscrise în tabelul 4.1 (anexa 1) am realizat identificarea bacteriilor acetice izolate. Concluzii 9 Testul lactatului indică faptul că cele 14 culturi de bacterii acetice aparţin genului Acetobacter. 9 Testul glicerolului şi al catalazei şi observaţiile macro - şi microscopice au arătat că cele 14 culturi pure de bacterii acetice aparţin speciei Acetobacter aceti. 9 Tulpinile de Acetobacter aceti, care nu s-au dezvoltat pe mediul de cultură Hoyer Frateur, şi anume Ai, A10 şi T10, aparţin subspeciei Acetobacter aceti orleansis. 9 Tulpina A14, care produce celuloză şi care formează o membrană groasă mucilaginoasă, s-a identificat ca fiind subspecia Acetobacter aceti xylinum. 9 Celelalte 10 tulpini de Acetobacter aceti care se dezvoltă pe mediul Hoyer - Frateur, care nu produc celulază şi nici pigment, şi anume tulpinile C2, C3, 2Gl, 3Gl, S, Bz, 3Gi, T5, T6, T8 aparţin subspeciei Acetobacter aceti subspec. aceti. 9 Coloniile dezvoltate pe mediu solid au fost studiate macroscopic din punct de vedere al testului de oxidare a glicerolului, gradului de dezvoltare, formei, profilului, felului marginii coloniei, aspectului acesteia şi culorii. Din punct de vedere al dezvoltării foarte bine s-au comportat tulpinile Ai, A10, 2Gl, 3Gl, T10, T5, T6 şi T8, aşa cum se observă în tabelele 4.3 – 4.5 (prezentate în anexa 2).

CAPITOLUL V. ACTIVITATEA FERMENTATIVĂ ŞI EFICIENŢA CULTURILOR DE BACTERII ACETICE SUB INFLUENŢA PRINCIPALILOR FACTORI (MATERII PRIME, CONCENTRAŢIA ALCOOLICĂ, ACIDITATEA, TEMPERATURA, pH-ul) ŞI A MATERIILOR AUXILIARE (EP, Ed, săruri) 5.1. CERCETĂRI PRIVIND UTILIZAREA CA MATERIE PRIMĂ A ALCOOLULUI DE FERMENTAŢIE ÎN TEHNOLOGIA DE OBŢINERE A OŢETULUI În acest studiu sunt prezentate rezultatele cercetărilor asupra fermentaţiei acetice, în diferite variante ale mediului de cultivare, cu diferite tulpini de Acetobacter izolate în prealabil. Experimentele efectuate în condiţii de laborator au fost orientate în două direcţii principale: 5.1.1. o direcţie, în care variabila în mediul de cultivare o reprezintă atât aciditatea, cât şi alcoolul;

12

5.1.2. o altă direcţie, în care variabila o reprezintă numai alcoolul, în timp ce aciditatea iniţială a mediului de cultivare, în toate variantele, este aceeaşi. Ca nutriment, în mediile de cultură, s-a folosit extractul de porumb indigen, subprodus al Fabricii de Amidon şi Glucoză – Târgul Secuiesc, produs apreciat în literatura de specialitate, în special, ca sursă ieftină de azot. 5.1.1. Cercetările efectuate cu 13 tulpini de Acetobacter, în 5 variante ale mediului de cultivare, scot în evidenţă sensibilitatea şi rezistenţa fiecărei tulpini la aciditatea iniţială a mediului de cultivare. Pentru fiecare tulpină de bacterii acetice experimentată se pot observa aspectele cele mai importante referitoare la variantele optime ale mediului de cultivare din punct de vedere al eficienţei activităţii fermentative. În stabilirea acestor condiţii trebuie, însă, să se ţină seama de proprietăţile şi comportarea fiecărei tulpini de Acetobacter folosită ca agent de fermentare. În sistem static, în recipienţi de sticlă şi la temperatura de 25oC în probe de 200 ml în condiţii identice, au fost cultivate cele 10 tulpini de Acetobacter, una industrială şi 9 tulpini izolate din vinuri şi cidru din 3 judeţe: Dâmboviţa, Galaţi şi Buzău. Cele 5 medii de cultivare au în comun nutrimentul folosit (1 % extract de porumb). Conţinutul în acid acetic al mediului de fermentaţie a variat între 2 şi 6 % iar alcoolul între 9 şi 5 %. Însămânţarea mediilor cu bacterii acetice s-a efectuat la toate probele în condiţii identice, cu aceeaşi cantitate de inocul. Periodic s-a urmărit aciditatea titrabilă exprimată în acid acetic şi, în final, pH-ul şi alcoolul rezidual. Datele analitice sunt cuprinse în tabelele 1 10, în urma cărora se pot face recomandări utile în cazul valorificării acestui material biologic În figurile 5.1-5.5 este prezentată dinamica procesului de fermentaţie acetică a tulpinilor de bacterii acetice studiate.

A10

8

C2

7

C3

6

2 Gl

5

3

2

T10

2

1

Bz

1

0

3Gi

0

42 zile

Ai A10

8

C2

7

C3

6

2 Gl

5

3 Gl

4

S

3

T10

2

Bz

1

3Gi

0 7 zile

14 zile

21 zile

28 zile

35 zile

42 zile

49 zile Durata fermentatiei, zile

Figura 5.3. Dinamica procesului de acetificare cu diferite tulpini de bacterii acetice (compoziţia mediului: alcool etilic 7%, acid acetic 4%, extract de porumb 1%)

S T10 Bz 3Gi 14 zile

21 zile

28 zile

35 zile

42 zile




9

3 Gl

7 zile

49 zile Durata fermentatiei zile

10

2 Gl

5

S

35 zile

C3

6

3

28 zile

C2

7

4

21 zile

A10

8

3 Gl

14 zile

Ai

9

4

7 zile

A c id it a t e a t it r a b ila g a c id a c e t ic / 1 0 0 m l

10


Ai

9

10



10

Ai

9

A10

8

C2

7

C3

6

2 Gl

5

3 Gl

4

S

3

T10

2

Bz

1

3Gi

0 7 zile

14 zile

21 zile

28 zile

35 zile

42 zile



13


10

Ai

9

A10

8

C2

7

C3

6

2 Gl

5

3 Gl

4

S

3

T10

2

Bz

1

3Gi

0 7 zile

14 zile

21 zile

28 zile

35 zile

42 zile



Tulpinile de bacterii acetice T5, T6, T8 s-au dezvoltat foarte slab în aceste condiţii de mediu. În tabelele 5.1–5.6 este prezentat clasamentul tulpinilor în funcţie de compoziţia mediului de cultură. Tabelul 5.1 Tulpina de Acetobacter folosită ca inocul [5%]

Aciditatea finală a oţetului g acid acetic / 100 ml

2% acid acetic 9% alcool din spirt 1% extract de porumb

Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3 Gi

8,33 8,75 7,64 8,33 8,89 8,75 8,57 8,95 7,89 7,75

70,3 75,0 62,7 70,3 76,6 75,0 73,0 77,2 65,4 63,9

Clasarea tulpinilor după rezultatele obţinute

Locul în clasament

Compoziţia mediului de cultură

Randamentul practic [%]

Clasamentul tulpinilor de bacterii acetice în funcţie de eficienţa lor (varianta de mediului de cultură V1)

T10 2 Gl A10, 3 Gl S C3, Ai Bz 3 Gi C2

1 2 3 4 5 6 7 8

14

1 2 3 4 5 6 7 8 9



8,35 8,70 9,02 8,57 8,64 8,21 8,21 9,39 6,32 4,50

62,1 67,1 71,7 65,3 66,3 60,1 60,1 77,0 33,1 7,1

Clasarea tulpinilor după rezultatele obţinute T10 C2 A10 2 Gl C3 Ai S, 3 Gl Bz 3 Gi

Locul în clasament

Tulpina de Aciditatea finală a Compoziţia oţetului Acetobacter folosită mediului de cultură g acid acetic / ca inocul 100 ml [5%]


Tabelul 5.3 Clasamentul tulpinilor de bacterii acetice în funcţie de eficienţa lor (varianta de mediului de cultură V3)

1 2 3 4 5 6 7 8 9



8,70 9,00 8,76 8,76 8,57 8,57 8,57 9,27 6,90 6,08

61,7 66,7 62,7 62,7 59,5 59,5 59,5 71,2 31,7 18,0

T10 A10 C2, C3 Ai 2 Gl, 3 Gl, S Bz 3 Gi

Locul în clasament

T 10 C3 C2 2 Gl, 3 Gl A10 Ai S Bz 3 Gi


1 2 3 4 5 6 7

Tabelul 5.5 Clasamentul tulpinilor de bacterii acetice în funcţie de eficienţa lor (varianta de mediului de cultură V5) Tulpina de Aciditatea finală a Compoziţia mediului oţetului Acetobacter de cultură folosită ca inocul g acid acetic / 100 ml [5%]



8,83 8,46 7,32 8,90 8,40 8,83 8,64 8,08 6,80 6,63


56,6 49,2 26,4 58,0 48,0 56,6 52,8 41,6 16,0 12,6

C3 3 Gl, Ai S A10 2 Gl T10 C2 Bz 3 Gi

Locul în clasament

63,5 69,0 70,9 71,3 70,5 70,5 62,8 77,3 51,3 23,5

8,08 8,52 8,67 8,70 8,64 8,64 8,02 9,18 7,10 4,80

Tulpina de Aciditatea finală a oţetului Compoziţia mediului Acetobacter folosită ca inocul g acid acetic / de cultură 100 ml [5%]







Tulpina de Aciditatea finală a oţetului Acetobacter folosită ca inocul g acid acetic / 100 ml [5%]

Locul în clasament

Compoziţia mediului de cultură



1 2 3 4 5 6 7 8 9

15

Clasamentul tulpinilor de bacterii acetice este prezentat în tabelul 5.6.

Tabelul 5.6

Locul I Locul II Locul III

2% acid acetic 3% acid acetic 4% acid acetic 5% acid acetic 6% acid acetic +6% alcool+ +5% alcool+ +9% alcool+ +8% alcool+ +7% alcool+ 1%Ep 1%Ep 1%Ep 1%Ep 1%Ep T10 T10 T10 T10 C3 2 Gl C3 C2 A10 3 Gl, Ai A10, 3 Gl C2 A10 C2, C3 S

Din tabelul 5.1 rezultă că cea mai bună activitate în ceea ce priveşte producţia de acid acetic este cea dată de tulpina Ai, în varianta de mediu V5, în care caz s-a produs după 49 de zile o aciditate de 8,83 g acid acetic/100 ml, însă ca o deficienţă, alcoolul rezidual a fost cel mai ridicat (2,05% vol.). Deşi tulpina Ai a produs relativ mai puţin acid acetic (8,33 g acid acetic/100 ml după 42 de zile de fermentare), alcoolul rezidual a fost numai 0,55% volume, ceea ce reprezintă un randament de transformare a alcoolului în acid acetic de 70,3%. Din aceste date se constată că folosirea soluţiei de alcool etilic cu 9% alcool şi 2% acid acetic pentru acidifiere dă rezultate bune la fermentarea acetică timp de 49 de zile. Pe de altă parte se constată că deşi cantităţile de acid acetic acumulate sunt diferite, pH-ul soluţiilor acetice rămâne aproape constante, fapt explicat prin constanta de disociere a acidului acetic, ce nu pare a fi influenţată de alcoolul rezidual. Rezultate similare se obţin şi cu tulpinile C2, C3, 2Gl, 3Gl, respectiv cu tulpinile S şi T10. Pentru fiecare tulpină utilizată se constată o acumulare continuă de acid acetic în funcţie de timp, durata de 42-49 de zile considerându-se satisfăcătoare pentru obţinerea unui oţet de calitate (a se vedea graficele 5.1 – 5.5). Din tabelele 5.1–5.4 se constată că cel mai bine se comportă tulpina T10, în condiţiile în care alcoolul din soluţie a scăzut de la 9 la 6%, iar conţinutul de acid acetic din soluţie a crescut de la 2 la 5%. Având în vedere atât alcoolo-toleranţa cât şi aceto - toleranţa, tulpina T10 identificată a fi Acetobacter aceti subspecia orleansis se comportă cel mai bine în procesul de fermentaţie acetică, atât ca randament de transformare a alcoolului în acid acetic, dar şi din punct de vedere al toleranţei la alcool, ceea ce presupune că această specie se adaptează foarte bine la stresul produs de aciditate şi de concentraţie în alcool. Cele menţionate rezultă şi din analiza datelor cuprinse în tabelul 5.6. Concluzii Calităţile fermentative ale tulpinii de Acetobacter T10, o recomandă ca agent de fermentare în tehnologia obţinerii oţetului din alcool de fermentaţie, utilizând ca nutrient extractul de porumb, un subprodus al industriei alimentare. 5.1.2. Prin studiul efectuat s-a urmărit activitatea fermentativă a bacteriilor acetice luate în experiment şi eficienţa acesteia în mediul de cultivare, în care variabila o reprezintă conţinutul în alcool (obţinut din spirt rafinat concentrat - 96% vol.), aciditatea iniţială a mediului de fermentare, nutrientul utilizat şi temperatura de fermentare fiind aceleaşi pentru toate tulpinile de Acetobacter testată. Acest experiment permite un studiu comparativ privind randamentul în acid acetic al fermentaţiei realizată de fiecare dintre tulpinile de bacterii acetice luate în studiu, în scop selectiv. Studiul menţionat urmăreşte randamentul practic al fermentaţiei acetice cu 10 tulpini de bacterii acetice, una industrială (Ai ) şi alte nouă tulpini izolate din vinuri şi cidru, având drept scop o selecţie a tulpinilor sub acest aspect. Cele zece tulpini de Acetobacter au fost testate în cadrul experimentărilor noastre pe medii de cultură cu conţinuturi diferite de alcool etilic (6, 7, 8, 9, 10, 11 şi 12% alcool), cu 2% acid acetic şi adaos de 1% extract de porumb, ca nutrient pentru bacteriile acetice. Alcoolul a fost luat din spirtul rafinat de concentraţie 96%. La prepararea mediului de cultură, pentru cele 7 variante experimentale cu concentraţii diferite de alcool etilic, s-a folosit pentru diluarea spirtului apă potabilă sterilă. Clasificarea celor 10 tulpini de Acetobacter şi prezentarea celor aflate pe primele trei locuri după randamentele cu care se realizează bioconversia etanolului în acid acetic este prezentată în tabelul 5.14.

16

Tabelul 5.7 Clasificarea tulpinilor de Acetobacter în funcţie de randamentul practic de bioconversie Caracteristici ale mediului de cultură

Tulpina de Randamentul Acetobacter practic, ηp [%] Ai 89,8 A10 95,0 C2 89,8 C3 94,0 Alcool – 6 % Acid acetic – 2 % 2 Gl 96,0 Extract de porumb 3 Gl 96,0 (EP) 1% S 95,0 T10 89,8 Bz 89,8 3 Gi 94,0 2Gl, 3Gl>S şi A10>C3 şi 3Gi>Ai, C2, T10 şi Bz ηp = 89,8 – 96,0%

2 Gl 76.6 3 Gl 72,3 S 71,8 T10 76,6 Bz 74.4 3 Gi 63,3 T10>A10>3Gl>S>Ai şi C3>2Gl>3Gi>C2>Bz ηp = 52,2 – 76,6

Tabelul 5.11 Clasificarea tulpinilor de Acetobacter în funcţie de randamentul practic de bioconversie Caracteristici ale mediului de cultură

Tulpina de Randamentul Acetobacter practic, ηp [%] Ai 67,6 A10 65,1 C2 51,3 C3 65,7 Alcool – 10 % Acid acetic – 2 % 2 Gl 70,2 Tabelul 5.8 3 Gl 67,0 Clasificarea tulpinilor de Acetobacter în funcţie de Extract de porumb (Ep) 1% S 61,4 randamentul practic de bioconversie T10 70,8 Caracteristici ale Tulpina de Randamentul Bz 69,5 mediului de cultură Acetobacter practic, ηp [%] 3 Gi 56,0 Ai 91,4 T10>2Gl>Bz>Ai>3Gl>C3>A10>S>3Gi>C2 A10 93,8 ηp = 51,3 – 70,8% C2 87,7 Tabelul 5.12 C3 88,7 Alcool – 7 % Clasificarea tulpinilor de Acetobacter în funcţie de Acid acetic – 2 % 2 Gl 85,0 Extract de porumb randamentul practic de bioconversie 3 Gl 86,0 (EP) 1% Caracteristici ale Tulpina de Randamentul S 90,4 mediului de cultură Acetobacter practic, ηp T10 87,7 [%] Bz 88,7 Ai 58,7 3 Gi 80,0 A10 55,3 A10>Ai>S>C3 şi Bz >C2 şi T10>3Gl>2Gl>3Gi C2 46,2 ηp = 80,0 – 93,7% C3 55,8 Alcool – 11 % Tabelul 5.9 2 Gl 57,5 Clasificarea tulpinilor de Acetobacter în funcţie de Acid acetic – 2 % Extract de porumb 3 Gl 58,2 randamentul practic de bioconversie (Ep) 1% S 55,8 Caracteristici ale Tulpina de Randamentul T10 61,5 mediului de cultură Acetobacter practic, ηp [%] Bz 60,0 Ai 82,1 3 Gi 46,6 A10 84,5 T10>Bz>Ai>3Gl>2Gl>C3 şi S>A10>3Gi>C2 C2 83,8 ηp = 46,2 – 61,5% C3 76,0 Alcool – 8 % Tabelul 5.13 2 Gl 75,3 Acid acetic – 2 % Clasificarea tulpinilor de Acetobacter în funcţie de Extract de porumb 3 Gl 83,8 (EP) 1% randamentul practic de bioconversie S 85,4 Caracteristici ale Tulpina de Randamentul T10 81,4 mediului de cultură practic, ηp Acetobacter Bz 72,9 [%] 3 Gi 76,0 Ai 45,9 S>A10>C2 şi 3Gl>Ai>T10>C3 şi 3Gi >2Gl>Bz A10 48,0 ηp = 72,9 – 85,4% C2 51,2 Tabelul 5.10 C3 46,4 Alcool – 12 % Clasificarea tulpinilor de Acetobacter în funcţie de Acid acetic – 2 % 2 Gl 48,6 randamentul practic de bioconversie Extract de porumb 3 Gl 49,1 Caracteristici ale Tulpina de Randamentul (Ep) 1% S 34,4 mediului de cultură Acetobacter practic, ηp [%] T10 52,3 Alcool – 9 % Ai 71,1 Bz 48,6 Acid acetic – 2 % A10 74,4 3 Gi 38,2 Extract de porumb C2 58,4 T10>C2>3Gl>2Gl şi Bz>A10>C3>Ai>3Gi>S (Ep) 1% C3 71,1 ηp = 38,2 – 52,3%

17

Tabelul 5.14 Clasamentul bacteriilor acetice în funcţie de toleranta la concentraţia de alcool

Locul I Locul II Locul III

6% alcool +2%acid acetic +1%Ep 2 Gl şi 3 Gl A10 şi S C3 şi 3 Gi

7% alcool +2%acid acetic +1%Ep A10 Ai S

8% alcool +2%acid acetic +1%Ep S A10 C2 şi 3 Gl

9% alcool +2%acid acetic +1%Ep T10 A10 3 Gl

10% alcool +2%acid acetic +1%Ep T10 2 Gl Bz

11% alcool +2%acid acetic +1%Ep T10 Bz Ai

12% alcool +2%acid acetic +1%Ep T10 C2 3 Gl

Analiza datelor prezentate mai sus a condus la concluzia că se obţin randamente practice mai mari de acid acetic cu tulpina T10, care suportă concentraţii de până la 12% alcool în mediul de fermentare, iar randamentul practic în acid acetic este destul de ridicat, în cele mai multe cazuri superior celorlalte tulpini de bacterii acetice (Acetobacter aceti subsp. orleansis), ceea ce este în concordanţă atât cu datele găsite în literatura de specialitate, cât şi cu cele obţinute în practica industrială. Astfel Banu (2000) arată că Acetobacter orleansis produce 9,3% acid acetic (% m/v) la temperatura de 30oC, fiind depăşit doar de Acetobacter schűtzenbachii, care produce 11% acid acetic(% mlv) la temperatura de 28oC. De remarcat că, de regulă în producţia curentă, nu se lucrează efectiv cu o singură tulpină de Acetobacter, ci cu tulpini diverse care intră în competiţie, în funcţie de alcool-rezistenţă şi de acido-toleranţă, în aceleaşi condiţii de mediu de fermentare. La folosirea culturilor mixte de bacterii acetice trebuie să avem în vedere temperaturile optime de fermentare, care sunt diferite pentru diferitele specii de Acetobacter (36oC pentru Acetobacter aceti, 33oC pentru Acetobacter acetigenus, 31oC pentru Acetobacter ascendens, 30oC pentru Acetobacter kutzingianus, Acetobacter orleansis şi 28oC pentru Acetobacter pasteurianus şi Acetobacter schützenbachii). De regulă, temperatura optimă de fermentare nu se corelează cu toleranţa la alcool şi la acid acetic. Concluzii În urma analizei datelor prezentate mai sus putem face următoarele concluzii: 1. Toate cele zece tulpini de Acetobacter luate în experiment se pot dezvolta mai bine sau mai slab, cu eficienţă diferită privind producerea de acid acetic în medii de cultură cu 6 – 12% alcool, cu 2% acid acetic şi 1% extract de porumb. 2. Bioconversia alcoolului în acid acetic se realizează cu randamente diferite în funcţie de concentraţia în alcool a mediului de cultură şi de tulpina de Acetobacter folosită ca agent de fermentare. Pe măsură ce creşte concentraţia în alcool a mediului de cultură, randamentul scade. În mediul de cultură cu 6% alcool, toate tulpinile de Acetobacter fermentează integral alcoolul cu randamente cuprinse între 89,8 – 96,0%. Randamentul maxim în aceste condiţii de mediu este obţinut de tulpinile de bacterii acetice notate cu 2 Gl şi 3 Gl. 3. În mediul de cultură cu 7 % alcool, în funcţie de tulpina de Acetobacter folosită în fermentare, randamentul practic în acid acetic variază între 80,0 – 93,7%. În acest mediu de cultură se ajunge la aciditatea de 8,57% cu un randament maxim de 93,7% realizat de tulpina „A10”, căreia îi sunt optime aceste condiţii de mediu. 4. În mediul de cultivare al bacteriilor acetice, cu 8% alcool funcţie de agentul de fermentare, randamentul în acid acetic variază între 72,9 – 85,4%. Se remarcă tulpina „S”, cu care se obţine o aciditate de 8,83 % exprimată în acid acetic cu randamentul maxim de 85,4 %. 5. În urma cultivării celor 10 tulpini de bacterii acetice în mediu cu 9% alcool, se ajunge la aciditatea de 8,89% realizată cu randamentul maxim de 76,6% de către tulpina de Acetobacter „T10”. În aceste condiţii de mediu randamentul minim de 52,2% este realizat de tulpina „Bz”. 6. Bioconversia alcoolului în mediul de cultură cu 10% alcool are loc cu randamente în acid acetic cuprinse între 51,3 – 70,8%. Aciditatea maximă de 9,08% se obţine cu randamentul maxim, realizat de tulpina „T10”, care se dovedeşte mai rezistentă la concentraţia în alcool.

18

7. În mediul de cultură cu 11% alcool randamentele în acid acetic obţinute cu bacteriile acetice studiate variază între 46,2 – 61,5%. Randamentul maxim se obţine tot cu tulpina „T10”, urmată de tulpinile „Bz” şi „Ai”. 8. În mediul cu 12% alcool dezvoltarea şi activitatea fermentativă a celor 10 tulpini de Acetobacter este mai slabă. Alcoolul rămas în mediu este de 4,1 – 7,05% şi doar 2 tulpini de Acetobacter ( „T10” şi „C2”) realizează randamente în acid acetic peste 50%. 9. Pentru mediile de cultură cu 6, 7 şi 8% alcool se recomandă tulpinile „2 Gl”, „3 Gl”, „S” şi „A10”. Pentru mediile cu 9 şi 10% alcool se recomandă tulpina „T10”, bacterie acetică cu însuşiri fermentative superioare, cu rezistenţă la alcool mai mare. 10. În mediul de cultură cu 6% alcool, cultura industrială „Ai” este depăşită ca randament în acid acetic de către 6 tulpini din cele 10 studiate. În mediile cu 8 şi 9% alcool, „Ai” este depăşită ca potenţial fermentativ de către 4 tulpini dintre cele experimentate. În mediile de cultură cu 10 şi 11% alcool, cultura industrială este depăşită ca randament de către tulpinile „T10”, „2 Gl” şi „Bz”. În mediul de cultură cu 12% alcool, cultura industrială se dezvoltă slab, cu un randament în acid acetic sub 50 %. În cele mai multe variante de mediu, cultura industrială (Ai) a prezentat activitate fermentativă inferioară culturilor selecţionate de noi şi luate în studiu. 11. pH-ul final al tuturor probelor experimentale s-a încadrat între 3,19 – 3,44.

5.2. CERCETĂRI ASUPRA UTILIZĂRII VINULUI CA MATERIE PRIMĂ ÎN TEHNOLOGIA OŢETULUI – ÎN MOD SINGULAR ŞI ÎN ASOCIERE CU ALCOOL DE FERMENTAŢIE

Randamentul practic, %

5.2.1. Folosirea vinului alb ca materie primă în cinci variante de mediu de fermentare, cu şi fără adaos de alcool rafinat şi urmărirea dinamici şi eficienţei fermentaţiei. În acest studiu am utilizat pentru experimentări 3 tulpini de bacterii acetice (T10, Ai şi 2 Gl), care au fost cultivate pe medii de cultură pe bază de vin alb cu 6% alcool şi 0,68% g acid acetic/100 ml şi de vin suplimentat cu până la 10% alcool (prin adaos de spirt rafinat cu concentraţia de 95%). Probele cu mediu pasteurizat, în 6 variante de câte 200 ml, au fost inoculate cu câte 5% cultură de Acetobacter din fiecare tulpină de bacterii acetice dintre cele menţionate. După omogenizare, prin agitare, probele repartizate în vase de sticlă de aceleaşi dimensiuni cu dopuri de vată, au fost termostatate în condiţii identice la temperatura de 25oC timp de 49 de zile, perioadă în care s-a urmărit săptămânal aciditatea titrabilă (exprimată în acid acetic) şi, în final, în plus s-a determinat pH-ul şi alcoolul rezidual (figura 5.6). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

6% 7% 8% 9% 10%

T10

2 Gl

Ai Tulpina urmarita

Figura 5.6. Variaţia randamentului în funcţie de tulpina bacteriană folosită şi de concentraţia de alcool

19

Concluzii În urma analizei datelor prezentate anterior putem face următoarele observaţii: 1. În vin cu 6% alcool şi cu o aciditate titrabilă exprimată în acid acetic de 0,68 g/100 ml, toate cele 3 tulpini de bacterii acetice testate în acest experiment (T10, 2Gl, Ai), realizează fermentaţia acetică cu randamente în acid acetic cuprinse între 98,6 şi 98,8%. În acest mediu alcoolic bacteriile acetice aproape că metabolizează integral alcoolul din mediul de cultivare. 2. În varianta de mediu, în care vinul cu caracteristicile menţionate, este suplimentat cu 1% alcool din spirt, tulpinile de bacterii acetice T10 şi 2Gl, se comportă similar, finalizând fermentaţia acetică cu un randament practic de 94,7%. În acelaşi mediu de cultivare, tulpina industrială Ai, realizează fermentaţia cu un randament practic (ηp) de 89,3%. 3. În mediul de cultivare, în care vinul cu 6% alcool suplimentat cu 2% alcool din spirt, bacteriile acetice luate în studiu, realizează fermentaţia acetică cu un randament de 80,1 – 83,8%. Randamentul maxim fiind obţinut de tulpina 2Gl. Aciditatea oţetului în final, funcţie de agentul de fermentare, variază între 7,09 şi 7,38, iar alcoolul în final variază între 0,25 şi 0,5%. 4. În vin cu 6% alcool – suplimentat cu 3% alcool (din spirt), tulpinile de Acetobacter 2Gl şi T10 manifestă acelaşi potenţial fermentativ – realizând fermentaţia cu un randament de 75,1%, în timp ce tulpina industrială transformă alcoolul în acid acetic cu un randament de 67,3%. În acest din urmă caz, alcoolul rămas în mediu nefermentat a fost cu 1,4%, procent mai mare decât în cazul tulpinilor T10 şi 2Gl, pentru care alcoolul rezidual a fost de 0,6% şi respectiv de 0,65%. 5. În ultima variantă de mediu cu 10% alcool, în care vinul (cu 6% alcool) a fost suplimentat cu 4% alcool din spirt, fermentaţia se desfăşoară mai slab, rămâne mai mult alcool nefermentat între 1,7 şi 2,4%. Aciditatea maximă fiind obţinută cu tulpina 2Gl cu un randament de bioconversie de 64,4%. 6. În medii alcoolice obţinute din vin cu 6% alcool sau din vin suplimentat cu 1 şi 2% alcool din spirt – toate cele 3 tulpini de Acetobacter dau rezultate foarte bune sub raportul eficienţei, fiind obţinut oţet cu un randament în acid acetic cuprins între 80,5 şi 98,8%. Variaţia randamentului între aceste limite se datorează atât alcoolului din mediu, cât şi agentului de fermentare. Aciditatea oţetului, pH-ul şi alcoolul rămas în mediu se încadrează în limitele indicate de normale UE (aciditatea oţetului obţinut din vin să fie de minimum 6% acid acetic şi maximum 1,4% alcool). Pe de altă parte pH-ul de 3,7 se încadrează în limitele perceperii gustului acru al acidului acetic. 5.2.2. Studiul fermentaţiei în care conţinutul în alcool al mediului de fermentare provine în părţi egale din vin alb şi alcool rafinat, cu şi fără adaos de extract de porumb, şi acid acetic. Pentru acest studiu am preparat un mediu cu 8% alcool provenit în părţi egale din vin şi alcool rafinat (considerat mediu de bază), cu şi fără adaos de extract de porumb şi acid acetic. Probele în studiu (de câte 200 ml) au fost repartizate în recipienţi de sticlă şi inoculate în condiţii identice în toate cele 6 variante de mediu(V1 -V6), cu fiecare dintre cele 3 tulpini de bacterii acetice luate în experiment. Toate probele termostatate la 25oC au fost analizate săptămânal şi urmărite timp de 49 de zile. În experienţele efectuate pe medii de fermentaţie conţinând părţi egale de alcool din vin şi spirt, cu sau fără adaos de extract de porumb şi cu folosirea tulpinilor T10, Ai şi 2Gl, s-a demonstrat că prin creşterea conţinutului în alcool din mediul de fermentare, a nivelului de acid acetic (1% sau 2%), dar mai ales prin folosirea extractului de porumb se îmbunătăţeşte conţinutul de acid acetic după 49 de zile de fermentaţie. De asemenea, s-a evidenţiat faptul că tulpinile T10, Ai şi 2Gl s-au comportat cel mai bine, indiferent de compoziţia mediului de fermentare şi că numai vinul ca atare satisface cerinţele nutriţionale ale bacteriilor acetice.

20

Evoluţia vitezei de fermentare

3

T10

2,5

Ai 2Gl

2 1,5

g acid acetic/100 m

g acid acetic/100 m

Materialul grafic ilustrează dinamica acumulării de acid acetic în cazul utilizării fiecărui agent de fermentare şi de asemenea scoate în evidenţă condiţiile în care se obţin cele mai bune randamente în acid acetic (figurile 5.7-5.13). Dinamica acumulării de acid acetic în varianta de mediu V3

8

T10

7

Ai

6

2Gl

5 4 3

1

2 0,5

1

0

0 7

14

21

28

35

42

49 zile

7

14

21

Figura 5.7

T10 Ai

5

2Gl

4

49 zile

Dinamica acumulării de acid acetic în varianta de mediu V4

9

T10

8

Ai

7

2Gl

6 5 4

3

3

2

2

1

1 0

0 14

21

28

35

42

7

49 zile

14

21

28

35

49 zile

42

Figura 5.11

Figura 5.8 Curbele de fermentaţie realizate pe baza acumulării în timp a acidului acetic rezultat din fermentaţie Dinamica acumulării de acid acetic în varianta de mediu V2 T10

7

Ai

6

2Gl

5 4

Dinamica fermentaţiei acetice pentru varianta V4 de mediu (tulpinile de Acetobacter T10, Ai, 2Gl)

g acid acetic/100 m

7

g acid acetic/100 m

42


g acid acetic/100 m

g acid acetic/100 m

Curbele de fermentaţie reprezentate funcţie de acumularea în timp a acidului acetic rezultat din fermentaţie

6

8

35

Figura 5.10


7

28

Dinamica acumulării de acid acetic în varianta de mediu V5

9

T10

8

Ai

7

2Gl

6 5 4

3

3

2

2

1

1 0

0 14

21

28

35

42

7

49 zile

Figura 5.9 Dinamica fermentaţiei acetice pentru varianta V2 de mediu (tulpinile de Acetobacter T10, Ai, 2Gl)

14

21

28

35

42

49 zile

Figura 5.12 Dinamica fermentaţiei acetice pentru varianta V5 de mediu (tulpinile de Acetobacter T10, Ai, 2Gl)

Randamentul practic,%

7

100

Influenţa adaosului de 0,3% Ep asupra randamentului în acid acetic obţinut cu tulpinile de Acetobacter (T10, Ai, 2Gl) a

80

b

60 40 20 0 T10 Ai 2Gl Tulpinile de Acetobacter în cele 2 variante de mediu a: 8%alcool provenit din 1/2 din vin şi 1/2 din spirt;b: cu 8% alcool provenit din 1/2 din vin şi 1/2 din spirt şi cu 0,3% Ep

Figura 5.13

20

Concluzii 1. În vin cu 6% alcool şi cu o aciditate titrabilă exprimată în acid acetic de 0,68 g/100 ml, (varianta V1), toate cele 3 tulpini de bacterii acetice utilizate în acest experiment, fermentează acest mediu alcoolic cu randamente în acid acetic cuprinse între 94,5 şi 98,33%. Randamentul maxim este obţinut cu tulpina T10, urmată fiind de tulpinile 2Gl şi Ai. Pentru acest conţinut alcoolic, vinul satisface cerinţele nutritive ale bacteriilor acetice cu randamente maxime în procesul de fermentaţie acetică. 2. În mediul de fermentare V2, în care conţinutul alcoolic de 8% este obţinut în părţi egale din alcool rafinat şi din vin (cu 6% alcool şi cu 0,68% aciditate), bioconversia alcoolului în acest mediu mai sărac în elemente nutritive, se realizează cu randamente cuprinse între 68,8 şi 81,5%. Randamentul cel mai mare în acest caz este obţinut de tulpina de Acetobacter T10, urmând tulpinile Ai şi 2Gl. 3. În mediul de cultură V3 (cu aceeaşi compoziţie ca şi mediul V2, în plus suplimentat cu 0,3% extract de porumb) randamentele practice, ca urmare a plusului de elemente nutritive, sunt îmbunătăţite la toate cele 3 tulpini de Acetobacter folosite. Suplimentul nutritiv ajută cel mai mult tulpina 2Gl, căreia îi îmbunătăţeşte randamentul cu 19,1% în varianta V3 faţă de V2. 4. În varianta de mediu V4, care faţă de varianta V3, are un adaos de 1% acid acetic, bioconversia alcoolului se realizează cu randamente cuprinse între 80,9 şi 84,9%. Randamentul maxim este obţinut cu tulpina T10, urmată de tulpinile 2Gl şi Ai. În aceste condiţii de fermentaţie se constată o uşoară scădere a randamentului în cazul tulpinilor T10 şi 2Gl faţă de varianta de mediu V3. 5. În mediul de fermentare V5 cu 8% alcool provenit, de asemenea, în părţi egale din vin şi din alcool rafinat, şi cu 0,3% extract de porumb şi cu 2% acid acetic, se obţin randamente în acid acetic faţă de V4 mai scăzute, cuprinse între 62,9 şi 72,4%. Randamentul maxim este obţinut de tulpina T10, urmând tulpinile 2Gl şi Ai. Aciditatea iniţială mai crescută influenţează uşor defavorabil multiplicarea bacteriilor acetice şi procesul fermentativ. 6. În ultima variantă a mediului de fermentare V6 în care alcoolul 8% este obţinut în condiţii identice variantei V5, cu acelaşi adaos de acid acetic de 2%, dar fără extract de porumb, se constată că fermentarea se desfăşoară cu randamente mai scăzute, cuprinse între 58,9 şi 67,6% . Randamentul maxim este obţinut de către tulpina T10, urmată de tulpinile 2Gl şi Ai. 7. Tulpina T10, în toate variantele de mediu prezintă potenţial superior faţă de 2Gl şi Ai, în cadrul acestui set de experienţe. 8. pH-ul final al probelor se încadrează între 3,58 şi 3,76. 5.3. EXPERIMENTE PRIVIND STUDIUL FERMENTAŢIEI ACETICE ÎN VIN ROZE ŞI ROŞU – CU DIFERITE TULPINI DE BACTERII ACETICE În tehnologia de obţinere a oţetului vinurile roşii sunt mai puţin preferate, deoarece un conţinut ridicat în polifenoli (antociani, flavone, tanin) ar putea influenţa defavorabil creşterea şi activitatea bacteriilor acetice prin perturbarea schimburilor osmotice dintre celule şi mediu. În idea că un rol important îl poate avea şi natura bacteriilor acetice, am iniţiat acest studiu, folosind ca mediu de fermentare un vin roze, cu 6% alcool şi 0,7% aciditate exprimată în acid acetic. Agentul de fermentare l-a constituit fiecare dintre tulpinile de Acetobacter Ai, T10, 2Gl. Rezultatele acestui studiu sunt cuprinse în tabelul 5.43. Temperatura la care s-a desfăşurat experimentul a fost de 28oC.

21

Într-un alt experiment efectuat am folosit ca mediu de fermentare un vin roşu cu 9% alcool, cu 2% acid acetic şi cu 81,75 mg/100 ml antociani. La fermentarea vinului roze cu 6% alcool şi 0,7% aciditate, după 21 de zile de fermentare s-au obţinut între 6,61 – 6-68 g/100 ml acid acetic, în funcţie de tulpină, cu randamente practice bune (mai mari de 94%), aşa cum se vede în tabelul 5.43. La folosirea vinului roşu cu 9% alcool, cu adaos de 2% acid acetic şi circa 82 mg/l antociani s-au obţinut rezultate bune numai cu anumite tulpini de bacterii acetice, care prezintă rezistenţă mare la polifenoli (taninuri) şi antociani. Tulpinile T5 şi T6 (respectiv Acetobacter aceti subsp. aceti I şi II) au avut cea mai bună comportare, atât în ceea ce priveşte cantitatea de acid acetic formată, cât şi randamentul practic realizat. În acest vin a fost testată activitatea fermentativă a unui număr de 13 tulpini de Acetobacter, din care numai 6 au desfăşurat activitate oxidativă satisfăcătoare, dar şi aceasta diferită în funcţie de tulpina de bacterie acetică. Rezultatele obţinute au fost înscrise în tabelele 5.43 – 5.44 şi în figurile 5.14 – 5.17. Urmărind comportarea a treisprezece tulpini de Acetobacter aceti în vin roşu cu 9% alcool, 2% acid acetic, cu un conţinut mare de antociani 81,75 mg/l , s-a constatat că numai şase dintre tulpini (T5, T6, T8, ai, 3Gi, A10) au desfăşurat activitate fermentativă. Cu patru dintre tulpini, şi anume cu T5, T6, T8 şi Ai, s-a obţinut oţet cu 9 – 9,65% acid acetic, cu un randament cuprins între 77,8 – 85%. Cea mai eficientă activitate fermentativă a dovedit tulpina T5, urmând în ordine descrescătoare tulpinile de Acetobacter T6, T8, Ai, 3Gi şi A10. Celelalte şapte tulpini 2Gl, 3Gl, C2, C3, S, Bz şi T10, mai sensibile la conţinutul mare în antociani ai vinului, care pe lângă tanin poate să influenţeze schimburile osmotice de la nivelul membranelor celulare, nu au prezentat activitate fermentativă. În vinul roze, cu un conţinut mai mic de antociani (200 mg/l), tulpinile T10 şi 2Gl au avut activitate fermentativă foarte bună, realizând oxidarea alcoolului cu un randament practic de 95 – 96,5%. Aceste două tulpini, după cum s-a observat, nu s-au putut dezvolta în vin roşu. Este de remarcat că tulpina de Acetobacter aceti orleansis (Ai) este mai tolerantă la polifenoli, prezentând activitate fermentativă bună, atât în vin roze, cât şi în vin roşu.

Ai

6

T10

5

2Gl

4 3 2 1 0 initial

7 zile

14 zile

21 zile

Durata fermentatiei, zile

Figura 5.14.

Randam entul practic al ferm entatiei acetice in vinului roze 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Ai

T10

Figura 5.15.

10

Ai

9

A10

8

3Gi

7 6

T5

5

T6

4

T8

3 2

Dinamica acumulării de acid acetic la fermentarea vinului roze (cu 81,75 mg/l antociani)

Randament practic, %

Randamentul practic al fermentaţiei acetice în vin roze

Aciditatea g acid acetic&100 ml

Aciditatea, g acid acetic/100ml

Dinamica fermentatiei acetice in vin roze 7

2Gl Tulpinile de Acetobacter aceti

1 0 initial

7 zile

14 zile

21 zile Durata fermentatiei , zile

Figura 5.16. Dinamica acumulării de acid acetic la fermentarea vinului roşu

Randamentul practic, %

Figura 5.17.

24

Randamentul practic al fermentaţiei acetice în vin roşu

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Ai

A10

3Gi

T5

T6 T8 Tulpina de Acetobacter

Concluzii În urma analizei datelor prezentate mai sus desprindem următoarele concluzii: 1. În cazul folosirii tulpinilor de Acetobacter Ai, T10, 2Gl, inoculate în proporţie de 5% în vin roze pasteurizat cu 6% alcool, 0,7% aciditate, exprimată în acid acetic şi 20 mg/l antociani, fermentaţia acetică s-a desfăşurat în condiţii similare, remarcându-se numai uşoare diferenţe între tulpinile de bacterii acetice testate. 2. Tulpina de Acetobacter T10 a condus la obţinerea unui oţet cu un conţinut de acid acetic de 6,7% şi un randament practic de bioconversie, de 95,0%. 3. În aceleaşi condiţii de fermentare, prin folosirea tulpinii de Acetobacter 2Gl s-a obţinut un oţet cu 6,68% acid acetic şi un randament de transformare de 96,5%. 4. Tulpina de Acetobacter Ai inoculată în acelaşi mediu de fermentare a condus la obţinerea unui oţet cu 6,61% acid acetic şi la un randament practic de 94,33%. 5. Tulpinile de Acetobacter Ai, A10, 3Gi, T5, T6, şi T8 au manifestat o mai mare rezistenţă la polifenoli, atunci când au fost inoculate în vin roşu. 6. Conţinutul de 81,75 mg/100 ml antociani al vinului roşu nu a exercita influenţă de inhibare a celor şase tulpini de bacterii acetice care au desfăşurat activitate fermentativă în acest vin. 7. Cu patru din cele şase tulpini de Acetobacter dezvoltate în vin roşu, se obţine oţet cu acidităţi de 9 – 9,65% acid acetic. 8. Tulpinile de Acetobacter T5 şi T6 sunt cele mai indicate în fermentarea vinului roşu. 9. Tulpina de Acetobacter T5 a condus la obţinerea unui oţet cu 9,65% acid acetic şi a unui randament practic de 85%, atunci când mediul de cultură a fost reprezentat de vinul roşu (cu caracteristicile menţionate).

5.4. INFLUENŢA UNOR SĂRURI DE AMONIU FOLOSITE SINGULAR SAU MIXT ÎN DIFERITE MEDII DE CULTIVARE A BACTERIILOR ACETICE 5.4.1. Influenţa fosfatului de amoniu folosit în mod singular sau în asociere cu extractul de porumb în mediu cu 7% alcool rafinat şi 2% acid acetic, fermentat cu fiecare dintre tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8, Bz, 3Gi şi S (în condiţii puţin modificate). În acest set de experienţe, în mediul cu 7% alcool (din alcool rafinat) şi 2% acid acetic, s-a urmărit activitatea fermentativă a tulpinilor de Acetobacter (T5, T6, T8, Bz, 3Gi) la diferite niveluri de adaos de fosfat de amoniu (F.a.) şi de fosfat de amoniu în asociere cu extractul de porumb (E.p.). Tulpina S, fiind considerată cu un potenţial fermentativ superior din experimentele anterioare, a fost experimentată şi sub acest aspect, al adaosului de nutrienţi în mediul cu 8% alcool şi 3% acid acetic. Toate probele de mediu de cultură, repartizate câte 200 ml în recipienţi de sticlă de aceleaşi dimensiuni, au fost inoculate cu 5% cultură de bacterii acetice şi termostatate la 25oC. În aceste condiţii s-a urmărit activitatea bacteriilor acetice prin evoluţia acidităţii ca rezultat al oxidării alcoolului, în toate variantele de mediu, iar , în final, s-a determinat alcoolul rezidual şi pH-ul oţetului obţinut. Concluzii

24

¾ Doza de 0,2% fosfat de amoniu, în mediul de cultivare cu 7% alcool şi 2% acid acetic, permite o slabă dezvoltare a bacteriilor acetice luate în studiu (T5, T6, T8, Bz, 3Gi), care realizează în mediul de fermentare, în funcţie de tulpină, 0,5 – 2% acid acetic. Acest nutrient mineral este mai bine metabolizat de tulpina de Acetobacter T8 şi cel mai slab tolerat de tulpina T5. ¾ Adaosul de 0,3% fosfat de amoniu, în acelaşi mediu de bază, conduce la rezultate mai slabe comparativ cu adaosul de 0,2% fosfat de amoniu. În aceste condiţii se realizează prin bioconversia alcoolului 0,3 - 1,9% acid acetic, cu valoarea maximă obţinută tot de tulpina de Acetobacter T8. ¾ Suplimentul de 0,2% fosfat de amoniu împreună cu 0,3% extract de porumb prezintă influenţă pozitivă asupra activităţii fermentative a tulpinilor de Acetobacter T6 şi T8, cu o creştere a acidităţii de 0,28 – 0,8% acid acetic, în timp ce tulpinile de Acetobacter T5 şi 3Gi sunt influenţate defavorabil, caz în care scade aciditatea cu 0,5 – 0,7% faţă de cea realizată numai cu 0,3% extract de porumb. ¾ Extractul de porumb folosit ca nutrient în concentraţie de 0,5% satisface mai bine necesităţile nutritive ale bacteriilor acetice, în comparaţie cu adaosul de 0,3%, faţă de care se constată o creştere a acidităţii cu până la 0,8% acid acetic. Adaosul de 0,5% extract de porumb în mediul de fermentare asigură obţinerea unui oţet cu 6 – 6,2% acid acetic de către tulpinile de Acetobacter T5, Bz, 3Gi. ¾ În variantele de mediu în care suplimentul nutritiv este de 0,2% fosfat de amoniu şi 0,5% extract de porumb, funcţie de tulpina folosită ca agent de fermentare, aciditatea obţinută în final variind între 5,8 – 6,2 g acid acetic / 100 ml. Dacă aceste acidităţi sunt comparate cu cele obţinute numai cu adaos de extract de porumb, se observă că fosfatul de amoniu 0,2% nu influenţează activitatea fermentativă a tulpinilor de Acetobacter T5, T8 şi Bz, aduce un plus de 0,8% acid acetic în cazul tulpinii de Acetobacter T6 şi o uşoară influenţă negativă asupra tulpinii de Acetobacter 3Gi. ¾ Adaosul de 0,3% fosfat de amoniu împreună cu 0,3% extract de porumb sau cu 0,5% extract de porumb influenţează negativ activitatea bacteriilor acetice, caz în care se obţin acidităţi finale sub nivelul acidităţilor realizate numai de extractul de porumb. ¾ În mediul de fermentare cu 7% alcool şi 2% acid acetic, cu adaos de nutrient în 8 variante, numai în varianta cu 0,5% extract de porumb se poate obţine oţet cu 6 – 6,2% acid acetic, astfel tulpinile de Acetobacter T5 şi T8 realizează un oţet de 6% acid acetic, tulpinile de Acetobacter Bz şi 3Gi un oţet de 6,2% acid acetic. Oţetul obţinut cu tulpina T6, în toate variantele de mediu, are aciditate sub 6% acid acetic. ¾ Tulpina de Acetobacter S asimilează mai eficient fosfatul de amoniu comparativ cu celelalte tulpini studiate. În mediul de cultivare cu 8% alcool, 3% acid acetic şi 0,2% fosfat de amoniu, se poate obţine oţet cu 6,1% acid acetic, dar cu un randament scăzut. În varianta cu 0,2% fosfat de amoniu adaosul de 0,3 sau 0,5% extract de porumb aduce o uşoară influenţă pozitivă. În cazul tulpinii S se remarcă varianta cu 1% extract de porumb, cu care se obţine oţet cu 9,8% acid acetic, cu un randament convenabil de peste 70%. ¾ În toate variantele adaosului de nutrienţi în mediul de bază cu 7% alcool şi 2% acid acetic, fermentat cu fiecare dintre tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8, Bz, 3Gi, rămâne alcool neoxidat, în cantitatea cea mai mică în varianta cu 0,5% extracte de porumb şi în cantitatea cea mai mare în varianta cu 0,3% fosfat de amoniu. ¾ pH-ul probelor de oţet în toate variantele cu adaos de nutrient, pentru toate cele cinci tulpini de Acetobacter studiate variază în limitele 3 – 4,12, cu valorile cel mai scăzute la probele cu 0,5% extract de porumb şi cu valorile cele mai mari la probele cu 0,3% fosfat de amoniu. ¾ În acest set de experienţe cu mediul de bază format din 7% alcool şi 0,2% acid acetic, fermentat cu tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8, Bz şi 3Gi, după adaosul de nutrimente, se obţin variante în care se produce oţet cu 6 – 6,2% acid acetic, însă randamentul practic nu depăşeşte 60%.

25

5.4.2. Studiul influenţei fosfatului de amoniu, sulfatului de amoniu, extractului de drojdie, nutrimenţilor utilizaţi separat sau în amestec în mediul de bază cu 5% alcool şi 3% acid acetic, ca şi în mediul de bază cu 6% alcool şi 2% aciditate, asupra activităţii fermentative a tulpinilor de Acetobacter T5, T6, T8, şi T10 În acest set de experienţe s-a folosit mediul de bază cu 5% alcool (din spirt rafinat) şi 3% acid acetic, care a fost suplimentat cu fiecare dintre următorii nutrimenţi 0,5% extract de drojdie, 0,2% fosfat de amoniu, 0,1% % fosfat de amoniu + 0,1% sulfat de amoniu şi 0,2% sulfat de amoniu. Mediul îmbogăţit cu nutrimenţii menţionaţi a fost repartizat în recipienţi de sticlă de aceleaşi dimensiuni câte 200 ml în fiecare recipient. După inocularea cu 5% bacterii acetice, în mod separat din fiecare tulpină de acetobacter T5, T6, T8 şi T10, toate probele au fost termostatate la 25oC şi urmărită săptămânal dinamica acidităţii titrabile. În final s-a determinat alcoolul rezidual şi pH-ul oţetului. Tot în cadrul acestui set de experienţe a fost folosit şi mediul cu 6% alcool şi 2% acid acetic, suplimentat, în mod separat, cu 0,1% fosfat de amoniu + 0,1% sulfat de amoniu, cu 0,5% extract de drojdie şi cu 1% extract de drojdie. Experimentele au fost efectuate folosind ca agent de fermentare tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8, şi T10. După inocularea mediilor cu 5% bacterii acetice, probele, repartizate (câte 200 ml) în recipienţi de sticlă de aceleaşi dimensiuni, au fost termostatate la 25oC şi urmărită evoluţia acidităţii ca rezultat al oxidării alcoolului. În final s-a determinat alcoolul rezidual şi pH-ul oţetului. Concluzii ¾ În mediul cu 5% alcool şi 3% acid acetic, suplimentat cu 0,5% extract de drojdie, dintre cele patru tulpini de Acetobacter T5, T6, T8, şi T10 folosite ca agenţi de fermentare, numai două dintre tulpini (T6 şi T10) au produs oţet cu 6 şi peste 6% acid acetic. Cu tulpina T10 inoculată în mediul cu 5% alcool, 3% acid acetic şi 0,5% extract de drojdie s-a obţinut oţet cu 7,4% acid acetic, cu un randament practic de 88%. ¾ În mediul de fermentare cu 5% alcool, 3% acid acetic şi 0,2% fosfat de amoniu cu trei din cele patru tulpini (şi anume cu T6, T10 şi T8) se obţine oţet cu 6 – 6,2% acid acetic, cu un randament practic cuprins între 60 – 64%. ¾ În mediul de fermentare cu 5% alcool, 3% acid acetic, suplimentat cu 0,1% fosfat de amoniu şi 0,1% sulfat de amoniu, numai în cazul tulpinilor T10 şi T8 se obţine oţet cu peste 6% acid acetic. Cu tulpina T10 se obţine oţet cu 6,9% acid acetic, cu un randament practic de 78%. ¾ În mediul de fermentare cu 5% alcool, 3% acid acetic, cu adaos de 0,2% sulfat de amoniu, dintre cele patru tulpini de Acetobacter testate, numai cu T10 s-a obţinut oţet cu peste limita impusă de 6% acid acetic, şi anume 6,2% acid acetic realizat cu un randament practic de 64%. ¾ În mediul de fermentare cu 6% alcool, 2% acid acetic suplimentat cu 0,1% fosfat de amoniu şi 0,1% sulfat de amoniu cultura de Acetobacter T5 prezintă o slabă activitate fermentativă. În acelaşi mediu de cultivare, tulpinile T6 şi T8 se dezvoltă mai bine, realizând o aciditate de 5,2 – 5,7% acid acetic, dar nu suficientă. Cultura de Acetobacter T10, tot în acest mediu de dezvoltare, este mai activă, mai eficientă, realizând o aciditate de 6,8% acid acetic, cu un randament practic de 80%. ¾ În mediul de fermentare cu 6% alcool, 2% acid acetic, îmbogăţit cu 0,5% extract de drojdie, în funcţie de tulpina de Acetobacter folosită se obţine oţet cu 5,6 – 6,74% acid acetic. Cu tulpina T5 se obţine oţet cu 6% acid acetic, cu randamentul practic de 66,7%. În acelaşi mediu de fermentare tulpina T10 produce oţet cu 6,74% acid acetic, cu un randament practic de 79%. ¾ În mediul cu 6% alcool, 2% acid acetic, cu un adaos de 1% extract de drojdie, tulpinile de Acetobacter T5, T6 şi T10 sunt cele mai eficiente, realizând acidităţi cuprinse între 6,2 – 7% acid acetic, cu un randament practic de 70 – 83,3%.

26

Tulpina T10 realizează aciditatea de 7% acid acetic şi un randament practic de 83,3%.

CAPITOLUL VI. EXPERIMENT INDUSTRIAL ÎN SISTEM CU ACETATOR FRINGS Cu orientarea dobândită în urma rezultatelor obţinute din numeroasele experimente de laborator efectuate cu tulpini diferite de Acetobacter, în medii de cultivare diferite, obţinute din alcool de fermentaţie rafinat, din vin plus alcool rafinat sau numai din vin alb sau vin roşu, am realizat un experiment industrial la Fabrica de oţet – Târgu Bujor, judeţul Galaţi. Cu acordul şi bunăvoinţa conducerii întreprinderii am efectuat cercetarea pe un acetator cu talaş, de capacitate 8 000 litri, utilizând materia primă de care a dispus fabrica, vin alb pichet cu 8,6% alcool, 0,7 g/l aciditate totală (exprimată în acid acetic) şi pH 4,5. Pentru această materie primă am decis să folosesc ca agent de fermentare tulpina de Acetobacter T10, care a manifestat potenţial fermentativ bun în condiţii apropiate de materia primă destinată experimentului industrial. Dacă însă, materia primă ar fi fost vin roşu, mai indicată, ca agent de fermentare, ar fi fost tulpina de bacterii acetice T5.

6.1. Pregătirea inoculului de bacterii acetice În studiul efectuat am folosit medii preparate din vin alb, vin alb şi spirt şi numai din spirt, cu şi fără adaos de nutrimenţi (extract de drojdie sau extract de porumb) utilizaţi în diferite proporţii, menţionate în tabelul 6.1, iar inoculul folosit pentru însămânţarea mediilor a fost de 10 şi 30%. În scopul producerii de biomasă (pentru a servi ca inocul) s-a experimentat cultivarea tulpinii Acetobacter aceti orleansis (T10), în instalaţia cu aerare în sistem submers, în varianta mediului de cultivare în lichid hidroalcoolic cu 6% alcool, provenit din spirt rafinat, cu adaos de nutriment în variante cu 0,1 şi 0,5% extract de porumb şi cu 0,5% extract de drojdie. Adaosul de 0,5% extract de drojdie ca nutriment în lichidul hidroalcoolic, creşte biomasa de bacterii acetice (stabilită numeric) cu 3,8% faţă de biomasa realizată cu 0,1% extract de porumb. Adaosul de 0,5% extract de porumb în lichidul hidroalcoolic, evident stimulează mai mult procesul de multiplicare al bacteriilor acetice şi, ca urmare, în aceste condiţii biomasa obţinută creşte cu 33,3% faţă de cea realizată cu 0,1% extract de porumb şi cu 28,4% în comparaţie cu biomasa obţinută în varianta adaosului de 0,5% extract de drojdie. În concluzie, extractul de porumb (0,5%) este mai convenabil în producerea de biomasă deoarece, prin compoziţia sa, favorizează metabolismul plastic al celulelor de bacterii acetice cu eficienţă în procesul de multiplicare şi, în plus, este convenabil şi sub aspect economic, fiind mai ieftin.

27

Tabelul 6.1. Evoluţia procesului de multiplicare a bacteriilor acetice pe diferite medii de cultivare şi cantităţi diferite de inocul

Mediu cu 6% alcool şi 2% aciditate (spirt rafinat)

Mediu cu 6% alcool şi 2% aciditate (vin alb)

Mediu cu 6% alcool şi 2% aciditate (250 ml vin alb şi 250 ml spirt rafinat)

Caracteristicile mediului de cultivare

Variantele de mediu

Inocul de bacterii acetice

Evoluţia procesului de multiplicare a bacteriilor acetice (prin stabilirea numărului de celule/ml) iniţial

la 12 ore după 24 oredupă 48ore după 72ore după 96ore după 120 ore după 144 ore după 168 ore

V1: cu nutriment 10% inocul 19x106 21x106 0,1% extract de drojdie din cultura

56x106

58x106

59x106

65x106

96x106

1,57x108

V2: cu nutriment Acetobacter 19x106 32x106 0,3% extract de drojdie aceti

84x106

96x106

98x106

1,02x108 1,07x108

1,3x108

1,84x108

orleansis 19x106 44x106 (T10)

96x106

1,01x108 1,12x108 1,20x108 1,30x108

1,50x108

2,12x108

1,10x108 1,28x108 1,30x108 1,33x108 1,34x108

1,35x108

1,36x108

1,25x108 1,38x108 1,43x108 1,47x108 1,50x108

1,55x108

1,62x108

1,31x108 1,53x108 1,60x108 1,63x108 1,75x108

1,85x108

1,98x108

1,11x108 1,36x108 1,40x108 1,54x108 1,65x108

1,81x108

1,93x108

1,20x108 1,58x108 1,70x108 1,83x108 1,95x108

2,05x108

2,30x108

1,28x108 1,78x108 1,90x108 2,13x108 2,35x108

2,48x108

2,60x108

1,22x108 1,30x108 1,33x108 1,35x108 1,60x108

1,72x108

2,18x108

de V2’’: cu nutriment 6 Acetobacter 94x10 0,1% extract de porumb

99x106 1,21x108 1,29x108 1,34x108 1,40x108 1,54x108

1,82x108

2,10x108

orleansis V3’’: cu nutriment 94x106 (T10 0,5% extract de porumb

99x106 1,40x108 1,52x108 1,70x108 2,00x108 2,22x108

2,70x108

2,75x108

de

V3: cu nutriment 0,5% extract de drojdie

V1’ 94x106 98x106 V2’: cu nutriment 94x106 1,0x108 0,1% extract de porumb 30% inocul din cultura V3’: cu nutriment 94x106 98x106 de 0,3% extract de porumb Acetobacter V4’: cu nutriment 94x106 98x106 aceti 0,1% extract de drojdie orleansis V5’: cu nutriment (T10) 94x106 98x106 0,3% extract de drojdie V6’: cu nutriment 94x106 99x106 0,5% extract de drojdie V1’’: cu nutriment 30% inocul 94x106 98x106 0,5% extract de drojdie din cultura

75x106

aceti

28

6.2. Rezultatele cercetării industriale În cadrul cercetării industriale am urmărit 5 şarje de fabricaţie a oţetului cu interes, privind evoluţia procesului fermentativ asupra duratei ciclului de fermentare şi a randamentului în acid acetic. În toate ciclurile de fermentare am folosit ca materie primă acelaşi vin alb pichet. În prima şarjă, peste 2 000 litri oţet cu 8,1% acid acetic s-a adăugat 5 600 litri vin alb pichet cu 8,6% alcool şi 50 litri cultură selecţionată de Acetobacter – cultivată şi înmulţită în prealabil în acelaşi vin. În ciclurile următoare, s-au menţinut aceleaşi proporţii între oţet şi vin, variind puţin aciditatea iniţială a oţetului rămas în acetator, care să asigure aciditatea iniţială a mediului de fermentare la fiecare şarjă. Astfel că, după omogenizarea mediului alcoolic din acetator, aciditatea iniţială a variat între 2,24 şi 2,31% acid acetic (g/100 ml), în timp ce alcoolul mediului de fermentare a fost acelaşi pentru toate ciclurile de fermentare şi anume 6,3%vol. Aerarea s-a făcut în condiţiile practicate în întreprindere, stabilită ca optimă prin deschiderea şi obturarea orificiilor laterale ale acetatorului. Vinul a fost introdus în acetator fără o încălzire prealabilă. Temperatura de fermentare s-a controlat zi şi noapte la cele 3 nivele ale acetatorului şi s-a încadrat în limitele 24 – 340C. Durata ciclului de fermentare până la începerea experimentului la acetatorul cu care am efectuat cercetarea a fost de 8 zile, iar aciditatea oţetului rămas ca zestre în acetator a fost de 8,1g acid acetic / 100 ml. În sistemul dinamic al experimentului, s-au efectuat analize de aciditate, alcool şi pH. Dinamica acidităţii fiecărui ciclu de fermentare se poate urmări în tabelul 6.2. În tabelul 6.3. sunt înscrise gradele acetice obţinute în cadrul celor 5 cicluri de fermentare, randamentul practic şi durata fiecărui ciclu de obţinere a oţetului. În medie, ciclul de fermentaţie realizat în cadrul experimentului industrial este de 125 ore. Din datele prezentate se poate constata că ciclul de fermentare (C4) în care ponderea culturii selecţionate, viteza şi temperatura de fermentare au crescut, are ca efect reducerea duratei de fermentare la numai 4 zile, dar cu unele pierderi de alcool prin evaporare, care scad randamentul practic de la 76,30 la 72,56%.

Ciclul de fermentare

Tabelul 6.2 Evoluţia în timp a acidităţii în acetatorul cu capacitatea utilă de 7 700 litri (EXPERIMENT INDUSTRIAL)

C1 C2 C3 C4 C5

Aciditatea titrabilă g acid acetic/100 ml

Caracteristici vin

mediu de fermentare

Alcool 8,6% Alcool 6,3% vol. vol. Aciditate 0,7 g Aciditate 2,24acid acetic/100 2,31 g acid ml acetic/100 ml pH 4,5 pH 4,5

Alcool pH rezidual % oţet

iniţial

După 1 zi

2

3

4

5

6

2,24 2,31 2,29 2,26 2,24

5,1 5,2 5,2 5,15 5,1

6,85 6,27 7,19 8,06 6,72

7,54 6,85 7,42 8,35 7,56

8,23 7,48 7,54 8,50 7,77

8,80 8,17 8,64

8,70 8,70

8,55

0,1

3,25

29

Grade acetice realizate / ciclu de fermentare

Randamentul de fermentaţie, %

C5

49 856

C4

48 564

C3

99,2

96,76

6,34

2,29

8,74

0,1

49 020

C2

5 600 l vin cu 8,6% alcool şi 2 000 l oţet cu 8,5oacetice 5 600 l vin cu 8,6% alcool şi 2 000 l oţet cu 8,5oacetice 5 600 l vin cu 8,6% alcool şi 2 000 l oţet cu 8,5oacetice 5 600 l vin cu 8,6% alcool şi 2 000 l oţet cu 8,5oacetice 5 600 l vin cu 8,6% alcool şi 2 000 l oţet cu 8,5oacetice

Ciclul de fermentare de la 8 zile (192 97,50 de ore) se reduce la 125 de ore

(4 zile)

6,34

2,26

8,50

0,1

47 424

C1

Caracteristici mediu de Compoziţia Durata Durata medie fermentare plămezii de ciclului de a unui ciclu fermentare o fermentare de fermentare oalc. ac din acetator

94,33

(5 zile)

6,34

2,24

8,55

0,1

47 956

Ciclul experimental

Tabelul 6.3 Caracteristicile oţetului şi randamentele de bioconversie pe cicluri de fabricaţie în acetatorul industrial

95,34

Caracteristici oţet finit o

ac

o

alc.

(5 zile)

6,34

2,24

8,80

0,1

(6 zile)

6,34

2,31

8,70

0,1

(5 zile)

125 de ore (sunt incluse şi operaţiile de încărcaredescărcare ale acetatorului)

Reducerea ciclului de fermentare prin aportul culturii selecţionate

Calcularea randamentelor de fabricaţie Randamentul teoretic este dat de cantitatea teoretică de acid acetic rezultă din reacţia stoichiometrică de conversie a alcoolului etilic în acid acetic: CH3–CH2–OH + O2 = CH3–COOH + H2O 46 g 32 g 60 g 18 g

Prin urmare din 46 Kg alcool şi 32 Kg oxigen se obţin 60 Kg acid acetic şi 18 Kg apă. Împărţind totul la 46 (greutatea moleculară a alcoolului etilic), vom avea: 1Kg alcool+0,696 Kg oxigen=1,304 Kg acid acetic+0,392 Kg apă 60 În mod teoretic 1 g de alcool etilic conduce la = 1,3 g acid acetic. 46 Calcularea randamentului teoretic este următoarea: din 100 g alcool etilic se obţin, teoretic, 130 g acid acetic. Dintr-un litru de alcool, care cântăreşte 0,794 Kg, rezultă 1,036 Kg acid acetic, iar dintrun Kg alcool absolut, ar trebui să rezulte teoretic 1,304 Kg acid acetic. 1l alcool (0,794 Kg)+0,553 Kg oxigen =1,035 Kg acid acetic+0,311Kg apă

30

În practică randamentul este cu 15–20% mai mic decât cel teoretic, datorită pierderilor de alcool etilic, aldehidă acetică şi acid acetic prin volatilizarea acestora sau prin participarea lor la reacţii secundare (de esterificare). Randamentul practic (ηp) al acetatoarelor Frings este situat între 75% (dacă acetatorul nu este prevăzut cu condensator, iar condiţiile de funcţionare ale aparatului sunt defectuoase) şi 90% din randamentul teoretic (dacă acetatorul este prevăzut cu condensator, iar condiţiile de funcţionare sunt corespunzătoare). Randamentul practic în cazul acetatoarelor fără umplutură (care funcţionează prin fermentaţie submersă) este de 98% din randamentul teoretic. Calcularea randamentului practic Se va lua ca exemplu şarja (C1) în care oţetul fabricat a avut tăria acetică de 8,8% aciditate, deci şi oţetul îmbibat în talaş a avut aceeaşi concentraţie. S-a introdus vin cu tărie alcoolică de 8,6% alcool, în cantitate de 5 600 l şi 2 000 l oţet cu 8,5o aciditate. S-au obţinut grade alcoolice/ciclu de fermentare astfel: % alcoolic iniţial x cantitatea de lichid alcoolic → o 8,6 x 7 600 = 65 360 grade alcoolice/ciclu de fermentare La sfârşitul fermentaţiei s-au obţinut grade acetice/ciclu de fermentare calculate astfel: (aciditatea finală – aciditatea iniţială) x cantitatea de lichid alcoolic din acetator → (8,8-2,24) x 7 600 = 49 856 grade acetice/ciclu de fermentare Împărţind gradele acetice ale oţetului rezultat la gradele alcoolice cuprinse în materia primă şi înmulţind cu 100, se obţine randamentul practic de : 49 856 ηp= ⋅ 100 = 76,3% 65 360 Randamentul de obţinere a acidului acetic, ( η f) în faza de fermentaţie, se calculează cu relaţia: Cp ηf = ⋅ 100 Ct în care: C p = cantitatea de acid acetic obţinută practic, [g]; C t = cantitatea teoretică de acid acetic, [g]. Randamentul de fermentaţie calculat pentru primul ciclu de fermentaţie este următorul: 76.3 ⋅ 130 = 99,2% ηf = 100 Rezultatele randamentelor practic, teoretic şi de fermentaţie obţinute pe fiecare ciclu de fermentaţie sunt prezentate în tabelul 6.4: Tabelul 6.4. Randamentele obţinute Ciclul de fermentare Randamentul Randamentul Randamentul de practic, (η p), % teoretic, (η t), % fermentare, (η f), % C1 76,30 130 99,20 C2 74,43 130 96,76 C3 75,00 130 97,50 C4 72,56 130 94,33 C5 73,34 130 95,34 Randamentele medii 74,33 130 96,63 pe cele 5 cicluri de fermentare După cum se poate observa din tabelul prezentat anterior, randamentele obţinute în fermentatorul cu talaş (Frings) se încadrează în valorile prezentate în literatura de specialitate.

31

Aciditatea, g acid acetic/100 ml

În figura 6.1 se poate urmări evoluţia procesului de fermentaţie în funcţie de ponderea în creştere a culturii selecţionate, prin dinamica vitezei de fermentaţie. 9 C1 C2

8

C3 C4

7

C5

6

5

4

3

2 1

2

3

4

5

6

7

Durata ciclului de fermentare, zile

Figura 6.1. Dinamica fermentaţiei acetice pentru cele cinci cicluri ale experimentului industrial Se subliniază faptul că, la fiecare dintre cele 5 cicluri de fermentaţie, s-a adăugat cantitatea menţionată de 50 litri cultură selecţionată de bacterii acetice (tulpina T10). Concluzii Oţetul obţinut în cadrul experimentului industrial, are culoare plăcută, a fost limpede şi nu a necesitat cleire cu bentonită. Aciditatea oţetului de 8,5 – 8,8% acid acetic cu un pH de 3,2 – 3,25 corespunde normelor europene de calitate. Randamentul practic cu care se obţine oţetul cu participarea culturii selecţionate, de 99 – 103% a fost foarte bun şi a evidenţiat o cultură de bacterii acetice activă şi o tehnologie corect aplicată. Ca urmare a utilizării culturii selecţionate de Acetobacter la fiecare ciclu de fermentare durata şarjei se reduce în medie de la 192 la 125 de ore (fiind incluse şi operaţiile de încărcare-descărcare), desigur cu consecinţe asupra creşterii productivităţii. Cultura de Acetobacter izolată, selecţionată, studiată şi utilizată în experimentul industrial, fără îndoială a demonstrat calităţi fermentative superioare în biotehnologia obţinerii oţetului.

32

CAPITOLUL VII. PROIECTAREA ŞI STABILIREA PARAMETRILOR DE FUNCŢIONARE A UNEI INSTALAŢII DE PRODUCERE A OŢETULUI ÎN SISTEM SUBMERS 7.1 Prezentarea instalaţiei de laborator cu funcţionare în sistem submers Instalaţia sub formă cilindro-conică a fost confecţionată din oţel inoxidabil, fiind prevăzută cu un agitator cu rotaţie variabilă, între 10-60 rot/min. Axul şi paleta agitatorului au fost realizate din sticlă ca, de altfel şi barbotorul de aer. Axul agitatorului se cuplează la exterior la un motoraş electric al unui agitator cu un cablu flexibil. Schimbătorul de căldură montat în fermentator s-a confecţionat din ţeavă de oţel inox cu diametrul ø = 6 mm, ramura de intrare şi ieşire fiind legate la un termostat cu termometru de contact, cu posibilitate de menţinere constantă a apei din termostat la 25100oC. Legătura dintre intrare şi ieşire a schimbătorului de căldură din fermentator şi termostat s-a făcut prin tuburi de plastic flexibile. Într-un orificiu situat pe capacul fermentatorului s-a montat un refrigerent răcit cu apă de la robinet, cu scopul de a condensa vaporii de acid acetic în vederea recuperării acestora. Capacul fermentatorului s-a fixat etanş de capac cu ajutorul unor şuruburi, iar etanşeitatea a fost asigurată de o garnitură de material plastic acido-rezistentă. Aerarea agitatorului s-a realizat cu ajutorul unei pompe de aer folosită în mod curent pentru acvarii. Verificarea temperaturii lichidului în fermentare s-a făcut cu ajutorul unui termometru cu mercur, cu limitele de măsurare cuprinse între 0 şi 50 oC. Schiţa de principiu şi vederea generală a instalaţiei de laborator este arătată în figurile 7.1 şi 7.2 (anexa 3).

7.2. Funcţionarea instalaţiei de laborator Iniţial se pregăteşte soluţia hidroalcoolică (formată din vin şi/sau soluţie hidroalcoolică, care se acidulează cu acid acetic până la aciditatea de 2 g%). Soluţia se inoculează cu cultură de bacterii acetice în proporţie de 10%. Amestecul realizat se introduce în fermentator (pentru aerare) printr-un orificiu prevăzut cu capac, cu ajutorul unei pâlnii de sticlă, orificiu care se închide apoi cu un dop de material plastic. Instalaţia este pusă în funcţiune prin conectarea agitatorului pompei de aer şi a termostatului la reţeaua electrică de 220 V / 50 Hz. Înainte de începerea fermentaţiei acetice temperatura se reglează şi se menţine la o 25 C, iar după declanşarea fermentaţiei acetice, care este un proces exotermic (se degajă 490 kJ/mol alcool etilic absolut), temperatura se menţine în limitele 27-30oC prin intermediul schimbătorului de căldură cuplat la termostat. La terminarea fermentaţiei se extrage 90 sau 80% din oţetul obţinut, iar restul de 10, respectiv 20% constituie cultura de producţie pentru o nouă şarjă. Fermentaţia acetică se desfăşoară în prezenţa oxigenului din aer.

7.3. Rezultate obţinute prin cultivarea bacteriilor acetice cu aerare, în sistem submers, în instalaţia proprie Pentru a dispune de bacteriile acetice, necesare pentru inocularea mediilor de cultură, în vederea realizării obiectivelor tezei de doctorat, am folosit instalaţia proprie de fermentare în sistem submers cu aerare (caracteristicile prezentate în capitolele 7.1 şi 7.2). Obţinerea culturii pure de bacterii acetice în instalaţia respectivă s-a realizat într-un timp mai scurt, decât în sistem static (până s-a ajuns la concentraţia în celule de 108 / ml).

33

celulex1000000 / ml

În sistemul discontinuu de cultivare a microorganismelor, creşterea şi multiplicarea lor au depins de mai mulţi factori, şi anume: de compoziţia mediului care se modifică treptat datorită consumului de substanţe nutritive şi a acumulării produşilor de metabolism, de pHul mediului, de condiţiile de aerare, de temperatură şi de cantitatea de inocul. În instalaţia amintită am urmărit, în timp, creşterea populaţiei bacteriene folosind diferite medii nutritive şi, totodată, aciditatea, oxigenul din interiorul mediului, pH-ul, temperatura mediului de cultivare, alcoolului şi modificările de culoare. În studiul efectuat am folosit medii preparate din vin alb, vin alb şi spirt şi numai din spirt, cu şi fără adaos de nutrimenţi (extract de drojdie sau extract de porumb) utilizaţi în diferite proporţii, iar inoculul folosit pentru însămânţarea mediilor a fost de 10 sau 20% (figura 7.1.). 300

V1 mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din 1/2 vin si 1/2 spirt)+0,1%Ed+10%inocul T10 V2 mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din 1/2 vin si 1/2 spirt)+0,3%Ed+10%inocul T10

250

V3 mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din 1/2 vin si 1/2 spirt)+0,5%Ed+10%inocul T10 V1' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+30%inocul T10

200

V2' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+ 0,1% Ep + 30%inocul T10 V3' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+ 0,3% Ep + 30%inocul T10

150

V4' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+ 0,1% Ed + 30%inocul T10 V5' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+ 0,3% Ed + 30%inocul T10

100

V6' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+ 0,5% Ed + 30%inocul T10 V1'' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din spirt)+ 0,5% Ed + 30%inocul T10

50

V2'' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din spirt)+ 0,1% Ep + 30%inocul T10 0 initial

12 ore

24 ore

48 ore

72 ore

96 ore

120 ore

144 ore 168 ore

V3'' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din spirt)+ 0,5% Ep + 30%inocul T10

Durata fermentatiei acetice, ore

Figura 7.1. Evoluţia populaţiei bacteriene în diferite variante de mediu, cu sau fără adaos de nutrienţi Concluzii 1. Numărul de celule pe unitatea de volum creşte odată cu creşterea dozei de nutriment (0,1; 0,3 şi 0,5% extract de drojdie (Ed) sau extract de porumb (Ep)). 2. Adaosul de 0,5% extract de drojdie sau extract de porumb asigură o mai bună nutriţie a bacteriilor acetice, în favoarea procesului de multiplicare şi randamente mai bune în acid acetic. 3. Variantele de cultivare a bacteriilor acetice în vin alb pasteurizat sau în mediu hidroalcoolic cu 6% alcool, cu sau fără nutrimente, inoculată cu 30% cultură de bacterii acetice sunt mai puţin convenabile, deoarece cantitatea prea mare de inocul scade mult pH-ul iniţial al mediului (la 3,4), ceea ce are influenţă defavorabilă asupra procesului de multiplicare al celulelor, a căror creştere nu depăşeşte 2% faţă de numărul iniţial de celule. 4. În mediile cu 0,1; 0,3 şi 0,5% extract de drojdie şi, respectiv extract de porumb, chiar dacă numărul de celule creşte mai puţin sau mai mult în 24 de ore, aciditatea mediilor nu creşte, deoarece au loc procese de biosinteză în cadrul metabolismului plastic. 5. Ca urmare a oxidării alcoolului, aciditatea începe să crească după 24 de ore, în toate variantele adaosului de extract de drojdie sau extract de porumb în mediile de cultivare.

34

6. Randamentul practic în acid acetic la fermentarea submersă a mediilor hidroalcoolice analizate variază între 62% (când mediul este obţinut numai din vin fără adaos de nutriment) şi 94% (când mediul este obţinut din vin alb suplimentat cu 0,5% extract de drojdie). 7. Pe măsură ce fermentaţia acetică avansează, consumul de oxigen în mediul de cultivare este mai mare şi ca urmare scade oxigenul prezent în mediu. 8. În acelaşi timp temperatura creşte uşor (variind între 18 şi 22 oC). 9. Nu există o corelaţie între concentraţia oţetului în acid acetic şi pH, dar odată cu creşterea concentraţiei de acid acetic, pH-ul scade puţin, rămânând în limitele valorilor 3,23 – 3,86, în comparaţie cu soluţiile de acid acetic pur de concentraţii diferite. Astfel pentru concentraţiile de acid acetic pur de 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10% , pH-ul soluţiilor respective prezintă următoarele valori 2,86; 2,83; 2,77; 2,73; 2,70; 2,65; 2,60; 2,55; 2,50. În cazul oţetului, aşa cum am menţionat, odată cu creşterea concentraţiei în acid acetic pH-ul scade puţin, dar rămâne superior valorii de 3, ceea ce demonstrează faptul că oţetul (din vin sau din soluţie alcoolică cu adaos de nutrimente) are o anumită capacitate tampon. În acest context trebuie avut în vedere că acidul acetic este un acid slab, gradul de disociere fiind cu atât mai redus cu cât pH-ul din mediu este mai scăzut. 10. Cu privire la modificarea culorii în condiţiile utilizării unui filtru cu lungimea de undă ( ‫ = ג‬420 nm) extincţiile citite variază atât în funcţie de culoarea iniţială a mediului de cultivare, cât şi în funcţie de stadiul procesului fermentativ. 11. În concluzie, din experimentul efectuat cu extractul de drojdie se obţin rezultate mai bune în ceea ce priveşte multiplicarea tulpinilor de bacterii acetice şi al randamentului în acid acetic, dar extractul de porumb (în varianta cu 0,5% Ep) este mai convenabil în producerea de biomasă (deoarece prin compoziţia sa favorizează metabolismul plastic al celulelor de bacterii acetice) cu eficienţă în procesul de multiplicare şi cu randamente mai bune şi, în plus, este convenabil şi sub aspect economic, fiind mai ieftin.

9

CAPITOLUL VIII. CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI

Ca urmare a experimentelor efectuate în prima etapă a cercetării impusă de obiectivele tezei de doctorat, am izolat şi selecţionat materialul biologic necesar. Au fost izolate 14 tulpini ce aparţin genului de bacterii acetice Acetobacter, care după testele de identificare aparţin speciei Acetobacter aceti. În cadrul acestei specii au fost identificate trei culturi de Acetobacter aceti orleansis, zece culturi de Acetobacter aceti aceti şi o cultură de Acetobacter aceti xylinum.

9 Etapa următoare a cercetării experimentale a urmărit sensibilitatea la aciditate şi

alcool a culturilor de Acetobacter izolate şi obţinute în culturi pure; în cazul utilizării ca materie primă a alcoolului de fermentaţie (spirt rafinat) şi a folosirii ca nutrient extractul de porumb. Acest studiu a permis stabilirea rapoartelor optime dintre alcool şi acid acetic, din mediul de fermentare pentru obţinerea unor rezultate bune pentru potenţialul fermentativ şi randamentul practic pentru fiecare tulpină de Acetobacter, luată în studiu.

9

În mediul de cultivare cu 2, 3, 4, 5 şi 6% acid acetic, completat (până la 11%) cu 9, 8, 7, 6 şi 5% alcool şi cu 1% nutrient (extract de porumb) s-a constatat la majoritatea tulpinilor de Acetobacter aceti, folosite ca agenţi de fermentare, o scădere a eficienţei fermentaţiei pe măsură ce a crescut aciditatea iniţială a mediului. Tulpina de Acetobacter aceti orleansis (T10) s-a dovedit a fi mai puţin sensibilă la aciditatea iniţială a mediului de fermentare, scăderea eficienţei constatându-se numai în mediul de cultivare cu 5% acid acetic şi 6% alcool.

35

Tulpină de Acetobacter aceti orleansis (T10) în mediul cu 4% acid acetic şi 7% alcool a condus la obţinerea unui oţet cu 9,4% acid acetic şi la un randament practic de 77%; în mediul cu 5% acid acetic şi 6% alcool s-a obţinut oţet cu 9,3% acid acetic, cu un randament practic de 71,2%. În mediul cu 6% acid acetic şi 5% alcool activitatea culturii a fost slabă, realizându-se un randament practic sub 50%. Prin utilizarea tulpinii de Acetobacter T10 s-a obţinut oţet cu peste 9% acid acetic, cu un randament practic în jur de 77%, în mediile de cultură cu 2%, 3% sau 4% acid acetic şi în completare cu 9%, 8%, 7% alcool, suplimentate cu extract de porumb (1%). Tulpinile C3, 2Gl, Ai şi S au manifestat acidorezistenţă mai mare, decât tulpina T10, ele conducând la randamente de fermentare de 52 – 58%, atunci când mediul de cultură a fost reprezentat de o soluţie alcoolică cu concentraţia de 5% alcool etilic, acidulată cu 6% acid acetic .

9

În mediile de cultură în care variabila a fost reprezentată de conţinutul de alcool (concentraţii testate: 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11% şi 12% alcool în asociaţie cu 2% acid acetic şi 1% extract de porumb notat cu „Ep”), s-a constatat că pe măsură ce a crescut concentraţia de alcool din mediul, randamentul practic a scăzut, diferenţiat în funcţie de tulpina de Acetobacter aceti, folosită ca agent de fermentare. În mediul de cultură cu 6% alcool, 2% acid acetic şi 1% Ep toate tulpinile de Acetobacter aceti au oxidat alcoolul etilic cu randamente bune, cuprinse între 89,8 – 96%. În mediul de cultură cu 7% alcool, 2% acid acetic şi 1% Ep, randamentele practice de fermentaţie pentru cele 10 tulpini de bacterii acetice s-au încadrat între 80 – 93,7%. Randamente mai mari de 90% au fost obţinute numai în cazul tulpinilor de Acetobacter A10 şi S. În mediul de cultură cu 8% alcool, 2% acid acetic şi 1% Ep, randamentele de fermentaţie obţinute cu tulpinile luate în studiu au fost cuprinse între 72 – 85,4%, evidenţiindu-se tot tulpinile de Acetobacter A10 şi S. În mediul de cultură cu 9% alcool, 2% acid acetic şi 1% Ep, randamentele de bioconversie a alcoolului în acid acetic au scăzut semnificativ, fiind cuprinse între 52 – 76,6%. În mediul de cultură cu 10% alcool, 2% acid acetic şi 1% Ep, randamentele de transformare a alcoolului în acid acetic de către cele zece tulpini de Acetobacter aceti s-au încadrat între 51,3 – 70,2%, iar cele mai bune rezultate au fost obţinute cu tulpinile de Acetobacter aceti orleansis T10 şi Acetobacter aceti aceti 2Gl. În mediul de cultură cu 11% alcool, 2% acid acetic şi 1% Ep, eficienţa fermentaţiei a scăzut semnificativ, randamentele de bioconversie a alcoolului în acid acetic la cele zece tulpini de Acetobacter fiind cuprinse între 46,6 – 61,5%; rezultatele cele mai bune au fost obţinute cu tulpinile de Acetobacter aceti orleansis T10 şi Acetobacter aceti aceti 3Gl. În mediul de cultură cu 12% alcool, 2% acid acetic şi 1% Ep activitatea fermentativă a celor zece tulpini de Acetobacter a fost slabă, cu randamente practice cuprinse între 38,2 – 52,3%. În aceste condiţii numai tulpinile de Acetobacter T10 şi C2 au transformat alcoolul în acid acetic cu un randament practic de 50 – 52,3%.

9

În cazul folosirii vinului alb cu 6% alcool şi 0,65% acid acetic (ca probă martor) şi a vinului alb suplimentat cu 1%, 2%, 3% şi 4% alcool (diferite variante de mediu de cultură), a rezultat, în cazul tulpinilor de Acetobacter T10, Ai şi 2Gl, folosite separat ca agenţi de fermentare, că pe măsură ce gradul alcoolic al mediului a crescut, randamentul practic de bioconversie a scăzut. Variantele de mediu optime au fost cele cu un conţinut de alcool de 6 – 8%, pentru care s-au obţinut randamente practice cuprins între 80 – 98%.

9

În cazul utilizării mediului de fermentare cu 8% alcool, provenit în părţi egale din vin şi alcool rafinat, s-au obţinut un randamente de bioconversie cuprinse între 79,9 – 81,5%. Diluarea vinului cu soluţie alcoolică din spirt a condus la sărăcirea mediului în

36

substanţe nutritive şi la privarea tulpinilor de bacterii acetice (T10, Ai şi 2Gl) de nutrienţii necesari. Suplimentarea mediului nutritiv cu 0,3% Ep a condus la creşterea eficienţei fermentaţiei şi a randamentelor practice de conversie (80,9 – 89,4%), în cazul utilizării tulpinilor de bacterii acetice T10, Ai şi 2Gl. Acest supliment nutritiv a stimulat, în special, activitatea tulpinii 2Gl, ceea ce a determinat mărirea randamentului practic cu 19,1%. În toate variantele de mediu de cultură pe bază de vin alb sau vin alb în combinaţie cu alcool rafinat, îmbogăţite sau nu cu extract de porumb, cu sau fără adaos de acid aceti (1% sau 2%), tulpina de Acetobacter aceti orleansis T10 s-a dovedit a fi cea mai eficientă.

9

Experimentările pe mediul de cultură pe bază de vin roşu cu 9% alcool, 2% acid acetic şi 81,75 mg/100 ml antociani au arătat că dintre cele treisprezece tulpini de Acetobacter aceti, luate în studiu, numai T5, T6, T8, Ai, 3Gi şi A10, au manifestat rezistenţă la polifenoli, ele desfăşurând activitate oxidativă remarcabilă.

9

Tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8 şi Ai în vin roşu au condus la obţinerea unui oţet cu 9 – 9,65% acid acetic şi la randamente practice de 77,8 – 85%, pe când cu tulpinile de Acetobacter A10 şi 3Gi s-a obţinut oţet cu 6 – 7% acid acetic şi un randament practic cu puţin peste 70%. Tulpinile de Acetobacter T10 şi 2Gl, care nu s-au putut dezvolta în vinul roşu, (81,75 mg/100 ml antociani) s-au dezvoltat în vinul roze (cu 20 mg/100 ml antociani) unde au realizat o activitate fermentativă eficientă şi un randamente practice de 95 – 96,5%, iar tulpina de Acetobacter Ai s-a dezvoltat bine, atât în vin alb, cât şi în vin roşu. Pentru fermentarea acetică a vinului roşu, cu un conţinut mai ridicat în polifenoli, recomandăm tulpinile de Acetobacter aceti T5 şi T6.

9

Fosfatul de amoniu (Fa) nu a influenţat semnificativ dezvoltarea şi activitatea bacteriilor acetice folosite. Tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8, Bz şi 3Gi în mediul de cultură cu 7% alcool, 2% acid acetic şi tulpina S, în mediul de cultură cu 8% alcool, 2% acid acetic, au fost mai sensibile la adaosul de fosfatul de amoniu (0,2-0,3%), înregistrându-se următoarea ordine descrescătoare privind eficienţa fermentaţiei acetice în prezenţa fosfatului de amoniu: S> T> Bz> 3Gi. Tulpinile T5 şi T6 au prezentat activitate fermentativă extrem de redusă. În prezenţa fosfatului de amoniu producţia de acid acetic a fost de 3,1% pentru tulpina S (0,2% Fa); 1,9% în cazul tulpinilor T8 şi Bz (0,3% Fa) şi de 0,8% (0,2% Fa) pentru tulpina 3Gi. Extractul de porumb folosit ca nutrient asigură o nutriţie şi o activitate fermentativă mai bune pentru culturile de bacterii acetice, dar nu satisface complet cerinţele nutriţionale, decât în cazul tulpinii de Acetobacter S. Adaosul de extract de porumb, în proporţie de 0,3-0,5% a stimulat diferenţiat activitatea bacteriilor acetice, înregistrându-se următoarea ordine descrescătoare de eficienţă a stimulării dezvoltării tulpini de bacterii acetice de nutrientul respectiv: T8 > Bz > 3Gi > T5 > T6 (în cazul mediului de cultură cu 7% alcool, 2% acid acetic, extractul de porumb). Tulpina de Acetobacter T5 a fost mai eficientă la un adaos de 0,5% Ep în mediul de fermentare, faţă de adaosul de 0,3% Ep. Tulpina de Acetobacter S a produs 4,4% acid acetic la un adaos de 0,3% Ep în mediu; 4,9% acid acetic la un adaos de 0,5% Ep şi la 6 g acid acetic / 100 ml la un adaos de 1% Ep (randamentul practic realizat 75%), în mediul de cultură cu 8% alcool şi 2% acid acetic. Eficienţa adaosului de Fa (0,2-0,3%) în asociaţie cu extractul de porumb a fost nesemnificativă.

9

Adaosul diferiţilor nutrienţi la mediul de cultură cu 6% alcool şi 2% acid acetic, în cazul acetificării cu tulpinii Acetobacter aceti orleansis a condus la următoarele rezultate:

37

- la un adaos de 0,1% fosfat de amoniu (Fa) şi 0,1% sulfat de amoniu (Sa), bacteria Acetobacter aceti orleansis a generat 6,8% acid acetic, la un randament practic de 80%; - prin adaos de 0,5% extract de drojdie (Ed) oţetul obţinut cu Acetobacter aceti orleansis a avut o aciditate de 6,7% acid acetic, randament practic fiind de 79%; - adaosul de 1% extract de drojdie a determinat creşterea activităţii fermentative a acestei tulpinii respective, care a produs oţet cu 7% acid acetic, cu un randament practic de 83,3%.

9

În cazul utilizării mediului de cultură cu 5% alcool şi 3% acid acetic, suplimentat cu diferiţi nutrienţi, tulpina de Acetobacter T10, folosită ca agent de fermentare a condus la obţinerea rezultatelor: - prin adaos de 0,1% fosfat de amoniu (Fa) şi 0,1% sulfat de amoniu (Sa) tulpina Acetobacter T10 a produs un oţet cu 6,9% acid acetic, la un randament practic de 78%; - prin suplimentarea mediului de cultură cu 0,5% extract de drojdie aciditatea oţetului s-a situat la nivel 7,4% acid acetic, iar randamentul practic la nivel de 88%.

9

Cercetările realizate la nivel de laborator au permis stabilirea variantelor optime de medii de cultură şi selecţionarea tulpinii de Acetobacter cu potenţialul oxidativ cel mai ridicat (Acetobacter aceti orleansis T10). Aceste rezultate au constituit punctul de plecare pentru obţinerea culturilor de producţie în acetatorul experimental proiectat şi realizat de noi, care au fost testate la nivel industrial într-un acetator Frings de mare capacitate (8000 l)

9

Experimentările, conduse la nivel industrial în cele cinci cicluri de fermentaţie, au confirmat eficienţa tulpinii Acetobacter aceti orleansis T10, în ceea ce priveşte viteza de multiplicare şi potenţialul de bioconversie a alcoolului etilic în acid acetic. Durata ciclului de fermentare a fost mai scurtă în raport cu varianta tehnologică aplicată în producţia curentă a fabricii şi randamentul practic a fost superior celui realizat în producţie.

9

Caracteristicile fizică-chimie ale oţetului obţinut de noi la nivel industrial au fost uşor îmbunătăţite în raport cu oţetul produs de unitate, unde au fost efectuate testările.

9

În experimentele realizate în sistem submers s-a urmărit evoluţia procesului de multiplicare a bacteriilor acetice şi caracteristicile fizico-chimice ale diferitelor variante de mediu de cultivare, astfel: - multiplicarea tulpinii de Acetobacter aceti orleansis (T10) prin citirea numărului de celule / ml soluţie cu ajutorul camerei Thoma; - cantitatea de oxigen din mediu (mg / l) cu ajutorul oxi-metrului „Multi 350i”; - pH-ul cu ajutorul pH – metrului; - temperatura mediului de fermentare (oC) cu ajutorul unui termometru cu mercur; - aciditatea (g acid acetic / 100 ml mediu) titrimetric; - culoarea (la lungimea de undă de 420 nm). Toate acestea sunt rezultatul unei activităţi îndelungate de laborator, în cadrul tezei de doctorat şi al sprijinului acordat de profesorul îndrumător. Acetatorul experimental va intra în dotarea laboratorului de biotehnologii industriale, iar culturile starter realizate vor fi donate colecţiei de microorganisme a facultăţii de Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor.

38

BIBLIOGRAFIE [1] Ana Alexandru, Tehnologia vinului şi subproduselor, Galaţi, 1980. [2] Ana Hulea, Ghid pentru laboratoarele de microbiologie şi bacteriologie. [3] Annencov M. G. Fabricarea oţetului, Pişcepromizdat, Moscova, 1951. [4] Bahrim G., Microbiologie tehnică, Editura Evrika, Brăila, 1999. [5] Banu C. Manualul inginerului de industrie alimentară, vol. I, Bucureşti, 2002. [6] Banu C. Biotehnologii în industria alimentară, Ed. Tehnică, Bucureşti, 2000. [7] Banu C., Voiculescu L., Stabilizarea şi dezacidifierea vinurilor, Editura de Presă Universitară, Bucureşti, 2000. [8] Banu C., coord. , Calitatea şi analiza senzorială a produselor alimentare, Editura AGIR, Bucureşti, 2007. [9] Bărzoi, D. Microbiologia produselor alimentare, Editura Ceres, Bucureşti, 1985. [10] Bohatier P. şa, Modeling the kinetics of growth of acetic acid bacteria to increase vinegar production: analogy with mechanical modeling, Laboratoire de Genie Biologique et Sciences des Aloments, Universite Montpellier. [11] Bourgeois C.M., Larpent J. P., Microbiologie alimentaire – les fermentation alimentaires, vol. II, Cap. 6 – Le vinaigre (Divies C.), Technique et documentation – Lavoisier, Paris, 1989. [12] Carpov S. Tehnologia generală a industriei alimentare, I.E.P. “Ştiinţa”, Ed. Tehnică, Bucureşti, 1997. [13] Cotea V. Tratat de oenologie – Vinificaţia şi biochimia vinului, vol. I, Ed. Ceres, Bucureşti, 1985. [14] Cotea V. Tratat de oenologie – Limpezirea, stabilizarea şi îmbutelierea vinului, vol. II, Ed. Ceres, Bucureşti, 1988. [15] Clark P.J., Fermentation-New Products from an Old Process, vol 58, no. 10, oct. 2004 [16] Dan Valentina, Oancea Ioana, Zara Margareta Îndrumar de lucrări practice la microbiologie, Galaţi, 1985. [17] Dan Valentina, Oancea Ioana, Zara Margareta Controlul microbiologic al produselor alimentare, Galaţi, 1991. [18] Dan Valentina Microbiologia alimentelor”, Ed. Alma, Galaţi, 2001. [19] Divies C., Contribution a l’etude de la production d’acide acetique et du metabolisme de l’ethanol par les bacteries acetiques. Paris.1973. [20] Ebner H., Acetic acid. Biotehnology, vol 3, pp.387-407, 1983. [21] Ghimicescu G., Chimia şi analiza alimentelor, băuturilor şi condimentelor, Editura Funimea, Iaşi, 1977. [22] Ionescu Aurelia, Zara Margareta Biotehnologia aditivilor alimentar”, Ed. Evrika, Brăila, 2001. [23] Mencinicopschi ş.a., Biotehnologii în prelucrarea produselor agroalimentare, Editura Ceres Bucureşti, 1987. [24] Moraru C., Râpeanu R., Tehnologia industrializării porumbului, Editura Tehnică, Bucureşti, 1972. [25] Oancea Ioana, Răşenescu I. Cercetări privind fermentaţia acetică, în lucrările celui de-al II-lea Simpozion de Microbiologie Industrială, Iaşi, 1980. [26] Oancea Ioana O nouă tulpină de Acetobacter în experiment industria”, în Lucrările Congresului ARA - Târgovişte, 1997. [27] Oancea Ioana Posibilităţi de combinare a materiilor prime folosite în fabricarea oţetului, în Analele Universităţii “Valahia” – Târgovişte, 2000. [28] Oancea Ioana Microbiologia produselor alimentare. [29] OIV, 2005 Recueil des methodes internationales d’analyse des vins et des mouts, volume 1, Paris. [30] Pogany I., Metode fizice în chimia organică - Spectrofotometria, Editura Ştiinţifică, Bucureşti, 1972. [31] Pomohaci N., Nămoloşanu I. Producerea vinurilor şi a altor băuturi din struguri şi vin, Ed. Tehnică, Bucureşti. [32] Popa A.I., Teodorescu C.Ş Microbiologia vinului, Ed. Ceres, Bucureşti, 1990. [33] Ribereau Gayon, J. ş.a. Sciences et techniques du vin. Dunod, Paris, vol.I, 1972, vol. II, 1975, vol.III, 1976, vol.IV, 1976. [34] Ronald A., Principles of Microbiology, St. Louis, Missouri, 1995. [35] Rugină V. Din secretele proceselor fermentative (de la vin …la antibiotice), Ed. Tehnică, Bucureşti, 1992.

39

[36] Salle A.J., Fundamental principles of bacteriology, Mc. Graw-Hill Book Company, Ing. 1954. [37] Satinover N., Marinescu I., Conservarea industrială a alimentelor, Editura Tehnică, Bucureşti, 1962. [38] Segal Rodica, Biochimia produselor alimentare, vol. II, Ed. Alma, 1999. [39] Segal Rodica, Metode rapide de analiză în industria alimentară, Editura Tehnică, Bucureşti, 1966. [40] Thonges Henrich , Sucuri de fructe, vinuri, oţet şi lichior- traducere din limba germană de Popescu Cornelia, Ed. M.A.S.T. – Bucureşti, 1999. [41] Tofan Clemansa, Bahrim Gabriela, Nicolau Anca, Zara Margareta, Microbiologia produselor alimentare, Ed. AGIR, Bucuresti, 2002. [42] Vasilescu I. Tehnologia şi aplicaţiile industriale ale enzimelor, Ed. Tehnica, Bucureşti, 1963. [43] Vandamme, E. Fermented foods en Fermentation. În Revue des fermentations et des industries alimentaires, 7, 1982, p.158. [44] Târdea C., Ghe. Sârbu şi A. Târdea, Tratat de vinificaţie, Editura Ion Ionescu de la Brad, Iaşi, 2000. [45] Ţârdea C., Chimia şi analiza vinului, Editura Ion Ionescu de la Brad, Iaşi, 2007. [46] *** Curs pentru profesorii candidaţi la gradul didactic I. Probleme ale calităţii produselor alimentare, Galaţi, 1997. [47] *** Tehnologia produselor fermentative, Ed. Tehnică, Bucureşti, 1950. [48] http://129.93.84.115/Chemistry/MicroScale/Titration of vinegar [49] http://linus.chem.ukans.edu/Hewlett/Chemistry184/Determination of AceticAcid in Vinegar [50] http://www.cipriani.com/cipriani/Aceto/chemicae1.htm/Vinegarchemistry [51] http://www.fermierul.ro/modules/bolile vinului, march 2002. [52] A Text book for student, Investigator and Manufacturer, Commercial Fruit and Vegetable Product, W. V. Cruess, Mc. Graw, Hill Book, Company, 1958 [53] Food sciens Foods and enzymes product by microorganisms, cap. 21. [54] *** Food & Drinks Globus, aprilie 2001, anul 3, nr. 20. [55] *** Food & Drinks Globus, ianuarie 2002, anul 4, nr. 29. [56] *** Food & Drinks Globus, februarie 2002, anul 4, nr. 30. [57] *** Food & Drinks Globus, Stroia I., Obţinerea oţetului de calitate superioară, anul 9, nr. 97, septembrie 2007. [58] http://www.Wikipedia/acid acetic/proprietati [59] STAS 184/2–87 – alcool etilic şi băuturi alcoolice. [60] STAS 6182/1-79 – vin. [61] STAS 3001-91 – apă potabilă. [62] STAS 157-86 – oţet alimentar. [63] SR EN 13188 – oţet.produs fabricat din lichide de origine agricolă. definiţii, prescripţii, marcare.

40

Anexa 1. Tabelul 1 Caracteristicile unor tipuri comerciale de oţet Tipul de oţet Indicatorul

Oţet din vin

Densitatea, [Kg/m3] Extract, [g / l] Cenuşă, [g / l] Aciditate totală, [% acidacetic] Aciditate volatilă, [%acid acetic] Acizi nevolatili, [%acid acetic] Alcool etilic, [%] Azot total, [%] Glucide, [g / l] Aldehidă acetică, [mg/l] Acetat de etil, [mg/l] Acid citric, [g / l] Acid malic, [g / l] *

Oţet de mere

Oţet de malţ

Oţet din spirt*

Oţet de orez Oţet balsamic

1013-1020 1013 - 1024 1011-1022 1015-1020

Oţet sintetic**

-

-

1007-1022

8,71-24,88 1,47-3,10

19-35 2-4,5

3-28 0,6-7,6

1,5-6 0,2-0,5

0,5-7,6

336,7-873,9 4-18,8

1-4,5 0,2-0,5

5,94-9,2

3,9-9

4,3-5,9

11,5-12,2

4-5,24

6,25-14,88

4,1-5,3

5,55-7,95

-

-

-

3,79-5,16

3,9-13,6

-

0,02-0,55

0,1-0,55

0,2-0,4

-

0,05-0,66

1,58-2,27

-

0-0,81 1,15-1,86 0-6,2

1,5-7

0,4-1,4 0-6,2

0,05-0,15 0,03-0,3 -

0,05-0,68 0,8-1,29 0-91

0,04-0,08 1,02-2,16 351-689,7

-

19,9-114,4

-

18,9-114,4

-

-

84,9-374,7

-

206-590

-

206-590

-

-

-

-

0,26-0,39 0,47-0,8

0,47-0,8

0,26-0,39 0,47-0,8

-

-

1,66-3,47 8-37,4

-

De regulă oţetul din spirt se colorează cu caramel.

** Nu este admis pentru consum alimentar conform legislaţiei în vigoare.

Tabelul 4.1 Caracteristici diferenţiale în cadrul genului Acetobacter CARACTERE MACROSCOPICE SPECII

SUBSPECII

Oxidarea

Oxidarea

Producerea Creşterea Producerea Producerea

lactatului

glicerolului

de catalază pe mediu de celuloză de pigmenţi Hoyer-

TESTE BIOCHIMICE CARE POT FI

Frateur Acetobacter aceti

FOLOSITE ÎN SCOP TAXONOMIC PENTU BACTERII

A.a.-aceti

+

+

+

+

--

--

A.a.-orleansis

+

+

+

--

--

--

A.a.-xylinum

+

+

--

--

+

+

A.a.-

+

+

+

+

--

+

+

--

--

±

--

--

A.p.-lovaniensis

+

--

--

+

--

--

A.p.-estunensis

+

--

--

+

+

--

A.p.-ascendens

+

--

--

--

--

--

A.p.-paradoxus

+

--

+

--

--

--

+

--

+

+

--

--

liquefaciens Acetobacter

A.p.-

pasteurianus pasteurianus

ACETICE

Acetobacter peroxidans

41

Tabelul 4.2. Caracterizarea macroscopică a tulpinilor de bacterii acetice studiate REZULTATUL TESTELOR BIOCHIMICE AL BACTERIILOR ACETICE Tulpina

Oxidarea

Oxidarea

de

lactatului

glicerolului

Producerea

Creşterea pe Producerea de Producerea de

de catalază mediu Hoyer-

bacterii

Introducere în

celuloză

pigmenţi

clasificare

Frateur

acetice testată Ai

+++

+++

++

--

--

--

A.a.-orleansis

A10

+

+++

++

--

--

--

A.a.-orleansis

C2

+++

+++

+

+

--

--

A.a.-aceti

C3

+

++

+

+

--

--

A.a.-aceti

2Gl

+++

+++

+

+

--

--

A.a.-aceti

3Gl

+++

+++

+

+

--

--

A.a.-aceti

S

+

+

+

+

--

--

A.a.-aceti

T10

+++

+++

++

--

--

--

A.a.-orleansis

Bz

+

+

+

+

--

--

A.a.-aceti

3Gi

+

+

+

+

--

--

A.a.-aceti

T5

+++

+++

+

+++

--

--

A.a.-aceti

T6

+

+++

++

+

--

--

A.a.-aceti

T8

+

+++

+

++

--

--

A.a.-aceti

+

+

+

--

A.a.-xylinum

T14

42

Anexa 2. Tabelul 4.3.

OBSERVAŢII MACROSCOPICE Caracterizarea coloniei dezvoltate pe mediu solid

Cultura Testul de oxidare a glicerolului dezvoltarea Ai +++

forma circulară, cu margini ridicate

profilul

marginea

aspectul

convex

uniformă aspru, mat

+++

filamentoasă

plat

+++

circulară, cu margini îngroşate

plat

++

neregulată

+++

culoarea crem

A10 aspru, mat

crem

uniformă neted, mat

crem

crescut

ondulată

lucios

crem

neregulată

crescut

lobată

neted, cremos

crem

+++


crescut

uniformă

neted, lucios

crem, închis

+

neregulată

plat

lobată

neted, lucios

crem

C2

erodată

C3

2 Gl

3 Gl

S

43

T10 +++

rizoidală

crescut

lobată

+

circulară

plat

Bz

3 Gi

neted, cremos

crem

uniformă cu margini cretate

neted, mat

alb


neted, mat

alb

+

circulară

plat

+++

circulară

plat

uşor ondulată

neted, mat

crem

+++

circulară

convex

uşor lobată

rugos, cremos

crem

+++

circulară

convex

lobată

rugos, cremos

alb crem

T5

T6

T8

Tabelul 4.4. Cultura Testul de oxidare Caracterizarea coloniei dezvoltate pe mediu solid a lactatului dezvoltarea forma profilul marginea aspectul Ai +++ circulară, plat ondulată aspru, punctiformă lucios

culoarea crem

A10 +

circulară, punctiformă

plat

uniformă

neted, lucios

crem

44

C2 +++

circulară

convex

uniformă

neted, cremos

crem

+

circulară

plat

ondulată

+++

circulară neregulată

crescut

lobată

rugos, cremos

crem

+++

circulară, rizoidală

plat

filamentoasă

aspru, lucios

crem, maroniu

+

circulară

plat

uniformă

aspru,cr emos

crem

ondulată

rugos, cremos

crem

C3 aspru, cremos

crem

2 Gl

3 Gl

S

T10 +++

filamentoasă crescut

Bz +

circulară

plat


neted, mat

alb

+

circulară

plat


neted, mat

alb

+++


convex

uniformă

neted, cremos

crem

3 Gi

Bz

45

3 Gi ++

T5 +++

neregulată, punctiformă


plat

ondulată

aspru, cremos

crem

convex

uniformă

neted, cremos

crem

T6 +++

circulară, neregulată

convex

neregulată

rugos, cremos

crem închis

+

punctiformă

plat

ondulată

aspru, lucios

crem

T8

Tabelul 4.5. Cultura

Ai A10

Testul de Caracterizarea coloniei dezvoltate pe mediu solid creştere pe dezvoltarea forma profilul marginea aspectul mediul Hoyer Frateur Nu s-a dezvoltat Nu s-a dezvoltat

culoarea

C2 +

filamentoasă

plat

filamentoasă neted, mat

alb

+

filamentoasă

plat

filamentoasă

aspru, lucios

alb

+

circular, filamentoasă

plat

erodată

neted, mat

crem

C3

2 Gl

46

3 Gl +


plat

erodată

neted, lucios

crem

+

circulară

plat

uniformă

neted, mat

alb

+

circular, punctiformă

plat


neted, mat

alb

+


plat


neted, mat

alb

+++


crescut

uşor erodată

aspru, mat

alb cretată

+


plat

uşor erodată

aspru, lucios

crem

++


crescut

uşor erodată

aspru, lucios

crem

S

T10 Bz

Nu s-a dezvoltat

3 Gi

T5

T6

T8

Legendă: +++ ++ +

dezvoltare foarte bună dezvoltare bună dezvoltare slabă

47

Anexa 3 5 7’ 7 8

11 2 3 10

1 6

9

4 Variaţi

Fig. 7.1. Acetatorul submers – pilot 1 - corpul acetatorului; 2 - capacul acetatorului; 3 - sistemul de închidere al capacului; 4 - robinet de evacuare a oţetului; 5 - electromotor; 6 - ax cu o paletă; 7 - intrarea apei de încălzire în schimbătorul de căldură; 7’ - ieşirea apei de încălzire din schimbătorul de căldură spre termostat; 8 - barbotor; 9 teacă; 10 - termometru; 11 - condensator.

Fig. 7.2. Vederea generală a instalaţiei cu funcţionare submersă – pilot

48

LUCRĂRI PUBLICATE DIN DOMENIUL TEZEI DE DOCTORAT

Lucrari publicate in reviste de specialitate: Buletinul Agir, anul VIII, nr.3, iulie septembrie 2003, ISSN 1224-7928, Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor, Studii şi cercetări, Instalaţie pilot pentru fermentaţia acetică submersă. Lucrari prezentate la conferinte de specialitate: 1. „A comparative study on the efficiency in acetic acid obtained in acetic fermentation with 10 Acetobacter colonies”, Banu Constantin, Garnai Maria Cristiana, Annals of the Suceava University – Food engineering, year VI, no.2, p 84, Ed. Universităţii Suceava, ISSN 1842-4597, 2007. 2. „The acetic bacteria isolation and selection for the vinegar industry”, Oancea Ioana, Garnai Maria Cristiana, Annals of the Suceava University – Food engineering, year VI, no.2, p 92, Ed. Universităţii Suceava, ISSN 1842-4597, 2007. 3. „Studiu asupra capacităţii fermentative a unor tulpini de Acetobacter aceti în vin roşu şi roze” , Garnai Maria Cristiana “Actes du cinquième Colloque franco – roumain de chimie appliquée” – COFrRoCA 2008, Bacau, Roumanie, no.5, p 172 , Ed. Alma Mater - Bacău, ISBN 978-973-1833-77-4 , 25-29 iunie 2008. Cărţi: „Tehnologia fabricării oţetului”, Editura „Fundaţiei Universitare”, Galaţi, 2006.

Otet

Recommend Documents