Orvosi Biokémia

Tartalom

Előszó

E lőszó

l.

az első kiad áshoz . . a m ásodik kia d áshoz

XV XVl

A fehérjék és enzimek szer·kezete. funkciója

l. l. A fehérjék szerkezete (Machovich Raymund). Aminosavak. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Az aminosavak szerkezeti tulajdonságai . Az aminosavak oldallánc szerinti csoportosítása. A fehérjékről általában . . . . . . . . . . . . . . . . . A proteinszerkezet különbözö szintjei: a háromdimenziós struktúra kialakulása A fehérjék elsődleges szerkezete . . A fehérj ék másod iagos szerkezete . A fehérj ék harmadlagos szerkezete A fehérjék negyedleges szerkezete . Mu ltienzim komplexek. . . . Szu pramolekuláris struktúrák . . . Fehérjék denaturációja . . . . . . . . . . A natív állapot kialakulása: a fehérje feltekeredése A fehérjeszerkezet megismerését szolgáló metodikák . Gélelektroforézis . . . . . Izoelektromos fókuszálás. . . . . . . Dialízis és gélszürés . . . . . . . . . Ioncserélő és affmitás kromatográfia .

1.2. E nzimek (Faragó A n11a) . . . . . . . . . . . Az enzimek katalitikus funkciója . . . . . . Az enzim- szubsztrát komplex kia lakulása. A katalízisben szerepet játszó tényezők Az enzimek osztályai . . . . . . . . . Koenzimek és prosztetikus csoportok A Michaelis-Menten-modell. Az enzimaktivitás gátlása . . . . . . .

-

-

-

-

- - - - - - - - - - - --

3 3 3 3

6 7 7 9 12 14 14 14 14 15 17 17

18 18

20 21

21 22

23 26 27 30 34

- --

-----------

VI II

»>»»>>>>»>»»>>>>»>>>»»>»>»>»»>m»»>»>»»>H>>>»>»>>H>»>»»>»»m>>»>»»»»m»>»>»»>»>»»>»»»»»»»>»>»»»»»»»>>>»>»»»»»»>>

Az enzimaktivitás szabályozásának módjai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Allosztérikus enzimek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A z enz imműködés szabályozása foszforiláció-defo szforiláció segítségéve!. A proenzimek átalakulása aktív enzimmé limitált proteolízis segítségével Az enzimek néhány gyakorlati a lkalmazása az orvosi diagnosztikában .

1.3. A hemoglobin és a mioglobin (Ma11dl József) . . . . . . . A hemoglobin és a mioglobin szerkezete, oxigénkötése . Az oxigénleadás szabá lyozása . . . . . . . . . . . . . . A hemoglobin aminosav-összetéte lének változásai. A haemoglobinopath iák .

2.

T ARTALOM

35 36

40 41 42

44 44 47 48

AL anyagcsere

2.1. Bioenergetika. Energiatermelés és -raktározás az anyagcsere során (Mandl József) Energiatranszform áció . . " Kapcsolt reakciók" elve. . . . . . . . . A metabolizmus . . . . . . . . . . . . . Csoportátvitel - csoportátviteli potenciál A foszforiltranszfer, az ADP/ATP ciklus. . . . Elektrontranszfer -oxidoredukció . . . . A legfontosabb e lektronátvivök redoxciklusa A biológiai oxidáció . . . . . . . . . . . . . . . . Elektrontranszfert katalizá ló enzimek - oxidoreduktázok . Terminális oxidáció -oxidatív foszfori láció A mitokondriumok szerkezete . . . . A mitokondriális légzési lánc alkotói A terminális oxidáció folyamata . . . Az oxidatív foszforiláció . . . . . . . Az ADPfoszforiláció ja - az akceptor kontroll . A kemiozmotikus elmélet . . . . . . . . . . . Mitokondriális fehérjék szintézisének zavarai - "mitokondriális betegségek" tA citrátciklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A citrátciklus helye az intermedier anyagcserében; a c iklus katabolik:us és anabolikus funkciója . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Az acetil-CoA képződése piruvátból, a piruvát-dehidroge náz enz imkomplex A citrátkör reakciói . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A citrátkör szerepe a tápanyagok katabolizmusában . . . . . . . . . . . A piruvát-dehidroge náz komplex aktivitásának szabá lyozása . . . . . . A citrátciklus szabályozása. A ciklust fel tö ltő (anaplerotikus) reakciók . A piruvát-dehidrogenáz csökkent működésének klinikai von atkozásai .

55 55 56 56 56 59 63 64 68 69 70 70 72 74 76 76 77 78 79

2.2. A szénhidrátok anyagcseréje (Adám Veronika és Mandl József) . . . . A legfontosabb szénhidrátok és tulajdon ságaik . . . . . . . . . . . . . A szénhidrátok emésztése, felszívódása és a glukóz bejutása a sejtekbe. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glikolízis A glikolizis helye az intermedier anyagcserében. A gliko lízis reakciói . . . . . . . . . . . . . . .

92

79 81 85 88 88 89 91

92 100 103 103 104

TARTALO M

))))))>) )))) )))) )))) )))) )) )))) )) )))))) )))))) )))) )) )) )))) )))))))) )))))))) ))))))

)) )))) )))))))) )))) )))) )))))))))) )))))))) ) ) )))) ))>))>)))))))) )))))) )) )) )))) )))) )))))))))))))))) )))) ))))

A gliko lizis energiam érlege. A g lukóz aerob és anaerob lebontásá nak energiam érlege . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sejtspecifikus sajátossá gok, klinikai, patológia i vonatkoz ások . . . . Redukáló ekvivalen sek transzportja a citoszolból a mitokond riumba . G lukoneogenezis - a glukóz de novo szintézise A gliko lízis és a glukoneo genezis szabályoz ása A fruktóz és a galaktóz metaboliz musa. A glikogén szintézise és lebontása . Glikogénszintézis. . . . . . . . . Glikogén lebo ntás. . . . . . . . . A g likogén-a nyagcsere szabályo zása . Glikogén tárolási betegsége k . . . . . A vércukor szint szabályozása . . . . . . . A glukóz direkt oxidációj a, pentóz-fo szfát-út A glukóz direkt oxidációj ának oxidatív szakasza A glukóz dire kt oxidációj ának nem oxidatív szakasza. Pentóz-fo szfát keletkezé se g likolízis intermedi erekből . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A pentóz-fo szfát-út szabályozása, jelentősége, lefolyásá nak különböző formái. A pentóz-fo szfát-ciklus müködés ének megváltozásával összefüggő kórképek Bioszinte tikus folyamatok a szénhidrá tok anyagcseréj ében. Glikopro teinek, proteoglikánok szénhidrá tláncának szintézise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.3.

A lipidek anyagcseréje (Á dám Veronika) . . . . A legfontosabb zsírsavak és jelölésüle . . . . . . Aci l-gliceridek. Trigliceridek és az energ iaraktáro zás . A zsírsavak de novo bioszinté zise . . . . . . . . . . . Az acetil-Co A transzportja a mitokond riumból a citoplazmába . A zsírsavsz intézis elkötelező lépése és az acetil-Co A-karbox iláz szabályoz ása. A palmitins av szintézise. A zsírsav-sz intáz A NADPH forrása . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . A zsírsavlá nc elongációj a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Speciális zsírsavak , amelyek a zsírsav-s zintáz reakcióba n keletkezhetnek A trig liceridek szintézise és raktározá sa . . . . . . . . . . . . . Lipolízis - a raktározo tt zsírsavak mobilizál ása a zs írszövetb ő l . A zsírsavak oxidációj a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A páros szénatom számú zsírsavak oxidációj a . . . . . . . A páratlan szénatom számú és a telítetl en zsírsavak oxidációj a Alfa-oxidáció és omega-ox idáció . . . . . . . . . . . . . . . A ketontest ek keletkezé se és fe lhasználása. Ketonaem ia, ketonuria . A ko leszterin metaboliz musa . . . . . . A koleszterin szintézise . . . . . . . A koleszter inszintéz is regulációja . A koleszterin-észtere k keletkezé se . Az epesavak keletkezése, metaboliz rnusa és j elentősége. A lipidek szállítása. Lipoprote inek . . . . . . . . . . A triglicerid ek szállítása. Kilomikr on, VLDL . A koleszter in szállítása. LDL, HDL Szabad zsírsavak . . . . . . . A zsírok ernésztés e és felszívódása. . . .

l

x

l 08 l 09 l 09 11 2 116 122 126 126 128 129 133 133 136 136 137 139 140 140 143 144 145 146 146 147 148 151 15 1 153 154 157 159 160 162 164 165 168 168 172 173 175 180 182 184 189 190

x

)) )))))))))))))))))))))))) »)) )))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))) ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

TARTALOM

A foszfolipidek és szfingolipi dek felépítése és jelentősége A foszfatidilkolin szintézise . . . . . . . Egyéb foszfolipidek szintézise . . . . . . . . . . . . A szfingolipidek szerkezete és szintézise . . . . . . A foszfolipidek és a szfingolipi dek transzportja a sejtmernbránba A szteroidhor rnonok rnetabolizrnusa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Szteroidho rrnonok szintézise a mellékvese kéregben . . . . . . . . A glukokortik oidok és a rnineraloko rtikoidok inaktiválása és szállítása a plazmában . . . . . . . . A nemi hormonok szintézise . A 0 3-vitamin szintézise . . . . . . . 2.4. Az aminosava k anyagcseré je. Porfirin-a nyagcsere (Machovic h Raymund) Az aminosav-a nyagcsere általános ismertetése. . . . . . . . A táplálékból származó aminosavak. A fehérjék ernésztése . A fehérjeemésztő enzimek aktivitásán ak szabályozá sa Az aminosava k transzportj a . . Az endogén fehérjék lebontása. Az aminosava k sorsa . . . . . Glutamát-d ehidrogená z. . . . . Transzami názok . . . . . . . . Egy szénatomo s csoportok transzfer reakciói A nem esszenciális aminosava k bioszintézise Az aminosava k átalakulásai . . . . . A nitrogén sorsa . . . . . . . . . . . Az ammónia eliminációj a . . . Az omitinciklus ("ureaciklu s"). Az ureaszintézis szabályozá sa . Az aminosava k szénláncán ak sorsa és az aminosava kból képződő nitrogéntartalmú vegyületek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A glicin, alanin, szerin és cisztein átalakulása . . . . . . . . . A triptcfán katabolizmusa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A glutamin, prolin, arginin, hisztidin és glutamát átalakulása . A metionin, treonin, valin és az izoleucin katabolizmusa: a 8 12-vitamin szerepe . . . . .. . .. . . . . . .. . A feni lalarun és tirozin katabolizmusa . . . Az aszparagin és aszpartát metabolizmusa. A leucin és lizin katabolizrnusa Porfirinek és epefestéke k . . . . . . . . . . . . . . . . A porfirinek szintézise . . . . . . . . . . . . . . A porfirinek lebomlása, epefestéke k képződése . A porfirinek hibás anyagcsere -folyamata ival értelmezhető kórképek. 2.5. A nukleotido k anyagcser éje (Machovic h Ray mund) A nukleotide k szerkezete . . . . A mononukle otidok fon·ása. . . . . . . . . . . . . Purin nukleotide k bioszintézise. . . . . . . . . . . Purin nukleotide k bioszintézisének szabályozása Pirimidin nukleotide k bioszintézise . . . . . . . . . .

193 196 201 203 210

210 210 215 21 7

219 220

220 221 223 226 227

228 228 229 232 232

240 240 24 1

241 243 246 246

248 250 254 254

260 260 26 1 261

265 265 269 269 27 J 271

275 277

TART ALOM

))>))))>

>l>»nm >lm>~>>>m»>>»»m>>>l»m»m>1>>>1>l>>>>>>>>»>>>>11>>>>1>» >>>> >m >>~>>>>>»>>>>>>>m m>»>>»>l>»>>»>>>>>»>>>l>>>>>>>>>>>>>>>>mm >>>m>> >>>>

Xl

Dezoxi-ribonukleotidok keletkezése . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A dezoxi-timidilát (dTMP) és a timidin-trifoszfát (dTTP) szintézise Dezoxi-ribonukleotidok bioszintézisének szabályozása . . . . . . . Nukleotidek bioszintéz isét befolyásoló vegyületek. Terápiás felhasználás Purin és pirimidin nukleotidek lebontása. Purinbáz isok lebontása . . . . . . . . Pirimidinbázisok lebontása. . . . . . Nukleotidek egymásba történő áta lakulásai 8 12-vitamin; metil-malonát-acidosis és anaemia . A nukleotidek, mint a legkülönbözőbb funkciókkal rendelkező molekulák forrásai

281 282 284 284 285 285 288 290 291 296

2.6. Biotranszformáció- méregtelenítés (Mandl József) . . . . . . . . . . . . . . . A biotranszformáció folyamata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A biotranszformáció első, előkészítő szakasza, a citokróm P450 enzimek A biotranszformáció második, konjugációs szakasza A biotranszformáció harmadik, transzport szakasza . . . . . . . . . . . . A biotranszformáció szabályozása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A biotranszformáció biológiai jelentősége. Méregtelenítés. Klinikai vonatkozások . Az "oxigéntoxic itás" . . . . . . . . . . . . . ROS képződése nem enzimatikus úton . ROS képződése enzimatikus úton A ROS eliminálása . . . . . . . . . . .

297 298 299 302 304 306 307 309 3 1O 3 1l 3 12

2.7. Az anyagcsere összehangolt szabályozása (Mandl József) . . . . . . . . . . . A sejt intermedier anyagcseréjének integrációja és a szabályozás szempontjai Elágazási pontok a sejtek intermedier anyagcseréjében . . . . . . . . . . A sejtek redox homeosztáz i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Az anyagcsere szabályozása a szervezet szintjén - éhezés, táplálékbevitel A máj. . . . . . . . . . . . . Izom . . . . . . . . . . . . . Agy (központi idegrendszer) . Zsírszövet. . . . . . . . . . . Az anyagcsere integrációja patológiás állapotokban .

3 15 315 3 15 3 18 320 320 323 324 324 325

3.

A genetikai információ tárolása és kifejeződése

3.1. DNS: replikáció és hibajavítás (repair) (Faragó Anna) A DNS szerkezete . . . . . . . . . . . . A DNS replikációja prokariótákban . . . . . . . . . . Az eukarióta kromoszóma szerveződése . . . . . . . . Az eukarióta sej tben történő replikáció néhány jellegzetessége . A sejtciklus szabályozása és a tumorszuppresszor gének által kódolt fehérjék szerepe a sej tciklus szabályozásában. . . . . . . . . . . . . . Az extranukleáris DNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . A DNS károsodásainak javítása: repair mechaniz muso k. Mutációk Rekombinác ió. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

331 33 1 336 343 344 345 347 348 35 1 353

XI l

3.2.

mm»>m m»>>>»>> >>>>>>>>»»»»»»» » »»»>>» >>» >»>>>>>»>>>>»>>>»>>>>>»>>>> >>>>>>>>>>>>>m>>>>>>>>>>»>>>>>»>>>>>>>>>>>>>>>>»>>>>>>>>>>> >>>>>>>> >>>>>>>>>>>>

R NS: transzkripció és szabá lyozása (Faragó Anna) . . . . . . . . Az RNS típusai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A transzkripciós egység és a transzkripció menete prokariótában . A transzkripció szabályozása prokariótákban . . . . . . . . . . . A polipeptidláncokat kódoló gének transzkripciója eukariótákban és az elsődl eges transzkripturn érése . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Eukarióta transzkripciós faktorok . . . . . . . . . . . . . A riboszóma-RNS és tRNS transzkripc iója eukariótákban.

3.3. A vírusgenom r eplikációja és a z onkogének (Faragó A nna) . A vírusgenom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A bakteriofágok replikációjának litiku és lizogén útja . . . Állati virusok replikációja . . . . . . . . . . . . . . . . . . Onkogéneket hordozó retrovírusok és acelluláris protoonkogének 3.4.

Fehérjeszintézis: a transzláció mecha nizmusa és a polipeptidlá nc további sorsa (Faragó Anna). A kódszótár . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A transzlációs apparátus komponensei . . . . . . A polipeptidlánc szintézisének mechanizmusa. . A fehérjék sejtorganell umokba irány ítása és a transzláció utáni módo ulások Fehérjeszintézis a mitokondriumokban . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.5. A la boratóriumi géntechnika (r ekombiná ns DNS-technológia) mód szer ei (Faragó A nna) . . . . . . . . . . . . . . Restrikciós endonukleázok és restrikci ós térképek. . . . A DNS bázisszekvenciájának meghatározása . . . . . . Rekombináns DNS és k lónozás, a génkönyvtár fogalma. Nukleinsavak bázisszekvenciájának azonosítá ára szolgáló módszerck . Kromoszómaséta . . . . . . . . . . . . A cDNS és a cDNS könyvtár . . . . . . . . . . Expressziós vektorok és fúziós fe hé1jék . . . Eukarióta vektorok és expressziós rendszerek " Riporter gének" . . . . . . . Irányított in vitro mutagenezis Polimeráz láncreakció (PCR). "Antiszenz" nukleinsavak Transzgénikus állatok . A DNS-chip . . . . . . . .

4.

T ART ALOM

355 355 358 362 366 371 374 376 376 377 379 383

386 386 387 390 394 399

400 400 403 405 408 409 410 410 411 412 4 12 413 413 41 5 415

A mcmbránok szerkezete. Membrántranszport-folyamatok

4.1. A m embránok szerkezete (Adám Veronika) . A membránok kémiai összetétele. Membránlipidek . Membránfehérjék. . . . . .

421 42 1 421 425

TARTALOM

))))))))))))))» »)))))))))))))>)) )) )))))))))))))) )))))))))))))>}))) ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))» ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

4.2. Membrá ntranszpor t-folya matok (Ádám Veronika) Facilitált diffúzió . . . . . . . . . . . A transzportfoly amatok energetikája. Aktív transzport . . . . . . . . . . . . Na+K--ATPáz - Na+K+-pumpa . . . . A transzport ATPázok csoportosítása Má od Iagos aktív transzport. A glukóz Na+_függő transzportja ABC fehérjék. Multidrog-rez isztencia . . . . . . . . . . Ioncsatornák . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A sejtek Ca2 -transzport-rendszerei . Ca2+-homeosztázis . . . . . . . Az intracelluláris Ca2 t-koncentráci ó emelkedését kiváltó szignálok és mechanizmus ok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Az intracelluláris Ca2+-koncentráció t csökkentő mechanizmus ok. . . .

5.

X lll

428 429 43 1 431 432 435 436 437 439 440 441 444

Extracellulár is jelek receptorai és a jelátviteli mechanizmu sok

5.1. Plazmamemb rán-receptor ok és jelá tviteli m echanizmusa ik (Ádám Veronika és Faragó A nna) . . . . . . . . . . . . . . A receptor- ligand kölcsönhatás jell emző i . . . . . . . . . A plazmamemb rán-receptoro k fe losztása és tulajdonságai . A receptor ioncsatornák. . . . . . . . . . . . . . . . . . . Heteretrimer GTP-kötő fehérjék (G-fehérjék) részvétele a receptorhatás ok közvetítésében Protein-kinázok és foszfoprotein-foszfatázok . . . . . . . . . . . . . . . . . A cAMP-mediátorrendszer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . lnozitol-foszfolipid jelátviteli rendszer. A Ca2+ mint intracell uláris mediátor és az inozitol- l ,4 5-triszfoszfát szerepe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A guanilát-ciklá z és a ciklikus GMP je l entősége ajelátvitelben. A nitrogén-mon oxid biológiai szerepe. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A nitrogén-mon oxid keletkezése és je len tősége . . . . . . . . . Tirozin-kináz-receptorokkal működő jelpályák és a protoonkogén ek .

482 484 486

5.2. Sejtmagr eceptorok (Fésiis László) . . . . . . . . . . . . . . . A szteroid- tiroid- D-vitamin- retinoid "magreceptor" család A honnonfúggő magreceptorc salád komplex itása . . . . . . Az "árva" magreceptoro k és a reverz endokrinológ ia kibontakozó vi lága. A magreceptoro k tágabb értelmezése. Orvosbiológiai jelentőség . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

495 495 499 500 504 504

5.3. A sejtprolifer á ció és a természetes sejthalál biokémiája (Fésiis László) A sejtosztódási ciklus biokémiai sajátságai és szabályozása . Proliferációs szignál útvonalak, a mitogén kaszkád A restrikciós pont szabályozása . . . . . . . . . . . . Az M fázis kináz (cdc2, CDK I) . . . . . . . . . . . . A ciklindepende ns kinázok szabályozásának főbb elvei. A proteolízis jelentősége a sejtciklusban . . . . . . . . . A sejtosztódási ciklus szabályozásán ak kapcsolata a tumoros sejtproliferáci óval . Protoonkogének és onkogének . Tumorszuppr esszor gének . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

505 505 506 509 509 509 511 511 511 512

449 449 451 455 459 464 471 4 75

XIV

>>>>»>m»>>>>»>>>>>>»»>>>>»>»>»>>>m»>>>>>>>>>>>>>>>>>>>m>>»>m>>>>»»>m>>»>>»>»>»>»>»»>>>>»>»»m>>>>>m>>»»»» »»>>>>>>>>>>»>>>>»>>>>>>>>>>

T A RTA LOM

A természetes sejthalál molekuláris háttere A természetes sej thalál formái . . A sejthalál (apoptózis) elindítása. Effektor mechanizmusok. . . Az elbalt sejtek fagocitózisa Az apoptózis gátlása Orvosbiológiai j elentőség . . . . .

6.

5 14 5 14 5 15 517 518 518 519

Az egyes szervek és szervrendszerek működésének biokémiai alapjai

6.1. A kémiai idegingerület átvitel (neurotranszmisszió) molekuláris alapjai (Ádám Veronika) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Az akciós potenciál és a feszültségfüggő Na+-csatorna A kémiai ingerületátvitel jellemzői . Aminosav neurotranszmitterek . . . . . . . . . . . . . Glutamát . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . . A glutamát neurotranszmisszió szerepe speciális fiziológiás és patológiás folyamatokban GABA és glicin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Acetilkolin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Az acetilkolin szintézise, raktározása és felszabadulása a koli nerg neuronokban . Kolinerg receptorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Az acetilkolin inaktiválása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A katecbolamin neurotranszmitterek. Noradrenalin, dopamin és adrenalin A katecholaminok bioszintézise és raktározása . . A katecholaminok rnetabolizmusa és inaktiválása . A noradrenalin és az adrenalin receptorai Dopaminreceptorok. . Szerotonin . . . . . . . . . Szerotoninreceptorok . Neuropeptidek . . . . Opioid peptidek. . . . 6.2. Kontraktilis rendszer (Dux László) . . . . . . . . . . . . . . . . . Az izomszövet kontraktilis rendszere. . . . . . . . . . . . . . . . A vastag filamentum rendszer, a miozin febétje szerkezete . A vékony filamentum rendszer. . . . . . . . . . . . . . . . A kontrakció mechanizmusa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Az érett harántcsíkolt izom felépítés. Szupramolekuláris struktúra. . A vázizom hossz- feszülés összefüggése, a csúszó filamentum (sliding filament) modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A kalciumszignál keletkezése és eliminációja izomban . . . . A kalciumszignál és az izom szarkatubuláris rendszere . A kalciumfelszabadulás mechanizmusa . . . . . A kalciumvisszavétel mechanizmusa . . . . . . Az izomkontrakció energiaszükségletének biztosítása. Az izomszövet alkalmazkodási reakciói . Az izomfáradás, izomláz . . . . . Az izom adaptációja, plaszticitása .

525 525 527 532 532 534 535 531 537 538 539 540 540 543 543 544 545 545 546 547 549 549 549 551 551 555 555 556 556 558 560 561 561 56 1 562

TARTALOM

6.3. A

» m> ,,,,»,,»>>>»>>»>>m>»»>>>>»>>»>>»>>m>>»>>>m>>>»>>m»»>m>»>»m>>>>»>>>>>» »>,>>»>»»>>>>m>»»>>»>,>>»mm>>>m>>>»» >»>>»m>»>>>»>•

XV

Az izomszövet citoszkeletális vázrendszere . . . . . . Egyes fontosabb izombetegségek biokémiai ala pjai . . Az izomszövet fontosabb anyagcsere-b etegségei A citoszkeleton, membrán-cito szkeleton rendszer betegségei izomban . Ioncsatorna-betegségek az izomszövetbe n . . . . . . . . . . . . . . . .

562 564 564 564 565

és a hám struktúrfehé rjéi (Machovich Raymund) Kollagének . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A kollagén bioszintézise és degradációja Elasztin Egyéb fehérjék . . . . . . . Keratinok . . . . . . . Fibronektin és laminin Proteoglikáno k . . . .

566 566 57 1 573 575 575 576 576

kötőszövet

6.4. Lokális hormonok egyes szervek működését befolyásoló hatása. Az eikozanoidok (Mandl József) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Prosztanoidok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Az arachidonsav metabolizmusa. Arachidonsavellátás. Foszfolipáz A2 . A "cikJoox igenáz"-út. Prosztanoid- és tromboxánszi ntézis A prosztana id és a tromboxán katabolizrnusa . . . . . . Leukotriének . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A lipoxigenáz-út. Leukotriének szintézise és lebontása . Eikozano idok biológiai hatásai . . . . . . . . . . . . . . . . . Eikozanoidre ceptorok. Eikozanoidok és szignál transzdukciós rendszerek .

579 579 579 58 1 583 583 584 584 587

6.5. Hemosztázis (Machovich Raymund) . . . . . . . . . . . A véralvadék képződése és feloldódása . . . . . . . . A véralvadás molekuláris és celluláris mechanizmus ai A fibrinogén és a fibrin . . . . . A trombin szabályozása . . . . . . . . A protrombin aktiválása . . . . . Az aktivált X-faktor keletkezése. A véralvadás beindítása és a véralvadási kaszkád . A trombinképző dés szabályozása; a protein C. . . A véralvadás inhibitorrends zere . . . . . . . . . . A szöveti faktor reakcióút inhibitora (tissue-factor pathway inhibitor; TFPI). A vérlemezkék (trombociták) Fibrinolízis . . . . . . . . . A fibrin feloldása . . . . . . . A plazmin keletkezése . . . . A plazminogén konformáció változásai . A plazminogénaktivátorok . . . . . . . . A plazminogénaktívátorok inhibito rrendszere . A plazmin inhibitorrends zere A fibrinolízis szabályozása . . . . . . A máj szerepe a hemosztázisban . . . . . . Az endothelium szerepe a hemosztázisban .

589 589 590 590 592 592 593 594 589 596 598 599 60 l 60 l 602 602 603 604 604 604 606 607

xv l

)))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))})))))))))))))))))))))))))))) )))}))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

TARTALOM

6.6. Mitokondriális betegségek (Sümegi Balázs) . . . . . . . . . . . . . . A mitokondriális genom károsodása .. . . . . . . . . . . . . . . . Mitokondriális genom mutációi és az ehhez kapcsolódó betegségek A mitokondrium oxidatív károsodása, öregedés Terápiás l ehetőségek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

610 610 613 614 615

6.7. A klinikai laboratóriumi diagnosztika biokémiai há tter e (Dux László). A klinikai laboratóriumi diagnosztika célja, feladata . . . . . . . . . . . A laboratóriumi diagnosztika, mint az élő szervezetek áramlási egyensúlyának nyomon követése . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Normál-, referenciatartomány fogalma meghatározása Káros laboratóriumi eredmények típusai . . . . . . . . La boratóriumi diagnosztikai eredmények hibái, értékelése . Az eredmények valódisága, pontossága, véletlen és szisztémás hibák Laboratóriumi diagnosztikaimér ések kalibrálása, standardok típusai . Kü l ső minőségell enőrzés a laboratóriumi diagnosztikában A laboratóriumi diagnosztikai vizsgálatok fő fázisai . A preanalitikai fázis . Az analitikai fázis . . A posztanalitikai fázis Szűrővizsgálatok . . . . . .

616 616 616 617 617 618 618 618 619 620 620 621 622 623

Tár gymutató . . . . ..

625

LOM

ilO ilO

il 3

d4 ol 5 16 16

Előszó

az

első

kiadáshoz

1996.

16 17

17 18 18 18 19

w

!O

~l

:2 :3 5

Biokémia könyve t írni egyszer re há lá és nagyon nehéz fe ladat. Hálás mert az utóbbi évtized ek talán leggyor abban és legnagy obb mértékb cn fejl ődő tudomá nyágáró l van szó, és nehéz, mert a terjedelmi korlátok egy rendkívül nagy anyagbó l csak szigorú válogat ást engedn ek meg. Kö nyvünk et e lsőso rban orvosta nhallga tóknak szánjuk , ezért az anyag összeállításáná l a meghatározó szempo nt az volt, hogy az o rvosi tanulmá nyokho z szervcs cn ille zkcdő, az egészsé ges és ká ros működésck megérté sét segítő ismereta nyagot adjunk közrc. A ham1adik évezred ben pályáju kat kezdő orvosok nak azzal a nem ki követei ménnye l kell szembe nézni, hogy megérts ék az embert, mint komple x biológiai-társadalmi lényt, de ugyana kko r érte lmezzék. a szcrvezct működését a molekulák szintjén is, - azon a szinten, ahol a terápiás tevékenység során a legtöbb ször beavatk oznak. Jelen könyvü nk az ehhez szükség es molekuláris szemlélet kialakítását kívánja szolgálni. E nnek a célnak a szem e lőtt tartásáv al do lgoztak a szerzők , akik a Semme lweis O rvostudományi Egyetem oktatói, és évtizede k óta nagyj ábó l azonos szem lé lettel, az orvosi-funkc ionális szempo ntok mindcn kori szem előtt tattásáv al oktatják a bio kémiát. A tanköny v tartalma zza a legalapvetőbb biokémia i ismereteket, a szervczctet felépítő mo lekulák egyszerű leírásától a fo lyamato k szabály ozásáig. Kü lön fej ezetet szentelt ünk a gyakorl ati orvostu domány ban is egyre nagyob b j elentőségge l bíró mo lekulári s biológia i ismeret ek összefo glalásá nak, amely magyar nyelvü biokém ia tanköny vben most kap először fo ntosság ának megfele lő hel yet. Szintén a megszakottó l nagyob b hangsúllyal, külön fej ezetben kaptak helyet a recepto rok és a szignál transzdu kc iós mechanizmuso k, ame lyek az embc1i szervcz et szabá lyozó mechanizmu ainak megérté c szempo ntjából kiemel kedő j elentőségűek. A szcrzők nek, akik megpró bállák a legúJabb - de kellően megerősített és ezért tanköny vbe foglalha tó - ismeret eket összegy űjteni , tudomá sul kellett venni , hogy mivel e terű leteken az ismeretanyag napró l-napra gazdagodik, a könyv megjele nésének időpo ntjában már kezdhet nék a fejezete k kiegész ítését. Az elnevez é ekben, a kiadó i szándék ellenére , sok he lyütt eltértün k az akadém iai kémiai he lyesírás i szabályzattó l és inkább a szakma i nyelvbe n elfogad ott angolsz á z írásmó dot használ juk. A kö nyv kéziratá t kiváló lektoro k o lvasták, és látták e l megjeg yzésekk el. Az észrevéte leik és a j avaslata ik nyomán elkészít ett módosítások javították a könyv színvon alát. A szcrkesztő ezúton is köszöni mindhá rom lektor (Alkonyi István egyetemi tanár, Pécsi O rvostudo mányi Egyetem ; Dux László egyetem i tanár, Szent-G yörgyi Albert Orvostu dományi Egyetem ; Friedric h Péter akadém ikus, MTA Szegedi Bio lóg iai Közpon t Enzimo lógia i Intézete ) lelkiismeretes és hozzáértő munkáj át. A szcrzők az egyes fej ezetek végén köszöne tte l említik meg azoknak a nevét, akik a fejezet megírá át j avaslata ikka l, tanác aikka l segí tették. Külö n is szcretné m köszöne temet kifej ezni Dr. Szikla Károlynak, aki a szcrkes ztési munká latokba n nyújto tt rendkív ül nagy segítség et. Köszönöm a Semme lwei Kiadó zerkcsztői kollcktívájának , hogy szívükö n viselték c könyv sorsát és minden t megtettek azért, hogy a biokémia tankö nyv igényes kivitelben kerű lj ön o lvasói kezébe. Az o rvostanhallgatók an kívül a könyve t j ó szívvel aj ánlo m azoknak az o rvos ko llégákn ak is, akik szakmáj uk egy-egy problémájának megérté séhez ismerni kívánjá k a mo lekulári s történés eket vagy egyszerűen képet kívánna k kapni arró l, hogy meddig j utott a biokémia az életfoly amatok megérté sében azóta, hogy e lhagytá k az egyetem et. Ehelyüt t is kérem a kö nyv mindcn kedves o lvasóját, hogy észrevételét, a jót és rosszat egyaránt, j uttassa cl hozzám.

Dr. Ádám Veronika

Előszó

a második kiadás

2000.

Négy évvel az első kiadás után jelenik meg az Orvosi Biokémia tankönyv második kiadása. Ez a könyv nem teljesen azonos az előzőveL Az a rendkívül gyors fejlődés, ami a biokérniában és különösen a molekuláris biológiában történik, arra késztetett bennünket, hogy könyvünke t kiegészítsük a legfonto abbnak tartott új ismeretekkel, azokkal, amelyekre a most orvostudom ányt tanuló hallgatóknak néhány év múlva már a gyakorlatban is szükségük lehet. Így e könyvben helyet kapott a sejthalál, a sejtproliferáció vagy a mitokondriális betegségek részletesebb leírása is. A könyv második kiadása a Medicina Könyvkiad ó gondozásában jelenik meg. Hálásan köszönöm a J(jadó szerke ztőinek az igényes, szép kivitel t. Ismételten köszönöm Dr. Szikla Károlynak a szerkesztö t segítő gondos munkát. A könyv szerzői az ország négy egyetemén ek Orvostudományi Karán a biokémia meghatározó oktatói, akik eltérő tudományos területen dolgoznak, de e könyv írásakor egységesen azt a szemponto t tartották szem előtt, hogy az orvostanhallgatók igényeinek , és a leendő orvosoktól elvárható tudásszintnek leginkább megfelelő ismeretanyagot adjanak át. A szerzők szeretik a biokém iá t ésszerették írni ezt a könyvet. Remélem sikerül megláttatniuk nemcsak a bonyolult összefüggéseket, hanem azt a rendet és szépségét is, ami molekuláris szinten is jellemzi az emberi szcrvezet működését. Változatlanul kö zönettel váram a könyvvel kapcsolato s észrevétele ket Dr. Ádám Veronika

..

1•

A fehérjék és enzim.e k szerkezet e, funkciója

FEJEZET

1.1. A fehérjék szerkezete (Machovich Raymund) Aminosavak Az aminosavak szerkezeti tulajdonságai Az aminosavak oldallánc szerinti csoportosítása A fehérjékről általában A proteinszerkezet különböző szintjei: a háromdimenziós struktúrakialakul ása Fehérjék elsődleges szerkezete Fehérjék másodiagos szerkezete Fehérjék harmadlagos szerkezete Fehérjék negyedleges szerkezete Multienzim komplexek Szupramolekulári s struktúrák Fehérjék denaturációja A natív állapot kialakulása: a fehérje feltekeredése A fehérjeszerkezet megismerését szolgáló metodikák Gélelektroforézis Izoelektromos fókuszálás Dialízis és gé lszűrés Ioncserélő és affinitáskromatog ráfia 1.2. Enzimek (Faragó Anna) Az enzimek katalitikus funkciója Az enzim- szubsztrát komplex kialakulása A katalízisben szerepet játszó tényezők Az enzimek osztályai Koenzimek és prosztetikus csoportok A Michaelis- Menten-modell Az enzimaktivitás gátlása Az enzimaktivitás szabályozásának módjai Allosztérikus enzimek Az enzimműködés szabályozása foszforiláció-defo szforiláció segítségével A proenzimek átalakulása aktív enzimmé limitált proteolízis segítségével Az enzimek néhány gyakorlati alkalmazása az orvosi diagnosztikában 1.3. A hemoglobin és a mioglobin (Mandl József) A hemoglobin és a mioglobin szerkezete, oxigénkötése Az oxigénleadás szabályozása A hemoglobin aminosav-összeté telének változásai. Haemoglobinopat hiák

A fehérjék szerkezete

.1 •

Machovich Raymund

Aminosavak Az emberi szervezet fehérjéi gyakorlatilag 20 különböző L,a- aminosavból képződnek, de nem minden febérjemolekulában fordul elő az összes aminosav. Bizonyos aminosavak, amelyek már jelen vannak a fehérjében, tovább módosulhatna k, ami újabb aminosav kialakulását eredményezi (pl. hidroxi-lizin, hidroxi-prolin, gamma-karbo xiglutaminsav). A 20-féle aminosav által biztosított variációs lehetőségek és a változatos molekulatöme gek bőven elégségesek a természetben található 10 12 febérjeféleség megvalósulásához.

Az aminosavak szerkezeti tulajdonságai Valamennyi, fehérjét alkotó aminosav karboxilés aminecsoportot tartalmaz az a C-atomon (alfa-aminosav) (1-1. ábra). Az egyes aminosavak különböző oldalláncokka l rendelkeznek, ennek rnegfelelően eltérő méretűek, töltésűek és fizikokémiai tulajdonságaik is különbözőek. A glicin kivételével az aminosavak aszimmetriku s C-atomot tartalmaznak, így optikailag aktív molekulák. A fehérjéket L-aminosavak alkotják. Vizes oldatban az aminosavak ionok, protondonorok vagy protonakcepto rok lehetnek az oldat pH-jától fiiggöen. Fiziológiai körűlmények között, pH 7,4 körül a monoaminom ono-karbonsa vak szinte teljesen ionizált állapotban vannak (a karboxiicsoport coo·, az am inocsoport NH3 ~), így egy pozitív és egy negatív töltésük van: ikerionok.

Az aminosavak oldallánc szerinti csoportosítása A fehérjék szerkezetének és funkcionális sajátosságainak megértéséhez szükséges az aminosavak kémiai tulajdonságainak ismerete. Az am inosavak oldallánc szerinti csoportosításá nak alapvető szempontja az oldallánc polaritása, vízzel való kölcsönhatása. A 20 aminosav között apoláros (hidrofób), valamint poláros (hidrofi J) aminosavakat egyaránt találunk. Oldalláncok szerinti felosztásban öt csoportot különböztetne k meg.

O Apoláros, nem aromás oldallánccal rendelkező aminosavak. A hidrofób oldallánc az alan in, valin, leucin, izoleucin esetében elősegí­ ti a fehérjén belüli hidrofób kölcsönhatáso k kialakulását. Ide sorolható még a legkisebb aminosav, a glicin (az apoláros oldallánc egyetlen H), ez a polipeptidlánc legnagyobb flexibilitását teszi lehetövé. Ennek ellentéteként a szekunder gyűrübe zárt aminocsoport következtében kialakuló merev konformáció miatt a Jegkisebb szerkezeti flexibilitást megengedő aminosav a prolin. f) Aromás aminosavak. Az aromás aminosavak közé tartozó fenilalanin, tirozin és triptofán szintén hidrofób kölcsönhatáso k kialakításában vesznek részt, kü lönösen, ha más aromás aminosavakkal kapcsolódnak. A tirozin hidroxilcsoportja hidrogénhídk ötéseket alakíthat ki.

4

A FEH ÉR.I ÉK ÉS ENZI MEK ZERKEZETE , FUNKCIÓJA

)))))H»»»»»»»»> »»m»»m>>»>»> »»»»>>»»»»»»» »>»»»»»»»»»•»»> »•

CH3

H

(6,01)

+

H N3

H - C - CH

CH

CH:t

l

/"CH CH

3

-l

tH

prolin, Pro, P (6 ,48)

izoleucin, Ile, l (6,02)

leucin, Leu, L

(5,98)

r:

-coo-

cool C-H l

coo-

N-9-H

3

l

Q

CH2

6

Cf-l

coo l C-H l

CH2

l

3

CH

valin, Val, V (5,97)

alanín, Ala, A

cool + HN - C - H l 3

+

/

Cl-l

glicin, Gly, G (5,97)

H N-

cool + HN - C - H l J

cool ~ H N -C-H l 3

cool + HN - C - H l 3

-~- H

j

CH

l .

C= CH l

OH

L

fenilalanin, Phe, F (5 ,48)

cool 1 H N-C- H l 3 CH p H

l

l

l'

-coo-

H N -C l -H 3

l

H -C- OH

l

CH3

szerin, Ser, S (5, 68)

triptofán, Trp, W

tirozin, Tyr, Y (5,66)

treonin, Thr, T (5,87)

l

l

(5,89)

cool H H3 N-9f

l j

CH

l

SH

l --

cisztein, Cys, C (5,07)

cöQ-l l -H l HN - C +

3

'

CH

l CH"

l

s l

~"'H

metionin, Met, M (5, 74)

A FEHÉRJÉK SZERKEZETE

)))))))))))))))))))))))})))))))))))))))))))))})))))))))))))))))))))))))))))))) )))))) ))))))))))))})))))))))))t)))))))))))))))))))))))~))))))))))))))))))~

aszparagin, Asn, N (5,41)

glutamin, Gin, Q (5,65)

aszpartát, Asp, D (2,77)

glutamát, Glu, E (3,22)

5

karakterü oldalláncot

+

cool

H N-C-H 3

l

CH~

l

CH2

*t

CH z.

6Hl lizin, Lys, K (9,74)

arginin, Arg, R (1 0,76)

hisztidin, His, H (7,59)

1-1. ábra. A fehérjéket alkotó aminosavak képletei. Feketével a valamennyi aminosavban közös részeket, pirossal az oldalláncokat jelöljük, zárójelben az izoelektromos pontot adjuk meg

6

•>»>~>»»»m•>»m>»>»»>»»>»>>m>m>»>>»>>>>>>»>»»»»»>»>>>>>>»>mm>>>m»

Poláros, töltéssel nem rendelkező oldalláncot tartalmazó aminosavak. Az ide tartozó szerin, treonin, cisztein, aszparagin, glutamin és a kevésbé poláros metionin olyan funkciós csoportokat tartalmaznak, amelyek hidrogénkötéseket képeznek vízzel, így ezek a molekulák jobban oldódnak vízben, hidrofilek. A cisztein könynyerr oxidálódik cisztinné oly módon, hogy diszulfidhidat képez egy másik ciszteinneL O Savas karakterű oldalláncot tartalmazó aminosavak. Két aminodikarbonsav, az aszparaginsav (aszpartát) és a glutaminsav (glutamát) tartozik ebbe a csopo.rtba. 0 Bázisos karakterű oldalláncot tartalmazó aminosavak. Ezt a csoportot a lizin, az arginin és a hisztidin képezi. @)

A

fehérjékről

általában

Fehérjék (proteinek) alatt aminosavakból felépü lö polipeptidláncokat értünk, amelyekben az egyik aminosav a-karboxil-csoportja, egy másik aminosav a-amino-csoportjához peptidkötéssel (amidkötés) kapcsolódik. A polipeptidlánc szabályosan ismétl ődő részbő l ("fő lánc") és változó részből ("oldallánc") épül fel:

H O +

l

H

ll

l

O

H O

ll

l

ll

HN -C- C- N- C- C-N - C- C- rr 3 l l l l l R1

H

R2

H

R3

A polipeptidlánc váza. A szabályosan ismétlődő részeket a peptidkötések (pirossal jelezve), míg a változó részeket az aminosav szerkezetétől függő R oldalláncok alkotják

A természetben ezek képezik a legváltozatosabb biológiai makromolek:ulákat. A sejtek szárazanyag-tartalmának kb. 50%-át alkotják. Strukturális és funkcioná lis szerepet töltenek be. Becslések szerint az é lővi lágban l 0 10- 10 12 különböző fehérje fo rdul elő , ebből kb. l 05-féle található meg az emberi szervezetben. Megkülönböztethetünk egyszerű és összetett fehérjéket; az előbbiek csak aminosavakból épülnek fel (kb. 50% C, 23% O, 16% N, 7% H és 0-4% S), az utóbbiak a fehérje-

A FEHÉRJÉK ÉS ENZIM EK SZERKEZETE, FUNKCIÓJA

lánc mellett más komponenseket is tartalmaznak (nukleoproteinek, lipoproteinek, glikoproteinek, foszfoproteinek, metalloproteinek stb.). A legtöbb ismert fehérje kb. l 00-300 aminosavból épül fel. A fehérjék nagyfokú variációt mutatnak molekulatömegük szerint is, amely nagy általánosságban 5 és l OOO k.Da között változik. A fehérjék molekulatömegét " relative molecular mass" (Mr), illetve dalton (Da) vagy kitodatton (k.Da) formában szokták kifejezni; így pl. a plazminogén (791 aminosavból épül fel) molekulatömege: Mr 90 OOO vagy 90 OOO Da, vagy 90 kDa. A fehérjék különböző biológiai funkciókat látnak el: O Szerkezetkialakítás. A citoszkeleton fontos al-

kotóelemei a fehérjék. A kötőszöveti elemek (pl. extracelluláris mátrix) és a vázszerkezetek (pl. csont, porc, inak, ligamenturnok, bőr, köröm, haj) kialakításában elsösorban a kollagének, az elasztin, az a-keratin és a mukoproteinek vesznek részt. 6 E nzimatikus katalízis. A biológiai rendszerek csaknem összes kémiai reakcióját makromolekulák katalizálják, amelyeket enzimeknek nevezünk. Az enzimek legnagyobb részét proteinek alkotják, bár bizonyos RNS- és poliszacharid-féleségek is rendelkezbetnek katalitikus aktivitássaL @ Transzportfolyamatok és tárolás. A fehétjék különféle molekulákat szállítanak. Így pl. a hemoglobin (vérben) és a rnioglobin (izomban) szá11ítja az 0 2-t, a transzferrio a vasat, a cöru loplazmin a rezet, a szérumalbumin a zsírsavak egy részét, a lipoproteinek a lipideket stb. A sejtmembránorr keresztül történő transzportfolyamatokban is kulcsszerepet játszanak a fehérjék. Raktározási szerepet tölt be a ferritin (vas), az ovalbumin (tojásfehérje) vagy a kazein (tejfehérje). O Hormonok és növekedési faktorok. Eukariótákban különböző növekedési faktorok és hormonok szabályozzák a növekedést, a fejlődést és a differenciálódást, amelyek egy része fehérje vagy peptid; pl. inzulin, ACTH, szomatosztatin. 0 Neurotranszmitter és receptor funkciók. A fehérjék fontos szerepet játszanak bizonyos receptorok kialakításában, amelyeken keresztül

AFEHtRJ tK ZERK EZETE

» » >>» » » >>>>» >>» >»>>>>>>>»>>>>>» >>>>>>>>>>>H>>>>>>»»>>>H>>>>»»>>»>>>>>>H> »>>» >>>>>»>>n>n>>>>>>>> >>>H>>>>>>n> >n>>>>>»»>>>>>H>>>

különböző

ingerek érvényes ülhetnek; pl. rodop zin: fotonak érzékelés e, vagy hormono k és neurotranszmittere k receptora i. Néhány neurotranszmittert is fehérjék alkotnak. @ Kontrakt ilitás. Az izomössz ehúzódás komponenseinek nagy részét fehérjék alkotják; ilyenek pL az aktin és a miozin. A sejtmozg ásokért (pl. spermiumok vándorlása), a sejtek osztódásá ért (kromoszómamotilitás), a sejtszekréciós folyamatokért (pl. a máj vagy a vérlemez ke szekréciós rendszerei) is fehérjék a felelősek. f) Védekezés. A szervezet védelmét vírusokkal és baktériumokkal szemben nagymértékben specializálódott fehérjék képezik; mint pl. az immun ellenanyagok (antitestek), a komplem entek. A vérveszteség megakadá lyozását szolgáló rendszerek szintén fehérjék. (l) A fehérjék mérgekk ént is szerepelh etnek; pl. diphtheriatoxin, clostridiu m botulinum toxin, kígyómérgek.

A fehérjékben az aminosav ak peptidkö tésekkel kapcsolódnak egymáshoz (1-2. ábra); biológiai szintézisük során az első beépülő aminosav a.aminocsoportja szabad marad (N-terminális). En-

nek megfelelően az aminosav sorrend le- írását ezzel a résszel kezdjük, így a végső aminosav szabad a.-karboxi l-csoport ot tartalmaz (C-termin ális). A peptidköt és savamidk ötés, a létrejött peptid szubsztituált amidnak tekinthető, illetve felfogható úgy is, mint acilezett amin. A peptidek elnevezése a reaktív acilcsopo rt jelzésével történik: pl. ha az N-terminális aminosav glicin és a C-termin ális alanin, akkor a dipeptid neve: glicil-ala nin. A peptidkö tés kialakulása energiaigényes. A fehérjékben a peptidköt és víz jelenlétéb en spontán hidrolizál, de a hidrolizis sebesség e rendkívül kicsi. Katalizátorok (pl. proteázok ) jelenlétében azonban extrém módon felgyorsu lhat A két aminosav ból álló peptidet dipeptidn ek, a hárombó l állót tripeptidn ek, a többő l felépülőt pedig o ligapeptidnek nevezik. Az 50-nél több aminosavból álló peptidet általában polipeptidként tartják számon.

A protein szerke zet különböző szintje i: a három dimenz iós struktú rakiala kulása A fehérje szerkezet ét az amino avak sorrendje meghatározza. Az aminosavsorrendet primer vagy el sőd leges szerkezet nek nevezik. A a lapvetően

o

o

ll :. . . . . . Y--.
l

/

Rt

ll yo

N - C- H

l

H

R2

O

H 1 -C- N- C

n

l

H

l

R2

körülmén yektől ft.iggően

további, molekulá n belüli kölcsönh atások jönnek létre. A peptidköt ések között hidrogén hidak alakulnak ki (szekunder vagy másodlag os szerkezet ), majd sorrendbe n egymástól távol álló aminosav ak térben egymáshoz közel kerülve stabilizálódhatnak oldalláncaik közötti újabb hidrogén kötések, hidrofób és ionpár-kölcsönhatá sok, illetve S-S hidak kialakulá sa révén (tercier vagy harmadlagos szerkezet). Mindez nagyfokú variációs lehetőségeket biztosít a fehérjék térszerkezetének. Végezetül két vagy több polipepti d-"gomb olyag" is kölcsönhatásba kerülhet egymássa l, mint alegysége k kapcsoló dnak össze (kvaterne r vagy negyedle ges szerkezet ). A kül önböző szintü szerkezet ek vázlatos képe látható az 1-3. ábrán.

A fehérjék 1-2. ábra. Két aminosav összekapc solódása; a peptidköté s kialakulása

7

elsődleges

szerkez ete

A fehérjék elsődleges szerkezet ét az aminosav ak sorrendje és az azok között kialakított peptidkötés jelenti .

8

A FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK SZERKEZETE, FUNKCIÓJA

1-3. ábra. A fehérjeszerkezet szintjei

A peptidkötésben a szén- és nitrogénatomok közötti távolság nem jelez sem tisztán cr-, sem tisztán cr1t-kötést; a két lehetséges távolság közötti átmenet, 7t-delokal izáció miatt jön létre (1-4. ábra). A peptidkötésben részt vevő hat atom egy síkban helyezkedik el, és az oxigén a hidrogénhez képest, illetve a két a-szénatom egymáshoz képest mindig transz-helyzetet foglal el. Az atomok egymással közel 120°-0S szöget zárnak be. A 7t-delokalizáció hozza létre azt a merev szerkezetet, amelyben a C-N kötés körüli rotáció nem lehetséges. Ezzel szemben az a-szénatom (Ca) és a karbonil szénatom (:::Cc - o) , illetve a Ca és a nitrogén között cr-kötések vannak, így ezek mentén rotáció következhet be (1-5. ábra). A rotáció mértékétöl függő­ en a peptidekben stabit és instabi l konfonnációk jöhetnek létre, illetve további szabályosan ismétl ő­ dő szerkezetek. A rotáció mértékét befolyásolja az oldalláncok térszerkezete, vagyis, hogy a peptid-

o-

o

l

ll

+

C -C - N-C ••--•• C -C= N -C c.

l H

u

a

J

"

H

1-4. ábra. A peptidkötés jellemzöi. A peptidkötésben a karbonil szénatom és a nitrogénatom közötti kötéstávolság (O, 132 nm) a tisztán cr, illetve CJ1t kötéstávolságok közé esik

kötést kialakitó aminosavak milyen tulajdonságokkal rendelkeznek (lásd késöbb).

A FEHÉR.IÉK ZERKEZETE

9

zetek találhatók. Ennek két fajtája ismert: az a-bélix és a ~-redőzött lemez. Az a -hélix úgy alakul ki, hogy a peptidsíkok a N-Ca- és Ca-C=O cr-kötések, mint tengelyek körül olyan szöggel fordulnak el, hogy egy helikális alakzat jön létre, amelyet hidrogénkötés ek stabilizálnak Egy polipeptidlán con belül két, egymástól 4 peptidkötés-tá volságra lévő amid nitrogén atomja és a karbonil oxigén atomja között hidrogénkötés jön létre. A hidrogénhidak a hélix hossztengelyével majdnem párhuzamosa k (1-6. ábra). Egy csavarmenete t 3,6 aminosavrész alkot és a csavarodás az óramutató járásával megegyezik Uobb menetes). Egy csavarmenet magassága 0,54 nm. Az aminosav-oldalláncok a hélix külső feJszínén helyezkednek el ("kllógnak"). A molekulaméretek és a tekeredés következtében a peptidkötés körüli atomok olyan közel kerülnek egymáshoz, hogy a hélix bel ső része nem " üreges", hanem "kitöltött". Minthogy a bélixet nagyszámú hidrogénkötés tartja össze, ezért a polipeptidlán c másod-

1-5. ábra. Az a.-szénatom körüli rotáció lehetősége. A valóságban az atomok egymás között nem 90°-0S, hanem attól eltérő szögeket zárnak be (Ca -nál - 1ogo, tetraéder)

A fehérjék másod/agos szerkezete Röntgendi ffrakciós vizsgálatok azt mutatják, hogy a fehérjékben periodikusan rendezett szerke-

1-6. ábra. Az a.-hélix konformációja. A képzeletbeli tengely körül csavarodó polipeptidlánc egy csavarmenetét mutatja az ábra. A peptidkötések planáris síkját téglalapok jelzik, a hozzájuk tartozó és a hélix tengelyétől kifelé elhelyezkedő oldalláncokat az R betük illusztrálják, a hélixet stabilizáló peptidkötések közölti hidrogénhidakat pedig piros pettyek mutatják. A mellékletben az a.-hélix stabilitását biztosító egyik hidrogénhid sematikus szerkezetét jelezzük. További hidrogénhidak jöhetnek létre a második és ötödik, a harmadik és hatodik stb. peptidkötések között is, amelyek csak térbelileg heliká/isan feltekeredett formában alakulhatnak ki

E c:

tengely

H

H

~

O

H

H

~

O

H

l l l l l l l -N-C- C-N- C- C-N- C- C-N-C- C-N-C- C1 l l l l l l l l H

R1

O

t

H

H

R3

O

H

H

'

R5

O

l0

»»»>»mmnmm>>»»>»>•>»>>m>»n>>»>>»»>>»»>»»>>»»»>m»»>»>»mm>>

Iagos szerkezete nagyon stabil. A hélix azonban megszakad o lyan helyeken, ahol prolin foglal helyet az aminosavsorrendben, ugyanis a prolin

1-7. ábra. A (3-redőzött lemez stabilltását biztosító hídrogénhidak helyzete

A FEHÉRJ ÉK ÉS E~ZIMEK SZERKEZETE, FUNKCIÓJA

a-he lyzetű

N-atomja egy merev gyűrű tagja, így a peptidsík megfelelő forgásszöge a N-Ca tengely körül nem jöhet létre. Fenti ok miatt a prolin N atomja hidrogénhíd kialakítására sem képes. Ezek a tényezök együttesen indokolják, hogy a prolin " megtöri" az a-hélixet. Az a-hélix szerkezetet destabilizálják, illetve kialakulását nem teszik lehetövé nagy térkitöltésü vagy ionos karakteru oldallánccal rendelkező aminosavak, ha azok halmozottan követik egymást. Hidrogénhidak más módon is kialakulhatnak a peptidkötések között. Az egymást követő peptidsíkok az előbbiekben említett tengelyek körül egymáshoz képest úgy is elfordulhatnak, hogy egy kinyújtott, ún. "cikcakk" szerkezet alakul ki. A peptidkötések egymáshoz úgy kerülnek közel, hogy két polipeptidlánc egymás mellett helyezkedik el, vagy egy polipeptidlánc úgy tekeredik fel , hogy annak különbözö szakaszai kerülnek egymás közelségébe. A hidrogénhidak az egymás rnellett párhuzamosan elhelyezkedő szakaszok peptidjei

[l

i

i

R - C- H

[N'

l

"""

.... 0 7

c

c

. . H- N

H - C-R

""" / "

~ - H ··

/

H - C- R

/.::::::::0 """ ......

.:::::::, 0 .

H - C- R

c

....

c

...... H - N/

i

R - C- H

07

c

""" /

" "-

N-

H ........

/

R - C- H

R - C- H

i

r

i

r1

parallel

D antiparallel

1-8. ábra. Parallel és antiparallel felépítésű p-redőzött lemezek. A polipeptidláncok vagy -láncszakaszok között kialakuló hidrogénkötéseket piros pettyek jelzik

A FEH ÉRl ÉK SZERKEZ ETE

)))))))))))UU))))) )))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))> )))))))))))))))))))l

között jönnek létre úgy, hogy orientációjuk a szerkezet hosszteng elyére meröleges. Az ilyen, hidrogénhidakkal rögzített szerkezetet ~-redőzött lemeznek (~-pleate d sheet) nevezik (1- 7. ábra) . A láncok lehetnek parallel vagy antiparall el belyzetüek attól függöen, hogy milyen a lefutásuk iránya. Ha az egymás mellé került polipeptidláncszakaszok N- és C-terminális iránya megegye zik, akkor parallel, ha ellentétes , akkor antiparall el ~-redőzött lemezről beszélünk (1-8. ábra) . Az R oldalláncok váltakozva a lemez síkja fó lé és alá orientálódnak. Míg az a-hélix szerkezetek " rúd"szerű formátum ot mutatnak , a ~-redőzött lemezek "lap"-sze rű formát alakítana k ki. Egy-egy fehérje nem szü kségszerű en csupán a-hélixbö l vagy ~-redőzött l emezből áll; ezek és más szabályos (~-tum) vagy szabálytalan stru.ktúrák (random coil) keveredhetnek egymássa l. A legtöbb funkcionális fehérje zárt, globulári s formában fordul elő, számos ellentétes irányú fordulatjön létre bennük. Ezek l egjell emzőbb alkotóeleme a ~-turn (~-görbül etnek vagy hajtű hajlatnak is nevezik), amely az a -hélix alapszerk ezetéhez hasonlít, de a hidrogénhíd az e l ső és harmadik peptidsíkok között j ön létre a láncon belüli egyik aminosav C=O csoportja és az ettől harmadik helyzetű NB-csop ortja között {1-9. ábra) . A ~-tum második eleme nagyon gyakran proli n. A ~-görbüle t a polipeptidlánc irányának hirtelen megváltozását eredmény ezi (1-10. ábra). A random coil nem tartalmaz szabályosan ismétl ődő struktúrát (1- J l . ábra).

R

H

C- C-

J / R N- C

l

/1

H- N

~

H

ll O

C= O

l

R- C - H

l

ll

u-hélix

-gorb1.,1let

cx·hélix ~-redőzött

lemez

p-górbulet

p-redőzött

lemez

1-1 O. ábra. Egy polipeptid láncon belüli a -hélixek vagy p-redőzött lemezek váltakozás a p-görbület tel

l~

H

C= O

/ H -N l

H- C - R

l

1-9. ábra. A ~-görbület. Gyakran fordul elő antiparallel lemezekben; innen a neve

~-redőzött

o))))))))))))))>))) )))))))))))U))))))> ))))))))>))))U)))) >H)))))))))))

1-11 . ábra. a-hélixeke t összekapc soló random coil szakasz egy polipeptid láncon belül. A random coil rendezetlen szerkezetet jelent

12

A fehérjék harmadlagos szerkezete A szekunder szerkezeti egységeket is tartalmazó polipeptidláncban további kölcsönhatások révén a primer szekvenciákban egymástól távol eső aminosavak egymáshoz közel kerülhetnek; a polipeptidlánc háromdimenziós globuláris, "gömb" formát alakíthat ki (nem minden fehérjemolekula mutat "gömb" formát, lásd a 6.3. fejezet). A febérjék ezen háromdimenziós, specifikus funkcióra alkalmas alakját natív konformációnak nevezzük. Milyen tényezők alakítják ki ezt a "felgombolyodást" és milyen erők tartják össze? A biológiai rendszerek reverzibilis molekuláris kölcsönhatásai három nem kovalens kötéstípuson alapulnak. Ezek: O hidrogénkötések, 6 elektrosztatikus kötések (ion párok) és ~

A FEHÉRJÉK ÉS ENZIM EK SZERKEZETE, FUNKCIÓJA

>»>>•>•>»>l>»»>»»»»»»»>»»>»»>>»»»m>»»>•»»»>>•l)»»»>»m»>m>»•m•

apoláros kölcsönhatások (London-féle

erők) .

Ezeket kiegészíti még egy kovalens kötés, nevezetesen a fehéijeláncban elhel yezkedő ciszteinek oxidálódhatnak úgy, hogy egymás között diszul-

fidhidakat alkotnak (lásd a fehérjék denaturációjánál). Hidrogénkötések nemcsak két peptidkötés között jöhetnek létre, hanem az aminosavak peptidkötéseiben részt nem vevő, ún. oldalláncok között is. Egyes aminosavak (pl. Trp, Arg) csak H-donorként szerepelnek, mások donorként és akceptorként egyaránt (pl. Asn, Gln). Végezetül vannak olyan aminosavak (pl. Asp, Glu, Tyr, His), melyek a közeg pH-jától függően szerepelhetnek akceptorként vagy donorként {1- J2. ábra), bár ez utóbbi az emberi szervezetben, ahol a pH értéke általában 7 ,4, nem játszik jelentős szerepet (kivéve a His-t). Elektrosztatikus kölcsönhatások (ionpárok) alakulhatnak ki negatív töltésű aminosav-oldalláncok (pl. Glu, Asp) és pozitív töltésű oldalláncok (pl. Lys, Arg) között. (Ezt a kötéstípust sókötésnek vagy sóhídnak is nevezik.) Ezek a kölcsönhatások megszűnnek, ha a pH elég magas vagy alacsony ahhoz, hogy a bázikus vagy a savanyú aminosav elveszítse töltését. Ez részben magyarázza a fehérjék savanyú vagy lúgos közegben történő denaturációját

1-12. ábra. Az aminosavak oldalláncai között kialakuló hidrogénkötések néhány tipikus példája ~

o

R - CH - C 2

""

N- H

rl /

)

~

/

Arg (H-donor)

Asn vagy Gin (H-donor vagy -akceptor) H

.-/ R - CH - C 2

~ ""

o·

0-H -.

~

H

Asp vagy Glu (protonált forma, alacsony pH ; H-donor és -akceptor)

Asp vagy Glu (ionizált forma, magas pH ; csak H-akceptor)

A FEHÉRJÉK ZERKEZETE

))>>»>)))))}) ))))')U)))))))))>>H))))))))))))))))) )))))))))>))>)))))))))>)))))))))))))h ))))))H))))))))))))))))))n))))))))>>) ))))))))))))>>>.)))))

A fehérjék natív térszerkezetének kialakulása nagyrészt vizes fázishoz kötött. Az emberi szervezet víztartalma hozzávetőlegesen 60 tömeg%, de még a csontszövetnek is 30%-át víz alkotja. A vízmolekula dipólus karakteru, az oxigén nagyobb elektronegatí vitása következtében részleges negatív, rníg a két hidrogén részleges pozitiv töl-

1-13. ábra. A globuláris fehérjék hidrátburkának kialakulása. Fiziológiás körülmények között (pH 7,4) a legtöbb fehérje felszíni töltése negatív, amely körül a hidrátburok elrendeződik.

(A vízmolekulákat a

~

szimbolizálja.)

A polipeptidlánc apoláros csoportjai a "gombolyag" centruma felé orientálódva apoláros magot (piros szaggatott vonal) hoznak létre

13

tésre tesz szert. Egy vízmolekula hidrogénkötések révén 4 másik vízmolekulával léphet kapcsolatba, azoknak rendezett struktúrát adva. A vízmolekulák azonban nemcsak egymással, hanem más vegyületekkel is képeznek hidrogénkötést Ilyenek pl. a hidroxil-, az amino- és a karboxiicsoportot tartalmazó szerves vegyületek. Nem meglepő, hogy a fehérjék (primer szerkezetükből következően) nagy mennyiségű vizet képesek megkötni; környezetükben általában rendezett hidrátburok alakul ki . Azok a részek viszont, amelyek nem képeznek a vízzel hidrogénkötést (pl. apoláros aminosavak) a víztől távol, egymás közelébe kerülnek. Vizes fázisban a fehérjék nagy része globuláris formába tekeredik fel ("folding"); a poláros és ionos karakteru oldalláncok a fehérje külső felszíne felé, mig a hidrofób oldalláncok a fehérje-"gombolyag" belseje felé orientálódnak (1- 13. ábra). A fehérje ionos karakterét a pozitív és negatív töltések száma határozza meg; ez természetesen pH-függő . Amikor a fehérj e összes pozitív és negatív töltése megegyezik, a hidrátburok szétesik, a fehérje oldékonysága minimumra csökken, a fehérjeoldat labilissá válik. Azt a pH-értéket, ahol ez bekövetkezik, a fehérjék izoelektromos pontjának (pl) nevezzük. A globuláris fehérjék felgombol yodása tovább módosulhat, ha a polipeptidlánc 200-nál több aminosavat tartalmaz. Egy láncból felépülő fehérjén is különálló "gombolyagok", ún. domének képződ­ betnek (1-14. ábra), amelyek különböző funkciókat láthatnak el (multifunkcionális fehérjék, pl. enzimek). A " tömör" régiót, a doméneket legtöbbször flexibilis részek kötik össze. A hasonló domének va lószínűleg egy ős gén duplikálódásából származnak. 1-14. ábra. Funkcionális nagyobb struktúrelemeket tartalmazó egységek egy fehérjemolekulán belül: a domének. Példaként az urokináz enzim doménjeit (növekedési faktor, kringle, szerin-proteáz) tüntetjük fel sematikusan. További részletekért lásd a 6.5. fejezetet

Kringle

növekedési faktor sze ri n-proteáz

14

)))))))'))))))))))))))))))))))))))))))).))))))))))))))))).))))))))))))))>))))))))))))))))))))))))))

A fehérjék negyedleges szerkezete Egy-egy feltekeredett polipeptidlánc a legkülönfunkeiét töltheti be, de szerepelhet egy funkcionális egység részeként is. Polipeptidláncgombolyagok, mint monornerek vagy alegységek kapcsolódhatnak egymáshoz oligamereket vagy akár polimereket alkotva. Ha két fehérje kapcsolódik, dirnerről, ha néhány, oligomerről, ha sok, polimerről beszélünk. Ha azonos szerkezetű fehérjék kötődnek egymással, homomemek, ha különböző szerkezetűek, heterarnemek nevezzük. A monornerek lehetnek szerkezetileg azonosak, de kü lönbözőek is. A kapcsolódás létrejöhet kovalens és nem kovalens kötéseken keresztül (az utóbbi a gyakoribb). Az alegységek közötti funkcionális kapcsolat jelentőségére lásd pl. a hemoglobin szerkezetét. A fehérjék ilyen jellegű rendezettségét kvaterner struktúrának, a fehérj ék negyedleges szerkezetének tekintjük.

A FEHÉRJÉK ÉS ENZlMEK SZERKEZETE, FUNKCIÓJA

zációt eredményezve; ilyenek például a riboszómák vagy az elektrontranszportlánc membránkomponensei.

bözőbb

Multienzim komplexek A febélje szerkezet egy további szerveződési szintjét eredményezi, hogy bizonyos enzimek, amelyek külön-külön is jól definiált funkciót töltenek be, összekapcsolódhatnak és ún. multienzim komplexet hoznak létre. Az ilyen szerkezetben az egyes enzimek összehangoltan működnek.

Szupramolekuláris struktúrák Multienzim komplexek, oligamer proteinek és egyedi enzimek tovább kapcsolódhatnak egymással egy magasabb szintű makromolekuláris organi-

Fehérjék denaturációja Az e l sődleges, a másodlagos, a harmadlagos és egyes esetekben a negyedleges szerkezet egy adott fehérjében elengedhetetlen a biológiai funkció ellátásához. Azt a szerkezetet, amelyben a fehérje működőképes, natív állapotnak nevezzük. Ha pl. egy fehérjeoldatot melegitünk, a fehérje szerkezetében változások következnek be anélkül, hogy annak primer struktúrája megváltozna. Mindez azt eredményezheti, hogy a fehérje oldékonysága csökken és elvész a biológiai funkciója. A hőmérsékl et növelése fokozza a molekula vibrációs és rotációs mozgását, és ez a gyenge kölcsönhatások megszűnését eredményezi. A legtöbb élőlény esetében a fehérjék biológiai funkciójának elvesztése általában jóval a víz forráspontja alatti hőm érsékletnél bekövetkezik, bár vannak termofil baktériumok, amelyek forró vízben, magas nyomáson, 100 oc felett is élnek. A folyamatot fehérjedenaturációnak nevezzük és úgy magyarázzuk, hogy a kül önböző aminosavak közötti kölcsönhatások (hidrogénhidak, hidrofób kötések, ionpárok) megváltoznak és/vagy a hidrátburok elvész az elsődl eges szerkezet megváltozása nélkül. A fehérjék bizonyos szerves savak (pl. triklórecetsav, szulfoszalicilsav) vagy nehézfémek (Pb, Hg) hatására irreverzibiliserr denaturálódnak. Ez utóbbi egyúttal magyarázatul szolgál a nehézfémek mérgező hatására. A pH-változás az ionpárok megszűnését és a hidrogénhidak felbomlását eredményezheti, amely

NH2

l

C=NH; CI1

NH2 guanidin-HCI

Na-dodecil-szulfát (SOS)

1-15. ábra. Fehérjedenaturációhoz gyakran használt vegyületek

urea

lÓJA

szórán-

s és

j ott

el6rje

~rje

cül, na.

:rJe

:eJ-

uta

öl•bb tak

ltti l fil

A FEHÉRJÉ K ZERKEZ ETE

>>>»>n >»> >> >»> >> >> >>>»»>» >> >> » » >> >HH>» >>>>>> >>>> » >> >>>>>> » >>>>>H))) >»U> n>>>>>> >nu~

szintén a hidrátbu rok mértéké t csökkenti. Ugyancsak a hidrátbu rok elveszté se révén reverzibilis denaturá ciót okoznak a könnyűfémek sói (pl. ammónium -szulfát, nátrium -klorid, magnézium-klo rid) vagy szerves oldósze rek (etanol, aceton stb.). Egyes, ún. denaturá ló vegyüle tek (1- 15. ábra) direkt hidrogén kötéseke t a lakítana k ki a fehérjév el (urea, guanidin). Mások, pl. a detergen sek (Na-dodecil-szul fát), apoláros kölcsönhatásokat létesítenek a febérje apo láro részével, amelyrő l tudjuk, hogy a "gombo lyag" belső részében helyezk edik el; így a fehérje "kitekeredik". Az eredeti körülmé nyek visszaállítása gyakran a fehérje natív térszerkezeténe k visszaalakulásá t eredményezi. Ezek szerint a denaturá ció lehet reverzibilis és irreverz ibilis. A fehérje e tulajdonsága leh etőséget teremt a fehérjék részlege s izo lálására, egymás tól történő elválasz tására. (Pl. bizonyo s ammón ium-szu lfátkoncentrációnál egy adott fehérje kicsapó dik, egy másik pedig nem; centrifu gálássa l így elválaszthatók, majd a só e ltávolítása után a fehérje natív szerkezetc visszaállítható.)

10-

~r­

lk, ta•k) !l-

tV,

á-

bi

:r-

dly

A natív állapot kialakulása: a fehérje feltekeredése A fehérjék z intézise kor az aminosa vak peptidkötésekke l összeka pcsolód nak, és az ún. "protein fo lding" során a peptidlá nc úgy " tekeredik", hogy kialakul a natív á llapot, a fehérje funkcionális szerkeze te. Ennek termodinam ikai oka van: a fehérjelá nc feltekere dése a termodi namikailag legkedvezőbb fo lyamato t követi. A feltekeredett polipept idstTuktúr a (fiziológiás körülmények között a natív konfo rmáció) ene rgetikail ag a fehérje szerkezetének kedvező bb állapota , mint a denaturá lt körülmények között mutatot t térszerkezet. A feltekeredés lényegé hez tartozik , hogy a fehérjeláncot hidrátburok veszi körül, amelyne k egy része feltekeredéskor elvész, mia latt az aminosa vak között kölcsön hatások (elektro sztatiku s, hidrogé nhíd és apoláros) jönnek létre. Sok fehérje natív szerkezetének kialakulásában további kölcsönhatások is részt vesznek , nevezete sen S-S hidak keletkeznek két cisztein oldallánc között. A feltekere dés hatá-

>U>>>»>> ~• >H> n >> >> >>>H> n >n> >»> n n >H> >>

IS

rozza meg a ciszte inek egymás hoz viszony ított helyzeté t és az oxidációjuk során kialakul ó kötések stabilizá lják a fehérje harmadlagos szerkeze tét. Ha pl. egy fehérjében 4 S-S híd kialakul ására van lehetőség (8 Cys ta lálható a primer szerkezetben), a különböző variáció s lehetőségek l 05 egyenlő valószínű ségű kombinációt eredményeznek, ami azt j elenti, hogy a korrekt natív struktúra véletlenszerű kia lakulásá nak kb. l % a va lószínűsége. Kísérletes bizony ítékok azt j e lzik, hogy mindig csak jól defini ált poz íciójú ciszte inek között alakul ki az S-S híd (pl. a ribonuk leázná l; 1-16. ábra). Tehát a primer szerkez et, az aminosa vak sorrendje meghatá rozza a natív állap ot konform ációját. Azonba n nem mindegy ik aminosa v j el entősége egyform a: azonos funkeié t ellátó, de különböző faj o kbó l izolá lt fehérjék sokszor a primer szerkeze tben 50%-ná l is nagyobb eltérést mutathatnak, s konformációjuk mégis nagyon hasonló. Mindez azt j elzi, hogy vannak "kitünte tett" aminosavak, a melyek a szekvenc iában elfogla lt helyzetüktő l függőe n alapvető fontossá gúak a konformáció kialakitá sában. Ezek el sősorba n az a-hélix és a P-lemez kia lak ításában , illetve az aminosav-o ldallán cok közötti kölcsön hatások létrej öttében játszanak szerepe t. Az el sődl eges szerkeze t és a natív ka nfonnác ió kialakulása közötti összeftig gés egyik szép kísérletes bizonyí téka a ribanuk leáz denaturá lása és renaturá lása (lásd 1- 16. ábra). Merkap toetanol (HO-C H2-CHrSH) és urea j elenlété ben a riba nuk leázban jelen l évő 4 S-S híd redukáló dik (merkap toetanol hatására ) és a hidrogén hidak megszűnnek (urea hatására ), aminek követke ztében a fehérjeg omboly ag kitekere dik és elveszti enz imaktiv itását. Ha ezután egyszer re e ltávolítj uk a merkaptoetanolt és az ureát, a feh é1je lassan reoxidá lódik és visszany eri eredeti aktivitá sát. Ha a denaturá lt fehérje ureaje lenlétében reoxidálódik, akkor csak l % aktivitás t lehet visszany erni. Ilyenkor, bár újra S-S kötések a lakulnak ki, azok nem a natív konform ációnak meg felel ő cisztein ek között jönnek létre, hanem ra ndom, a l 04 maradék kombinációs l ehetőség szerint. H a viszont az S-S kötések kialakul ása te ljesen gátolt, pl. erélyes oxidáció val a ci szteinbő l c iszteinsa v képződik (az -SH átalakul -S03 -rná), a denaturá ció irreverzibilissé válik és semmifé le enz imaktiv itást ne m lehet . . v1sszanyem1 .

16

>>>> >> >»H> H>))))> >H>>>»>> )) )) )))))))))))) ))>>>> >>)»>>> >>>)))>U>))>>»))>>))))>))> )))) >> >>))

natív ribanukleáz (aktív)

A FE H ÉRJ ÉK ÉS IINZIMEK SZE RKEZETE, FUNKCIÓJA

denaturálódott ribanukleáz (reverzibilisen redukált; inaktiv)

denaturáció

124

~ ur~:eltávolítás

(S-S híd átrendeződe"'' ""ZE nyomokban)

~E~eltávolítés)

124

1

reoxidált ribanukleáz (.. rossz" S-S hidakkal; inaktív)

1-16. ábra. Fehérjedenaturáció és -renaturáció. A natív ribanukleáz konformációjának stabilizálásában a 26-84, 40-95, 58-110 és 65-72 ciszteinpárok vesznek részt. Denaturáció során az urea a hidrogénhidakat, a merkaptoetanol (ME) pedig az S-S hidakat szünteti meg. A merkaptoetanol eltávolításakor oldott oxigén jelenlétében a ciszteinek reoxidálódhatnak, de az S-S hidak nem a natív szerkezetnek megfelelő helyzetekben jönnek létre (reoxidált ribonukleáz). Az urea eltávolítása után a hidrogénhidak újra kialakulhatnak a fehérje elsődleges szerkezetének megfelelöen, ha nyomnyi mennyiségű SH jelenlétében a .,rossz" S-S hidak redukálódnak Majd a nyomnyi merkaptoetanol eltávolítása és továbbireoxidáció során a ribanukleáz felveheti újra natív térszerkezetét, amelyet a natív konformációnak megfelelőe n egymáshoz közel került ciszteinek közölt kialakuló S-S hidak (további reoxidáció) rögzítenek

Ezek a kísérletek azt is jelzik, hogy az elsődleges szerkezet ismerete nem elégséges a fehérjék felgombolyodásának pontos megértéséhez. A fehérjék környezete nagyon változatos lehet a szintézis helyétől (riboszómák) történő vándorlásuktól, az aminosavmódosulásoktól, a szénhidrátláncok kapcsolódásától ftiggően, illetve lipidmembrán-komponensekkel történő kölcsönhatások következtében. Ezen utak több konformációváltozás lehetőségét tererntik meg. Az ún. natív konformáció megváltozbat, amikorpl. egy enzimmás fehérjével vagy lipiddel kerül kölcsönhatásba, vagy egy allosztérikus regulátor molekula kötődik hozzá (lásd 1.2. fejezetet). A környezettől függő konfor-

mációváltozások lényeges szerepet játszanak az anyagcsere-folyamatok szabályozásában. Ehhez szarosan kapcsolódik, hogy bizonyos fehérjék, az ún. chaperonok speciális szerepet játszanak más, in vivo funkcióképes polipeptid-szerkezer kialakításában. Alapvető funkciójuk, hogy denaturált, de legalábbis nem szabályosan feltekeredett fehérjékhez kötődnek és meggátolják azok aggregálódását, illetve elősegítik a natív konformáció kialakulását. De szerepük lehet a denaturált fehérjék eltávolításában is. A chaperonok különböző proteincsaládból származnak és szerkezetük nem szükségszerüen hasonló. Több közülük ATP-t igényel funkciója ellátásához.

A FEHÉRJÉK ZERKEZETE

» >))»>>>u>H))HH»>>>n>>>>>>>)>>>>n»>>>H>>»»>»>>>>n>> >H»H))>>; >> >>»>>»>H> >»HH>»>u Hn>n>> »>»>>n»>>>>»n> >>,.,>>>>»>» >>

A fehérjedenaturációval kapcsolatban összefoglalóan el kell mondaní, hogy a denaturáció míndig egy bízonyos proteinfunkció elvesztésével jár, de egy fehérjefunkció csökkenése vagy elvesztése nem szükségszerüen azonos a denaturáció jelenségével. A protein natív szerkezetében bekövetkezett kis változás eredményezheti pl. egy enzim katalitikus aktivitásának elvesztését, de ez nem feltétlenül jelenti a másodiagos és annál magasabb fokú szerkezeli szintek teljes felbomlását. A biológiai jelentőséget illetően az az elképzelés, hogy sok esetben a denaturáció jelenti a fehérj ék degradációjának a szabályozását, mert az emésztő enzimek nagy általánosságban nem a natív, hanem a denaturált fehérjéket " ismeri k fel". Végezetül, egy elméleti szempontból figyelemreméltó tényt érdemes még megemlíteni. Nevezetesen, hogy bár a fehérjék elvileg szinte végtelen sok konfonnációt vehetnek fel, a szintézis során a natív konformációjuk hihetetlenül rövid idő, a másodperc tört részei alatt kialakul. Hogy miért és hogyan, az ma még kutatás tárgyát képezi.

A fehérjeszerkezet megismerését szolgáló metodikák A fehérjék izolálása a lapvető feltétel a szerkezet-funkció megismerése szempontjábóL A legjell emzőbb tulajdonságok, amelyek alapján a fehérjék elválaszthatók egymástól és más komponensektől : a méret, az oldékonyság, a töltés és a kötő­ dési affinitás. Oldékonyság alapján történő izolálás: lipide k, szénhidrátok és a l egkülönbözőbb fehérjé k o ldékonysága v ize fázisban, poláro vagy apoláros o ldószerekbe n, dete rgensek jelenlétében, a pH-értéktöl é vagy az ionerősségtől fúggően, más és más. Ezek a lapjá n részlegesen egymástó l e lvá laszthaték. 0 Méretek szerinti elválasztásra alkalmas módszer e k: (i) SOS-poliakrilamid gé le le ktrofo rézi (ame ly denaturált körülmények közölt je lle mzi a fe hérje tömegét), (i i) gélszüréses kroma tográ fia és (iii) ultracentrifugálás. 6 Töltéstől függő szeparálás: (i) elektroforézis, (ii) e lektroforézis pH-grádie nsben (izoelektromo fóku zálás) és (iii) ioncserélő kromatográfi a. €) Ligand (kötődési) affinitás alapján történő elválasztás: sok fehérje fé leség nagy affinitássui kötödik b izonyos

17

kémiai csoportokhoz és így a nagy affinitá sal kötődö fehérje elválasztható a többitől. Ezek a csoportok (lehetnek szintc likus vegyületek, enzimgátl ók vagy szubs..ctrátok, antitestek) kovalcn. cn ún. hordozó anyagokhoz köthctök. Az ún. affinitás kro matográ fiás módszerek e lvét a fenliekben röviden isme rtete tt tulajdonságok képezik. A fehérjék a minosav-összetételé nek meghatározására a ké rdéses proleint izolá lni ke ll, majd savas hidro lízis után (6 N l ICI, ll O°C) az aminosavak io ncserélő kromatográ fiáva l egymástól e lválaszthatók é ninhidrinne l vagy fluoreszkaminnal mennyiségileg meghatározha tók. Az a minosavszekvencia meghatá rozására a fehé rje -terminá lis a mino avát reagá itatni ke ll olya n vegyülette l, ame ly az aminosavval együtt (hidro líz issel) eltávolítható a polipeptidlánctóL Az aminosav nagy nyomású fo lyadékkromaIO~,>Táfiáva l (HPLC) azonosítha tó. Egy következő c iklusban az egy aminocsoporttal rövidült peptid " új" N-termin ális aminosa váva l történik egy úja bb reakc ió . A ciklus töbször isméte lhető ún. a uto matikus szckvenátorokka l. Az ami nosavszekvenc ia meghatá rozá át forrada lmasitotta a rekombináns D S-tcchnika: a D S nuklcotidszekvenciájából következte tni lehet az a mino avak sorrendjé re. A D $-szekvenc ia meghatá rozása egyszerűbb és esete nké nt pontosabb rnódszcr, mint a direkt ami no avszekvená lás, viszont nem ad informác iót a poszttranszlációs módosulásra. A polipeptidláncok mestcrségesen is szinteti.lálhatók. A rnódszer lényege, hogy egy adott aminosav ka rboxilcsoportját víz ben o ldhatatlan anyaghoz kapcsolják, é ezután az o.-aminoe o portját reagáltatjá k egy következő aminosav akti vált o.-karboxilesoportjával. Fehérjék dete ktá lására és kvantitatí v meghatározá ára antitestek is fc lha zná lhatók. A z enzimkötött immunoassay (E U SA) és western blot SDS-poliakrilamid gél ha ználata nagyon elterjedt rne todika. A fehérjé k loka lizációj át immun- tluoreszccnc iáva l és immuno-e lcktronmikros7kóppal (je lzett antitesttel) lehet követni. Fe hérjék funkc ióinak megisme résére, így például kölcsönhatásaik (köt ődései k) leírására gya kran haszná lnak radioaktív izotóp je lzési techni kákat. Ezek leggyakoribb módszere, hogy a fe hérjé kbe n a tirozinokat és hisztidine ket j óddal ( 1251 vaf,ry/és 131 1) j elezne k és arotán a polipe ptide ket a legkül önbözőbb reakc iókhoz használják fe l. A radioaktiv itás mé rtékéből , loka lizációj ából következtetni lehet a fu nkcióra. A fehé rjék háromdimenziós szerkezeté nek a mcgi merésére röntgen-krisztallográ fiá t é mágncse rnagrezonanciát (NMR) használnak.

Gélelektroforézis A gélelektroforézis alapelve az, hogy a töltéssel rendelkező molekulák az össztöltésüknek megfelelően elektromos térben az ellentétes töltéssel rende lkező elektród felé vándorolnak. A vándorlás sebessége (v) függ a molekula töltésétő l (z), töme-

18

''"'""""'"""""" lm>>>»»»)} >)>»>l»>m» »>H»»»»)> )>)>)))»I>»> m»>»»»>

gétöl és alakjától függö súrlódási együtthatótól (t) továbbá az elektromos térerőtő l (E): E·z

v =--

f A fehérjék elválasztásához leggyak rabban olyan porózus gélt használn ak, amellyel a proteinek nem reagálnak és amely egyben molekul aszűröként is szolgá l. A pórusok nagyságától ftiggöen a különbözö méretü fehérjék vándorlá a be folyásolható: ha a molekula mérete kicsi a pórusok hoz képest, gyorsan mozog, ha nagy, a fehérje szinte mozdulatlan marad a gélben (a pórus mérete változtatható). Ha a fehérjék denatur álódnak, nátrium-dodecil-szul fát (SDS: 1-15. ábra) jelenlét ében, akkor a fehérjék jól elválasz thatók egymás tól molekulatömegük alapján. Az SDS erősen kötödik a pol ipeptid apoláro s oldalláncaihoz (általában egy SDS-mo lekula jut két aminosavra), és így a fehérjének nagy negatív össztöltése lesz. Ha a fehérje több láncból épül fel, amelyek et diszulfidhidak tar-

A fEliÉRJ ÉK É F:NZil\1E K SZE RKEZET E, FUN KC IÓJA

tanak össze, akkor azok redukciója után (pl. merkaptoetanol jelenlét ében) az egyes láncok elválaszthatók egymás tól és relatív tömegük meghatározható. A polipeptidláncok elválasztás után láthatóvá tehetök különbözö, festési eljárásokkaL Sok fehérje (bár nem az összes) elektroforetikus mobilitása SDS-poliakrilamid gélben Jogaritmikusan arányos a tömegével. Így, ha ismert molekulatömegű fehérjék (marker ek) is rendelkezésünkre állnak, a módsze r különbözö fehérjék relatív molekulatömegének meghatározására is alkalmas. Az elektroforetikus mobilitá s eredmén yét mutatja az 1-1 7. ábra. A módszer már O, l ).lg protein detektál ását is lehetövé teszi és olyan fehérjék, amelyeknek molckulatömege több mint két százalékkal eltér, általában már megkülönbözte thetök. Az elektroforézise s módszer nemcsak analitika i, hanem preparat iv célokra is felhasználható.

Izoelektromos fókuszá/ás

50

30

25 17

-

-

- --+

1-17. ábra. Az SOS-poli akrilamid gélelektr oforézis. Ismert molekulatömegü fehérjék láthatók az első öt pozícióban, míg a hatodikban egy ismeretlen fehétjekeverék komponenseinek elválasztása követhető . A fehérjeoldatokat a start helyre (szaggatott vonal} juttatják. A fehérjék az SDS-nburokban··negatív töltésüek, így a feszültség rákapcsolása után a pozitív pólus felé vándoro/nak. A gyakorlatban az ismert molekulatömegü fehérjéket összekeverik és egy startponthoz juttatják, ahol elektroforézis után elválnak

Fehérjék elválaszthatók egymástól azon az alapon is, hogy milyen a savas é bázisos aminosav tartalmuk. Azon pH-értéknél, amelyné l a fehérjék össztöltése nulla, a fehérjék nem vándorolnak SDS-me ntes elektroforézis során. Ezt a pH-érté ket izoelektromos pontnak (pr) nevezik , ami jellemző a fehérjékre. Különbö zö töltéstartalmú polimerekkel (poliam folitokkal) olyan pH-grád iens hozható létre, amelybe n a fehérjék addig vándorolnak, amíg el nem érik az izoelektromos pontjuknak megfe lelő tartományt. A fehérjék ilyen alapon történő elválasz tását izoelekt romos fókuszálásnak nevezik. A módsze r kombinálható az SOS-poliakrilamid gélelekt ro foréziss el, nagy érzéken ységű szétválá st eredményezve. Így először izoelektromos elválasztást végezne k az egyik irányba, majd utána erre merölegescn SDS-gélelektroforézist. A módszer, amelyet kétdimenziós elektrof orézisne k nevezne k, alkalmas egy-egy sejtféleség közel ezer különfé le fehérjéinek elkülönítésére. ....

Dialízis és

gélszűrés

A fehérjék könnyen elválasz thatók kis molekulatömegű vegyületektől dialízis segítségéve!. Az el-

FEHÉRJÉK ZERKEZETE

19

járás lényege, hogy szemipermeábilis membránon (pl. pórusos cellulóz), amelynek pórusátméröi jelentösen kisebbek, mint a fehérjék mérete, a polipeptidek nem tudnak átdiffundálni, míg a pórusméreteknél kisebb molekulák szabadon vá ndorolnak. A módszert elsősorban fehérjéknek ionoktól, sóktól és általában kis molekulatömegü vegyületektől történő e lvá lasztására vagy kicserélésére használják. Hasonló elven működik a gélszüréses kromatográfia, de a dialízisné l sokkal kifinomultabb eljárás. Ez a módszer fehérjék egymástól történő elválasztását is lehetövé teszi és alkalmas a relatív molekulatömeg meghatározására is. A módszer lényege, hogy vízben o ldhatatlan, de nagymértékben hidratált polimereket hoznak létre, amelyekben különbözö méretű pórusok alakulnak ki. A gélt ezután vékonycsövekbe töltik (oszlopnak nevezik) és rá-

1-18. ábra. A gélszüréses kromatográfia elve. A különböző molekulatömegü fehérjék keverékét az ,.oszlop" tetejére helyezik, majd azon átfolyatják. A kis molekulatömegü peptidek bejutnak az üregekbe és így tovább időznek az oszlopon, mint a nagyobbak. A nagy molekulatömegüek egyáltalán nem férnek be az üregekbe (lásd a szöveget is). Az átfolyó oldatot az "oszlop" alján gyűjtik (pl. 1 ml-es térfogatokban), amelyeket frakcióknak neveznek. Végül az egyes frak· ciók fényelnyelés mértékét meghatározzák fotométerrel 280 nm-nél (A 280) . Az abszorbció arányos a fehérjekoncentrációval

rétegezik a kérdéses fehérjeo ldatot Egy határértéknél nagyobb molekulatömegü fehérjék nem tudnak belépni a pórusokba, azok me llett gyorsan áthaladnak, míg a kisebb méretűek be lépnek, így tovább időznek az oszlopon (! -18. ábra). A gélszürés során (az elektroforéz issel ellentétben) a molekulák töltése nem, alakjuk viszont lényegesen befolyásolja vándorlásuk sebességéL A módszer ugyan alkalmas a relatív molekulatömeg meghatározásra, de figyelembe kell venni, hogy ez csak globuláris fehérjék esetén értékelhető (az elnyújtott alakú polipeptidek úgy vise lkednek, mintha nagyobb molekulatömegük lenne a valós értéknél). Bár a módszcr alkalmas fehérjék egymástól történő elválasztására, felbontóképessége nem olyan jó, mint a gélclektroforézisé, viszont nagyobb mennyiségü fehérje izolálása érhető e l vele.

háromféle fehé~e

keveréke

frakciók száma

!

uuuu frakciók (kémcsövek mozgásiránya)

20

»»>»>»m»mmm>>>m»»»»mm>»m>n»»»>»n»>m>m>»m>>»>»>>>»>»»>

Ioncserélő

és affinitás kromatográfia

Ha egy fehérje pH 7-nél pozitív töltésű, akkor á ltalában kötődik olyan szilárd fázisú "oszlophoz" , amelyen negatív töltésű csoportok vannak kovalensen rögzítve (kati oncserél ő kromatográfia), míg a negatív tö ltésű fehérjék nem kötődnek hozzá. Ez a tulajdonság lehetövé teszi a fehérjék töltéstől függő elválasztását, illetve izolálását. Ezután (ha a pozitív töltésű fehérjére van szükség) a kötött protein vi sszanyerhető elúcióval; amely azt jelenti, hogy növekvő sókonceotrációval (pl. NaCl) vagy a pH emelésével a fehérje leválasztható az oszlopról. A Na+ koropetál a fehérje pozitív töltésével , amelyen keresztül az az oszlophoz kötődik. Minél kisebb egy adott fehérje pozitív töltése, annál gyengébb a kötődése és annál alacsonyabb sókoncentrációval választható le. Így nemcsak a pozitív töltésű választható el a negatív töltésűtől , hanem a pozitív töltésűek is részben szeparálód-

A FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK SZERKEZETE. FUNKCIÓJA

hatnak egymástól. Negatív töltésű fehérjék viszont, a fentiekhez hasonló elvek alapján, pozitív töltésű (anioncserélő) oszlopokhoz kötődnek. Az affinitás kromatográfia módszer elválasztási elve, hogy ha egy fehérje nagy affinitással megköt egy másik molekulát (ami lehet pl. glukóz vagy peptid, vagy egy szintetikus vegyület is), akkor, ha ezt (pl. aszintetikus vegyületet) kovalensen hozzákapcsoljuk egy oszlophoz, ahhoz a kérdéses fehérje nagy affinitással kötődni fog, míg a többi fehérje nem. Ezután az oszlophoz kovalensen kötött vegyület kötetlen formájával (magas koncentrációban) szabaddá lehet tenni ("eluálás") a kérdéses fehérjét, hisz a kötetlen molekula koropetál a kötötte!. Végül a szabad vegyület (ligand) dialízissei eltávolítható az izolált fehérjétőL Az elúció egy másik lehetséges módja, hogy a nagy affinitással kötött fehérjét reverzibilisen denaturáljuk (pl. pH-változtatás); így annak affinitása lecsökken, és nem kötődik tovább az oszlophoz.

A fejezet megírásával kapcsolatban tett javaslatoké rt és kritikai megjegyzésekért a Dr. A rányi Péternek, Dr. Krajcsi Péternek és Dr. Szikla Károlynak.

szerző

köszönetet mond

Ajánlott irodalom Biochemistry, Ed. L. Stryer. W . H. Frceman and Cornpany New York, . Y. USA, 1988. Biochemistry, Ed. J. D. Rawn, cil Patterson Publisher, Burlington, . C. USA, 1993. Principles of Biochcmi try, Eds. A. L. Lehninger, D. L. Nelson, M. M. Cos, Worth Publishcrs,

ew York, NY, USA, 1993.

Enzimek

.2.

FaragóAnna

Az enzimek katalitikus funkciója Az élő szervezetben nagyon kevés kémiai reakció megy végbe önmagától, bár a kiindulási anyagok és végtermékek termodinamikai paraméterei lehetövé tennék a reakciót (a reakcióhoz tartozó szabadenergia-változás értéke negativ, lásd 2.1 . fejezet). Az élő szervezet körülményei közőrt (az élettel összeegyeztethető hőmérsékleten, a földi atmoszféra nyomásviszonyai mellett) azonban ezek a reakciók önmagukban rendkívül lassúak lennének, meggyorsításukhoz katalízisre van szükség. A katalízist enzimeknek nevezett febéljék végzik, amelyek Lerövidítik a kémiai anyagok átalakulásához szükséges időt, egy-egy reakció sebességét az 12 adott körülmények között 109- 10 - szeresére [okozhatják. Újabban megfigyelték, hogy néhány egészen speciális biokémiai folyamatban bizonyos ribonukleinsavmolekulák is képesek a katalizátor feladatát ellátn i (" ribonukleinsavak mint enzimek"). A katalitikus képességekkel rendelkező ribonukleinsavakat " ribozim"-nek nevezik. Az ismert ribozimek közül három típus önmaga átszerkesztődését katalizálja, de van egy o lyan típus is (ribonukleáz P), amely valódi katalizátornak tekinthető. Mindazonáltal jó hatásfokkal kizárólag RNS-molekulákon végbemenő reakciói katalizálnak a ribozimok. Felfedezésüknek az evolúció molekuláris mechanizmusával foglalkozó elmé letek szempontjából nagy jelentősége van, az evolúció során azonban a 20-féle építő­ el emből álló fehérjék szerkezete sokkal alkalmasabbnak bizonyult az élőszervezetben folyó katalízisre.

A különböző fehérjék szerkezete együttesen igen nagy variációs lehetőségeket rejt magában, így a

legkülönbözőbb kémiai anyagok számára is rendelkezésre állhat olyan febérjemolekula, amely az összes lehetséges intermolekuláris erők igénybevételével - megköti , egymáshoz közeli és megfelelően orientált helyzetbe hozza a reakcióban résztvevő partnereket (szubsztrátokat) és megkönnyiti a meglévő kémiai kötések bontását és újak kialakulását. A szubsztrát(ok) és kialakuló végte1mék(ek) stabil kémiai szerkezete között az átalakuló molekulának egy ún. tranzíciós (átmeneti) állapotba kell kerülnie, amelyben átmenetileg mind a kiindulási szerkezethez, mind a végtermék szerkezetéhez tartozó energiaszintnél magasabb energiaszintet ér el. A tranzíciós állapot eléréséhez szi.ikséges átmeneti energiaszint-emelkedés a gátja a reakciónak. Ha magas az energiagát, akkor nagyon lassú a reakció, mert időegység alatt a molekuláknak csupán kis hányada képes szert tenni a szükséges energiára. Az enzimek szerkezetének bizonyos része pontos kiegészítője a tranzíciós állapotban levő szubsztrátja(i) szerkezetének, ezáltal stabilizálni képes a tranzíciós állapotot és így csökkenti az aktiválás i energiának nevezett energiagátat, amely a reakció gyorsulásához vezet. Az enzimek által végzett katalízis általában ezen elv alapján folyik (1-19. ábra).

A tranzíciós állapotban levő molekula már nem azonos a szubsztráttal és még nem azonos a produktummal, bármelyikké alakulhat vagy visszaalakul hat. Enzi m nélkül nem stabil, izolátni nem lehet. A tranzíciós állapot stabilizálásának fontosságát a katalízisben az is bizonyítja, hogy kisérleti úton sikerült o lyan immunglobuli n antitesteket produkálni, ame-

22

)))))))))))H)>>n>>>>>>n>>>>>H>>h>>>>)H>>>>>>>>>»>>>»>>>>>>>»>>>»>>n>H>»>>>>>>>>>>>>>>

A FEHÉRJÉK É ENZI:'\I EK ZERKEZE TE, FUNKCIÓJ A

aktivált állapotnak megfelelő legmagasabb energiaszint

kiindulási anyag (S) -

1-19. ábra. A nem katalizáll reakció és az enzim által katalizáll reakció során kialakuló energiaszi ntek. A !!.G-érték a kiindulási anyag és végtermék szabadenergia-tartalma közti különbség, amely a reakció irányát megszabja. A reakció sebességél az aktivált állapot eléréséhez szükséges legmagasabb energiaszint határozza meg, ez minél kisebb, annál gyorsabb a reakció. E és E. a nem katalizált, illetve katalizá/t reakció aktiválási energiáját jelölik

~~!_-_-_-_-_----~----_-_-_-_ -~ -- végtermék (P) reakció

koordináta

lyeknek antigént kötő felszíne pontos kiegészítője egy-egy molckula tranzíciós állapotnak megfelelő szerkezetén ek, és így az antitesthez kötődö antigén időegy ség alatt okkal nngyobb valós7inü. éggel fordul elő tranzíciós á llapotban, mint szabadon. A7 ilyen antitest ("abzim") ké pes katalizálni a m egle lel ő moleku la áta lakulását, noha credelileg nem cnzimfe héljc.

Az enzimek szerkezet e olyan mértékben specializálódott egy-egy bizonyos molekulával történ ő kapcsolatra, hogy csak azzal nagyon analóg szerkezetű molekulá t képes fe lisrnemi és már nagyon kis különbségek (mint pl. a diasztere oizomére k közti különbség) esetén sem jön létre a kapcsolat. Ezért az enzimek igen specifikusak a szubsztrátjukra nézve. Ugyancsa k igen specifiku sak abból a szempon tból, hogy egy adott enzim egy adott molekulá nak csak bizonyos átalakulá sát képes katalizálni , másfajta reakcióho z egy másik fehérje szükséges. Minthogy az enzimek kizárólag ef,>)' bizonyos reakció aktiváJási energiájá t csökkent ik, de nem változtatják meg a szub ztrátjaik, illetve produktumaik kezdeti és végállapo tához tartozó termodinamikai paraméte reket, nem változtatj ák meg a reakció egyensúlyi állapotát. Egy enzim mindkét irányban képes meggyorsítani a reakciót (vagyis a szubsztrátok átalaku lását produktu mmá, illetve a produktu m visszaalakulását szubsztrá ttá), a reakció tényleges irányát nem a működő enzim, hanem a kiindulás i és végállapo t közti szabaden ergia-vál-

tozás iránya határozza meg. (A szabadenergia-változásnak van a kiindulás i anyagok és végtermékek koncentrációjától függő kompone nse is, lásd 2. J. fejezet). Az élőszervezetben az enzimek által katalizál t reakciók nettó eredmény üket tekintve mindig a szabaden ergia-csö kkenés irányában mennek végbe. Ez nem aztjelent i, hogy az é lőszervezetben nem mehetnek végbe olyan reakciók, amelyek önmagukba n szabaden ergia-növ ekedésse l jámának, csak azt jelenti, hogy egy ilyen típusú reakcióhoz mindig kapcsoló dik egy másik reakció is, amely viszont szabadenergia-csökkenéssei jár (kapcsolt reakciók). Az enzimek szerkezete megengedi, hogy rajtuk több, különféle kötőhely egyszerre, koordináltan funkcion áljon és ezért léteznek o lyan enzimek, melyek több reakciót képesek összekapcsolni. Az átalakulás irányát ilyenkor az együttes reakciók nettó szabaden ergia-csö kkenése határozza meg.

Az enzim-s zubsztr át komplex kialakulása A szubsztrátok az enzim szerkezet ének egy speciális régiójához kötődnek (szubsztrátkötő hely), amely az ún. aktív helyhez tartozik. Az aktív helyhez tartoznak még azok a katalitikus csoportoknak nevezett aminosav -oldallán cok is, amelyek részt vesznek a szubsztrá tok átalakítás ának folyamatában. (Vannak olyan enzi mek is, amelyek mlíködé-

ENZIM EK

))>H))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))>)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

sükhöz prosztetikus csoportokat vesznek segítségül. Ezek kis molekulatömegű, nem polipeptid természetű molekulák, igen sok közülük vitamin természetű anyag származéka. Az enzimre jellemző prosztetikus csoport ugyancsak az aktív helyhez kötődik. Vannak olyan enzimek is, amelyekben egy fémion is fontos szerepet játszik az aktív hely funkciójában .) Az aktív hely felépítésében az enzim szerkezetének csak kis része vesz részt. Azok az aminosav-oldalláncok, amelyek az aktív he lyet alkotják, a polipeptidlánc elsődleges, lineáris szerkezetét jelentő amjnosavszek venc iában gyakran egymástól távol he lyezkednek el és csak az enzim harmadlagos szerkezetének kialakulásako r kerülnek egymás közelébe és hozzák létre azt a pontos, háromdimenziós struktúrát, amely az aktív he lyet jelenti. Az enzim szubsztrátkötő helyét alkotó oldalláncok és a szubsztrát közötti kapcsolatot gyenge, reverzibilis kölcsönhatás ok (elektrosztatik us

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))>>)))))))))•>n))U)~))))))>)

23

kötések, hidrogénhidak és hidrofób kölcsönhatások) sokasága biztosítja. Az aktí v hely az ismen szerkezet ű e nzimek esetén a.t enzim harmadlagos szerkezete által alkotoll résbe n vagy nyíl úsban helyezkedik cl, a szubsztrátok kötődésekor a víz kizáródik e résből . hacsak nem vesz részt pannerként a reakcióban.

Az aktív hely szubsztrátot kötő része a szubsztrát szerkezetének pontos térbeli kiegészítője, ez az a lapja az enzim specificitásán ak. Az el ső enz im- szubsztrát kapcsolattal foglalkozó elméletek ezt a kapcsolatot mechanikusan olyannak képzelték, mint amilyen a zár és a hozzá tartozó kulcs kapcsolata. A legtöbb enzim aktív he lye azonban nem teljesen merev szerkezetű és nem is teljesen preformált A szubsztrátot kiegészítő (komplementer) szerkezet éppen azáltal jön létre, hogy a szubsztrát és az enzim egyes aminosav-old alláncai közötti kölcsönhatáso k révén a szubsztrát kötődése hozza létre az egymást kiegészítő csoportok pontos illeszkedését, a szubsztrát kötődése módosítja az enzim szerkezetét az aktív hely közelében. Az enz im- szubsztrát kölcsönhatás álta l indukált illeszkedést (induced fit) egy sor enzim csetén különböző fiz ikai módszerekkel : spektroszkópi ával, röntgen-krisz tallográfiával , magmágneses rezonancia vizsgálatokka l, elektron-spin rezonanciával stb. bizonyítani lehetett. Ma már a legtöbb enzimet (fehérjét) nem tekintik rideg, mozdulatlan szerkczetnek. hane rn úgy véli k és erre bi7onyítékok is vannak. hogy egy enzimfehérje több, meghatározott. termod inamikailag megengedett konfonnációban is előfor­ dulhat, szabad állapotban rnozog e7en állapotok között, és a natí v állapot lulajdonképen ezen megengedett kanformációk ös zeségc.

A szubsztrát és a szubsztrátkötő hely o ldalláncai közötti kölcsönhatás a szubsztrát szerkezetében is torzulást okozhat, ez a torzulás is hozzájárulhat a tranzíciós állapot kialakulásáho z (1 -20. ábra).

1-20. ábra. A szubsztrát enzimhez való kötődése a kulcs-zár modell szerint, illetve az indukált illeszkedés alapján. {a) Kulcs-zár mode/1: a szubsztrátkötő hely térben pontosan meghatározott szerkezete már az enzim szabad állapotában is pontos kiegészítője a szubsztrát szerkezetének. {b) Indukált illeszkedés (induced fit) : a szubsztrát és a szubsztrátkötő helyet alkotó egyes csoportok kölcsönhatása hozza létre a komplementer szerkezetet

A katalízisben szerepet játszó

tényezők

Ma már igenjól ismerik egy sor enz im által katalizált reakció esetén az enzim aktív helyét alkotó aminosav-oldalláncok pontos szerepét a szubsztrát á ta lakulásában. A legtöbb reakció lényegében né-

24

»>>»>>>>»>>))>))))))))))))))))))))>))))>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>H>)>))>>>>>>>)))>>>>>>>>>

A FE HÉRJ ÉK ÉS E ZIMEK ZE RKEZETE, FUNKCIÓJA

A reakció

c. .

~

'

.

~

.

.

.

RNS... pirimidin bézis

OH

O

"

...RNS

RNS... pirimidin bázis

2. töredék

OH 1. töredék

OH

O

"

... RNS

1-21 . ábra. Sav-bázis katalízis mechanizmusa a ribonukleáz enzim aktív helyén. A pancreas-ribanukleáz a ribonukleinsav molekulákat úgy hasítja rövidebb molekulákra, hogy egy pirimidinbázist tartalmazó nukleotid ribózának 3'0H-ja és a szomszédos ribóz egység 5'0 H-ja közti tosztodiészter kötést az 5'-oldalon hidrolitikusan elbont. A ribanukleáz aktív centrumában két hisztidin oldallánc, az aminosavsorrendben a 12. és 119. helyen levő két csoport végzi a sav-bázis katalizist. A His 12 a reakció első lépésében bázisként müködik és a toszfodiészterkötés 3'-oldalán levő ribóz 2'0H-jától protont von el. A His119 viszont savként viselkedik

ENZIMEK

25

RNS...

o

O

0 o/~

pirimidin bázis

0 -

H

" p ,f'

His,+ - N -

H

t19

O "'

C H2

O

l.

"

OH ...RNS 1. töredék

RNS ...

o

o Hls119- N:

"

o

/

p

pirimidin bázis

/

o

O

"

... RNS

~

o 2. töredék

RNS...

o

O His1 ;<1- NH

OH

pirimidin bázis

OH

l

HO - P = O

l

o és protont ad át, aminek következtében a foszfodiészterkötés az 5'-oldalon elhasad. Az új szabad 5'0H-val rende l kező RNS-töredék disszociál az enzimröl, a foszfodiészterkötés 3' oldalán levő ribózon pedig kialakul egy 2'-észter-kötés is (ciklikus 2',3'-foszfát képződik.). A katalízis második lépéseként a His müködik bázisként és protont vesz fel egy vízmoleku lától, amely119 nek maradéka megbontj a a ciklikus foszfátésztert, miközben a His most már savként 12 viselkedik és visszaadja a protont a ribóz 2' pozicióban levő OH-jának. Igy már disszociá lhat az enzimről a második RNS-töre dék is, amely 3'-végén foszfátész tert tartalmaz

26

FEHÉRJ ÉK ÉS ENZIM EK SZERKEZF..T E, F NKC IÓJ

hány fontos részfolyamaton, illetve azok kombinációin alapul. Ezek közé tartozik többek között a sav-bázis katalízisnek nevezett folyamat, a kovalens katalízis, az entrópia effektus. Á ltalános savnak, illetve általános bázisnak nevezik a gyengén disszociáló csoportokat, általános sav mindcn csoport, amely az adott pH-n és adott körülmények között protont tud leadni és általános bázis minden csoport, amely protont tud felvenni. A fi ziológiás pH-tartományban az egyik legfontosabb általános sav a hisztidin protonált formája, míg a nem protonált hisztidin általános bázis. Ugyancsak általános sav a cisztein SH-csoportja, a tirozin OH-csoportja vagy a lizin E-amino-csoportjának protonált f01máj a, míg általános bázis ezen csoportoknak proton nélküli formája vagy a glutaminsav, aszparaginsav peptidkötésben nem szerepl ő karbox il-csoportjának disszociált alakja. Sav-bázis katalízis során az általános savak protonálni képesek a szubsztrát valamely csoportját, míg az általános bázisok protont vonzanak a szubsztrát egy másik csoportjától. A sav-bázis katalízisre jó példa a pancreas által terme lt ribonukleáz enzim működésének mechanizmusa (1-2 1. ábra). Kovalens katalíziskor bizonyos enzimek aktív helyének egyes aminosav-oldalláncai (például a szerin-oldallánc) vagy az enzimhez kötö tt prosztetikus csoport átmenetileg kovalens kötést létesíthetnek a szubsztráttal. Ez az enzimhez vagy prosztetikus csoporthoz kovalensen kötött intermedier labilisabb, mint az eredeti szubsztrát. A katalízis után az enzim eredeti szerkezete helyreáll. A kovalen katalízisre jó példa a kimotripszin nevű, fehérjét bontó enzim aktív helyének m űködése (1-22. ábra).

kicsi. Az enzimhez történő kötődéskor viszont éppen a megfe l elő pozicióban kerülnek egymás közelébe a reagáló partnerek. Az enzimek egy j elentős része férniont tartalmaz (metalloenzimek) . A fémion lehet csupán az enzim harmadlagos szerkezetét stabilizáló passzív tényező, azonban igen gyakran aktív szerepetjátszik a katalízis fo lyamatában. Részt vehet a szubsztrát kötésében vagy a reakció intermedierjeinek a stabilizálásában. A férniont tartalmazó enzimek egy jel entős csoportja oxido-redukciós reakciókat katalizál, amelyekben a fémionnak alapvető szerepe van. Az élő sejteken belül több enzim nem önállóan müködik, hanem multienzim komplexek formájában. Olyan enzimek, amelyek egymással összefüggő reakciókat, reakciósorokat katalizálnak, gyakran szoros kapcsolatban állnak egymással. Ez aszoros kapcsolat Lehetövé teszi, hogy az intermedier molekulák (vagyis az egyik enzim produktuma, amely a következőnek a szubsztrátja) az egyik enzim aktív hel yéről közvetlcnül a másik enzim aktív helyére kerülhetnek, és így kis mennyiségű intermedier molekulával is gyors a reakciósorozat Szélsőséges esetben nem egymáshoz szerosabban vagy lazábban kapcsolódó különböző enzimmolekulák alkotják a multienzim rendszert, hanem egyetlen polipeptidlánc rendelkezik több különböző aktív hellyel. (Ez utóbbi típusú multienzimek jellegzetes képviselőj e például az em lősök zsírsavszintézisét katalizáló enzim vagy az Escherichia coli baktérium DNS-polimeráz r enzime.)

A fehé rjéke t bontó enzimeket proteát:oknak nevezik. Aktív helyük je ll em ző. fontos szcre pet betö lt ő komponen e alapján megkü lönbö71etnek szerin -, cisztein-, aszpa ragin av- é metalloproteázokat. Akimotripszina sze r io- proteázok közé tartozik, az általa kata li7ált reakció mec ha n i zmusaje ll e mző a többi szerin-proteáL által katalizál t reakció mechanizmusára is.

Az enzimeket egyszerűbb azonosításuk céljából, az általuk katalizált reakció jellegeszerint hat osztályba sorolták. A hat osztály mindegyike alosztályokat is tartalmaz, amelyek ugyancsak további csoportokra oszlanak. Az osztályokat, alosztályokat, csoportokat és ezeken belül magukat az egyes enzimeket arab számokkal jelölik, egy-egy enzimet ilyen módon négy szám határoz meg (például az alkohoi:NAD-oxidoreduktáz enzim száma l. l. l. l.). Az enzimek szisztematikus nevében előbb a szubsztrát(ok) neve, majd a katalizált reakció (-áz

Az entrópia effektus több szubsztrátos reakcióknál érvényesül, és a rendszer rendezetlenségéne k átmeneti csökkentését jelenti . Ha két szubsztrát o ldatban van, annak valószínűsége, hogy megfele lő orientációban kerülnek egymás közelébe, nagyon

Az enzimek osztályai

ENZIMEK

végzödéssel) szerepel. A hat nagy osztály a következök szerint csopo rtosítj a az enzim eket

O Oxidoreduktázok. Az ebbe az osztál yba sorolt enzimek mind oxidá ciós-r edukc iós reakciókat katalizálnak, a külön bözö aloszt ályok at a különbö zö mechanizmussal működö enzim ek alkotják. Például: etanol + NAD +H acetal dehid + NAD H + W.

6 Transzferázok. Az ebbe az osztályba sorolt enzimek funkcionális csopo rtokat viszn ek át egyik szubs ztrátról a másikra (vagy ugyan azon szubs ztrát egyik csoportjáról a másikra). A különbözö aloszt ályok at a különbözö típusú funkcionális csopo rtok átvite lét katali záló enzim ek képezik. Például: glukó z +

@

ATP~

glukó z-6-fo szfát + ADP.

A foszfotran zferáz aktivitással rendelkező enzimek et kinázoknak is szokták nevezni. Hidrolázok. Az ebbe az osztályba sorolt enzimek jelleg zetessége, hogy víz segítségéve l hasítana k el külön bözö kötéseket.

Például: glukóz-6-fo szfát + H20 anorganikus foszfát.

~

g lukóz +

O Liázok. Ezen enzimek által katalizált reakc iók során viz, ammó nia, szén- dioxid vagy valam ilyen más molek ula adódik egy molek uláho z, vagy vonód ik el egy molek ulábó l. Például: 2-foszfoglicerát H foszfoenol-piruvát + H 0. 2

0 Izom erázok. Külön bözö típu ú izome rizációka t (cisz- transz , aldóz -ketóz , epimerizáci ó stb .) katalizáló enzim ek. Például: glukó z-6-fo szfát H fruktóz-6-foszfát.

0 Ligázok. Ezen enzim ek úgy kapcsolnak össze különbözö molek uláka t, hogy ehhez egyidejű­ leg magas energiájú foszfátkötés hasítá sából szárm azó energ ia szüks éges. Példá ul: glutam át + NH3 + ATP anorg aniku s foszfát.

~

glutamin + ADP +

Az egyes individuális enzim ek tehát saját (négy tagból álló) számm al rendelkeznek. Egy-egy ilyen szám azonb an nem minde n esetb en képvisel csupán egyet len fehérjét. Az egy bizon yos élő l ényben el.öforduló, azono s szubs ztrát(ok) azono s reakcióját katalizáló, ám elsődleges szerkezetük ben egymástól külön bözö enzim eket izoenzimeknek nevez ik. Az izoen zimek külön bözhe tnek egym ástól szabá lyozá sukba n, a sejten belüli elhely ezked ésükbe n, a külön bözö szerv ek vagy sejttíp usok közti mego szlásukban, az általuk katalizál t reakció sebes ségér e vagy a szubs ztrátj ukhoz való viszonyukrajell emző kvant itatív param éterek ben, stabilitásukban stb. Napja inkba n igen sok enzimről derül ki, hogy nem egyetlen fehérje, hanem izoenzimek formájában van jelen.

Koenzimek és prosztetikus csoportok Az enzim ek egy jelentős ré ze katalitikus funkciója betöltéséhez egy koenzimnek nevez ett segédmolek ulát igényel. A koenz imek általában höstabil , kis mol ekulatömegű anyag ok, gyakran olyan molek ulák szárm azékai, amely eket az embe ri szervezet egyál talán nem vagy csak kis menn yiségben képes előállítani és ezért vitam inkén t a táplálékból vesz fel. Ha a koenzim és enzim kapcsolata nagyon szoros, a koenz imet prosztetikus csoportnak nevez ik. (Az így kialakuló komplex a holoe nzim, míg a prosztetiku s csoportjától megfoszto tt, inaktív enzim az apoenzim). A prosztetiku s csopo rt és az enzim közötti kapcs olatot szélsőséges esetek ben kovalens kötés biztos ítja (például lipons av, biotin esetéb en), másko r a szoros kapcs olat kovalens kötés nélkül is létrejö n. A koenzim és enzim kapcs olatán ak másik szélsösé-

28

>H>)))))) >H)))))))))>)>> )))))))))))))))))) ))>)>))>)n> )))H)))))))>))>»

>>>>»))

>>)))))))))))) >)

A FEH ÉRJ ÉK É ENZIME K SZERKE ZETE, FUNKCIÓ JA

o ll AsP102 -c-o ... H l

HO"

<( /

Ser" ,

H-O R' -

'

N- C- R

l

H

ll

O

o ll

Asp 102 - C -

o- ~

N

H is"-( _)

o

N

'-H R' - N

l H

l

/

Ser19s

C- R

ll

o

ENZIMEK

29

coo·

/

Ser

o

l H- O- C- R l

o

tetraéderes tranzíciós állapot

H

"o

Ser 195 /

coo·

HO-C - R

ll

o t 1-22. ábra. Kovalens katalízis a kimotripsz in aktiv helyén. A kimotripszin fehérjék peptidkötés éf hidrolitikusan bontó enzim, amely katalitikus centrumában reaktív szerin oldallánco t tartalmaz (szerin-pro teáz). A katalfzis során átmenetileg a reaktiv szerin- (Ser195) oldallánchoz kovalensen kötve tartja az egyik fehérjetöredéket. Ahhoz, hogy a Ser 195 reaktlv legyen, az aktív helyhez tartozó más csoportok, egy aszparaginsav- (Asp 10z) és egy hisztidin- (His ) oldallánc közremúkö dése is szükséges. A (pH 57 7,4-en) disszociált állapotban levő Asp 102 protont von el a His5rtől, ez viszont a Ser -től von el protont. Az ilyen módon reaktiwá 195 tett szerin megtámadja a szubsztrátban levő stabit peptidköté st és a karbonilcsoportot tartalmazó töredékkel instabil kovalens kötést létesit (instabil acilá/t enzim képződik), míg a peptidkötésben levő nitrogén oldalához tartozó töredéken szabad NHr vég alakul ki és disszociál az enzimről. A Ser19s-höz instabil észterkötéssel csatlakozó másik töredék hidrolitikus hasitása a reakció leglassabban végbemenő lépése. Egy vfzmolekula megbontja ezt az észterkötést, ennek eredménye ként az újonnan kialakuló szabad karboxilcsoporttal rendelkező második töredék is disszociá/hat az enzimről, míg a vízből származó proton helyreál/Ifja a katalitikus helyhez tartozó csoportok eredeti állapotát

ges esetével találkozu nk olyankor , amikor a koenzim sokkal lazább, asszociációs-disszociációs viszonyban áll az enzimme l, úgy viselkedik mint egy szubsztrát (leggyakrabban így viselkedi k, például,

a NAD+, NADP ' , tetrahidrofolsav). A biokémiai reakciókb an leggyakrabban el őforduló koenzimcket az 1-1. táblázat foglalja össze.

))

)))))))))))>))))))))))))))))))))l

))))))~ l)'))))>)))t))))))))))

30

)))))HU))>l)t)))n)U))))))))H))

1-1. táblá zat. A leggy akrab ban _ ~oenzimek és ~zerepük _ Koenz im

működö

_

_

_

' Reakc ió (a koenz im által szállít ott csopo rt)

-l Nikotinsavamid-adeninl dinukleotid (NAD•) L (niacinszármazék)

hidrogénatom és elektro n

Nikotinsavamid-adenindinukleotid-foszfát (NADP•) 1 (niacinszármazék)

hidrogénatom és elektron

l flavin-mononukleotid

hidrogénatom

l

l

(FMN) (riboflavin, 8 2 -vitamin-származék)

l

l

1 hidrogénatom

l l _J l

l

fiavin-adenin-dlnukleotid (FAO) (riboflavin, 8 2-vitamin-származék)

l

koenzim Q

hidrogénatom

!iamin-pirofoszfát (tiamin , 8 1-vitamin-származék)

aldehid

koenzim-A

aci lcsoport

l

aci lcsoport

l

•

1

liponsav

l

-

l alkilcsoport

kobalamid (kobalamin, l Bwvita min-sz ármaz ék) biotin (B-vitamin-csoport)

szén-dioxid-fixálás

piridoxál-foszfát (piridoxin, 8 6 -vitamin-származék)

aminocsoport

l tetrahidrafolsav l

J J

l (pantoténsavszármazék) r ~

l

(folsavszármazék)

1

l

l

1

metil-, metilén-, formil -és formiminocsoport

A Mic hae lis-M ente n-m ode ll Az enzim- szubs ztrát komp lex létezésének el ső bizonyítékát, már jóval a modern fi zikokémiai módszerek használata el őtt, az enzim által katalizált reakció sebes ségén ek az analí zise nyújtotta. Reakciósebesség (v) alatt az időegység alatt átalakuló szubs ztrát vagy időegység alatt képződő produktum mennyiségét értjük. A nem katali zált kémiai reakciók sebes sége a reakc ióban részt vevő anyag(ok) koncentrációjának a fl.iggvénye, a rea-

JA A FEHÉ RJÉK É. El\ZIM EK SZER KEZE TE, F l\KCIÓ

gáló anyag ok koncentrációját emel ve a reakció sebessége fo lyamatosan emel kedik (a körülmények által meghatározott sebességhatárig). Egy enzim által katalizált reakció esetén más a helyzet. Természetesen a katalizált reakció sebessége sokkal nagyobb, mint a nem katalizálté, azonban egy adott a reakcimennyiségű enzim jelen létébe n vizsg álva ése egy emel nak át, a reagáló anyag koncentrációjá bizonyos koncentrációtartomány felett (telitési konc entrá ció) már nem okoz észrevehető sebességnö veke dést fl yenk or a rendszer megközelítő­ leg az elérhető maximális reakciósebességgel (V ma,) működik. A maximális reakciósebességet akko r éri el a rendszer, ha rninden enzim mole kula szubs ztráto t köt, azaz enzir n-szu bsztr át komplex formájában van jelen , nincs több szabad enzim , minden enzim mole kula "dolgozik". (Elméletileg ez csak végtelen nagy szubsztrátkoncentrációnál következik be, a telítési szubsztrátkoncentrációnál azonb an ez az érték gyakorlatilag megköze l íthető .) E fölött a telitési szubsztrátkoncentráció felett már hiába adun k több szubs ztráto t a rendszerhez, a reakció sebes ségét ez nem fokoz za észrevehetően. (A szubsztrát szem pontj ából nulladrendű reakcióról beszélünk ilyenkor, mert a reakc ióseb esség éta ki indulási anyag koncentrációja tovább nem befolyásolja.) Ha azonban a rendszerben levő enzim menn yiség ét növelj ük, ezzel már tovább növelhetjük a reakc ió scbességét. n A telítés! mutató konce ntráció fliggés j cllemz ö minde ula molek fehé1je egy yben amel gre, olyan biokém iai j elensé nhaegy másik m(llek ulát (ligan dot) köt reverzibilis kölcsö fehérképes ra ciáció diss:.w így és l, tások segitségéve je ligand kompl ex j ön létre {1-23. áhra).

A modell, amely leírja az enzim ek által katalizál t től és legegyszerűbb reakc ió mene tét, L. Michaelis , llnek mode M. Mententől származik. A lényege e hogy a katalízis folyamatának elkerülhetetlen lépése a speci fikus cnzim- szubs ztrát komplex létrejötte. Bizo nyos egyszerűsítések figyelembevételével a reakc ióta következő egyen let írja le: (l)

Az enzim- szubs ztrát komplex (ES) a szabad enlétre (k 1 zi mből (E) és szaba d szubs ztrátb ól (S) jön

r

ENZIM EK 31

l

hatjuk azzal a kiindulási szub ztrátkoncentrációv al, amely et mi állítunk be, és amely melle tt v izsgálni kíván juk a reakc ió sebességéL Vizsgálj uk meg tehát, hogy egy adott enzim koncentráció melle tt (az össze s enzim koncentrációja [EJ), az általunk kiválasztott szubs ztrátk oncen tráció [S] mekk ora kezde ti reakcióseb ességet eredményez. (A reakciósebesség, azaz a v egyenl ő a produktum konce ntráci ójána k időegységre eső változásáva l.)

Ol

•Q)

Cll Cll

Q)

.o Q)

Cll

nem katalizáll reakció

·O

·n ~

ctl

~

o

Vmax B

Ol

•Q)

Cll Cll

~ Vmax B

.rs

2

tó

VmaxA -

·n Q)

L.

Vmax A

L •. l • . •.. •.

l Ja va lóban kezdeti sebess éget vizsgá lunk és tanj uk magunkat az e l őzőekben ismerte tett fe ltételekheL. akkor a kiválasztot t nrbsztrátkon centrác iónál mérhetö v érték a vizsgálat tar1am a ala tt nem vá ltozik!

A Michaelis- Mente n-mod ellböl látható, hogy a produ ktum képző désén ek sebes sége az enzimszubs ztrát komplex koncentráci ójától [ES] függ.

-

2

szubs ztrátko ncentráció

1-23. ábra. Egy enzim által kataliz ált reakci ó sebess ége a szubsztrátkon centrá ció függvé nyébe n. B görbe esetéb en az enzim mennyisége kétszerese az A görbéhez tartozó értéknek

v = k, [ES]

(2)

Egy adott [EJ enzim konce ntráció melle tt az enzimmoleku lák egy része szabad enzimként, más része enzim -szubsztrát komp lexként van jelen: (3)

sebességi álland óval), kialakulása azonban reverzibilis folyamat, az ES komplex szét is eshet szabad enzim re és szubs ztrátra (k 2 sebességi állandóval). Másré szt viszont a produ ktum (P) csak az ES komplexen keres ztül képzödhet, az ES komp Lex, átalakulása után szabad enzimre és produktumra esik szét (k3 sebességi állandóval). Ha a reakc iónak csak a kezdeti sebességét vizsg áljuk, amiko r még nagyo n kevés produ ktum képző dött és ezért P koncentráci ója nagyo n kicsi, akkor P visszaalaku lásána k a sebessége gyakorlatila g elhanyago lható, és az ES-bő l (E + P)-vé történ ő átalakulást egyirányúna k tekjnthetj ük. A modcll egyszerű kezelésének ugyan csak fontos feltéte lei, hogy a szubs ztrát konce ntrációjának az enzim konce ntrációj ánál nagys ágrendekkel kell nagyo bbnak lennie és hogy a vizsgált időta rtam alatt az eredeti szubs ztrátkoncen tráció hoz képest gyakorlatila g elhan yagolható mennyiségü szubsztrát alaku ljon át. llyen fe ltétele k melle tt a szabad szubsztrát koncentrációját gyako rlatila g azono sít-

A reakc iót katali záló enz imünk akkor műkö dik a maxim ális sebes ségge l (V ma.,), ba az összes enzim molekula (E,) enzim - szubs ztrát komplex fonnában van (ilyenkor [ES] = [E,]), a max imális sebes ség tehát:

(4) Könn yen belátható, hogy egy általu nk választott szubs ztrátk oncen tráció nál mérhc tö kezde ti reakcióseb esség úgy arány lik a lehets éges maxim ális sebességhe z, ahogy az ennél a szubs ztrátkoncentrác iónál kialak uló enzim- szubsztrát komp lex kance ntráci ó [ES] arány lik az összes enzim konce ntrációjáho z [E,]: v [ES] --=--

v """

[E ,]

(5)

Mi határozza meg az enzim- szubsztrát komplex koncentrác iój át az általunk választott szubs ztrátkonce ntráció melle tt? Mint az (l) egyenletbő l lát-

>>>>)) >»>>>u>>>>H •~t>>}) >>>>>»>n >H>)' )Jt>> .,, >>H't> >H> >Jt>>>> >>>>n>»> Jt) >n>n))>>>>>>)>)>>> >n>>> >Jt)> n>>>>>)>> >H>))))>>>> >H>>>)) n~>>>>> >>n >hn> HH>>>>n n n Hn >>>H>>> •~ >>

32

ható, ES koncentrációja [ES] attól függ, hogy kialakulásának sebessége hogyan viszonylik elbomlásának sebességéhez. ES csak egyféle módon alakul ki, egy k 1 sebességi állandóval, kialakulásának sebessége a szabad enzim koncentrációjától és a szabad szubsztrát koncentrációjától függ (feltételeink között a szabad szubsztrát kancentráció azonos a kiválasztott szubsztrát koncentrációval): ES kialakulásának sebessége = k 1 [E][S] Elbornlani azonban az enzirn-szubsztrát komplex két úton is tud. Vagy szétesik szabad enzimre és szubsztrátra egy k2 sebességi állandóval, vagy átalakul és k3 sebességi állandóval szabad enzim és produktum képződik belőle. ES elbomlásának sebessége = k2 [ES] + k3[ES] = (k2+k3)[ES] A reakció megindulása után igen gyorsan beáll a stacionárius állapot (steady state), amelyre j ellemző, hogy ES kialakulásának és elbomlásának sebessége azonos: (6) A stacionárius állapotot leíró egyenletből az enzim- szubsztrát komplex koncentrációja kifejezhető:

ENZIMEK

Helyettesítsük be [ES] és [E1] kifejezett értékét az (5)-ös egyenletbe, majd végezzük el a lehetséges egyszerüsí téseket: [S][E]

v

vmax

=

KM [S][E] + [E] KM

[S]

=-..::........::-

Ez utóbbi egyenlet átrendezése után jutunk a Michaelis- Menten-egyenlet szokásos formájához, amely szerint: [S]V ma. (S) + K 1

V =--..:.:.:..=..:'-

(8)

A különböző szubsztrátkoncentrációknál mérhető reakciósebesség értékét egy derékszögű hiperbola egyenlete írja le. Vizsgáljuk meg azt az esetet, amikor a reakciósebesség éppen a fele a maximális reakciósebességnek, vagyis V =

0,5 V ma•

=

0,5 V max.

[S]V ma:< [S] +KM

átrendezve [S] + KM= 2 [S],

[E] [S] = (k 2 : k 3 ) [ES], vagyis [ES] = [E][S] k2+ k, l kl

A k 2 + k 3 összefüggésből adódó érték ko n sk. ezt Michaeüs-konstansnak (KM) neérték, tans vezik. A KM felhasználásával összefiiggésünk a következőképen alakul: [ES] = [E] [S] KM A (3) -as egyenletet figyelembe véve:

( 7)

ilyenkor tehát KM= (S]. A Michaelis-konstanst ezek szerint úgy is defini álhatjuk, hogy számértékileg egyenlő azzal a szubsztrátkoncentrációval, amely meUett egy adott enzimmennyiség az általa elérhető maximális reakciósebesség felét éri el. A különböző enzimek KMértéke l 0'7 és l o-2 molJliter között van általában és meghatározott körülmények (hőmér­ séklet, pH, ionerősség stb.) között j ellemző az enzim bizonyos szubsztráthoz fűződő viszonyára. (Minél kisebb érték a KM, annál alacsonyabb szubsztrátkoncentrációnál képes az enzim "dolgozni". Fiziológiás viszonyok között az enzimek általában a KM értékéhez közel álló szubsztrátkoncentrációknál működnek). Egy enzim KMés v max értékét meghatározhatjuk, ha megmérjük az enzim által katalizált reakció

A FEHÉ RJ ÉK SZERKEZ ET E

kezdeti sebességét rációknál.

33

kü lönböző

szubsztrá tkoncent-

Ezek meghatároz ásához (teki ntettel arra, hogy a Michaelis-e gyenletet több évtizeddel a személyi számítógépek általános használata el őtt kezdték alkalmaz ni) a derékszögű hiperbola et,'Yenletét különbözö lehetséges m6dokon transzformálták, így egyenes egyentetté alakították. Ezzel egyszerűbb é és jobban áttekinthetővé vált a KMé V"'"" értékek számítása. A sok ismert linearizálás i fo rma közül az itt bemutatásra kerülö kettős reci prok (Lineweaver- Burk-féle) ábrázolás csupán az egyik lehetséges változat, azonban meglehetösen gyakran al kalmazzák . A kettős reciprok értékhez úgy jutunk, hogy a Michaelis- egyenlet rnindkét oldalának a reciprokát vesszük:

K M+ [S] v

[S]Vnwc

az elvégezhető egyszerüsítések után: KM l l - = - --- + - v v.... (SJ v"""'

(lásd l - 24. ábra)

Az e lérhető maximáli s reakciósebesség (Vma-<) részben az enzim menny i ségétő l , részben annak katalitikus képességétől függ. A kata litikus képességet az átviteli szám j ellemzi, amely azt mondja meg, hogy egy molekula enzim időegység alatt hány mo lekula szubsztrá t átalaku lását képes kata-

KM

merede kség =- 1

vmax

vmax 1

o

1 [S]

1-24. ábra . A Michaelis-Mente n-egyenlet ne k megfelel ő s zu bs ztráttelités i görbe kettős rec iprok (Lineweav erBurk-féle) á bráz olásban

lizálni. (Az átviteli szám a Mi chaelis- Mcnten-m odellben k3-ként szerepel) . A kü lönböző enzimek átviteli száma általában másodpe rcenként O, l é 106 között van. Az átviteli szám ismeretében egy enzim koncentrá ciója (mennyis ége) a maximáli s reakci ósebességből kiszámíth ató. Ismert enzimek esetén (pl. a klinikai laboratóriumi gyakorla tban, gyári készítm ények jellemzésekor) az enzim mennyisé gét az enzim a ktivitásá val szokták jellcmczni. Ez lényegében reakcióse bességet jelent, vagyis azt, hogy a jelen l evő enzimme nnyiség szigorúan meghatározott feltételek és pontosan meghatározot t (lehetőleg telítési) szubsztrá tkoncentráció mellett, időegység alatt mennyi szubsztrát átalakulását (produktu m képződését) katalizálja. Egysége (U) l mikromo l/ perc. (SI egysége a catal, l molls a gyakorlatban nem használha tó.) Egy enzim fajlagos aktivitás árólleginkább az enzim tisztítása során szoktak említést tenn i. Faj lagos aktiv itás alatt az egységny i mennyiségü fehérjére eső enzimakt ivitást (mikromo l/ perc/mg fehérje) értjük. Egy enzimpre parátum fajlagos aktivitása a tisztítás során növekszi k, majd a teljesen tiszta enzim fehérjére j ell emző értéken megáll. A növekedé s oka a szennyező fehérjék mennyiségének csökkenése. (Egy enzim tisztitása során az enzim fehérjébő l is veszítünk, de megfelel ően m egválaszt ott eljárás esetén csak a szennyező fehérj éktő l szabadul unk meg, az enzim fehérje jelentős része megmara d.) Enzimaktivitás mérésekor figyelembe kell venni, hogy az enzim meghatároz ott környezeti feltételek mellett (pH, hő­ mérséklet, ionerösség , esetleg fémionok jelenléte) müködik. Az enzimek akti vitása egy bizonyos pH-tartomá nyban általában optimumot mutat, de vannak olyan enzimek is, ame lyek jól müködnek egy meglehetösen széles pH-tartomá nyban (am elyben szerkezetük még nem sérül) . Az optimális pl l a szubsztrát, illetve az enzim katalízis zempontjáb ól fontos disszociáló csoportjaitól függ. A hőmérséklet emelése minden kémiai reakció sebességél fokozza, a fehérjék azonban a fizio lógiásnál magasabb hőmé rsék leten denaturálód nak, ezért aktivitásuknak hőm érsék l eti optimuma is van. Az enz im- szubsztrát közölti reverzíbilis kölcsönhatásokat gyengíthetik, illetve a katalízis folyamatát befolyásolhatják a jelen levő ionok. Fémionok egyes enz imek esetében kofaktorké nt működhetnek.

A Michaelis- Menten-modell és az ennek felhasználás ával levezetet t egyenlet a l étező legegyszerűbb enzimrea kcióra vonatkoz ik, csupán egyetlen szubsztrá tot vesz figyelemb e. A valóság-

34

) U) tHUU> )))) )) ) ) )) >>~~U))))>)>> >UH))))))) H))))))))))))))))>)))))))))>>>)))))))) ))))>))>>))

ban azonban nagyon kevés enzim van, amelynek csupán egyetlen szubsztrát átalakulását kell katalizálnia, a legtöbb esetben lega lább két szubsztrát vesz részt a reakcióban. Ezeket a reakciókat sokkal bonyolultabb rnódon lehet csak modellezni, a reakció jellege szerint. Ez lehet szekvenciális, amikor el őbb az egyik, majd a másik szubsztrát kötődik az enzimhez egy hármas ke mpiexet eredményezve és az átalakulás, majd a produkturna k disszociációj a is csak a hármas komplex kialakulása után történik meg. A szekvenciális reakciók csoportjában vannak o lyanok, amelyekben a szubsztrátok csak szigorúan meghatározott sorrendben kötődhetnek, és vannak olyan reakciók, amelyekben a szubsztrátok kö tődésének sorrendje vél etlenszerű lehet. A másik csoportba tartozna k az ún. ping-pong reakciók, az ilyen reakciókban az el ső szubsztrát kö tődé­ sét és átalakulását követi az el ső produktum disszoc iálása és csak ezután kötődik az enzimhez a második szubsztrát, amelynek átalakulása a máso d ik produktumot eredményezi. Ez utóbbi reakciótípusnál nem alakul ki hármas ko mplex.

A FE HÉRJ ÉK É ENZIM EK Z ERKEZETE, F NKCIÓJA

Több szubsztrátos reakcióknál a maximális reakciósebességet telítési szubsztrátkoncent rációknál nem a M ichaelis modellbő l ismert k 3 határozza meg egyedül , hanern több sebességi konstanstól fugg. Ezért ezen reakciók maximális sebességének jellemzésére a k1 helyett egy ~~~~ -tal jelzett, összetett sebességi konstanst szoktak használni. Egy enzim hatékonyságát valamely szubsztrát átalakításakor a ~a.IKM hányadossal szekták jellemezni.

Az enzimaktivitá s gátlása Az enzilnek müködését gátc ini lehet reverzibilisen vagy irreverzibilisen. Reverzibilis gátláskor a gátló anyag (inhibitor molekula) gyenge kölcsönhatások segítségével kötőd ik az enzimhez és gyorsan disszociálni tud. Irreverzibilis gátlás akkor következik be, ha a gátló anyag nagyon erősen, legtöbbször kovalens kötéssel kapcsolódik az enzimhez, ezért nagyon lassan, vagy egyáltalán nem disszociál az enzimrő L

H

H

l

H C-C-CH

o

o

3

l

E:>-

l

CH20H

l l

H3C- C -CH3

:-~-=-----+• ~ CH, - 0 -

+ F- P = O

l o l l

H C-C-CH 3

HF HC -

3

3

H

l

l

3

~O

l l

C -CH

3

H

o ll

~· ~- CH,S -CH,- C - NH, Hl

1-25. ábra. Enzimek irreverzibilis gátlása aktiv centrumuk kovalens módosításával. (a) Az aktív centrumukban reaktív szerí nt tartalmazó enzimek gátolhaták diizopropil-fluor-foszfá ttal (vagy ezzel analóg módon ható vegyü/etekkel). A diizopropil-fluor-foszfát az enzimet inaktfv diizopropi/-foszforil enzimmé alakítja. (b) Az aktiv centrumukban levő vagy az aktív centrumukon kívül található, azonban a katalitikusan aktív konformáció fenntartása szempontjából kritikus ciszteínoldalláncot tartalmazó enzimek gátolhatóak alkilezöszerekkel (pl. jódacetamlddal), amelyek a ciszteinnel kovalens kötést képeznek

A FEHÉRJÉK SZERKEZETE

))))l))H))))l)))) ))Hl)))))l)H))))))))))))))U))))))))).))))))))))))}))))))))H)))))))))))))))))>)>>>>n>>>H>>>))>)>>>H) >>lo))HH>>)))))))>UHH)

A7 irrever7ibilis gátlás egyik "klasszikus" pé ldája a katalitikus centrumukban reaktív szerin-oldallánccal rende lkező enzimek, pl. szerio-proteázok (kimotripszin, tripszin stb.). észteráz aktiv itású enzimek (pl. az acetilkolin-észtcrát.) gátlása foszfortartalmú szerves vegyülete kkel (J-25a ábra). A kata litikus centrumukban cisztein-oldalláncot ta11almazó enzimeket pl. alkilczőszcrekkel lehet irrevezibilisen gátolni

(1-25b ábra}. Reverzibilis gátlások esetén a reakciósebesség analízise információt nyújt arra vonatkozólag, hogy a gátló anyag a szubsztrát enzimhez való kötődését akadályozza, vagy nem az enzim-szubsztrát komplex kialakulását befolyásolja, hanem a katalízis folyamatát gátolja. Ha a gátló anyag a szubsztrát enzimhez való kötődését akadályozza, kompetitív gátlásról beszélünk. Ilyenkor a szubsztrát és az inhibitor verseng egymással az enzimért, mert csak egyikük kötődhet az enzimhez. Ha az enzim- szubsztrát komplex kialakul, az inhibitor nem tud kötődni. A kompetitív inhibitor ezért csökkenti az enzim- szubsztrát kialakulásának valószínűségét egy adott szubsztrátkoncentrációnál, ha azonban emeljük a szubsztr'át koncentrációját, az enzim- szubsztrát komplex mégis kialaku l. Végtelen szubsztrátkoncentrációnál már sokkal nagyobb a valószínűsége a szubsztrát kötődésének, mint az inhibitorénak, ez utóbbi valószínűsége elhanyagolható (egy adott, véges inhibitorkancentráció mellett). A kompetitív inhibitor tehát nem változtatja meg a végtelen szubsztrátkoncentráció mctlett kialakuló maximális reakciósebességet (Vma.~ ), azonban látszólag megnöveli a K M értékét. Valódi kompetitív inhibitorok az olyan molekulák, amelyeknek kémiai szerkezete nagyon hasonlít a szubsztrátéra és ezért az enzimen a szubsztrát helyére képesek kötődni. A leghatásosabbak azok az anyagok, amelyek a szubsztrát tranzíciós állapotának szerkezetére hasonlítanak (tranzíciós analógok). A valódi kompetitiv inhibitorok közül igen nagy jelentősége van az orvosi gyakorlatban az ún. antimetabolitoknak (lásd később). A kompetitív gátlás kinetikai képét azonban nemcsak a szubsztrátra hasonlító, valódi kompetitív inhibitorok képesek létrehozni, hanem más olyan mechanizmus is, amelyben az inhibitor és szubsztrát kölcsönösen lehetetlenné teszik egymás kötődését (lásd allosztérikus enzimeknél). A kompetitív gát-

35

lás kinetikai képe alapján csak azt lehet állítani, hogy az inhibitor és szubsztrát kölcsö-nösen kizárják egymás kötődését, de azt, hogy az inhibitor hova kötődik, más módszerrel kell meghatározni. A reverzibilis gátlások másik formája a nem kompetitiv gátlás. Ilyenkor a gátló anyag nem a szubsztrátkötő helyhez, hanem az aktív centrum valamely katalízisben részt vevő csoportjához kötődik, vagy más módon akadályozza a katatízist (például a katalízisben szerepet játszó fémionnal képez komplexet). A nem kompetitív gátlást nem lehet felfüggeszteni a szubsztrátkoncentráció emelésével, ez a gátlás a maximális reakciósebesség (Vm
Az enzimaktivitás szabályozásának módjai Az edd i giekbő l kitűnt, hogy egy élő sejtben, szervezetben vagy akár a kémcsőben történő vizsgálatok során, adott, konstans feltételek mellett, két tényező határozza meg egy enzim aktivitásának mértékét. Az egyik tényező az enzim mennyisége (a jelen lévő enzimmolekulák száma), a másik

36

•>))))))JJ>t>HHJ>)HH>>n>>>>>>HH >)>)))))>)>>>H)))))HU>)))))))))))l) U))>)))))J)))))))>>))>))))))))))))))) )))))))))))))))>))J)))))))))))))>)))))))

a

o

1 [S]

b

o

1 [S]

c v

l

L

o

1

[S]

1-26. ábra. A reverzibilis enzimgátlások kinetikai képe kettős reciprok ábrázolásban. (a) Kompetitív gátlás, (b) nem kompetitív gátlás, (c) unkompetitív gátlás. Az 1. számmal jelölt egyenes gátlószer nélkül, a 2. számmal jelzett egyenes egy kisebb, míg a 3. számú egyenes egy nagyobb inhibitorkoncentráci6 me/lett mutatja az enzim működését. Kompetitiv gátlás eseién az 1Nmax változatlan, míg az X-tengely negatív részén kimetszett 1/KM érték csökken (vagyis a KM növekszik). Nem kompetitiv gátlás eseién az X-tengely negatív részén kimetszett 1/KM érték nem változik, míg az 1Nmax érték növekszik (tehát Vmax csökken). Unkompetitív gátlás esetén mind az 1Nmax. mind az 1/KM érték növekszik (tehát Vma• és KM értéke csökken)

pedig az egyes enzimmolekulák működé­ sének sebessége. Az él ő szervezetben az enzimek mennyiségét egy adott időpontban a kérdéses enzimfehérje szintézisének, illetve lebomlásának sebessége határozza meg, e fo lyamatokkal majd a későbbi fejezetekben foglalkozunk. A már megtényező

)))))))))>>>H»H>>>>>)))))))

ENZIMEK

szintetizálódott enzirnmolekulák működésének sebességét (a rendelkezésre álló szubsztrátkoncentráció, koenzim stb. mellett) többféle regulációs mechanizmus módosíthatja. A három legismertebb ilyen mechanizmus az enzimműködés allosztérikus szabályozása, a szabályozás az enzimfehérjék oldalláncai nak kovalens módosítása, ezen belül elsősorban foszfori láció, illetve defoszforiláció útján és a proenzimek átalakulása aktív enzimmé limitált proteolízis segitségével. Sejten belül egy-egy enzim vagy enzimcsoport tevékenységél nagymértékben el ősegíti vagy éppen lehetövé teszi a kompartmentalizáci ó jelen ége. A kompartmentalizáció aztjelenti, hogy egyes enzimek a sejten belül bizonyos " rekeszekben" helyezkednek el, és e rekeszekben kialaku ló lokális szttbsztrátkoncentráci ó határozza meg müködésüket. A lokáli szubsztrátkoncentráció a "rekeszben" gyakran sokkal nagyobb, mintha a szubsztrátolmak a teljes intracelluláris térbe kellene szétdiffundálni. továbbá a "rekcszben'' képződő szubsztrátokon nem kell megosztozni egy másik cnzimmel, amely a rekeszen kívül helyezkedik el és esetleg ugyanazt az anyagot képes szubsztrátként használni. A kompartmentalizáció egyszerű példáját mutatják a sejtorganellumokban elhe lyez kedő enzimek, amelyek a ejtorganellum mcmbránja által határo lt térben található szubsztrátokkal műkődnek. Ha egy sejtorganellumban müködö enzim szubsztrátjának valamilyen transzportmechanizmussal kell a rnembránon keresztül bejutnia az organellum belsejébe, e transzportmechanizmus szabályozása közvetve a kompartmentben levő enzim működését is szabályozza. Kompartmenta lizációs •·rekesznek" tekintjük a multicnzim komplexek által létrehozott szerkezetet is, amely akár scjtorganellumon belül, akár a citoszolban is létrejöhet. Ez a szerkezet szinte irányítja a közös intermedier molekulát (amely az egyik enzinmek a produktuma és a következőnek a szubsztrátja) a megfel e lő kata litikus he lyhez, magas lokális szubsztrátkoncentrációt biztositva a következő enzi mnek, a .telje ejtre (esetleg a teljes organellumra) vonatkoztatott lényegesen alacsonyabb intermedier kencentráció mellett. A multienzim komplexek szerveződé e c komplexek egy részénél nagyon stabil, más komplexek tagjai lazább, dinamikusabb kölcsönhatásban vannak egymással. Fontos komponense lehet a biológiai szabályozás molekuláris mechanizmu ának egy-egy enzim (fehérje) kompartmentalizáció helyének vá ltoztatása, a fehérj e sejten belüli transzlokációja, például citoszolból a sejtmagba vagy citoszolból a plazmamembránhoz.

Allosztérikus enzimek Az enzimek egy igen nagy csoportját képező allosztérikus enzimek a katalízis szempontjából kiemelt, aktív helyhez tartozó szubsztrátkötő helyen

A FEHÉRJÉK ZERKEZETE

kívül rendelkeznek még más ligand (vagy ligandok) számára is kötőhellyel (kötőhelyekkel). Ez a szubsztrátétól eltérő szerkezetű ligand kötésére alkalmas második (vagy harmadik stb.) kötő­ hely az enzimmolekula szerkezetének az aktív helytől jól megkülönböztethető részét foglalja el (allosztérikus kötőhely), gyakran az aktív helytől távol található. Az. aktív hely és az allosztérikus helyre kötődö ligand (allosztérikus effektor) közötti funkcionális kapcsolatot az enzim harmadlagos szerkezetének, az enz im konformációjának a (allosztérikus biztosítja változása konformációváltozás), amely akkor következik be, ha a szubsztrátkötő helyre vagy az allosztérikus kötőhelyre bekötödik a megfelelő ligand. A szubsztrát kötődését kisérő indukált illeszkedés (induced fit) leírá akor már említettük, hogy az enzimek túlnyomó többségének a szerkezete nem merev struktúra, hanem bizonyos mozgásokra képes. Az allosztérikus konformációváltozás az indukált illcszkedést kisérő változásoknál kiterjedtebb, az enzim szcrkczeténck nagyobb részét érinti.

Több polipeptidláncból (több alegységből) álló enzimek esetén a szubsztrátkötő hely lehet az egyik, az allosztérikus kötőhely a másik polipeptidláncon, a funkcionális kapcsolat ilyenkor nemcsak a harmadlagos, hanem a negyedleges szerkezet változásain keresztűl is érvényesül. Az allosztérikus helyre kötődö ligand megváltoztatha~a az enzim szerkezetét úgy, hogy az a katalízisre alkalmasabbá váljon, ilyenkor allosztérikus aktivátorról beszélünk. Gyakran azonban ennek az ellenkezője történik, az allosztérikus helyre kötődö ligand a katalitikus tevékenységet gátolja (allosztérikus inhibitor). Mind az aktiválás, mind a gátlás többféle mechanizmus segítségével érvényesülhet. Az enzimaktivitás allosztérikus szabályozásának fontos jellemzője, hogy az allosztérikus Iigandok kötődése ugyanazon típusú gyenge kölcsönhatások sokaságán alapul, mint a szubsztrát kötődése, ezért nyilvánvalóan reverzibilis folyamat. Az asszociáció-disszociáció általában pillanatszerő és az allosztérikus ligand (illetve bizonyos esetekben az allosztérikus ligand és a szubsztrát) aktuális koncentrációjától függ. Egy allosztérikus aktivátor létrehozhat olyan konfonnációváltozást, amely elősegítheti a szubsztrát kötődését (megnövelheti az enzim affinitását a szubsztrát iránt, ilyenkor az aktivátor jelenlét-

37

ében csökken az enzimnek az illető szubsztrátra vonatkozó K M értéke), vagy segíthet a katalízis folyamatában részt vevő aminosav-oldalláncok legkialakulásában orientációjának megfelelőbb (ilyenkor növeli a Vmax értékét). Vannak olyan enzimek is, amelyeknek működőképes szerkezete kizárólag akkor alakul ki, amikor allosztérikus aktivátoruk kötődik hozzájuk. (A legegyszerűbb­ nek látszó ilyen mechanizmus az, arnikor az enzim alapállapotában a szubsztrátkötő helyet elfedi az enzimfehérje egy másik része, az allosztérikus aktivátor hatására ez a fedő rész elmozdul és szabaddá válik a szubsztrátkötő hely. Ez természetesen csak egy, a lehetséges aktiválás i mechanizmusok sokféle változatából.) Az. allosztérikus inhibitorok által okozott gátlás ugyancsak többfélemódon érvényesülhet. Előfor­ dul , hogy az allosztérikus inhibitor kötődése által létrehozott vagy stabilizált konformáció nem alkalmas a szubsztrát kötésére. Ezzel a mechanizmussal gyakran együtt jár az is, hogy a szubsztrát kötődése viszont olyan konformációban stabilizálja az enzimet, amely az allosztérikus inhibitor kötésére nem alkalmas. Ha a kétféle ligand kölcsönösen kizárja egymás kötődésének lehetőségét (vagy legalább erősen csökkenti a másik ligand kötődésének valószínüségét), az allosztérikus inhibitor jelenlétében mérve az enzim aktivitását, a kompetitív gátlás kinetikai képét kapjuk (látszólag kompetitív gátlás), holott a szubsztrát és a gátlószer nem ugyanazon kötőhelyért versengenek egymással. Az allosztérikus inhibitorok más csoportja viszont nem befolyásolja az enzim szubsztrátkötő képességét, de olyan konfomációváltozást hoz létre, amely erősen csökkenti a katalízis sebességét. A nem kompetitív kinetikát mutató gátlóanyagok között gyakran találhatunk allosztérikus inhibitorokat A sejten belüli anyagcsere-folyamatok összehangolásában, a különböző anyagcsereutak sebességének szükség szelinti gyorsításában és lassításában elsőrendű szerepe van az allosztérikus szabályozásnak. A szubsztrátétól eltérő szerkezetű allosztérikus aktivátorok és inhibitorok hatását heterotrop hatásnak nevezik. Míg a heterotrop hatás létrejöhet egyetlen polipeptidláncból álló allosztérikus enzimeken is, a több azonos polipeptidláncból álló, azonos alegységeket tartalmazó (oligomer szerke-

38

>>n))>>>)))))))))))))))l))) )>>>>U)))))))))H)))))))))) ))))))))))>))U)))))>))>))))) )))))))))))))

zetű)

enzimek (fehérjék) esetén az allosztéria jelenségének egy sajátságos változatát, a hornotrop hatást is megfi gyelték. A hornotrop hatás lényege, hogy egyetlen fajta molekula, enzimek esetén maga a szubsztrát, képes betölteni az allosztérikus ligand szerepét is. A jelenségnek az oligerner enzimek negyedleges szerkezetét érintő konformációváltozá s a magyarázata. Ha egy oligerner enzim egyetlen alegységének szu bsztrátkötő helyéhez kötődik egy ligand, az nem csupán ezen egyetlen alegység konformációj át képes megváltoztatni , hanem a változás átterjed a többi alegységre is. Ezért az a ligand, amely az első alegység esetében a szubsztrát szerepét tölti be, a többi alegység szempontjából allosztérikus szabályozóként szerepcl. Részletesen csak a pozitív hornotrop hatással foglalkozunk, vagyis azzal a jelenséggel, amikor az el ső molekula ligand (szubsztrát) kötő­ dése e lősegíti a második (harmadik stb.) molekula kötődését a többi alegységen. A pozitív hornotrop hatás (homotrop kooperatív hatásnak is nevezik) a Michaelis- Menten-modell által leírt, derékszögű hiperbolának megfelelő szubsztrát telitési görbétől eltérő, jellegzetes S alakú (szigmoid) telitési görbét eredményez (1-27. ábra). Kis szubsztrátkoncentrációknál a szubsztrát kötődésének a va lószínűsége kicsi . Az e lső molekula szubsztrát kötődése azonban úgy változtatja meg az enz im negyedleges szerkezetét, hogy a következő molekula szubsztrát kötődésének a valószínűsége megnövekszik, a szubsztrát kencentrációj ának növelésével a telitési görbe meredeken emelkedni kezd ( 1-27. ábra). A hornotrop hatást kétféle modell ·cgít égével magyará7zák, valószínűleg egye fellétjék az egyik, más fehérjék a másik mechanizmust követik. A szimmctria modell feltételezi, hogy az ol igorner enzim számára kétféle konformáció lehetséges, az egyik a katalizisre alkalmas, szubsztrát iránt nagy affinitási mutató re laxá lt (R) konfonnáció, a másik a szubsztrát iránt kis affinitással rendelkező, feszített (T, tense) konfonnár;ió és a szimmctriaelv értelmében az összes alegység vagy az egyik, vagy a másik konformációban fordul elő, hibrid enzim nem lehetsége. (J-28a ábra). A szabad enzim állandó mozgá ban van az R- és T-állapot között, ezek egyensúlya azonban a T irányában van eltolva. Ezért a7 el ö s7ubsztráunolckula esélye kic i arra, hogy a csak kis valószínűséggel el őfordul ó R-konfom1ációban találkozzék az cnzimmel. Amikor azonban ez mégis megtörténik, az első molekula szubsztrát kötődése nemcsak a saját alegységét, hanem az egé z oligomerenzimct az R-konformációban stabili7álja, ezért azután a kö vetkező molekula szubsztrát már a

A FEHÉRJÉK ÉS E~ZIM EK SZERKEZETE, FUN KCIÓJA

a

b

ligand kancentráció

vmax Ol

-Q)

1/) 1/)

(])

.o (])

1/)

•O

"ü

~

co

~

o

[S]

1-27. ábra. A hornotrop kooperatív hatás kinetikai képe. (a) A vékony vonal egy Michaelis-Menten-egyenlet szeríni müködő, a vastag vonal egy hornotrop kooperatív hatást mutató enzim szubsztráttelitési viszonyait ábrázolja. (b} Az 1-es görbe egy hornotrop kooperatív hatást mutató enzim szubsztráttelítés i görbéjét, a 2-es görbe ugyanezt a látszólag kompetitív gátJási mutató allosztérikus inhibitor, mlg a 3-as görbe ugyanezt, egy, a szubsztrát iránti affinitási növelő allosztérikus aktivátor jelenlétében ábrázolja

nagy affinitással rendelkező többi alegységgel találkozik. és így kötődésének a valószínű ége a következő alegységen megnövekszik. A szubsztrát tehát a másik alegység(ck) számára aktivátorként i működik. Ha egy ilyen mechanizmussal működö enzimnek allosztérikus inhibitora i van, az az egész enzim konfom1áeióját a T-állapotban stabilizálja. A homotrop hatáson kívül az enzimnek még heterotrop aktívátora is lehet. CL ism~t az R-konformáció felé tolja az egyensúlyt. A szekvenciális modell szcrint nem kötelező az enzim összes alegységeinek azonos konformációs állapota, hibrid állapot is lehetséges (l-28b ábra). E7 amodell nem állítja, hOb'Y a szabad cn7im konformációja is az R- és T-állapot között változik és a zubsztrát vagy inhibitor csak tabilizálja az egyiket vagy másikat. hanem feltételezi, hogy a szubsztrát kötődése houa létre azt az új konfom1ációt, amely alkalma!> a katalízisre (mintegy az indukált illeszkedés kiterjedtebb változataként). Az e lső alegység konformációjának változása áttcrjcd a következő alegységre i , dc nem szükség zerücn

E~ZI\1EK

>>>>))>))U>) )))>>))))))))))

>»>>>))))>>H))>>)))))) )))))))))) ))))))) ) )))))))))))))) >>)) >»))))) )) )))) )) ))))>H)))))))))))>

hozza létre ugyanaz t a konfo m1ác iót, amelyet a szubsztrát által már elfoglalt alegység mutat. A második molekul a szubsztrát kötődése ismét változás t indukál, a me lyik á ne rj ed a köve tkező alegységrc, és így tovább.

Az allosztérikus szabályozás minden formáj ának szerepe van a sejten belüli anyagcserefolyamatok összeh angalá ában, a különböző anyagcsereutak sebessé gének szüksé g szerinti gyorsításában vagy lassításában. A különböző anyagcsereutakat katalizáló enzims arok müköd ésének szabályozása általában az út első specifi kus lépését kataliz áló enzimn él történik , amely allosztérikus enzim szokott lenni. Ez a "karme ster" vagy "közlekedési rendőr" szerepé t betöltő enzim allosztérikus aktivátora vagy inhibitora koncentrációjána k változá sán keresztül érzékeli, hogy az általa irányított reakciósornak gyorsa n, lassan vagy éppen egyáltalán nem kell működnie.

>>))))))))))))))n >H)>>>>)))))) >>))))

39

R

A pozitív hornotrop (vagy hornotrop kooperatív) hatás fiziológiai jelentősége az, hogy az S alakú telítés i görbén ek megfelelően az enzim (fehérje) valódi müködésének tartományát sokkal szűkebb szubsztrát- (ligand-) koncentrációkeretek között tartja, és így a ligand koncentrációjának változásával sokkal élesebb működésbeli változásokat hoz létre, mint a Michae lis-egy enlet szerinti szubsztrátkötődés. Csökkenő ligandk oncent ráció esetén például sokkal nagyobb mértékben veszíti el ligandját egy ilyen fehérje , mint egy nem allosztérikusan szabály ozott, és ennek komoly regulációs jelentősége lehet. A hotnotrop kooperatív hatás nem korláto zódik enzimfehérjék.re, gyakra n megfigyelhető valame ly ligando t kötni képes oligom er szerkezetü nem enz imfehérje esetében is. A legtöbbet v izsgált példa a négy alegységből álló hemo-gl obin szigmoi d oxigénte lítési görbéje . Ha a he moglobin nem vo lna alloszlériku fehé rje és a deré kszögü hipcrboiána k megfele lő oxigénte litési muta tná, az artériá kapillári okban ne m tudná leadni az általa zállito lt oxigé nt. mert a nonnál telitési görbe alapjá n a kapillári sokban levő oxigénte nzió me l le tt még al oxigén je lentős részét kötésben kellene tartania. Az S ala kú ox igéntelít ési görbé nck megfele l ően azonban , a kapillári sokban l evő oxigénte nzió mellcll olyan kicsi a he moglobin oxigénn el zemben mutatott affinitása, hogy az oxigént már nem ké pes kötésben ta rtani. Ismert néhány olyan cn?im is, a melyne k egyetle n po lipeptidlá ncán több kötőhe l y van egy bizonyo s ligand számára. Ilyen csetekben a hornotro p koope ra tív hatás egyetle n polipe ptidlánco n be lül is létrej öhe t.

)))))'))))>>))) )))>>)) ))

ll ll

TT

RT'-hib rid

ll RR 1-28. ábra. A hornotro p koopera tív hatás modellje í. (a) A szimmet ria mode/1 és (b) a szekven ciális mode/1. A model/e k lelrását lásd a szövegb en

elsőrendű

Bioszintetikus uta k el ő enzimeit gyakran alloszté rikusan gátolja a kérdéses bioszinte tikus út végtc rméke, és így nem törté nhet meg az, hogy a végterrn ék sziikségtelen nagy mcnnyis égbcn felszapo rodik (feedba ck gátlás). Más c etckben egy anyagcsereút valamely ik e l őanyagá n ak felhalmo zódása akti válja az anyagcs erc út spccifiku el ő lépését katal izáló enz imet (prekur zor aktiválá s). Arra i van példa, hogy egymással ellentétes folyama tok esclé n egy bi7onyo s molckul a az egyik út számára allosztérikus aktiváto r, míg a visszafe lé folyó út egyik enzimén ek allosztérikus innibitora és így biztosítj a az ellentéte s utak koordiná lt müködé sét.

Mint ahogy a hotnotrop kooperatív hatás sem korláto zódik kizáról ag enzimfehérjékre, az enzi-

l

40

"''""" •»»»»»»>»>»>>»»»»> »>»>»»»mm»»»»»»>>»>»»»»>»»»>»>>>»

mek allosztérikus szabályozásán keresztül megismertjelenség is általánosabb, mint aszigorúan vett enzimaktivitás-szabályozás . Egyes fehérjéknek az a sajátossága, hogy egy ligand bizonyos helyre történő kötődése által kiváltott konformációv áltozás a fehérje szerkezetének egy másik részét érintő funkcióváltozást képes létrehozni, képezi a molekuláris alapját az egyik legáltalánosabb szabályozási mechanizmusnak Lényegében hasonló elv alapján m űködnek mindazok a fehérjék, amelyeknek egy ligand számára kötőhelyük van és a ligand kötődése szabályazza a fehérje kapcsolatát egy másik fehérjével (mint például a hormonreceptorok egy jelentős része), vagy egy ligand kötődése szabályazza a fehérje kapcsolatát a DNS-sel (mint pl. a prokarioták génexpressziój át szabályozó fehérjék közül néhány). Az allosztériának ez a tágabb értelmezése a biológiai folyamatok szabályozásában olyan általános, hogy ma már hangsúlyozni sem szekták egy-egy speciális regulációs jelenség elemzésekor.

Az enzimműködés szabályozása foszforiláció-defoszforiláció segítségével Az allosztérikus enzimeknél megismert, többszörös gyenge kölcsönhatáson, azaz pillanatszern asszociáción- disszociáción alapuló szabályozási rnechanizmus on kívül létezik egy másik mecha-

ATP

A FEHÉRJÉK ÉS ENZIM EK SZE R KEZETE, FUNK Cl ÓJ A

nizmus is, amely magasabbrendű szervezetekben éppen olyan általános és nagy jelentőségű szabályozási rendszer kialakulását teszi lehetövé, rnint az allosztérikus szabályozás. A kétféle szabályozási rendszer kiegészíti egymást. Ez a második szabályozó mechanizmus az enzim- (és nem enzim) fehérjék foszforilációj án és defoszforilációján alapul. Minthogy kovalens módosításról van szó, ez nem megy végbe önmagától, a szabályozás a kovalens kötés létrejöttét, illetve eibentását katalizáló speciális enzimeket igényel (J -29. ábra). A szerkezetmódosítás valamelyest hosszabb időt igényel és tartósabb, mint az allosztérikus ligand által Jétrehozott konformációv áltozás. A különbözö fehérjék foszforilációj áért felelős enzimek a transzferázok osztályába tartoznak, protein-kinázoknak nevezik öket (1-29. ábra). Általában az ATP y-he l yzetű foszfátcsoportjának terhére alakítják ki az észterkötést az ilyen módon regulálódó febéljék bizonyos, az aminosavsorrendben pontosan meghatározott helyen levő szerin/treonin vagy tirozin oldalláncának OH-csoportjával. A legtöbb protein-kináz vagy csak szerin/treonin , vagy csak tirozinoldalláncot foszforilál. A febérje meghatározot t oldalláncán bekövetkező foszforiláció módosítani képes a febélje harmadlagos szerkezetét, és így megváltoztatia annak funkcionális állapotát. Bizonyos enzimek esetén a foszforiláció az enzim aktivitásának fokozódását, más enzimek esetén az aktivitás esők1-29. ábra. Az enzimaktivitás kovalens szabályozása foszforilációdefoszforiláció segítségével

ADP

ol

0 - P= O

l o-

OH

l

-0 - P = O

l o-

A HEMOGLO BIN ÉS A MIOGLOB IN

)))))))))HHH»>>> )) )))))) >)

» >>))))))))))))))))>)) ))))>HH))))H))))))))) )>))H))))'))))U >UU> ))}t>>hn>>>>))))>>U)) >U>>>>> h >•H

kenését, esetleg az enzimaktivitás teljes gáttását idézheti elő. Az enzimműködés nyilvánvaló módosításán kívül a foszforiláció még más módon is befolyásolhatja az enzim (vagy nem enzimfeh érje) funkcionális állapotát. A foszforiláció által indukált konformáció például alkalmasabb lehet más fehérjékhez vagy kis molekulatömegű ligandokhoz, esetleg a DNS-hez történő kapcsolódásra, más esetben éppen ell enkező irányú lehet a változás. A defoszforilációt katalizáló enzimeke t foszfoprotein-foszfatázoknak nevezik. Ezek az enzimek a hidrolázok osztályába tartoznak, a protein-kinázok által létrehozo tt észterköt éseket bidrolitikusan hasítják, ilyen módon egy adott enzim (fehérje) esetében a protein-kináz hatásával éppen ellentétes hatást váltanak ki. Mind protein-kinázból, mind protein-foszfatázból igen sokféle ismert, az egyes kinázok és foszfatázok különböző módon szabályozódnak. A protein-kinázok abban is nagyon különböznek egymástó l, hogy melyikük milyen enzimet vagy fehérjét és annak mely pontján foszforilál. A foszfoprotein-foszfatázok szubsztrátspecifitása valamely est kisebbnek látszik, mint a proteinkinázoké. A protein-kinázok aktiválódása különböző Iigandok által indukált allosztérikus szabályozás (pl. cAMP-függő protein-kinázról, vagy Ca2+kalmodulin függő protein-kinázról stb. beszélünk), vagy egy másik protein-kinázzal történő foszforiláció útján megy végbe. Az egymást foszfori láló protein-kinázok (ún. foszforilációs kaszkád) segítségével az első protein-kinázt aktiváló kémiai jel hatása megsokszorozódhat. A protein-kinázok és foszfoprotein-foszfatázok némelyko r "targettáló" alegységgel is rendelkeznek, amelynek fe ladata az enzim megfelelő sejtkomp artmentb e irányitása. A reverzibilis fehérjefoszforilációnak leggyakrabban az extracelluláris jelre adott sejtválasz ok kialakulásában, illetve a sejtproliferáció és differenciálódás szabályozásában van fo ntos szerepe.

A proenzimek átalakulása aktív enzimm é limitált proteolízis segítségével Az enzim-fehérjék szintézis utáni kovalens módosítással történő szabályozásának ugyancsa k jól ismert mechanizmusa a limitált proteolízis. Prote-

4J

olízisnek nevezik a fehérjékben található peptidkötések hidralitik us hasítását. A teljes proteolízis a fehérje aminosavakra történő szétesésé hez vezet. Limitált proteolízisről akkor beszélünk, ha a fehérjében csak néhány, jól meghatár ozott helyen levő peptidkö tés szakad fel, ezek hasitását proteázoknak nevezett enzimek végzik. Leggyakr abban éppen a proteáz enzimek (első­ sorban az aktivitásu kat extracellulárisan kifejtő, katalitikus centrumukban szerinold alláncot tartalmazó szerin-proteázok) szabályoz ása történik ezen a módon. Ezek az enzimek inaktív proenzim (zimogén ) formájában szintetizálódnak, éppen azért, hogy szintézisük helyén ne fejthessék ki fehérjét bontó hatásukat, csak a funkciójuknak megfelelő helyen (pl. a táplálékfe hérjék bontását végző enzimek az emésztőcsatomában, a véralvadásban szereplő enzimek a vérplazm ában) és csak bizonyos körülmén yek között legyenek aktívak. Aktiváládásu k úgy történik, hogy egy másik proteáz molekula egy vagy néhány kitüntetett peptidkötésüket elhasítja, és az így kialakuló rövidebb vagy több darabból álló polipepti dlánc tudja kialakítani az enzimaktivitással rendelkező szerkezetet. A bélcsatomáb an működő enzimek esetében a már aktiválódott proteáz molekulák autokatalízis-szerűen is részt vehetnek a limitált proteolízis elősegí tésé­ ben, deszüksé g van az egymást aktiváló proteázok (proteáz-kaszkád) közreműködésére is (1-30. ábra). Az egymást aktiváló proteázok kaszkádszeru sorozata még kifejezettebb a véralvadás szabályozásában. (A kaszkádjelenség itt is az első kémiai jel hatásának megsoksz orozódás ához vezet). A limitált proteolízissei történő aktiválódás, mely a fehérje elsődleges szerkezet ének a megváltozásával jár, irrevezibilis folyamat. Ha egy ilyen enzim aktivitására már nincs szükség, akkor vagy teljesen lebomlik az enzim, vagy valamily en fehérjetennész etü gátló molekula kötődik hozzá. A fehérjetermészetű gátló molekulák egyik jellegzetes képviselője a tripszin inhibitor . A tripszin inhibitor szerkezete a tripszin számára olyan szubsztrát analógot jelent, amelyet a tripszin rendkívül lassan képes csak elbontani (egy molekula bontása hónapokig tartana). A tripszin és a tripszin inhibitor gyenge kölcsönhatások sokaságával kötődik egymáshoz, ezek a kölcsönh atások azonban együttese n olyan erősek, hogy a gátlás irreverzibi-

A FEHÉ RJÉ K ÉS ENZI l E K ZE RK EZ ETE, FUNK CLÓJA

42

s- -s

s- -s

kimotripszinogén inaktrv

245

lllipszin

Se r1rAIQ1s

Thr147- Asn

l 4S

::==1

rr-kimotripszin aktív

kimotripszin

n-kimotripszin aktív

Ile 16

coo Ala

149

245

1-30. ábra. A kimotripszinogén átalakulása aktiv kimotripszinné. A pancreas által szintetizált kimotripszinogén, a kimotripszin proenzime egyáltalán nem rendelkezik enzimaktivitással. A duodenumbakerülve aktiválódik limitált proteolízis segitségével. A proenzimet egyetlen, 245 aminosavból álló polipeptidlánc alkotja, amely öt diszulfidhidat tartalmaz. (Az ábrán csak két diszulfidhíd van feltOntetve, amelyek a végleges molekulában összetartják a polipeptidláncokat.) Az aktiválódás elsőlépését egy másik proteáz, a tripszin katalizálja, amely e/hasítja a peptidkötést a kimotripszinogén polipeptid 15. helyén levő arginin és 16. helyén levő izo/eucin között. Az így módosuló fehérje, amelyet Jt-kimotripszinnek neveznek, már rendelkezik proteázaktivitássa/, de még nem a véglegesen kialakuló enzim. A Jt-kimotripszin egy másik Jt-kimotripszin-molekulát hasít úgy, hogy két dipeptidet vág ki belőle, a 14-15. helyen levő Ser-Arg és a 147-148. helyen levő Thr-Asn dipeptideket. Az igy képződő fehérjemolekula a stabit formája az enzimnek, ez az o.-kimotripszin. Az o.-kimotripszin három polipeptidlánca diszulfidhidakkal van egymáshoz rögzítve. Az enzim aktivált formáját már az első proleolitikus hasítás létrehozza, amely a 16. helyen álló izo/eucin szabad NHr jét produkálja. Ez az oldallánc kerül elektrosztatikus kölcsönhatásba egy, az enzimmo/eku/a belsejében levő aszpartátoldallánccal, amelynek következtében a fehérjemoleku/a körülirt, nem nagy kiterjedésü részén bekövetkező elmozdu/ások hozzák létre a szubsztrátkötő hely megfelelő szarkezetét és stabilizálják az ak1ív helyet

lissé válik (a komplex disszociációs állandója l o - l J M). Orvosi szempontból j elentős az a. 1-antitripszin. Ez az inhibitor a sejtek lizoszomáiban müködő proteázok gátlására szolgál, a lizoszomán kívü l. Az a. 1-antitripszin génjének az örökl ődő hibáj a a tüdőszövet proteázok elleni védelmének csökkenése miatt annak súlyos károsadását eredményezi.

Az enzimek néhány gyakorlati alkalmazása az orvosi diagnosztikában

Egyes enz imek (fehé1jék) enzymopathiának nevezett genetikai károsadá a (az illető enzimfehérjét kódoló gén szerkczetének károsodása) jellegzetes anyagcsere-be-

A II E~10GLOB I

É A MIOGLOBI~

tcgségekhez vezet. A jelenséget az érinten anyagcserc-folyamatok analízisével szokták diagnosztizál ni. Bizonyos szervek, sejttípusok károsodása az intracelluláris enzimek kiáramlásához, ezen enzimek vérplazmai koncentrációjának az emelkedéséhez vezet. Léteznek olyan enzimek vagy bizonyos enzimek egyes szervckre jellemző izoenzim változatai, amelyek megjelenése, illetve koncentrációjának emelkedése a "érplazmában jól meghatározható jele lehet az adott szerv megbetcgedésénck. Más csetekben a betegség lefo lyásának menetét lehet figyelemmel kísérni, pl. a szívizom károsodásakor kiáramló enzimek vérplazmai koncentrációjának változásával. A klinikai diagnosztikában gyakran használt enzimek a glutamát-oxálacctát-transzamináz (GOT, másik nevén aszpartát-aminotranszferáz, ASA T), a glutamát-pinJvát-transzamináz (GPT, másik nevén alanin-aminotranszferáz, ALAT), tejsav-dehidrogenáz (laktát-dchidrogcnáz) izoenzimek, savanyú foszfatáz, alkalikus foszfatáz, amiláz, kreatin-kináz stb. A vérplazmában előforduló és bizonyos betegségckben vagy betegségeket előidéző állapotokban kórosan magas koncentrációt elérő nem fehérje természetü anyagok konccntrációjának meghatározásához (pl. koleszterin, trigl icerid) gyakran használnak enzimeket segéd-

43

eszközként. A legmodernebb diagnosztikai segédeszközök között találhatunk immobilizált enzímeket is, amelyek valamilyen hordozó anyaghoz vannak rög7ítve, és nagyon egyszerűvé teszik a próba alkalmazását. Általában olyan enzimekjöhetnek számításba, amelyek a kérdéses vegyü let felha ználásával egy színes vagy színes é tehető produktum képződését katalizálják. Az oldhatatlan hordozó anyagokhoz kovalens keresztkötéssel immobilizált enzimeket a modern gyógyszeripar is felhasználja specifikus kémiai reaktorként Az enzimkémia és immunológia együtte alkalmazásának eredménye az ELISA-ként ismert vizsgálati módszer. Az ELISA betű zó a módszer angol nyelvű meghatározásának (enzyme-linked immunosorbent assay) a rövidítéséből származik. Itt az enzimet indikátorként alkalmazzák. A módszer lényege, hogy egy antigén-antitest reakc ió létrejöttét, illetve menny iségi viszonyait az el ső ant itest ellen elöállított, és aaal reagáló második antitesthez kova lensen kötött enzim által produkált színes (vagy fényeffektust létrehozó) tennék alapján tudják meghatározni. Néhány esetben bizonyos enzimeket terápiás célokra is alkalmaznak. A legismertebb példa a véralvadékot oldó proteázok alkal mazása.

Ajá nlott irodalom Mcchanism of Enzyme Action. Control of Enzyme Act i\ ity. ln Lubcrt Stryer: Biochemistry. W. 1-1 . Freeman and Company. e w York. !988 Enzymcs: Classification, Kinetics and Control. by J. Lyndal York. ln Thoma M . Devlin editor: Textbook of Biochemistry with C linical Correlations. Wiley-Liss, Inc., USA, 1992 Enzymes in A lbert L. Lehninger, David L. Nelson, Michacl M. Cox: Principles of Biochemistry. Worth Publishers. Inc., USA, 1993

A hemoglobin és a mioglobin -

.3.

Mandl József

Az energiatranszformáció során a tápanyagokkal felvett energia kémiailag hasznosítható fonnákba (ATP stb.) alakul (lásd 2. 1. fejezet). Ez a fo lyamat aerob körülmények között, oxigén jelenlétében körülbelül tizennyolcszor hatékonyabban történik, mint anaerob viszonyok esetén. Ehhez azonban az oxigén állandó jelenléte szükséges. A keringési rendszer önmagában a sejtek oxigénellátását a szükséges szinten nem lenne képes biztosí taní, mivel az oxigén oldékonysága vízben nagyon kicsi. A megfelelő oxigénkoncentrációt speciális oxigénkötő, illetve szálLító molekulák biztosítják. Ilyen oxigént kötő, szállító molekula a vörösvértestekben a hemoglobin (Hb), izomsejtekben pedig a mioglobin (Mb). A két molekula funkciója különbözik egymástól. A Mb főként oxigén tárolására, a Hb az oxigén szállítására szolgál. A Hb-mentes vér oxigénkoncentrációja 5 ml normál állapotú 0 2/l, a normális Hb-tartalmú véré 250 ml 0 2/l. Mind a Hb, mind a Mb rendkívül részletesen és aprólékosan tanulmányozott fehérje. Szerkezetük megismerése, a Hb negyedleges szerkezetének és allosztérikus szabályozásának tanulmányozása a röntgen-krisztallográfiás módszerek alkalmazásával tudománytörténeti jelentőségű. Ezek a módszerek lehetövé tették a Hb (és a Mb) térszerkezetének igen alapos megismerését, az oxigénkötődés következményeinek pontos elemzését A Hb "Nobel-díjas" L'l10lekula, Max Perutz és John Kendrew a Hb és a Mb háromdimenziós szerkezetének feltárásáért nyerte el a k itüntető cimet. Ezeknek a kutatásoknak óri ás i, szemléletformáló hatása volt

A hemoglobin és a mioglobin szerkezete, oxigénkötése Mindkét molekula hemoprotein, prosztetikus csoportként hem et tartalmaz. A hemet vas Fe(II) és protoporfirin IX alkotja (ez adja a Hb és a Mb jellegzetes színét). Hem prosztetikus csoportot tartalmazó fehérjék az oxigénkötésen, -transzporton kívül redoxreakciókban is részt vesznek. Ezek különbözö folyamatok, azonban a molekulán belül az oxigén- és az elektronakceptor azonos: a hem-vas. A vas a hemben a tetrapirrot gyűrűrend­ szer közepén mind a négy nitrogénhez kötődik, ezenkívül azonban további két koordinatív kötésre képes a hem síkjának két oldalán (1 -31. ábra). Az egyik kötés révén a hem a globinhoz kapcsolódik, a másik az oxi génkötő hely. Az oxigén 0 2-molekula formájában kötődik. A hem-vas ötödik koordinációs kötőhelyéhez a globinlánc egyik hisztidinje (proximális His) kapcsolódik. A dezoxi Hb-ban a vas a porfumgyűrű síkjából a proximái is His irányába kiemelkedik. Az 0 2-molekula a vas hatodik koordinációs kötőhelyéhez kapcsolódik a hem másik oldalán. Az oxigénkötő hely kialakításában meghatározó funkciója van a globinláncban egy másik hisztidinnek (disztális His), amely nem kötődik a vasatomhoz. A szén-monoxid az 0 2-nél jóval erősebben kötődik mind a Hb, mind a Mb hem-vasához (ezért is olyan veszélyes a CO-mérgezés). A Hb és a Mb affinitását a CO-hoz éppen a di sztális His mérsékli. Az oxigénkötés képessége a hem-Fe oxidáltsági állapotától függ. 0 2-kötésre csak a hem-vas [Fe(II), ferro-] alkalmas, a hem-vas

A HEM OGL O BIN ÉS A MIO GLO BIN

U)))))) ))))))> >)))))) )})))}\)

)))))))) )))))))) )))))))) ))))))))

)))'n))) )))))>) )))))>) >HH)

)) ))))))H )))>))> )>)>>) )))))

H)))))) >>))))) )))

glob inH is (proximális His)

hem (Fe-protoporfirin IX)

globin His {disztális His) - - " polipeptidlánc

1-31. ábra. A hem szer keze te, a hem -Fe hat kötőhelye

oxidált állapotban (Fe(III), ferri- ; rnethem oglobin] erre nem képes. Ez a feltétel nemcsak a Hb-ra és Mb-ra, hanem más bem apro tein ekre is igaz. l ly módon elektronfel véte llel, illet ve-l eadással az oxig énkötés szab ályo zható (pl. eite króm P450 enzimek mük ödés e, lásd 2.6. fejezet). A hem opro teine k egy rész e ugyanis enzi m, ame ly szintén köti az oxigént, azon ban a kötö dést valamilyen enzi matikus folyamat követi, ame lyne k során az oxig én átalakul (lásd pl. terminá lis oxid áció , oxig eniz áció ).

Így a hemoproteinek egy része: • Fe(ll)-állapotban 02- tran szp orto t bonyolít le (Hb, Mb), • Fe(II) ~ Fe(III) redoxrendszer, elek trontranszferben vesz részt (citokrómok), • Fe(II)-állapotban 0 2-t köt majd Fe(Il) ~ Fe(JII) redoxreakcióban az Or t redukálja (c itokróm P450 enz imek). A Mb , illetve Hb oxigénkötése reverzib ilis.

45

46

))>))))))))l))))))))))))))))))))))))))»)))))))))))>))))))>)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

1-32. ábra. A hemoglobin 4 polipeptidláncának elhelyezkedése. Az alfa-láncok világos szürkével, a béta-láncok söféfszürkével, a hem pirossal jelölve M. Perutz kísértetei alapján

A Mb egyetlen polipeptidláncból, illetve az ehhez kapcsolódó hemből áll. A Hb globinrészét négy polipeptidlánc alkotja. A négy polipeptidlánc mindegyikéhez egy-egy hem tartozik, amelyhez egy-egy oxigénmolekula kőtődhet. A Hb A-t (adu lt = felnőtt) két alfa- és két béta-lánc alkotja. Az alfa-láncot 141 , a béta-láncot 146 aminosav építi fel, mindkét láncban, valamint a Mb polipeptidláncában több (8) a-hélix-szakasz található. A Hb négy polipeptidlánca (a2 ~ 2) szorosan kapcsolódik egymáshoz tetraéderes formában gömbölyű, tömör molekulát alkotva, amelynek az átmérője kb. 5,5 nm (J -32. ábra). A négy L áncot apoláros és ionos kölcsönhatások (8 ionpár) tartják együtt. A magzati Hb F (foetalis) két alfa- és két gamma-láncból áll. Az oxigénkötő fehérjéket telitési görbéjük.kel jellemzhetj ük, amely azt mutatja, hány százalékuk köt 0 2-t k:ülönböző parciális 0 2-nyomásoknál. A Mb-l, illetve a Hb-l a lkotó po lipeptidláncok szerkezete, felépítése rendkívül hason ló az élőv ilágban. Ezek a fehérjék nemcsak a szerkezct- funkc ió. hanem a génevolúció tanulmányozásának is kedvelt objektumai. A Mb-t, illetve a l lb-t a lkotó polipeptidláncokat kódoló gének három exont ta 11a lmaznak; am ino savszekvencia-azonossági vizsgála tok alapján is a közös ős bizonyíthatóan létezett.

A FEH ÉRJÉK ÉS ENZI MEK SZERKEZETE, FUNKCJÓJ A

Összefüggésben a Mb és a Hb eltérő funkciójával, alapvető különbség mutatkozik a két molekula oxigéntelítési görbéjében. A Mb oxigénkötési görbéje hiperbola, hasonló a görbe lefutása, ha 4 bétavagy 4 alfa-láncból mesterségesen kialakított Hb oxigénkötését vizsgálják. Ezzel szemben vörösvértestekben az a 2 ~ 2 Hb oxigéntelítési görbéje szigmoid (1-33. ábra), ami az alegységek közötti kooperatovitásra utal, valamint arra, hogy a Hb allosztérikus protein. Az ábrán látható, hogy a Mb alkalmatlan lenne oxigénszállításra, mivel a szövetekben fennálló viszonyok között nem adná le az oxigént. A Hb negyedleges szerkezete éppen az oxigén leadását teszi lehetövé. A dezoxi-Mb és az oxi-Mb szerkezete hasonló, az oxigénkötés azonban megváltoztatja a Hb negyedleges szerkezetét. A változások lényege, hogy oxigén hatására a Fe(II) és a porfiringyűrű térbeli viszonya módosul, az oxigén nélkül a gyűrű síkjából 0,06 nm-t kiemelkedő Fe oxigént kötve a gyűrű síkjában helyezkedik el. Az oxigén mintegy behúzza a gyű­ rűbe a hem-vasat. Mivel a Fe(II) kovalensen kapcsolódik a globinlánchoz, ezért az oxigenálás a láncok kapcsolatát is megváltoztatja. A láncok

artériás vér

100

~

o

O>

·Q) C/)

t:

~

2 o l

N

10 1 5 13 izom izom munkában nyugalomban oxigén parciális nyomása (p02 , kPa)

1-33. ábra. A hemoglobin és a mioglobin oxigéntelitési görbéje in vivo

A FEH É RJ ÉK ZER KEZETF:

>)))>> >>>>>n>»>>>»>»»»>»>>>>>>>>>»)) >H> >> >>>> >>>> >> >>

oxigenálás következtében egymáshoz képest elmozdulnak. Az ox igenálás két lényegi következménnyel jár: megváltoznak az alfa- és béta-láncok közti hidrogénhídkötések és apoláros kölcsönhatások, valamint felszakad a deoxi-Hb-t stabilizáló 8ionpár. A nem kovalens elektrosztatik us kereszt kötéseket létrehozó sókötések láncvégi szabad karboxilcsoportok és láncvégi szabad aminocsoportok, a szabad karboxiicsopo rtok és az a-tánc ban adott pozícióban található Lys, valamint Asp-His, Asp-Arg között jönnek létre pontosan ismert helyeken. A sókötések kialakulása tehát akadályozza az oxigén kötését. A dezoxi-Hb sókölésekkel "összehúzott" negyedleges szerkezetét T- (tense) módosulatnak nevezik, szemben az oxi-Hb R- (relaxed) formájával. Allosztérikus fehérjék esetében T-formának nevezik azt a módosulatot, aho l a molekulának a szubsztráthoz való affinitása kisebb. A kérdés az volt, hogy mi stabi lizálja a deoxi-Hb negyedleges szerkezetét. Megoldását egy furcsa megfigyelés készítette elő, a Hb oldatban nagyobb affinitással kötötte az oxigént, mint a vörösvérsejten belül, tehát a sejten belül valami rontja a Hb 0 2 iránti affinitását.

Az oxigénleadás szabályozása A hemoglobin negyedleges szerkezetét befolyásoló effektorok, a 2,3-biszfoszfog/icerát szerepe. A hemoglobin oxigénleadása acidosisban A 2,3-biszfoszfo glicerát (2,3-BPG, 1-34. ábra) a vörösvértestekben igen nagy mennyiségben termelődi k (lásd 2.2. fejezet). Kötödik a dezoxi-Hb-ho z, a kötés ekvimoláris; l tetrarner Hb-moleku la egy molekula 2,3-BPG-t köt. A 2,3-BPG-nek fiziológiás viszonyok között 5 negatív töltése van . A Hb 2,3-BPG kötőhe lyét a béta-láncok négy His, illetve 2 Lys am inosava alakítja ki. A pozitív tö ltésű aminosav-oldallá ncok és a negatív tö l tésű 2,3-BPG közötti kölcsönhatások olyan kötődést hoznak létre, amely stabilizálja a deoxi-Hb negyedleges szerkezetét A 2,3-BPG oxi-Hb-hoz nem kötődik, ugyanis az oxigenálódás fo lyamán a láncok elmozdulása miatt a BPG-kötő hely megváltozik, szük lesz a 2,3-BPG számára. Megváltozik a kötőhelyet

» >> >>>>>U»>>»>>>>>>»>» >> >> >> >>n>>»>>>>>>>»>>>>>»>>>H>>> >> >n•>>>>n >H>>>>>>>

cool

47

o ll

H- C - 0 - P - o · l t H- C - H 0 -

l o l

-O - P= O

l

o-

1-34. ábra. A 2,3-biszfoszfog licerát képlete

kialakító aminosavak közti távolság is, így a Hb egyszerre 0 2 és 2,3-BPG kötésre nem képes. A 2,3-BPG koncentrációj a kb. 4,5 rnM, szabályozott, a szabályozás pontos mechanizmus a azonban ismeretle n. A g li kolízisbe n (lásd 2.2. fej ezet) részt vevő egyes e nzimek szintézisének zavarai vörösvérteste kben befo lyásolják a 2,3-BPG-szi ntet. Így hexokináz-hiá nyos á llapotokban a 2,3-BPG-szint c ökkcn, e7ért az oxigéntclítési görbe balra tolódik, a l lb oxigénaffinirá a nő. Piruvát-kináz-hiányos állapotokban a görbe j obbra tolódik, mcrt a 2.3-BPG-koncen tráció emelkedett, a Hb ox igénaffinitása csökken. Azokba n a betegségekben, aho l króniku hypoxiajön létre (pl. krónikus emphyscmában, amikor a tüdő "légzőfelülete" je lentősen csökken) a 2.3-BPG-szint megemelkedik 4,5 mM-rol 8,0 mM-ra , s ezzel az ox igénellátás felté te lei lényegcsen j avulnak. Hasonl ó folyamat játszódi k Ic a magassági viszonyokhoz történő alkalmazkodás során. 2 nap alatt 7,0 mM-ra emelkedik a 2,3-BPG-szint a tengerszi nt felett 4500 m-hez va ló alkalmazkodásk or. A konccntrációem clkedés reverzibilis, a "te ngerszintre" visszatérés utá n a 2.3-BPG-koncen tráció is eredeti érté kére c ökken.

Ha a vörösvértest nem tartalmaz 2,3-BPG-t, a Hb telitési görbéje ha onJóvá válik a Mb telítési görbéjéhez. A tá rolt vér 2,3-BPG-tartalma fo lyamatosan csökken, ezért oxigén-affinitása nő. Ez igen előnytel en t:ranszfúziók csetén, amikor a vérpótlás egyik legfontosabb célja az oxigénszállító kapacitás biztosítása. Ezért a tárolt vérhez inozint adnak, amelyből a vörösvérsejte kbe bej utva 2,3-BPG képződik a g likolízis során. A Hb F kevésbé köti a 2,3-BPG-t, mint a Hb A, így a Hb F 0 2-affinitása nagyobb, mint a Hb A

48

)))))) )) )))))))))))))))))) )) )})))))) )) )))))})))))))))) )) )))))))))})) )))))))))) )) )))))))) )) )))) ))))

A F EHÉRJ É K É ENZIME K ZERKEZ ETE, FUNKC IÓJA

1-35. ábra. A hemoglo bin 0 2· és C02-száll ítása

tüdő­

Hb - -·H+ + 40... / /

/

2,3-BPG

\ \

'

alveolus okban

Hb(02) 4

+

H~

+ Heo ; + 2,3-BPG

szövetekben

HCO

0 2-affinitása. A Hb F Hb A-nál nagyobb 0 2-affinitása elősegít i az oxigén bej utását az anyai keringésbő l a magzati vérkerin gésbe. A magzati vörösvé rtestekben l évő dezoxi- Hb F az anyai vörösvérte tekben lévő oxi-Hb A-ból kapja az oxigént a placentá ris keringés ben. Így az anyaitól eltérő szerkeze tű magzati Hb szerepet játszik a magzat optimális oxigéne llátásáb an. A Hb és a Mb között további lényege s különbs ég az, hogy a Hb protono kat és C02-ot is köt, ill etve zállít. Régi megfigy elé , hogy a pH csökken ésével a Hb 0 2-affinitása csökken (pH 7,6, valamin t a szövetek ben szokáso ox igén parciális nyomás esetében , 40 Hg mm pOrérté knél a Hb az oxigén 0%-át visszatartja, pH 6,8-ná l ez a menny iség 45%). A metabol izmus során a Hb álta l leadott Orből mintegy 80%-ban C02 lesz és a keletkez ett C02 kb. 15%-a a Hb-hoz kötődik. intenzív ebb metermelőd ik és az tabolizm us esetén több kkor, el sősor­ Ugyana ik. Orszük séglet is fokozód ban fokozott izomműködé ben a laktátter melés is megemelkedik, a vér-pH csökken , a Hb telitési görbe jobbra tolódik. Ez a Bohr-ef fektus. A képző­ dött C02, illetve a protono k egy részét a Hb úgy köti meg, hogy a b éta-lánc N-terminális aminocsoportj áva l ka rbamáto t COOC- HN-R) képez. (Nem ez a C02-transzport fő mechan izmusa a vérben, hanem a bikarbo náttrans zport). Tovább i ókötése k jönnek létre, ami tovább csökken ti a Hb oxigénaffinitásá t A tüdőal veo lu okban a Hb leadja a felvett C02-ot, iIletve protono kat és 0 2-t vesz fel (1-35. ábra).

co2

A hemoglobin am inosav-összetételének változásai. A haem oglob inopa thiák Nemcsa k a Hb " molekul áris anatómiája" ismert igen jól, a "molekuláris patholog iája" is.

Több mint 300 humán haemog lobinop athiát írtak le, amelyek mint a termész et experim entumai (termész et alkotta site directed mutagen es is, lásd 3. fejezet) hozzájár ultak a Hb szerkezet- funkeió megértéséhez. Legtöbb jük, mindössze egyetlen aminosa v változás ával és csak kisebb szerkeze ti és funkcion ális hatásokkal jár, azonban bizonyo s esetekbe n egyetlen aminosavelt érés súlyos kórkép kialakulásához is vezethet. Amikor 1904-be n Chicago ban egy vérszegény feketebőrű diák vérében furcsa sarló alakú vörösvé rtesteke t észlelt egy orvos, hat évig nem merte leközölni új, szekatla n megfigy elését. A kórkép - amelybe n egyébké nt l OOO fekete amerika iból 4 szenved - leírását 1949-ben követte Linus Pauling felfedez ése: a Hb S, a moleku láris betegsé g szemlét etváltoz tató fogalmána k kialakítá sa. A Hb S mindöss ze egyetlen aminosa vban tér e l a Hb A-tól; a béta-lán c 6. amine ava Glu helyett Val. Ez a Hb S fizikai-kémiai tulajdon ságainak megváltozását okozza, a dezoxi- Hb S ol-déko nysága csökken , a Hb aggregá lódik. A Hb S-aggre gáció hosszú helikális rostok képződéséhez vezet, amely megvált oztatja a vörösvérte st alakját, ozmotik us rezisztenciáját, élettartamát, (sicklc cell) sarlósej tes anaemi a alakul ki. Amikor a megváltozott aminosav a molekul a kül ő részéne k változás át idéz i elő, ez rendsze rint ártalma tlan, nemjár klinikai tünetekk el, kivéve épp a Hb S-t. Az aktív hely körüli változások már patológi ai történés ekkel járnak. A Hb Heuthrow esetében egy P he helyén szerepe l Leu, amely a hemogl obin (relaxál t) R médcsu latát stabilizá ló tényező . Az eredmén y az 0 1-affinitá s fokozód ása, aminek következtében polycyth aemia alakul ki. A Hbaoston Tyr-t (genetik ai kódja UAU, UAC) tartalma z a

A FEH ÉRJÉK ZERKEZETE

>H>»>>>H>>>>>>>>>>>))))))))))))))) ))))U)))))))))))))))))))))))))'H ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))>H )>)))))))))H))U>H>>H))>))>)))>>>> >>

proximális His (CAU, CAC) helyén, ennek a változásnak a következtében a Fe(U) kiemelkedik a porfiringyűrű síkjából és Fe(fll)-rná oxidálódik; methaemoglobinaernia alakul ki. Ezért ezt a Hb-t Hb M-nek nevezik. Ilyenkor a Fe(IJI) H20-t köt 0 2 helyett. A Hb számos más formáját is leírták a Hbo05100-on kívül, a ll br.,htwaukce, Hbsa,kn~<"'"' Hbuydc t'urk mind-mind egyetlen al fa-, illetve béta-láncban elhelyezkedő aminoav mutációja nyomán alakulnak ki. Magyarországon is leírtak abnormális Hb-t. A methaemoglobinaemiával járó HbK"kunhala, a Hbo0 , 100-nal azonos defektus eredményének bizonyult. Az irodalomban ismert a Hbauda és a Ilb,,~t i o

Egy-egy aminosaveltérés a harmadlagos szerkezet megváltozásához, instabil Hb-ok kialakulásához vagy a negyedleges szerkezet módosulásához, ez esetben az allosztérikus

49

effektorokra való reagálás készségének változásához vezet. A hemoglobin egy vagy több polipeptidl ánca szintézisének genetikai rendellenessége a thalassaemiáknak nevezett betegségcsoport létrejöttét eredményezi. Különböző mutációk nem stabil, gyorsan bomló Hb-láncok képződését is okozhatják. A Hb-szintézis öröklődő zavarai a thalassaemja-szindrórnák, a Hb F (a2 y2) előfordu­ lása felnőttkorban a béta-láncok szintézisének elégtelensége rnjatt alakul ki. A thalassaemiaszindróma súlyos, az esetek egy részében gyerekkorban fatális betegség, anaemjával, vörösvértest-rendellenességekkel okozhat magzati halált is. Az alfa-lánc-szintézis zavarait a-thalassaemiának a béta-lánc zavarait P-thalassaerniának nevezik.

A fejezet megírásával kapcsolatban tett javaslatokért és kritikai megjegyzésekért a sze rző köszönetet mond Dr. Csala Miklósnak, Or. Csermely Péternek, Garzó Tamásnak és Dr. Tóth Miklósnak.

Az anyagcsere

2.1. Bioeoergetika. Energiatermelés és -raktározás az anyagcsere során (Mandl József) Energiatranszformáció "Kapcsolt reakciók" elve A metabolizmus Csoportátvitel - csoportátviteli potenciál A foszforiltranszfer, ADP/ATP ciklus Elektrontranszfer - oxidoredukció A legfontosabb elektronátvivők redoxciklusa A biológiai oxidáció Elektrontranszfert katalizáló enzimek - oxidoreduktázok Terminális oxidáció - oxidatív foszforiláció A mitokondriumok szerkezete A mitokondriális légzési lánc alkotói A terminális oxidáció folyamata Az oxidatív foszforiláció Az ADP foszforilációja - az akceptor kontroll A kemiozmotikus elmélet Mitokondriális fehérjék szintézisének zavarai - ,,mitokondriális betegségek" A citrátciklus · A citrátciklus helye az intermedjer anyagcserében; a ciklus katabolikus és anabolikus funkciója Acetil-CoA képződése piruvátból, a piruvát-dehidrogenáz enzimkomplex A citrátkör reakciói A citrátkör szerepe a tápanyagok katabolizmusában A piruvát-dehidrogenáz komplex aktivitásának szabályozása A citrátciklus szabályozása. A ciklust felöltő (anaplerotikus) reakciók A piruvát-dehidrogenáz esőkkent müködésének klinikai vonatkozásai 2.2. A szénhidrátok anyagcseréje (Adám Veronika és Mandl József) A legfontosabb szénhidrátok és tulajdonságaik A szénhidrátok emésztése, felszívódása és a glukóz bejutása a sejtekbe Glikolízis A glikolízis helye az intermedier anyagcserében A glikolízis reakciói A glikolizis energiamérlege. A glukóz aerob és anaerob lebontásának energiamérlege Sejtspecifikus sajátosságok, klinikai, patológiai vonatkozások Redukáló ekvivalensek transzportja a citoszolból a mitokondriumba Glukoneogenezis - a glukóz de novo szintézise

l A glikolízis és a glukoneogenezis szabályozása A fruktóz és a galaktóz metabolizmusa A glikogén szintézise és lebontása Glikogénszintézis Glikogénlebontás A glikogén-anyagcsere szabályozása Glikogéntárolási betegségek A vércukorszint szabályozása A glukóz direkt oxidációja, pentóz-foszfát-út A glukóz direkt oxidációjának oxidatív szakasza A glukóz direkt oxidációjának nem oxidatív szakasza. Pentóz-foszfát keletkezése glikol ízis intermedierekből A pentóz-foszfát-út szabályozása, jelentősége, lefolyásának külőnbőző formái A pentóz-foszfát-ciklus működésének megváltozásával összefüggő kórképek Si oszintetikus folyamatok a szénhidrátok anyagcseréjében. Glikoproteinek, proteoglikánok szénhidrátláncának szintézise 2.3. A lipidek anyagcse réje (Adám Veronika) A legfontosabb zsírsavak és jelölésük Acil-gliceridek. Trigliceridek és az energiaraktározás A zsírsavak de novo bioszintézise Az acetii-CoA transzportja a mitokondriumból a citoplazmába A zsirsavszintézis e lkötel ező lépése és az acetil-CoA-karboxiláz szabályozása A palmitinsav szintézise. A zsírsav-s zintáz A NADPH forrása A zsírsavlán c elongációja Speciális zsírsavak, melyek a zsírsav-sz intáz-reakcióban keletkezhetnek A trigliceridek szintézise és raktározása Lipolízis - a raktározott zsírsavak mobilizálása a zsírszöve tből A zsírsavak oxidációja A páros szénatomszámú zsírsavak oxidációja A páratlan szénatomszámú és a telítetlen zsírsavak oxidációja Alfa-oxidáció és omega-oxidáció A ketontestek keletkezése és felhasználása. Ketonaemia, ketonuria A koleszterin metabolizmusa A koleszterin szintézise A koleszterinszintézis regulációja A koleszterin-észterek keletkezése Az epesavak keletkezése, metabolizmusa és jelentősége A lipidek szállítása. Lipoproteinek A trigljceridek szállítása. Kilomikron, VLDL A koleszterin szállítása. LDL, HDL Szabad zsírsavak A zsírok emésztése és felszívódása A foszfolipidek és szfingolipidek felépítése és j elentősége A foszfatidilkolin szintézise

Egyéb foszfolipidek szintézise A szfingolipidek szerkezet e és szintézise A foszfolipidek és a szfrngolipidek transzpor tja a sejtmemb ránba A szteroidh ormonok metaboli zmusa Szteroidh ormonok szintézise a mellékve sekéregb en A glukokor tikoidok és a rnineralo kortikoid ok inaktiválá sa és szállítása a plazmába n A nemi honnono k szintézise ADr vitamin szintézise

2.4. Az aminosavak anyagcseréje. Porfirin-anyagcsere (Machov ich Raymund) Az aminosav -anyagcs ere által.ános ismerteté se A táplálékból származó aminosav ak. A fehérjék emésztés e A fehérjeemésztő enzimek aktivitásá nak szabályoz ása Az aminosav ak transzpor tja Az endogén fehérjék lebontása Az aminosav ak sorsa Glutamát -dehidrog enáz Transzam in ázok Egy szénatom os csoportok transzfer reakciói A nem esszenciá lis aminosav ak bioszintézise Az aminosav ak átalakulásai A nitrogén sorsa Az ammónia elimináci ója Az omitincik lus ("ureacik lus") Az ureaszintézis szabályoz ása Az aminosav ak szénláncá nak sorsa és az aminosav akból képződő nitrogént artalmú vegyülete k A g licin, alanin, szerin és cisztein átalakulá sa A triptofán kataboliz musa A glutamin , prolin, arginin, hisztidin és glutamát átalakulá sa A metionin , treonin, valin és az izoleucin katabolizrnusa~ a B 12-vitamin szerepe A fenilalaai n és tirozin kataboliz musa Az aszparagi n és aszpartát metaboliz musa A leucin és lizin kataboliz rnusa Porfirine k és epefesték ek A porfuine k szintézise A porfmnek lebornlása, epefesték ek képződése A porfirine k hibás anyagcse re-folyam ataival értelmezhető kórképek 2.5. A nukleotidok anyagcseréje (Machovich Raymund) A nukleotid ek szerkezet e A mononuk leotidok forrása Purin nukleotid ek bioszintézise Purin nukleotid ok bioszintézisének szabályoz ása Pirimidin nukleotid ok bioszintézise Dezoxirib onukleoti dok keletkezé se

\

A dezoxi-timidilát (dTMP) és a timidin-trifoszfát (dTTP) szintézise Dezoxi-ribonukleotidok bioszinté zisének szabályozása Nukleoti dok bioszintézisét befolyásoló vegyületek. Terápiás felhasználás Purin és pirimidin nukleotidok Lebontása Purinbáz isok lebontása Pirimidin bázisok lebontása Nukleoti dok egymásba történő átalakulásai B 12-vitamin; metil-malonát-acidosis és anaemia A nukleotid ok, mínt a Legkülönbözőbb funkciókkal rendelkező molekulá k forrásai

2.6. Biotrans zformáci ó - méregtelenítés (Mandl József) A biotranszformáció szakaszai A biotranszformáció első, előkészítő szakasza, acitokró m P450 enzimek A biotranszformáció második, konjugác iós szakasza A biotranszformáció harmadik, transzpor t szakasza A biotranszformáció szabályozása A biotranszformáció biológiai jelentősége. Méregtelenités. Klinikai vonatkoz ások Az "oxigénto xicitás" ROS képződése nem enzimatikus úton ROS képződése enzimatikus úton A ROS eliminálá sa 2.7. Az anyagcse re összebangolt szabályo zása (Mandl József) A sejt intermedier anyagcseréjének integráci ója és a szabályoz ás szempon tjai Elágazási pontok a sejtek intermedier anyagcse réjében A sejtek redox homeosz tázisa Az anyagcse re szabályozása a szervezet szintjén - éhezés, táplálékbevitel Máj Izom Agy (központi idegrendszer) Zsírszöve t Az anyagcse re integrációja patológiá s állapotokban

Bioenergetika. Energiatermelés és -raktározás az anyagcsere során

•

Mandl József

Energiatranszformáció A biológiai rendszerek működésének az az alapja, hogy folyamatosan képesek a szabadenergianövekedéssel j áró (endergonikus) folyamatok energiaigényét biztosítani. Az é l ő lé nyek alapvető­ en izoterm és izobar rendszerek, amelyek térfogatingadozása is viszony lag csekély. Ezért a heterotróf sej tek fő energiaforrása a kémiai energia; a fotoszintézisre képe sejtekkel ez a könyv nem foglalkozik. Az alapkérdés az, hogy hogyan képes az élőlény a környezetéből fo lyamatosan energiát felvenni, hogyan képes azt o lyan formává átalakitani, arnivel fedezni tudja az endergonikus folyamatok energiaigényét Ez a kérdés nemcsak a szervezet egésze szintjén, hanem egyetlen kiragadott reakció szintjén is felvetődik. Az energiaigény kielégítését a heterotróf élőlény tápanyagok felvételével biztosítja. A tápanyagokat kémiai reakciók sorozata segítségével lebontja, és az ebből nyert kémiai energiából fedezi a bioszintézis, a mechanikai munka, az aktív transzportok és más folyamatok energiaigényét A bioenergetikát, amely a biokémiai reakciókat kisérő energiaváltozásokkal foglalkoz ik, biokémiai termodinamikának is nevezik.

badentalpia-változás (t.F és G) foga lmait. M inthogy az é l ő szervezetben t.E::::: t. H, t.F ::::: t.G a továbbiakban a biokém iai iroda lomban mcgszokott módon (a Gibb -fé le szabade nergia után) a zabadencrgia-változást a szabadentalpia-vá ltozás betüszimbó lumáva l (t. G) jelöljük. A szabadenergia-változás ( G) a tcm1odinamika második főtétele a lapján: .1G =

ll - T t.

Egy reakc ió szabadenergia-vá ltozása a tem1ékek és kiindulási a nyagok zabadenergia-tartalmából kiszámítható:

Standard körülmények közölt (a reakc ióban részt vevő molekulák koncentrációja l ,O mol/1, pH 7,0. 25 °C. l O1,3 kPa) az egyensúly i konstans K~· ismeretében meghatározható egy reakció standard szabadenergia-változása ( G 0 . ), amely az adott reakcióra jellemző ko n tans érték. Egy reakció aktuá lis szabadenergia-változá a (.1G) azonban mindig a tem1ékek és a kiindulási anyagok aktuá lis koneentráeiójától (és az aktuális hőmérséklettöl) függ. /\ t.G és t.G 0' értéke egy A+ B ~ C+ D reakc ióba n: t.G = t.Gcr + RT ln [C][D]

[A][B] ahol a dől t betűvel jelölt értékek az ak tuá lisan jelen l evő me nny iségeket, illetve koncentráeiókat jelölik (R: gáLállandó. 8,3 1 J moi' 1K"1; T: ab zolút hömérséklet, ° K) lia G = O t.G 0 . = - 2,303 RT log Ke. (J). ha T= 298 ° K, akkor

A termodinamika megkü lönbözteti az energia- és entalpiaváhozás (t. E. illetve t. I l)* mintájára a ·zabadenergia- és sza-

•

t.G 0 ·= 5,69 log

Ke' (kJ)

6 11: entalpiavaltodts (a reakc ióhö): 6 1-l E + p 6 V: biokémiai reakciók feltéte le i között a nyomás (p) nem, a térfogat (V) cs<~k ktsmértékben válto;ik. ezért a 6 1l közel azonos a belsöenergia-változással ( E): T: abs;olút hömérésklet: öS: entrópiaváltotás

A ' VAGCSE RE

Gyakoribb az összcrüggés fordí toll fe lhasználása, mivcl redox folyamatokban rcdoxpotcnciál-mérés ckkcl a ~Go· meghatározható, s ebből számítható a !(.;.

A ~G állapotfüggvény, így értéke független a reakc ió úttól. A ~G ugyanakkor termodinamikai és nem kinetikai fogalom, így értékéből nem következtethetünk a reakció sebességére .

" Kapcsolt reakciók" elve Ha ~G értéke negatív (exergonikus reakc ió), a reakció energiabevitel nélkül "spontán" végbeme het; ha ~G értéke pozitív (endergonikus reakció), akkor a reakció nem megy végbe ("magától") csak meg fe lel ő fe ltéte lek esetén. A megfelelő fe ltételt az exergonikus és endergonikus reakciók kapcsolása jelenti. Ennek lényege, hogy a kapcsolt exergonikus/endergon ikus reakc iók "eredő", nettó szabadenergia-változ ása negatív. Ez a kapcsolódás a szervczet szintjén (azaz folyamatok rendszerét szemlé lve) elv, absztrakc ió; az egyes kapcsolt reakc iók szintjén azonba n ko nkrét fehérjék (el sősorban enzimrnolekulák) fe Jszínén és részvételével zajló törté nés. Az é l ő szervezetben végbemenő (bio)kémia i reakciók döntő többsége gyakorlatilag nem megy végbe "spontán " akkor em, ha a ~G értéke negatív, mivel e reakciók akti váJási energiáj a többnyire nagy. Sebességük az enzimaktiv itásole aktuá lis szabályozottságától függ. Endergonikus reakció spontán végbemenete le termodinamika ilag nem lehetséges, ez enzim közreműködésével sem következhet be.

A metabolizmus A metabolizmus során a környezetből a szervezetbe, sej tbe kerül ő (táp-) anyagok lebomlanak, áta lakulnak a sejt saj át an yagaivá. A lebontó (az esetek többségében exergonikus) reakciók összességét katabolizmusnak , a fel építő (az esetek tö bbségében endergonikus) reakciókat anabolizmusnak nevezik. Az anabo likus és katabolikus reakc iók együtt jelentik a metabolizmust az é l ő szervezetek sejtjeiben. A sz intetikus fo lyam atok során formálódnak a sejt különböző spcciá lis funkc iójú molekulá i és a

fe lépülnek a sejtet a lkotó polimer (makro-) molekulák - fehérjék, nukle insavak, po liszacharidok, lipidek - , ame lyek szintén lebomlanak és áta lakulnak. A metabolizmusban képződő mo lekulák egy része a sejt biológ iai funkc ió iból adódóan miután megtermc l ődött, távoz ik a sej tből, illetve a sejtek a számukra nem hasznosítható anyagaikat is kiürítik. A nyagcserén, metabolizmuson a szervezetben a felszívódástó l a kiürülésig lejátszódó összes kémiai átalakulást értjük, amelyek enzimek által katalizált reakciósorozatok útján valósulnak meg. Az intermedier anyagcsere, illetve intermedier metabo lizrnus fogalmát gyakran a kis molekulatömegű anyagok átalakítását célzó sejten be lüli folyamatok összességére értik. monornerekből

Csoportátvitel - csoportátviteli potenciál A (heterotróf) szervezet sej tjeinek sz in~én az alapkérdés az, hogy milyen mechanizmussal oldható meg az endergonikus reakciók +~G igényének fedezése? A megoldás á ltalános, egyszerűsített sémáját aerob kürülmények között a 2- l . ábra szemlé lteti. A tápan yagok (szénhidrátok, zsírok, fehérjék) szerves molekulák, am elyek o lyan kötéekben tartalmaznak hidrogént, hogy azt oxidoredukc iók révén képesek átadni speciális hidrogén- (elektron-) szálU tó, (átvivő) m olekuláknak. Több, kül önböző funkciój ú illdrogént szállító molekula j átszik szerepet az anyagcserében, az energiatranszformáció folyamatában azonban a NAD+ és a FAD redoxciklusa (részletesen lá d 64 . oldalt) döntő j elentőségű. A metabolizmus során képződő N A DH-t és FADHr t képes a sejt végül úgy oxidálni (terminális oxidáció), hogy ehhez kapcsoltan egy endergonikus foszforiltranszfer történik; ADP foszforilálódik és ATP ke letkezik (oxidatív foszforiláció) . Az A TP terminá lis foszfátjának hidrolíziséhez szárnos endergonikus reakció kapcsolható. A 2-2. ábrán látható sémán különböző exergonikus és endergonikus reakciósorozatok, illetve reakc iók kapcso lódnak. Az energetikai szempontból lényegi történések e lektron-, illetve foszforiltranszferek. Viszonylag egyszerű élő szervezetekben, pl. egy baktériumban is legalább ezerféle kémiai reakció történhet. A reakciók j e lentős része valarnilyen

57

BIOENERGETIKA

2-1 . ábra. Energiatranszformáció sémája az aerob heterotróf anyagcserében

t .. k ornyeze

hidrogéntartalmú (oxidálható) - - --+ tápanyagok

(AH2 )

szénhidrátok zsírok fehérjék

+

! bioszintézis mechanikai munka aktív transzport

atomcsoport vagy adott esetben elektron, proton, átvitelével jár. Rendszerezésüknek az egyik - számos következtetés levonására alkalmat adó - módja, amikor a kategorizálás az átvitt csoport alapján történik. A csoportátvitel, illetve -szállítás eszköze egy közös intermedier, szállító, átvivő molekula. Azonos típusú csoportátviteli reakciók kü lönböző molekulák között, azonos átvivő közbeiktatásával bonyolódnak . Az átvivők az él ővilágban többnyire univerzális molekulák. Egyaránt donorok és akceptorok· képesek a csoport felvételére és leadására. A csoportátvitelt enzimek katalizálják , kivételek azonban vannak. Számos biokémiai reakció esetében ezért a reakció feltétele nemcsak a reagáló molekulák é az enzim, hanem a koenz imfunkciót betö ltő, átv ivő mo lekula jelenléte is. Az átv i vő molekulák, illetve előanyagaik (prekurzoraik) egy részének szintézisére az emberi szervezet nem képes. Táplálkozásélettani szempontból ezek a vegyületek legtöbbször vízoldékony vitaminok, illetve azok szánnazékai (2- 1. táblázat).

(

\

NAD 1='\D

NADH "\Dr

-z

Qi

H

-
c

...o

.7i: Q) Qi

Hp ADP + P

ATP

2-2. ábra. Elektronátvitel és foszforil átvitel az energ iatranszformációban. Piros nyil: endergonikus folyamat, fekete nyíl: exergonikus folyamat)

58

)) ))>))))))))>)))))))) )))))))) ))))>l)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))>)))) ) ))))))))))))) )))))))) )) )))))) )))))))) )))))) )) )))))))) )))))) )))))) )) )))) )) )))))) ))))>)))))))

A csoportátvite l iránya vál tozó: a csoport valame ly m olekuláró l az átv ivő molekulára, illetve az átvivő mo lekuláról egy más molekulára kerülhet. A reakció gyakran mindkét irányban lehetséges. Az átvitelre kerülö csoportnak az átvivöre kerülése - a csoport "aktiválása" - átmenet; "végleges" helyére a csoport az átv ivő molekuláról kerül. A 2-3. ábrán példaként bemutatott fo lyamat aminocsoport-átvitel, transzaminálás (részleteket lásd a 2.4. fej ezetben). Az átvi vő molekula 8 6-vitaminszármazék, a piridoxálfoszfát, amely a folyamatot katalizáló transzamináz enzimhez kötve helyezkedik el; a csoportátvitel reverzibilis. A csoportátvitel tendenciája a csoportátviteli potenc iá lla l jellemezhető. A csoportátviteli potenciált a csoportá tviteli reakc ió öG0·-értéke határozza meg. Az energiatranszformáció szempontjából elsősorban a foszforil- és az e lektron- (hidrogén-) transzfer kitüntetett fontosságú.

2-1. táblázat. Egyes, csoportátvitelben szerepet játszó vizoldékony vitaminok és azok néhány koenzimszármazéka Átvitelre kerülö .,aktivált" csoport

Atvivö, .,carrier" koenzim

aldehid elektronok elektronok aci lC1-töredék

!iamin-pirofoszfát FAO NAD koenzim-A tetrahidrafolsav bioti n piridoxál-foszfát

co2 1

amino-

piridoxáf-foszfát

coo+

B, 82 niacin pantoténsav folsav

l biotin Bs

ptrídoxamin-foszfát

coo-

l l

l C=O l

CH2

CH2

CH2

CH2

HN - C- H 3

Vitamin

l

l

l coo-

glutamát

Al'\YAGCSERE

l

l

coo a-ketoglutarát

2-3. ábra. Aminocsoport átvitele alaninról a-ketoglutarátra, illetve glutamátról piruvátra

BIOENE RGETIKA

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))})))) ))))))))))>) ))))))))))))))))))))))}) )))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))})))))))))))))))

A foszforiltranszfer, az ADP/ATP ciklus A foszforilcsoport átvitele alapve tő az exergonikus és endergonikus reakciók közötti szabadenergia-transzferben. A 2-2. táblázat egyes, az anyagcserében j elentős foszfátvegyületek foszfátcsoportjai hidrolízisének i1G0 --értékeit mutatja. A csoportátvitel logikája szerint foszforilcsoport átvivő funkcióra olyan vegyü let alkalmas, amely lehet foszforildonor és -akceptor is, vagyis csoportátviteli potenciálja közepesen nagy. A foszforil-transzferben az adenozin-foszfátok szerepe a legfontosabb. Az A TP adeninból, ribózból és három foszfátcsoportból áll, a sejtben Mg2 ~­ komplexet alkot (2-4. ábra), tenninális foszfátjának hidrolízise, mint exergonikus reakció, számos endergonikus reakcióhoz kapcsolódhat A 2-2. táblázatban felsorolt foszfátvegyületek aszerint, hogy a foszfátcsoport hidrolízisének i1G0 . értékei hogyan viszonyulnak az A TP terminális

o

o

ll

o

ll

o

ll

O- ~ - O - ~ - 0 - ~- 0- CH 2

o·

o·

o

" Mg2~ / f(ATP)

OH

adenozinditoszfát

OH

NH 2

l

N~~~,

l

HC~N/ o

o

ll

ll

o - ~ - o- ~ -

o

l

'\;CH

C"'- /

N

o

o- cH2

o

"

/ Mg2-

2·2. táblázat. Az anyagcserében jelentős néhány foszfátvegyület foszfátcso·· portjai hidrolízisének ilG0 '-értékei

(ADP)

OH

OH

--~~~~~--~~~--~~--~A

Foszfátvegyület foszfoenol-piruvát karbamil-foszfát 1,3"-biszfoszfoglicerát kreatin-foszfát 3'5'-cAMP ATP(~ ADP(~

ADP)

AMP) pirofoszfát AMP glukóz-1-foszfát glukóz-6-foszfát fruktóz-6-foszfát

l

adenozinmanafoszfát

t.G 0' (kJ/mol) -61 ,9 -51,4 -49,3 - 13,4* -43,7 -49,7 -30,5 -27,6 -27,6 - 14,2 -20,9 -13,8 -15,9

NH2

l

C

N

N~"~ ~

ll

j

'\;CH

HC~N/ C"'-/ N

o

o

ll

1

o-~ -

Mg2 •-

0 - CH2

o

(AMP)

* A C3-foszfát-csoport hidrolízisének t.G0·-értéke

2-4. ábra. ATP, ADP, AMP

OH

OH

59

60

»>»»>>m»»•m»»>»»>>>>>mm» »>m>>»>»>m>""m»m »» »>>>»m >m»>>>>>m >>>>»>»>>>>»>»>»>>>>»>» >>>>>»>»

A NYA G CSE R E

>>>»>mmm»»>»»>>>>>»>>»>

zött enzimek hatására defoszforilálódnak, illetve bomlanak le. Az ADP/ATP ciklus központi j el entőségű . Az A TP intracellu láris koncentrá ciója 2- l O mmol/1. Nyugalom ban egy 70 kg-os férfi 24 óra alatt kb. 145 kg ATP-t " fogyaszt" , azaz alak ít át ADP-vé és Pi-vé. Ezt a szervezet úgy valósítja meg, hogy kb. 51 g A TP áll rendelkez ésére. Az A TP-készl et így "nyugalo mban" mintegy 30 s-ra elég; a szükséglet kb. O, l kg/perc. Eszerint a számítás szerint naponta mintegy 3000-szer kell az ADP-mo lekulának újra fo zforilálódnia. Aktív izommun ka esetén azonban az A TP-"fogy asztás" pi llanatok alatt 0,5 kg/perc-re emelkedh et. Az A TP fo lyamatosa n felhaszná lódik és újraterme lődik Az ADP/ATP arány meghatár ozza a sejt energiaállapotát, az egész metabo lizmus sebesség ét és irányát. Az adeni lát rendszer kieme lkedő fonto ságú a fosz-

0 foszfátja hidrolízisének óG . értékéhez, ez alatti és feletti részre osztható. A2 ATP, ADP, pirofoszfát alatt található észterfos zfátok ún. "alacsony energiájú" foszfátve gyü letek. Az ATP felett találhatók az ún. " magas energiájú", azaz nagy csoportátviteli potcnciálú, makroerg foszfátok . Ezen vegyü letek esetében hidrolíziskor foszforsavanhidrid - (ATP, ADP), foszforsa v-karbonsav vegyes anhidridCl ,3-biszfos zfoglicerá t C- l foszfátja), enolfoszfátészter- (foszfoenolpiruvát) (2-5. ábra), savamid(kreatin- foszfát) kötés bő l kerül a foszforilcsopo rt a vízre. A magas csoportátv iteli potenciálra utaló kötést a koncepei ét kialakító Lipmann javaslatára "-"-jellel jelöl ik. A foszfátcs epott átviteli potenciálját foszfor ilációs potenciá lnak is nevezik. Az ATP és a többi nukleozid-trifoszfát viszonylag stabil molekula. Fiz iológiai körülmén yek kö-

®

o,;

o

~o H C-C

~/

c

~

3

l

S- CoA

HCOH

l

H2c- o - ® 1,3-biszfoszfoglicerát (foszforsav-karbonsav vegyes anhidrid)

piH

acetii...CoA (tioészter)

foszfoenolpiruvát (enolfoszfát-észter)

piH

hidrolizis

hidrolízis

pl

pl

o~

- / O

3-foszfogl icerát

~o

C-C - OH

ll

CH2

piruvát (en ol)

H 3

c -c

"

o-

acetát

e/lett az acetil-GoA hidro2-5. ábra. Mag as csoportátvite li potenc iál ú vegyület ek hidrolízise . A foszfátvegyületek hidrolízisem be mutatja ábra 2-4. íziséta ADPhidrol ATP, Az lízise a magas energiájú lioészterkötés hidrolízisére példa.

))))))))))))))))>>>»>))»»»» ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))»)))))»>)))))))))))))))))))}))>>))})))))))))))))))))))))

BIOENERGETIKA

forilcsopmt-transzferben. A rendszer kapacitását az ener gia töltéssel (energy charge) is jellemzik. energiatöltés =

l

61

potenciálja magasabb, m int az ATP-é, az esetek egy részében képesek közvetlenül az ADP-nek átadni foszfori lcsoportjaikat Ilyen reakció a citoszolban zajló g li kolízis során az 1,3-biszfoszfog licerát ~ 3-foszfoglicerát, illetve a faszfoenol-piruvát ~ p iruvát reakció, amelyekhez kapcsoltan ADP foszfori lá lódik ATP-vé. (A reakció mechan izmusát részletesen tárgyalj uk a 106. oldalon.) Ezt szubsztrátszintű foszforilá ciónak nevezzük (2-6. ábra). Az ATP mint foszfátdonor képes átadni a terminális foszfátcsoportot Ilyen típusú reakciók során "a lacsony energiájú" foszfátvegyü letek keletkeznek. K lasszikus példája e kapcsolt reakcióknak a g lukóz foszfori lációja, amely a glikoliz is első lépése (lásd 2.2. fejezet):

2 [ATP]+ [ADP]

2 [ATP] + [ADP] + [AMP J

A nevező a teljes adenilátkészlet (pool) ([ATP]+ [ADP]+ [AMPJ), a számláló a magas csoportátviteli potenciálú savanh idridkötések száma a poolban: l molekula A TP-ben 2, egy molekula ADP-ben l. Az energiatöltés értéke így l -O között ingadozhat; ha minden actenilát ATP lenne, akkor l , ha minden AMP, akkor O. Aerob körülmények között legnagyobb mennyiségben ADP a m itokondri umban, a tenninális oxidációhoz kapcsoltan az oxidatív foszforiJáció során foszforilálódik A TP-vé. Azok a vegyületek azonban, amelyeknek a foszfori lcsoport-átviteli

glukóz + Pi ~ glukóz-6-foszfát + H 20 o· t.G = + 13,8 kJ/mol.

2-6. ábra. Szubsztrátszintű foszforiláció a foszfoenolpiruvát --; piruvát átalakulás során. Foszfátcsoport-átvitel a glukóz --; glukóz-6-foszfát átalakulásban szmtű"

foszfoenolpiliuvá,t

foszforiláció

ADP

\ ÁT~"

ADP

0 T"P)

CH2 -0-~21)

CHPH

..1----0

A----

H

H

OH

a-D-glukóz-6-P

O

OH

a -o-glukóz

62

))))))))))l)))))))))))))))) ))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))>)))))))))))))))))))}))))) ))))))))))))))))))))))))))>))))))}))))))))))))))))))))

Ez a reakció endergonikus, tehát spontán nem mehet végbe, azonban hozzákapcsolható egymásik exergonikus reakció: ATP + H20 -7 ADP + Pi 6G 0. = - 30,5 kJ/mol. A két reakció a sejtekben a hexokináz enzim segitségével kapcsolódik (2-6. ábra): glukóz + ATP -7 glukóz-6-foszfát + ADP 6 G0' = - 16,7 kJ/mol. Több lépé es reakció, illetve részreakciók esetén az egyes reakciók óG0 ·-értékei additívak; az eredő .1G 0. a részreakciók óG0 ·-értékcinck matematikai összege.

A kapcsolt reakció végbemegy, sőt eléggé exergonikus folyamat ahhoz, hogy a sejtben gyakorlatilag irreverzibilis legyen. Az ilyen típusú reakciók funkciója különböző. Számos reakciósorozatban azonban a foszforilációs reakció rendszerint az első, elkötelező, "aktiváló" lépés, akár kataboiileus út esetében is. Erre több példát kínálnak az intermed ier anyagcserét tárgyaló fejezetek (zsírsav-ox_idáció, ureaciklus, glikolizis stb. reakciói), az energia-"átadás" akár két makroerg foszfáttranszfert is jelenthet; [pl. ATP-ből AMP és pirofoszfát (PPi) keletkezik a zsírsavak aktiválása során]. Ilyenkor a szubsztrát nem foszforilálódik, hanem acil-AMP-vé alakul át, "aktiválódik". A PPi a pirofoszfatáz enzim hatására két Pi-re hasad; e hidrolízis során felszabaduló energia teszi összességében exergonikussá a folyamatot (lásd még a 2.3. fejezetben). Bioszintetikus reakciók so-

ANYAGCSERE

rán gyakran a foszforiláció a bevezető lépés, illetve szerepelhet a bioszintézis további reakcióiban is. Nukleinsavszintézis során a prekurzor nukleozidtrifoszfátok szintén PPi-t vesztenek és így épülnek be az RNS-, illetve DNS-láncba. Az A TP nemcsak bioszintetikus reakciókban energiadonor. A transzportfolyamatok egy része igen jelentős energiafogyasztók. Például az emberi vesében, illetve agyban az energiafelhasználás mintegy fele, esetenként kétharmada a 1 Na ~ /K -ATPáz müködését fedezi amely aK+ és a Na+ koncentrációgrádiens ellenében történő transzportját teszi lehetövé. Az ATP kötődése egy febérj éhez, majd hidrolízise ADP-re, illetve Pi-ra és az ezt követő fehérjekonformáció-változás az alapja a kontraktilitásnak, a mechanikai mozgásnak is (lásd a 6.2. fej ezetet). Az ATP-nek nincs energiaraktározó funkciója. Ezt a szerepet elsősorban az izomszövetben és az agyban a kreatin-foszfát (2-2. táblázat) tölti be. A kreatin ATP terhére kreatin-foszfáttá foszforilálódik (2-7. ábra). Kreatin-foszfát formájában tárolt energia közvetlenül mobilizálható (2-8. ábra). Az ADP/ATP ugyan a legfontosabb foszforildonor, illetve -akceptor, de nem az egyetlen. Más nukleozid-trifoszfátok is szerepeinek foszforil-, illetve végső soron energiadonorként a különböző kapcsolt reakciókban: pl. a glukoneogenezi.sben, a fehérjeszintézisben GTP, a szénbidrátszintézisben általában UTP, lipidszintézisben CTP. Ezekben a reakciókban keletkező GDP, UDP és CDP foszforilációja azonban ATP terhére történik (2-9. ábra).

2-7. ábra. A kreatin foszforilácíója

o ll

H

0-P - N

l

O

l

C=NH;

l H C -N 3 l

\./. kreatin-kináz

CH 2

l cookreatin-foszfát

ADP t.G0'

ATP

=-

12,6 kJ/mol

kreatin

BIOENERGETIKA

)))))))) , , )))))) )))))))))))))) )))))) )))) )))))))) )))))) )))))) ) ) ))))))>))))))))))) )) )))))))) )))))))))))))))))))>)))))) )))))) )))) )))) >))))) )))) )))) )))))) )))))))>)))) )))))\

63

2-8. ábra. A kreatin-foszfátenergiaraktár szerepe

kreatin-foszfát

ADP

kontraktilitás bioszintézis aktív transzport

kreatin

energiafelhasználás

2-3. táblázat. Néhány fontos vegyület által alkotott redoxíelektródok standard redoxipotenciálja

nukleoziddlfoszfátkináz ATP

GDP E0' (V) -0,67 -0,38 -0,32 - 0,29 -0,23 -0,21 -0, 19 - 0,17 +0,03 +0,08 +0,22 +0,29 +0,3 +0,82

szukcinátla-ketoglutarát a -ketoglutarátlizocitrát NAD./NADH +H+

CDP ~-----+ CTP

ADP

2-9. ábra. A GDP, UDP, COP foszforilációja

Lipoátldihidro-lipoát glutation-diszulfid/ glutation FAO/ FADH2 Piruvátfiaktát Oxálacetátlmalát Fumarátlszukcinát citokrómb Fe3./Fe2• citokrómc, Fe3./Fe 2 • citokróma Fe3./Fe2• 0 2/H20 2 1/2 0 2/H20

Elektrontranszfer -oxidoredukció El sőso rban

a katabolikus folyamatok, de a bioszintetikus, anabolikus reakciók jelentős része is oxidoredukció - elektrontranszfer. A sejtbe n mint vizes oldatban a különböző redoxfolyamatokban részt vevő molekulák redoxrendszert - elektrondonor/elektronakceptor konjugá lt párt képeznek (2-3. táblázat).

AL elektronátadás irúnya egyik redoxrends:c::crböl a músikba, a; elektronvesztés, illetve -felvétel tendenciúja a silindard redoxipotenciállal (E,,·) jcllcmeLhctö. A standard redoxipotenciált redukciós potenciálnak is nevezik, ami a rends7er e lektronfelvétel iránti készségét jellemzi. Ily módon a standard redoxpotenciál funkciója redoxreakciókban megfeld a c oportátvitdi potenciál funkciój ~ma k . öGtl

=

nFö1:0 .

(n: aL átvitt elektronok száma; F: a Faraday-konstans)

»>>>>>~>)HJ)

)))))))))))))>))))))))))))))>)>)>>>>>>»>>>>>>>>>>>>n

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))H))))

>>>>>>>>>> >>>>»>>>>>>>>»» >>>>»>>>>>>>>>>>>>>)))))))

64

A"'IYAC C ERE

2-1 O. ábra. A piruvát H laktát átalakulás

CH3

l

H -C- OH

l coo-

piruvát

plruváfllaktát e~ = ~o. 19

w

laktát

NAD /NADH+H~ E~

NADH -r H

= - 0,32 V

NAD

Az aktuális redoxpo tenc iál egy ox idoredu kc iós reakció ban a7onba n a ernst-eg yenlet s7crint a résztvevő anyago k kancentrác ióinak hányad osától fúggő érték. amely az oldat pl l-jától is nigg. A7 E0 ·-értékc k arra az esetre vonatko 7nak, am ikor a mércnd ö rcdoxrc nds; cr oldatáb an a pH 7,0, az oxidált/red ukált kompon ensek konccn trációjá nak aránya l és a vonatkoztatási alap a standar d ll-elekt ród .

[ox] , RT E= E" + - 1og- [red J nF Így például a piruvát laktát és a NAD ' ADH+ l l' redoxre nd zer (1-/0. ábra) redoxpo tenciálj a e nnek mcgfelelöcn a reakció aktuáli G értéke is a p iru' át- és a laktát-, 1 illetve a AD - és NADII- konccn tráció arányán ak fliggvénye. öG = nFöE

Az elektro ntrans zferre l j áró reakciókban az e lektron ok először speciá lis átvivő molek:ulára kerü lnek. A legfon tosabb el ektron átvi vő mo lekulá k a NAD ... , FAD, NADP+, g lutatio n, aszkor binsav . A 2-10. ábrán látható, hogy a piruvá t ~ laktát átalak ulás esetén az el ektron átvi vő a NAD ·. Az átvi vő molek ulák reduká ltsági fo ka megha tározó jel entőégű, detenn inálja a sejt metab olizmu sát. Az ATP/A D P arány mellett a NAD;./NAD H + H ' arány jellem zi a sejt interm edier metabo lizmus ának állapo tát, illetve megsz abja annak irányát. Emelle tt azonb an más-m ás aspekt usokb ól rendkí vü l fonto a többi nukleo zid-tri foszfá t/nukle oziddifosz fát, illetve oxidáltiredu kált el ektronátv i vő arány is. K ülönbs ég a két csoportátvi teli rendsz er között , hogy valam ennyi foszfo rilá lási reakci ó enzim atikus , azonban a sejtben folyó oxidoredukc iók egy ré ze nem enzim atikus folyam at. A

nukleo zid tri-, illetve difosz fátok így enzim ek zubszt rátjaké nt (kocnz imkén t) funkci onálna k. A redoxf olyam atokba n ré zt vevő el ektronátvivő mole- ku lák egy kisebb része (glutation, aszkor binsav ) viszon t nemcs ak koenz im, hanem spontá n, nem enzim atikus reakci ó résztvevője is lehet.

A legfontosabb redoxciklusa

elektronátvivők

A tápany agok lebont ásában a nikoti nsava midadenin-dinukJeotid (NAD) megha tározó elektronak ceptor . A NAD+ két nukleo tidot tartalm az, amely ek foszfá tcsopo rtja ikon keresz tü l savanh idridköt éssel kapcso lódnak egymá ssal (2-ll a ábra). A nikoti nsavam idban találha tó piridingyűrű miatt a NAD+-ot (és a NADP ' -t) piridin nuk leotido knak is nevezt ék. A tápa nyagle bontá különböző enzimatiku reakciói során lépé enkén t a különböző molekulák 2 hidrog énatom ot adnak le. Ebből a NAD +- nikot insavamid-gyű rűje két elektro n t é egy proton t (H-, hidridion) vesz át az oxidál ódó szubsztrátt ól, míg a szubsz trát más ik H-je H+ formájában az oldatb an jelenik meg (2- ll b ábra) . A dehidrogená lás általáb an a 2-12. ábra szerin ti módon történi k. (Erre példa a 2-1 O. ábrán szemté ltetett laktát ~pi ruvát reakció is.) A NAD ' me ll ett fontos elektro n- (hidro gén-) akceptor a fla vin-m ononu kleoti d (FMN ) és a flavin-aden in-diouk.leo tid (FAD) (2- 13. ábra). A F AD izoallo xazint, ribitolt, foszfátot és AM P-t tartalmaz , az FMN izoallo xazint , ribitol t és foszfá tot. Szemb en a nikoti nsavam id-gyü rüvel, az izoallo-

BI OE~ERGETI KA

)) )) )) U >> >H>>>>>)) )) H>>>> n )) >) >>))>U) >H> >> >H))H))) >>})>)>U>>>)))))> »)))))))))))))) ))))))))>)))))))

2-11 . ábra. A NAD(P)+ szerkezete . NAD+ esetében R = H. (a) A NADP• esetében az R helyén foszforilcsoport található, (h) a NAD nikotinamidgyűrűjének hidridion-fe/vétele és -leadása

o

)))))))))) )) )))) ) )

>>))>>)))))))))) )) H)) >>)))))))))))))))) ))

l

~ o~ l

o

~ C-NH

2

~+ N -

o

ll

·o - P-

65

0 - CHz

OH

OH

OH

OR

o

lb

H

6

~-NH2 +

H'+ 2e-~

N+

o-C-N~ N

l

l

2-12. ábra. A NAD•-koen zimmel müködö dehidrogen ázok által katalizált reakció átalános sémája

~

H

H

Rl

Rl

NAD"

NADH

H

l

NAD + R - C - R' ~ l~ OH

1

·.f:H + H + R- C - R'

ll

o

~--------------------~~L

66

>~ ~> » ,.>•,>>> H))>)>• >>H ~• >>nn •••• •>>>»>>>>»>• >>>»>,,>> >> »>>>>>>>>>> » •• >> >>>>>> »>> >>->>»>>»>>,>>>n»»>>>>>>>>»»>> n>>>>>>>>>>>>>>>>>~>>»>>>>>>» >>n>>>>>>>>>>.,

.\:\ VAGCSERE

2-13. ábra. A FAO szerkezete

OH

xazin -gyíírű

OH

egy vagy két hidrogénatomot képes felvenni, illetve lcadni . A felvétel és leadás két lépé!)ben is történhet; ez megteremti az l elektrontrans7 fcr l ehetőségé L l hidrogénatom felvétele csetén az izoalloxaz in gyfu·ű szcm ikinon formája alaku l ki (2- 14. ábra). A flavinesoportokka l műkö­ dö en;;imek esetében a dehidrogenálás a 2- 15 ábrim ábrázolt reakciótípus szerint megy végbe. At oxidáció leggyakrabban katabolikus, a redukció anabolikus l'olyamat. A bioszintet ikus, reduktÍ\ folyamatok (redukciós szinté7isek) esetében " reduká ló e rőre" , e lektrondonor koenzimre van szükség. A nikotinsavamid-ad enin-dinuk leotidfo~Lfá t NA DP redukált formája több redukciót kataliLátó enz im koenzime (2-ll a ábra). A N ADP! l a NA Dll -hoz ha o nlóan hidridion formájában adja Ic és veszi fel az elektronokat.

A NADII, NADPH, FADH 2 stabit molekulák. Fiziológiai körűlmények között elektronjaikat csak enzimek által katalizált reakciókban adják le, 1 illetve veszik fel. A NAD , illetveNADP ezekben a reakciókban koenzim (az enzimhez lazán, nem kova lensen kötődnek), a FAD, FMN prosztetikus csopot1ok (kovalens köté sci kapcso lódnak az enzimhez). A NAD ox idált és redukált formában összesen kb. l o·" M koncentrációban van jelen a szövetekben. A NAD INADH arány a sejtben nagyobb egynél. A NADP és a NADPH összmenyny isége egy nagyságrenddel kisebb, mint a NAD és NADH összmcnnyisége. A NADP /NADPH arány, szemben az elözövel, a NADPH irányába van eltolva. A sejtben így fiziológiai körülmények közölt elsőso rban NAD és NADPil van nagyobb mennyi-

BIOE ERGETIKA

3~ cu l '-': :

CH~ 3

NH

N: (O: N

l

"'N~o

FMNH szemildnon

CH2

l

HCOH

1~~

l

HCOH

l

HCOH

CV'(~0NH

l CH2

l

o

FMNH~

C~NJlN~O

l

0 - P= O

l o-

(redukált)

l

3

H

R

FMN (oxidált)

2-14. ábra. Az FMN redukciója

nzim - FAD + R

H H l l

- c- c

l l H H

H

- R'

F

nzim -

+

FADH2

l

R

C= C-- R'

l H

2-15. ábra. A FAO prosztetikus csoporttal müködö dehidrogenázok által katalizált reakció á ltalá nos semája

SH l CH 2

H l / CH / N " cH 2 C-N "- c l ll ~ H 0

ll

l

o

2

coo

CH 2

l l

H-C - NH 2-16. ábra. A glutation (GSH) szerkezete. OxidáciÓJa során két molekula glutation diszulfidkötéssel kapcsolódik egymáshoz (GSSG), s ezze/ párhuzamosan egy másik anyag (A) redukálódik

l

coo· 2 GSH

3

GSH

+A~ GS-SG

+ AH 2

68

)))))) )) )))))) )))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))) )) )))))))))) )) )))))) )))))))))) >))))) )))) )))))))) )) ) ) )H))))))))))))))))) H)))>)))))))))))) H)))) ) )))))))))))))))))))))

O=y - - -.. . ,. C- OH

ll

C- OH

C=O l

l

H- tl -----l

HO - C - H

o

y=O l

H- C -------'·

l

HO -C-H

l

l

CH20 H aszkorbinsav

2-17. ábra. A C-vitamin (aszkorbinsav) oxidoredukciója

O=y-----.~

o

AN\' AGCSERE

CHpH de hidraaszkorbinsav

ségben jelen és ez összefügg a két elektronátvivő koenzim eltérő funkciójávaL Egyes oxidoredukciós fo lyamatok igen fontos elektronátvivő rendszere a glutation. A glutation g licint, ciszteint és glutaminsavat tartalmazó tripeptid (2-16. ábra). Redoxciklusa több sejttípus - például vörösvértest, hepatocita - müködésében rendkívül fontos; kapcsolatban lehet egy másik, szintén igen jel entős el ektronátv ivő rendszerrel, a C-vitaminnal (aszkorbinsavval) (2-17. ábra). A sejt redox homeostasisával, ezen belül a glutation szerepével a 2.7. fejezetben foglalkozunk.

-CH2 0H

hídroximetil (alkohol)

+ form il (aldehid)

+o

-c~

"

karboxíl {karbonsav)

OH

A biológiai oxidáció A bio lógiai ox idáció két alapvető folyamata a szerves vegyületekben levő szén oxidációja és az oxigénmolekula redukciój a. Az oxidáció során elsősorban az egyes szénatomokra számított oxidáltsági fok változik. A legredukáltabb (-CH3) és a legoxidáltabb állapot (C02) között több fokozat van (2-18. ábra). Az oxidáció az esetek többségében dehidrogenálást jelent; az elektronvesztés hidrogénvesztés útján valósul meg. Az ox igénmolekula redukciója, amely 4 e lektron felvételét jelenti, rendszerint a c itokróm-oxidáz e nz im által katalizált folyamatban történik. A tökéletlen redukc ió súl yos veszélyekkel. patológiai következményekkel, oxigé ntarta lmú szabad gyökök keletkezésével járhat (lásd 2.6. fejezetet).

Elektronátvitel a sejtben enzimatikus és nem enzimatikus úton történhet. Energiatranszformáció

+

co2

széndioxíd

2-18. ábra. A szerves vegyületekben

levő

szén oxidációja

szempontjából az enzimatikus úton történő elektronátvitelnek van jel entősége. A molekulák közötti elektrontranszfer az intermedier anyagcserében az alábbi médokon jön létre: O Direkt módon elektronok kerülhetnek át egyik

molekuláról a másikra. Ez főként olyan molekulák között történik, amelyek fémionokat tartalmaznak. Vas- és réztartalmú fehé1jék között valósul meg például ilyen típusú elektrontransz-

BI OE~ E R GF.T I KA

>))))))) >> >H•n>>U

•)))

>> >• >> >)), >>>»>>> >H)))))))))) )))»>>)))>) )))))))))))»>U)>))) >H>>»>>)))) )))>>>>))))>>

fer, amelyre a mitokondriáli s légzés i lánc egyes reakció i tipikus példák . 6 Az elektro ntranszfer hidrog énátvitellel is történhet. Az egyik moleku la ebben az esetbe n hidrogéndonorként, a másik hidrog énakce ptorként viselkedik. (Az ilyen típusú transz fer minden esetbe n két elektro n felvéte lét, illetve leadását jelenti .) €) A hidridion (H-) formá ban való elektro nátvite l esetén két elektron és egy proton kerül át egyik molekuláról a má ikra. Erre példa a már tárgyalt NAD , illetve NA OP ~ koenz imekkel mű ködő elektro ntranszfer.

Elektrontranszfert katalizá/ó enzim ekoxidoreduktázok

Az oxidoredukc iós folyamatokat katali7áló enzimek négy csoportba orolha tók: oxidázok, dehidrogenázok, hidroperox idázok, oxigenázok.

Oxidázok. Az oxidázok által katalizált reakci óban az oxigén a hidrog énakc eptor. Két alcsoportot különböztetü nk meg. O víz keletkezésével járó, oxidác iót katalizáló

oxidázok Cu-iont tartalm aznak (2-19a ábra). Jellem ző képvise l őj ük a tenn ináli oxidác ióban a citokró m-oxidáz. 6 A másod ik alc oportba tartozó oxidáz ok FAD-, illetve FMN-tartal mú fehérjék, fl avopro teinek . A reakció végterméke hidrogén-perox id (2- J9b ábra). Számos esetbe n a tlavoproteine k fémet i talialmaznak (mctallofl avopro tein). Erre példa a nukleotid-anyagcse rében részt vevő ma libdéntartalmú xantin-oxidáz . Ezekben az esctekben a fém i részt vesz az elektro ntrans zferbe n.

.___ _.

h i drogén átvivő

H

>>)) )))))) ))>>» >> >) >> >> >> >)))

69

l/2 o

A b

2-19. ábra. Az oxidázo k által katalizá lt oxidore dukció k általános sémája

Oehid rogen ázok. A dehidrogenázok olyan ox idoredukcióka t katal izálnak , ahol oxigén nem vesz részt a reakci óban (2-20. ábra). Számo s enzim tartozik ebbe a csoportba (példá ul a citrátkör debidrog enázai ); dehidrogenázok katalizálnak redukció s bioszintetiku s folyamatokat is. A dehidn rogená zok többsége által katalizált folyamatokba 1 az e l ektron á tvi vő molekula a NAO+, NADP • a FAD és az FMN. A FAO és FMN rendszerint a nikotinsavamid koenz imeknél sokka l szerosabban kö tődik az apocn zimhez. A fl avopro teinek e etében a FAO, illetve az FMN prosztetikus csopor tként müköd ik, szemben a piridinnukleo tid koenz imekke l, amelyek könny en disszo ciálnak az enzimrő l, illetve juttatnak el elektro nokat egy másik enzimhez. A flavop rotein-dehidrogenázok többsége az elektro n-transzportlánc(ok)hoz kapcso lódi k vagy azok része.

Bl

AH

A

a

)) ))))))))))))»> H)>>>>

B

2 -20. ábra. A dehidro genázo k által katalizá lt reakció k általán os sémája

70

)))HH))~ >) )))) )) )) )))) >>H >n>))>)))))))))>»>))))>>>) ))))>)))))>))))))))))))))))))) ))>>))))))

Hidroperoxid ázok. A hidraperoxidá zok szubztrátja i elektrondono rok (pl. g lutation, aszkorbinsav); a reakcióban az elektronakcep torok a hidrogén-peroxid vagy organikus peroxidok. Ezekkel a reakciókkal részletcsen 2.6. fejezetben foglalkozunk. Oxigenázok. Az oxigenázok á ltal katalizált reakciókban az oxigén beépül a szubsztrátba . Az oxigén beépülése szerint két alcsoportra oszthatók: O A dioxigenázok olyan reakciókat katalizálnak, amelyekben az 0 2-molekula mindkét oxigénatomja beépül a szubsztrátba. Ilyen típusú enz im például az amino av-anyagc erében a triptofán-diox igenáz. 6 A monooxigená zokat kevert funkciójú oxigená7okna k i nevezik, mert c ak az egyik oxigén épül be a szubsztrátba. a másik oxigén vízzé redukálódik (2-21. áhra). A monooxigenázok müködéséhez elektrondono r szükséges, amely a NADPH vagy a NADH lehet. A monoox igenázokhoz az e lektronok speciál is elektrontransz portlánc útján jutnak el; e fehérjék egy több komponensü, membránhoz kötött enzimrendsze r részei. Ilyen rendszerhez tartoznak például a májban az endoplazmás retikuium membránjáho z kötött drogmetaboli zmus, vagy a mellékve ekércg, a here, az ovarium mitokondriális belső membránjába n a szteroidszintézis oxidoreduktáz ai.

))>>>>>H> H)))) U >> >) )))))))) )) >>)))U> >) )))))))))))) )) )) )))))))) ))>) )'))) )) )) ))

A \ AGCSERE

Terminális oxidáció oxidatív foszforilác ió A terminális oxidáció - oxidatív foszforiláció helye a mitokondrium belső membránja. A katabolizmus konvergens, az anabolizmus divergens folyamatrend zer. A katabolizmus konvergenciá ja eredményeké ppen a különbözö tápanyagokba n található hidrogén redox reakciók sorozata után NAD+-ra, illetve F AD-ra kerül (lásd 2-l. ábra). A NAD~ részben a citoszolban, de főként a mitokondriumban , a F AD a mitokondrium ban redukálódik. A katabolizmu végső, "terminál i "lépése a terminális oxidáció, amikor a ko faktorokhoz kötött hidrogén a mitokondrium ban vízzé oxidálódik. A terminális oxidáció exergonikus folyamat; a hidrogén oxidálódik, illetve 0 2 redukálódik vízzé:

a l/2 O:lH:!O redoxelektród ; E".= +0,82 V. Az oxigén redukciójának fő hidrog~nforrása a NADH+H /NAD redoxelektród ; Eu = -0,32 V. A potenciálkülö nbség L\ Eu. = l , 14 V, az ennek megfeletö L\G0 ·-érték =-220 kJ/mol. Ehhez kapcsoltan történik az oxidatív foszforiláció, amelynek során ADP foszforilálódi k ATP-vé endergonikus folyamatban. A terminális oxidáció - oxidatív foszforiláció térben és időben összerendezet t, kapcsolt folyamatrends zer. Ö szehangolt működé e nemcsak az ebben részt vevő enzimek, hanem egy egész sejtorganellum , a mitokondriu m strukturáli s épségéhez kötött.

AH

A mitokondriu mok szerkezete A mitokondrium ok átlagosan 2 J.lm hosszú, 0,5 J.lm átmérőjű sejtorganellum ok. Feltételezhetően a mitokondrium ok, mint eukariota ejtorganellum ok az evolúció során prokariotákbó l származnak: aerob bakt~riumok és primitív anaerob eukariota sejtek szimbiózisábó l jöhetett létre a jelen állapot.

AO H

B

2-21. ábra. A manaoxigenáz ok által katalizárt renkciók általános sémája

S/.ámuk sp~c iesenk é nt és sejuípusok S7erint változó. Eukariota hepatociták például sejtenként 800-2500 mnokondriumot tartalmaLnak. A nagyon aerob s7Í\ izomszövet sejtjei c itoplazma-térfog atának kb. a felét mitokondriumok képezik. Az ére tt vörösvértestekbe n nincsenek

71

BIOE El{GET lk.A

membrán közti .tér ..

- riboszómák - piruvát-dehidrogenáz komplex -citrátkör enzimei - zsírsavoxidáció enzimei - aminosavoxidáció enzimei - egyéb enzimek

- F0 F 1 ATP-szintázok - légzési lánc komplexei - membrántranszporterek

2-22. ábra. A mitokondriu m felépítése

mitokondriumol-. igy nem képesek oxidatív l(lszfori l:ició útján ATP-t termelni .

A mitokondri umokat két membrán határolja (2-22. ábra). A külsö membrán kb. 50%-ban lipidekböl, 50%-ban fehérjékből áll, viszonylag egyszerűbb szerkezetű . A bel ö membrán szerkczete igen bonyolult, kb. 75%-ban fehérjéket tartalmaz. A külsö membrán permeábili s az intermedie r anyagcsere több intermedie rje számára, mivel egy porin nevű fehérje viszonylag nagy átméröjü csatornákat formál a membráno n keresztül. A belső membrán ugyanakko r szinte valamenny i ionra nézve impermeábilis. A bel ö mcmbránba n heLyezkedik cl a légzési lánc elektronátvivő rendszere és az ATP- zintáz. Máj mitokondri umokban például több mint l O OOO légzési lánc és ATPszintáz található egyetlen ejtorganell umban. A

membrán által határolt mitokondri ális mátrixban található számo alapvető enzimrend szer (pl. a citrátkör, zsírsav-oxi dáció enz imei). A bel ö membrán transz porter rendszerei biztosítják a kapcsolatot a citoszol é a mátrix között. Az anion-kicserélődési transzporte reket a 2-23. ábra foglalja össze. A N ADH-ról, iJietve aFADHr röl az e lektronok, illetve a proton(ok) a belső membránba n elhe lyezkedő légzési lánc komponens ein, oxidoreduk ciók sorozatán keresztül jutnak cl az 0 2-re, és ily módon H?O keletkezik. A lánc meghatároz ott komponensei oxidoreduk ciókhoz, tehát e lektrontran szferhez kapcsoltan protonokat pumpálnak ki a mitokondriáli mátrixból a membráno k közti térbe. A protonok kipumpálás a elektrokém iai grádiens kialakulásához vezet. Proton rnotoros erő generálódik , amely két komponens böl tevődik össze: a mcmb-

bel ső

72

)) )) )) )) )) )) )) )))) )) U)) )))))) H))))))))))) ) ))l>U))

monok arboxil át- piruvát transzporter

))))))H))))) ))))))))\)))) ))))))))))))) )))))))))))))

----T-J OH

+--L-+-IIII

l ..

l

11 .,1.1,__..-;-----;.~. . . ma lá t

dikarbo xiláttranszp orter

foszfát

trikarbo xiláttranszp orter

ma lát

l

l

! foszfáttranszp orter

adenin nukleotid transzp orter

Asp- G lu transzp orter

maláta.-keto glutará t transzp orter

l

))))))))))))) )))))))

~' AGC

F..RF..

ránpot enciá lból és abból, hogy a pH-kü lönbsé g következtében konce ntráció s elem alakul ki. A protonok a mitoko ndrium bel ö memb ránj án protoncsa tornát tartalm azó ATP-szi ntázon keresztül kerülh etnek vissza a mátrix ba (2-24. ábra). Csökken az iongrádiens, a töltés és koncentráció különbség és ehhez az exergonikus folyamathoz kapcso ltan ADP foszfo rilálód ik ATP-vé. A belső memb rán két o ldala között kia lakuló protongrádie ns összek apcsoUa az oxidác iót és a foszforiláció t, a kapcso lás alapfe ltétele a mitoko ndrium szerke zeténe k ép ége.

ll "

l

))))))))))))) ))))))))))))) ))))))))))))) )))))))))))))

ci trát

A mitokondriális légzési lánc alkot ói

fos z fát OH

A mitok ondriá lis légzés i lánc a mitoko ndriumok belső memb ránjában helyez kedik el. Komp onensei redox folyam atokra képes prosztetikus csoportokat tartalm azó fehérjé k, ame lyek négy komplexet alkotnak (2-25. ábra). A folyam atrend szerben az e lektrondonor a NADH + 1-r, illetve a F ADH2 ; így a láncba egyszerre két elektro n lép be. A biológ iai oxidác ió egység ének ezt a reduká ló ekvivalens párt tekinti k . Az elektro na kcepto r a rendszerben az oxigén molek ula 0 2, ame lynek redukálásához 4 elektro n átvitele szüksé ges:

ADP

ATp G lu

Asp malát ~ ~ a.-ketoglutará t

2-23. ábra. A mitokon d ri um belső membrá nj á nak néhá ny bioene rgetikai szem pont ból fontos tra nszport rendsze re

2-24. ábra. Proton - és elektrontran szport a mitoko ndrium bcl~ö mcmbrá nján belső

memb rán mátrix

BIOE:'IIERG ETIKA

)) )) U))))))))>))) •H> ))}) >>n))}))))) )H))))})))))))}))))))l))))))))))))>))))))))))))))))))))))))))))))))))~>)))))))))))))))))))))))) )l)))))))))) H)) )ll)))))))))))))) J>

2-25. ábra. A légzési lánc alkotói és gátlószerei. Rövidítések a szövegben találhatók. A pirossal satírozott részek a légzési lánc komplexei. A gátiászerek szürkével satírozoltak

73

zsiracii-CoA

~ NADH

acil-CoA-dehidrogenáz FAO

!

FAO

NADH- UQ-oxidoreduktáz FMN , FeS l.

FAO, FeS

rotenon amitál

ua

antimicin A 1

t t

gIice ri n-3-foszfát

citokróm-oxidoreduktáz J FeS, cit b, cit c 1 lll. -

~

t glicerin-3-foszfátdehidrogenáz FAO, FeS

cit c

~ dáz citokróm-ox~· cit a, cit a3 , Cu

IV.

t A NADH mint a dehidrogenázokkal reverzibilisen asszociálódó vízoldékony elektronátv i vő, a kü l önböző oxidoredukciók során nyert elektronokat a légzési lánc első komplexéhez száll ítja. A ADPH az anabolikus folyamato k e lektronigényét biztosítja. A ké t koenzim közti kapc olatot a bclsö mcmbrán belsö fe lszíné n e lhclycLkcdö piridinnukleotid -trans7hidrogcnáz á lta l katalizá ll reakció teszi lehetövé.

NADPH + NAD+ ~ NADP+ + NADH A reakció irányát a proton mctoros erő szabályozza. A FADH 2, illetve az FMNH2 szerosa n, néha kovalens kötéssel kapcsolódik a dehidrogenázokhoz.

A standard redoxpotenciálj uk ezért attól a fehérjétő l függ, amihez asszociálódnak. A navoprote inek a kár egy. akár két elekiront képesek fe lvenni, illetve lcadni. Ezért közvetítenek olyan rcakciókban. ahol két ele ktron átadása mcgy végbe ( ADH). dc ök maguk csak egy e lekiront adnak tovább; mind a mitokondriális, rnind a mikroszómális elektrontranszportlánc cbö tagja flavoprotcin.

A légzési láncot alkotó komplexek fehérjéi közötti elektronátvitelben a flavoproteineken kívül kü l önböző típusú, fémtartalmú prosztetikus csoportok vesznek részt. A citokrómok (cit) o lyan elektrontranszferben részt vevő fehérjék, amelyek prosztetikus csoportként hemet tartalmaznak. Vasatomjuk az

74

>>»»»>m»»>>>m>»>»>>>>>>>>>m,,>>>>>>>>>>»>>>>»»>»>>>mmm>>»m»»>>»»>»»>>»>»>»»>>> »>>>>>>mm »»>>>»»>>>>>>>>>>>>> >>>»>>»>»>>»>»>>m

:f-~:CR, l

CH3

-...----~..1

l l

NYÁ GCS E ll E

2-26. ábra. A citokróm C, C 1 hem kovalens kötődése a polipeptidlánc két ciszteinjéhez

CH3

HC - -(

Á

1}-----.- CH

3

2

N--- Fe +---N l

CH2 - ' - - - (

i~

HC

j

(l

."______..~_ CH - S - CH2 - Cys

CH

21

~H,

elektrontranszfer során redukált (Fe ), illetve oxidált (Fe3 ) állapotokban van. Három osztályba sorolhatók: fényabszorpc iós spektrumuk közti különbségek alapján a, b, c eitekrómokat különböztetnek meg. Az a és b citokrómok hemcsoportj ai szorosan, de nem kovalens kötéssel kapcsolódnak a polipeptidláncokhoz, a c c itokrómok hemcsoportjai tioéter kötést képeznek Cys-en keresztül és így asszociálódnak a fehérjéhez (2-26. ábra). A fla voproteinekhez hasonlóan, a citokrómok fehérje alkotórésze j ele n tősen befolyásolja a standard redoxpotenciáljukat (lásd a 2-3. táblázatot). Többféle vas-kén komplex (FeS) prosztetikus csoportot tartalmazó fehérj ét talá lunk a légzési táncban. A citokrómok:tól rnegkülönböztetendő, nem hem-vasat tartalmazó fehérjéknek is nevezik őket. A vasionok a ko mplexekben redukált (Fe2+) vagy oxidá lt (Fe3 +) állapotban vannak· anorganikus S-atomokkal, illetve a polipeptidláncban elő­ forduló cisztein S-atommal asszociálódnak. A légzési lánc egyes fehérjéi rézionokat is tartalmaznak. A rézionok redukált (Cu ) vagy oxidált (Cu2...) á llapotban fordulnak elő. A légzési láncot alkotó fehérjekomplexeket két elektronszállító molekula, a koenzim Q vagy ubikinon (UQ) és a viszony lag kis molekulatömegű citokróm c köti össze. Komponenseinek standard

~

redoxpotenciá l-értékeit (lásd 2-3. táblázatot) és a terminális oxidáció folyamatát, a lépések egymás utániságát áttekintve adódik a következtetés: a mitokondriális légzési láncnak mint membránstruktúrának felépítésében a rendező elv a redoxpotenciálok sorrendje. Három fehérjekomplex (Komplex l, rn, IV) tartalmaz olyan polipcptidláncokat, amelyek transzmembrán fehérj ék és protont pumpálnak ki a mátrixból.

A terminális oxidáció folyamata A lánc e lső komplexe a NADH-UQ-oxidoreduktáz (NADH-dehidrogenáz) 25 polipeptidláncból álló nagy (850 kD) fehérjckomplex. A N ADH-ról hidridionok formájában érkező elektrono k transzferében FMN-t, majd több különböző FeS-központokat prosztetikus csoportként tartalmazó fehérjék vesznek részt. A komplex NADHkötő helye a mátrix felé néz, így a mátrixban képződő NADH-t megköti és oxidálja. Az el ső kompl exrő l az elektronok az élővi lágban mindenütt el őfordul ó ubikinonra innen a név kerülnek (lá. d 2-25. ábra). Az ubikinon (UQ) speciesenként változóan hosszú i zoprénegységekből á lló láncot tartalmazó, hidrofób, a membránban könnyen diffundáló kinonszárma7ék. Emlősökben

BIOE'JE RGETIK.\

>>>> >»~ >>>»»>>n~ >>>H>>>>>>> >n> >>>»H) >un>»>>>»>>n>>»>>> >n>>>>>>>))>»>>>>>)))>>»»>>>>)»>»>>>>>>>>>» >> >> » >>» >> >>>HH>» >>>>n>>n >n>>>>>

általában a lánc tíz izo prén egységből áll. Az ubikinon, ha onlóan a navoprotein átv i vőkhöz, képes egy elektron felvételére; a képződő szemikinon intennedier a másod ik elektron fe lvéte lével redukálódik ubikinollá (UQH:!) (2-27. ábra). Ez a légzési lánc egyellen olyan e lektron á tv ivője, amely nem kötődi k kovalens kötéssel fehérjéhez, így a mitokondrium be l ső membránjában viszony lagos mozgási szabadsága van.

Az ubi kinon rendkÍ\ ü Ilonlos anlloxidáns (lásd 2.6. fcje7.:t). A korral az UQ mennyiségc csöJ..ken, ez alátámasnani látst-ik tiLokat at e l kép~.:c l ésekct . amelyek az

o H +

+ e

oxidált UQ

o szemikinong yök

OH H

+

+e eirH +

OH R redukált UQ CH3

OH

2-27. ábra. Az ubikinon (UQ) két lépéses redukciója

u >nu> >>

75

öregedés folyamatát az oxidatív káro!>odásokJ..al honák össLcfüggcsbc. OxidatÍ\ stressz esetén ugyani!. az UQ mcnnyiségc fokozódik. FoJ..orolt oxigénfelvéte l (például inten7Í\ tcsted7é!:>) at érintett ~zövctckbc n szintén az UQ mcnnyi ·égének tokoL6dá áHtl jár.

A komplex r-tő l az ubikinon az elektronokat a komplex lll- hoz szállítja. Az ubikinon nemcsak a ko mplex l - tő l képe átvenni e lek trono kat, elektrondonorké nt más F ADH2 prosztetiku s csoportta l rendelkező enzim( komplex) is szerepe lhet (lásd 2-25. ábra). Így e lektronok nemcsak a N ADH közvetítésével kerülhetnek a légzési láncba. Ha a szukc inát oxidálódik fum aráttá és az ebbő l szánnazá elektronok kerülnek 0 2-re, akkor a ~En kisebb, mivel fumarát/szu kcinát Eo = 0,03 1 V ; ennek alapjá n ~0°'-érték = - 152 kJ/mo l. A szukcinát- UQ-oxidor eduktáz a szukc inátró l képe ele ktronokat átvinni az ubikinonra. Ezt a reakciót a szukc inát-dehidrogenázt tarta lmazó ko mplex katalizálja, amelynek prosztetikus csopo rtja FAD . A szukcinát-d ehidrogená z a citrátkö r egyetlen membránho z kötődö enzime, amely a z ukcinátot fumaráttá oxidá lja (lá d később a 2-36. ábrát). A szukcinát-dehidrogená z eközben redukálódott FADI-h prosztetiku s csoportjáró l FeS-fehérj é ken keresztül kerülnek az e lektronok az ubikino nra. Ennek a komplexne k, szemben a hasonló működés ű N ADH-UQ- reduktázza l, azonban nincs proto npumpa-aklivilá a. A NADH+H /NAD :UQ/ UQH 2 redoxpárok közötti redoxpotenc iál-különbs éggel összeha onlítva, a FA DH/ FAD:UQ/ UQH 2 redoxpá rok közölti redoxpotenc iál-különbs ég kisebb; nem e légsége ahhoz, hogy a protonpum pának mint endergonik us fo lyamatnak az energia igényét kie légítse és a komplex Ir nem is tarta lmaz proto npumpát. A g licerol-fosz fát-dehidro genázról, amely a reduká ló ekvivalens tra nszportban j átszik szerepet (lá d 2.2. fejezetet), illetve a zsíracii- CoA-deh idrogenázról, ame ly a z irsavoxidác ióban zerepel (lásd 2.3. fejezetet) mint szintén FA O-dal működő ox idoreduktá zokró l FeS-közpo ntú proszteti ku csoportot tarta lmazó fehérjék közbeiktatá ával kerülnek az elektrono k az ubikino nra. A légzési lánc második proto npumpa-ak tivitáskomplexe a komplex Jll, az sal rendelkező uktáz. Az elektronok c-oxidored UQH2 -citokróm

76

)))))))))))))))))))~))U)))))))))))))))))))))))))))))))))))}))}t))))t)))))~)))))))))))))))))))))))))))))))))))U))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))>)))))))

ezen komplex segítségével a UQHr ról egy vízoldékony fehérjére, a citokróm c-re kerülnek, amely a belső membrán külső felszínén helyezkedik el. A ill komplexet többek között citokrómok (citokróm b és c 1), valamint FeS fehérje alkotja . A citokróm b, c 1 és c ugyanolyan hernet (protoporfirin IX) tartalmaz, mint a mioglobin vagy a hemoglobin. A ci tokróm c, az ubikinonhoz hasonlóan, az élő­ világ rendkívül elterjedt molekulája. A növényektől kezdve minden olyan organizmusban megtalálható, ahol van légzési lánc. A citokróm-oxidáz a légzési lánc harmadik protonpumpa-aktivirá ú fehérjekomplexe. A citokróm-oxidáz redukálja az oxigénmolekulát vizzé. Az elektrondonor a redukált citokróm c: 4 cit c (red) + 4H + 0 2 -+ 4 cit c (ox) + 2H20 A citokróm-oxidáz négy elektron átvitelét katalizálja. Minden olyan körülmény, amely részlegesen redukált oxigénszármazék szabaddá válását eredményezi, súlyos veszélyeketjelent (lásd 2.6 fejezetet). Ezért az oxigén redukciója rendkivül pontosan és szigorúan szervezett folyamat. A komplex legalább nyolc alegységből áll. A négy elektron transzferjében négy fém vesz részt. Két hem-vas (citokrórn a, a3), illetve két rézion kapcsolódik be a két oxigénatom-kötés ébe, valamint a négy elektronátvitel lebonyolításába. A citokróm-oxidáz az egyik legtöbbet tanulmányozott és legrészletesebben megismert fehérjekomplex. A légzési láncban az elektronok átvitele különböző pontokon különböző gátlószerekkel megakadályozható. A legfontosabb gátlészerek támadáspontjai a 2-25. ábrán láthatók.

ANYAGCSERE

(redoxelektródpár ), amellyel a lépés redoxpotenciál-változása mérhető. A légzési lánc, mint a mitokondrium belső membránjában kialakított struktúra a standard redoxpotenciálok sorrendjének, mint rendező elvnek megfelelően szervező­ dött. A különböző redoxelektródok közötti redoxpotenciál-különbség három esetben tesz lehetövé a belső rnembránon keresztül a mátrixból kifelé történő protonpumpálást, ami endergonikus folyamat. A protongrádiens azért alakul ki, mert a bel ső membrán impermeábilis protonokra nézve. Mind a három esetben a létrejött protongrádiens egy-egy ADP-molekula foszforilációját teszi lehetövé ATP-vé. A kitüntetett hely, ahol a protonok visszatérhetnek a mátrixba - ami exergonikus folyamat, s ezáltal a kialakult elektrokémiai grádiens megszünik - egy protoncsatoma, amely egy több alegységből álló enzim (ATP-szintáz) része. Termodinamikai számítások (a standard elektródpotenciálok, illetve a standard szabadenergiaváltozás értékek) alapján a három redoxpotenciál-különbségnek megfelelő szabadenergia-csökkenés nagyobb, mint az ADP foszforilációjának energiaigénye. l molekul a NADH oxidációjához 3 molekula ADP foszforilációja kapcsolódik, míg l molekula szukcinát oxidációjához csak 2 molekula A TP képződése társul, mivel a ll komplexen keresztüli e lektrontranszfer esetében a NADH-UQoxidoreduktázhoz kapcsolt protonpumpa kimarad. A NADH oxidációja az oxigén (O) fogyását és az ADP foszforilációját A TP-vé, azaz anorganikus foszfát (Pi) szerves foszfátba történő beépülését eredményezi. Az egy atom oxigénfogyásra ( l molekula H 20 keletkezésére) jutó anorganikus foszfátbeépülés, a P:O hányados, az oxidatív foszforiláció régóta alkalmazott jellemzője. NADH oxidációja esetén a P:O hányados 3, szukcinát (F ADH2) esetén 2.

Az oxidatív foszforiláció A terminális oxidáció a mitokondriumban elektrontranszfere k sorozata - exergonikus folyamat. Az oxidatív foszforiláció - az ADP és P 1 kondenzációja - a NADH oxidációjához, mint exergonikus folyamathoz kapcsolt foszforiltranszfer, endergonikus folyamat. A légzési láncban végigmenő elektronpár redoxrendszerről redoxrendszerre vándorol. Mindegyik folyamathoz rendelhető két redoxelektród

Az ADP foszforilációja az akceptor kontroll Az ATP-szintáz univerzális enzim, amely két - F 1. Fo - áll. Elektronmikroszk óppal az F 1-rész látható, mint a mitokondrium belső rnembránjának a mátrix felé irányuló betüremkedése. Az F 1-et ötféle polipeptidláncból álló kilenc alegység építi fel (a3, f33, y, o, E, molekulatömeg: 380 k.D). részből

BIQE'; ERGET II\:A

Ez az egység felelős az ADP foszfo riláci ójáért A négy különböző polipeptidláncból képződő F0 -egység képezi a proto ncsat ornát Ez az egysé g, így a protongrádiens kiegyenlítődése, oligom ycinnel gátolható - ily módo n az ATP szinté zisét gátolni lehet. Ezzel ellentétben a mitok ondri um belső memb ránja különböző szerekkel proto nokra perme ábilis á tehető. Ilyen " klassz ikus" proto nofor pl. a 2,4-dinitrofenol. Az eredm ény az ATP szemp ontjából nézve azonos, az ATP szintézise gátlód ik. A 2,4-dinitrofenol a memb ránt proto nokra perme ábilissá teszi, ezért szétka pcsol ja az elektr ontran szportot é a foszforilációt, mert nem jöhet létre a protongrádiens. Az elektrontranszp01t nem akadá lyozott, sőt az oxigé nfogy asztás szabályozatlanul fokozódik. Az ATP-szintézist ily módo n gátló szereket szétk apcso ló zereknek nevezile Az elektrontranszport szaro san kapcs olt az ADP foszforilációjához. Az oxida tív foszfo riláció elektron- (a tápanyagok hidrag énje terhére folyamatosan újra reduk álódó NAD H, illetve FADH2), oxigén-, ADP-, valam int P,-ellá tást igényel. Az oxidatív foszforiláció ebess égét elsősorban az ADP koncentrációja szabja meg. Az ADP menn yisége attól függ, mennyi ATP haszn álódik el a sejtben. Ha az ATP/ ADP arány az ADP javára tolódi k el. ez jelzés az oxidatív foszforiláció fokozására. Az ADP- szint oxidatív foszforiláció sebes ségét meghatározó szerep ét légzés i (respirációs) kontrollnak vagy akcep tor kontr ollna k nevezik. Az ADP- szint így nemcsak az oxida tív foszforiláció, hanem ebből következően a terminális oxidá ció sebességét is meghatározza. Az oxida tív foszfo riláció gátlása vissza hat a terminális oxidá cióra, gátolja azt. Az A TP szinté ziséne k gátlás a tehát az elektrontranszfert, a NAD H oxidá cióját , végső soron pedig a sejtben a tápanyag fogyását gátolja. Az oxidatív foszforiláció és terminális oxidá ció szétkapcsolásának jelentősége azonb an nemc sak experimentális, illetve toxikológiai , amen nyibe n a szétkapcsoló zerek súlyos, mérgező hatásúak. Szerepe van a hőterrnelésben, a testhőmérséklet fenntartásában, téli álmot alvó állatok, újszülöttek (embe r is) hőmérséklet-adaptációjában. A hőter­ melésben - termogenezisben - igen fontos szerepet játszi k a mitok ondri umok ban igen gazda g barna zsírszövet. A benne találh ató mitok ondri urnok tartalmaznak tenno genin t, egy szétkapcsoló

fehérjét, amely proto ncsato rnát tartalmaz, így mega kadál yozza a proto ngrád iens kialakulását, mert a protonok vissza jutnak a mitokondrium mátrixáb a. Ezáltal az ATP-sz intézi s elmarad. Az ADP, illetve az ATP a mitok ondri um belső memb ránján egy specif ikus transzportfehérje, az ATP-A DP transz lokáz (adenin nukleotid karrier) segíts égéve l jut keresztül. Az ADP- nek a mátri x ba vitörténő belép ése az A TP kilépé séhez kötött , és köza gátlás ő szont. (Enne k atraktiloziddal történ vetve gátolj a az oxidatív foszforilációt).

A kemi ozmo tikus elmé let Az energ iatran szduk ció általá nosan elfoga dott mech anizm usát a kemio zmoti kus elmélet (MiLchell) írja le (2-28. ábra). A légzési láncban az elektr onátv itelt proto ngrád iens kialakulása kiséri a ok belső memb rán menté n azáltal, hogy proton pump álódn ak a mátrixból a memb rán közti térbe. A proto nkonc entrác ió-kü lönbs ég pH-vá ltozás t eredm ényez. A mátri x lúgos abb lesz a memb rán közti térhez viszonyítva, illetve töltéskülönbség alakul ki, amen nyiben a mátrix negatívabb lesz. Az így kialakuló elektrokémiai potenciál, proto n motoros erő (öp) tehát két komponensből tevődik össze: a memb ránpo tenciá lból és H +--konc entrác ió enerkülönbségből. Az oxido reduk ciók szaba d iává energ gia-cs ökken ése ily módo n elektr okém iai transzformálódott. A proton motor os erő különböyét ző élő lényekben többfé le munk a energ iaigén képes fedezni, közvetlenül a bioszintetikus folyamatok energ iaigén yét azonb an nem, ezt az A TPhidrolízis fedezi (2-29. ábra). A proto nok spontán, az elektr okém iai grádie nsnek megfelelő visszaáraml ása a mátrixba szaba dener gia-cs ökken éssei járó folyamat. Ez transz formá lódik az ADP foszfori lációj ával kémiai energiává. Ha a proto nok áramlása az F 0 F 1 komp lexen keresztül gátolt, ADP nem foszfori lálódik ATP-vé és a terminális oxidá ció továb b folyik , a protongrádie ns egyre nagyobb, így egyre több energia szüks éges a proto npum pához , amely a mátrixból a grádie ns ellené ben történik. Ha ennek energ iaszüks églete meghaladja az elektr ontran szfer kapcsán felsza badul ó energiát, az elektr ontran szfer megáll, a NADH oxidációja csökken, majd abbamarad. Ez a légzési, akcep tor kontroll magy aráza -

78

>>>>>>>>>>•~n>>>>n>)•>>)u>>n>>>>>>>>>>>>»>>>>>>•)>>>>n>>>>'t>>>>>>>)>>>•>>>>>n>•»n>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>)>>>>U>>>>»»n>>»>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> >>n>>>>>>H>>

A 'IYAGCSERE

+

ADP + Pi

ATP

2-28. ábra. A kemiozmotikus hipotézis modellje. A pirossal satirozott részek a légzési komplexek, a szürkén satírozott rész a protoncsatornát alkotó A TP-szintáz

ta. Az egész folyamalrendszer ép struktúrához, kompartmentalizáltsághoz, a mitokondrium épségéhez kötött.

.._____

transzportok

Mitokondriális fehérjék szintézisének zavarai - " mitokondriális betegségek" A

m it o k.o ndriá l i~

fchl!rjék egy rl!s7c a mitokondriumban illet\ c a mitokondriáli:-. D S által kódol!. A 'isLon) lag kis mo l ckulatö megű ( 16 OOO báti pár) D S-röl 13 polipeptidlánc kép7öd ik, köt.tük a légtc:-.i lánc komponen~ti met iLá l ód ik.

l h ő -+-----

mechanikai munka

l

aktív transzportok

bioszintetikus folyamatok

2-29. ábra. A protongrádiens szerepe a különbözö sejttevékenységek energiaigényének f edezésében. A protongrádiens egyes egysejtűekben a mechanikai munka energiaigényét fedezi. Protongrádiens terhére megvalósuló aktiv transzportok emlős szervezetekben ts vannak (pl. szekréciós vezikulák transzportjat, lásd 6. 1. fejezet) . p = proton motoros erő

..))))"»>»»» >)>l)," »»»»>) )>)))))) ) )) >})>))

BIOENERG ETIKA

)) )) )))))))) )))) )))))})) ))))}) )))))) )))))))) )))))) )))))) ))))))

l reneinek egy része, a komplex l, lll, IV proto npumpáva intáz TP-sz A az int valam , delke ző alegy égein ek egy része és tRNS DNS ális ondri mitok a eg; es alegy égei. Ezenk ívül rR S géneket i tartalmaz.

A magi és mitokondriális DNS -károsod ások hoz súlyos kórkékötődö mitokondriális elvá ltozá sok r ck kialakulásáho z veze tnek, ame lyek az esete k egy részé ben lassan progrediá ló, fatál is bete gségek. Több kóro s, illetv e elég telen né váló , izomsorvadásos betegség (myo pathia) oka a mito kond ek riális fehérjeszintézis zavara. Szív izombete gség (card iomyopathiák), idegműködés i zava rok (neu beropathiák), szemelvá ltozá sok egy részében a tegség mitokondriális ered etű (lásd részletese bben téa 66. fejezetbe n). A mitokondriáli s fehé rjék szin és üköd túlm rigy zisét a tirox in fokozza. Paj zsmi esetén a mito kondrium ok száma nő, a légzési lánc kom ponensei foko zott mértékbe n szintetizálód nak.

A citrátciklus A citrátciklus hely e az inte rme dier anyagcserében; a cikl us kata boli kus és anabolikus funkciója m A metaboliz mus kata bo likus részében háro ). szakaszt külö nböz tetne k meg (2-3 0. ábra

-

anyagcsereutak

l.

citrát kör

ll

lll.

co2

1/2 0 2--{ _-- -- ADP + P,

t---. ATP H20

79

Az első szak aszban a külö nböző tápa nyag ok túlnyo mó több ségé ből a kü lönböző anya gcsereuta dik kon keresztü l acetil-Co A képződik . A máso tkele szakaszban az acetii-Co A oxid álód ik ' CO? mákezik. A harmadik szak aszban az első , illetv e n sorá sodi k szak asz dehi drog enálási reakció i H redu káló dott elek trons zállító molekulá k, a NAD ' áciilletv e a FAD H2 oxidálód nak a te rmin ális oxid óba n, a tápa nyag okban l evő hidr ogénből víz képfoszforiláció ződik, ehhe z kapc solta n az oxidatív révén ADP fosz forilálód ik ATP -vé. A kataboliz mus így telje s; a tápanyagokba n l évő az szén C0 2-dá, a hidro gén vízz é oxidálód ik, soáció oxid ene rgiatrans zformáció , a tápan yago k rán felsz abaduló energ iáj ának hasznosí tható ener tsegi ek giafo rráss á alakitása fosz fori ltranszfer ségé vel, optimális. Az opti máli s hasznosí tás felté ő­ lehet ak tele az o:! felvételének és felha szná lásán bosége . A háro m szak aszból álló komplett kata lizmust sejtl égzésnek neve zik. a A meta boliz mus kata bolikus fo lyam ataiban rkonv erge ncia , anaboliku s folya mata iban a dive utak genc ia úgy érvé nyes ül, hogy a bios zinte tikus vikula mole sorá n term előd ő, rendkivül sokféle szonylag kisszámú mole kulá ból képződ i k, ame ékei term lyek egyben a kü l önböző lebo ntási utak (2-3 1. ábra). A sejt anya gcseréjének középpontjában egy elos ztóre ndsz er műk ödik , ame lyne k funk viszo nyok aktu ális ener getikai az ciój a zik. Ha a válto int (AT P/AD P, NADH!N AD ' ) szer

gluk-é'l.

NADH + H+ FADH 2

)))))) )))) >)))))

)))))) )))) )))) ))))>))) )) )))) ))))))))))

terminális oxidá ció oxida tív foszforiláció

2-30. ábra. A katab o lizmus konv ergen ciáj a, a tápan yago k lebon tásán ak három szaka sza

80

ANYAGCSERE

glukóz aminosavak

citrát

l \

- - - . zsírsavak

izocitrát

fumarát

a-ketoglutarát

/

szukcinát

szukcinii-CoA aminosavak

L

-------1-- . . .

aminosavak

porfirin

-----------L-- ------......1

2-31. áb ra. A citrát kö r anabolikus és katabolikus j ellege. Vastag fekete nyilak: lebontó folyamatok, piros nyilak: anabolikus folyamatok

sej t ATP-koncentrációja nem elegendő az aktuálisan jelentkező igények kielégítéséhez, a szubsztrátok dehidrogenálódnak - hidrogénjük koenz imekre kerül, majd a terminális oxidáció folyamán oxidálódik, hogy ehhez kapcsoltan A TP képzödhessen. M egfelelő A TP-ellátottság állapotában különbözö szintetikus folyamatok indulnak be, amelyekben általában nem az oxidáció, hanem a redukció dominál. Szemben az előző állapottal, ezek a folyamatok energetikai szempontból nem az e nergia fel szabadítását, átalakítását, hanem az energia raktározását szolgálják. Az elosztórendszer funkcióját a citrátciklus valósítja meg.

A citrátciklus különbözö tankönyvekben citromsavciklus, trikarbonsav-ciklus, Krebs-ciklus, Szent-Györgyi- Krebsciklus néve n található meg. Reakció inak fel fedczése, a ciklus felismerése szemlé letileg is igen nagy je lentőségű a biokémia tönénetébcn. A ciklus megismeréséhez több fontos megfigyelé el járult hozzá Szem -Györgyi Albert szegedi laboratóriuma.

A 2-3 1. ábrán látható, hogy a tápanyagok - szénhidrátok, zsírsavak, aminosavak - katabolizrnusa hogyan kapcsolódik a ciklushoz. A citrátkör katabolikus szempontból a különböző tápanyagok oxidációjának kőzös szakasza. Bár a citrátkörbe való belépés lehetősége több ponton adott, a szub-

mmm>>m•»>» mm>»»»>» >>>>>>m>••>m >>••» >>m>>>••••>>

BIOENERGETI KA

»mm••••••>»mm> >>•••• >»>••••>>>»m>>>>••m»»»>>>••»••••••••••••>»m>>••>>» ••

sztrátok zöme aceti l-CoA formájában kerül be. A citrátkör végső soron aceti l-Co A-t "fog yasz t"; a kre kerü l, szénből co:! lesz, a hidrogén koen zime majd vízzé oxidálódik. A citrátciklus és bevezető reakciói azon ban nemcsak a tápanyagok katab olizm usán ak közö s szakaszai banern az anab olizmus kiinduló pontjai is. A 2-31. ábrán látható, hogy ezek a reakc iókje lentik a őségét. különböző mole kulák átala kítás ának lehet Ez elsősorban a szén hidrá tok zsíro kká történő átalakítása miatt igen jelentős. A katab olizm us második szakaszát jelentő reakciók egy része tehát a sejt energiaállapotától függőerr fontos anab oliku s célokat is szolgálhat.

Az acetíi-CoA képződése piru vátb ól, a piru vát- dehi drog enáz enzi mko mple x A tápanyagok döntő több ége lebon tása során vagy piruváttá, vagy aceti l-Co A-vá alakul. Ez igen lényeges különbség, amelynekjelentőségéta 2.7. fejezet tárgyalja.

8l

Ha az aceti l-Co A gluk ózbó l vagy olyan aminosavakból kelet kezik, rnelyek lebontásának közti terméke a piruv át, akko r az acetil-CoA-képződés megh atáro zó lépés e a piruvát~ aceti l-Co A átalakulás. n zajA piruvá t oxidá ciója a citrátkörrel együtt koord inálta oxiát pin1v a pciója konce ti kezde iklus ló folyamat. A citrátc t. dáció jára vonat kozot

Az aceti l-Co A képződése során irrev erzibilis reakció soroz atban piruv át oxid atív deka rbox ilezé se történik.

piruv át + CoA + NAD ~1 ~ aceti l-Co A + NAD H + H + C0 2 0 ~G = - 33,4 kJ/mol A reakciókat euka rióta sejte kben a mitokondriumb an található piruv át-de hidro genáz komp lex katalizálja (2-32. ábra). A kom plexe t megh atáro zott térbeli elren dezé sben és arány ban háro m enzi m, a piru vát-d ehid roge náz, a dihid rolip oiltrans zace tiláz, valam int a dihid rolip oil-dehid -

2-32. ábra. Aceti i-CoA képződése piruv átból . A vékony fekete nyilak az egyéb reakcióúton történő keletkezés i, illetve átalakulást jelzik

o

~/

o-

c l

C= O l

piruvát

CH3

co,

-J

~~

piruvát-dehidrogenáz komplex

S-C oA

l C=O l

zsírsavak

~ aminosavak

acetii-CoA

CH3

oxálacetát

citrát

83 BIOE. ERGETIKA

NH2

l

c ,f' "

N

C - CH:! -

l

ll

H3C - C~ / C N

+

~ N

c- s

ol

1

"-C= C- (CH ) -

l

@

ol

O- P - O - P - 0

22

CH3

ll

ll

O

O

tiamin-pirofoszfát (TPP)

o o

Ö-l

ll

ll

C

C

CH

-1

,....H

o piruvát

c

h1droxiet - TPP

t-dehi droge náz által katali záll reakc ióban 2·34. ábra. A piruvá t kötődése a TPP-h ez a piruvá

CH2

s/

~

l

1

CH2

J

s" CH / liponsav-

l

~-

HS-coA

C= O

HN~

v

H

c

A N / H"-c A

H

l

Lys

E 2 polipeptidlánca

ll

o

zacet iláz által kataliz áll reakc ióban . 2-35. ábra. A lipons av szere pe a dihidr olipoi l-trans : dihidrolipoil-transzacetiláz- lipoamid Rövidítések: E,-TP P: piruvát-dehidrogená z-TPP; LA-E 2

c

s-coA

84

»>m>>m>>>»>>>m>mmm»»»>»»>»»>Hm»>>>>>»>>>>»»>>»»>>>>>»>>>>>»>m >>>>>>>» »>>>>>>» >>>>>>>m>>>»> m))>m >>mmm>m >>>»»»>>»mmm

A !'í Y A GCSERE

O = C-CO()

l

CH 2 -cooCH2 - COO

oxálacetát

coo-

l

l

Ho - c - coo-

HO - CH

l

l

CH2 - coo-

CH2

l

citrát

coom lát

H ,O-Jj

CH2 - coo-

l

c - coo

coo

ll

l

cH - coo-

CH

ll

cisz-akanitát

HC

l

/fH ,O

coofumarát FAO

~

FAOH2

CH2 - Coo-

l

H - c - coo-

CH2 - Coo-

l

NADH~H

l

~

CH2

l

HO -

CH - COO-

1

coo-

~

szukc0 át ' n

CH2 - coo-

l

GTP GDP+ P.l

l

CH2

CH 2

C - S-CoA

c - coo

o

o

szukcinii-CoA

a -ketoglutarát

l

CoASH

CH, - COO-

ll

l

ll

2-36. ábra. A citrátciklus. A ciklus irreverzibilis reakcióit pirossal kiemeltük

~zocitrát ~ •

NAD

l

• BIOENERGETIKA

n>> ))H ) l n)~))))))))))))>)))))))))))>)))>))))) H ))))) )))))))))))) >)) ) ))))))))))))) ))))))>)))))))))))>>))))))))))))))))))))))>>)) )) ~)H>)>) U)))))>)))))))))) U >>))))))

A citrátkör reakciói

kondriumban igen alacsony. Az, hogy az enzim csak akkor köti az acetil-CeA-t, ha az oxálacetátot már megkötötte, j elentős körülmény, mert a citrátszintáz ezért nem képes az acetil-CoA-t hidrolizálni . A kondenzációt követő ticészter hidrolízis előfeltétele a citril-CoA létrejöttéhez kötődö újabb konforrnációváltozás. A keletkezett citrát tovább alakulhat a mitokondriumban, vagy egy transzportrendszeren keresztül a citoszciba kerülhet. A citrát citoszolba történő transzportja a mi tokondriumban képződő acetil-CeA citoszol ba jutását szolgálhatja, ahol el sősorban zsírsav- és koleszterinszintézisre használódik, és lehetövé teszi a NADPH tennelését. A mitokondriurnban maradó citrát reverzibilis izomerizáció során izocitráttá alakulhat át. A kétlépéses, átmeneti dehidratálással járó folyamatot (2-38. ábra) az akonitáz katalizálja, amely egy FeS-központot tartalmazó fehérje. A FeS-központ rnind a szubsztrátkötésben, mind a H 20-addíció, il-

A citrátkört reverzibilis és irreverzibilis reakciók alkotják, amelyeket intramitokondriális enzimek katalizálnak (2-36. ábra). A ciklus első reakciója a citrát képződése. Acetil-CeA oxálacetáttal citrátot képez aldolkondenzáció, illetve az ezt követő hidrolízis során (2-37. ábra). Az irreverzibilis reakciót (0°' = - 32,2 kJ/mol) a citrát-szintáz katalizá1ja. Az enzim szerkezete, illetve a reakciómechanizmusa jól ismert. A citrát-szintáz a reakció során először a mitokondriumban igen alacsony koncentrációban jelen levő oxálacetátot köti; az ezt követő konformációváltozás teszi lehetövé az aceti l-CeA megkötését. Intermedierként citril-CoA képződik, amiből víz belépésével fe lszabadul a CoA. A magas csoportátviteli potenciál ú ticészterkötés hidrolízise teszi a reakciót erősen exergonikussá. Ez fontos, tllivel az oxálacetát koncentrációja a mito-

o

·' l

l

ll

o CH -C"'-' S-CóA

l

acetil-CoA o=c - coo-

H20

ll

C "'-' 5-CoA

CHJ

__.

2

Ho-c-coo-

l

CH 2 -COO~

H5-CoA

\__ _) ..

CH2 - coo

l

Ho - c - coo-

l

l

CH2 -

CH2 - COO""

oxálacetát

coo-

citrát

citrii-CoA citrát-szintáz

2-37. ábra. A citrát-szintáz által katalizált reakció

CH2 - coo·

l

HO - C - COO~

l

HCH - coocitrát

CH2 - coo-

l

'

C - CocJ

ll

CH2 -coo· -"-...::::......_ _ _,..,

Hd-coo·

l

CH - coo-

HO -CH-COO-

císz-akonitát

izocitrát

akonitáz

2-38. ábra. A citrát ~ izocitrát átalakulás

85

86

» >»>>>>»>» >>>»»>>»m>»>mm» >>m>>m m>» >m >>>m» >»>>mm>>>>>»>H>»>»>>m>m>m >>>H»m>m»mH»»»m»>>»>»H»»»>>»

>>mmn>>»»>

letve dehidratá lás folyamatában részt vesz. A rea kció során intermedi erként képződő cisz-aka nitát kötődik az enzimhez. Egyensúl yi állapotba n a citrát mindössz e kb. 7%-a alakul izocitráttá. A tényleges helyzet az aktuális koncentrá cióviszonyok függvénye, ami a sejt energiaál lapota szerint változik. Az izocitrát fogyásának sebessége az izocitrát-d ehidrogenáz aktivitásá tól függ. Az izocitrát -dehidro genáz a citrátkör " katabolikus részének" tekinthető reakcióso rozat e l kötelező lépését, az első dehidrog enálást katalizálja. Ennek során alfa-keto glutarát és C0 2 keletkezik, valamint NAD 1 redukálód ik (2-39. ábra). Az irreverzibilis reakció (~0°'= - 20,9 kJ/mol) oxidatív dekarbox ilezés. (A citoszolban található izocitrát-dehidrog enáz funkciója első orban a

CH

l

2

ANYAGCS ERE

NADP+ redukciój a, amely bioszinte tikus folyamatok fontos feltétele, lásd 2.7. fejezetet). Az alfa-keto glutarát a mitokondriumban kül önböző reakciókban vehet részt, am e l yekrő l a 2.4. fej ezetben lesz szó. Az alfa-keto glutarát- dehidrog enáz enzimkomplex katalizálj a az alfa-keto glutarát átalakítását szukcinii-CoA-vá (2-40. ábra), mű ködése a piruvát-d ehidrogenáz enzimkomplexhez hasonló. A komplex irreverzib ilis (~0°·= - 33,5 kJ/mol) ox idatív de karbox ilezést katalizál, amelynek során az alfa-keto sav oxidációj ából származó energia seg ítségéve! magas csoportát viteli potenciálú ticészterkötés j ön létre. Az enzirnkomplexet háromféle enzim alkotja: az alfa-ketoglutarát-d ehidrogenáz, a dihidrolip oil-transzszukcinil áz és a di-

~7o-;?'

2-39. ábra. Az izocitrát -t alfa-ketog lutarát átalakulás

HC - COO

l

HO - CH - coo· NAD+ izocitrát

CH2 - coo·

l

izocitrát-dehidrogenáz

CoA-SH

CH2

l

c - coo

ll

CO

><

NAD

o

NADH+ H

NADH+ H+

a -ketoglutarát

a-ketoglutarát

CH2 -

coo·

2-40. ábra. Az alfa-ketog lutarát oxidativ dekarboxil ezése

l

CH2

l

C "- S-COA

ll

o szukcinii- CoA

a-ketoglutarát-dehidrogenáz enzimkomplex

2-41 . ábra. A szukcinii-C oA -t szukcinát átalakulás

CH2 - coo·

l

CH2 -

C "- S-CoA

ll

o szukcinii-CoA

szukcinát szukcinii-CoA-szintetáz

l

BIOE ' ERGETIKA

87

cool

CH

ll HC

l

cooszukcinát

fumarát szukcmát·dehrdrogen 1..

2-42. ábra. A szukcinát-dehidrogenáz által katalizáll reakció

coo-

coo·

l

l

~

CH

ll HC

HO-CH

'

l

coo-

l

HC

l

coo-

fumarát

L-malát fumara z

2-43. ábra. A fumarát -) malát átalakulás

hidrolipoil-reduktáz. Működésükhöz ugyanazok a kofaktorok szükségesek, mint a piruvát-dehidrogenáz komplex működésé bez; a reakció eredményeként szukcinil-CoA és C02 képződik, valamint NAD r redukálódik. Szemben a piruvátdehidrogenáz komplexszel, ez a komplex nem tartalmaz kinázt, illetve foszfatázt. A szukcinii-CoA szintén lehetséges "kijárat" a ciklusból, mive l ez a vegyü let a porfirinszintézis előanyaga (lásd 2.4. fejezetet).

A szukcinil-CoA-szintetáz hatására szukci nilCoA-ból hidrolízissei szukcinát és CoA lesz (2-41. ábra). A magas csoportátviteli potenciálú ti oészterkötés felbomlásához kapcsolt reakció a foszforiltranszfer. Először átmenetileg az enzi m, majd GDP foszforilálódik GTP-vé a reakció során. A GTP energetikailag ekvivalens az ATP-vel. amennyiben a nukleozid-difoszfát-kiná..:: által katali..::ált reakcióban tenninális foszfátját képes ADP-nek reverzibilis módon iltadni.

A szukcinii-CoA által katalizált reverzibilis reakció szubsztrátszi ntű foszforiláció, azaz nagy energiájú kötés alakul ki függetlenül a légzési lánctól , jóllehet a mitokondriumban történik. A citrátciklust a ke letkezett szukcinátot fumaráttá oxidáló enzim, a szukcinát-debid rogenáz a légzési lánchoz kapcsolja. A szukcinát-dehidrogenáz több FeS-központot tartalmazó flavoprotein, az általa katalizált reakció sztercospecifikus, benne csak fumarát képződik. Ez a citrátkör egyetlen olyan enzime, amely a mitokondrium bel ső membránjában helyezkedik el. Része a terminális oxidációs légzési lánc n. komplexének (2-42. ábra). A reverz ibi lis oxidoredukció folyamán az enzimhez kovalensen kötött F AD redukálódik és a keletkező FADH2 hidrogénjei az ubikinont redukálják. A fumarátból víz belépésével reverzibilis reakcióban malát képződik a fu maráz enz im közremű­ ködésével (2-43. ábra). Az addíció zigorúan sztereospecifikus, kizárólag a malát L-izomerje képződik, illetve ellenkező irányban csak fumarát képzödhet (Maleát a fumarát cisz-izomérje, illetve D-ma lát nem szubsztrátjai az enzimnek.) A malát~ oxálacetát átalaku lásért felelős malát-dehidrogenáz a c itrátkör utolsó, a ciklust bezáró enzime (2-44. ábra) . A malát-dehidrogenáz

2-44. ábra. A malát-dehidrogenáz

cool

által katalizáll reakció

HO- C - H

l CH2

l coo malát

oxálacetát malát-dehrdrogenáz

88

H>H••u»>>>>>))H",,,",,,),,H>>>»H,.>u>•u>»>>>H>>>>>>>>>>>»>H>>>n»>>»»»>>>>n>>>nnn>>n>n>nHH>>n>>nn>t>>>H>>>>>H>>>)>n)>n>>)>)>>~>>»>>>>>)))))

0 NAO+ koenzimmel müködik. A reakció LlG ' = +29,7 kJ/mol értéke ellenére reverzibilis. Az egyensúlyi konccntrációviszonyok szerint a reakció a malátképződés irányába lenne eltol va. Az aktuális oxálacetát-koncentráció azonban igen 1 alac ony ( l o·6M), illetve a reakció a NADH/NA0 arány szerint tolódhat az oxá lacetát-képzödé irányába.

A ciklus aerob állati és növényi sejtekben, valamint számos aerob prokariota sejtben mcgtalálható.

A citrátkör szerepe a tápanyagok katabolizmusában

A citrátkör a katabolizmus tenninális részének e l őkészítő fázisa. A szén oxidálódi k, a hidrogén pedig redox koenzimekre kerül. A piruvát-dehidrogenáz és a citrátkör reakciói l piruvát, illetve l acetil-CoA molekula teljes ox idációját eredményezik: a három oxidatív dekarboxilálás során a piruvát három C atomja COr dá oxidálódik. Acetil-CoA-ból indulva a citrátkör reakcióinak összessége a következöképpen írható fe l:

ANYAGCSERE

acetil-CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H20 -t 2C02 + 3NADH + 3H++ FADH 2 + GTP + CoA A körfolyamat reakcióiban egy acetilcsoport teljcsen oxidálód ik, ez végső soron a keletkező két co2 forrása , (annak ellenére, hogy közvetlenül nem az acctilc oport oxidálódik). Négy dehidrogenálási reakcióban négy pár hidrogén kerül elektronkarrierekre (3 NAD ', l FAD redukálódik). Ezzel összefüggésben fontos körülmény, hogy egy ciklushoz 2 molekula víz is szükséges. Egy ciklus folyamán egy GDP foszforilálódik GTP-vé. A redukált, elektron! szá llító molekulák a légzési láncban oxidálódnak, így l acetilcsoport teljes oxidációja 12magas csoportátviteli potenciálú kötés létrejöttét (3 NADH -t 9 ATP, l FADH2 -t 2ATP, GTP) eredményezi. A piruvát-dehidro genáz komplex aktivitásának szabályozása A piruvát-dehidrogenáz komplex energetikai

funkciója kettős, szabályozása kétszintü (2-45. áb-

~

inzulin zsírszövetben

~oH-foszfatáz

POH foszfonlált

{maktfv)

ATP-képződés

2-45. ábra. A piruvát-dehidrogená z enzimkomplex aktivitásának szabályozása. POH: piruvát-dehidrogenáz; vastag fekete nyilak: reakciófolyamatok; vékony fekete nyilak: gátlás; piros nyilak: serkentés

BIOE'IERGETIKA

>»>»>>>H»> >>>> >>» >> >> >>» » >>>>>>» >> >> >> >> >> >>>>>»>>»H»>>>>>>>>>>>>>»>>>>>>>> >>» >HH»>>>>»>>»>>H»»»>>H>n>>>>n,.>> H» >H»>n H>»>>H>»>>>~n >>

ra). Az ebben a reakció ban ke letkezett acetilCoA-nak energetikai szempontból kettős szerepe vr n: (i), ha a sejtnek A TP-re van szüksége, eloxidálódik a c itrátkörbe n és az oxidatív foszforiláció ATP-t terme l; (ii) ha az ATP-szint meg fe l e lő, a citrát kiléphet a citoplazmába, ahol a zsírsav- és koleszterinszintézishez szelgáltat acetil-CoA-t és JZ energia neutrális lipidek formájában raktározódik. A szabályozás egyrészt az enz imaktiv itás allosztérikus befolyásolása; a keletkezett acetii-CoA és NADH , valamint az ATP allosztérikus gátlói a piruvát-dehidrogenáznak Ez a gátlás jelentősen fokozódik hosszú lá nc ú zsírsavak jelenlétében. Másrészt azonban részben ugyan ezek a m o lekulák serkentik az enzim foszforilációját; a poszttranszlációs kovalens modifikáció a piruvát-dehidrogenáz alfa-alegységét a lkotó aminosavak közül három szerin foszforilációj ával történik és a piruvát-dehidrogenáz inaktiválódását eredményezi . A szabályozásban a piruvát-dehidrogenáz komplex további két kompo nense, a piruvát-dehidrogenáz-kináz és a piru vát-dehidrogenáz-foszfatáz vesz részt. ATP, acetil-CoA és NADH aktiválják a kinázt, a piruvát-dehidrogenáz foszforilá lódik és inaktiválódik. Az enzim defoszforilálódik és aktiválódik, ha csökken az acetil-CoA, illetve eme lkedik az ADP-szint. A CoA, a NAD"", illetve az AMP-koncentráció növekedése viszont allosztérikusan aktivá lj a az enzimet , és így fokozza az acetil-CoA belépését a ciklusba. Kül önböző szövetekben a piruvátkoncentráció eme lkedése, illetve az inzulin serkentik a piruvát-dehidrogenáz akti vitását Májban a piruvát gátolja a kinázt, zsírszövetben az inzulin serkenti a foszfoprotein-foszfatázt. Ez szoros kapcsolatban van azzal a követe lménnyel, hogy amikor glukóztöbblet van, az enzimnek intenz ívebben ke ll működn ie a glukóz hasznosítása érdekében. Étkezések között azonban az aktivitást csökkenteni kell (az agy ki véte lével), mert az csökkentené a vércukorszint fenntartásához szükséges glukózprekurzorok menny iségét. A piruvát-dehidrogenáz kom plex álta l kata lizált reakció szabályozá a nemcsak az adott sejt, hanern a szervezet energ iaforgal ma szempontjábó l is a lapvető, amennyiben meghatározó a glukóz képzésére alkalmas (glu.kogén) prckurzorok szintjének a lakításában. Ezt a kérdéskört a 2. 7. fej ezetben tárgyalj uk.

89

A citrátciklus szabályozása. A ciklust feltöltő (anaplerotikus) reakciók A c itrátc iklus reakc ió i mind az anabo lizmus, mind a katabo lizmus szempontjábó l központi reakc ióutak, ezért a c iklus szabá lyozása kül önböző ene rgiaállapotoknak kell , hogy megfeleljen. A szabályozás összehangolt mind a c iklust bevezető piruvát-de hidrogenáz komplex, mind az oxidatív foszforiláció regulációj áva L A fő zabályozási pontokat részint az irreverzibilis reakciókat katalizáló enzimek - citrát-szintáz, izocitrát-dehidrogenáz, a lfa-ketoglutarát-dehidrogenáz - aktivitásának, részint az oxálacetát kencentrációjának változtatása j elentik (2-46. ábra). A NADH/NAD+, valamint az ATP/ADP arány a ciklus legfontosabb kontrollja, a NADH, illetve az A TP optimális képződésének igénye szabja m eg a ciklus müködését. Az irreverzibilis reakciókközü l a citrát képződé­ se a citrát-szintáz aktivitásán, illetve részben az oxálacetát-koncentráció vá ltozásán keresztül szabá lyozott. A citrát-szintáz allosztérikus gátló zerei az ATP, NADH, valamint a zsíracii-CoA. Ez j ól dem onstrálja a c itrát szintézi ének kettős funkciój át: egyré zt szerepét a katabo lizmusban, másrészt a c itrátszintézis és a zsírsavszintézis összefúggését. A c iklus intetmedierjcinek koncentrációeme lkedése szintén gátló hatású, a szukcinii-CoA a citrát-szintáz allosztérikus gátlój a. A c itrát-szintáz a llosztériku aktívátora az A DP. A citrátciklus katabo likus részének bevezető, cbbe n az irányban elkötelező lépését, a másodi k irreverzibilis reakciót katalizáló izocitrát-dehidrogenáz aktivitását el sősorban az ATP/ADP, illetve 1 a N ADH/NAD arány szabá lyozza. Az a llosztérikus szabályozásban a legfontosabb aktivátor az ADP, míg az ATP, illetve NADH az izocitrátde hidrogenáz allosztérikus gátló i. Ez szoros összefüggésben van az akceptor kontrol lal. Az A DP-ke ncentráció eme lkedése így nemcsak az oxidatív foszforilációt és ezen keresztül a terminális oxidációt gyorsítja, hanem biztosítja a terminális oxidáció fokozott redukáló ekvivalens szükségletének kie légítését is. Ha az A TP-koncentráció emelkedik, a terminális ox idáció ennek következtében lassul, ezért a NADH oxidációj a csökken, az izocitrát ox idációj ának sebessége visszaszorul. A citráttermelés ettő l függetlenül

90

l'iY GC ERE

piruvát

oxálacetát

l

malát

t \

fumarát

2-46. ábra. A citrátcik lus szabály ozása. Vastag fekete nyilak: a ciklus reakciói; vékony fekete nyilak: gátlás, vékony piros nyilak: serkenté s

még folyhat , a piruvát-dehidrogenáz a kétszintű szabály ozás miatt még aktív állapotban lehet. llyenko r a termelődő citrát inkább bioszin tézisre, energiaraktározásra fordítódik. A harmad ik irreverzibilis lépést katalizáló alfaketogl utarát- dehidr ogenáz enzimk omplex a piruvát-dehidrogenáz komple xhez hasonló an szabályozott. Ebben az esetben azonban nincs kétszintű szabály ozás, hiányzik a kináz, illetve foszfatáz által kataliz ált foszfor ilációs -defosz forilác iós mechanizm us. A komple x aktiv itását gáto lja az ATP és a NADH , valami nt a szukcinil-CoA és a GTP. Izomsz övetbe n - ahol a Ca2 t -ionok szerepe igen jelentős a kontrak ció mechan izmusá ban, a kontrakció viszon t ATP-t fogyasztó folyam at - a piruvát -dehidr ogenáz komple x, az izocitrát-deh idrogenáz és az al fa-ketogl utarát-dehidrogenáz aktivitását Ca 2 ~ ionok fokozzák. Ez az összeh angolt Ca 2 +-fúggő reguláció másszö vetekb en is kialalru l. A szabály ozás másik fontos szempo ntja az oxá lacetát koncen trációjá nak alakulása. A citrátkö r

intermedierjei egyben bioszintetikus prekurzorok is, ezért igen fontosa k a ciklust feltöltö (anapleroti kus) reakciók. Ezek emelik , illetve biztosítják az oxálace tát mennyiségét. A legfontosabb ana p lerotiku s reakció a piruvát~ oxálact>tát átalaIru Jás. A reverzibilis reakció t a piruvá t-karbo xiláz katal izálja: piruvá t+ HC03- + ATP +-t oxálac etát + ADP + Pi E l sősorban

a glukóz de novo szintézisére képes májban , illetve vesében fontos ez a reakció, mivel a keletkezett oxálac etát glukoneogenezis intermedierként közvet ve elhagy hatja a citrátkört (lásd 2.2. fejezetet). A piruvát -karbox iláz C0 2 fixálást katalizál, prosztetilrus csoportja a biotin. Az enzim allosztérikus serkentője az acetii-CoA. Emelkedett acetii-C oA-kon centrác ió serkenti a piruvát ~ oxálace tát átalaku lást, így a ciklus több acetil-C oA-t képes felvenni.

.,

BIOENERGE TIKA

További anaplerotikus lehetőség elsősorban szívben és vázizomba n a foszfoenol -piruvát-k arb<,xikináz által katalizált reverzibilis reakció: foszfoenol-piruvát + C0 2 + GDP~ oxálacetát + GTP Anapieretikus szerepe lehet a malát (almasav) enzim által katalizált reverzibilis reakciónak is: piruvát + HC0 3- + NAD(P)H ~mal át + NAD(Pt Anapieretikus reakciók közé sorolható még a glutamát oxidatív dezaminálá sa is (lásd 2.4. fejezet), amit a glutamát-d ehidrogen áz katalizál. glutamát + NAD(Pt ~ a.-ketoglutarát + NAD(P)H + H++ NH/

A piruvát-d ehidrogen áz csökkent működésének klinikai vonatkoz ásai

A piruvát-dehidrogenáz müködéséhez több vitamin szánnazéka is szükséges. B 1-vitarrun (tiamin) hiányában a piruvátoxidáció, így a glukózoxidáció zavara alakul ki. Ez a beriberi kór tünetegyüttesét okozza, többek között gyengeséget, idegrendszeri és kardiológiai tüneteket. A betegség tökéletlen, tiaminhiányos táplálkozás miatt gyakran olyan helyeken lép fel, ahol alacsony tiamintartalmú rizs a fő táplálék. De kialakulhat alkoholistáknál is, a rendszerint nem megfelelő táplálkozás miatt. A piruvát-dehidrogenáz csökkent működése, a tiamin hiánya a glukózoxidáció súlyos zavarát okozva elsősorban az agy működését veszélyezteti. Az agy fő energiafetTása a glukóz.

Piruvát-dehidrogenáz csökkent müködésével járó állapotokban a glukóz nem alakulhat át acetil-CoA-vá, ezért csak a glikolízisben tud ATP termelödni. Ez komoly tüneteket, eszméletvesztést, kómás állapotot is okozhat. A keletkezett piruvát nem tud továbbalakuln i, Jaktát képződik, a laktátkonce ntráció emelkedik, laktátacidosis jön létre (lásd ll 6. oldal). Ilyenkor egy B 1-vitamin nélkül adott glukózinfúzió csak súlyosbítia az állapotot, rnivel fokozza a laktátacidosist és fatális kimenetelű lehet. Alkoholisták esetében az acidosist csak fokozza az ilyenkor fellépő ketosis. A piruvát-dehid rogenáz c ökkent müködésc gyerckkorban fel l épő, neurológiai tünetek esclén gyakran halálos kimenetelű beteg ég. A piruvát-dehid rogenáz komplex különbözö összetevőinek károsodott expre sziója o kozhat klinikai tüneteket. Az emelkedett szénunlaktát-, -piruvát-, -alaninszint krónikus laktátacidosissal jár. A piruvát-dehidrogenáz funkciójának kicsé c miatt az anaerob metabolizmus válik dominánssá, mivel a citrátkör nem jut elegendő mennyiségbcn acetil-CoA- hoz. Az acetil-CoA hiányos képzödését ketogén diétával lehet részben ellen úlyozni, illetve csökkentett zénhidrátbev itcllel lehet egyes e etekben javulást elérni.

Anaerob körülmény ek természetesen nem teszik lehetövé a katabolizmus három szakaszát. A redukált koenzimek nem oxidálódnak a légzési láncban. Az aerob és anaerob anyagcsere "elágazási pontja" a piruvát (lád 2.7. fejezetet). Ha egyes aerob sej ttípusok anaerob viszonyok közé kerülnek (pl. elégtelen Orellátás izomkontrakciók esetén), energiaigényüket csak egy inkomplett ox idáció - glikolizis - megvalósításával képesek fedezni , amelynek legoxidálta bb molekulája a piruvát. Anaerob sejtek és organizmusok, így az emberi szervezet azon sejtjei, amelyekben nincs mitokondrium (pl. vörösvértest), energiaigényüket csak glikolízissel fedezik.

A fejezet megír ásáva l kapcsolatba n tett j avaslatokért és kritikai megjegyzése kért a sze rző köszönetet mond Dr. Bánh egyi Gábornak, Dr. Braun Lászlónak, Dr. Csermely Péternek, Garzó T a másnak, Dr. Kö nig Tamásnak, Dr. MüUner Nándornak és Dr. Tóth Miklósnak .

.2.

A szénhidrátok anyagcseréje

Adám Veronika és Mandl József

A szénhidrátok a szervezet számára a lapvető tápanyagok. Anyagcseréjük központi folyamata a glikolízis, amelyben a g lukóz piruváttá oxidálódik. Ebből anaerob körülmények között laktát, aerob körülmények között pedig aceti l-CoA-n keresztül C02 és H20 keletkezik. A sejtek a glukoneogenezis folyamán nem szénhidráttermészetü anyagokból glukózt képesek szintetizálni. A glukóz mellert fontos egyéb szénhidrátok melabolizmusa is ezekhez a folyamatokhoz csatlakozik, illerve a szervczctbcn keletkezö szénhidrátok zintéLisc innen indul.

A glukóz a glikogenezisben glikogénbeépül be, raktározódik és innen rnobilizálható (glikogenolízis). Pentóz-foszfátok képződnek a glukóz direkt oxidációja során. Mindezeket a folyamatokat vázlatosan a 2-47. ábrán j elezzük és ebben a fejezetben tárgyaljuk.

A legfontosabb szénhidrátok és tulajdonságaik A szénhidrátok aldehid- vagy ketocsoportot tartalmazó több szénatomos molekulák, amelyek mi.nimálisan két vagy több alkoholos OH funkciós csoportot tartalmaznak. Osztályozásuk több szempont szelint történik: O A fenti definíciónak megfelelő legkisebb egységek a monoszacharidok. Két monoszacharidból összekapcsolt molekulák a diszacharidok, több monoszacharid-egységet tartalmaznak az oligoszacharidok, míg több száz, illetve ezer monoszacharidbó l épülnek fel a poliszacharidok.

6 A monoszacharidok a jellegzetes funkciós csoport szerint lehetnek aldózok (aldehidet tartalmaznak) vagy ketázok (ketont tartalmaznak). @ A molekulát fel építő C-atomok száma szerint a monoszacharidok lehetnek: triázok (3 C-atom), tetrózok (4 C), pentózok (5 C), hexózok (6 C), heptázok (7 C). O A diszacharidok redukáló tulajdonságuk alapján két fő csoportra oszthatók: redukáló és nem redukáló diszacharidok. 0 A poliszacharidok két fő csoportot képeznek: a homopoliszacharidok azonos monoszacharidegységekbő l , a heteropo liszacharidok különböző monoszacharid-egységekből, illetve azok származékaiból felépülő polimerek.

Monoszacharidok. A monoszacharidok szerkezetileg legegyszerűbb képviselői a triózok: a glicerinaldehid és a dihidroxi-aceton, az előbbi aldotrióz, míg az u tóbbi ketotrióz. A glicetinaldehid királis molekula, tartalmaz egy a~zirnmetri­ kus C-atomot, a dihidroxi-aceton nem. A glicerinaldehid két sztereoizomér módosulata D-, illetve L-glicerinaldehid.

H"

H-

c

\ ~o

~o

C-

c

OH

D-glicerinaldehid

HO -

C-

H

L-glicerinaldehid

ZÉ~HIDRÁTOK ANYAG SERÉJE

~z

t ---:e

ll
Gf..tl(,

UDP-glukóz ~

f

0G€tvo

glu öz-1-foszfl:\t ~ •

1

ltl

•

gb1kóz.."6-foszfá t

GLUKÓZ DIREK TOXIDÁCIÓJA

l~l

14.

l l l l l l l

l l l l l l l

.l

,

r~ l

fruktóz-6-foszfát

glikoproteinek, proteoglikánok szénhidrátlánca

pentöz-foszfáto k

§l z ~~ .....l

L<9 J

piruvát

f/ " ;

laktát

acetil-GoA

~ CITRÁTKÖR

•

ATP-szintézis

2-47. ábra. A szénhid rát-meta bolizmu s fő útjai

A további monoszacharidok egy vagy több kiralitáscentrumot tartalmaznak, így különböző sztereoizomér ek léteznek. Rendsz erezésü k alapja, hogy kémiai reakciók útján melyik glicerina ldehid-konfigurációból szárma ztathat ók, illetve melyikké bonthatók le. Ezek alapján D-, illetve L-konfigurációval rendelkező monos zachari dokat különböztetünk meg. Általános szabály ként elfogadott, hogy a D-, illetve L-konfiguráció úgy állapítható meg, hogy a karbonil szénato mtól legtávolabbi kiralitáscentrum körül a konfiguráció a D- vagy L-glice rinalde hiddel megegyező. Az emberi szervezetben a o-mono sza9ha ridok forduln ak elő , legfont osabb képviselőik szerkez etét vázlatos formában a 2-48. ábra mutatja be. Ha két monoszacharid csak egyetlen kiralitáscentrum körüli konfigu rációba n tér el egymás tól,

azokat epimer eknek nevezik. Ilyen epimer ek pl. a D-gluk óz és a D-mannóz vagy a D-gluk óz és a D-galaktóz. Vizes oldatba n az aldehid - vagy a ketocso port egy távolabbi (4. vagy 5.) szénato m alkoho los OH-cso portjáh oz térben közel kerül és félacet ál vagy félketál jön létre, amely a molekula egyidejű gyűruvé záródá át is maga után vonja (2-49. ábra). A glukóz bemuta tott gyürüs (ciklusos) félacetálszerkez ete a heterociklusos piránmolekulára emlékeztet, illetve abból szárma ztathat ónak is felfogható, piranóz típusú monoszacharid. Ezzel szembe n a D-ribóz ugyanilyen reakció követk eztében a furánhoz hasonló 5 tagú gyűrűt, ciklusos félacetál t alakít ki: furanóz típusú monoszacharid. A D-fruktóz szintén furanóz típusú szerkez etet formál azzal a különbséggel, hogy a reakció ciklu-

CHO

CHpH l C -= 0

~

CHp H

l

CHp H o-g licerioaldehid

dihidroxiaceton

CHO

F

CH pH o-eritróz

CHO

CHpH l C=O

~

CHp H l C=O

F

CH 20 H

i-

CH20H o-ribóz

o-ribulóz

--

CHO

l

CHp H

CHO

1

CH20 H

CH20H

CHO

~

CHp H

CHO

i

CHp H

o-xilulóz

CHp H l C= O

i=

CHP H

o-glukóz

o-mannóz

o-galaktóz

o-ldóz

~-----------

-~----------~

o-fruktóz

CHP H

l

C= O

1

CHp H

o-szeduheptulóz 2-48. ábra. A szervezetben helyzetét jelzik

előforduló

legfontosabb monoszacharidok. A képletekben vízszintes vonalak az OH-csoportok

sos félketált eredményez (2-50. ábra). A ciklusos félacetál, illetve félketál létrejöttének van egy további következménye, nevezetesen az eredeti C=O csoport szénatomja a reakció után egy újabb kiralitáscentrummá vált, a hozzá kapcsolódó OH-csoport viszont a többi alkoholos OH-csoporthoz ké-

pest némileg e l térő tu lajdonságokkal rendelkezik. Ezért megkülönböztetés ül glikozidos OH-csoportnak nevezik. A glikozidos OH csoport térbeli elrendezödése újabb két konfigurációt eredményezhet, ezeket anomereknek nevezik. Ha a glikozidos OH a

95

SZÉ~HID RÁTOK AI\ YAGC ERÉ:JE

2-49. ábra. o-glukóz C~OH

l

C-

~~8

0

c

\

c/

'-.... H

H/ ' \OH l l

OH

c- c l

l

OH

H

gyűrűvé

nyílt szénlán c

zárt

2-50. ábra. a-o-ribof uranóz (a) és a-D-frukt ofuranó z (b)

OH

OH

OH

b

a

J----~ 0

H

OH

H

OH

p-o-gluk óz

a-D"QIUkéíz.

(glukop iranóz)

o

OH

a-o-fruk tóz

2-51. ábra. a- és p-anome rek

OH

H

H

p-o-fruktóz (fruktofu ranóz)

~ OH

H

96

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))}))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))>))))))))))))))})))))))))))))))})))))))>))))))))))

o-konfigurációt meghatározó c-atomon levő OHcsoporttal azonos térálLású a-anomer, ha ellentétes ~-anomer (2-5 J. ábra). A glikozidos OH egy másik molekula (pl. monoszacharid, aminosav, egyéb molekulák) alkoholos vagy egymá ik monoszacharid glikozidos OH-csoportjával acetált, illetve ketált képez kondenzáció útján. Az így kialakult vegyü leteket összefoglaló néven glikozidok:nak, ún. "0"-glikozidoknak nevezik. Aminokkal a monoszacharidok glikozidos OH-ja szintén kondenzác ióval "N"-gli kozidokat képez (pl. purin- vagy pirimidinbázisok ri bózzal vagy dezoxi-ribózzal). [A teljesség kedvééit megemlítjük, hogy tioalkoholokkal (-SH) "S"-glikozidok jönnek létre.] Az aldehid-, illetve ketocsoport megfelelő redoxpartnerrel reagálva alkoholos OH-vá redukálódik polialkoholt, ún. cukoralkoholt eredményezve (pl. ribóz~ribitol, glukóz~glucilol, másik

ANYAGCSERE

neve szorbitol). Ezeknek a vegyületeknek az orvosi gyakorlat szempontjából nagy jelentősége van, ugyanis cukorbetegek részére pL aszorbitol (szorbit) mesterséges édesítőszerként kerül alkalmazásra. Ha a glukóz aldehidcsoportja karboxillá oxidálódik glukonsav keletkezik (anionja a glukonát). A karboxiicsoport az aldehiddel kapcsolatban leírtakhoz hasonlóan reagálhat a C5 OH-csoporttal észtert képezve. Ez a reakció ismét gyűrűzáródás­ hoz vezet, belső észtert, ún. laktonszerkezetet hozva létre (pl. glukonolakton, 2-52. ábra). A primer alkoholos OH-csoport oxidációj a ún. uronsavakat (anionjaik az uronátok) eredményez (2-53. ábra). Az anyagcsere-folyamatokban a monoszacharidok nagyon jellemző reakciója a foszforsavval alkotott észterképzés. A heteropol iszacharidokban monoszacharidok kénsavas észterei is megtalálbatóak.

2-52. ábra. o-glukonát és o-glukonolakton

o"

c

~o

CH2 0H

o

l

H-C-OH

~o

l

HO - C - H

l

H - C - OH

OH

l

H-C-OH

l

H

CH2 0 H

OH

2-53. ábra. Uronsavak

o

o OH

OH

H H

OH

B-D-glukuronsav

OH

H

OH

H

H

OH

~-o-galakturonsav

H

ZÉ. IfiDRÁTOK .\ 'I Y ·\ CCSERÉJ E

>))) )))))))) )))))) ))))>))) )))) )))))))))))))))) )) )) )))))))))))))) )))))) )))) )))))))))))))))))))))) )))))»> )))) )))))))) )))) )))>))))))))))))

97

g lukóz, illetve galaktóz aminoszármazéka a heteropoliszacharidokban fordul e l ő, a melyekben a hexóz C2 OH-csopOitját -N H2 szubsztituálja. Ennek további változata az ecetsavval alkotott amid (2-55. ábra). A glikoprote inek a lkotórésze az N-acetil-neuraminsav (sziá lsav, 2-56. ábra). OH

H

2·54. ábra. 13-2 -dezoxi-D-ribóz

A monoszacharid- zármazékok közül fonto ak az ún. dezox i-monoszacharidok. Legismertebbb képviselőjük a ~-2-dezoxi -D-ri bóz (2-54. ábra). A

Táplálkozási szempontból fontos diszacharidok. Három fontos diszaeharid érdemel említést: a szacharóz (nádcukor), a ma ltóz és a la któz (tej cukor). A maltóz és a laktóz redukáló diszacharid, ugyanis az egyik monoszacharid glikozidos OH-csoportja "szabad" , nem vesz részt a glikozid (0 -glikozid) kötésben, míg a szacharóz esetében mindkét monoszacharid g li kozidos OH-csoportja a lakítja ki az 0 -glikozidot. (A képletek é a pontos e lnevezés a 2-57. ábrán látható).

2-55. ábra. Glukózamin és acetilszármazékai

NH

H

l l

C= O

13-D-glukózamin

CH3 N-acetii-13-D-glukózamin

2-56. ábra. N-acetil-neuraminsav (sziálsav)

0 HO

O

\.~

c

R:

l

H- C- OH

l l

H- C- OH CH~OH

OH

H

98

ANYAGC. ERE

o ____j OH

OH

0 -u.-o-glukopíranozil-( 1-4)-a-o-glu kopiranó z [Gic (a 1-4)Gic]

ma t

o OH

OH

0 -13-o-galaktopiranozil-( 1-4)-1}-o-glukopiranóz [Gal

2-57. ábra. A diszacha ridok képletét és elnevezé sét azzal a monosza charidda l kez'djük, amelyne k glikozido s OH-csoportja a glikozido s kötés (acetál) képzéséb en részt vesz, más szóval a nem redukáló véggeL Ha mindkét vég nem redukáló tetszőle­ ges sorrendet választhatunk, de pl. a szacharóz esetében az ábrán mutatott konvenció az elfogadott. Az elnevezésben az ,,O" jelentése: 0-glikozid. Az a , illetve p jelölés a monoszacharid anomer konfiguráci óját jelöli. A o betű a o-gltcerinaldehidre vonatkoztatott relativ konfigurációra utal. Az egyes monoszacharidok öt- vagy hattagú gyűrüs szarkezetét is fel kell tüntetni a névben. A zárójelbe tett számok pl. {1-4) jelzik, hogy az 0-g/ikozid-kötés az első és másodtk monoszacharid melyik szénatomJa közölt alakul ki. A diszacharidok részletes, pontos elnevezése meglehetösen bonyolult, nehézkes; ezért általában közismert diszacharidok esetében a pirossal jelzett egyszerűsitett változat (az ún. triviális név) gyakrabban kerül alkalmazásra. Az ábrán a H-atomokat nem tüntettük fel. helyüket rövtd függöleges vonalak jelzik

[p 1-4)Gic]

laktóz

OH

OH

0 -a-o-gluk opiranoz ii-(1-2)-P-o-fruktofuranóz [Gic (a1-2)Fru] szacharó z

Poliszacharidok. Az emlő szervezetekben és a növényekben a szénhid rát tápanya g raktároz ása homopo liszacha rido k formájá ban történik . Növények esetében a polimer kemény ítő , míg emlős állatokban és emberb en a májban és az izomban tárolt glikogén .

Szerkez etét tekintve a sok hasonlóságot mutat.

kem ényítő

és a glikogén D-glukó z monoszach arid-egységekbő l épül fel. A kernényí tőt kétféle polimer alkotja: az amiláz és az amilopektin . Az amiláz felépítés ében több száztól néhány ezerig terj edő számú a-D-glu kóz vesz részt, Mind kettő

'ZÉ'\ HIDRAT OK Ai\\ AGC ERÉJE

>>>>n>>>»>nt>>H>>>»>>>>n»>> >>»>>>>>>>»>>H>>>»>>>>>>>>>>>HU>»>>>>»>>>»>»>»>>>>>>>>>>>>n>»»>H>>>>>>>>>>>»»>>>•n>>

amelyek egymá ssal kizáról ag a l-4 glikozidos kötések révén kapcso lódnak, ugyanú gy, ahogy a maltóz két monoszacharidja. Az egymá ssal kapcsolódó piranóz gyürük egy helikális szerkez etet hoznak létre, amely hélix egy menete melked ését hategy mást követő g lukóz alkotja. Az amilop ektin szerkezete annyiban tér el az amilóztól, hogy a hosszirányú láncot képező minden 24-30. glukózegységnél egy-eg y elágazá s alakul ki. Az elágazásokat szintén 0-gliko zidos kötések hozzák létre, ez viszont a 1-6 kötés (2-58. ábra). A hosszirányú láncban az elágazá si pontba n l évő glukóz C6 alkoholos OH-cso portja és az elágazá st indító glukóz g likozidos OH-cso portja kondenzál.

A glikogén szerkez ete nagyon hasonló az amilopeletin struktú rájához (2-59. ábra) , a különbség csak abban van, hogy a g likogén ben az elágazások gyakoribbak; a hosszanti lánc minden 8-12. glukóz egység énél található egy elágazási pont. Ez termés zetesen egy újabb hosszanti lánc kialakulását teszi lehetöv é, amelyről ugyanilyen gyakorisággal újabb elágazá sok fejlődnek ki. Végül a polime r egy faágra cmlékeztető szerkezetet fonnál , amelyn ek hajléko ny "ágai" egyetlen gömb fonnáb a, granulu mba tömörü lnek (2-59. ábra). A szerkez et ily módon történő kialaku lásából következik, hogy a polime rnek egyetle n olyan vége van, ahol a glikozidos OH szabad (redukáló

o

o

:r:

o

l

OH

2-58. ábra. Elágazá sokat létrehoz ó u 1-6 glikozid os kötések

o

o

o

o

99

OH

OH

l OO

»»>»>»>»>>m>>»>»»>>m»mm »>»>>»>»>»>»>> »>»>»>»>» » >>»»»>mmm»m»>>»»m>>mm»>m>> » » >m>>m»»>»>>>> »mm>mm»>>»m

A. YAG CSE R E

2-59. ábra. A glikogén szerkezete

vég, amely egy fehérjéhez kapcsolódik; lásd később), és nagyszámú, ún. nem redukáló vége, ahol a láncvégi glukóz glikozidos OH-csoportj a a glikozidos kötésben vesz részt. A szénhidrát tápanyag (glukóz) ilyen típusú szerkezetben való raktározása a sejtek számára két szempontból , cé l szerű". A viszonylag nagyszámú g lukózmoleku la monoszacharid formájában a sej ten belül rendkívüli mértékben megnöve lné a magas kancentráció miatt az ozmózis nyomást, míg a polimerbe "bezárva" az ozmózis nyomás változása elhanyagolható mértékű . A polimer faágszerű szerkezetében az a cé lszerűség fedezhető fel, hogy az egyes g lukózmolekulák m egfe lelő enzim által történő beépítése, illetve szabaddá tétele (az 0-glikozid-kötés bontása) egyszerre sok helyen válik lehetövé, az enzimmolekulák számára j obb a hozzáférhetőség.

A szénhidrátok emésztése, felszívódása és a glukóz bejutása a sejtekbe A tá plálékkal elfogyasztott szénhidrátok a gyomor- bél traktusban enzimek hatására monoszacharidokra bomlanak, amelyek a vékonybél hám ejtjein keresztül felszívódnak

Az emésztés a szájüregben kezdődik; a nyálmirigyek által tenneit a-amiláz a poliszacharidokban lévő a l -4 g likozidos kötéseket hidrol izálja. Az a-amiláznak egyaránt szubsztrátja a legfontosabbb növényi eredetű poliszacharid, a keményítő és az állati eredetű glikogén. Az amiláz sem az al -6 kötéseket, sem az elágazásoknál l évő a 1-4 kötéseket nem bon~a. Mivel a táplálék a szájüregben rövid ideig tartózkodik, a gyomorban pedig az amiláz a savas pH miatt inaktívvá válik, a nyálmirigyek által termelt amiláz mennyiségi szempontból kisebb jelentőségű. Fontosabb a pancreas által termelt ugyano lyan hatású a-ami láz, amely nagy feles legben szekretálódik és a duodenumban folytatja a szénilldrátok emésztését. Az a-amiláz hatására a diszacharid maltóz, a triszacharid malto- trióz, és az elágazást is tartalmazó, kb. 8 g lukózból felépülö a-limit-dextrin keletkezik. Ezek hidrolízisét, csakúgy mint a többi diszacharidét, a vékonybél epithelsejtek luminál is membránjában található enzimek végzik. Az enzimek között vannak olyan oligoszacharid ázok, amelyek a 1-4 kötéseket, illetve olyanok, amelyek a I-6 köté eket hidrolizálnak. A megfelelő diszacharidokat a diszacharidázok, azaz a maltáz, a szukráz és a !aktáz (p-galaktozidáz) bontja. A vékonybél lumenében végeredményben monoszacharidok keletkeznek,

IUl

2-4. táblázat. A szénhidrátok emésztésében részt vevő fontosabb enzimek

----

Enzim a-amiláz

Eredet

..

- - 4'"1--

Specificitás

nyálmirigyek, pancreas

vékonybél

a 1-4

oligoszacharidáz

vékonybél

a1-6

r

--

Termék

-

glikogén

maltóz, maltotrióz, a-limit-dextrin

amilóz

glukóz

amilóz, amilopektin,

a1-4

oligoszacharidáz

Szubsztrát

l izomaltóz,

glukóz

a-limit-dextrin malláz

vékonybél

szukráz

vékonybél

lakláz (~-galaktozidáz)

vékonybél

l

amelyek az ileumban szívódnak feL Az emé ztésben részt vevő fontosabb enzimeket a 2-4. táhlázat foglalja össze. A felszívódás (2-60. ábra) az epithe lsejteken keresztül történik és az epithe lsejtek membránjában számos transzporter működéséhez kötött. Az epithelsejtek membránja a különböző felszíneken eltérő összetételLL A mikrovillusokat is alkotó lumináli membrán tartalmazza azokat a Na+monoszacbarid kotr anszpor·tereket, amelyek a glukózt és a ga laktózt az epithelsejtekbe transzportálják A transzporter a Na elektrokémiai g rá-

u.1-4

maltóz

glukóz

a1-~2

szukróz (szacharóz)

glukóz, fruktóz

131-4

glukóz, galaktóz

! laktóz

diense terhére szá llítja a monoszacharidokat a koncentrációgrádiens c llenében a , ej tekbe. (Az ilyen transzporterekre általában és konkrétan még a g lukóz felszívódásra a 4. fejezetben vis n térünk; lásd 436. oldal). A fruktóz transzportját más 1 feh érje végzi, amelynek müködése a Na -tó l H.ig1 getlen. A Na -kotranszporteren kere ztül a monozacharidokka l együtt Na is felszívódik, ez nem elhanyagolható körülmény különösen akkor, amizük éges (pl. cholekor orális elektrolitpótlá rában, lá d 436. oldal). Ahhoz, hogy a glukóz az epithe lsej tekbő l a kapi llárisokba kerüljön, a bazá-

2-60. ábra. A monoszacharidok felszivódásához szükséges transzporterek a vékonybél epithelsejtek membránjában

KAPILLÁRIS

l 02

m> >»>>>»»>m>»>>»>»>»>>>>>>>>>>>»>m»»»>>»>>»»>m>>»m»>m»»>»>>»»>»mm»>»>»>>>m»>»»»>»>»m»m»

lis membránba n egy másik transzporte mek is mű­ ködni kell. Ez egy Na+-tól nem függő transzporte r, s mivel kétirányú, g lukóz ekvilibrium ot biztosít az epithelsejte k és a kapillárisok között. A glukózorr kívül galaktózt, mannózt és dezoxiglukózt is transzportá L llyen, facilitált glukóztran szporterek biztosítják a keringé ből a sejtekbe történő g lukóz felvételt is (lásd alább). Mivel a luminális membránba n található Na 1kotranszpo rter is két irányban képes transzportálni, és az epithelsejte kben a g lukózkonce ntráció magasabb, mint a lumenben, a glukózfelsz ívódás szempontjából kritikus a Na+-grádiens fenntartása . A bazáli s, illetve az interstitium fel é néző membránban helyet foglaló Na-'-K+-ATPáznak az a feladata, hogy a Na~ -t az elektrokémiai grádiens ellenében a sejtbő l kipumpálja (és cserébe K i -t pum- páljon be). Az enzim működésérő l a 4. fejezetben szólunk.

Az epithelsejtek transzporterein keresztül csak monoszacb aridok transzportálódnak, sem a poliszachar idok, sem az oligoszach aridok. sem a diszacharid ok nem szívódnak fel, de normális körűlmények között ez nem jelent problémát, mert a szénhidráto k lebomlása az enzimek nagy feleslegem iatt tökéletes. Előfor­ dul, leggyakrabban a laktóz esetében (mert a !aktáz v1szonylag kis meanyiség ben termelő­ dik), hogy az enzimatiku s hidrolízis nem teljes. Ilyenkor a laktóz a béllumenbe n marad, ez az ozmotikus viszonyok miatt vízvisszata rtást is jelent, amely diarrhoea-t (hasmenés ) eredményez. Az alsóbb bélszakasz okban bakteriális enzimek hatására anaerob metabolizmus történik és gázok keletkeznek, ami kellemetlen tüneteket és diszkomfo rt érzést okoz. Ez az ún. laktózinto lerancia, a tej és tejtermékek fogyasztása után fellépő emésztési panaszokka l jár. (A joghurt általában nem okoz panaszokat , mert benne a laktóz részlegesen már emésztett.) A laktózintoleranciát ritkán veleszületett enzimdefek tus okozza, gyakoribb, hogy valamilyen bélrendszeri rendellenes ség következtében alakul ki (pl. colitis, vírusos gastroenteritis).

» >>>>>>>>>>»>>>»>>»»>>>m>

A :'ll Y G C E RE

A glukóz transzport ja a vérből a sejtekbe. A g lukóz a legfontosab b tápanyag, amelyhez a keringésbő l j utnak hozzá a sejtek. A vérben a glukóz konstans szinten tartása (fiziológiásan - 5 mM) szigorú szabályozá s alatt áll. Az egyes szervekben , am elyek a szénhidrát-anyagcsere szempontjából el térő tulajdonság úak, külőnbőző sajátossággal bíró glukóztranszporterek találhatók (2-61. ábra). Közös bennük, hogy a D-glukóz facilitált, vagyis a koncentráció-grádiens irányába történő transzportját végzik. (Működésük nem Na -függö és nem kapcsolt az ATP hidro líziséhez.) Ezidáig négy olyan glukóztran szporter (GLUT) ismert, amelyek szerkezete, lokalizációja és funkci ója j ól defmiált, de molekulári s bio lógiai módszerekkel ennél több transzporte r kül öníthető el. A GLUT-1 sok szövetben, el sőso rban a vörösvértes tben, de az agy-, izom-, zsírszövetben is rnegtalálha tó, s működése nem függ az inzulintól (inzulinindependens). Ilyen a GLUT-3 is, amely az agyban található, s a GLUT-1-g yel együtt biztosítj a az agy számára elsődleges tápanyagké nt szolgáló glukóz felvételét. A GLUT-2 főleg a májsejtek membránjá ban található, de ilyen transzporte r működik a pancreas P-sejtjeiben, a vesében és a vékonybél-epithelsejtek basalis membránjá ban is. Jellernzöj e a magas Kwérték és a nagy kapacitás, ami különösen a máj sejtek esetében fontos, aho l két irányú transzportot biztosít a koncentrác ióviszonyoknak megfelelően . Magas vércukorsz int esetén a G LUT-2-n keresztül a máj glukózt vesz fel, alacsony vércukorszint esetén pedig a májban de novo szintetizált g lukózt a keringésbe transzportálja. Hasonlóan működík a vesében található GLUT-2, illetve az a transzporte r is, amelyik a vékonybélben a glukóz felszívódás ban vesz részt. A GLUT-4 elsősorban az izom és zsírszövetb en található és az a jellegzetessége, hogy inzulin jele nlétében működik (inzulindepende ns). Megnövekedett vércukorsz int esetén az inzulin ezekben a szervekben fokozza a glukózfelv ételt (lásd még a vércukorsz int szabályozásánál, 133. oldal). A fentieken kívül leírt GLUT-5-rő l kimutatták, hogy elsősorba n nagy affinitású fruktóztranszporter és va lószín ű leg a vékonybélben a fruktóztranszporté rt felel ő . A szintén leírt GLUT-6 pedig j elentős hasonlóság ot mutat a GLUT-3-mal. Feltételezik, hogy a G LUT-7 a máj endoplazm ás retikulum glukóztran szportjáért fel elős fehérje. Azok

ZÉ~IIIDRÁTO K ANYAGCSE RÉJ E

103

2-61 . ábra. Glukóztranszporterek (GLUT) az egyes szervekben

INZULININDEPENDENS

INZULINDEPENDENS

a sejtek tehát, amelyek g lukózt képesek a keringésbe küldeni, így döntően a hepatociták, el sősorban GLUT-2-t tartalmaznak. A glukózigényüket a vérglukózszint terhére kielégitő sejtek a GLUT- l, -3,-4 segítségével veszik fel a glukózt. Ezek közü l azokban a szcrvekben, amelyekben kizárólag (vörösvértest) vagy el sősorban (agy) glukóz a tápanyag, a transzporter működése nem függ az inzulintól (GLUT-1 ,-3). Azok a szervek, amelyek alternatív tápanyagokat is oxidálnak (izom) vagy tápanyagot raktároznak (zsírszövet) csak magas vércukorszint esetén, inzulin hatásáraj utnak hozzá a glukózhoz (GLUT-4).

Glikolizis A glikolízis helye az intermedier anyagcserében A g likolizis során egy molekula glukózból két molekula piruvát lesz; a g lukóz lebontása árán ATP keletkezik. Valamennyi emberi sejt képes glikolízisre. A glukóz a metabolizmus "központi" tápanyaga, mivel minden sejt képes hasznosítani

k épződő és szénvázából a szcrvezetben valamennyi anyag szénváza fel (át)épülhet. A g likolizisben klasszikusan érvényesül a metabolizmus kettős - anabolikus és katabo likus - jellege. A g likolizis (glykys = édes, lysis = hasítás, görög) a legős ibb, univerzális energiatermelő fo lyamat; a katabolizmus három szakaszát tekintve (lásd 2-30. ábra) a glikolízis a glukóz katabolizmusának első, e l őkészitő szakasza. A szervezetet alkotó kü l ö nböző sejttípusok m ű­ ködésükhöz különböző mértékben igényelnek glukózt. A emberi szervezet igénye kb. 160 g glukóz naponta. A központi idegrendszer, az agy sej tjeinek napi g lukózigénye J 20 g, és napi kb. 40 g glukóz fordítódik ATP-szintézisre fó leg azokban a sejtekben, amelyek döntően vagy kizárólag csak a glukóz hasznosításával tudják működésük energ iaszükségletét fedezni. fl yen sejtek a vörö vértestek, a leukociták, a comea, a szem lencse, részbe n a retina sejtjei, a vese velőá llományát alkotó sejtek, a testis sejtjeinek j e lentős része, a mitokondriumokban szegény "fehé r" izomrostok sejtjei. A glikolizis reakciói a sej t energiaállapotától függően anabolikus szerepet is betölthetnek

104

)))))))))))) ))))))))))))))))) ))))))))))))))))) )))))))))))))))))

))))))))))))))))) ))))))))))))))))) ))))))))))))))))) )))))))))))))))))

))))))))))))))))) )))))))))))))))}) )))))))))

A NYAGCS ERE

Interme dierjei több bioszintetikus folyama t ki indulópontjai, illetve több katabolikus folyama t végterméke g likolizis intermed ier. A g likolizis teszi lehetövé anaerob körülm ények között is az ATP-termelést. Aerob körülmé nyek között a g likolizis a piruvátnál "végződik" (aerob g likolízis), anaerob v iszonyo k között a piruvát lakt.áttá reduká lódik. Azokba n a sejtekbe n, aho l nincs mitokon drium (pl. vörösvé rtest), aero b körülmé nyek között is laktát termel ődik . A piruvát így fonto metabolit az aerob-a naerob metabo lizmusban .

A glikolíz is reakció i A glikolí/i~ ' olt az clsö metabolikus út, amelyet mcgi~­ mcrtek a huszadik stúzad e l ső harmadúban. A klass7ikus biokémia nagyjai a glikolizis reakcióinak megismerésén kercs/ti.il j utottak cl snímos. kors7akot formáló biokémia i fel fedczéshc /. H

A g likolizis valamennyi reakciój a a c itoszolba n zajlik le. Számos vizsgálat arra uta l, hogy a g likolizis enzimei a c ito zolban multien zim komplex eket képezne k. Ezek a nem kovalens, stabil komplexek a glikolíz is intermedierek igen gyors "csatornázott" útját, transzferét biztosítj ák egyik e nzimtő l a másikho z. A glikoliz isben hat-, illetve három C-atomo s foszfátv együlete k vesznek részt, amelyekben a foszfát vagy észter-, vagy savanhi dridkötéssel kapcsol ódik az intermedierekhez. A foszforiláció a g likolízis e l ső lépésébe n megtörténik, s mivel a keletkező és minden további intermedier negatív tö ltésű, számuk ra a plazmamembrá n nem permeábilis. Ez biztosítj a, hogy a sejtet nem tudj ák elhagyn i. A hat C-atomo s hexózok (valame nnyi D-izome r) részvételével folyó reakciók j e lentik a g likolizis l . szakasz át (2-62o ábra), a három-C -atomos gliko lizis interrne dierek reakciói a 2. szakaszát (2-62b ábra). A g likolizis t reverzibilis és irreverz ibilis reakciók alkotják .

OH

glukóz-6-foszfá t

foszfogl ukóz· izomerá z

+t

OH fruktóz-6 -foszfát

v - - ATP

~ ADP

OH

H

fruktóz-1,6-biszfo szfát

t+

aldoláz /}'O

®-o-CH2-TH - ~ OH 2-62. ábra. (a) A glikolizis folyamat ának első szakasza (glukóz ~ glicerina ldehid-3- foszfát). (b) A glikolizis folyamatán ak második szakasza (glicerina ldehid-3- foszfát

) piruvát)

foszfofru ktokináz l

®-O-CH 2

H

C- CH2OH 11

O

glicerina ldehid3-foszfát

+ dihidroxi acetonfoszfát

ZÉ HIDRÁTOK t\ . YAGCSERÉJJ::

b

O

'\:/

» >»>»))>H>>>» >>>>>>>>>> >>>>>»H>>>l)>>>>>>>>>>>>>>»>>>>»>H»>>> >>» » >>>>>>>>>»>n» H>>))>H~ ~·>>>H>>>>>>>>> >H>>>>> >>>>>>

tnázfoszfátizon'\eráz

H

CH20H

l l

C= O

l l

H-C-OH

CH 2 - 0 - ®

CH2 - 0 - ® dihidroxi-aceton-foszfát

glicerinla ldehíd;3-foszfát t:: NAD+

glicerinaldehid-3-foszfátdehidrogenáz

NAD!H+ H•

®

o~

o

y l

H-C-OH

l

CH2-o- ® 1,3-biszfoszfoglicerát

o

l

~ADP

~ATP

V

foszfoglicerát-kináz

o-

l

H-C-OH

l

CH2 - 0 - ® 3-foszfoglicerát

t~

foszfoglicerát-mutáz

2-foszfoglicerát

~~Hp

eno láz

-----

ADP ATP

\!

_ _. laktát

................aerob

piruvát-kináz foszfoenolpiruvát (PEP)

o'o

3~'3e;.---

................

piruvát

.........,. acetil-GoA

105

106

»

)) )))))))))))))))))))) )))))))) )))) )))))) )))))))) )) )))))))) )))))))))) )))))) )))))))))))) ))>))))))))) )))))))))))))) )))) )))) )))) )))))))))))))) )))))) )) )))))))) )))))))))) ))))))))

ANYAGCSERE

A két enzim (izoenzimek) között fontos funkcionális különbség van. A hexokináz nem specifikus glukózra, a glukokináz viszont csak glukózt foszforilál. A hexokináz müködését a reakció végterméke, a glukóz-6-foszfát allosztérikusan gátolja, a glukokinázét nem. A gátlás nagy jelentőségű a szervezet glukóz-anyagcseréjében. A hexokináz KM-értéke 0,1 mM, a vércukorszint4,5 mM. A vércukorszint szabályozatlan hexokinázaktivitás esetén igen gyorsan leesne. A glukóz-6-foszfát fontos elágazási pont az intermedier rnetabolizmusban (lásd 2.7. fejezetet). reverzibilis reakcióban alakul át fruktóz-6-foszfáttá, ami szintén több enzim szubsztrátja lehet. A reakciót a foszfoglukóz-izomeráz (foszfohexózizomeráz) enzim katalizálja. A fruktóz-6-foszfát foszforilációja fruktóz-l ,6-biszfoszfáttá a foszfofruktokináz I által katalizál t, irreverzibilis reakcióban a glikolízis elkötelező lépése:

katalizált reverzibilis reakcióban átalakulhat egymásba (2-62b ábra). A glikolizis során a glicerinaldehid-3-foszfát alakul tovább; oxidációja, illetve foszforilációja a következő lépés. Ezt a reverzibilis fo lyamatot a D-glicerinaldehid-3foszfát-dehidrogenáz katalizálja. A dehidrogenálás koenzime a NAD+. A gl icerinaldehid 3-foszfát-dehidrogenáz SH enzim, ezért monojódacetáttal gátolható. Aktív centruma ciszteint tartalmaz, s ezen keresztül kovalens kötéssel köti meg az aldehidcsoportot (2-63. ábra), amely a reakció folyamán karboxi lcsoporttá oxidálódik, miközben NAD+redukálódik. A kialakuló intermedier magas csoportátviteli potenciálú tioészterkötéssel kapcsolódik az enzimhez. Az oxidoredukció során szabaddá váló energia teszi lehetövé a makroerg tioészterkötés létrejöttét. A következő lépés foszforolízis, a karboxiicsoport egy foszfátcsoporttal magas csoportátviteli potenciálú vegyes savanhidridkötést képez, így a létrejövő l ,3-biszfoszfoglicerát egy savanhidridés egy észterkötésben tartalmaz foszfátot. A foszfoglicerát-kináz a magas csoportátviteli potenciálú foszfát átvitelét katalizálja ADP-re, s ez a glikolízis első reakciója, amelyben ATP keletkezik.

fruktóz-6-foszfát + ATP~ fruktóz-l ,6-biszfoszfát + ADP

1,3-biszfoszfoglicerát + ADP~ 3-foszfoglicerát + ATP

A fo ·zfofruktokináz ll a fruktóz-6-foszfát fruktóz-2,6biszfos?tattá történő foszforilációját katalizálja (lásd l 20. o ldal).

Ez a reakciósorozat anaerob körülmények között is végbemenő szubsztrátsziotű foszforiláció, ami azt jelenti, hogy ATP keletkezik közvetlenül egy reakcióban, a légzési lánctól fúggetlenül.

A glukóz foszforilációját glukóz-6-foszfáttá a hexokináz és a glukokináz katalizálja. A hexokináz minden sejtben megtalálható, a glukokináz azonban csak a máj parenchymasej tjeiben. glukóz+ ATP~ glukóz-6-foszfát + ADP

A foszfofTuktokináz I aktivitását több allosztérikus aktivátor és inhibitor szabályozza. A leghatékonyabb aktivátor a fruktóz-2,6-biszfoszfát, melynek szerepét a glikolízis és a glukoneogenezis hormonális szabályozásánál tárgyaljuk. Allosztérikus aktivátor még az AMP; inhibitor az ATP (szubsztrát!), a citrát és a zsírsavak. Ez a glikolízis legfontosabb szabályozási pontja. A keletkezett fruktóz-l ,6-biszfoszfát két triózfoszfátra hasad, amelyek közül az egyik, a glicerinaldehid-3-foszfát, aldóz, a másik, a dihidroxi-aceton-foszfát, ketóz. A reverzibilis reakciót az aldoláz katalizálja. Ezzel a lépésset lezárul a glikolízis első szakasza, amelynek során a glukózból két 3 C-atomos termék keletkezik (2-62a ábra). A két triózfoszfát, a triózfoszfát-izomeráz által

Az arzenár (HAsO/ ) képes a P,-l helyettesíteni. ezért az arzenát szintén kötődik a glicerinaldehid 3-foszfát-dehidrogenáz P; k ötőhcl yérc. Ha arzenál kötődik a reakcióban az enzimhez P, helyett. 1-arzenato-3-foszfoglicerát keletkezik, így ne m képzöd ik A TP. A képződ ött arzenál vegyes sa vanhidrid, nem stabil, bomlékony, pontán továbbalakul 3-foszfogliceráttá és a glikolizis fol ytatódik. Az arzenát így "szétkapcsolja" a glikolízist és a szubsztrátszintü foszforilálás t. Az arzén további formája az arzeni t (As0 2.) már olyan e nzimekhez kötödik, melyek liponsav koenzimmct működnek (piruvát- dehidrogenáz, a-keto-glurarát-dehidrogenáz), és bénítja azokat. Mindezen hatások miatt az arzén mérgezö.

A képződött 3-foszfoglicerát 2-foszfogliceráttá alakul a foszfoglicerát-mutáz által katalizál t reak-

SZÉ HIDRÁ TOK Al'iYAGCSERi!:JE

))))))))))))) ))))))))))))) ))))))))))))) )))))))))))))

CH2 -0-®

)))))) ))))))))))))) ))))))))))))) ))))))))))))) )))))))))))))

))))))))))))> '))))))))))

107

CH2- 0 - ®

l

l

H-C- OH

H-C- OH

l

l

C= O H/

ros/

glicerinaldehid-3-foszfát

(tiofélacetál)

H-C- OH

CH2 -0- ®

~

l

H-C- OH

l

C= O

cr-J (tioész ter)

NAD

NAD

CH2

l

-o-®

H- C -OH

l

C= O

"-"\

o'-'\

® 1 ,3-biszfoszfoglicerát 2-63. ábra. A glicerin aldehid -3-fosz fát-deh idrogen áz enzim által

cióban. A 2-foszfoglicerátból a 2-foszfoglicerátanhidratáz, ismertebb, triviális nevén az enoláz enzim hatására foszfo enolpi ruvátj ön létre. Az enoláz aktivitása fluoriddal gátol ható. A víz kilépésével egy magas csoportátviteli potenciálú enol-f oszfát észter keletkezik. A 2-fosz foglice rát esetében a 0 foszfátcsoport hidrolízisek or a t1G • étték - 17,6 kJ/mol, ugyanez az érték a foszfoenolpiruvát esetében - 61 ,9 kJ/moL (közel kétszerese az A TP hidrolízisekor felszabaduló energiának). A foszfoenolpi ruvát ezt a magas csoportátvite l i potenciál ú

kataliz áll reakció (a piros-j el makroerg kötést szimbolizál)

kötésb en levő foszfátot képes az ADP-r e átvinni a piruvá t-kiná z enzim segitsé gével. foszfoenolpiruvát + ADP ~ piruvá t + A TP

Ez a foszforiláció szintén szubsztrátszintü foszforilác ió, azonb an az előző reakcióval szemben irreverzibilis folyamat. A piruvá t-kiná znak az A TP allosz térikus inhibitora.

108

))))))H)))))))}))>)))> >»h))>)H)))))))>)))) )))))))U))))H)o)))))) ))))))))))))))))))))))))

)))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))} )))))))))))))))))))))))) ))))))))))

A~YAGCSE:RE

2-64. ábra. A piruvát > etanol átalakulás a mikroorganiz musokban folyó anaerob glikolizisben

co2 piruvát _ _ _ _ /:..__ __..., piruvát-dekarboxiláz

alkohol-dehidrogenáz

A keletkezett piruvát további sorsa a sejt típusának, illetve oxigénellátottságának függvénye. Aerob viszonyok között a keletkezett piruvát zöme aceti l-CoA-vá alakul (lá d citrátciklus). Anaerob körü lmények között a piruvát laktáttá redukálódi k. A laktát-dehidrogenáz által katalizált reakció reverzibi lis, koenzime a NADH (lásd 2- l O. ábra). Folyamatos glikolízisben a glicerinaldehid 3-foszfát ox idációjához folyamatos NAD--ellátás szükséges. Ha a keletkezett NADH nem tud a mitokondriwnb an oxidálódni, (mert a sej t nem tartalmaz mitokondri umot vagy nincs e l egendő oxigén) a NADH a laktát-dehid rogenáz hatására oxidálódik vissza, ezért ilyen körülmény ek közötte reakció a folyamatos glikolízish ez nélkülözhetetlen. Ugyanakko r a laktát a glikolízis végtermék e, amely csak úgy tud tovább alakulni, ha visszaoxidálódik piruváttá. Ehhez viszont éppen NAD+ szükséges. NAD akkor ál l újra rendelkezésre, ha ismét aerob körülmény ek vannak . Ha erre nincs mód , a laktát szecemálód ik a vérbe, ahonnan aerob sejtek veszik fel (lásd Cori-kör, l L5. oldal). A szérumlakt át-szint a szervezet anyagcseré jének fontosjelle mzöje, emelkedés e fontos patológi ás állapotok j elzője. Egyes mikroorgani1mu okban az anaerob glikolizisnek egy másik formája, az alkoholos erjedés megy végbe. A piruvát-dehiJ rogenáL által katalizáll reakcióhoL hasonlóan a piruvát clö~1.Ör dekarboxilálódik a piruvát-dcka rboxiláz hatúsára (ennek TPP tiam in-piro fos7fa t - a prost:tctikus csoportja). EL a dckarboxile1é aLonban nem oxidatív. a kcletkeLett ac-etaldehid második lépésben az a lkohol-dehid rogenáz hatására NADI I segítségével etanollá redukálódik (2-64. úhra).

A glikolízis energiamérlege. A glukóz aerob és anaerob lebontásának energiamérlege A glikolízi során anaerob körülmény ek között egy moleku la glukózból 2 moleku la laktát keletkezik, két ADP foszfori lálódik ATP-vé:

glukóz + 2 P,+ 2 ADP ~ 2 laktát + 2 ATP + 2 H 20. Aerob körülmények között ez a folyamat másként alaku l: glukóz + 2 P,+ 2 ADP + 2 NAD ~ 2 piruvát + 2 ATP +2 H~O +2 NADH + 2H ' egy molekula glukóz lebontása 2 A TP-t, 2 NADH-t és 2 piruvátot eredményez. A két NADH attól fiiggően, hogy milyen transzportrendszeren jut el a mitokondriális elektrontranszport-lánchoz (lásd később), 4 vagy 6 ATP-vel egyenértékű, így 6-8 ATP képződik aerob körülmény ek között. A két piruvát lebontása a piruvát-dehidrogenáz komplex által , illetve a citrátkörben 2x4 NADH-t (24 ATP), 2x l FADH:!-t (4 ATP), 2 GTP-t, összesen 30 A TP-t jelent. Így egy rnolekula glukóz aerob oxidációja (C02-dá és H20-zé) összesen 36- 38 ATP termeléséhez vezet. A standard zabademalpia-vállozá ok értékei alapján törszámítások zerint:

ténő

glul-.óz ~

co~

+

11~0.

~Gu - 2840 kJ/mol, illetve

3 ADP + 38 P,-d8 ATP. ~Gtr= 38 x 30.5 kJtmol = l 160 kJ/mol. ct kb. 40° o-os hatásfok ot jelent. a glukó.~: energiájának 40%-a .,őrLődik'' így meg ATP formájában. A való ágban ilyen zámítások végLése rendkívül bonyolult. mivcl az aktuális konccntráció ' iswnyok értékei alapján aL ADP foszforilációjának tényleges energiaigényét nem könnyü meghatározni. llasonló s7ámítások alapján egy molekula glukóz 2 molckula piru\.<áttá alakulásához (illetve a két rnolekula AD' rcdukciójáhoL), mint exergonikus folyamathoz ( Gu- - l 46 kJ/mol) két molekula A DP foszforilációját ( G0 . = 2 x 30.5 kJ rnol = 6 1 kJ mol}, mint endergoniku folyamatot kapcsoh a a glukóL~ piru\ át átalakulás hatásfoka a glikolizisben energetikai szempontból az aktuális intracellulári koncentrációértékd.kel sLámoha kb. 60° o-os.

~)).)))U))))1)

))))))))))))))))))))))U)))))))))))))UUU))))))))t))))))))

nnt))H)))))))t)))))))))))))l))))))))))t)))))))))))))))))

Anaerob vi zonyok közepe tte azonba n mindössze 2 ATP termelőd.ik a 38 (36) helyett, ami tizt:nkilenc zeres (tizcnnyolcszo ro ) különb séget jelent. ll;c,onló a; arány. ha ö sLevetjük a glukót oxidációjál C0 2-dá és JJ,O-zé ( Gu - 2840 kJ/mol) a piru\áttéi történő r ~-.zlegcs O\Jdációjéíval (\Gu· - 146 kJ mol).

A glikolízi sebessé ge - olyan szövete kben, ahol az oxigén ellátás változh at - alapvetően attól függ, hogy aerob vagy anaero b viszon yok vannak . Loui Pasteu r fedezte fe l, hogy anaero b körülmények közöll a g li kolízis sebessé ge többszö röse annak, amit aerob körülm ények között mémi lehet. Ez a jelensé g a Pasteu r-effek tus, é magyar ázata éppen az, hogy az ATP alioszté rik u an gátoUa az irreverzibilis fo zforilá ciót kataliz áló enzim, a foszfofruktokináz l aktivitá sát. Aerob körülm ények között a fentiek alapján jóval kevese bb glukóz szükség e a megfelelő ATP-sz int elérésé hez. A gli.kolíz is sebessé gének zabályo zását a glukone ogenezi~ szabály ozásáv al együtt tárgyaljuk (lásd J 16. o ldalt).

Sejtspecifikus sajátosságok, klinikai, patológiai vonatkozások

Vörösv értestek ben a glikolíz is fontos tennéke a 2,3-bis zfoszfo glicerá t (2,3-BP G). A 2,3-BP G l ,3-bisz foszfog licerátb ól képződik a foszfog licerát- mutáz enzim segítsé géveL A 2,3-BP G foszfatá z hatásár a veszíti el az egyik foszfátcsoportot és 3-foszf oglicer áttá alakulv a bomlik le. A 2,3-BP G jelentőségél a hemog lobin oxigén szállítá sában az 1.3. fejezetb en tárgyalj uk. A 2,3-BP G koncen trációja vörösvérsej tekben 4-4,5 mM, a szabály ozás mechanizmus át nem ismerjü k. A glikolit iku · kapacit ás a különböző szövetekben eltérő, s ennek fontos patológ iai következmén yei lehetne k. Vázizo mban például nagy a glikolitikt1s kapacit ás, ezért a vázizo m jól alkalmaz kodik a hypoxi ás körülm ényekh ez, nincs vázizom infarctu s. A szívizo m glikolitiku s kapacit ása viszont kisebb, ezért hypoxi a követk eztében infarctu s alakulh at ki.

109

Gyorsa n növő tumors ejtekbe n a jelentős gliko1ízis piruvát túlterm elést idéz elő, az ebből szárma zó laktátfe lhalmo zódás követk eztében lokál is acidosi s jön létre. A szérum laktát-d ehidrog enáz aktivitá sának mérése fontos laborat óriumi diagno sztikai eszköz több szövetk árosod ással járó kórkép megállapítá sában, amelye kben a szövets zétesés miatt ~enzim a sejtekbő l a keringé sbe kerül.

Redukáló ekvivalensek transzportja a citoszolból a mitokondriumba A citoszo lban keletkező NADH a mitokondri umban oxidáló dik, a NAD+, illetve nem transzp ortálód ik a azonba n NAOH mitoko ndrium bel ső membr ánján keresztül. A redukáló ekviva lensek transzp ortja két közvetítő rendsze ren kereszt ül valósul meg (2-65. és 2-66. ábra). A gliceri n-foszf át-dehidrogenáz mind a citoszo lban, mind a mitoko ndrium belső membránjána k kül ső fclszínén megtal álható enzim, a dihidro xi-acet on-fosz fát ~ glicerin -foszfá t átalakulást katalizálja. A citoszo lban NAD+ koenzi mme! a rnitoko ndrium ban F AD-da l működik . A citoszo lban képződött NADH így reduká lja a dihidro xi-acet on-fosz fátot, a képződött glicerin -3foszfát eljut a mitoko ndrium bel ső membr ánjáho z. Ott visszao xidálód ik dihidro xi-acet on-fosz fáttá' amely reakció során FADH 2 keletke zik. A FAOH., a légzési láncban oxidá lódik, a dihidroxi-aceton= foszfát a citoszo lbajut, ahol újra reduká lódhat. Így a citoszo lban keletkezett NADH+H NAD'" -dá oxidáló dott és hidrogé njei FAOE-h útján érik el a légzési Láncot (2-65. ábra). A transzp ort másik módja a malát-o xálacetát átalaku lás. A citoszolban képződött NADH NAD ~-dá oxidáló dik ' miközb en a malát- dehid rogená z által kataliz áll reakció ban az oxá lacetát reduká lódik maláttá. A malát transzp011álódni tud a mitoko ndrium ba, ahol oxálace táttá oxidáló dik, ennek kapcsá n a mitokondriu mban NAD ' reduká lódik, NADH+ H+ keletkezi k, és ez a légzési láncba kerül. Ily módon a cüopla zmában képződött NADH int.ramitokondriá lis NADH formáj ában éri el a terminá lis

,. liO

))))~}))))•)•)H))))H>)))))H))~))H>>nH•n•>t))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))}))

))))))))))))))))))))))))))))H)) ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

))

2-65. ábra. Redukáló ekvivalens transzport a citoszolból a mitokondriu mba l (glicerin-3-foszfátdehidrogenáz)

citoszol

NAD

+

A:'IYAGCSERE

dihidroxi-ac eton-foszfát ghcenn-3-foszfáttlehldrogenáz

gl c nn-3 s deh1C! oge glicerin-3-foszfát

mitokondri um membrán

belső

2-66. ábra. Redukáló ekvivalens transzport a citoszolból a mitokondriu mba ll. (malát-dehidrogenáz)

, a6t a ketog utara

NAD

~anszporter

oxálacetát

citoszol

mitokondri um membrán

belső

mátrix

ZÉ~ ~IIDRÁTOK A~YAGCSERÉJ E

lll

glukoz-6-foszfatáz glukóz-6-foszfát

t

l

fruktóz-6-foszfát

fruktóz-1.6-b•szfoszfatáz

fruktóz-1 ,6-biszfoszfát

GLICEROL

----4••

lll glicerinaldehid-3-foszfát dihidroxi-aceton-foszfát •4- - - +

l l l l

1,3-biszfoszfoglicerát

3-foszfoglicerát

AMINOSAVAK

2-foszfoglicerát

LAKTAT •4- -•lll piruvát

foszfoenolpiruvát

foszfoenolplruv~·- t

+

karboxikiná7

1-

piruvát ~ oxálacetát - - + malát ...._.... malát--+ oxálacetát

p1ruvat~

karboxiláz a.-ketoglutarát

aszparta' t

~ o.-ketoglutarát glutamát ~

l

glutamát ----

. o.-ketoglutarat

.

ll> aszpartat

MITOKONDRIUM

2-67. ábra. A glukoneogenezis lépései és az oxálacet át transzportjához szükséges transzamináz reakciók. Keretben és pirossal azokat az enzimeket és reakciókat jelezzük, amelyek nem a glikolizis enzimei és reakcióinak megford/tásai

112

>>>>>>>>>n»H>>H»>>>>H>>>>>>>»>>>>>H>>>>>>HU>>>>>>>>>n>n»»>>>>H»n>>>>>>>>>>>H>>»>HHH>>H>>>>>>HH>>H»>>>>>>n))>>H>>H>>>>>n>>>>>>>HH>>>>H>>>>>>>

oxidációt. Ez a transzportrendszer bonyolultabb, mivel az oxálacetát nem transzportálódik a mitokondriális membránon keresztül. Az oxálacetát két rnódonjuthat a citoszolba: egyrészt redukálódva malát formájában , vagy transzaminálódás után (lásd 2.4. fejezetet) aszpartát fonnájában (2-66. ábra). Ez a transzportrendszer a NADH+ H+ hidrogénjeinek transzportját szolgálja: az oxálacetát redukálódás után mint malát lép be a mitokondriumba és aszpartát formájában lép ki a mitokondriumból. A malát transzporteren az alfaketoglutarát, az aszpartát transzporteren a glutamát e llenkező irányú transzportja történik. Így malát belépésekor egy alfa-ketoglutarát kilép a mitokondriumból a citoszolba, aszpartát ki lépésekor glutamát lép be a mitokondriumba. A citoszalba jutott a.-ketogl utarát és aszpartát transzaminálással oxá lacetátot és glutamátot képez. Az oxálacetát egy újabb NADH segítségével ismét redukálódhat maláttá, s ezzel újabb redukáló ekvivalens pár indul a terminális oxidáció irányába. Végezetül, a mitokondriumban "visszaoxidálódott" oxálacetát glutamáttal transzaminálódva aszpartátot, illetve a.-ketoglutarátot képez. A transzport két módja energetikailag különböző eredményt ad, amennyiben a citoszolban képző-

ATP

CO
l

-

C= O+HC03

l

CH3

dött NADH, ha NADH+Hi formájában kerül a légzési láncba, akkor ez három A TP, ha F ADH 2 formájában, akkor csak két ATP termelését eredményezi.

Glukoneogenezisa glukóz de novo szintézise A glukoneogenezis az a folyamat, amelynek során glukóz szintetizálódik nem szénhidrát prekurzorokbóL Glukózszintézisre használódhat a tejsav, a glukoplasztikus aminosavak, a glicerol és a propiOnsav. A g lukoneogenezis legtöbb lépését ugyanazok az enzimek katalizálják, amelyek a glikolízisben is részt vesznek, és az intermedierek is majdnem teljesen azonosak. Az egész folyamat mégsem egyszeruen a glikolízis lépéseinek megfordítása, hiszen három olyan enzim is részt vesz a glikolízisben, amelyek irreverzibi lis folyamatokat katalizálnak. Ezek a hexoki náz, a foszfofruktokináz T és a piruvát-kináz, amelyek a glukoneogenezisben nem vesznek részt, az ellentétes lépéseket más enzimek katalizálják A glukóz-

2-68. ábra. Foszfoenolpiruvát keletkezése a glukoneogenezisben

t,OP F

\._/

ANYAGCSERE

...

piruvátkarboxiláz

piruvát

oxálacetát

GTP foszfoenolpiruvátkarboxikináz

GDP

cool

2-

ll

3

C- 0 - PO CH2

foszfoenolpiruvát

ZÉ litDRÁTOK ANYAGC ERÉJE

)))) )) J))))))))) >) )) )) )) )) ))

szintézis egyes lépései az 2-67. ábrán láthatók. A glukoneogenezisben az első olyan reakció, amely nem egyszerűen a glikolizis fordított irányú lépése, a piruvát ~ foszfoenolpiruvát átalakulás, amelyben magas csoportátviteli potenciálú foszfátkötés jön létre. Az átalakulásban, amelyhez két enzimre (piruvát-karboxi láz, foszfoenolpiruvát-karboxikináz) és két magas energiájú foszfátvegyülette (ATP, GTP) van szükség, oxálecetsav intermedier keletkezik (2-68. ábra). A piruvátkarboxiláz katalizálja a piruvát ~ oxálacetát átalakulást, am ihez biotin közreműködése szükséges. Az enzim négy azonos a legységből á ll, amelyek mindegyike egy molekula biotint köt egy lizin E-aminocsoporton keresztül. A biotin a karboxiláz reakciót katalizáló enzimek kofaktora (prosztetikus csoportja). A folyamat energiaigényes, mert ATP hidrolízise szükséges ahhoz, hogy a bikarbonát "aktiválódjon". Az A TP-ről lehasadó foszfát és a bikarbonát között vegyes savanhidridkötés jön létre, innen a először az enzimen kötött biorinra, majd a biotinról a piruvátra kerül és kialakul az oxálacetát. A reakciómechanizmust az 2-69. ábra mutatja. Hasonló mechanizmussal , biotin kofaktorral működnek más karboxiiázok is (pl. aceti l-CoA-karboxiláz, propionil-CoA-karboxi láz, lásd 2.3. fejezetet).

J 13

» )))))))))))))) ))))))))))))))))n >>))))))))))))))))))))))l)l)))l))UHHnH>>>)))) l)))l))))))> >)))U>> ))

HC03

co2

A biotin számo táplálékban megtalálható vitamin, amel ye kből a zervezet hozzájut a szükséges mennyiséghez. Hiánybetegség nagyon ritkán alakul ki, általában c ak nagy mennyi égü nyer tojá fogyasztása esetén, mi vel a tojásfehérje tanalmaz egy avidin nevü fehérjét. amely biotini köt és megakadályou a a bélcsatornából tönénő felszívódást. ( Főzött tojásban az avidin tennészetesen denaturált és inaktív.)

A piruvát-karboxiláz müködéséhez acetil-CoA-ra van szükség, ami az enzim allosztérikus aktivátora. Ennek reguláló szerepére még visszatérünk. foszfoenolpiruvát-karbox ikináz A hatására az oxálacetátból alakul ki a

cool

C= O

l

CH3

piruvát

cool

+

C= O

l

CH2 ~

coo

oxálacetál

- - - - -2-69. ábra. A piruvát-karboxiláz reakciómechanizmusa

J

l l .t

>mmm»>»>>>>m>>>»>>>»»»»>»»>»m>>»»»»>>»>»»»»>»»>»>H»m»>»»>»>» >>»>>»>»>>»»»>>»»»»>m»mm»>m>>»»>>>>>>»>>>>»>»»>

fo zfoen olpiru vát, amelyben a maga s energiájú kötéssel kapcs olódó foszfá tot a GTP term inális foszfátcsoportja adja. Így a piruvá t ~ foszfo enolpiruv át átalak ulás össze sen 2 A TP feU1asználását jelent i (2-68. ábra). A glikolízis minde n enzime a citosz olban található, két enzim kivételével (piruvát-kar boxiláz, gl ukóz- 6-fosz fatáz) ugyanez igaz a g lukoneogenezisre is. A piruvá t-karb oxiláz a mitok ondriumb an lokalizálódik, s itt keletk ezik az oxálacetát, amine k a citosz ciba kell transz portál ódnia ahhoz , hogy szubs ztrátja lehess en a foszfo enolpiruvá t-karb oxikin áznak (2-67. á bra). A mitokondrium belső memb ránon azonban az oxála cetát nem tud áthala dni, így vagy transz aminá lással aszpartáttá a lakul, amit az aszpa rtát-g lutam át carrie r a citosz ciba transzportál (2-66. ábra), vagy a malát -dehid rogen áz által katali zált reakc ióban ma láttá reduk álódik és így kerül a c itoszolba. A két út közöt t energ etikai külön bség van, mégp edig a malát transzportja egyben reduk áló ekviv alens transzport is a mitok ondriu mból a citoszolba. A citosz olban transz aminá lás útján újra oxála cetát

H C-O -P02-

2I

3

keletkezik, illetve a malát oxálacetáttá oxidálódik és NADH+ H' keletkezik. A gluko neoge nezis további lépése i a c itoszo lban történnek. (A transzaminálási reakc iókról részle tesen a 2.4. fejezetben lesz szó.) A foszfo enolp iruvát tól a fruktó z-l ,6-biszfoszfátig az interm ediere k keletk ezésé t a glikolízisnél megis mert enzimek katalizálják. A fruktó z-l ,6b iszfos zfátbó l a fruktóz-1,6-biszfoszfatáz hatására, a foszfátészter hidrol izál, anorg an ikus foszfát keletk ezése közbe n jön létre a fruktóz-6-foszfát (2-70. ábra). A gluko neoge nezis utolsó lépé ében, a szaba d glukó z keletk ezésé t a glukóz-6-foszfatáz katalizálja (2-71. ábra). Az enzim az endoplazmás retiku lumba n memb ránho z kötve található. A glukóz a májsejtet elhag yva a kering ésbe kerül. (Ebben a folyam atban fe ltétele zik a GLUT-7 szerep ét.) A g lukóz szinté zise energ iaigén yes folyamat, l molek ula glukó z ke letkez ése 2 molek ula laktátból 6 ATP felhas ználás át jelenti: 2 laktát + 6

ATP~

l glukó z + 6 ADP + 6 P1•

2-70. ábra. A fruktóz -1 ,6-bisz foszfatáz által kataliz ált reakci ó

H2C-O H

l

C= O

C= O

HO- C-H

HO -C- H

l

l

l

H-C- OH

l

l

H-C -OH

l

+ p

l

H-C -OH

H-C -OH

l

2

H2C-O -P03

H2C-O -P03

fruktóz-1 ,6-biszfoszfát

fruktóz -6-foszfát

2·

2-71 . ábra. A glukóz -6-fosz fatáz által kataliz ált reakci ó

H 2C-0-PO~­

J--- -0 H

H

ANY AGC. ERE

OH

glukóz-6-foszfát

H

OH glukóz

ZÉ HIDRÁTOK

>>>>>>>>»>>>>»>>>>>>>>>>>>>>>>>>»>>»>>>>>>>>>>>>>>>>»>>>>>>>>>)))>)))))>>>>>>>>>>>>>>>>>>»>>>>»HH>>»>>»>>>>>>>>)>H>>>>>>>>

'IIYACCSEHÉJ E

Glukoneogenezis szempontjábó l a legfontosabb szerv a máj. Bár a vesékben is folyik glukoneogenezis, a máj , tömegénél fogva ennél jelentő­ sebb kapacitástjele nt A glukoneogene zis enzimei, a glukóz-6-foszfatáz kivételével az izmokban i j elen vannak, azonban itt szabad glukóz nem keletkezik, a glukóz-6-fosz fát a glikogénszintézis irányában alakul tovább. A kérdés az, hogy a májban folyó glukoneogenezishez honnan állnak szubsztrátok a rendelkezésre. A laktát az anaerob glikolízi végtermékc. Anaerob glikolízis a vérellátástól és oxigén ellátottságtól fúggően kisebb-nagyo bb mértékben minden szervben történik. Jelentékeny é folyamatos a laktátképződés a vörösvérteste kben, aho l nem lévén mitokondrium , a glikolizis az egyetlen ATPtermelő folyamat. A harántcsíkolt izomban is a többi szervet meghaladó mértékben keletkezhet laktát, mert fokozott izommunkában, a relatív hypoxia miatt az anaerob g likolíz is ke1ül előtérbe. A laktát a keringéssei jut e l a májba, az itt szintetizált glukóz pedig a keringéssei jut vissza, egyebek me llett ezekbe a szervekbe. A máj és az extrabepatiku s szervek közötti ilyen munkamegos ztás és táp-

l iS

a nyagforgalom együttesen a Cori-cikJust alkotja, a melynek sémáját a 2-72. ábra mutatja. A glukoneogenezis alaninból is történhet, s ha ez az extrahepatikus szervekben, pl. izomban a glikolízisbcn keletkező piruvátbó l (transzaminá lással) jön létre és szállíródik a májba, az ún . alaninciklus részét képezi (2-72. ábra). Az aminosavak közül az alan in a l egfőbb, dc nem az egyetlen glukózforrás: minden aminosavból, ami piruváttávagy oxálacetáttá tud a lakulni (ezek a részben vagy teljes egészében glukoplasztik us aminosavak, lásd a 2.4. fejezetet) g lukóz szintetizálódhat. A lizin és a leucin kivételével gyakorlatilag minden aminosav képes erre. Acetil-CoA-b ól nem képződik sem piruvát, sem oxálacetát, így acetil-CoA-bó l nem történik glukózszintézis. Minthogy a zsír avak oxidációja során acetii-CoA keletkezik, a zsírsavakból nem keletkezhet glukóz. Ezalól kivételt a páratlan szénatomszámú zsírsavak jelentenek, amelyek oxidációja molekulánkén t egy propionil-CoA keletkezést is eredményez, amely szukcinii-CoA -vá alaku l (lásd 162. oldal), s ebből a citrátkörben oxálacetát keletkezik. G lukóz szintetizá lódhat a zsírsavraktá-

2-72. ábra. A Coriciklus (piros nyilak) és az alanincik/us (fekete vastag nyilak)

MAJ

·r

/ p iruvát

l

.

t

laktát

CORl-CIKLUS CORl-CIKLUS

VÖRÖSVÉRTEST

ALANINCIKLU S

IZOM

l 16

>>>>n >H>>~n >>>n>>> n>>>> n >»H> >U>>> >U>>>>>>»~» >HU))>>> >»>»>HH>,>>n>,> >))>>H>>>>>

>hunnH> >H>>»>»>>>>>>>>>»»>>>»»n»»»>»>» >U»> >>>»H>>>»»

ANYACCS ERE

CH2 0H

l

CHOH glicerin -kináz glicerin

l

H2C - O - PO~glicerin -3-fosz fát

glicerin-3-foszfátdehidr ogenáz dihidro xi-acet on-fosz fát

l

laktát

2-73. ábra. Dihidro xi-acet on-fosz fát keletke zése

\

glukóz

glicerinből

rakban található trigliceridek gliceri nkomponensé is, amely két lépésben dihidroxi-acetonfoszfáttá alakulhat (2-73. ábra). Az a megállapítás tehát, hogy lipidekbő l nem keletkeznek szénhidrátok általában igaz, de csak e két kivéte l figyelembevételével. ből

Emellett acetonból is képzödhet g lukóz ci tokróm P450 e nzimek seg ítségével a májban . Diabetes mellitus ban és hyperacetonaemiával járó állapoto kban (pl. éhezés) lehet ennek a reakcióút nak jelentő sége (lásd 2.6. fejezet).

Mint láttuk, a glukoneogenezis energiaigény es folyamat. A felhasználódó A TP a zsírsavak oxidációja során keletkezik. A zsírsavak, mint alternatív tápanyagok fokozott mértékben oxidálódnak akkor, am ikor glukoneogenezis történik, azaz csökken a vércukorszint. A zsírsavak oxidác iója nemcsak mint energiaforrás járul hozzá a glukoneogenezishe z, hanem a mitokondrium acetilCoA-szin~ ének emelé sével, a piruvát-karb oxiláz allosztérikus srimul álásán keresztül is fokozza a glukózszintézist.

Tejsav as acidos is. Fiziológiás körülmények között a tejsav a sejtekben csak kis mennyiségben képződik, mert oxigén jelenlétében a piruvátból acetil- CoA keletkezik, ami a citrátkörben alakul tovább (kivételt képez nek azok a sejtek, pl. vörösvértest, ahol csak glikolí zis folyik) . Megnő a tejsav menny isége fizioló giás körűlmények között fokozott izom-

munkában, vagy ha az oxigénellátás patológiás okból csökkent (pl. görcsök, shock , cardiopulmonalis betegségekben). A keletkezett tejsav a plazmamembrán laktát!H+ transzporteren keresztül a sejteket elhagyja és a keringésbe kerül. A laktáteliminációt a szervezetben vagy a C02-d á és H20-zé történő oxidáció, vagy a májban, a glukoneogenezisben a glukózzá történő átalakulás biztosítja. Minth ogy e folyamatokhoz is oxigénre van szükség, általános hypoxiás állapotban nemcs ak a laktátkeletkezés fokozódik, hanem csökken a laktátelimináció is. Az utóbbi bekövetkezik a májparenchymasejtek pusztu lásával járó kórképekben és krónikus alkoholizmusban is. Tejsavas acidosisban a tejsavkoncentráció a vérben 5 mM fölé emelkedhet, ugyan ekkor csökken a pH és a bikarbonátkoncentráció.

A glikolízis és a glukoneogenezis szabályozása A glikolizis és a glukoneogenezis a közös intermedierekés enzim ek okán egymással összefüggő folyamatok. Bármelyik folyamat gátlása egysze rsmind a másik stimulálását is jelenti; amikor a glikolizis sebessége csökken, fokozódik a glukoneogenezis és e llenkezőleg, a glikol izis stimuláci-

ZÉNHIDRÁT OK ANYAGCSER ÉJE

>>))))))))))))>))>)U))))>))))))))>> ))}))))))))))) >>)))) >>))» '')))) >> )>))>))))) >>)U))) >H)

>>)))) )))) )))) )) >) )) ) ))) >>)))) >)>)>)))))))

ójával párhuzamosan csökken a glukoneog enezis. Mindkét folyamat szabályozá sa az irreverzibilis lépéseket katalizáló enzimeken keresztül történik. A glikolízisben a reguláit enzimek a hexokináz, a foszfofruktokináz l és a piruvát-kin áz, a glukoneogenezisben pedig a piruvát-karboxiláz és a fruktóz-1 ,6-biszfoszfatáz. A reguláció allosztérikus mechanizmusokkal történik, de szerepe van enzimek kovalens módosításá nak (foszforilál ás) is. Az allosztérikus regutátorok a glikolizis és a glukoneoge nezis sebességét annak függvényéb en módosítják, hogy (i) rnilyen az adott sejt energiaál-

la pota (ATP, AMP, citrát), (ii) változik-e az intracelluláris pH , illetve (iii) milyen a szervezet energiaálla pota (fruktóz-2, 6-biszfoszf át). Az utóbbi hatást hormonok, főleg a glukagon közvetíti. A regulációb an a fe lsorolt enzimek közül kiemelkedően a legfontosab b szerepet a foszfo-fruk tokináz l játssza. Az allosztériku s reguláció összefogla lása az 2-74. ábrán látható. O A g likolízjs sebessége a sejt energiaáiJ apotának megfel elően az ATP, illetve az AMP hatá-

!

t

glukóz

glukóz ATP = i hexokináz l ADP

~

1

~

glukóz-6-fos zfatáz

P,

glukóz-6-foszfát

glukóz-6-foszfát

!

fruktóz-6-foszfát

f

fruktóz-6-foszfát

tp

~

. \T~

r.__ ATP = i • ' fruktóz-1 ,6ffoszfofruktokináz 1 fi)•
+e

e

t

:

l

t

l

(2) foszfoenolpiruvát

(2) foszfoenolpiruvát

+

GC) •ATP (2) ADP= i • piruvát-kináz .., •a1an1n (2) ATP

16:\

(2) piruvát

~

acetil-GoA •

11 7

(2) oxálecetsav (2) ADP + P,

CD

piruvát-karboxiláz -------(2) piruvát

(2) laktát

2-74. ábra. A glikolizis és a glukoneogen ezis allosztérikus regulátorai

+

(2) laktát

(2) ATP

co2

sára változ ik. A TP alloszterikusan gátolj a a g liko lízis legfon tosabb szabályozó enzim ét a foszfo frukto kináz 1-t, valam int a piruvá t-kinázt. Ennek eredményeképpen a g likolíz is lelassul, amiko r az ATP-ke ncentráció megnő a sej tekben. Az ATP-s zinttel e llentét es irányb an változik az AMP konce ntrációj a. Az ATP + ADP + A MP menny isége a sejtekben közel állandó, az egyensúlyt a citoszo lban az adeni lát-kin áz (miok ináz) biztos ítja, ami a 2ADP ~ A TP + AMP reakciót kataliz álja. Normális körűlm é­ nyek között az A TP-ko ncentr áció mindig sokkal nagyo bb mint az A DP és még inkább, mint az AMP (ATP> >A DP>> AMP). Kis csökke nés az A TP-koncentrációban viszony lag j elentős emelkedést okoz az AMP-koncentráció ban. Az AMP alloszt érikus aktívá tora a foszfo frukto kináz I enzimnek és ezálta l stimul álója a g likolízis nek. Ugyan akkor a lloszté rikusan gátolja a fruktó z-1,6- biszfo szfatázt, így is biztos ítva a g likolízis- glukon eogen ezis egyen súlyán ak glikolízis irányába történő eltolódását. (A foszfo frukto kinázt az ADP is gátolja .) A glikolí zis sebesség e csökke n citrát hatására, mert a citrát a foszfo frukto kináz I alloszt érikus gátlój a. Citrát ke letkez ik a citrátkörben nemcs ak a szénhi drátok, hanem a zsírsavak vagy a ketontestek oxidác iója során is. Így azokban a sejtekben, ame lyek zsírsav at ox idálna k, csökke n a g lukózfelhaszná lás és ez g lukózt takarít meg pl. az agy számá ra, amely majdnem kizáró lag csak glukózt oxidál. Ugyan akkor a zsírsav ak oxidác iój a során keletkező acetil-CoA a piruvá t-karboxilá zt aktivá lja és a glukon eogeoezist serken ti. Az acetii- CoA és a hosszú szénlá ncú zsírsavak a piruvá t-kináz t gátoljá k. 6 A W -koncentráció emelkedése a foszfo fruktokiná z I gáttásá t okozza. Az anaerob g likolíz is fokozódása a laktát me llett H+-felszaporodást is j elent, ami "fékez i" a glikolí zist. A laktát a H' -nal együtt egy transzp orteren keresztül a keringés be j ut és a glukon eogen ezis folyamatában, a májba n glukóz szintéz isre használódik (2-72. ábra). t) A gliko lízis és a g lukone ogene zis hormo nális szabá lyozás ában a glukag on és az inzulin j átszik szerep et. A g lukagon a pancre as a-sejtjeiből a vércukorszin t-csök kenés hatásá ra kerül a kering ésbe. Hatásá nak az a lényeg e, hogy a

májban csökk enti a g lukózfelhasználást, és serkenti a glukóz szintéz is és -mobi lizáció folyamatait. A metabolizrnusra gyakoro lt hatása enné l összetettebb , mert a szénhi drát-anyagcserével párhuz amosan a lipidek metabo lizmus át is befoly ásolja. Hatása inak tárgya lására az egyes metabolik us utakná l, majd "A metabolizmu s integrác iój a" címü fej ezetbe n új ra visszatérünk , ezen a helyen csak a glikolí zis- glukoneogenezisre gyako rolt szabál yozó hatáss al foglalkozun k. A májsej tek memb ránj ában receptorok vannak, amely ek felism erik és kötik a kering ésben jelen l évő gluka gont. A receptorró l és minda zokról a fo lyama tokról, amely ek a sejtben a receptorstimul álás hatásá ra végbernennekk:ülön fejezetben (5. fejeze t) részletesen szólun k majd. A glukag on hatásá nak megértéséhe z itt annyit kell csak ismerni, hogy a sejtekben ATP-b ő l az adenil át-cikl áz hatásá ra c iklikus AMP (cAMP) keletk ezik. A cikliku s AMP, amely nek képletét az 2-75. ábra mutatj a, intrace llulárisan a cAMP -depen dens protein -kináz t aktiválja, ami

2-75. ábra. cAMP képlete

ZÉNHIDRÁ TOK ANYAGCS ERÉJE

>U> >»> >> ,,n>>>»>»>>>> >>>>»»>>»n»>>>»>>>»>>>>>»>>>»>>>>>> »>H>>> >>>>» >> >»,n))n >H>>> H>H> >H>» >HU»>

fehérjéket képes szerin/treonin OH-csop orton foszforilálni. A cAMP-fü ggö protein-k ináz számos olyan enzimet foszfori lál, amelyek a metabolizmusban jelentős szerepet játszanak , s ez egyes enzimek esetében az aktivitást csökkenti, mások esetében az aktivitást fokozza. A májsejtekben a glukagon hatása a glikolízisre és a glukoneogenezisre a fruktóz-2 ,6-bisz-

OH

119

foszfát szintjének változásá n keresztül érvényesül. A fruktóz-2,6-b iszfoszfá t (2-76. ábra) a fruktóz-6-foszfátból keletkezik a foszfofruktokináz ll hatására. A foszfofruktokináz II egy sajátos, kettős funkciójú enzim, amely a fruktóz 2,6-biszf oszfát fruktóz 6-foszfáttá történő visszaalakulását is katalizálni képes. Az, hogy melyik funkcióját tudja ellátni, attól függ, hogy az enzim foszforilált vagy defoszforilált állapotban van-e. Az enzimet a cAMP-fü ggö protein-kináz foszforilálja és a foszfoproteinfoszfatáz defoszforilálja. A foszforilált enzim foszfatázként működik és a fruktóz-2,6-biszfoszfát ~ fruktóz-6-foszfát átalakulást katalizálja, míg a defoszforilált enzim kináz aktivitású és a fruktóz-2,6-biszfoszfát keletkezését katalizálja. A szabályozás vázlatát az 2-77. ábra muta~a. A fruktóz-2 ,6-biszfo szfát a glikolízis sebességét fokozza, a glukoneo genezis sebességé t pedig csökkenti, mert pozitiv allosztérikus regulátora a glikolízis sebességmeghatározó lépését katalizáló foszfofruktokináz I enzimnek és ne-

H

2-76. ábra. Fruktóz-2, 6-biszfosz fát

L

>n>>>>>>>»

FOSZFOFRUKTOKINÁZ ll. (defoszforilált)

FOSZFOFRUKTOKINÁZ ll. (foszforilált)

i

foszfoprotein-foszfa táz fruktóz-6-foszfát

ATP ~

flr P1

ADP ~

r

fruktóz-2, 6-biszfoszfá t

2-77. ábra. Abifunkcio nális foszfofruk tokináz ll-kináz és -foszfatáz aktivitása és foszforilác ióval

történő

szabályoz ása

120

A ~ YAG C

gatív allosztérikus effektora a fruktóz l ,6-biszfoszfatáznak. Fruktóz-2,6-biszfoszfát nélkül a foszfofruktokináz I aktivitása elégtelen, a fruktóz- l ,6-biszfoszfatázé viszont fokozott. Mindezek ismeretében a glukagon hatására végbemenő folyamatok a következőképpen foglalhatók össze (2-78. ábra). Glukagon hatáára foszforilálódik a bifunkcionális foszfofruktok:ináz ll , amely ennek eredményeképpen foszfatázként működik és a fruktóz-2,6-biszfoszfát ----)- fruktóz 6-foszfát átalakulást katalizálja. Lecsökken a sejtekben a fruktóz-2,6biszfoszfát-koncen tráció és megszűn i k a foszfofruktokináz l aktiválása, illetve a fruktózl ,6-biszfoszfatáz gátlása. Ez azt jelenti, hogy a

ERE

folyamatok a glukoneogenezis irányában müködnek. Glukagon hiányában ezzel szemben a foszfofruktokináz ll a foszfoprotein-foszfatázok hatására defoszforilálódik, a kináz aktivitása válik dominánssá és katalizálja a fruktóz6-foszfát ----)- fruktóz-2,6-biszfo szfát átalakulást. A fruktóz-2,6-biszfo szfát mint a foszfofruktokináz I leghatékonyabb allosztérikus aktivátora, a gli kolízis sebességét fokozza, ugyanakkor a fruktóz- l ,6 biszfoszfatázon keresztűl a glukoneogenezist gátolj a. A glukagon glikolízisre és glukoneogenezisre gyakorolt hatásában a fruktóz-2,6-biszfoszfát j átssza a legfontosabb szerepet. Ezt egészíti ki a piruvát-kináz gátlása, amely annak a követ-

glukagon

t l

t

cAMP

+

cAMP-függő

protein-kináz

glukóz

fruktóz-6-foszfát

l l l l l

fruktóz-2,6-biszfoszfát

kináz

•

L()

l l

tl l

l

l

l

l l

! ~ fruktóz-6-foszfát

FOSZFOFRUKTOKINÁZ l

l

j1

FRUKTÓZ-1 ,6-BISZFOSZFÁTFOSZFATÁZ

fruktóz-1 ,6-biszfoszfát ll l l l l

t

Cll .N ~

oOl

l l l l

3

:

:

Ol

•

!

l

l

Q)

c

o

piruvát

2-78. ábra. Fruktóz-2,6-biszfosz fát hatása a glikolízis re és a glukoneogenezisre. Glukagon hatására a vastag fekete nyilakkal, glukagon hiányában a vastag piros nyilakkal jelzett folyamatok dominálnak

SZÉNHIORÁTOI< ANYAGCSERÉJE

)) ))>) >>»))»>H>>)>> >>>> >>>>

>>))>> >>>>)>)))\>»>>>>>)) >) >)>> >>))))>>»>>))>H> >>>H>>))>))) UH> >H>>> >H> >H>>>))>>>)))))>>>> )))> >>

121

2-79. ábra. A glukagon glikolízisre és gluko· neogenezisre gyakorolt hatásában szerepet játszó tényezök vázlata

ATP

cAMP

+

cAMP-függő

~

foszforiláció

foszfofruktokináz ll

A glikolízis szabályozásában és az egyes szervek vércukorszinttől függő eltérő g likolitikus aktivitásában fontos szerepet játszanak a hexokináz izoenzimek. A különböző szervekben eltérő hexokináz izoenzimek találhatók, de a legtöbb helyen az enzim glukóz iránti KM-értéke < l mM, és gátolható a reakcióban keletkező glukóz-6-foszfáttaL Így nem fordulhat elő, hogy a sejtek anorganikus foszfát készlete glukóz-6-foszfátban halmozódjon fel, amikor a glik.olízis folyamata valamiért gátolt. (Ez történik viszont a fruktóz~ fruktóz-l-foszfát átalakulásban, amikor a fruktóz anyagcserezavart szenved.) A máj parenchymasejtekben található a glukokináz, amelynek KM-értéke l OmM körüli és nem gátolható glukóz-6-foszfáttaL

~ piruvát-kináz i)

fruktóz-2,6-biszfoszfát-szint J..

kezménye, hogy a cAMP-függő protein-kináz a piruvát-kinázt is foszforilálja és ezáltal inaktiválja (2- 79. ábra) . A glukagonnal ellentétes hatású honnon az inzulin, amely a pancreas ~-sejtjeiből a vércukorszint-emelkedés hatására választódik el. Glikolízisre gyakorolt hatásának mechanizmusa még nem tisztázott. Lehetséges, hogy a foszfoprotein-foszfatázokat vagy a cAMP-t AMP-vé alakító ciklikus nukleotid-foszfodiészterázt (lásd 470. oldal) aktiválja. Mindkét mechanizmus a glukagonnal ellentétes hatást, azaz a glik.olízis serkentését és a glukoneogenezis sebességének csökkenését eredményezi.

protein-kináz

~

glikolizis Cl glukoneogenezis ()

Gáto lja viszont a glukokinázt egy inhibitor fehérje. A fru któz-6-foszfát e l őseg íti a gátló fehérje kö tődését a glukokinázhoz és ezáltal gátoüa az enzimet A fruktóz-l-foszfát ezzel szemben gáto lja ezt a kölcsönhatást, ami nek következtében a gluko kinázt aktiválja. Ez a hatás j elentössé válik akkor , amikor a fruktóz-l -foszfát felszaporodik a sejtekben, fo kozott fruktózfel vétel vagy a fruktózanyagcsere zavara miatt.

A glukokináz viszonylag magas KM-értéke magyarázza, hogy a vércukor-koncentráció (fiziológiásan - 5 rnM) kismértékű emelkedése fokozza a g lukóz ~ glukóz-6-foszfát átalakulást, vagyis a májban a glukózfelhasználást, amely egyszersmind a vércukorszintet csökkenti (2-80. ábra) .

hexokináz glukokináz

10 15 mM 5 glukózkoncentráció

2·80. ábra. A hexokináz és a glukokináz aktivitása a glukózkoncentráció függvényében

122

>>»»»>>>>>m>>>m>>»>m>>>>mm>m>>>>»>>»»»>»>>>>>>»>>>>»>>>>>>>>»m»>>>>>>>>>>>>m>m»>»»>>>>»>>>>»>>>>>»>>>>m>>>>»>>»>>>>»»>m>>>>>>>»>

Azok a szervek, amelyekben az alacsony Kw értéktl hexokináz foszforilálja a glukózt (pl. az agy), csökkenő vércukorszint esetén is hozzájutnak a glukózhoz. A glukokináz mük:ödése összefügg az ellentétes irányú reakciót katalizáló glukóz-6-foszfatáz mű­ ködésével is. Ezt az enzimet is magas (-3 mM) KM-érték jellemzi, így a glukóz H glukóz-6foszfát átalakulás irányát a koncentrációviszonyok szabják meg. 5 mM körüli vércukor-koncentrációnál az ellentétes irányú folyamatok egyensúlyban vannak. Ez A TP-felhasználást jelent ugyan, de a két enzim együttes működése fontos szerepet játszik abban, hogy a máj az aktuális igényekhez alkalmazkodva glukózt vesz fel, vagy ha szükséges, glukózt küld a keringésbe. A g lukokináz gén transzkripcióját az inzulin fokozza, azaz glukokinázindukciót okoz. A megnövekedett enzimmennyiség a máj alkalmazkodását jelzi a megnövekedett g lukózfogyasztáshoz. Inzulinhiányban a glukokináz elégtelenné válik és a megemelkedett vércukorszint ellenére a máj csökkent kapacitással képes a g lukózt felvenni.

A fruktóz és a galaktóz metabolizmusa Mindkét monoszacharid metabolizmusára jellemző, hogy olyan intermedierek keletkeznek, amelyek vagy a glikollzis vagy a g lukoneogenezis folyamataiban alakulnak tovább. A fruktóz igen jelentős emberi tápanyag, a napi fruktózbevitel kb. l 00 g, melynek jelentős része az asztali cukorból (szacharóz, szukróz) származik. Sok fruktózt tartalmaznak egyes gyümölcsök, a méz, de az elmúlt évtizedekben az élelmiszeripar is használja, mivel kisebb mennyiségben okoz édes izérzést, így alkalmazásával az energiabevitel csökkenthető. A fruktóz elsősorban a májban metabolizálódik (2-81. ábra). A máj tartalmazza legnagyobb mennyiségben a fruktokináz enzimet, amely foszfori lálja a fruktózt és fruktóz- l -foszfát keletkezik. A fruktóz- l-foszfát a fruktóz-1-foszfátaldoláz (aldoláz B) hatására g licerinaldehidre és dihidroxiaceton-foszfátra hasad. A glicerinaldehidből glicerin-foszfáton keresztül dihidroxi-aceton-foszfát keletkezik. A fruktóz így vagy a

ANY AG CSERE

glikolízisbe csatlakozik és lebomlik, vagy a glukoneogenezisben glukózzá alakulhat. A fruktóz szubsztrátja a hexokináznak is, a hexokináz affinitása a fruktózhoz azonban lényegesen kisebb. Fmktóz-6-foszfát számottevő mennyiségben csak adipocirákban keletkezik. A fruktóz metabolizmusának sebessége a glikolizisben gyakorlatilag csak a fruktóz mennyiségétől függ, mivel kikerüli a glikolízis sebességmeghatározó lépését katalizáló, szabályozó enzimet, a foszfofruktokináz l-t. A fruktóz így gyorsan metabolizálódik, és a keletkező acetil-CoA a májban könnyen zsírsavvá alakul.

Ha a fruktóz továbbalakulása enzimdefektus miatt akadályozott, a fruktóz-l-foszfát-felszaporodás súlyos következményekkel jár. Ez történik fruktózintolerancia esetén, amikor elégtelen a fruktóz- l-foszfát-aldoláz működé­ se. ilyenkor lecsökken a májsejtekben az anorganikus foszfát mennyisége, mert a foszfát a továbbalakulni nem tudó fruktóz-l-foszfát "csapdájában" marad. Foszfát hiányában csökken a terminális oxidációban az A TP keletkezése, aminek súlyos sejtkárosító hatása van, ha olyan fokú, hogy a Na+K+-ATPáz nem tud a működésének eleget tenni. (Az enzimről Lásd a 4. fejezetben.) Az anorganikus foszfát hiánya Iniatt következik be a fruktózintolerancia egyik legsúlyosabb akut tünete is, a hypoglykaemia, ami fruktózfogyasztás után lép fel. A hypoglykaemia oka az, hogy anorganikus foszfát hiányában nem tud glikogénből glukóz-l-foszfát keletkezni, s így kiesik egy, a vércukorszint fenntartásához elengedhetetlen akut szabályozás. Nagy mennyiségü fruktóz hasonló problémákat okozhat enzimdefektus nélkül is, mert az aldoláz B kapacitása normálisan is lényegesen kisebb, mint a fruktokinázé, és a korlátozás nélküli fruktózfoszforiláció az ATP-szint csökkenését okozza. Ezért kell elvetni a fruktóz adását parenterális táplálásban, noha sok szempontból a glukóznál kedvezőbb lenne (felvétele a sejtekbe nem ftigg az inzulintól, metabolizmusa gyors). A fruktózhoz hasonlóan, májsejtkárosító hatású a szorbitol glukóz helyett történő parenterális alkalmazása is.

ZÉNI-IIDRÁTO K

VAGCSERÉJE

)))))')))))))))))))))>)>>>>»>>>>H>>>> >>>>>)))))>))))))))))))))U))))))))))))))) ))))))h>>>>>>>>»H>)»>>>>>>>>>>n >>>>>>H))))))))))

123

o

OH RUCTOSURA fruktóz

glukóz

l

FRUKTOKINÁZ

1l 1l 1l

glukóz-6-foszfát

fruktóz-6-foszfát

OH /

fruktóz-1-foszfát --

-

FRUKTÓZINTOLERANCIA

l

FRUKTÓZ-1-FOSZ FÁTALDOLÁZ (B)

dihidroxi-aceton-P + - --

glicerinaldehid

fruktóz-1,6-biszfoszfát

- - - - - - + glicerinaldehid-3-foszfát

... l l

~o

l l l

C- H

l

l

l l l

CHOH

l

l

CH:PH

l l

l l l

NADH + H' - j ALKOHOLNAD• ............ DEHIDROGENÁZ

ATP glicerin

: {GLICERIN-FOSZFÁTNADH:HDEHIDROGENÁZ NAD+

• l piruvát

ADP GLICERINKINÁZ

glicerin-foszfát

2-81 . ábra. A fruktóz metabolizmusa

j

124

))))))))l)>)>)))))))))l)> ))))))l)l))))))))))J>>l)) ))))ll>>>>>l>>>>>>> >»»»>>>>H· >)l))))l)l))l>)))))))

Előfordul,

dc jóindulatú á llapot az esszenciális fructosuria, amelyben elégtelen a fruktokináz müködése. Fruktózfogya sztást követően ilyenkor a vérben nagymértékben megnő a fruktózkonce otráció és a fruktóz megjelenik a vizeletben is.

Fontos körülmény a fruktóz metabolizm usában, hogy a fru ktolcin ázt nem gátolja a reakcióban keletkező fruktóz- l-foszfát (szemben a hexolcinázzal, amelyet allosztérikusan gátol a glukóz-6foszfá t), vagyis a sej tekbe került fruktóz azonnal foszforilálódik. Ennek fiziológiás körűlmények között az a következm énye, hogy a májsejtek fruktózfe lvétele nem korlátozott. Fruktóz keletkezhet is az emberi szervezetben g lukózból, szorbitolon kere ztül (2-82. ábra). A fruktóz a spermiumok legfőbb energiaforrás a, amihez a fruktóz a vesicula seminalisban keletkezik és innen szekretálódik . A pem1i urnokban a fruktóz a glikolízis és a citrátkör folyamataiban COrdá és H20-zé oxidálódik, a kel etkező energia pedig a sperrniumok rnozgását fedezi.

CH2 0H

l

H - C - OH

l

HO - C-H

l

)))))))))))))))))))l))) ) ))))>>)ll))))))ll))))))) ))))))))))))))))))))))l

keznek, tehát csakúgym int a fruktóz, a galaktóz is a glukózmetabolizmus valamelyik útjába csatlakozik (2-83. ábra). A galaktózt a galaktokin áz foszforilálj a az ATP terhére. A reakcióban galaktóz-l- foszfát keletkezik. A következő lépést a galaktóz-1-foszfáturidil-tran szferáz katalizálja, amelynek eredményeképpen UDP-galaktóz és glukóz-l-fo szfát képződik. Ennek a reakciónak az a jelentősége, hogy az epirneráznak, amely a ga laktóz~ glukóz átalakítást végzi, az UDP-galak tóz a szubsztrátja. A keletkező UDP-glukó z glukóz-1-foszfáton keresztül glukóz-6-foszfáttá alakul, amelynek további ú~át a metabolizmus egyéb tényezői határozzák meg.

Nem metabolizálódik a galaktóz akkor, ha elégtelen az UDP-galaktóz szintéziséhez szükséges galaktóz-1-foszfát-uridil-transzferáz mű­ ködése, mert a folyamat a galaktóz-l- foszfátnál megáll. Ez az állapot a galactosae mia, amelyre jellemző a tej fogyasztás után fellépő hányás, hasmenés, a máj megnagyobbodása, sárgaság és mentális retardáció kialakulása. A galactosaemia galactosuriával jár. A tejet és tejtermékeket a beteg étrendjéből ki kell hagyni, s így valamennyi klinikai tünet visszafejlő­ dik, a mentális retardációt kivéve. Ezért nagyon fontos a betegség korai felismerése. Galactosaemiában a galaktóz az aldóz-reduktáz hatására redukálódik és galaktítol képződik (2-84. ábra). A galaktital képződése a szemlenesében cataracta (szürkehályog) kialakulásához vezet.

H -C-OH

l

H - C- OH

l

CH2 0 H CH2 0 H

l

2-82. ábra. Fruktóz keletkezése glukózból és a szorbitol képlete

H - C-OH

l

HO-C-H

l

HO - C - H

l

H - C-OH

A galaktóz szintén fontos tápanyag, különösen szü letés után, arnikor a tej meghatároz ó táplálék. A tejcukorból (laktóz) az emésztés során keletkező galaktóz a májban metabolizá lódik. Az átalakulásban a glukózmetabolizmus intermedierjei kelet-

ANYAGCSER E

l

CH2 0 H

2-84. ábra. Galaktitol

r

ZÉNHIDRÁTOK ANYAGCSERÉJE

>H>>>>>>>>>>>>>>>>H>>Hn>>>>>>>HH>>>>))n>u>>>>>>H>>>H>>>H>>>n>>>>>>nnh>>>>>>•>>>>H>>>HH>>>>>>>>>>>>>>n>>>»>>>>>n>>

125

galaktóz

OH

ATP galaktakináz

ADP

galaktóz-1-foszfát

OH

UDP-glukóz~ glukóz-1-foszfát

J(.

galaktóz-1-foszfáturidil-transzferáz

GALACTOSAEMIA

+ U DP-galaktóz

i

UDP

....

glukóz --.....c~~ laktóz

OH

~

laktózszintázJ

katalitikus alegység

+

a -laktalbumin

galaktóz-4-epimeráz

U DP-glukóz

t

PP, ....

UTP

~

glukóz-1-foszfát ~-_-_-_-_-_-. glukóz-6-foszfát

2-83. ábra. A galaktóz metabolizmusa. A sötétebb szürkével satírozoli keretben az látható

emlőmirigyben történő

laktózszíntézís

J

J26

)}>> ~))U))) )h) })>>)))) >)>>>))) >HHU> )))))) ))>>)))H> )l ))l))))))))}))))))))» >»> >> )U)))))))>) >>)))))))})))H))))))))) )))))))))))

A galaktóz nem esszenciá lis tápanyag. Tekintettel arra, hogy az UDP-gal aktóz-4-e pimeráz által katalizált reakció reverzibi lis, a glikoprot einek, a glikolipidek, illetve szoptatás alatt, a tejcukor szintéziséhez szüksége s galaktóz glukózbó l szintetizá lódhat. A laktózszintézis az emlőmirigyben történik a laktóz-sz intáz hatására. Az enzim katalitikus a legysége, a galaktozi l-transzfe ráz, amelynek szubsztrát specificit ását az határozza meg, hogy jelen van-e egy másik a legység is, az a.-laktalb umin. Ennek hiányába n a laktóz-sz intáz a galaktózt N-acetil-glukóz aminhoz köti, arninek számos szövetbe n a glikoproteinek szintézisé ben van jelentősége. laktóz-szintáz UDP-galaktóz + N-acetil-glukózamin - - - - - • katalitikus alegység galaktóz-N·acetil·glukózamln (1-4) + UDP

a.-laktalburnin rnódosítja a katalitikus alegység specificit ását úgy, hogy jelentétéb en a galaktóz a g lukózhoz kapcsolód ik és tejcukor keletkezi k (2-83. ábra). Az a.-laktalb umin szintézise hormonális szabályoz ás alatt áll és prolaktin hatására, a szülést követően csak az em lőmirigyben keletkezik. Ezért laktóz csak itt szintetizálódik.

A glikogén szintézise és lebontása A sejtek egy jelentős része képes a glukóz raktározására glikogén formájában. A két legfontos abb glikogénr aktár a máj és a vázizom. A glikogénb en történő raktározá s el őnye, hogy igényese tén gyorsan és glukózké nt mobilizál ható a benne tárolt g lukóz. Hátránya , hogy nagyobb a raktározá s helyszükségle te annál, mint amikor a g lukózból zsírsavak képződnek és a tárolás lipid formában történik. Ez utóbbi esetben azonban a mobilizálás során képződő interrned ierek nem glukoplas ztikus anyagok.

Glikogénszintézis A glukóz-6 -foszfát - amely a glukóz foszforilációja, illetve a glukoneo genezis során képződik szubsztrátja a foszfoglu komutáz enzimnek ; reverzibilis reakcióba n glukóz- 1-foszfáttá alakulhat:

>)))) >) )))))) )) >) )UU>>>)))))))) >>

>)) )))

glukóz-6-foszfát~

ANYAGCS ERE

glukóz- l -foszfát

A foszfoglu komutáz kofaktora a reakció intermed ierje, a glukóz- l ,6-biszfoszfát. Az enzim aktív centruma foszforilá lt szerint tartalmaz, amely reverzibil iserr elveszti foszfátcsoportját, amikor a glukóz-6- foszfátbó l glukóz-l ,6-biszfos zfát képző­ dik. A foszfoenz im regenerál ódik, amikor a glukóz-l ,6-b iszfoszfá tról (a 6. C-atomró l) a foszfát visszaker ül az enzimre és kialakul a glukóz-l- foszfát. A keletkeze tt g lukóz- l-foszfát UTP-vel nukleotid hoz kötött "aktivált" glukózt képez, amely nemcsak a glikogéns zintézis, hanem több más bioszinte tikus útnak is prekurzora. A reakció kondenzá ció, az UDP-glukóz-pirofoszforiláz enzim katalizálj a, miközben pirofoszfát szabadul fel. A pirofoszf át az anorganikus pirofoszfatáz által katalizált reakcióban anorganikus foszfátok ra hasad, így az UDP-glu kóz képző­ désének ára két nagy energiájú kötés. Emiatt ez a folyamat exergoni kus folyamat (G0 .=-25kJ/mol). glukóz-l- fo zfát + UTP UDP-glu kóz + PPI

~

A glikogén-szintáz által katalizál t glukóz transzferben az UDP-glu kózról a glikogén láncvégj glukózához (nem redukáló vég) egy újabb glukóz kapcsolód ik (2-85. ábra). A glikogén- szintáz mű­ ködéséhe z egy legalább négy glukózt tartalmazó poliglukó z primer szüksége s. A gl ikogén igen nagy molckulatö megü polimer (több ezer kO) részcc két. partikulum ot képez a sejtben, amely elektronmikroszkóppal látható. Szintézisén ck tanulmányozá ában az új molekula kezdete. a primer megi merése igen nehéz feladatot jelentett. Jelen ismeretcink szerint az első glukóz egy glikogenin nevü fehérjében egy Tyr-hoz kapcsolódik. A glikogenin és a g likogén-szintát. együtte hatása szük éges az első nyolc glukózegys ég összekapcsolá ához. A glikogcnin a g li kogénrésze cske képződése során a partikulum belsejében a poli-glukó7 lánchoz kovalensen kötve helyezkedik el.

A glikogén- szintáz mellett a glikogén szintézisében igen jelentős az elágazáso kat kiaJakitó amiJo-(1 ~4)-(1 ~6)-transzglikoz iláz vagy glikozil(4~6)-transzferáz enzim müködés e (2-86. ábra). Ha egy, legalább ll glukózbó l álló lánc elkészül, az enzim egy kb. 7 glukóz ál tal alkotott láncrészt áthelyez és a. l -6 kötéssel kapcsolja a pol iglukózlánchoz.

N

~

'Z

:t

o

~ -l

o

o;J\

ll

c HN

/

l

Ho

H

1

ll

ll

ll

(j Vl

CH C "-N /

ef'

o1

> z -< > C')

""CH

r"l

~

~­

o--p - 0- P - 0- CH2

~

.

o

o

~

~

~

U DP-glukóz

OH

OH

C~OH

CH20H

..1----0

..1---

CHp H

- 0

"'~

:;;

~ ~

~

g

~

glikogén~

szmtáz

o

o

OH

:;;

"'

~

:;;

::::

::::

OH

H

CHpH

l

CH20H

CHpH

CH20H

H

OH g likogén (glukóz)n

~ ~:;;

~::: ~

:::

..1----0

l

H

~

::::

H glikogén (glukóz)n. 1

o

o

o

~

:;;

~:;; ~

:;;

:::

;

H.

OH

H

OH

H

OH

H

~

::::

"

2·85. ábra. A glikogén-szintá z által katalizárt reakció

N ....

UDP UDP

(

(7)

nem redukáló vég 4

UDP

6 nem redukáló vég

---O H

o

transzglikoziláz glikozil- (4-6) transzteráz

l

@CH2

-o H

2-86. ábra. Elágazások

képződése

OH

a glikogénszintézis folyamán

A g likogénmolekula felépítésében igen nagy j el en tőségűek az elágazások. A láncvégi glukózok számának növelése több l ehetőséget nyújt a glikogén-foszforil áz, illetve g likogén-szintáz mű­ ködésére, ezért ez gyorsítja a glikogénszintézist és a lebontást.

Glikogénlebont ás A g likogén lebontását a sejtekben a glikogénfoszforiláz enzim katalizálja. A reakcióhoz anorganikus foszfátra van szükség, a lehasadó glukóz

foszforilálódik, és glukóz-l-foszfátk ént szabadul fel (2-87. ábra). Ez a foszforolízis energetikailag igen kedvező. Így a glikogén-foszforiláz által katalizált reakció különbözik a g likogén hidralitikus bontásától, amelyet az amiláz katalizál és a szénhidrátok emésztésében van szerepe. A glikogénfoszforiláz müködéséhez piridoxál-foszfát szükséges. Az elágazásokat külön ("debranching") enzim, az ún. oligo-(a.~6)-(a.~ 4)-glukán-transz feráz bontja. A képződött glukóz- l -foszfátbó l glukóz-6-foszfát lesz a foszfoglukomutáz által katalizál t reakció-

SZÉNHIDRÁTO K ANYAGCSERÉJ E

>)))))) >> )) )) >>)) >>)))))))>>>)>U >>)) >> >> >> >>)))) )))))) )> >>>>)))) >>))>> )))~))))U)) H >H> >>)))) >))>)) )) ) ))))) >>)) >)

)})) ~) )))))))) >>)))

129

2-87. ábra. A glikogén-foszfo riláz által katalizált reakció

H

OH

H

OH

glikogén (glukóz)n glikogenfoszforiláz

!l/

r

+ H

OH

glukóz-1-foszfát

ban, amely vagy a glikolizisben alakul tovább (izom), vagy a glukóz-6-foszfatáz hatására glukózzá alakul (máj ) és a keringésbe jut.

A glikogén-an yagcsere szabályozá sa A glikogén-anyage ere szabályozá ának részletes megismerése igen nagy jelentöségü volt mind a cAMP-függö szabályozások mechanizmusának, mind a poszttranszláció kovalens módosítá ok reguláció szerepének megértésében. A glikogén-fo zforiláz volt az el ö olyan allosztériku enzim. ahol a reverzibil is fehérjefoszforilá ció szcrepét a szabályozásban fcltárták. Így ez az enzim az enzimaktivitás szabályozá ának gyakran használt ,.iskolapéldája". Röntgenkri ztallográfiás vizsgálatokkal megi merték mind az aktív. mind az inaktív enzim háromdimenzió szerkezetét.

A glikogénszintézis és -lebontás két kulcsenzime a glikogén-szin táz és glikogén-fosz foriláz foszforHált és foszforilátatl an formában létezhet. Mindkét enzim polipeptidláncaiban több Ser-OH

glikogén (glukóZ)0 _ 1

foszforilálódik protein-kiná z hatására, illetve foszfoszerinek vesztik el foszfátcsoportjaikat foszfoprotein -foszfatáz hatására. A foszforiláció lényegesen befolyásolja enzimaktivitásukat A glikogén-szintáz foszforilált formában inaktív, míg a glikogén-foszforiláz foszfori lált formában aktív. Így a foszforiláció ellentétesen befolyásolja a két enzim aktivitását. Az izom- és májglikogén funkciója az anyagcserében különbözik egymástól, a glikogénmetabolizmus szabályozása is eltérő a májban és az izomban. Izomban a glikogénből felszabad ul ó glukóz- l foszfát a glikolízisbe kerül. Az izomglikogén az izomsejt energiaraktára , amely a fokozott izommű­ ködés megnövekedett energiaszükségletét hivatott fedezni . A glikogén-foszforiláz szabályozását az 2-88. ábra mutatja. Az enzim nyugalmi állapotban zömmel foszforilátatla n glikogén-fosz foriláz b (kevésbé aktív). A foszforiláció a két identikus

cAMP-függ6 protein-klnéz

ATP

+

ADP Ca2·

+

foszforiláz b-kináz (u, fl, y, 8)4 (aktiv)

foszforiláz b-kináz (inaktiv) foszteprotein-foszfatáz l

1

HO

/

~ ATP

glikogén-foszforiláz b (kevésbé aktív)

ADP

glikogén-foszforiláz a (aktív)

l

foszteprotein-foszfatáz l

glikogén~ glukóz-1-foszfát P,

+ glikogénn-1

2-88. ábra. A glikogén-foszfori láz szabályozása

alegységbő l

á lló enzim egy-egy Ser OH c oportján következik be a foszforiláz b-kináz enzim által katalizált reakcióban. A fo zforiláz-kináz 4-féle alegységböl á lló enzim (a, j3, y, ö)4 • Az a - és 13alegy ég tartalmazza azokat a Ser oldalláncokat, amelyek a cAMP-dependens protein-kináz hatásá2 ra foszforilálódnak. A ö-alegy ég 4 Ca ' kötöhellyel rende lkezik és megfelel a kalmodulinnak (e 2 fehérjéről az 5. fejezetben lesz szó). A Ca +-kötés hatá ára aktiválódik a y-katalitiku alegység, defo zfori lá lt enzi m e etében i . A fo zforilá lt enzim

i csak Ca 2 jelenlétében müködik teljes aktivitá sal. Ezért vázizomban a kalciu mot a foszforiláz b-kináz a llosztérikus aktivátorának tekintik. 2 Izomkontrakció során az intracelluláris [Ca ] emelkedik é serkenti a foszforiláz b átalakulá át foszforiláz a-vá. Így alakul ki a gükogénfoszforiláz a (aktív). A g likogén-foszforil áz a és a foszforiláz-kináz defoszforilációval kerül a kevé bé aktív b á llapotba, ezt a folyamatot a foszforiláz a-foszfatáz (vagy foszfoprote in-foszfatáz-1 ) enzim katalizálja (2-88. ábra). A foszforilációval tör-

ZÉNHIORÁTOJ< Al'iYAGCSERÉ JE

J))))))))))))) ))))))))))))))) )>>>>>)))))) )))>>))>>>>

))))))>> ))'))))U U)) .))U))))) U)))))) )H>)>>> U))))))

H))~)))>>))>> H)))) U))))')~

l31

p

P 2H

Ca serkent

foszfoproteinfoszfatáz l

glikogén-foszforiláz b (kevés bé aktív) oszttranszlációs ovalen s módos ítás.

ozása vázizom ban 2-89. ábra. A glikogé nlebon tás kovale ns és alloszt érikus szabály

szabályozás másod percek alatt megy végbe hormonok - vázizo mban elsősorban az adren alin - hatására, B-receptor közreműködésével, cAMP által mediá lt szigná l transz dukció val (lásd 5. fejezet). A glikog én-foszfori láz a hatásá ra keletkező glukóz -l-fosz fát g lukóz- 6-fosz fáton keresztül a glikolízisbe áramli k, fokozódik az ATP-t ermelé s, ami az intenzív izomm unka energi aigény ét bizto-

ténő

sítja. A hormonális szabályozáso n kívül a glikog én foszfori láz b allosz tériku san is aktiválható AMPvel (2-89. ábra). A foszforiláz b AMP-kötőhellyel rendelkezik. AMP hatásá ra rns-ok alatt a foszforiláz b aktív lesz, így az allosztérikus szabályozás gyorsabb, mint a posztt ranszl ációs kovalens modifikáció. Az AMP- konce ntráció akkor emelkedik, ha fokozódik az ATP-b ontás, pl. intenzív

izommunk.ában. Ha az A TP magas koncentrációban rendelkezésr e áll, az AMP nem aktiválja az enzim et, mert az ATP gátolja az AMP kötődését az alloszt érikus kötőhelyre. Így ez a szabályozás az AMP/ ATP arányt ól függ. Májba n a glikog énrakt ár funkci ója a vércukorszint fenntartása. Ez vércukorszin t-csök kenés esetén glikog énlebo ntást és g lukóze xporto t, táplálékbev itel, illetve többle t esetén glukóz impor tot és raktár ozástj elent. A glikog enolízis során felszabaduló glukóz - J-foszf átból, hasonl óan az izom hoz, g lukóz- 6-fosz fát lesz. A glukóz-6-foszfátot azonban a hepato cita endop lazmá s retikulum luminális kompa rtment jében levő g lukóz- 6-fosz fatáz defoszforilálja és a g lukóz a vérpályába szecernálódik. A májba n a glikog én-fos zforilá z b~a áta lakulás fó hormonális serkentője a gluka gon,

132

))))))))))))))))>)))))))) ))) ))))))))))))))))))))U))nH))>)))))))) )))H))H>>>>>))))H)))))))))l)))H> ))))))))))))))))))))))))))))))))),)))))

2 glukóz

)))))))))))))))))))))))))))))) ))

AN YAGCSERE

2P1

~

1

foszforiláz a foszfatáz

glikogén-foszforiláz a (aktív)

glikogén-foszforiláz b (kevésbé aktív)

2-90. ábra. A glikogén-foszfori láz a glukóz szenzor funkciója a májban

cAMP mediált jelátvitelleL A cAMP dependens szabályozás mellett a májban is létezik egy, az intracelluláris Ca2+-koncentráció emelkedésén keresztü l, a. 1-adrenerg receptorokkal rnediált jelátviteli út, amelynek révén az adrenalin fokozza a glikogénlebontást. Hasonló hatású a vazopresszin, az oxitocin és az angiotenzin ll is.

A glikogén-foszforiláz a a májban allosztérikusan is szabályozódik; az effektor molekula itt a glukóz (2-90. ábra) . Emelkedett vérglukóz-koncentráció esetén a glukóz bekerülve a hepatocitába a foszforiláz a-hoz kötődi k és konformációs változást o koz. Emiatt a foszforiláz :: szubsztrá~a lesz a foszfatáznak és a foszforilált Ser defoszforilálódik,

- - -+• cAMP-dependens protein-kináz

",-"

",",/'

'

\\,

","'

',

",","'

\

",",","'"'"'

/'

r

'lll(

~"'"'"'

foszforiláz-kináz b

foszforiláz-kináz a // /l

+

Jt'_"/'

,,'

/

glikogén- ~ glikogénszintáz a ~ szintáz b (aktív) ............. ....................

)~

glikogén- ~ glikogénfoszforiláz b ~ foszforiláz a / (aktív) 11

.........., _

l

.......................

/1 ......................... .....

/

,'

// ,,

l l

/

/

foszteprotein-foszfatáz l

l

inzulin (máj) glikogénszintézis

2-91. ábra. A glikogén-anyagcsere cAMP-függö reciprok szabályozása. Feketével a glukagon, pirossal az inzulin hatására végbemenő folyamatokat jelezzük

SZÉNHIDRÁTOK A NYAGCSERÉJE

)))))) )))))) )) )))) )))) ) ) )))) )))))) )) )))) )))) )))))) )))))) )) )))))))) )) )))))) )) ) ) )) )) )))) )))) ) ) )))) ) ))))))) ) ) ) ) )))) )))) ) ))) )))) )) ) ) ))))))

a foszforiláz a foszforiláz b-vé alakul. és a glikogénlebontás abbamarad. A máj glikogén-foszforiláz a-t ezért glukózszenzor molekulának tekintik, ami a máj glikogén metabolizmusát a vércukorszintnek megfelelően alakítja. A glikogén-szintáz regulációja ezzel éppen ~1lentétes. A foszforilálatlan állapotban aktív enzun a glikogén-szintáz a. Többféle - köztük cAMP és kalmodulinfüggő - protein-kináz hatására foszforilálódik és az enzim foszforilált, kevésbé aktív glikogén szintáz b-vé alakul. Aktiv állapotba az enzim defoszforilációval, a foszfoprotein-foszfatáz-1 által katalizált reakció segítségével kerül. A foszfoprotein-foszfatáz aktivitásátafoszforiláz a gátolja. A foszforiláz a~b átalakulással a gátló hatás kiesik, így a glukóz hatására nemcsak a glikogenolízis csökken, hanern a glikogénszintézi.s is fokozódik. A glikogén-szintáz b defoszfonlálását, így aktíválását az inzulin serkenti. Összefoglalva: a szabályozás azt biztosítja, hogy egyszerre teljes intenzitással ne történjen glikogénszintézis és -lebontás (2-91. ábra). A glikogénszintézis és -lebontás enzimei, a glikogén partikulum részeként, együtt helyezkednek el. A hormonális, allosztérikus mechanizmusokon, szabályozásokon kívül a fehérje- fehérje kölcsönhatások is igenjelentős szerepetjátszanak a sok enzimbő] álló összetett rendszer rnüködésében.

133

A glukóz-6-foszfatáz hiánya következtében a glikogén nem tud lebomlani, mivel nincs meg a glukózszekréció lehetősége. Ezért hypoglykaemia alakul ki, étkezések közötti éhségrohamok jellemzik az állapotot, ketosis és hyperlipaemia lép fel. A máj glikogénszerkezete normális, de a mennyisége igen nagy és hepatomegaliajön létre. A McArdJe-szindróma az izom glikogénfoszforiláz hiányamiatt alakul ki. Hiába magas az izom glikogéntartalma, az egyébként normáJisan fejlett betegek képtelenek aktív izommunkára. A laktátkoncentráció ilyen esetekben nem emelkedik meg az izomban, illetve a pH nem csökken (lásd 2.7. fejezetet). Az izomglikogén nem tudja fedezni az izomsejt energiaszükségletét és ezt a szerepét nem lehet helyettesíteni mással. Ugyanakkor a betegségből az is következik, hogy a izomglikogén megfelelő hasznosítása nélkül is lehet élni. Az Andersen-betegségben a májban az elágazásokat katalizál ó enzim expressziója károsodik. Az így szintetizálódott glikogén kevés elágazást tartalmaz, mennyisége nagy és funkcióját nem képes ellátni. A betegség az első életévben halálos.

Glikogéntárolási betegségek

A vércukorszint szabályozása A glikogén-anyagcsere öröklődő rendellenességei a "glycogenosisok", a glikogéntárolási betegségek. Ezeknek a nem túl gyakori betegségeknek a segítségével igenjól éttelmezhetők és érthetők a glikogénmetabolizmus összefiiggései és szervspeciftkus tulajdonságai. Nyolc típusú glycogenosist írtak le, amelyek a glikogén-anyagcsere kölönböző enzimeinek defectusai. Közülük csak a legismertebb és Jegfontosabb betegségeket említjük. von Gierke-kórban egy nem glikogén metabolizmus enzim, a glukóz-6-foszfatáz expreszsziója igen alacsony a májban, vesében és vékonybélben. A von Gierke-kór volt nemcsak az első leírt glikogéntárolási betegség, hanem az első megismert öröklődő májenzimdefektus is.

A glukózkoncentráció normálértéke a plazmában 4,5- 5,5 mM. A vércukorszint normálértéken belül tartása életfontosságú feladat, mert a glukózkoncentráció hirtelen csökkenése az idegsejtek glukózfüggőségemiatt súlyos következményekkel jár. Bármelyik irányban tér el a vércukorszint a normálistól, kompenzáló mechanizmusok lépnek életbe. A szervezetben az egyes sejtek szintjén és a szervek között is összehangolt szabályozások működnek a vércukor normálszinten tartása érdekében. Ebben a szabályozásban a döntö szerepet két hasnyálmirigy eredetű hormon, a glukagon és az inzulin játssza. A glukagon a Langerhans-szigetek a-sejtjeiben termelődö 29 aminosavból álló polipeptid. Az ínzulint, amely két diszulfidkötéssel összekapcsolt

láncból áll (A lánc 2 1; B lánc 30 aminosav) a P-sejtek termelik. A honnonok nagyobb, prohormonok formájában szintetizá lódnak, amelyből proteolitikus hasítással alakulna k ki a hatékony moleku lák. Pl. a proinzulinból, amely egy 86 am inosavból álló peptidlánc, proleolitikus hasítás távolít el egy ún. C-peptidet úgy, hogy két lánc jön létre, amelyet az addig intramolekuláris diszulfidhidak fognak össze.

Arnikor a vércukorszint lecsökken, csökken az egyes szervek glu.kózfelvétele, rnegszű nik. a pancreasból az inzulin szekréciója és glukagon mobilizá lódik. Csökken a glukózfelvétel az izomban és a zsírszövetben, ahol inzulin szükséges a glukóz transzporter működéséhez. (Viszonylag ép marad a glukózfelvétel pl. az agyban, ahol a glukóz transzporter inzulinindependens és az alacsony KM-értékű hexokináz a glukózt azonnal foszforilálja, biztositva a glukózgrádienst). A hepatociták membránjában található glukóz transzporter

(GLUT-2) KM-értéke magas. A transzporter ilyenkor " fordított" irányban működik, mert a sejten belül a glukagon hatására megindulnak azok a folyamatok, amelyek a glukóz szekrécióját eredményezik. Glukagon hatására a májsejtekben aktiválódik a cAMP-dependens, foszforilációs kaszkád és a glikogénből glukóz-l-foszfát keletkezik, miközben a glikogén-szintáz inaktiválódik. A glukóz-l-foszfátból glukóz-6-foszfát keletkezik, ami a glukóz-6-foszfatáz hatására glukózzá alakul. A glukagon a glikolízis- glukoneogenezis egyensúlyát is a glukózkeletkezés irányába tolja el, mert a cAMP-dependens foszforiláció a fruktóz 2,6-biszfoszfát szintjének csökkentésével a glikolízist gátolja és a glukoneogenezist stimulálja. A glikolízis gátlásához hozzájárul a piruvát-kináz foszforilációval történő gátlása is. A májban tehát ilyenkor glukóz keletkezik - a g l ikogénből és a glukoneogenezisben egyaránt - , s ez a glukóz transzporteren keresztül a keringésbe kerül (2-92. ábra).

2-92. ábra. A glukagon- és inzulinelválasztás szerepe a vércukorszint szabályozásban

glukagonelválasztás t

glukózfelvétel i máj izom, szövet

l l

glikogénmobilizálás glukóz de novo szintézis máj

GLUKÓZ A KERINGÉSBE

~

glukózfelvétel i máj

inzulinelválasztás

glukózfelvétel izom zsírszövet

i

i

glikogénszintézis

máj

GLUKÓZKONCENTRÁCIÓ A KERINGÉSBEN CSÖKKEN

ZÉl HIDRÁTO KANYACC ERÉJE

>>•>•>>>>>)))))) ))l)>)))))))))))))))) ))))>-)))))))))))>> ))))))))U))))>))U))

)))))))))H))>H»l> >UH>>n>HllHllH l>U,>lU))))))))>

135

2-93. ábra. A glukóz transzport er plazmamembrá nba kerülése inzulin hatására az izom- és zsírszövet ben

glukóztranszporter

A vércukors zint-emel kedés, ami étkezések után fiziológiás, éppen ellentétes hatású . Azonnali - és hormonoktól nem függő - hatás a májsejtek be történő glukózfelvétel-fok ozódás, a GLUT-2 transzpOiteren keresztül. A glukóz-tr anszporto t nemcsak az teszi lehetövé, hogy a transzpor ter magas KM-értékű és nagy kapacitás ú, hanem az is, hogy aktiválód ik a szintén magas KM-értékű glukokin áz és a felvett glukózt azonnal foszforil álja. Ilyenkor vá likjelentőssé, hogy a májban a tö bbi szervtől eltérően magas KM-értékű hexokiná z izoenzim található. Magasab b vércukorszint mellett a pancreas B-sejtek glukózfelvétele is fokozódi k és inzulinelvá lasztás történik, miközben az a.-sejtekből csökken a glukagonelválasztá s. Az inzulin stimulálja a glukózfelvéte lt a harántesi kolt izomban és az adipocitá kban. A glukóz transzpor ter ezekben a sejtekben inzulin hiányába n intracellu lárisarr vezikulák membrán jában található, inzulin hatására pedig a plazmam embránb a kerül (2-93. ábra). Az inzulin azonnali vércukor szint-csökkentő hatását az izom és a zsírszövet fokozott glukózfe lvétele magyaráz za. (Az inzulin nem befolyáso lja a máj glukóztranszportjá t, ennek fokozódá sát közvetlenül a vércukors zint-eme lkedés okozza). Az inzulin hatása a májsejtek glukózme tabolizmu sára a glukagonéval ellentétes . A hatásmec hanizmus nem teljesen tisztázott , de az eredmény a foszforilációval regulálha tó enzimek defoszfor ilációja. Ez a glikogén -foszforil áz inaktiválá sát és egyidejűleg a glikogén- szintáz aktíválás át jelenti , továbbá a glikolizis stimulálá sát a fruktóz-2 ,6biszfoszfát szintjéne k emelése következ tében. A májsejtek ilyenkor a glukóz t a glikogénbe építik vagy a g lukózból zsírsavak at szintetizá lnak, tehát hatékony an távolítják el a g lukózt a keringésbőL Inzulin hatásának tulajdoní tható, hogy g lukózfelvételt követően két órán belül v isszaáll a vércu-

korszint a nonnálér tékre. Inzulin hiányába n, diabetes mellitusb an a már eleve magasab b vércukorszint a glukózfel vételt követően nagym értékben emelkedi k és a kétórás vizsgálati perióduson belül alig csökken (2-94. ábra).

~15

§. ·O 'ü ·CO

-E 10 Q)

u

c

o

~ l

N

~ 5 :l

e>

•Q)

>

1 idő

2 (óra)

2-94. ábra. Glukóztole rancia-tes zt. A vér g/ukózkoncentrációjának változása 100 g glukóz éhgyomorra történő elfogyasztását (nulla időpont) követően

Tartósan magas vércukor szint esetén spontán (nem enzimatik us) reakcióba n a glukóz az a ldehidcso porton keresztül a hemoglob in P-lánc NH2 termináli s aminocsoportjához kötödik (Schiff-b ázison keresztül ) O Hb - NH-

ll

CH2 - C -

H

l

OH OH

l

l

C - C - C - CH2 - OH

l

OH

l

H

l

H

AiiiYAGCSERE

@

és glikozilált hemoglobin jön létre (hemoglobin A 1c). A glikozilált hemoglobin megjelenése elhúzódó emelkedett vércukorszint jele. s akár a teljes hemoglobin 12%-át alkotha~a. A diabeteses betegek kezelése során a glikozilált hemoglobin mennyiségének csökkenése a terápia hatékonyságát jelzi. A diabetes mellitus késői szövődményeinek kialakulásában (retinopathia, nephropathia, neuropathia, kardiológiai szövődmények) szerepet tulajdonítanak más glikozilált fehérjéknek is, amelyek fi zikokémiai tulajdonságai a glikozilálás hatására megváltoznak Ilyenek például a kollagén, a fibrin és az antitrombin III. (lásd 6.3. és 6.5. fejezetet). A diabeteses cataracta patomechanizmusában az a-krisztallin glikozilálása a szemlenesében bizonyított.

:c

~ ü-

o

1

1

I

1/)

~

0- ü- ü- ü

l

:c

:2

E

l

·;::

:c

ou M

N

•(1)

c: Q)

:c

Ol

e :"Q

+

c..

o

.c: Q)

z
"O

@ l :c

o

l

o" A glukóz direkt oxidációja, pentóz-foszfát-út

:c

o o o n

~ .!?

l l

:c

l l

:c

l l

:c

:c

l l

l l

o

o o l

N

:r:

o- u- u- u- o- u

o.f'

:c

o

:r:

:r:

-ic:á

;(;j c

o

~

:J

c;, o N 1/) .E l

:c

CD

"'

.El (()

fi ;_; c

o

Je

:c

~ (\j' ....__

e

A glukóz direkt ox idációja elnevezés mellett ez a

i-;

•(1)

c: Q) Ol

c

@

l o 0-0-Ó-u- 5

o o Ll~

o

:c

:c

l

:c

l

.

:c

l

o :c

l

:c

l

:c

o

~ l

Cll

!O l

o c o ~

:J

c;, o N 1/) o

l

CD

:c

+

A glukóz direkt oxidációjának oxidatív szakasza A pentóz-foszfát-út el ső, el kötelező lépése a glukóz-6-foszfát átalakulása 6-foszfoglukono-de lta-laktonná. A reakció irreverzibilis oxidoredukció, amelyet a glukóz-6-foszfát-d ehidrogenáz katalizál (2-95. ábra). Az oxidálódó glukóz-6-foszfátról a hidrogén NADP ' -re kerül. A következő lépés a C l karboxi l- és CS hidroxilcsoport közötti intramolekuláris észterkötés (lakton gyűrű) felszakadásával - a reakciót a

Ol

.E N

•(l)

1

reakcióút a pentóz-foszfát-ciklus, a pentóz-foszfát-út elnevezést is viseli. A több elnevezés azt jelzi, hogy több rendel tetésű, különböző módokon megvalósuló reakciók sorozatáról van szó. A pentóz-foszfát-út során NADP+ redukálódik, illetve ribóz-5-foszfát termelődik glukóz-6-foszfátbóL A citoszolban lejátszódó reakciósorozat két részre osztható, az oxidatív szakaszra és a nem ox idatív szakaszra.

o -le .2

.c:

~

iö -....::: N

"'

.E l


N -o -le

~

....... .... .._ eV

N Cll

ev ev

~

:c

N Cll

~1

8

> :;; ev

~

...

)(

o

c..

~

-~

·ev

N Cll

@

o .E~

l o o l [~ I l l l :r:

:r:

:c

ü

ü - U- 0 - ü - 0

:c

:c

l

e :"Q

l

l

o:c

l

:c

l

:c

1/) l

CD l N

·O

~

:J

c;,

o

";

N

·0

1:

Q)

c.

<1: ...eV

.c

•ev

II'Í

Ol

C:.

SZÉNHIORÁTOK A ' YAGCSERÉJE

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))}))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))).))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))})))))))

137

o~ ~ H2C - OH

l

C= O

l

HO -C- H

l

H-C- OH

H2C-OH

foszfopentózepimeráz

1

C= O

l

H- C - OH

l

H- C- OH

l

l

CH2-o - ®

CH2 - 0 - ® xilulóz-5-foszfát

ribulóz-5-foszfát

foszfopentózizomeráz

c l

H- C- OH

l

H ~ C - OH

l

H- C - OH

l

CH2-o - ® ri bóz-5-foszfát

2-96. ábra. A ribulóz-5-foszfát izomerizációja és epimerizációja

laktonáz katalizálja - a 6-foszfoglukonát képző­ dése. Ez a reakció újabb dehidrogenálást készít e lő. A 6-foszfoglukonát-dehidrogenáz által katalizált első hasonlít az részben oxidoredukció dehidrogenálásra, amennyiben a hidrogénakceptor itt is a NADP- , részben kü lönbözik attól, mert ez egyúttal a szubsztrát dekarboxilezését eredményezi (oxidatív dekarboxilálás). Így a hexóz pentózzá - D-ribulóz-5-foszfáttá - rövidül. Az oxidatív szakasz során tehát két NADPH, illetve egy C0 2 (HC03- ) képződik, miközben egy glukóz-6-foszfátból D-ribulóz-5-foszfát lesz. A D-ribulóz-5-foszfát két módon alakulhat tovább (2-96. ábra): O izomerizációval a foszfopentóz-izomeráz szubsztrátjaként D-ribóz-5-foszfát képződik. A reakció mechanizmusa hasonló a glikolizis során megismert többi, aldóz-ketóz (glukóz6-foszfát ~ fruktóz-6-foszfát, glicerinaldehid-3-foszfát ~ dihidroxi-aceton-foszfát) izomerizációhoz. 6 D-x ilulóz-5-foszfát képződik belőle a foszfopentóz-epimeráz által katalizált reakció során. A o-ribóz-5-foszfát a nukleotidszintézis (lásd 2.5. fejezet) el őanyaga. Abban az esetben azonban, ha a sejtben erre éppen nincsen igény, további reakciók segítségével glikolízis intem1edierekké alakulhat. Az oxidatív út eredményeképpen: glukóz-6-foszfát + 2NADP- + H20 ~ ribóz-5-foszfát + 2NADPH + 2H+ + C0 2,

egy molekula glukóz-6-foszfát oxidálódik, ribóz5-foszfát és co2képződik, miközben két molekula NADP+ redukálódik.

A glukóz direkt oxidációjának nem oxidatív szakasza. Pentóz-foszfát keletkezése glikolizis intermedierekből A glukóz direkt oxidációjának nem oxidatív szakaszát reverzibilis reakciók alkotják. Ezek orán fruktóz-6-foszfát, i Iletve glicerinaldehid-3-foszfát képződik pentóz-foszfátokból, illetve a fol yamat fordítva is végbemehet a fenti glikolizis intermedi erekből pentóz-foszfátok keletkezhetnek. A reakciókat kétféle enzim, a transzaldoláz és a transzketoláz katalizálja (2-97. ábra). A transzketoláz két szénatomos csoport átvitelét teszi lehetövé, koenzime a tiam in-pirofoszfát. A transzaldoláz három szénatomos csoport átvitelét katalizálja. Mind a kétféle csoport ketocsoportot tartalmaz, így a donor minden esetben ketóz, az akceptor pedig aldóz. Ebbő l adódóan a kiinduláshoz mind a pentóz-foszfátok, mind a glikolizis intermedierek oldaláról egy ketóz és egy aldóz szükséges. A pentóz-foszfátokból indulva xilulóz-5-foszfátból és ribóz-5-foszfátból glicerinaldehid-foszfát és szedoheptulóz-7-foszfát keletkezik a transzketoláz által katalizált reakcióban. A keletkezett két intermedier transzaldoláz segítségével továbbalakul fruktóz-6-foszfáttá és eritróz4-foszfáttá . A fruktóz-6-foszfát további sorsa a g.li kolízis (glukoneogenezis) állapotának függvénye. Az eritróz-4-foszfát további metabolizmusá-

138

>HHH•>uH,n>>>>>>>>~••n•>•>•••>>n>>H>>»>>»>>H>>u>>>>n>>>>>>U>»»>»>>>>>>»>>U>>>>>»>>>>>>>>>»>>>>>>»>>>>»>»>>>»•>•>>>•H•>un»>>>»>»••>>>>»n>>H>

o '\-

c

CHOH

)1

l

c-o

H- C- OH

HO - C - H

H-C- OH

l

l

l

l

H- C - OH

H - C- OH

l

l

CH2-o - ® xilulóz-5-foszfát

A Y AGCSERE

CH2- 0 - ®

~

ribóz-5-foszfát

~nSZ.'CU . .J

CH pH

o ~ )1 ~c

l

H- C - OH

l

CH2 - 0 - ® glicerinaldehid-3-foszfát

l

C= O

' ----,---------HO C f.l

l

H- C- OH

l

H- C - OH

l

H- C-OH

l

CH2-0 - ® szedoheptulóz-7-foszfát

CHpH

l

o '\-

c

c o

l

H - C - OH

l

H - C- OH

H- C- OH

l

H-C- OH

l

l

l

l

HO-C- H

l

l

CH2-o - ®

H- C- OH CH2 - 0 - ®

l

C= O

l

HO - C- H

CH~OH

)1

eritróz-4-foszfát

V.

CH2-o - ® xilulóz-5-P

~nszketoláz

fruktóz-6-foszfát

CHPH

l

c- o l

HO - C- H

l

H- C - OH

l

H - C - OH

l

CH2- 0 - ® fruktóz-6-foszfát

2-97. ábra. A pentóz-foszfát-út nem oxidatív szakasza

o'\-

c

)1

l

H- C - OH

l

CH2-o - ® glicerinaldehid-3-foszfát

SZÉNHmRÁTOK

'Y i\CCSERÉJE

hoz egy újabb ketopenróz - xilulóz-5-foszfát kell, valamint transzketoláz. A reakció eredménye két glikolizis intermedier, a fruktóz-6-foszfát és a glicerinaldehid-3-foszfát Összefoglalva, két molekula xilulóz-5-foszfátból és egy molekula ribóz-5-foszfátból két molekula fruktóz-6-foszfát , illetve egy molekula glicerinaldehid-3-foszfát keletkezik három reverzibilis reakció során. Ebből következöen mindez fordítva is végberneh et. 2 xilulóz-5-foszfát + ribóz-5-foszfát ~ 2 fruktóz-6-foszfát + g licerinaldehid-3-foszfát

A pentóz-foszfát-út szabályozása, jelentő­ sége, lefolyásának különböző formái A pentóz-foszfát út jel entősége kettős, egyrészt NADPH-terme lés, másrészt a pentóz-foszfát szintézise. A NADPH-ra sokféle bioszintetikus folyamat redukciós lépésében van szükség, ilyen pl. a zsírsavak, a koleszterin, a szteroidhormonok szintézise. A NADP+ redukciójának ez az egyik legfontosabb helye. A ribóz-5-foszfát, illetve származékai nélkülözhetetlenek a nukleotidok, nukleinsavak szintézisében. A NADP+-redukció és a pentóz-foszfát-termelés igénye azonban nem mindig esik egybe. Vannak esetek, amikor N ADPH-ra van szükség, pentóz-foszfátra azonban nem és fordítva. A reakcióút különbözö módokon müködhet a sejt különböző metabolikus állapotainak megfelelöen. Irreverzibilis, el köte l ező és ily módon sebességmeghatározó lépés az oxidatív szakaszban a glukóz-6-foszfát dehidrogenálása. Ha a pentóz-foszfát-igény a domináns és NADPH-ra nincs szükség, a nem oxidatív szakasz aktív, az oxidatív szakasz nem működik. Ilyenkor a glukóz-6foszfát-dehidrogenáz - amelynek aktivitását el ső­ sorban a NADPt-/NADPH arány szabályazza gátlás alatt áll. Pentóz-foszfát fruktóz-6-foszfátbó l és glicerinaldehid-3-foszfátból keletkezik. Azokban az állapotokban, amikor N ADPH-ra és pentóz-foszfátra egyaránt szükség van, az oxidatív szakasz működik egyedül, a nem oxidatív szakaszra nincsen igény. Megjegyzendő körü lmény, hogy az oxidatív szakasz enzimei indukálható enzimek, amelyek példáu l más NADPH-igényes folyamatok

139

enzimeivel együtt (pl. citokróm P450 enzimek) koordinatíven indukálódnak Fokozott nukleinsavszintézis - ennek megfelelöen fokozott nukleotidfogyás - esetén is az oxidatív szakasz intenzívebb működése szükséges. Végül lehetnek esetek, amikor nincs pentózfoszfátra igény, NADPH viszont kell. Ez az az eset, amikor a reakcióút ciklusként működik; a glukóz-6-foszfátból ke letkezctt pen tó z-foszfátok tovább alakulnak fruktóz-6-foszfáttá, illetve glicerinaldehid-3-foszfáttá, amelyek, mint g liko lízis/glukoneogenezis intermedierek visszaalakulnak glukóz-6-foszfáttá. Ez egyben valóban a glukóz direkt oxidációja. Hat ciklus alatt a g lukóz valamennyi szénatomja C02-dá oxidálódik, miközben 12 molekula NADP..- redukálódik NADPH-vá. Különböző típusú sejtekben a ciklus különböző­ képpen reguláit és intenzitásának mértéke eltérő. Alacsony a ciklus intenzitása például izomsejtekben, ugyanakkor magas a zsírszövetben a zsírsavszintézis fokozott NADPH-igénye miatt, és daganatokban az intenzív nukleinsavszintézis miatt emelkedett pentóz-foszfát-igényt kompenzá-

2GSH

GSSG

NADPH + H

glukóz direkt oxidációja

2-98. ábra. A glukóz direkt oxidációjának szerepe a redox homeosztázis fenntartásához szükséges redukált glutation (GSH) szint fenntartásában (GSSG = oxidált glutation)

l 40

m> » »»» » » »»»>»>» >»»>»»»»» »»»» >m>>» >>»>>»»»»>>»» >»> »»» » >>» »» »» »m»>>>>»>m> >>» >>>»>»»»»» » » >>»»»>>>>»>»>»»>>>m

landó. Intenz ív a pentóz-foszfát-ciklus azokban a sejtekben, szövetekben is, ahol a glutation fontos a sej thomeosztázis biztosításában, így pl. vörösvértestekben, májszövetben. Az oxidált glutationt (lásd 2- I 6. ábra) a glutation-reduktáz redukálja, a reakcióban az elektrondonor a NADPH. Ezért nem megfe lelő NADPH-ellátottság esetén a redukált glutation szintje csökken (2-98. ábra) .

A pentóz-foszfát-cik/us működésének megváltozásával összefüggő kórképek

A glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz-hiány vörösvértestekben kb. l 00 millió embert érintő örökl ődő betegség. Fő tünete a rendszerint gyógyszer által indukált hemolitikus anaemia. A glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz csökkent expressziója vörösvértestekben - ahol nincs mitokondrium, ezért a pentóz-foszfát-út jelentősége a NADPH-tennelésben kiemelten fontos - különösen csökkenti a NADP.,. fokozott redukciójának lebetöségét. Vörösvértestekben a NADPH elsősorban az antioxidáns redukált glutation szint fenntartásához kell (lásd 2 .7. fejezet). Fokozott oxidáns hatás (például a betegség felfedezéséhez vezető antimaláriás vagy más gyógyszeres kezeléssel) fokozott glutationoxidációt, az emelkedett oxidált glutation szint intenzív NADPH-oxidációt eredményez. A pentóz-foszfát-út azonban nem tud intenzivebben működni éppen a glukóz-6-foszfátdehidrogenáz csökkent expressziója miatt, ezért a NADPH-termelés nem tud alkalmazkodni a fokozott igényhez. A glukóz-6-foszfátdehidrogenáz-hiány jellemző p éldája annak, hogy egy genetikai defektus akkor manifesztálódik betegségben, ha ezt egy környezeti terhelés kiváltja. A defektus prediszponáló tényező. Más genetikai okok miatt bekövetkező anaemiához hasonlóan, maláriás fettőzés esetén a glukóz 6-foszfát-dehidrogenáz-hiány is szelekciós előny, mivel az élősködő szaporodásának ez nem kedvez. A Wernicke-Korsakoff-szindróma szintén olyan kórkép, amikor a genetikai ok (a transzketolázhiány) meghatározott környezeti felté-

AN Y A GCS ERE

tel (B-vitamin-hiány- TPP) esetén manifesztálódik betegséggé. A kórkép krónikusan alultáplált, alkoholista betegeken fejlődik ki főként neuropszichiátriai tüneteket okozva.

Bioszintetikus folyamatok a szénhidrátok anyagcseréjében. Glikoproteinek, proteoglikánok szénhidrátláncának szintézise A szénhidrát-anyagcsere bioszintetikus fo lyamatai glukóz-l -foszfátból vagy fruktóz-6-foszfátból indulnak ki. A 2-99. ábrán összefoglaljuk a legfontosabb bioszintetikus fo lyamatokat. A bioszintetikus lépések ki indulási pon~a a nukleotid cukorszármazékok képződése. Az UDP-glukóz képződésével a glikogén-anyagcsere tárgyalásánál foglalkoztunk. Elsősorban UDPcukrok, de ezenkívül CMP- és GDP-származékok is szerepeinek az "aktivált" nukleotidcukrok között. Az UDP-glukóz fontos elágazási pont a szénhidrátszármazékok képződésében. UDP-glukózból UDP-galaktóz képzödhet epimerizációval. Az UDP-glukóz-debidrogenáz által katalizált reakcióban UDP-glukuronsav képződik UDP-glukózból. UDP-glukóz + 2NAD+ ~ UDP-glukuronsav + 2NADH + 2tr Az UDP-glukuronsav részben glukuronidáció kofaktora (lásd 2.6. fejezet), részben különbözö más metabolikus utak kiindulópontja (így a C-vitamin-szintézisnek is, az ehhez szükséges enzimek azonban emberben hiányoznak). Az UDP-xilóz, amely a glikoproteinek szénhidrátláncának alkotórésze, dekarboxilezéssel keletkezik UDP-glukuronsavból. A glikoproteinek és proteoglikánok szénhidrátláncában el őfordu l ó aminocukrok aminecsoportja glutaminból származik. A különbözö aminecukrok a glikoproteinek, glikoszfingolipidek és glukózaminoglikánok fontos alkotórészei. A Jegfontosabb aminecukrok a hexózaminok -

ZÉ:\'HIORÁTOK A VAG

141

Ell ÉJ E

glukóz-6-P

~===:::!!:

fruktóz-6-P

mannóz-6-P

~ --

ll

mannóz-1-P

glukózamin-6-P

~

N-acetil-glukózamin-6-P

UDP-glukuronsav --+ glukuronidok

~

glikogén

[ UDP-xilóz

laktóz

glukózamin

LGDP-mannóz

1l

N-acetil-glukózamin-1-P

j

r

U DP-galaktóz

glukóz~t J N-acetil-

--

UDP-N-acetil l

l

~ GDP-fukóz

UDP-N-acetil-glukózamin

galaktózamin

galaktóz-béta-N-acetilglukózamin

~

glikoproteinek

fCMP-N-acetil-neuraminsav

2-99. ábra. Szénhidrátok bioszintézisének fontosabb útjai. A glikoproteinek, proteogikánok szénhidrátláncának egyes alkotóit külön kiemeltük

glukózamin, galaktózamin és mannózamin és a 9 szénatomos sziálsav (N-acetil-neuraminsav). A szintézis során az aminocsoport-donor a glutamin . Az aminecukrok zömmel N-acetilált formában fordulnak e l ő, az acetildonor az acetil-CoA. A glikoproteinek szénhidráttartalma 1- 85% között ingadozhat. A humán glikoproteinek hétféle monoszacharidot tartalmaznak. Közülük a legjel entősebbek az oLigoszacharidlánc végén elhelyezkedő N-acetil-neuraminsav, amely rendszerint galaktózhoz, vagy N-acetil-galaktózaminhoz kapcsolódik. Ezenkívül a g likoproteinek szénhidrát oldalláncában g lukóz, mannóz, fukóz és N-acetil-glukózamin fordul elő. Az o ldalláncok komponensei el őször "aktiválódnak" és aztán kerülnek rá az oldalláncra. Az egyes "aktivált" nukleotidc ukrok képződését a 2-99. ábra mutatja. A szénhidrátoldalláncra egymás után kerülnek rá a komponensek. A k:ülönböző glikozil-tr·anszferá-

zok által katalizált g likozi lác iós lépések a Golg i-hálózat lumenében történnek, az UDPcukrok antiport-rendszereken keresztül transzportátódnak a citoszolból a lumenbe. A nukleotidcukor belépéséhez a vonatkozó nukleotid kilépése társul. A szénhidrátoldallánc a polipeptidlánc szerinjéhez, treoninjához vagy hidroxilizinjéhez 0-glikozidos kötéssel, vagy aszparaginhoz N-glikozidos kötéssel kapcsolódik. Ennek megfelelően O-kötött és N-kötött glikoproteineket különböztetnek meg. Egy fehérjének több mint 30 o ligoszacharid-lánca lehet, amelyek hosszúsága különböző.

A glikoproteinek szénhidrátláncát specifikus glikozid ázok bontják. Proteoglikánok azok a fehérjék, amelyek kovale nsen kötött glukózam inoglikánokat (GAG) tartalmaznak. Tulajdonságaik inkább a poliszachari-

14 2

)) ••))))))>H))))) >H>)))))))))))))))))))~))))H)))))))))) )U))))))))))))))))U))),.)))))))))))))))))) )) ))))))))')))))))))))))))))})H))H))))))) )))))))))U>u))))))))))))))))

dokra jellemzőek, mint a fehérjékre. Régebben mukopoliszacharidoknak nevezték őket. A proteoglikánok 95%-a szénhidrát lehet, amely a következő glukózaminogliká nokból áll: hialuronsav, kondroitin-szulfát , keratán-szulfát l, JI, heparin, heparán-szulfát, dermatán-szulfát. A GAG nem elágazó poliszaharid, amely ismétlődő di-szacharidokból épül fel. Az egyik alkotó aminoculcor D-glukózamin vagy D-galaktózamin, a másik komponens uronsav (D-glukuronsav vagy L-iduronsav). A hialuronsav kivételével szulfátot tartalmaznak O-észter vagy szulfátészter formában. A GAG a fehérjéhez szerinen vagy treoninon keresztül 0-glikozidos kötéssel kapcsolódik. A szénhidrát UDP-cukorról kerül a fehérjére. Ezenkívü l, a g likoproteinekhez hasonlóan, N-glikozid kötés is kialakulhat az Asn amid-N, illetve a GAG között. A proteogl ikánok szintézise az endoplazmás retikulumban történik, illetve a Golgi-hálózatban fejeződik be. A GAG-Iánc szintézise után további módo ítások történhetnek, például szulfatálás.

AN y AGCSE RE

A GAG lebontása specifikus enzimek segítségével történik általában a lizoszomákban. A lebontást endoglikozidázok, exoglikozidázok, proteázok, deacetilázok és szulfatázok katalizálják. A lebontó enzimek öröklődő hiánya a GAG felhalmozódásához vezet. Számos ilyen kórképet leírtak, ezeket mucopolysaccharidosisoknak, illetve mucolipidosisokn ak nevezik. Ezeket a betegségeket proteoglikánok tökéletlen lebontása során képződő oligoszacharidok felhalmozódása jellemz i a szövetekben. A derrnatán-, illetve beparán-szulfát lebontását katalizáló hidrolázok hiánya k:ülönféle kóros állapotokat eredményez, amelyek súlyos, halálos betegségek lehetnek. Szellemi visszamaradottság és különböző más tünetegyüttesek alakulnak ki. A mucopolysaccharidosis ritka, 30 OOO sz ületésből egy ilyen beteg jön a világra.

A fejezet megírásával kapcsolatban tett javaslatokért és kritikai észrevételekért a szerzök köszönetet mondanak Carzó Tamásnak, Dr. Szikla Ká rolynak és Dr. Tretter Lászlónak.

r

.3.

A lipidek anyagcseréje

Ádám Veronika

A lipidek olyan eltérő felépítésű és funkciójú molekulák, amelyek közös tulajdonsága, hogy vízben nem vagy csak nagyon rosszul oldódnak, ezért szövetekböl csak apoláros oldószerekkel vonhaták ki. Az emberi szervezetben számos fontos feladatot látnak el, amelyek közűl a legfontosabbak:

Mennyiségileg kevésbé, ám az emberi szervezet müködése szempontjából nem kevésbé fontos a szteroidhormonok, a zsírsavakból keletkező másodlagos messengerek és mediátorok, az epesavak vagy a felületaktivitással bíró lipidek szerepe. (Oldékonysági tulajdonságaik miatt a lipidekhez sorolhatók még az A-, D-, E-, valamint a K-vitaminok is.) Hidrofób tu lajdonságuk következtében a zsírok legtöbb funkciója (pl. membránstruktúra felépítése), raktározása (trigliceridcseppek az adipocitákban) és szállítása (lipoproteinek) a vizes környezettől elkülönülve, kompartmentekben történik. A 2-100. ábra a lipidek funkció szerinti felosztását mutatja.

O A metabolizmusban játszott szerep; a zsírsavak

oxidációja a sejtek számára energiát szolgáltat, illetve a trigliceridek formájában a zsírok biztosítják az energiaraktározás leggazdaságosabb fonnáját. 6 A sejtmembrán felépítésében meghatározó szerepet játszanak. A membránok alapszerkezete egy lipidstruktúra, amely a membránok barrier tulajdonságát biztosítja és megfelelő közegetjelent a fehérjék számára. , r~·-·~·~.~-~-"~":..:~~- ,·~"-~~' ·.~~!(1!! .. ·--~~-~-·.::::..-:_, . .

TRlGLICERIDEK

FOSZFOLIPIDEK

2-100. ábra. A legfontosabb lipidek és funkcióik

·.l'J. '._it...-:,~ ~.. :_-..;·b:~~-~ . -~--~---~_.!..)l .. ~ 1'

·- , ..

LII?IDEK

.

GLIKOLIPlDEK

.

~~~~

::

;::.~ ~ ~

:"

_

·.,

,',·--: ~

KOLESZTERIN

.

SZTEROIDHORMONOK EIKOZANOIDOK VITAMINOK (A, D, E, K)

A. VA GCSERE

A legfontosabb zsírsavak és jelölés ük A legtöbb lipidtermészetű anyag vagy zsírsavat tartalmaz, vagy zsírsavakból származik. Kisebb mennyiségben a zsírsavak nem észter fo rmában, nagyrészt azonban komplexebb molekulák részeként, zsírsavészterekként fordulnak elő. A lipidek két legfontosabb funkciója szempontjából is meghatározó a zsírsavak szerepe; oxidációjuk során a sej tekben (elsősorban a máj és izomszövetben) felzabaduló energia ATP-szintézist eredményez, a trig liceridek részeként a legfontosabb energiaraktárként szo lgálnak, a foszfolipidek (és szfingolipidek) részeként pedig meghatározzák a membránok felépítését és számos tulajdonságát. Részt vesznek a glikolipidek, a prosztaglandinok és a koleszterinészterek alkotásában is. A zsírsavak egy szénhidrogénláncból és egy terminális karboxiicsoportból állnak, amelyet legegyszerűbben a CH 3-(CH 2)n-COOH képlettel lehet leírni. A szénhidrogénlánc hossza különbözö lehet, így önkényes felosztás alapján rövid szénláncú a 2- 5, közepes szénláncú a 6-ll , hosszú szénlánc ú a 12- 26 szénatomot tartalmazó zsírsav. A szénhidrogénlánc hidrofób karaktere meghatározó a zsírsavak két legfontosabb funkciója szempontjábóL Ez a tulajdonság határozza meg a membránokat fel építő lipidekben a zsírsavak orientációj át, így végső soron a membránok alapszerkezetét, és ez teszi lehetövé azt is, hogy a trigliceridekben az energiaraktározásnak egy gazdaságos és koncentrált formáj a valósul meg. A zsírsavakban a szénatomokat többféle módon j elölhetjük, amelyekközül a legáltalánosabb a számozás, a karboxiicsoport C-atomját tekintve az el ső szénatomnak. Elterjedt még a görög abc betűi­ nek a használata, aho l az alfa-szénatom a karboxiicsoport melletti szénatomot jelzi, az omega pedig az ettől legtávolabbit.

a

4 CH3-

3

2

(CH 2 ln- C H2 - CH 2 - CH 2 -

1 COOH

J

A zsírsavak ezen általános képlete kettős kötést nem tartalmazó, telített zsírsavat mutat. A szervezetben j elentőségge l bíró zsírsavak egy része azonban egy vagy több kettős kötést tartalmaz, azaz egyszeresen vagy többszörösen telítetlen. A szervezetben szintetizá lódó zsírsavakban a kettős kötés mindig cisz-konfigurációj ú, s ha a molekulában egynél több kettős kötés található, ezek soha nem egymás mellett, hanem három szénatomnyi távolságra helyezkednek el. A kettős kötést általában a delta és egy szám jelö li, amely megadja a kettős kötések pontos helyét is. A 16: l Ll9 tehát a palmitoleinsavat írja Le, amely 16 szénatomot és egy kettős kötést tartalmaz a 9. és J O. szénatom között. A szervezetben el őforduló legfontosabb zsírsavakat és jelö léseiket az 2-5. táblázat mutatja.

2-5~

táblázat. A szarvezetben legfontosabb zsírsavak -~-

Zsirsav neve

palmitinsav palmitoleinsav sztearinsav olajsav linolsav linolénsav arachidonsav

l

előforduló

1Kettő~ f

Catomok száma

16 16 18 18 18 18

l 20

Kettős

kötések helyzete

kötések l száma

o

l~

2 3

4

69

w-7

L\9 L\9, 12 L\9, 12, 15 AS, 8, 11, 14

(1)-9 (o>-6 w-3 w-6

A t. és w jelek magyarázatát lásd a szövegben

A kettős kötés helyzetét megadha~uk az omega-véghez viszonyítva is, így négy olyan fontos csoport ír ható le, melyek az 2-5. táblázatban látható "szü l ő" zsírsavakbó l keletkeznek, de egymásba átalakulni nem tudnak. A 20 szénatomot tartalmazó arachidonsav pl. az ro-6-csoportba tartozó linolsavból szintetizálódik, nem keletkezhet azonban a szintén 18 szénatomos, de az ro-9-csoportba tartozó olajsavbóL A zsírsavakban a kettős kötés jelenléte megváltozta~ a a szénhidrogénlánc mozgékonyságát, mely telitett zsírsavakban egy flexibilis, lineáris struktúra. A telítetlen zsírsavak az eml ős szervezetekben cisz-konfigurációban fordulnak e lő, ezért a molekula hossztengelye megtörik.

LIPIDEK ANYAGC ERÉJE:

)))))))))))))))))))))))))>)))>)))))))))))))))))))))))))))»))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))1)))))))1>)))))))

A szei-vezet számára szükséges zsírsavak részben a bioszintézis során a szervezetben keletkeznek, részben a táplálékkal elfogyasztott zsírsavakból származnak. Mivel a metabolizmus során a zsírsavak jelentősen médosulhatnak a szervezet, illetve az adott sejt pillanatnyi igényeinek megfelelően, a táplálékkal elfogyasztott zsírsavak összetétele nincs közvetlen befolyással a sejtek zsírsavösszetételére. Két szempontból is meghatározó azonban a tápláJékban található többszörösen telítetlen zsírsavak mennyisége, valamint a telített és telítetlen zsírsavak aránya. A bioszintézisben a 9. szénatomtól disztálisan nem tud kettős kötés kialakulni, ezért linolsav (ro-6) és linolénsav (ro-3) nem szintetizálódik. Ezek az esszenciális zsírsavak, melyeket a táplálékkal kell a szervezetbe juttatni, s amelyek szükségesek a membránalkotó többszörösen telítetlen zsírsavak és az eikozanoidok szintéziséhez (lásd 6.4. fejezet). Valószínűleg ezek hiánya magyarázza azoknak a tüneteknek egy részét (dermatitis, rossz sebgyógyulás), amelyek tartósan zsírmentes diétán tartott egyénekben alakulnak ki.

145

Egy, az Egyesült Á llamokban fol ytatott vizsgálat azt mutatja, hogy a táplálékban található többszörösen telítctlen és telítell zsírsavak aránya fontos tényező a szérumkoleszterin-szint szabályozás ában is, ez utóbbi viszont a szívinfarctus szempontjából meghatározó, ún. rizikófaktor. Az co-6-linolsav, amely növény i olajokban található, el sősorban a szérumkolcszteri n-szintet csökkenti és kevésbé befolyásolja a trigliceridszintet, míg az ro-3-linolénsav, a Lengeri halakban nagy mennyiségbcn található zsírsav, inkább a trigli ceridszintet csökkenti, a koleszterinszint lényeges vá ltoztatása nélkül. Ezeknek a rendkívül fontos v áltozásoknak a biokémiai mechanizmusa ma még nem isme1t.

Acil-gliceridek. Trigliceridek és az energiaraktározás A glicerin zsírsavakkal alkotott észterei az acil-gliceridek, amelyek - attól fúggően , hogy a glicerin hány alkoholos OH-csoportja észteresített - lehetnek monoacil-, diacil- és h·iacil-gliceridek vagy egyszerűbb néven mono-, di- vagy trigliceridek (2-101. ábra). A trigliceridek ún. neutrális zsírok. Ha a glicerin l. és 3. szénatomjához kapcsolódó primer alkoholos OH-csoport két különböző zsírsavval alkot észtert, vagy csak az egyik vesz részt észterkötésben, a molekula optikailag

L-triacil-glicerid

H2C- OH

l l

HC - 0 H2C -OH

L-1 ,2-diacil-glicerid

2-101. ábra. Acil-gliceridek. Az R; R 1; R2 a zsírsavak szénhídrogénláncát jelölik

2-monoacil-glicerid

146

»>>>>»>>»>>>H>n>>>>>>>>>>>>>>>>>>»>>»>>»>>>>»>>»>>>>>>>>>>»>>>>>>»H>>>>>>>>>>>>>>>.,.H»»»»>>>>»>>>.>>>>>>>>>»>>>>>>>>>>>>»~>>>>>»»>>n>>>>>>>>>>>>>>H»>>

aktív, a glicerin 2. szénatomja a kiralitás centrum. Az eml ős szervezetekben ezek a vegyületek L-konfigurációban fordulnak elő. A trigliceridek telítetlen zsírsav (pl. olajsav-) tartalma jelentősen befolyásolja a zsírok olvadáspontját, a zsírok "keménységét" . A cisz-konfigurációval rende lkező te lítetlen zsírsavakban a kettős kötésnél a lánc megtörik, így a környező apoláros zsírsavláncokkal kisebb mértékü apoláros (London-féle) kölcsönhatás kialakitására van lehetőség. A magasabb telítetlen zsírsav tartalom a zsírok olvadáspontját csökkenti, " lágyítja" a zsírokat A telített és telítetlen zsírsav aránya fajonként eltérő, ugyanazon faj esetében is változó lehet a földrajzi helytő l és az évszakoktól függően. A monoacil-gliceridekben a glicerinnek vagy a primer, vagy a szekunder alkoholos OH-csoportja észteres ített, így 1-monoacil-glicerid vagy a 2-10 l . ábrán látható 2-monoacil-glicerid fordulhat el ő. A monoacil-gliceridek a zsírok felszívódása során a bélhámsej tekben, illetve a lipidek intermedier metabolizmusa során keletkeznek. Szintén a zsírsavak molekulán belüli helyzete alapján különithetünk eJ 1,2- és J ,3-diglicerideket. Ezek is részben a lipidanyagcsere intermedierjei, részben fontos szerepet játszanak bizonyos hormonok és neurotranszmitterek hatásának közvetíté ében.

ANYAGCSERE

A zsíranyagcsere szempontjából a trigliceridek a legnagyobb jelentőségűek, mivel triglicerid formában történik a zsírsavak raktározása és részben szállítása is. A trigliceridek szintézise, raktározása és mobilizálása a zsírszövetben, az adipocitákban történik. Az energiaraktározás hatékonyságát két tényező biztosítja; részben az, hogy a zsírsavak erősen redukált molekulák, részben pedig az, hogy hidrofób tulajdonságúak.

A zsírsavak de novo bioszintézise Az aceti/-CoA transzportja a mitokondriumból a citop/azmába A zs.írsavak bioszintézise az emberi szervezetben a májban, a zsírszövetben, a laktáló emlő mirigyeiben és kisebb mértékben a vesében, a sejtek citoplazmájában történik. A szintézis kiinduló anyaga az aceti 1-CoA, amely a szénhidrátok, az aminosavak és a zsírsavak lebomlása során keletkezhet A zsírsavakba beépülő acetii-CoA elsősor­ ban a szénhidrátok metabolizmusából származik, tehát közvetlenül a piruvát-dehidrogenáz-komplex által katalizált reakcióban keletkezik. Ez az enzim a mitokondriumban található, ahonnan az acetil-

2-102. ábra. Az acetilGoA transzportja a mitokondriumból a citoplazmába, a zsírsavszintézis helyére

acetil-CoA

'

~_5_---... ClTRÁT

------~~

l

HS-CoA oxálacetát

CITRÁT~ ATP

acelii-CoA

ADP+ Pi

ATP:CITRÁT-LIÁZ

147

LIPIDEK A \ AGC. ERÉJE

CoA-na k el kell jutni a citoplaz mába, a zsírsavsziTitézis helyére. A molekul a koenzim -A része a mitokondrium membrá nján nem tud átjutni, az acetilgyök pedig citrát romlába n transzpo rtálódik . A mitokon driumba n az acetil-C oA oxálacet áttal citráttá kondenz álódik, ami a citromsa vciklusb an alakulhat tovább. A citrát citoplaz mába történő or, amikor az transzportjára akkor kerül a citrát és az miatt gátlása izocitrát-dehidrogenáz izocitrát felszaporodik. Az izocitrát -dehidro genáz gátlását a megnöv ekedett koncent rációjú ATP okozza (lásd citrátkör), ami egyben annak a lehetöségét és szükség ességét is megtere mti, hogy az energia zsír av formába n raktároz ódjon. A citoplazmában az A TP:citrát-liáz enzim hatására a citoplazmatikus CoA felhaszn álásával, ATP energiájának terhére i mét acetii-C oA és oxálace tát keletkezik (2- 102. ábra). Az oxálace tát visszake rül a mitokondriumba (lásd l l O. o ldal).

A zsírsav szintéz is elkötelező lépése és az acetii-C oA-kar boxiláz szabál yozása A zsírsavs zintézis ben az elkötelező lépés a malonii-CoA keletkez é e acetil-C oA-ból az acetii-CoA -karbox iláz hatására (2- 103. ábra). Az acetil-C oA-karb oxiláz müködé se hasonló a piruvát-k arboxilá z enziméh ez; kofakto ra a biotin, amely A TP energiáj ának terhére megköti a C02-ot, kapcsol ódik az acetils ez az "aktivál t" CoA-hoz. Az acetii-C oA ~ malonii -CoA átalakul ás azért kitüntetett jelentőségű, mert itt történik a zsírsavszintézis legfontosabb regulác iója. ln vitro az acetii-C oA-karb oxi láz müködé séhez citrátra van szükség, ami az inaktív monomerekből az enzim aktív polimer formájá nak kialakul ását teszi lehetövé. A citrát tehát egyrész t a szubsztr átot szállítja az

co2

2-103. ábra. Maloníi-C oA keletkezé se

l~

~o CH3 - C - SCoA acetil-Go A

enzim számára , másrész t, mint allosztér ikus aktivátor, serkenti az enzim müködé sét. A citrát hatása in vivo is logikusn ak tűnik ; az enzim aktiválá sához akkor áll elegendő mcnnyis égü citrát rende lkezésre, amikor a sejt energiaá llapota megfelelő az energia zsírsava kban történő raktároz ásához. inaktív monome rek

aktiv polimer

l

l

citrát

palmitoii-CoA (malonii-Co-A)

Ugyanig y ésszerű, hogy a reakció terméke , a malonii -CoA és a zsírsavs zintézis végterm éke, a palmito il-CoA gátolják az acetii-C oA-karb oxiláz enzimet , az aktív polimer kialakul ásának gátlása révén. A metabol izmus á ltalános állapota , konkrét an a vércuko rszint hormon ális úton is befolyás olja az enzim müködé sét. Az acetil-C oA-karb oxilázt a cAMP-f üggö protein- kináz foszfori lálja é ennek követke ztében gátolja. A glukago n és az inzulin ezen a módon szabály azza a zsírsavs zintézist : a glukago n hatására az enzim foszfori lá lódik, azaz amikor a vércuko rszint csökken , a sejtekbe n nem történik zsírsavs zintézis és energiar aktározá s. Az inzulin akkor szekretá lódik, amikor a szerveze t ,jóllako tt", és ezzel ellentéte s hatású. Mind az alloszté rikus, mind a foszfori láció-defo szforilá cióval történő szabályo zá azonnali változás t jelent a zsírsava k szintézi sének sebessé gében a metabol izmus pillanatn yi állapotá nak megfelelően. A zsírsavs zintézi tartós alkalmazkod ását a szervez et tápláltsá gi állapotá hoz az enzim szintézi sének vagyis mennyi ségének válto-

o --,

l

+ Hco;

7 ~ ATP

..

~ooc

ADP+P1

enzim: ACETIL-GoA-KARBOXIL ÁZ

-CH2 -

~

c- scoA

malonil-GoA

148

>> »">> >»H>>>>>>>>>>>>> >> >> >> >> >))>>> >>>>>H>n»>>>> n>>>>>>>>>H>>>>>>>>>»>>>>>>>>>> >> >> >>» >> >> >>>> >HH> >H>>>>>>>>>>>>>>>>HH>n»n >»UH) >>J>>>))))»>»> >H> » >>

zása biztosítja: szénhidrátokban gazdag vagy zsírszegény étrend az enzim szintézisét fokozza, mig tartós éhezés vagy nagy mennyiségü zsír fogyasztása csökkenti az acetil-CeA-karboxiláz mennyiségét.

A palmitinsav szintézise. A zsírsav-szintáz A zsírsavszintézis következő lépéseiben megtörténik a 16 szénatomos palmitinsav szintézise, a többi zsírsav a palmitinsavból alakul ki. A szintézis lényege az, hogy a zsírsavlánc két szénatomonként hosszabbodik, s ezek a szénatomok az acetilCeA acetilcsoportjából származnak. Az el ső aceti l-CoA metilcsoportja lesz a palmitinsav omega-szénatomja, a további két szénatomos egységeket a malonil-CoA adja, amelyben az acetilCeA metilcsoportja karboxilálással aktiválódott. A lánc felépülése során azonban a malonil-CoA dekarboxilezödik, így a zsírsav minden szénatomja az acetil-CoA-ból származik. A szintézist egy rnultifunkcionális enz imkomplex, a zsírsav-szintáz végzi. E mlős sejtekbe n ez az enzirnkomplex, két azonosalegységet tartalmaz, amelyekben hét, különbözö enzimaktivitással rendelkező fehérje kapcsolódik össze. Mindegyik alegységen két kitüntetett SR-csoport található, amelyek az acetil- és az acilcsoportokat kötik meg. Az egyik SE-csoportot a 4'-foszfopantetein tartalmazza, amely a pantoténsav származéka és megtalálható a koenzim-A-ban is (2- 104. ábra). A 4'-foszfopanteteint kötő fehérjét acil carrier proteinnek (ACP) nevezik, mert a zsírsavlánc az ACP-hez kötődve épül fel.

A'IYAGCSERE

A lánc indítá a, az alacsonyabb rendű szervezetektöl eltéröen, emlősökben úgy történik, hogy az acetilcsoport az acetil-transzferáz enzimhez, a malonilcsoport a malonil-transzferáz enzimhez kötödik. Az acetilcsoport innen átmenetileg egy másik nevezetes Sl-I-csoportra, a kondenzáló enzim (béta-ketoacil-szintáz) cisztein Sl-I-csoportjára tevődik át, amely a továbbiakban is kitüntetett szerepet játszik majd.

+ enzim-SH ~ acetil-S-enzim + CoA-SI-1 enzim : acetil-transzferáz

O acetil-CoA

A malonil-CoA pedig átkerül a zsírsav-szintáz másik alegységén található ACP-SH csoportra. 6 malonii-CoA + ACP-SH ~ malonil-S-ACP +

CoA-SH enzim: malonii-CoA-ACP-transz aciláz (malonil-transzferáz) Ezt követően kerül sor az acetil- és a malonilcsoport kondenzációjára, miközben felszabadul az a C02, amely az acetil-CeA-karboxiláz reakcióban beépült a molekulába. Ez a dekarboxiláció fedezi a két molekula összekapcsolódásához szükséges energiát (ami így végül is az acetilCeA-karboxiláz reakcióban felhasznált A TP energiájából származik). A reakciót a béta-ketoacil-ACP-szintáz (kondenzáló enzim) katalizálja. C)

malonil-S-ACP + acetil-S-enzim ~ acetoacetil-S-ACP + C0 2

n

- NH - CH2 -CH:?- C - NH -CH~- CH 2 -

ACP

pantoténsav 4'-foszfopantetein

2-104. ábra. Az ACP-hez kapcsolódó 4'-foszfopantetein

ciszteamin

LIPIDEK ANYAGCSE R ÉJ E

)))))})))))))))))))}))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))>))))))))))))))))))))),.))))))))))))))))))))))))))))

A következő három lépés azt a célt szolgálja, hogy redukciók során kialakuljon a négy szénatomos butiril-S-ACP (2-l 05. ábra) . Ennek során e lő­ ször egy redukció történik, majd dehidratálás és újabb redukció, amelyekhez a hidragént a NADPH szolgáltatja. A redukciók eredményeképpen kialakul a négy szénatomos zsírsavlánc és kezdőrlbet a következő ciklus, amelyben ismét két szénatommal hosszabbodik a lánc. Az újabb ciklus úgy indul, hogy a kész, négy szénatomos zsírsav az ACP-SH-csoportról átkerül a béta-ketoacil-ACPszintáz cisztein SR-csoportjára (analóg az l. lépéssei). Az ACP szabaddá vált SR-csoportja megköti a következő malonilcsoportot (analóg a 2. lépéssei) és létrejön a kondenzáció (analóg a 3. lépéssei), ami után a most már hat szénatomos lánc az

o 11

ACP-SH-csoporton maradva hat szénatomos zsírsavvá redukálódik (2-105. ábra a, b és c reakciók). 1ly módon, egymást követő hét ciklusban alakul ki a palmüoil-S-CoA, arniből egy tioészteráz hatására szabadul fel a palmitinsav. A zsírsav-szintáz modellje (2- 106. ábra) alapján az enzimek összerendezett működése úgy képzelhető el, hogy az egyik alegység ACP-SH-csoportja és a másik alegységen a kondenzáló enzim SR-csoportja térben egymáshoz közel kerülnek és így lehetövé válik az acetil- (illetve a hosszabbodó aci!-) csoport és az ACP-n kötődö malonilcsoport kondenzációja. Az ACP-hez kapcsolódó 4'-foszfopantetein-rnolekula relatíve hosszú, mozgékony lánca teszi lehetövé, hogy a kondenzálódott és az ACP-n kötve maradó láncrész a másik alegység re-

o

v

n

ACP -S -C-CH2 C-CH,a

a

~A1DI?lH+I4

~ NADP' O

OH

ll

l

tk

toac AC? RE UKTAz

~-hidroxi-butirii-ACP

ACP - S -C-CH2- CH-CH3

~H,O

b

f3·hidroxi-acii-ACP-DEHIDRATÁZ

o ll

krotonii-S-ACP

ACP -- s - C - CH = CH-CH3

~ NADPH+ H+ c

~ NADP'

enoii-ACP-REDUKTAz

butiril-S-AGP

2-105. ábra. Redukciós lépések a zsírsavszintézisben

149

ISO

»>)>)) ))) )))) )))))) )))))))))))) )))) ) ))))))))))))))))) )))) )) )))))))))))>)})))))) )))))))))) )) ))))))))))

)) ))))))))"'))) ) ) )))) )) >)))}) )) )))))) )))))))))))) )) )) )))) ))))>) )) ))))))

redukáló enzimek

malonil-transzferáz kondenzáló enztm

ANYAGCSERE

ticészteráz

/ff ~

,) !

/

l l

l

l l

l l

l

l

l

ACP

1--

-ticészteráz

kendenzálo enztm malonil-tran szferáz acetil-transzferáz

redukáló e nzimek

ALEGYSÉG ll

2-106. ábra. A zsírsav-szin táz modellje. Az enzimkomple xben két azonos alegység van, me/yek mindegyike tartalmazza a zsirsavszintézishez szükséges valamennyi enzimei. A két alegység összerendezett mOködése két zsfrsavlánc egyidejű felépftését biztosítja. Az AGP-hez (aci/ carrier protein) kapcsolódó 4'-foszfopantetein mozgékony lánca teszi lehetövé, hogy az SH-n kötődö csoportok közel kerülhetnek mind a kondenzáló enzimhez (nyil), mind a redukáló enzimekhez (szaggatott nyil), amelyek a másik a/egységen helyezkednek el

kondenzáló enzim

kondenzáló enzim

kondenzáló

kondenzáló enzim

kondenzáló

SH

s

s

C= O

C= O

H

l

l

C=O

l

l

l

C H3

l

CH2

l

CH 2

--·---· lépesek

l

--·-. co2

CH3

CH2 1-.o. :>.u ·o

l

CH2

malontl-CeA l CH3 belépése

CH3

CH3

cool

C= O

C H2

C H2

CH2

C H2

CH2

C= O

C= O

C=O

C= O

l

l

l

l l

l

s

s

l

fe l é pülő

"\co

..

i

l

l

l

l

SH

l

s

B B B B B 2-107. ábra. A

onoen-a .!Ó

coo

l

s

r

zsírsavlánc ,.ingaj árata" az ACP-SH és a ko nd enzáló enzim-SH között

..

LIPIDEK ANYAG('. ERÉJE

)})))) •> >>)))) ))l) •>H >H) >>H)>))))>)»»n»>>n))))))))>) )))) )) )))) )) )))) ))) ))) )))))) )) )) )) )) )) ))>)))))))))))>>>> )) >>))>))) >> >> >>))>H> h >U>))))))

dukáló enzimeihez (domén ll) közel kerülhet és szubsztrátul zolgálhat Minden ciklus végén az ACP-röl a redukált aci !csoport átmenetileg a másik alegység kondenzáló enzim Sl-I-csoportjára transzlokálódik és az ACP-SH-csoport megkötheti a malonil-CoA-ról a következő malonilcsoportot (2-107. ábra). Egy molekula palmitinsav szintézise tehát az alábbiak szerint foglalható össze: 8 acetil-CeA + 14 NADPH + 14 H+ + 7 ATP~ palmitinsav + 14 NADP' + 7 ADP + 7 P, + 7 H 20 + 8 CoA A NADPH forrása

A zsírsavszintézishe z elengedhetetlen, hogy a sejtekben elegendő NADPH álljon rendelkezésre. Ez elsősorban a glukóz direkt oxidációja során keletkezik (lásd 2.2. fejezet). Emellett NADP+ redukciója kíséri a citoplazmában az almasav piruváttá alakulását, amit az a lmasav enzim (malic enzyme) katalizál (2- 108. ábra). Almasav oxálecetsavból keletkezik a citoplazmatikus malátdehidrogenáz hatására. Így végsősoron a zsírsav-szintézishez a szubsztrátot szállító citrát hozzájárul a szintézis egy másik komponensének, a NADPH-nak a keletkezéséhez is. Az almasav enzim által katalizált folyamat reverzibilis, fordított irányban malát keletkezését teszi lehetövé piruvát-

ból, ami a citrátkör intermedierjeit pótló, ún. anapieretikus reakció (lásd 2.1. fejezet). NADPH keletkezhet még a citoplazmában az izocitrát-dehidro genáz által katalizált reakcióban. Nem tisztázott, hogy in vivo mely ik reakció, milyen mértékben vesz részt a zsírsavszintézishe z szükséges NADPH elöállításában, valószínű, hogy ez a sejten belüli egyéb reakcióutaknak is függvénye. A zsírsavszintézis sebességél elsősorban a már említett acetil-CeA-karbox iláz szabályozása határozza meg. Ezt egészíti ki a zsírsav-szintáz szintézisének a szabályozása, ami úgyszintén a zsírsavszintézis tartós alkalmazkodását segíti elő. Szénhidrátdús vagy zsírszegény étrend az enzim mennyiségének növekedésével jár, míg éhezés vagy zsírdús táplálkozás az enzim szintézisét csökkenti . Az acetii-CoA-karbox iláz és a zsírsav-szintáz enzim mellett az A TP:citrát-liáz, a glukóz-6foszfát-dehidroge náz és az almasav enzim is ezen a módon tud tartósan adaptálódni a zsírsavszintézis igényeihez.

A zsírsavlánc elongációja Mint az eddigiekböJ kitűnt, a de novo zsírsavszilltézis végterméke a 16 szénatomos telített zsírsav, a palmitinsav. Ez a ló l néhány kivétel van csak,

zsírsavszintézis

_/~

citoplazma

acetii-CoA

piruvát + HCO l

NADPH+H•

ll l

: almasav

citrát

l

citrát ____/

AT~ liáz

ISI

malát-dehidrogenáz oxálacetát

l l

+

--7---:?""-'\:::-----•~ malát NADH+H•

2-108. ábra. NADPH keletkezése az almasav enzim által katalizált reakcióban

NAD

enzim

szálunk. A szervezet számára szükséges egyéb zsírsavak - a többszörösen telítetlen zsírsavak kivételével - a palmitinsavból alakulnak ki a lánc hosszabbításával (ez az elongáció), illetve kettős kötések kialakításával (ez a deszaturáció ). Az elongáció vagy a mitokondrium ban, vagy az endoplazmás retikulwnban történik, sennek során a zsírsavlánc két szénatomos egységekkel hosszabbodik. A mitokondrium ban a két szénatomos egységet az acetil-CoA, az endoplazmás retikulumban - ahol az elongáció a legtöbb vizsgált emlős sej tben aktívabb, mint a mitokondriumban - a malonil-CoA szolgáltatja. Ez utóbbi esetben a dekarboxiláci óval éppúgy elvész az a C02 , ami a malonil-CoA keletkezéseko r a molekuamelyekrő l később

Jába beépült, mint a de novo szintézisben. A kialakult béta-ketoacii- CoA redukciója is ugyanúgy három lépésben, NADPH részvételével történik, mint a zsírsavak de novo szintézisénéll áttuk. A különbség az, hogy a részt vevő enzimek különállóak é nem részei egy enzimkomple xnek, továbbá, hogy a hosszabbodó zsírsav nem egy carrier fehérjéhez kötve, hanem CoA-val aktivált formában (makroerg tioészterkötés) vesz részt a fo lyamatban. A mitokondrium ban a redukció ettől némileg e ltérőenNADH és NADPH igénybevételé vel, lényegében a béta-oxidáció fordított irányú lépéseiben történik, ahol az utolsó lépésben a F ADH helyett NADPH vesz részt a redukcióban. A legtöbb sejtben az elongáció során az endoplazmás retikulumban palmitinsavbó l sztearinsav

H~€o~

deszaturáz hidroxi-sztearil enzim

2-109. ábra. A zsírsavak deszaturációjáb an részt vevő elektrontranszp ort-rendszer

LIPIDEK ANYAGCSER it JE

153

keletkezik, amit az alábbiak zerint lehet összefoglalni:

tett zsírsav arány kialakulásáho z, annál kevésbé van szükség az endogén zsírsavak deszaturációjára, s ilyenkor a szteari l-CoA deszaturáz aktivitása csökken. A regulációban va l ószí nű leg az enzimkomple x terminális komponense, a deszaturáz enzim a meghatározó.

palmiloil-GoA + malonil-GoA 2NADPH +H+

Speciá/is zsírsavak, amelyek a zsírsavszintáz reakcióban keletkezhet nek

2NADP+ sztearii-GoA + GoA-SH + G0 + H 0 2 2

A telítetlen zsír avak kialakulása, a deszaturáció szintén az endoplazmás retikulumban történik. A cisz kettős kötések kialakítá ában NADP, 0 2 , továbbá három enzim vesz részt - egy Oavoprotein, a citokróm b5 és egy nem hem-vasat tartalmazó deszaturáz - , melyek a mikroszómáli s elektrontranszportlánc részei (l 09. ábra). A deszaturáz enzimek szubsztrátja, az aci i-CoA a deszaturázok specificitá ától fiiggően lehet telített vagy telítetlen. A 69-deszaturáz nak a sztearil-CoA a szubsztrátja, a másik három deszaturáz, a 66-, 65- és ö4-deszaturáz ok a kettős kötést már tartalmazó zsírsavba visznek be további kettős kötéseket a már meglévő kettős kötés és a ticésztcr közé. Hangsúlyozni kell, hogy az w vég és a meglévő kettős kötés közölt egyik enzim sem tud kettős kötést kialakítani , azaz a 18:269,12 és a 18:369,12, 15 a szervezetben nem tud szintetizálódni, amiért is az ember számára ezek esszenciális zsírsavak. A deszaturáció regulációja a szervezet aktuál is igényeinek megfelelően működik. A májban található sztearii-CoA deszaturáz enzim aktivitása éhezésben jelentősen csökken, míg a táplálkozás megindulá a után fokozódik. Ez utóbbi állapotban alakulnak ki a telítetlen zsírsavak olyan mennyiségben, ami biztosítja a membránlipid ek optimális fluiditá át. A deszaturációtjelentőscn befolyásolja a táplálékban található telítetlen zs írsavak mennyisége is. Minél nagyobb mértékben járul ez hozzá az optimális fluiditáshoz szükséges telítetlen/telí-

A zsírsavak de novo szintézisének végterméke az esetek túlnyomó többségében a palmitinsav, melyből mint láttuk, utólagos módosítás során alakulnak ki a szervezetben jelentőséggel bíró egyéb zsírsavak. Néhány speciális e etben azonban ettől eltérően is létrejöhetnek zsírsavak, mégpedig a zsírsav-szintá z álta l katalizált reakcióban. A palmitinsavnál rövidebb szénláncú zsírsavak találhatók a l egkü l önbözőbb á llatokban keletkező tejben. Valószínűleg igaz az emberi zervezetre is, hogy az emlőmiri gyben a zsírsav-szintá z rövidebb szénláncú zsírsavakat is képes szintetizálni , mégpedig úgy, hogy a lánc lehasad az aci l carrier proteinről még aze l őtt, hogy a 16 szénatomos lánc kia lakult volna. Ezt a lehasítást egy szelubilis ticészteráz végzi, amely hormonális szabályozás alatt ál l. Egy másik lehetőség az elágazó szénláncú zsírsavak szintézise. Ezek a zsírsavak a magasabb rendű szervezetekbe n speciális funkciókat szalgálnak (pl. az izzadságmirigyekben termelődő viasz). A legtöbb elágazó szénláncú zsír av a telített egyenes szénláncú zsírsav metilált szánnazéka, amelynek szintézisét a zsírsav-szintá z végzi. Amikor a malonil-CeA helyett a metil-malonii -CoA a szubsztrát, a zsírsavba egy metilcsoport épül be a 2-J 10. ábrán látható módon. Ezek a reakciók számos sejtben megtörténnek , csak több nagyságrendd el lassabban, mint amikor malonil-CeA a szubsztrát. Az elágazó szénláncú zsírsavak keletkezését va lószí nűleg az határozza meg, hogy a szubsztrátok, azaz a malonil-CeA és a metil-malonii -CoA milyen arányban állnak rendelkezésre. Fokozódik az elágazó szénláncú zsírsavak szintézise akkor, amikor a malonil-CeA mennyisége csökken, ami számos szövetben a malonil-CoA- dekarboxiláz enzim hatására bekövetkezhet Patológiás körülmények között is, pl.

154

>>>>>>>H> ,, >>» » >> >>>>>>n n >HH>>>>> •• >> >H~ 'n>>> >H> >H>>>>> >H>>> >HHUu>» .-.)»>n>>>>>>>>>H>>> >> » >> >> >>>>» >>>>>n>»>>>>>>>UU>u >»H>>>>> >>>>>H>>»»>>>»>>

i\ 'JYAGCSERE

2-11 O. ábra. Elágazó szénláncú zsírsavak keletkezése a zsírsav-szintáz reakcióban

~o CH3 - (CH2)., - C - S- ACP

l

+

O CH3

~

metil-malonil-CoA

O

~

l

CH3 - (CH2)n- C-CH-C - S-ACP + C0

l l l

2

+ CoA-SH

redukciós lépések

+ B 12-vitamin hiányában eme lkedhet a metil-malonil-CoA mennyisége, ami az elágazó szénláncú zsír avak keletkezésének fokozódásához vezet.

cerideket szintetizálni, azonban Jegnagyobb mennyiségben a májban és a zsírszövetben keletkeznek. A szintézis aktivált zsírsavakból és glicerin-3-foszfátból történik.

A trigliceridek szintézise és raktározása

A zsírsavak akliválását az endoplazmás retikulumban vagy a mitokondri umok külsö membránjában az acii-CoA-szintetá z (tiokináz) végzi (2-ll l . ábra). A reakc ió két lépésben történik, amelynek során először egy acil-adenilát interrne-

A szervezetben a zsírsavak trigliceridek formáj ában raktározódnak. A legtöbb szövet képes trig li-

-Co

sztntetaz

~o CH3-

(CH2)0 -

C- S - CoA + AMP -+ PP,

acii-CoA zsírsav

részreakciók:

~o l.

R -C

~o +ATP

. "ozsJrsav R- C-

AMP

+ PP, (

+ CoA-SH

#o

' fl' R- C- Sacii-CoA

2-111 . ábra. A zsírsavak akt iválása

-•<,)

acil-adenilát

~o 2.

R - C-AMP

C oA

+ AMP

LIPIDEK ANYAGCSERÉJ E

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))) ~)))))))))))))))))) )))))))))))) )))))))))))))) )))))))))) ·~ )))))))))) ))\))))) )) ))>> ))))))" )))))))) ))

Ha a glicerin egyik prime r a lkohol O H-csoportját foszforsa v észte resíti, a molekula királis lesz. A konfiguráció egyértelm ü leírásához a glicerin szénatomjait ún. "sn" (stereospecific numbering) számozá . a l látjuk cl.

dier keletkezik, miközben az A TP-rő l p irofoszfát hasad Je. A koenzim-A SH-csoportja az enzimhez szarosan kötődö aci l-adeniláttal reagál és létrejön az aktivált zsírsav, az acil-CoA (2-111. ábra), amelyben a zsírsav nagy energiáj ú ticészterkötéssel kapcsolódik a koenzim-A-hoz. Az aktiválás részreakciói reverzibilisek, irreverzibilissé az teszi a reakciót, hogy a pirofoszfatáz hatására a PPi (inorganikus) foszfátokra hidrolizáL Ez a mechanizmus nemcsak a zsírsavak aktiválásában, hanem számos egyéb bioszintetikus folyamatban biz tosítja azt, hogy a fo lyamat iiTeverzibilis legyen. Az acil-adenilát intennedier keletkezése úgyszintén általános mechanizmusnak tekin thető a karboxilcsoportok aktiválásában, ez történik pl. a fehérjeszintézisben felhasználódó aminosavak esetében is. A trigliceridek szintézisében az aktivált zsírsav vagy a dihidroxi-aceton-foszfáthoz, vagy a glicerin-3-foszfáthoz kapcsolódik. A dihidroxi-acetonfoszfát mind a májban, mind a zsírszövetben a glukózból a glikolízis során keletkezik, s ebből NADH-val történő redukcióval a glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz hatására alakul ki a glicerin-3foszfát (2-112. és 2- 113. ábra).

1l H20 H Ho -

2c

.

-

H

o ll

H 3c-o - P- o2

l o-

A szcrvezctbcn a g licerin-3-foszfátL-konfigurációban fo rdu l elő, így a belöle származtatható valamennyi királis lipidmolekula L-konfigurációj ú.

A máj ban egy másik l ehetőség is van a glicerin-3-foszfát kialakulására, mégpedig a glicerinből a glicerin-kináz hatására. Ez az enzim a zsíTszövetben hiányzik, így ott a glicerin-3-foszfát kizárólag a glukózmetabolizmusból származik (2-113. ábra). A trigliceridek szintézise során (2-ll 4. ábra) el őször lizofoszfatidsav keletkezik az aktivált zsír-

2-112. ábra. Glicerin-3-foszfát keletkezése a májban

glicerin-Pdehidrogenáz

\_~/

ADP, glicerin-kináz ATP

glicerin/

\

/

/

155

/

156

ANYAGCSERE

Lglikolizis J

......_=--•• glukóz ----====-• dihidroxi-aceton-P - ---• j gli~erin-P. dehidrogenáz

INZULIN

l

l

l

/ E) ;. LIPOPROTEINLIPÁZ

r-- -- --.. TRIGLICERID (VLDL, kilomikron)

GLICERIN-3-FOSZFÁT

~------~-----~ TRIGLICERID

2-1 13. ábra. A triglicerid ekbe

NADH+H•

beé p ü lő

glicerin-3-foszfát és a zsírsavak forrásai az adipocitákban

acii-CoA

acild1h drox ceton-P-reduktá,

tr~ n~

glicerin-3-P

lizofoszfatidsav acii-CoA ac1ltranszferáz CoA-SH "' • --- ---- FOSZFATIDSAV

•"'

","'"'

komplex lipidek szintézise

-

foszfatáz

',,,

aciltranszferáz

TRIGLICERID

2-114. ábra. Triglicerid ek szintézise

~o

' •---------- DIGLICERIO

H21 C-0-C-R

acilCeA CoA-SH

O ~ R -C-O-CH 2

l

H2C -OH

1

LIPIDEK ANYAGC ERÉJE

savból és a glicerin-3-foszfátból vagy egy aci ldihidroxi-aceton-foszfát intermedieren keresztül dihidroxi-aceton-foszfátból. A lizofoszfatidsavat egy további aktivált zsírsav észteresiti és kialakul a foszfatidsav, ami kulcs intermedier más lipidek szintézisében is. A foszfatidsavról a foszfatidsav-foszfatáz hatására a foszfátcsoport hidrolizál és diglicerid keletkezik, am i végül egy harmadik acil-CoA-val trigliceriddé alaku l. A bélhámsejtekben a trigliceridszintézis során nem keletkezik foszfatidsav, mivel a béllumenben az emésztés eredményeképpen 2-monoacil-glicerol keletkezik és abszorbeá lódik a rnucosasejtekbe, ahol is aci l-CoA-val először l ,2-diglicerid, majd triglicerid alakul ki (lásd A zsírok emésztése és felszívódása című alfejezetet). Bizonyos törvényszerűséget mutat a kűlönbözö zsírsavak helyzete a glicerin három szénatornján. Az első szénatomon általában telített zsírsav, gyakran palmitinsav, a 2. szénatomon telítetlen zsírsav található, a 3. szénatomon bármelyik e lő­ fordulhat. A trigliceridekbe beépülő zsírsavak milyenségét és helyzetét valószínilleg részben az aciltranszferázok specificitása, részben pedig az határozza meg, hogy az aci l-CoA készletben milyen arányban találhatók a különböző zsír avak. A trigliceridek szintézise, mint láttuk, némileg eltérő lehet a májban és a zsírszövetben, további sorsuk pedig markánsan különbözik e két szervben. A májban a szintetizált triglicerid lipoproteinekbe, elsősorban a very low density lipoprotein-be (VLDL) épül, amely a keringésbe kerül és szállítja a lipideket a perifériás szervekhez (lásd később).

A zsírszövet (ún. "fehér" zsírszövet) a trigliceridek szintézisére, raktározására és mobilizálására specializálódott szövet. A szintézisben a gl icerin-3-foszfát kizárólag a glukózanyagcserébő l származik, s a beépülő zsírsavak egy része is glukózból szintetizálódik az adipocitákban (2-113. ábra). A többi zsírsavat trigliceridek formájában lipoproteinek (VLDL, kilomikron) szállítják a zsírszövetbez, ahonnan a kapiJlárisok endothelsejtjeinek felszínén található lipoprotein-lipáz szabadítja fel a zsírsavakat (lásd késöbb), s ezt az adipociták felveszik. A szénhidrát-ellátott ság tehát komplex módon határozza meg a trigliceridek keletkezését és raktározását. A glukóz-ellátottságtól

157

függ a g licerin-3-foszfát keletkezése és mint láttuk a zsírsavak szintézise is (lásd acetii-CoA-karboxiláz szabályozása). A zsírszövet - szemben a májjal - g lukózt csak inzulin jelenlétében képes felvenni , s inzulin aktiválja a lipoprotein-lipázt is, ami a trigliceridekben ideszállított zsírsavakhoz hozzájuttatja a zsírszövetet (2-113. ábra). Bőséges szénhidrát-ellátottság esetén tehát a zsírszövet triglicerideket szintetizál és ezeket az adipociták citoplazmájában raktározza. A szervezet fehérjéket, illetve aminosavakat gyakorlatilag oem raktároz, szénhidrátot is csak korlátozott mennyiségben, jórészt csak a máj és izomszövetben, glikogén formájában . Ezzel szemben a zsírokat tartósan, nagy mennyiségben, egy erre specializálódott szövetben tudja raktározni. A metabolizmus regulációi úgy működnek, hogy a szénhidrátokkal elfogyasztott felesleges energia zsírsavakba, majd trigliceridekbe épül be. Ez a raktár jelenti a szetvezet legfontosabb energiatartalékát, ahonnan a zsírsavak, a szervezet igényeinek megfelelöen mobilizálódnak. A trigliceridek féléletideje néhány nap, ami azt mutatja, hogy a zsírszövetben folyamatos és intenzív triglicerid-szintézi s és -lebontás folyik. Amikor a zsírszövetben túlzott mértékűvé válik a zsírok felszaporodása, kialakul az obesitas (el hízás), amelynek során az adipociták száma és az egyes adipociták mérete egyaránt megnő.

Lipolízis - a raktározott zsírsavak mobilizálása a zsírszövetből Ahhoz, hogy a raktározott zsírsavak eljussanak a szervekhez és energiát szolgáltassanak, először a zsírszövetben ki kell szabadulniuk a trigliceridraktárbóL A trigliceridek hidrolízisét lipázok végzik, amelyek a triglicerideket zsírsavvá és glicerinné alakitják. A glicerint a zsírszövet nem tudja hasznosítani, mivel hiányzik a glicerin-kináz enzim. A glicerin az adipocirákból kidiffundál, a vérkeringéssei a májba szállítódik, ahol glicerin-3-foszfáttá alakul. Itt vagy trigliceridszintézisre használódik, vagy dihidroxi-aceton-f oszfáttá alakul a 2-1 12. ábrán bemutatott reverzibilis reakcióban é vagy a glikolízis, vagy a glukoneogenezis folyamatába kapcsolódik. A felszabaduló zsírsavak az adipociták membránján átdiffundálva a vérpályába kerülnek, ahol azonnal albuminhoz

158

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))})))>))))))))))))))))))))))))))))).. ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))

kötödnek és szabad (nem észteresített) zsírsavként (FFA; free fatty acid) szállítódnak a szervekhez. A trigliceridek mobilizálásában meghatározó szerepe van annak a lipáznak, amelyik az el ső zsírsavat felszabadítja, általában a glicerin első vagy harmadik szénatomjáról. Ez az enzim hormoná lis szabályozás alatt áll, s megkülönböztetendö a másik két zsírsavai lebasító enzimtől (diglicerid-lipáz és monoglicerid-lipáz) a bormonszenzi tív lipáz elnevezést kapta. Ennek az enz imnek a regulációja biztosítja, hogy a keringésben mindig legyen elege ndő mennyi ségű zsirsav a szervek ell átásához. Zsírsavak mobil izálódnak a zsírszövetböl, amikor a vércukorszint csökken, így étkezések közötti idő­ szakban, éhezés alatt, valamint tartós fizikai és pszichés igénybevétel során. Ezzel szemben étkezések után, állandó, bőséges táplálékbevitel mellett, testi és lelki nyugalo mban a zsírsavak nem

ANYAGCSERE

mobi lizálódnak, hanem éppen ell e nkezőleg, trigliceridraktárba épülnek be. A folyamatot a 2-l 15. ábrán látható módon hormonok szabályozzák. Az adipociták membránjában receptorok kötik a szimpatikus neurotranszmitter noradrenalint, illetve számos, a vérben kerin gő hormont (glukagon, adrenalin), aminek következtében aktiválódik az adenilát-cikláz, cAMP keletkezik és aktiválódik a cA MP-függő protein-kináz. Az adipocitákban a cAMP-függő protein-kináz egyik szubsztrátj a a hom1onszenzitív lipáz, ami foszforiláció hatására aktiválódik és elindítja a trigliceridek hidrolízisét. Az enzim foszfatázok hatására defoszforilálódik és inaktiválódik, amikor a vérben emelkedik a glukóz, illetve az inzulinkoncentráció. Stimulálják a lipolízist egyéb hormonok is, mint pl. a kortikoszteroidok, a tiroxin é különbözö nö-

inaktív protein-kináz A

~

aktí~::kináz

AÍ

inaktív -----. aktív hormonszenzitív ~ hormonszenzitív digliceridlipáz áz lipáz .

triglicerid

yl

-J

l

diglicerid - r

zsírsav

zsírsav

l

l

szabad zsírsav (FFA) albuminhoz kötve

SZERVEKHEZ 2-115. ábra. Zsírsavak m obilizálása a zsírszövet trigliceridraktárából

MÁJBA

LIPIDEKANYAGCSERÉJE

vekedési honnonok, amelyek azonban az enzimek mennyisé gét növelik és ezért hatásuk lassúbb és hosszan tartóbb.

zsírsavat vagy ketontest eket oxidál az energiaszükségle t fedezésér e. A sej tekbe került zsírsav először koenzim- A-val aktiválód ik pontosan olyan módon, ahogy a trigliceridszintézis tárgyalásánál láttuk (2-1 11 . ábra), és ennek során aktivált zsírsav, acil-CoA keletkezik. A z aktiválás az endoplaz más retikulum ban vagy a mitokond rium külső membrán jában tö1ténik, az oxidáció he lye pedig a mitokond rium matrixa, ahová az aktivált zsírsavna k be kell jutni. Mivel a mitokond rium belső membrán ja a koenz im-A molekulá ra nem átjárható , egy carrier mű­ ködik a membrán ban, ami a zsírsavat bejuttatja a mitokond rium belsejébe. Ez a speciális carrier a karnitin, amelynek alkoholos OH-csop ortjához kapcsoló dik a zsírsav a CoA-ról (2- 116. ábra). A reakciót a kamitin-a ciltranszf eráz J. katalizálj a, amely a mitokond rium belső membrán jának citoplazmatik us oldalán található (2- 11 7. ábra). Az aci l-kamitin a rnitokond riummatr ixba transzportálódik egy karnitinmolekuláér t cserébe. A bel ő membrán belső felszínén egy másik enzim, a karnitin-a ciltransz feráz ll. visszaala kítja az acilCoA-t, a mitokond riális CoA felhaszná lásával. A szabaddá váló kamitin azon a cseretran szporton keresztül jut vissza a citoplazm ába, amely az aci lkamitint a mitokond riwnba juttatja, az aci i-CoA

A zsírsavak oxidác iója A keringésben jelen l évő zsírsavak - a zsírszövetből származó szabad zsírsavak és a lipoproteinekbő l a lipoprote in-lipáz hatására keletkező zsírsavak egyaránt - a membrán okon átdiffund á lva a sejtekbe kerülnek, ahol oxidálódn ak és energiát szolgáltatnak. A különböző szervek nem azonos mértékben képesek zsírsavak at felhaszná lni; az idegszőve t, a vörösvért est, a rnellékvese velőállo­ mánya egyáltalá n nem hasznosítja a zsírsavak at, míg a szívizom és a harántcsí kolt izomzat számára a zsírsavak nagyon jelentős energiafo rrást jelentenek. A zsírsavak felhaszná lása természetesen a metabolizmus á llapotától is fiigg. Jóllakott ál lapotban, amikor a sejtek elsősorban szénhidrá tokat oxidálnak, a feleslege t pedig raktározz ák, nem folyik zsírsav-o xidáció. Étkezések közötti időszak­ ban, tartós fiz ikai munkavé gzés közben és különösen éhezésbe n a zsírsav-o xidáció jelentősé­ ge megnő. Hosszan tartó éhezésbe n a legtöbb sejt

CH3

l+ CH -N 3 l

CH3

H

l l

~o

CH - C-CH -COOH 2

R -C-S-C oA

2

OH

---- --- -.1

amilln

CH3

H

l. l CH -N -CH -C-CH 3 l 2 l 2 CH3

O

l C= O l

R

acil-karnit i n 2-116. ábra. A karnitin-ac iltranszfer áz által katalizáll reakció

COOH

+ CoA-SH

160

)))) >H))))))J)) n >)) ) >))> >>

>> >)>) )))))) >>)))))))) >>))'')))) >))))) )))) >>>>)))))))))))))))) ))1))))) )) )))) )))) )) )))))U) ))>>))))))))>)))»)) »)))))))))> >> ) ))>)))) )>)))))) >> >>))

ANYAGCSERE

ZS IRSAV

ATP CoA-SH AKTIVÁLÁS

.

~

AMP+PPI

l a~i i~ CoA l

malonii-CoA ·" • J

l

CITOPLAZMA

G

~RNITIN-ACILTRAN;ZFE;RÁZJ

CoA-SH

MITOKONDRIUM BELSÖ MEMBRÁN

c 1-KARNITIN

KARNITIN

CoA-SH ~-oxidá ció

MITOKONDRIUM

2-117. ábra. Zsírsavak transzportja a citoplazmából a m itokondriumba

pedig a mitokondr iumban készen á ll az oxidációra (2-1 17. ábra). A karnitin-aciltranszferáz enzim hiá nyában a zsírsavak nem j utnak el aL oxidáció helyére és lehetetlenné válík a zsírsavak felhasználása. Az ilyen egyénekben a fájda lmas izomgörcsök már kora gyermekkorban megjclennek izommunka során, éhezésben vagy zsírdús étkezés után, vagyis azokban az állapotokban. am ikor a harántcsíko lt izom normá Jisan zsírsava kat égetne. Az enzimdefektus nem érin ti az izmok egyéb anyagcsere-folyamatait és a röv id vagy közepes lánchosszúságú zsírsavak égctését scm, mivel ezek mitokondriális transzportjához ka rnitinre nincs szükség.

A páros szénatomszámú zsírsavak oxidációja A mi tokondriumban a zsírsavak a béta-oxid áció során bomlanak le, ciklusonké nt két szénatommal rövidülnek, miközben egy acetii-CoA, egy FADH 2

és egy NADH+H ' keletkezik. A 2-J 18. ábrán a palm itinsav lebomlásának első ciklusában a béta-oxidáció négy egymást követő lépése látható. Az el ső lépés oxidáció, melynek során kialakul az alfa- és béta-szénatom közötti kettős kötés, amely transz konfigurációjú, és közben FADH 2 keletkezik. A reakciót katalizáló acil-CoA-dehidrogenáz többfajta enzimet jelenthet, amelyek különböző hosszúságú zsírsavláncra specifi kusak. Így elkülön íthető hosszú szénláncú acil-CoA-dehidrogenáz, közepes szénláncú acil-CoA-dehidrogenáz és rövid szénláncú acii-CoA-dehidrogenáz. A második lépés hidratálás, ami a transz konfiguráció következtében L-konfigurációj ú ~-bidroxi -acil-CoA-t eredményez. A sztereospecifitás azért fontos, mert a következő lépésben az oxidációt katalizáló dehidrogenáz enzim az L-izomérre specifikus. Ebben a lépésben NADH + H keletkezik és megtörténik a béta-szénatomon az oxidáció (innen a béta-oxidáció elnevezés). Az utolsó lépésben tiolízis történik, amelynek során újabb CoA belé-

LIPIDEK

:\'YAGCSERF.JE

)U))) )))) )) )))) )))) )))))))))) )))) )))))) )))))))) )))))) )))) )))))))) )) )) )) )))))H)))))))))))))))>)))))}) n )) •U>))n >>

» >))) >> >>>>>UH>)UU))H) >> >) >>

J6 l

L-ij-hidtOXIacii-CoA

~ ~-hidroxi-ac•I-CoA- ~ dehidrogenáz

~-ketoaci l -CoA

rHS-CoA

acetii-CoA-aclltranszferáz Jl-ketottoláz

+

~o CH3 - C - S -CoA

acii-CoA

acetil-GoA

2-118. ábra. A zsírsavak béta-oxidációja

pésével acetil-CoA hasad le, s így kialakul a most már két szénatommal rövidebb aktivált zsírsav. Az utóbbi három enzim a zsírsavlánc hosszúsága szempontjából széle specifitású. A tiolízissel keletkező két szénatommal rövidebb acil-CoA egy újabb béta-oxidációs ciklusban a lakulhat tovább.

A béta-oxidáció lépései hasonlóak a zsír av de novo szintézis fordított irányú lépéseihez, azonban attó l mégis markánsan e ltérőek. O

Mindenckelőtt,

más kompartmentben történnek; a zsírsavszintézis a citoplazmában, az oxidáció a mitokondriumban folyik.

162

>»»>>>>>>>» >HH>>>>>>»>>»>>> >HHH> » >>» » >> >> >>» >>>>» >>>H>»>>>»>>>»n>>» >> >> >>>>>> >>>>» >> >> >> >> >> >>» >»>>>»>>>>>n>>>>>>>>>»n>>>»>))>>>H>»>»>>u>>H>

O A zsírsavszintézisben a folyamat ACP-hez, az oxidációban koenzim-A-hoz kötve történik. C) A szintézisben a redukciókban NADPH, az oxidációban a FAD és a NAD a kofaktor. O A szintézisben D-hidroxi-, az oxidációban L-hidroxi-intermedier keletkezik. 0 Végü l pedig a szintézisben közvetlenül a malonil-CoA vesz részt, míg az oxidációban acetil-CoA keletkezik. A palmitinsav teljes lebontásához hét egymást ciklu ra van szük:ség, amelynek végeredményeképpen 8 acetil-CoA, 7 FADH 2 és 7 NADH +H + keletkezik. Tekintve, hogy egy acetil-CoA molekula eloxidálása 12 ATP szintézisét eredményezi (lásd 2.1. fej ezet), valamint, hogy egy FADH 2 visszaoxidálása 2, mig egy N ADH-é 3 molekula ATP szintézisét eredményezi, a palmitinsav oxidációja során keletkező ATP-molekulák száma: 8x l2 + 7x.2 + 7x3 = 131 , viszont le kell vonni az aktiválás során fe lhasznált két makroerg foszfátkötés miatt 2 ATP-t. Vagyis a palmitinsav-molekula teljes oxidációja moleku lánként 129 A TP keletkezését teszi lehetövé. Mindezideig nem ismert, hogy a zsírsavak béta-oxidációjának regttlációjában valamelyik enzimnek kitüntetett szerepe lenne. Valószínűbbnek látszik, hogy az oxidáció attól függ, hogy a szubsztrátok és kofaktorok milyen méctékben állnak rendelkezésre, illetve a keletkező aceti l-CoA milyen sebességgel tud eloxidálódni a citromsavciklusban. Fontos reguláló szerepe van a malonii-CoA-nak, ami gátolja a karnitin-acil-transzferáz l. enzimet (2- l 17. ábra), ezáltal megakadályozza, hogy a zsírsavak eljussanak az oxidáció helyére. Minthogy a malonil-CoA a zsírsavszintézis intermedierje, ily módon meggátolj a, hogy a sejtben egy idejű leg zsírsavszintézis és -lebornlás történjen, vagyis a citoplazrnában szintetizálódó zsírsavak a mitokondriumba jussanak és eloxidálódjanak. követő

A zsí rsavak béta-oxidációjának károsodását okozza az a nemrégiben felfedezett örökl ődő enzímdefektus, ame lynek lényege az acii-CoA-dehidt·ogenáz elégtelen működése. Attól fúggöen, hogy melyik dehidrogenáz érintett, különbözö hosszúságú zsírsavak oxidációja károsodhat; a leggyakoribb a közepes hosszúságú acilCoA-dehidrogenáz e légtelensége. A tünetek többnyire

ANYAGCSERE

több óráig tartó éhezést követően j elentkeznek, általában már az első két é letévben, hányás, letargia, gyakran coma formájában. A zsírsav-oxidáció gátlása következtében ketontestek scm keletkeznek, az izmok csak glukózt égetnek, am í következményes hypoglykaemiához vezet. A közepes szénlánchosszúságú zsirsavak alternatív úton alakulnak át, részben az omega-szénatomon oxidálódnak és közepes hosszúságú dikarbonsavak jönnek létre. részben glicinnel és karnitinnel észtereket alkotnak, amelyek a vizeletben megjelennek és a diagnózis megállapítását teszik lehetövé. Hosszan tartó éhezés elkerülésével a metaboli kus kompli kácíók elkerülhctök és az érintett egyének egyensúlyban tarthatók.

A páratlan szénatomszámú és a telítetlen zsírsavak oxidációja A szervezetben eloxidálódnak - bár lényegesen kisebb rnennyiségben, mint a telített, páros szénatomszámú zsírsavak - a páratlan szénatomszámú és a telítetlen zsírsavak is. Ehhez a béta-oxidáció enzimjein kívül néhány ki egészítő enzimre is szükség van. A páratlan szénatomszámú zsírsavak oxidációja az utolsó ciklusig ugyanúgy történik, mint a palmitinsav oxidációja (2-1 18. ábra). Itt azonban nem acetii-CoA, hanem a három szénatomos propionil-CoA keletkezik. A propionil-CoA-ból karboxilálással metil-malonil-CoA keletkezik (2-l 19. ábra). A propioni i-CoA-karboxiláz, csakúgy, mint minden karboxi láz, biotin kofaktorral működik. A metil-maloni l-CoA a szénatomok átrendeződéséve l a metil-malonil-CoA-mutáz hatására szukcinil-CoA-vá alakul, ami belép a citromsavciklusba. A metil-malonil-CoA-mutáz működéséhez B ,2-v itaminra van szükség, melynek hiányában ez a reakció nem történik meg és propionsav és metil-malonsav jelenik meg a vizeletben. A mutáz enzim veleszületett hiánya okozza az öröklődő metilmalonsavas acidaemiát és aciduriát, melyben meti lmalonsav szaporodik fel a vérben és jelenik meg a v izeletben. A telítetlen zsírsavak oxidációját is nagyrészt a béta-oxidáció enzimei végzik.

LIPID EK ANYAGCSE RÉJ E

»>>n>l>>>>>>>>>~l>»n>>>>l>>>»>ll>>>>>>>nnn>>n>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>)))l>)>>>>>>>>>>>l>l»>>>> >>>>>>n>>»>>)>))nHn>>>>»>>>>>>>>>>>>>>H>>

163

~o CH3 - CH2 - C - S- CoA propionlr CoA

Hco; yATP ~ADP+I?1

l ffioPIONIL-CoA- : KARBOXILÁZ l

l

H

~o

l

CH3 - (CH2ln- CH2 - C - CH2 - C - S - CoA

coo~o l

l

OH

CH3 - CH - C - S- CoA

~

p-o-hidroxi-acii-CoA

1

1

metil-malonii-CoA

EPIMERÁZ

B" -vitamin

O ~ CH3 - (CHzln- CH2 -cr- CH2 - C - S - CoA OH

l

H P-L-h idroxi-acii-CoA

l l

szukcinii-CoA

b 2-119. ábra. A propionii-CoA metabolizmusa

~-oxidáció

'Y H

l

CH 3 -(CH~0 - C =-

4

H

~o

l

C -CH2 - C - S -CoA l

,

3

cisz-L\3-enoii-CoA

Ha a zsírsavban a kettős kötés transzkonfigurációjú és a béta-ox idációban, amikor a folyamat eljut a kettős kötésig - helyzete ő2, vagyis megegyezik azzal, ami a béta-oxidációban amúgy is kialakuina - , akkor az e lső dehidrogenálási lépés kivételével az oxidációt a béta-ox idáció további enzimei végzik. Néhány ettől eltérő he lyzet is lehetséges, me lynek megoldására további enzimekre van szükség. Ha a ke ttős kötés a megfel e l ő he lyen van, de a molekula cisz-konfigurációjú (2- 120a ábra), akkor a béta-oxidációban megtörténik a hidratálás, mely azonban nem L-, hanem 0-hidroxi-acii-CoA-t eredményez, s ez nem sz ubsztrátja a következő, N AD ' -da l működ ő dehidrogenáznak. Ilyenkor egy epimcráz megváltoztatja a konfigurációt, és a molekula már tovább alakulhat.

1

l tZOMERÁZ

transz-L\2-enoíi-CoA

l l

!3-oxidáció

'Y 2-120a-b ábra. A telítetlen zsírsavak oxidációjának kiegészitö lépései. Az a, b reakciókhoz lásd a szöveget

1 6~

)H))))H)>)»>HHH))I)))))))))))))))))))))))))))))))») )))}))))))))))))))))))))))))))))))))»)) ))))))))))>)))>)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))

transz-62-cisz-.84-enoU-CoA

r- NADPH+H

~'aNADP

(R8mJKTAz j

transz-6 3-enoii-CoA

l

Alfa-oxidáció és omega-oxidáció

~o

l

31

2

l

H transz-62-enoii-CoA

l l

...

~-oxidáció

2-120c ábra. A telítetlen zsírsavak oxidációjának pései. A c reakciókhoz lásd a szöveget

kiegészítő

Néhány esetben a béta-ox idác ióná l leí rtakt ól némil eg is történhet a zsírsavak oxidációja. ami mennyiségileg nemje lentős ugyan, a7onban egy-egy esetben fiziológiai vagy patofizio lógiai jel ent őségű lehe t. Ilyen az a lfa-oxidáció. amikor rövidebb zénatom számú zsírsavak a lfa-szénatornján törlén ik egy hidroxilá lá .. " az ezt követő dckarboxilálás után kezdődik cl a béta-oxidác ió. Ez történik a 1-12 J. áhrán látható titánsav oxidációjában. Fitánsav a fitolmc taboliz musában kel etkezik és nagyobb mcnnyiségben a tejben és á llati Lsírokban ta lá lható. A béta-oxidáció a 3. zénatomon lévő -Cl h-csoport mia tt csak akkor tud elkezd ődni . ha először megtörténik az aJfa-szénatomon a hidroxilálás. majd a dekarboxilálás. Ezt követően a béta-ox idác ióban három propio nii-CoA. három acetil-CoA é egy izobutirii-CoA molckula ke letkee llérően

CH3 - (CH2)4 - CH2 -CH2 -C - C-C-S -CoA 4

Ha a kettős kötés a 3-4-es szénatom között található, s a molekula cisz-konfigurációjú (2-120b ábra), akkor egy izomerázra van szükség, ami egyszerre változtatja meg a kettős kötés helyzetét és a konfigurációt, létrehozva a transz62 módosulatot. Ezt az intermediert az első dehidrogenálás kivételével a béta-oxidáció enzimei alakítják tovább. A linolsav ( 1869, 12) oxidációjában fordul elő, hogy az első négy acetil-CoA keletkezése után a béta-oxidáció következő fordulójában az eredetileg a 12- 13-as szénatomok közötti kettős kötés a 4-5. szénatomok között helyezkedik el (2- / 20c ábra). Az acil-CoA-dehidrogenáz által katalizált oxidáció egy transz-62, cisz-64-enoilCoA-t hoz létre. Ezt a problémát egy olyan reduk.táz oldja meg, amely NADPH-val müködik és redukcióva l egy transz-63-enoii-CoA-t eredményez, amely izomerizációval transz-62enoil-CoA-vá alakul és szubsztrátja a béta-oxidációban az enoil-CoA-hidratáznak. A telítetlen zsírsavak oxidációja természetesen kevesebb A TP szintézisét teszi lehetövé, mint az ugyanolyan széoatomszámú telített zsírsavaké, mivel kevesebb redukált FAD keletkezik, ami a terminális oxidációban ATP szintézisét eredményezné.

IZOMERAZ

H 5

ANYAGCSERE

lé-

2-121 . ábra. Fitánsav

CH3 CH3 -

CH3

CH3

l l l l a CH - (CH2b- CH - (CH2b- CH - (CH2lJ- CH -CH2 - COO-

E

LIPIDEK A ., AGC ERÉn:

zik. A hidroxilalá valószínüteg az endoplazmás retikulumban é. a mitokondriumban történik a7 ún. kevert funkciójú oxigenázok részvételével.

Egy ritka genetikai betegségben, a Refsum-kórban nem történik meg az alfa-hidroxiláció, a filánsav nem bomlik le, hanem felhalmozódik a szövctckben és a szérumban, aminek súlyos neurológiai következményei vannak (retinitis pigmcntosa, pcrifériás neuropathia, cerebellaris ataxia stb.). A tejtennékek és a hús fogyasztásának visszaszorításáva l az állapot lényegcsen javítható. Szintén ritkán, dc elörordul, fOicg a közepes zénatomszámú zsír avakkaL hogy a hídroxilátás a7 omega-szénatomon történik (omega-oxidáció). s további oxidációval dikarbon av alakul ki. A dikarbonsavak bánnclyik karboxiicsoporton aktiválódhatnak és a béta-oxidációban rövidebb szénláneú dikarbonsavvá alakulnak. A folya mal el sősorban a peroxiszómákban történik, szintén kevert funkciójú oxigenázok rés7vétclével.

A ketontestek keletkezése és felhasználása. Ketonaemia, ketonuria A ketontestek az acetil-CoA-ból keletkező, vízoldékony molekulák, amelyek el sősorban a májban, kisebb rnértékben a vesében szintetizálódnak és a periféfiás szövetek számára alternatív energiaforrásul szolgál nak. A ketontestek szintézise a 2- / 22. ábrán látható módon a májsejtek mitokondriumába n történik. Két molekula acetil-CoA-ból a béta-ketotioláz hatására acetoacetil-CoA keletkezik, amely egy újabb acetil-CoA-val 3-h idroxi-3-metil-glutarilCoA-vá (HMG-CoA) alakul. Ez a szintézis sebességmeghatározó lépése, amit a HMG-CoAszintáz katalizál. A HMG-CoA-ból a HMG-CoAIiáz hatására keletkezik egy acetil-CoA és az acetecetsav. Az acetecetsavból redukcióval alakul ki egy másik ketontest, a béta-hidroxivajsa v. Ennek az átalaku lásnak a sebessége a mitokondriumban lévő NADHINAD+ aránytól függ. A HMG-CoA-szintáznak két izoenzimje létezik, amelyek különböző kompartmentekbe n helyezkednek el: a mitokondriumban található az egyik izoenzim, a citoplazmában pedig a másik. fntramitokondriálisan lJMG-CoA-szintáz csak a májban található, ezért ketontestszíntézisr e csak itt

165

van lehetőség. A citoplazmában csaknem minden sejtben keletkezik HMG-CoA a citoplazmatikus HMG-CoA-szintáz hatására. A citoplazmában nincs liáz enzim, vagyis ketontestek nem keletkeznek, a HMG-CoA itt a koleszterinszintézisben alakul tovább (lásd késöbb). Kis mennyiségben, spontán dekarboxilációval az acetecetsavból aceton keletkezik, patológiás körülmények között, pl. diabeteses ketoacidosisban ez olyan mennyiséget érhet el, hogy a tüdőben kiválasztódva érzékelhetővé válik a leheletben. A ketontestek a májsejtekből a keringésbe diffundálnak, s mivel viszonylag jól oldódnak vizes közegben, carrier nélkül szá llítódnak a perifériás szervekhez. A sejtekbe diffundálva a mitokondriumban a béta-hidroxi-butirát visszaoxidálódik acetoacetáttá, az pedig az aceto-acetát:szukcinilCoA CoA-transzferáz hatására acetoacetii-CoAvá alakul, amibő l a tioláz által katalizált reakcióban 2 acetil-CoA keletkezik, s ez a citromsavciklusba lépve eloxidálódik (2-123. ábra). A májsejtekben hiányzik a CoA-transzferáz, vagyis a ketontestek nem tudnak - értelmetlenül - a keletkezés helyén azonnal eloxidálódn i. Normális körülmények között, egyensú lyban lévő metabolizmus során is keletkeznek ketontestek, amelyek koncentrációja a vérben a 0,2 mM-t nem haladja meg. A perifériás szervek, különösen a szívizom és a vesekéreg ilyen körülmények kőzött is oxidál ketonteste ket, sőt el őnyben is részesíti öket a glukózzal szemben. Nagyobb mennyiségben akkor keletkeznek ketontestek, amikor a rnetabolizmusban az egyensúly a zsírsavak oxidációja felé tolódik el. Ez történik éhezésben, amikor szénhidráthiány alakul ki, vagy inzulinhiányos diabetesben, amikor a sejtek - a magas vércukorszint ellenére - relatív szénhidrátínségben vannak. Ilyenkor az energiaszükséglet fedezésére a sejtekben, a májsejtben is, előtérbe kerül a zsírsavak oxidációja. Ahhoz, hogy a béta-oxidációban keletkező acetil-CoA a citrátkörbe léphessen, el egendő mennyiségü oxálacetátra van szükség, ami azonban ilyen esetben nem áll rendelkezésre, mert a májban a relatív g lukózhiány kompenzálására megindul a glukoneogenezis, melyben elhasználódik az oxálacetát egy része. A citrátkör nem tudja felvenni a nagy rnennyiségben keletkező acetii-CoA-t, ami ilyenkor fokozott mértékben terelődik a ketontest-keletkez és irányába (2- 123. áb-

acetoacetii-CoA

HMG-CoA-LIÁZ

C02

._L spontán

~o

o ll

CHJ- C - CH2-coo acetoacetát

OH

l

CH3

CH - CH7 -

COO

[1-hidroxi-butirát

CHj -C-S-CoA

2 acetii-CoA

i - - + acetoaoetii-CoA

~ HMG-CoA-SZINTAz HMG-CoA

;:o ~·

ACETON 111

..

j

ACETOACETAT

!

1~-HIDROXI-BUTIRÁT

oxál

tHE~ÉS Dl ABaTES

ll l

piruvát

GLUKONEOGENEZIS

MAJ

KERINGÉS < 0,2 mM (3- 5 mM) KETONAEMIA

J..

PERlFÉRlAS SZERVEK szívizom harántcsíkolt izom vese agyszövet-neuron

KETONURIA

2-123. ábra. A ketontestek keletkezésének és felhasználásának összefoglalása. A ptros ny1/ak azokat a folyamatokat Jelzik, amelyek fokozottan érvényesuinek éhezésben és mzullnhiányos diabetesben

16H

)))))))))))'t))l'tH))Uo))))))))\)~)))))))))))))))))),))),)))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))')))H))l))))))))))))t)))))))))))))))o)))))))))))))))))))))))))>)>))))))))) •>H

ra, piros nyilak). A periférián a sejtekben a glukózhiány miatt fokozott jelentőségűvé válik a ketontestek égetése, különösen az agyban, aho l e l enyésző a zsirsavégetés. Éhezésben és diabetesben az agyszövet - ahol normális meta.bolizmus mellett g lukózégetés folyik az energiaszükségletének akár 75%-át is képes ketontestekböJ fedezni . Amikor a ketontestek keletkezésévelnem tart egyensú lyt a periférián történő oxidáció, ketonaemia alakul ki. A ketontestek fokozott mértékü keletkezése éhezésben nom1ális regulációnak tekinthető, s ilyenkor a vérben a koncentTáció 3- 5 mM is lehet (fiziológiás ketosis). Ezzel szemben a diabeteses ketoacidosis olyan patológiás körülmény, amikor a vérben a ketontestek koncentrációja a 20 mM-t is elérheti. Tekintettel arra, hogy a ketontestek savak (pKs 3,5), jelentő cn csökkentik a vér pH-ját (metabolikus acidosis). A ketonlestek megjelennek a vizeletben (ketonuria), súlyos diabetesben a napi ketontestürítés elérheti az 5 g-ot. A ketontestek hidrofil molekulák, kiválasztásukjelentős vízveszteséggel is jár, ami a. keringő vértérfogat csökkentésével tovább ron~a a. beteg állapotát.

A koleszterin metabolizmusa A koleszterin a szervczet egyik legellentmondásosabb molekulája, amely minden ej tben megtalálható és életfonto ságú funkciók ellátásához nélkülözhetetlen, ugyanakkor ha a nom1álisnál nagyobb mennyiségben fordul el ő, korunk egyik leggyakoribb betegségének, a.z atherosclerosisnak és ennek következtében a szívinfarctus és az agyvérzés kialakulásának lehet kiinduló tényezője. A koleszterin minden sejtmembránnak alkotórésze és fontos fe ladata a membránok fluiditásának szabályozása. Ko l eszteri nből történik a különböző szteroidhormonok szintézise, amelyekesszenciálisaka normális mctabolizmus, a sóés vízhá.ltartás és a nemi működésck szabályozásáho7 egyaránt. Koleszterin a kiinduló anyaga az epesavak szintézisénck is, amelyek a lipidek emé ztéséhez S7ükségcsek.

A~ '

A (;(..S 1:.: R E

A koleszterin ciklopentanopcrhidrofcnantrénváza.t tartalmazó 27 szénatomból álló molekula, amelynek képletét és a szénatomok számozását a 2-124. ábra mutatj a.

2-124. ábra. A koleszterin képlete

A szteránvázboz (A-, B-, C-, 0-gyűrük csupa transz- konfigurációjúak) két anguláris mctilcsoport, a C 18 és C 19 kapcsolódik, amelyek a gyű­ rű síkja elé irányulnak, azaz béta-konfigurációjúak. A CJ-hoz egy szintén béta-konfigurációjú szekunder alkoholos hidroxil csoport, a 17-hez egy nyolc szénatomból álló alifás oldallánc kapcsolódik és a B-gyűrűben a C5-C6 között egy kettős kötés találbató. A szervezetben előforduló koleszterin 70%-a nem szabad koleszterinként, hanem koleszterinésztcrként van j elen, amelyben az alkoholos OHcsoporthoz észtcrkötéssel kapcsolódik egy zsírsav, legtöbb esetben olajsav vagy linolsav. A koleszterin fontos tulajdonsága, hogy vizben nagyon rosszul oldódó, hidrofób molekula, ezért kulcskérdés a:teknak a mechanizmusoknak a normális mű­ ködése, amelyek a szcrvczctbcn a koleszterint oldatban tartják.

A koleszterin szintézise Az életfontosságú funkciók ellátásához a megfcmcnnyiségü koleszterin két forrásból áll rendelkezésre; részben a táplálékkal kerül a szcrvczctbc, részben de novo szintetizálódik. Kolc ztcrinszintézis a legtöbb sej tben folyik, azonban l e lő

liPIDE K ANYAGC E R~:.J E

)))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))) )))))))))U)))))))))

azokban a szervekbe n, ahol a koleszterinből más anyagok szintetizá lódnak, vagyis koleszterime nagyobb mennyisé gben van szükség, a szintézis is nagyobb mértékű és j elentőség ű . Így kitüntetett fontosságú különöse n a májban, valamint a mellékvesében, az ovarium ban és a testisben fo lyó koleszterinszintézis . Je lentős mennyi ségű koleszterin szintetizá lódik még a bélháms ejtekben . A máj a koleszterin de novo szintézisén kívül meghatározó szerepet j átszik a táplálékkal a szervezetbe került koleszterin további sorsába n és a szervekhez történő szállításá ban is. Aszintézisa sejtek citoplazmáj ában megy végbe egy soklépése s reakció során, ame lynek egyes enzimei a citoszolban, mások az endoplazmás retikulum membránjához kötve helyezkednek el. A koleszterinszintézis lépései é a keletkező interrnedierek a 2-125. ábrán láthatók. A szintézis acetil-Co A-ból indul ki ; a koleszterin minden szénatomja acetil-Co A-ból szánnazik. Az első lépések azonosak a ketontestek szintézisé vel, vagyis a tio láz által katalizált reakcióba n 2 acetil-CoA-ból acetoacetii-CoA keletkezik, majd még egy acetil-Co A-val kondenzá lódva a HMGCoA-szintáz hatására 3-hidroxi-3-metil-g lutariiCoA j ön létre (2- J 26. ábra). Ezek a reakciók, szemben a ketontestek szintézisével, minden sejtben a citoplazm ában történnek . A HMG-Co A a kö-

)))))))))))))H))))) )))))))))))))))))U> •H>>>>>))U))UU >H>>•n>>>>

169

vetkező

lépésben mevalons avvá alakul, amelyben redukcióv al egy alkoholos OH-csoport alakul ki, koenzim-A felszabad ulása közben. A reakciót a HMG-C oA-redu ktáz kata lizálja, amely az endoplazmás retikulum ban lokalizáló dó enzim és mű­ ködéséhe z N ADPH-ra van szükség. Ez a koleszterinszintézis sebességmeghatározó lépése, a HMG-CoA-reduktáz szabályoz ásán keresztül valósul meg az egész szintézis regulációja. A mevalonsav két, egymást követő lépésben, A TP terminális foszfátcsoportját felhaszná lva 5-pirofoszfomevalonsavvá alakul. Ez az intermedi er egy újabb A TP felh asználásá val dekarbox ilálódik és kialakul az az öt szénatomos izoprénegység, ami a további lépésekbe n a koleszterin széntomj ait szolgáltatja. Ez az öt szénatom os izoprén, az izopentenil-piro foszfát, illetve a belöle izomerizációval kialakuló dimetil-aliil-pirofo szfát A koleszterinszintézisben a következő intermed ier, a l O szénatomos geranil-p irofoszfá t egy izopcntenil-pirofoszfát és egy dimetil-a liil-pirofo szfát kondenzá ciójával jön létre, s ebbő l egy újabb izopentenilpirofoszfáttal történő kondenzá ció során a 15 széntomos farnezil-p irofoszfá t. Két farnezil-p irofoszfát kondenzá ciója hozza létre a 30 szénatom os szkvalén t, miközben pirofoszfát szabadul fel, sebben a reakcióban ismét N ADPH-ra van szükség. A reakciót katalizáló szkvalén- szintáz az endoplaz-

acetii-CoA

o:;...,:..a..,. ....:J~bn<&

'

•

2

4

6

5-pirofoszfomevalonsov ,

~. ~:.?-./ ·" !,.•.•.Ve

6

·'5-· r~

»~aM">.f'......:w,"'-'IWv~,.z,.~·~

6

5

geranil-puafoszfát

farnezil- irafoszfát,

10

15

~,....,J.,~-F.'l,~l.:.'.- •'wll,'.~v t.J.'Nh

30

30

27

2-125. ábra. A koleszterin szintézisb en keletkező intermedie rek. A piros számok az intermedier ek szénatomszámát mutatják

citoplazmatikus HMG-CoA~szitltáz r - - - -

CH3

c;"eftl,.CoA Co4S'ffi

l l

CH2

l

COO

""' 2 ._.

C= O

? H2 CH - C - OH

l

3

O

C=

l

CH2

l

S - CoA

2 acetli-CoA

C= O

l

acetoacetii-CoA

HMG·CoA- ~ reduRtárz _

l.

S - CoA 3-hidroxi-3-metil-.glutarii-CoA

coo l

CH2 --1111-~

coo ATP

l

CH3 ~ C- OH

ADP ATP

l

ADP

\) . _ \J .

CH - C-OH CH2

CH2-0H

CH2- 0 -® - ®

l

mevalonát

5-pirofoszfomevalonát CH3 CH3 '-/

CH2

"~ c l

c ll

CH2

CH

CH2- 0 -® - ®

CH2

izopenten il-pirofoszfát

CH2

l

l

izopentenil-pirofoszfát

l

~

l

ll

C-CH

ll

3

CH

l

CH3 CH3

'-/

CH2 - 0 - ® - ®

c ll

geranil-pirofoszfát

CH

l

CH2 - 0 - ® - ® dimetil-aliil-pirofoszfát

> -<•

NADPH+H•

--111 -~

Hco;

CH2

l

--1111-~

l

3

ADP+P,

\
l

l

CH3

ATP

CH2

farnezil-pirofoszfát

farnezil-pirofoszfát

NADP+ szkvalén

2 PP,

2-126. ábra. A koleszterinszintézis lépései a szkvalén kialakulásáig

LIPIDEK Al\'YAGCSERÉJE

171

más retikulumban található. A szkvalénben a gyű­ rűs szerkezet még nem alakult ki, noha a molekula már bizonyos mértékben emlékeztet a koleszterinvázra (2-l 27. ábra). A gyűrű záródása egy epoxid kialakulásával kezdődik, ugyanis egy mono-

oxigerráz hatására molekuláris 0 2 -böl egy oxigénatom épül be úgy, hogy kapcsolódik mind a C2-, mind a C3-atomokhoz. A kialakuló szkvalén-2,3-epoxidban a kettős kötések n-elektronjai a 2-127. ábrán jelzett módon elmozdulnak és meg-

s~kvalét'l

szkvalénmonooxlgen~

cikláz

HO Ianoszteri n

szkvalén-2,3-epoxid

l

l ll l l

•

NADPH+H• NADH+H+

02

'

HO koleszterin

2-127. ábra. A koleszterin keletkezése szkvalénból

l 72

>»»m>m »>>>»>>m>> >»> »»>m»>»>>>>>>>>>»>>>>» >>»>>>»>»>»>»>»>»»»»»>»>»»m»m»>»>>»>>»> >»>»»»»»»»»>>»>»>>>m>>»>»»>»»>>»>

történik egy cikláz által katalizált reakcióban a A lanoszterin kialakulásá hoz még két metilcsopo rt helyeződik át; a C 14-ről a C 13-ra (ebből lesz a Cl8 metilcsopo rt) és a C8-ról a C 14-re. A lanoszterinben jelen van már a béta-orientációjú C3-0H csoport. A gyűrűzáródáshoz a szkvalén egy carrier fehérjéhez (sterol carrier protein1; SCP 1) kötődik , majd a keletkező lanosztenn egy másik fehérjéhez (SCP2) kapcsolódi k és kialakul a koleszterin . Ebben a reakcióban több lépésben, oxigén, NADH és NADPH részvételével, három metilcsopo rt (C4 és Cl 4-ről) C02 formában felszabadu l, a B-gyűrűben a kettős kötés a C5-C6 helyzetbe kerül, és NADPH-v al redukálódi k az oldalláncon a C24-C25 kettős kötés. Egy molekula koleszterin szintéziséh ez 18 molekula acetil-CoA használódi k fe l, 36 molekula ATP-re és 16 molekula N ADPH-ra van szükség. A 18 A TP az ATP:citrát -liáz reakcióban használódik fel , amelyben a mitokondri umból citrátformá ban a citoplazmá ba transzportá ll acetil-CoA visszaalakuL A felhasznált NADPH nagy része a g lukóz direkt oxidációba n keletkezik. A koleszterinszintézisben tehátjelentős energia- és reduktív ekvivalens felhasználás történik. gyűrűzáródás.

A koleszterinszintézis regulációja A koleszterin de novo szintézisén ek szabályozá sa egyike azoknak a tényezőknek, amelyek szerepet játszanak a normális plazmakoleszterin-szin t regulációjában. Mivel az endogén koleszterin szintézisében mennyiség ileg a legfontosab b szerepet a máj , kisebb részben a bél játssza, a szintézis szabályozásának is itt van a legnagyobb jelentősége. A legfontosab b tényezőket a 2-128. ábra foglalja össze. A szabályozá sban, a jelen ismeretek szerint, a RMG-CoA-reduktáz a meghatároz ó enzim. A legfontosabb szabályozó maga a koleszterin , ami gátolja az enzim működését. A gátlás mechanizmusa nem tcUesen tisztázott, de val ószinűleg fontos tényező az enzim mennyiség ének változása. A HMG-CoA -reduktáz féléletideje kb. 4 óra. Koleszterin hatá ára csökken a már meglevő enzim aktivitása és csökken vagy megszünik a HMG-CoA reduktáz szintézise. Két forrásból származhat koleszterin, ami szabályozza az endogén szintézist: az egyik a szintézis végterméke ként ke l etkező ko-

A:"~ YA G CS E R E

leszterin, a111ely negatív feedback gátlással csökkenti a további szintézist, a másik a táplálékkal elfogyaszto tt koleszterin . Ezt, mint a későbbiekben részletesen ismertetjük (182. oldal), a vékonybélbő l lipoprotein ek - kilomikron ok - szállítják a májhoz. A hepatociták membránjá ban receptorok ismerik fel és kötik meg a lipoproteineket, majd ezeket a koleszterin nel együtt intemalizál ják, a sejten belül a koleszterin felszabadu l a lipoproteinből és gátolja a HMG-CoA -reduktázt. Ugyanez a mechanizmus biztosítja az LDL-ben (low density lipoprotein) szállított koleszterin nek a vérplazmából a sejtekbe j utá át. A lipoproteinekről és ezen mechanizmusokról a későbbiekben részletesen is szó lesz ( 180. oldal). Amikor tehát a táplálékkal elfogyaszto tt koleszterin mennyiség e megnő, a májban csökken vagy megszűnik a kole zterin de novo szintézise. Ezzel szemben alacsony koleszterintartalmú étrend melJett az endogén szintézis fokozódik. A koleszterinszintézist a HMG-CoA -reduktáz müködésén keresztül hormonok is szabályozz ák. [nzulin és trijódtironin fokozza, míg glukagon és kertizol csökkenti a koleszterinszintézist. A hormonok hatásában két mechanizm us játszhat szerepet, az egyik az enzim szintézisén ek, vagyis mennyiségének változása (kortizol), a másik az enzim kovalens módosítása (glukagon) . A HMG-CoAreduktáz ugyanis fo zforilációval és defoszforilációval is szabályozható; foszfori láció az enzimaktivitás csökkenésé t, defoszforiláció az enzim reaktíválását idézi elő. A foszforilációt végző kináz és a defoszforil ációt végző foszfatáz enzimek szabályozá sa a glikogén-anyagcserénél leírtak szerint történik (129. olda l). A sejten belüli koleszterin szint csökkentésén keresztül befolyásolh atják a koleszterin-anyagcserét az epesavak. Mennyiség i szempontból ugyanis az epesavak szintézise jelenti a koleszterin átalakulás legfőbb útját. Amikor az epesavak szintézise fokozódik, megnő a májsejtek koleszterin iránti igénye. Ez azért érdemel külön em lítést, mert a kórosan megnövekedett plazmakoleszterin-szin t csökkentésében ennek a mechanizmusnak a kihasználása jó lehetőség az orvos zámára ( 187. oldal). Úgyszin tén terápiás jel entőségű azoknak a gyógyszere knek a hatá a, amelyek közvetlenül gátolják a HMG-CoA -reduktázt és ezáltal csökkentik az endogén koleszterin szintézist (pl. Lovastatin).

LIPIDEK A~\ i\ GC ER ÉJE

>>>>>H>>»>>>•>H»»>>>>>H>»>>>U>>H>>U>>>>>>>»>>>>>»>>H»>>>>>»>>)»>>>>>>H>>>>>»>»>>>>>>>>>>HJ>>>>H>>H>»»n>>>>»>H>>>>>)>nunn

173

TÁPLÁLÉK

mevalonsav l l

l l l

t KOLESZTERIN

l EPESAVAK

2-128. ábra. A koleszterinszintézis szabályozása a májban

A plazma koleszterinszin~ének szabályozása komplex mechanizmus, amelyben a HMG-CoAreduktáz szabályozásán kívül egyéb tényezök is fontos szerepet játszanak. Ennek részletes összefoglalására a felszívódás és a lipoproteinek tárgyalása után visszatérünk. A HMG-CoA-reduktáz aktivitásának váJtozá a magyarázza a koleszterinszintézis diumális ritmusát. A szintézis éjszaka a legintenzívebb, míg ébredés után kb. 6 órával minimális, ami tökéletesen követi a sebességmeghatározó enzim, a HMGCoA-reduktáz aktivitá ának változását.

A koleszterin-észterek keletkezése A koleszterin egy része a szervezetben nem szabadon, hanem észterek formájában található,

alkoholos kole zterin a amelyben OH-csoportjához észterkötéssel egy zsírsav kapcsolódik. Koleszterin-észterek keletkeznek a szervekben akkor, amikor a koleszterin feleslegben van jelen és nem használódik fel sem a sejtmembrán, sem hormonok vagy epesavak szintézisére. A koleszterin-észterek a sejtekben, el ösorban a májban, a mellék- vesekéregben, a bélhámsejtekben és az artériák falában aktivált zsírsavakból keletkeznek a 2-129. ábrán látható reakcióban. A szintézist az endoplazmás retikulumban található enzim, az acii-CoA:koleszterin-aciltranszferáz (ACAT) kataLizálja. Amikor a sejtekben megnő a szabad koleszterin mennyisége, fokozódik az ACAT aktivitása és elraktározódik az éppen fel nem használódó koleszterin. Ettől eltérő mechanizmussa l történik a koleszterin-észterek keletkezése a p lazmában. A keringés-

zsírsav

aktiválás

l

ACIL-CoA.KOLESZJE~IN

zsírac1I-CoA + kolesztenn

ACI LTRA

koleszterín-észter +

máJ bélhámsejtek mellékvesekéreg artériafal

o l'

1

H C-0- C - [CH l - CH ' ll ~~ 2" 3 ~ -o- c- H 0

~o

3

CH

,

H,C - 0 -P - O-CH2 - CH2 -N l

LECITIN·KOLESZTERINACILTRANSZFER

Jec1trn

o

---------ti !J.• koleszterin-észter+ lizolecitin LCAT

2-129. ábra. A koles::te rin-észterek keletkezése

- CH~

+koleszterin

LIPIDEK ANYAGCSERÉJE

ben a koleszterint - tekintettel arra, hogy erősen hidrofób - lipoproteinek szállítják. A lipoproteinekben a koleszterin mintegy 70%-a koleszterin-észterké nt van jelen. Ennek keletkezésé t egy másik enzim, a lecitin:kol eszterin-ac il-transzferáz (LCAT) katalizálja, a zsírsav a lecitin 2. szénatomjáról származik, ahol általában linolsav található (2-129. ábra). A plazmában a reakció a high density lipoprotein ekben (HDL) történik és a foszfolipid szubsztrát is a HDL-ből származik. A keletkező koleszterin -észterek hidrofób tulajdonsága a koleszterin nél erősebb, s azonnal a keletkezés után a HDL belsejébe kerülnek, s a májba szállítódnak . Ennek a mechanizm usnak fontos szerepe van a szervekben felhalmozó dott koleszterin eltávolításában és májba történő szállításába n (lásd még a lipoproteineknél). Az LCA T enzimet a máj szintetizálja és juttatja a keringésbe . Májsejtkárosodással járó kórképekbe n csökken a plazmában a koleszterin-észterek mennyiség e annak következtében, hogy károsodik a májban részben az enzim, részben a foszfolipid ek szintézise. A koleszterin -észtereket a koleszterin -észterázok hasítják és koleszterin , valamint zsírsav keletkezik. Koleszterin -észtcrázok találhatók intracellulárisan a lizo zómákban, itt történik a lipoproteinekkel a sejtekbe felvett koleszterin -észterek hidrolízise. Az endoplazm ás retikulum is tartalmaz koleszterin -észterázok at, amelyek speciális körülmények között, reverz ibilis reakcióban koleszterin-észterek keletkezésé t katalizálha tják. A bélhámsejtekben szintetizáló dó koleszterin -észterek egy része valószínűleg ilyen rnódon keletkezik. Koleszterin -észterázok szekretálód nak a pancreasból is, amelyek hatása extracelluláris és feladata a táplálékkal a bélbe került koleszterin -észterek hasítása.

Az epesavak keletkezése, metabolizmusa és jelentősége A koleszterin a szervezetb en két jelentős metabolikus úton alakulhat át. Az egyik az epesavak szintéz ise, amely a májban történik és mennyiségilegje lentősebb koleszterin felhasználá st jelent, mint a má ik metaboliku s út, a szteroidhor rnonok szintézise, amely azonban a hormonok funkciója rniatt kitüntetett jelentőségű .

Az epesavak a koleszterinböJ keletkező molekulák, amelyek számos jelentős funkcióval rendelkeznek. O Szerepet játszanak a zsírok emésztéséb en. Mi-

vel poláros és apoláros csoportoka t egyaránt tartalmazna k, detergens tulajdonság gal rendelkeznek; a vékonybélb en a táplálékkal elfogyasztott zsírokat emulgeáljá k, felületüket megnövelik , ennek következté ben a pancreaslipáz számára a lipideket hozzáférhetőbbé teszik. Az emulgeáló hatáson kívül a lipidek emésztését azért is gyorsí~ák, mert közvetlenü l aktiválják a lipáz enzimet 6 Feladatuk, hogy a foszfolipid ekkel együtt oldatban tartsák az epébe kiválasztád á koleszterin t, megakadá lyozva ezáltal a koleszterin kiválását és koleszterin kövek kialakulásá t. ~ A koleszterin kiürülés lehetőségét biztosítják. A koleszterin gyűrűs váza ugyanis (a megfelelő enzimek hiányában) a szervezetb en nem tud lebomlani széndioxid dá és vízzé, és nem is választódik ki. Mennyiség ileg a legfontosab b lehetőség a koleszterin eltávolításá ra az, hogy epesavak keletkezne k belőle, amelyek egy réze fiz iológiás körülmény ek között a széklettel kiürül. Az epesavak a májban keletkeznek . A koleszterinmolekul án történő változások és a szintézis vázlatos összefoglal ása a 2-130. ábrán látható. A szintézis sebességm eghatározó lépését a 7-a lfa-hidroxil áz katalizálja, ami a koleszterin 7. szénatomjá n egy alfa-helyzetű alkoholos OH-csoportot eredménye z. A kólsav, az egyik el sődleges e pesav ebben a lépésben gátolja az epesavszintéz ist. A 3. szénatomo n izornerizác ióval az OHcsoport béta-konfig urációja alfára változik. A kólsav kialakulásá ban a 12. szénatomo n is hidroxilálás történik, ami után az 5-6. szénatomo k közölti kettős kötés redukálódik . Az oldalláncok rövidülnek mégpedig úgy, hogy először hidroxilálás, majd további oxidáció történik a 26. szénatomo n és kialakul egy karboxilcsoport. Hidroxilác ió és oxidáció történik a 24. szénatomo n is, ami után a 24. és 25. szénatom között a kötés felhasad, miközben CoA-SH-v al a kialakuló e lsődl eges epesavak aktiválódnak és propionsav keletkezik (páratlan zénatomszámú zsírsav). Az elsődleges epesavak, a

A:'I'YAGCSERE

1

OLE...SZTERI~

7a.-h'dr,oxijác 6

- iz.omerápló

i3J3-0H ~ 3a.-OH

12-hidroxiláció

Ho···

! !

26-hidroxiláció + oxidáció 24-hidroxiláció + oxidáció

o ll

! !

o

ll

c'
c'
Ho ··

··oH HS-CoA ~

propionát ~ ~o c-s-coA

Ho·

HO ,.. KOLIL-GoA

..

·······oH KENODEZOXIKOLIL-CoA

AKTIVÁLT ELSÖDLEGES EPESAVAK

)))))))))))))))))))))))))>n)))H))))U))))))))>>>lo>)))))) )))H))))))))))))))>))))))))))))>)>>>)>>))>)))>)>>))))) )))))>))))))))U>)))>))))))))))))))))

~~---- gjlcta (M + em 2 - c~ 1 -----~ ~ va'g

i}ii]Jlgácló

FfS C0A~~~~i-----· t8urm (1\JH~ + -(CH2)~ - SO -) ---..,........j~l [

~ TAUROKENODEZOXIKOLÁT

GLIKOKE_N_ O_DE _ Z_O....;X:....IK - OLÁT

fKONjll_GÁLT ELSÖDLEGES EP~SAVAK bo

..·

.. Ho ··

··oH

··o H

~;l

dekonjugáció

EPE

r

_,/

\.._

~

KOLÁT

( EL&öDLEGES EPESAVAK

l

l

7-dehid roxilálás

HO ....-

Ho ···

KENODEZOXIKOLÁT

l

.··

T]

loEZOXI KOLÁ

[MASODLAGOSEPESAVA~ )

2-130. ábra. Az epesavak szintézise és metabolizmusa

o

ll C- NH-[CH ) -SO 22 3

C~ NH - CH2- CO
Ho ··

i

LITOKOLÁT

J77

Al\ Y AGCSERE

kólsav és a kenodezoxikólsav, mielőtt a májból kiválasztódnak, glicinnel vagy taurinnal konjugálódnak, s ezek a konjugált elsődleges epesavak az epecsatornák felé hagyják el a májsej teket. Az epesavak, mint a szerkezetükből látható, poláros és apoláros csoportokat egyaránt tartalmaznak. Az epesavak esetében az AB gyűrűk konfigurációja cisz, a poláros karakterű valamennyi funkciós csoport azonos irányba orientálódik. Így a molekula amfipatikus jellegű: egyik oldala tisztán apoláros, míg a másik poláros. Az amfipatikus tulajdonság meghatározó mind a lipidek emulgeálásában, mind a koleszterin oldatban tartásában. Az epesavak -COOH csoportja, csakúgy mint a konjugált származékok -COOH, illetve -S0 3H csoportjai savasan disszociálnak, az anionok Na , illetve K~-nal sókat alkotnak, amiért epesavas sóknak is nevezik őket. A nevezéktan nem egységes, használják ezt az elnevezést az epesavakra és a konjugált származékokra egyaránt. Az epesavak az epehólyagban tárolódnak és a táplálkozással összefüggésben, hormonok hatására a duodenumba ürülnek. A vékonybélben közreműködnek a lipidek emésztésében, a lipideket emulgeálják, ami esszenciális a pancreas-lipáz hatékony működéséhez, és így a trigliceridek és egyéb lipidek (pl. zsírban oldódó vita- rrunok) tökéletes felszívódásához. Ezt a hatást egészíti ki a pancreas-lipáz aktiválása. A bélben bakteriális enzimek hatására az elsődle­ ges epe avak nagy része átalakul; dekonjugálódnak, a 7. C-atomon dehidroxilálódnak és kialakulnak a másodiagos epesavak. A kólsavból dezoxikólsav, a kenodezoxikólsavból litokólsav keletkezik. A másodiagos epesavak és az át nem alakult el sőd leges epesavak nagy része nem vész el a szervezet számára, rnert a vékonybél- és a vastagbélmucosán keresztűl felszívódnak és a portális keringéssei visszajutnak a májba, ahol a nem konjugált származékok konjugálódnak és ismét kiválasztódnak az epébe (2-13 1. ábra). A másodiagos epesavak fel szívódása elsősorban a jej unumban és a colonban passzív diffúzióval, az elsődleges epesavaké az ileumban aktív transzporttal történik. A portál is keringésben az epesavak albuminhoz kötve szállítódnak. Az epesavaknak egy kis része, napi kb. 300 mg nem szívódik fel , hanern a széklette l távozik. Ez viszonylag kis mennyiség, de biztosítja, hogy érdemleges mennyiségű koleszterin a szervezetből e ltávozhat. A többi epesav a májba

visszakerül és újra felhasználód ik. Ezt a körforgást az epesavak enterohepatikus körforgásának nevezik (2-131. ábra). Az epesavak naponta 5- 10szer megjárják ezt az utat, 15- 30 g epesav választódik ki a májbóL A parenchymasejtekben történő szintézis lényegében csak a széklettel kiürült mennyiség pótlására szolgál.

Az enterohepatikus körforgást meg lehet szakítani o lyan gyanták per os alkalmazásával, amelyek a bélben az epesavakat megkötik, és az a széklettel kiürülnek. A májban ilyenkor, a teljes kiürül t mennyiség pótlására fokozódik az epesavak szintézise. Ilyen gyógyszereket akórosan megnövekedett plazmalipoprotein-szint csökkentése céljából alkalmaznak. A terápiás lehetőséget éppen az biztosítja, hogy az epesavak szintéziséhez fokozott mennyiségben használódik fel és ürül ki a szervezetből a koleszterin (lásd még a 187. oldalt).

Az epe olyan vizes oldat, amely az epesavakon kívül foszfolipideket, szabad koleszterint és más, számos szerves (pl. epefestékek) és szervetlen anyagot tartalmaz. Szemben a plazmával, ahol a koleszterin nagyobb része, kb. 70%-a koleszterin-észterként van jelen, itt csaknem teljes egészében szabad koleszterin található. A koleszterin az epében a foszfolipidekkel és az epesavakkal ún. vegyes micellákat alkot, ami lehetövé teszi, hogy a koleszterin oldatban maradjon. Ebben a funkcióban - mennyiségileg - különösen fontos szerepet játszanak a májból az epébe kiválasztódó foszfolipidek, elsősorban a lecitin. Az epe analizise és a 2-132. ábrán látható háromszögletű koordináta-rendszerben történő ábrázolás lehetövé teszi annak megállapítását, hogy az adott epesav, foszfolipid és koleszterin arány mellett a koleszterin oldatban van-e. Ha az alkotórészek ilyetén ábrázolása olyan metszéspontot ad, ami a satirozott területhe esik, a koleszterin oldatban van, ha ezen a területen kívül van, akkor a kole zterin az epében kiválik és koleszterinkövek keletkeznek. Az ábrán a P-vel jelzett pont a normális epeösszetételt jelzi, amelyben 5% a koleszterin, 15% a foszfatidilkolin és 80% az epesavak aránya.

LIPIDEK A'IYAGCSJi:RÉ.JE

MÁJ

r--------------------+ ELSODLEGESEPESAVAK (-300 mg/nap)

~----+ MÁSODLAGOSEPESAVAK

l

+-KONJUGÁCIÓ__. tnl"'ln taurin)

KONJUGÁLT r----++ MÁSODLAGOS EPESAVAK

KONJUGÁLT ELSÖDLEGES ~--~----~------+ EPESAVAK

15-30 g/nap

EPE

DUODENUM 1. LS ÍROK E:MUL GbÁL X 2. PANCREAS LIPÁ Ah

KONJUGÁLT ~--~~LSÖDLEGES

EPESAVAK

jejunum } passzív diffúzió colon ileum - aktív transzport

}-oEKONJUGACR'I .-----+-- ELSÖDLEGES EPESAVAK

15- 30 g/nap

~7'0H MÁSODLAGOS FPf• XA:\II lU

VENA PORTAE

ll

SZÉKLET

KONJUGÁLT ÉS NEM ELSÖDLEGES ÉS IVII"'\~VUL.I~

2-131. ábra. Az epesavak enterohepatikus körforgása

~~YAGCSERE

2-132. ábra. Az epe három fő alkotórészének ábrázolása

:"koleszterinkristályok és micellák

100

80 60 40 20 o +-- - - - - epesavas sók% -----~

Koleszterinkövek keletkezésére akkor kerül sor, amikor- ismeretlen okból- az epébe kiválasztott koleszterin relatív mennyisége megnő, s a foszfolipidek és az epesavak nem tudják a koleszterint oldatban tartani. Az epekőbeteg­ ség, a cboleütbiasis, korunk egyik leggyakoribb betegsége, s az esetek 80%-ában a köveket elsősorban a kivált koleszterin alko~a.

A lipidek szállítása. Lipoproteinek A lipidek a plazma vizes közegében nem oldódnak, ezért szállításuk a különböző szervek közölt bonyolultabb feladat, mint a glukózé, am i vizoldékony molekula lévén oldott állapotban van a keringésben. Miért és hogyan történik a zsírok szállítása? A szervezet részben a táplálékkal jut lipidekhez, részben a bioszintézis biztosítja megfelelő mennyiségű zsír jelenlétét. A táplálékkal elfogyasztott lipideknek a vékonybélből el kell jutni azokhoz a szervekhez, amelyek zsirok oxidálásá-

val tudnak energiát termelni, illetve a rnájhoz, ami az anyagcsere központi szerve. Mint ilyen, a máj szintetizál is zsírokat a többi szerv táplálása céljából, amit el kell szállítani a felhasználás helyére azokkal a zsírokkal együtt, amelyek a táplálékból kerülnek a májba. Egy hannactik "központ" a zsírszövet, ahol a raktározás történik, s ahonnan a szükségletnek megfelelően mobilizálódnak a zsírok és szállítódnak a megfele lő szervekhez (2- 133. ábra). A lipidek szállítása azért is érdemel külön figyelmet, mert az arterioscrelosis és a coronariabetegségek kialakulásában a lipidszállítási rendellenességek meghatározó jelentőségűek , és ezért ún. rizikó faktornak tekinthetők . Lipidszállítási rendellenessé gek gyakran fellépnek olyan általános anyagcsere-betegségben is, mint pl. a diabetes vagy az elhízás. A prebtémát leginkább a zsírsavak, a trigliceridek és a koleszterin illetve a koleszterin-észterek szállítása jelenti, mert ezek a leginkább hidrofób rnolekulák. A l egegyszerűbb mechanizmus a zsírsavak szállttására alakult ki, amelyek a plazmában albuminhoz kötődnek és ezáltal oldatban maradnak (lásd később). Bonyolultabb a trigliceridek, a koleszterin és a koleszterin-észterek szállítása.

LIPID EKANYAGC ERÉJ E

)) >>>• \)>>n h))))))~> >>> \) >> >>>> ,.,)))))\)) >>>»> )) >>>>n ,, >>>>>>H>>>>,,))11>H.H>>>n h Hu));,>>))~,>> h ,n >H>>;)))),,>>>>>>i\ >H>>' l))),,)) l) n n

181

2-133. ábra. A lipidek szállitásának vázlata

VLDL

tnghcerid

EGYÉB SZERVEK

---- ---- - - -. - -- __ ". VLDL~ LDL

koleszterin

HDL

koleszterin

Ezeket komplex struktúrák, az ún. lipoproteinek szállítják. A lipoproteinek általános jellemzőj e, hogy bennük a hidrofób lipidek egy hidrofil hurokba csomagolva és ezáltal a plazma vizes közegétől elválasztva találhatók (2- 134. ábra). A burok részben fehérjékből áll, amelyeket apoproteineknek nevezünk, továbbá foszfo lipidekből, amelyek poláros

csoportjaikkal a vizes közeg, apoláros csoportj aikkal pedig a lipoprotein belseje felé irányulnak. Ebben a burokban tud helyet foglalni a koleszterin, 3-0H-csoportjával a foszfolipidek poláros feje felé fordulva. A lipoprotei nek belsejében helyezkednek el az apo láros lipidek, a trigliceridek és a koleszterin-észterek, amelyekkel kölcsönhatásba lépnek a burokban elhelyezkedő foszfo lipidek

2-134. ábra. A lipoproteinek felépítése

triglicerid

CH2 --o-co~ l l

c-

CH - O -

apaprotein

CO /WINIM J

t

CH2 - O - CO/WINIM

koleszterin-észter koleszterin

ANYAGC ERE

12-6.táblázat. A lipoproteinek néhány t~don~ Lipoprotein

Denzitás

___ l

_..,.

__._.

kilomikron very low density lipoprotein (VLDL) intermediate density lipoprotein (lDL)

(~o)

1

1 7-10

1 15-20

high density lipoprotein l (HDL)

20-25

Legfontosab b lipid

Lipidtartalom ( 0/o)

i

l 98-99

1- 2

>------

low density lipoprotein (LDL)

l

Fehérjetartalom

_

90-93 80-85

koleszterin-észter

50- 55

fosztolipid koleszterin-é szter

...

apoláros csoportjai. Ez a szerkezeti adottság minden lipoproteinre jellemző , ffiggetlenü l attól, hogy mely szervben keletkezett és milyen lipid szállítására pecializálódott. A különböző lipoproteinekben azonban e l térő a lipid- és a fehérjetarta lom, és ennek következtében a denzitásuk is különböző (minél magasabb a fehérjetartalom, annál nagyobb a denzitás). A lipoprotein ek ultracentrifugálással és elektroforézissel választhaté k el egymástól. A denzitás alapján történt meg a lipoprotein ek megkülönböztetése, amely szerint az alábbi lipoproteinek ismertek: ki lomikron, VLDL (very low density lipoprotein), IDL (intermedia te density lipoprotein), LDL (low density lipoprotein), és HDL (high density lipoprotein). A legfontosabb lipoproteineket és főbb tulajdonság ait a 2-6. táblázat mutatja. Az apcprotein ek szerepe a lipoproteinek működésében összetett. Egyrészt a lipoproteinek szerkezetén ek alkotásában veszik ki részüket, vagyis a lipidek oldatban tartását szolgálják. Számos apcprotcin emellett mintegy "megjelöli" a lipoprotein eket, ezt a jelölést a máj és az egyéb sejteken található receptorok felismerik, a lipoproteineket felveszik és ezáltal a keringésből eltávolítják. Végezetül az apcprotein ek egy része a lipoproteinek metabolizm usában meghatároz ó enzimek, fehérjék működését aktiválja vagy gátolja. Az apcprotein ek eddig megismert, legfontosab b funkcióit a 2-7. táblázat fog lalja össze.

C-l, C-11, C-lll, E---l

75-80

~ -l- ~ __ 40-55

_J 8-1~

triglicerid koleszterin-észter

-·j -

Legfontosab b apoprotein

B 48, C-11, C-111, E

triglicerid triglicerid

1-

r

B-100, E

~

B-100

l A-1, A-11, C-1, C-11, C-lll, E

r 2-7. táblázat. Az apaproteinek néhány fontos

~ funkciój~ Apoprotein

~l B-100 C-ll

l

Funkció

Taktiválja a LCAT enzimet kötödik az LDL-receptorhoz

l aktiválja a lipoprotein-lipázt

C-lll

gátolja a VLDL felvételét a májban

E

el ősegíti a kilomikron remnant felvételét a májban

A triglicerid ek szállítása. Kilomikro n, VLDL A táplálékkal elfogyaszto tt és fel szívódott zsírokat a kiJomikron szállítja el a bélbő l. A kilomikron a Jegnagyobb méretű és százalékos összetételé ben a legnagyobb lipidtartalmú (a száraztöme g 9899%-a), ezért a legkisebb dcnz itású lipoprotein . A kiJomikron ban található lipidek legnagyobb része triglicerid. A kiJomikron a bélhámsejt ekben keletkezik a bé l l umenbő l abszorbeálódott és a sejtekben reszintetizálódott tri gli ceridekből és koleszterin ből (lásd zsírok emésztése és fel szívódása) . Ezek a fo zfolipidekkel együtt a sima fe l színű endoplaz-

LIPIDEK A YAGC ERÉJl

183

más retikulumban micellákat alkotnak, majd kiegészülnek azokkal az apoproteinekkel, amelyek szintén a bélhámsejtekben szintetizálódnak (apo B-48, A-1, A-lY) és létrejön az ún. naszcens kitomikron (2-135. ábra). A koleszterin-észterek még a kilomikronba történő beépülés e lőtt kialakulnak a koleszterinbőL A naszcens kitomikron -

ami tehát a táplálékból származó, de a bélhámsejtekben közben lebomlott és újraszintetizálódott triglicerideket és a koleszterint tartalmazza - a sejteket a nyirok kapillárisok felé hagyja e l é a nyirokereken, majd a ductu thoracicuson kere ztül jut a véráramba. Itt további apaproteinekkel kiegészülve érett kilornikronná alakul. A zsír zövetben,

triglicerid koleszterin koleszterin-észter fosztolipid apaprotein 8-48, A-1, A-IV

!

NYIROK

TRIGLICERID KOLESZTERIN

endocitózis

Apo E-receptor

PLAZMA

KILOI l f ~ MARADVÁt--,

zsírsav ZSIRSZÖVET ÉS EGYÉB SZERVEK

zsírsav

2-135. ábra. A kitomikron metabolizmusa. Koleszterin- és trigliceridszállítás a

bélből

184

'''"'"'''"''''''H'»»»m>mm>m>m>H»»»»»>>>»»>>m»m»»~>»~>>>>>m>>>>m»»>»>>»»m•>>>>>»>»»»>>>>>>>»>>>>>m

a szívben, a harántcsíkolt izomban é a laktáló ernlőben a kapillárisok tartalmaznak egy extracelluláris enzimet, a Lipoprotein-Lipázt, amely a kiJomikron (és VLDL - lásd később) által szá llított triglicerideket zsírsavra és glicerime bontja. A lipoprotei n-lipáz a sejtfelszíni glukózami ng likánokhoz kötődik és onnan heparinnal szabadítható fel. Az enzim kofaktora a C-TI apoprotein, amely aktiváló batású. A glicerin a keringéssei a májba kerül, a zsírsavakat pedig a szervek fe lveszik. Az izomban a zsírsavak eloxidálódnak és az izommű­ ködés energiaszükségletét biztosítják, a zsírszövetben pedig trigliceriddé szintetizálódva raktározódnak. A kilomikron, ami ily módon trigliceridtartalmánakjelentős részét elveszítette, kisebb méretű és nagyobb denzitású részecskévé alakul. Ezt az ún. kiJomikron maradványt az apo E-nek köszönhetően a májsejtek felismerik és endocitózissal felveszik a keringésbőL Az anyagcsere állapotától függően a trigliceridek itt lebomlanak és energiát szolgáltatnak vagy ketontestekké alakulhatnak. Ha a táplálék nagy mennyiségben, feleslegbcn tartalmaz zsírsavakat, akkor a májban azonnal újra szintetizálódik a triglicerid, és VLDL formájában a zsírszövethez szállítódik. A ki lomikronak metabolizmusát a 2- 135. ábra foglalja össze. A lipideket a májból a very low density lipoprotein, a VLDL szállítja el, amely kb. l O% fehérjét és 90% lipidet tartalmaz. A VLDL zsírtartalma fóleg trigliceridekből áll, amelyhez a zsírsavak több forrásból származnak. A trigliceridek szintéziséhez felhasználódhatnak a táplálékból származó, a kiJomikron maradvánnyal a májba kerülő zsírsavak, illetve azok, amelyeket a keringő szabad zsírsavakból a májsejtek felvesznek, továbbá a májban de novo szintézissel keletkező zsírsavak, amelyek legfőbb forrása a táplálékkal feleslegben elfogyasztott szénhidrátokból keletkező acetilCoA. A VLDL szállítja el a májból a koleszterint is, amely szintén részben a táplálékból származik, másrészt a májban de novo szintetizálódik, továbbá a plazmából felvett lipoproteinekkel kerül a májba. A VLDL-ben a koleszterin/triglicerid arány általában l :4, ami azonban koleszterindús étkezést követően akár l : l is lehet. Jellegzetes fehérje a VLDL-ben a B-1 00 apoprotein, ami a VLDL-ből keletkező LDL (low density lipoprotein) felismerését teszi lehetövé. A VLDL a keringéssei transzportálódik a szervekhez, elsősorban a

• >»> m>»»•>m••m

A NYA G C E RE

zsírszövethez, ahol a már említett lipoprotein-lipáz - amit az apo C-Il aktivál - a triglicerideket hasítja. A keletkező zsírsavakat a sejtek felveszik, oxidálják vagy újraszintetizálják a triglicerideket és intracelluláris lipidcseppek fonnájában raktározzák. A VLDL-ből a plazmában ily módon kialakuló lDL (intermediate dcnsity lipoprotein) koleszterint és kevés maradék trigliceridet tartalmaz, relatív fehérjetartalma nagyobb, zsírtartalma kisebb, mint a VLDL-é (2-136. ábra). A lipid- és az apaproteintartalom mind a kilomikronban, mind a VLDL-ben lényegesen és folyamatosan változik a keringésben. A VLDL koleszterint vesz fel közvetlenül a vörösvértestekből és a HDL-ből , illetve triglicerideket ad le a HDL-nek (lásd később). Az apcproteinek is cserélődnek a különböző lipoproteinek között, az apo A-1, A-IV a kiJomikronról a HDL-re, az apo C-ll, C-lll pedig a HDL-ről a ki lomikronra és VLDL-re kerül. Az apcprotein transzfer reakciók gyorsak és végbernennek az alatt a viszonylag rövid idő alatt, amit pl. a kitomikron a keringésben tölt. A kilomikronok a plazmába történő belépést követő­ en 5- l O percen belül eltűnnek a keringésből , a VLDL esetében ez több órát vesz igénybe. A VLDL-bő l a keringésben kialakuló IDL-t a májsejtek a felszínükön található apo E receptorokkal felismerik és endocitózissal felveszik. A keringésben maradó lD L-ből további átalakulással LDLjön létre (2-136. ábra). Ennek során az apo E, a lipoproteinek közötti fehérje transzport révén a HDL-re kerül, a maradék triglicerid pedig elbomlik. A trigliceridek hidrolízise a májsejtek felszínén, a hepatikus lipáz (máj-lipáz) hatására megy végbe, amely a lipoprotein lipázhoz sok szempontból hasonló enzim. A triglicerideken kívül a felszíni foszfogliceridek hidrolízisét is katalizálja. Nemcsak az lDL-ben, hanem a HDL2-ben levő trigliceridek is szubsztrátjai, ezért szerepet játszik a HDL2 HDL3 -má történő átalakításában (lásd később) .

A koleszterin szállítása. LDL, HDL A keringésben lévő VLDL mintegy fele fokozatos átalakulás után, melynek során trigliceridtartalmát elveszti és az apcproteinek nagy részét a lillL-nek átadja, LDL-lé alakul. Az LDL-ben a

•

LI PID EK AN ACCSE RÉJ E

)))))J))J)))>H)>H>))>)))>>t>))>>>>))))))))))>>>H>>>nn>>>>>>>)>)>)>))))>>>>>>>>>U>n>»J))))J))))>>>)J>>>1o>))>>>>>>J))>>>))>>>>>>>>>>)>>>»>)>)>)

185

Apo B-100recepfor

triglicerid koleszterin fosztolipid apoproteln B-100

zsírsav

ZSIRSZÖVET ÉS EGYÉB SZERVEK

2-136. ábra. Triglicerid- és koleszterinszállítás a májbóL VLDL. /OL, LDL; TG: triglicerid; KE: koleszterin-észter

meghatározó lipid a koleszterin-észter, a fe hérjék közül pedig a B- l 00 apoprotein. A szervezet legtöbb sejtje rendelkezik olyan receptorral, amely a B- l 00 fehérje felismerésére képes, azonban mégis kevés szervnek van meghatározó szerepe az LDL metabolizrnusában. A re-

ceptor csak a B- 100 apoprotei nt köti , annak ellenére, hogy a B-48 és B-100 fehérjékben szám os közös epitop van. Az LDL-nek mintegy kétharmada ezen nagy affinitású receptor közrcműködéséve l hagyja el a keringést. Az LDL kisebb része más mechanizmussal, lassabban kerül felvételre a sej-

A:"'YAGCSERE

tekbe, amelynek azonban megnő a jelentősége olyan egyénekben, akikben a specifikus receptor hiányzik (lásd később). Az LDL metabolizmus ában kvantitatíve a máj játssza a legfontosabb szerepet, mivel itt történik az LDL-lebomlá s legalább fele. Fontos még a bélrendszer, illetve a me! lékvese és a gonádok részvétele az LDL keringésből történő eltávolításában. Az LDL-receptor ok kettős funkciót látnak el: meghatározzá k az LDL keringésből történő eliminációját és lehetövé teszik a koleszterin sejtekbe jutta tását. Az LDL-receptor az apo B- LOO-at ismeri fel és köti meg, ami után az LDL-receptor- LDL komplex endocitetikus vezikulákban intemalizálódik. A sejten belül az LDL disszociál a receptorról, a receptor visszavándorol a sejtfelszínre, az LDL-t tartalmazó endocitotiku veziku lák pedig lizoszomákkal fúzioná lnak, sa lizoszomális enzimek hatására az LDL fehérjekompo nense lebom-

lik (2-137. ábra). A koleszterin-észterázok hatására felszabaduló koleszterin komplex módon szabályazza a sejtek koleszterinmetabolizmusát. Egyrészt gátolja az LDL-receptorok szintézisét, s ezáltal gátolja feleslegesen nagy mennyiségü koleszterin felvételét a plazmából. Másrészt a sejten belül gátolja a koleszterin de novo szintézisét a 3-hidroxi-3-m etil-glutaril-C oA-reduktáz szabályozásán keresztül. A HMG-CoA-re duktáz, ami az endoplazmás retikulumban található enzim, koleszterin jelenlétében l 0-szer gyorsabban bomlik le, mint a többi enzim az endoplazmás retikulumban. Ezen túlmenően a koleszterin gátolja az enzim transzkripcióját is. Végeredmény ben tehát a koleszterin mind a sejtek koleszterinfelvételét, mind pedig a szintézisét gátolja, s ezáltal megakadályozza kontrollálatlanul nagy mennyiségű koleszterin felha lmozódását a sejtekben. Koleszterime minden sejtnek szüksége van a membránok felépítésé-

LDL

endocitózis

lizoszómák

l l SZINTÉZISEK ACAT koleszterinész terek

sejtmembrán szteroidhormon ok epesavak

2-137. ábra. LDL-receptorok felvétele a sejtekbe. A koleszterinszin t szabályozása

LIPIDEK ANYAGCSERÉJE

hez. A mellékvesekéregben és a gonádokban a szteroidhormonok szintéziséhez is felhasználódik koleszterin, a májban pedig epesavak szintetizálódnak belőle. A felesleges koleszterint a sejtekben az acii-CoA:koleszterin-aciltranszferáz (ACAT) észteresíti, ami az LDL-felvétel következtében aktiválódik, sa koleszterin-észterek a citoplazmában raktározódnak.

Az LDL-receptorok számának vagy funkciójának elégtelensége súlyos zavarokat okoz a koleszterin-anyagcserében. Az ún. familiaris hypercholesterinaemiák mutációk következtében jőnnek létre, amelyek leggyakrabban a receptorok szintézisének hiányát okozzák. Sérülbet mutációk következtében a receptorok poszttranszlációs módosítása, vagy szerkezeti módosulás jöhet létre a ligandkötő doménben. A familiaris hypercholesterinaemia heterozigóta formájában, amelyben egy LDL-receptor gén hibás (szemben a homozigótával, ahol kettő), a receptorok száma a normálisnak a fele ' sennek megfelelően csökken az LDL keringésből történő eliminációja. A homozigóta formában gyakorlatilag nincs LDL-receptor-színtézis. A familiaris hypercholesterinaemia heterozigóta formájában hatékony terápiás lehető­ ség a HMG-CoA-reduktáz gátlók (Lovastatin) alkalmazása. Ezek a de novo koleszterinszintézis gátlásával csökkentik a sejtek koleszterinLartalrnát, amely következményes LDL-receptorszám-emelkedéssel és a plazmából történő fokozott LDL-felvétellel jár. Jó hatásúak lehetnek olyan epesavkötő gyanták is, amelyek a bélben megakadályozzák az epesavak felszívódását, vagyis az enterohepatikus körforgást. A májsejtekben ilyen körülmények között a koleszterinből fokozott epesavszintézis történik . ' amt a LDL-receptorok számát nagymértékben fokozza, és ennek következtében csökken a plazma LDL-szintje. A familiaris hypercholesterinaemia homozigóta formájában a gyógyszeres terápiának nincs hatása, egyedüli leh~tőségként a korai életkorban elvégzett máJtranszplantáció jöhetne szóba.

187

A koleszterinhomeostasis fenntartásában fontos szerepetjátszik ahigh-density lipoprotein (HDL), amely az ún. reverz koleszterintranszporttal koleszterint szállít a májba az extrabepatikus sejtekből és az artériák falából. A májban a koleszterin ep~savakká alakul, kiválasztódik az epébe, és ily modon a szervezetbő l kiürülhet vagy beépül VLDL-be. Ezért nevezik a HDL-ben szállított koleszterint ,Jó" koleszterinnek, szemben az LDL "rossz" koleszterinneL A naszcens HDL legnagyobb része a májból és a bélből szekretálódik. Korongszerü képződmény, amel~ főleg foszfolipideket, koleszterint és apaprotemeket tartalmaz. A naszcens HDL-ben a meghatározó fehérje az apo E. Érett, gömb alakú képződménnyé válásában két tényező játszik szerepet Az egyik a lecitin:koleszterin-acil-transzferáz (LCAT), amely a koleszterin-észtereket hozza létre, s ezek mint neutrális lipidek a HDL apoláros, belső részébe mozogva a bilayert szétfeszí.tik, amíg a gömb forma létre nem jön. A másik tényező azapoE helyettapo A-l beépülése a struktúráb~,. ami az érett HDL legjellegzetesebb apoprotemJe. A HDL nem egy statikus struktúra, összetétele a keringésben folyamatosan változik. Ennek során koleszterint vesz fel más lipoproteinektől és a sejtek membránjából, amit az LCA T koleszterin-észterré alakít (biztositva ezáltal a koleszterindiffúzió irányát), foszfolipidek és triglicerid épülnek be, koleszterin-észtereket ad le, illetve apaproteineket ad le vagy vesz fel más lipoproteinektőL A lipidek felvétele a HDL-be részben egy lassú spontán folyamat, részben az ún. lipid transzfer fehérjék közreműködésével megy végbe. A HDL foszfatidilkolin komponense egyszersmind az LCAT enzim egyik szubsztrátja, és más foszfo lipidekkel együtt szubsztrátja a máj-lipáznak is. Az apcproteinek is cserélődnek a lipoproteinek között. Az érett HDL-ben az apo A-I egy része apo A-II-re cserélődhet, az apo C számára pedig a HDL egy olyan "raktár", ahonnan a trigliceridtartalmú naszcens lipoproteinekre transzferálódhat. A HDL-nek szubpopulációi léteznek, amelyek főleg a lipidösszetételben különböznek. A HDL, trigliceridekben gazdagabb és nagyobb méretü. ' mmt a HDL3. A trigliceridek a VLDL-ről kerülnek a HDL-re, amelyek viszont koleszterin-észtereket vesznek fel a HDL-ről. Kilinikailag is megfigyel-

18!!

»»»»>>mm>»mm»»»> >>•>m>m >>>>>~>»M>M»)) > "''' >m• »>>H»>>>>>»> m,

»>'" >>»>»>>> >~»»»mm• "' »mm

»>»»>>>m»m>

A '1\'AGC ERE

PLAZMA

c

~

lipid transzfer protein

w

o

::::; C)

02 .....

2-138. ábra. HDL-metabolizmus

hető,

hogy posztprandiálisan (táplálkozás után) megnő a HDL trigliceridtartalma. A HDL-trigliceridek a máj-lipáz zubsztrátjai, a belőlük keletkező zsírsavakat a májsejtek ve zik fel. A HDL:! a máj-lipáz hatására alakul át HDL3-má. A HDL-ből a koleszterin-észtereket is a máj veszi fel, ahol a koleszterin a már megbeszélt utakon alakulhat tovább. A HDL-metabolizmu ö zefoglalá a a 2-138. ábrán látható. Epidemiológiai viz gálatokban egyértelmű negatív összefüggést találtak a plazma HDL-, ezen belül is a HDL 2-koleszterin-szint és az arteriosclerosis kialakulása között. A HDL védő hatásának nem teljesen tisztázott a mechanizmusa. Lehetséges, hogy egyszerűen a reverz koleszterintranszport normális funkciójáról van zó, amely megszabadítja a sejteket é az artériák falát a fele -

leges koleszterintőL Nem kizárt azonban az em, hogy a HDL - ma még nem i mert módon - közvetlenül befolyásolja az atherogene i folyamatát.

Olyan kórképekben, amelyek a lipidek transzportjának zavara következtében jönnek létre, extrém magas plazma-triglicerid- és/vagy -koleszterinszint figyelhető meg. Ritka, de súlyos állapot a lipoprotein-lipáz müködésének elégtelensége vagy hiánya, amelyben lehetetlenné válik a kitomikron keringésböJ történő eliminációja. Az állapoton, amelyben zsírdepozitok jelennek meg a bőrben és pancreatitis alakul ki, zsírszegény d iétával javítani lehet.

LIPIDEK A." 'YAGCSKRÉJE

)) n)))))))) H H)))))))) H))))))))))))))))))))))).))))))))))))) ))))))))))))))\)))))))))))>))))))) l))))))))))))))))))-'))))))}))))))))))))))))))))))))) H

189

2-8. táblázat. A hyperllpidaemiák felosztása Általános elnevezés (az érintett lipoprotein) exogén hyperlipaemia (kilomikron)

Elsődleges károsodás

Típus

l.

familiáris lipoprotein-lipáz elégtelenség C-ll apclipoprotein elégtelenség

endogén hyperlipaemia (VLDL)

IV.

familiáris hypertrigliceridaemia (enyhe} familiáris többszörös lipoprotein típusú hyperlipidaemia sporadikus hypertrigliceridaemia T angier-betegség

vegyes hyperlipaemia (VLDL+ kilomikron)

V.

familiáris hypertrigliceridaemia (súlyos) familiaris lipoprotein-lipáz elégtelenség C-ll apclipoprotein elégtelenség

hypercholesterinaemia (LDL)

lia

familiáris hypercholesterinaemia (LDL-receptor-elégtelenség) familiáris többszörös lipoprotein típusú hyperlipidaemia különbözö eredetű hypercholesterinaemia

összetett hyperlipidaemia (LDL + VLDL)

ll b

familiáris többszörös lipoprotein típusú hyperlipidaemia ismeretlen eredetű

egyéb hyperlipidaemia (p-VLDL)

lll.

familiáris dysbetalipoproteinaemia ismeretlen eredetű

lamelláris hyperlipoproteinaemia (vezikuláris és diszkeid lipoproteinek)

familiáris lecitin: koleszterin-aciltranszferáz elégtelenség

Még súlyosabb a kép az abetalipoproteinaemiában, melyben az apaprotein B szintézise sérült. A plazmában a kilomikron, a VLDL és LDL egyaránt hiányzik, ami nagyon súlyos lipidfelszívódási és anyagcserezavarokat okoz. A hyperlipidaemiával járó egyes kórképek felosztását a 2-8. összefoglaló táblázat mutatja.

Szabad zsírsavak A keringésben a zsírsavak több mint 95%-a trigliceridekben, foszfolipidekben és koleszterin-észterekben található, amelyeket a fent összefoglalt lipoproteinek szállítanak. A keringő zsírsavaknak néhány százaléka nem észteresített formában és nem lipoproteinekben található, ezek az ún. szabad zsírsavak (FFA; free fatty acids) amelyek albuminhoz kötve szállítódnak Bár mennyiségileg ez nem tűnik jelentősnek, a metabolizmusban a szabad zsírsavak nagyon fontos szerepet játszanak. A zsírszövetben raktározott trigliceridekből mobi]jzált zsírsavak a keringésben

szabad zsírsavkéntjelennek meg. Kis részben hozzájárul a plazma szabadzsírsav-tartalmához a lipoprotein-lipáz által a lipoproteinekből felszabadított zsírsav is, ennek nagy része azonban, mint láttuk korábban, közvetlenül a szervekbe kerül. A keringésben a zsírsavaknak egy kis hányada ténylegesen szabadon, albuminhoz nem kötve van jelen, ami egyensúlyban van az erős albuminkötésben található zsírsavval (zsírsav/albumin ~ zsírsav + albumin). A szervek a nem kötött zsírsavat veszik fel, ami azonnal pótlódik a zsírsav/albumin kötésből disszociáló zsírsavval, s ez újra a szervek rendelkezésére ál l. A keringő szabad zsírsavak így nagyon gyorsan a szervekbe kerülnek. A szabad zsírsavak mennyisége a keringésben a metabolizrnus állapotától függ: éhezésben és erőteljes izommunka során megnő, étkezés után, amikor elegendő glukóz áll rendelkezésre az energiaigény fedezésére, csökken a szabadzsírsav-tartalom. Éhezésben a szervek számára az energia nagy részét a szabad zsírsavak lebomlása biztosítja. A szabad zsírsavak a szöve6 lipidek szintézisére is felhasználhatók. A májba felvett szabad zsírsavak a ketontestek szintézisével az agy számára is fontos energiaforrást jelentenek, de közvetlen ül, zsír-

ZSÍRSZÖVET

/

\l

triglicerid

AcCoA

PLAZMA OXIDAC IÓ '-

hormo~s;Zenzitív ll pa z

SZABA'D ZSfRSAV (FFA) t 4----=----- l= zsfrsav zsirsav~albumin

'-"""""""""'"....,.....................,...........",.....,

SZERVEK szfvizom harántesikolt izom vese

2-139. ábra. Szabadz sírsav-fo rgalom az egyes szervek között

savként az agyban nem hasznosíthatók. A plazma szabadz sírsav-mataboliz musának legfontosabb tényezőit a 2-139. ábra foglalja össze.

A zsírok emész tése és felszívódása Egy felnőtt ember napi átlagos zsírfogyasztása 50- 150 g, amelyne k 90%-át trigliceridek, a többit koleszterin, koleszterin-észterek, foszfolip idek és zsírsavak alkotják . A zsírok enzimat ikus bontá a kismértékben bár, de megkezdődik a szájüreg ben anyelv mirigyei által termelt lipáz hatására, amely aktív marad agyomorban is a savas közeg ellenére. A hidrolízis lassú, mivel a zsírok vízben nem oldódó molekul ák lévén, e lkül önülő fázisban , lipidcse ppekben van-

nak jelen, sa vize közeg felé, aho nnan az enzimek a zsírokho z hozzáfé rnek, kis felülettel rendelkeznek. Ezt a problémát az epesava k oldják meg, amelyek a májban szintetiz álódnak , az epehólyagban raktározódnak és az epével a duodenumba választódnak ki. Az epesava k detergen s hatásúak , kölcsönhatásba lépnek a cseppek be tömörült lipidekkel és a vékonybél vizes közegével egyaránt, s ennek következtében a lipideke t emulgeálják. A lipidcseppek emulgeá lásához hozzájárul a perisztaltika is, a béltartalom mechanikus keveréséveL A lipidek tényleges emésztése a vékonyb élben történik, s az enzimek a pancreasból hormonhatásra ürülnek a duodenu mba. A jejunum ban és a duodenu mban a béltartalommal megjelenő zsirok és fehérjék hatására kolecisztokinin szekretálódik, amely a keringés el transzportálódik és az epehó-

LIPIDE K A~Y GCSERÉJE

191

l

l

f

R

- coo

r<3

coo

+ UJPÁZ

triglicerid

2-monoglicerid

zsírsavak

2·140. ábra. A trigliceridek hidrolízise lipáz hatására

lyag kontrakcióját, va lamint a pancreas-enzimek kiválasztását okozza. A másik hormon a szekretin, amelynek hatására a pancreasból bikarbonátban gazdag nedv ürül.

A tri g!iceridek emésztését a hasn yálmirigylipáz végzi. Az enzim a glicerin l. és 3. szénatomján lévő észterkötéseket hidrolizálja, így zsírsav és 2-monoacil-glicerin (2-monoglicerid) keletkezik (2- 140. ábra). A lipáz működését egy másik en-

2·141 . ábra. A foszfatidil-kolin lebomlása a vékonybélben

~o

O HC 2 - 0 - C- R li 1 l R2 - C - O-CH o

~

l

~

H C-O- P - O-CH - CH- N (CH3 )3 2 " 2

o-

2

foszfatidilkolin

FOSZFOLIPÁZ A2

~o H C-0- C

R

21

HO-CH

l

O

+

~

H2C- O- P -O-CH -CH "

o

2

R

COO

+

N [CH3)a

2

lizofoszfatidilkolin

zsírsav

LIZOFOSZFOLIPÁZ

H2C-OH

l

HO - CH

l

O

~

+

+

HC- 0 -P -0-CH -CH -N (CH3b 2

"

o-

2

2

g l ice rotoszfari lkol in

zsírsav

..

NYAGCSERE

zim, a kolipáz segíti, amely kis mo lekulatömegű, szintén a pancreasban keletkező fehérj e és az a fun kciój a, hogy a lipázt a lipid és a vizes fázis felszínén rögzítse. A lipáz me11ett kevésbé specifikus észterázok is ürülnek a pancreasból, amelyek egyéb lipidek mellett a koleszterin-észtere ket hidro lizálják ko leszterime és zsÍJ·savakra. A pancreasnedvvel nagy mennyiségü foszfo lipáz A 2 proenz im is a vékonybéibe kerül, ahol tripszin hatására aktiválódik. A foszfolipáz A 2 a foszfo lipidek 2. szénatomjáról távolítja el a zsírsavat, a ke letkező l izo foszfolipidről további észteráz hatásra a másik zsírsav is hidrolizáL A ke letkező glicerofoszfokolin a széklettel távozik vagy további hidrolízis után fe lszívódik. A

foszfatidilkolin-lebomlás lépéseit a 2-141. ábra mutatja. A lipidek hidrolízisének eredménye tehát a j ej unumban 2-rnonoglicerid, zsírsavak és koleszterin keletkezése. Ezek az epesavakkal micellákat alkotnak, amelyekben a lipidek hidrofób csoportjai a micella bel ső, a hidrofil csoportok pedig a felszín felé orien tálódnak, így az egyébként vízben roszszul oldódó lipidek a bél vizes közegében oldott állapotban vannak. A lipideket a micellák viszik a béllumenben a mucosasejtekhez, ahol a lipidkomponen ek a sejtmembránon áthaladva a sejtekbe abszorbeá lódnak. A sejtekben a 2-monogliceridből a trigliceridek új raszintetizálódnak. Az abszorbeált zsírsavak aktiválódnak, és az aciltranszferázok

EPEbfóL'11AG

BÉLHÁMSEJT

s

1

l

~~~~;~,;~ic:d}cT '-:.-t--+ zsírsav ---+ acii-CoA triglicerid

~oleszterin--~ __.. zsírsavak

l eszterek

koleszterin

apoproteinek VÉKONYBÉLLUMEN

_j nyirok

2·142. ábra. A trigliceridek emésztése és felszívódása

LIPIOI!:K A . \ AGCSERÉJE

észteresitik a g licerin l. és 3. szénatomját. Megtörténik a koleszterin-észterek és a foszfolipidek szintézise is. A bélhámsejtekben a foszfolipidekböl, a trigliceridekből , a koleszterin-észterek- ből és a sejtekben szintetizálódó B-48 nevű fehérjéből létrejön a naszcens kilomikron, az a lipoprotein, amely a bélhámsejteket a nyirokutakon hagyja el és feladata a táplálékkal elfogyasztott lipidek e lszállítá a a májba és egyéb szervekbe. Eza lól kivétel a 12-nél kisebb szénatomszámú zsírsavak felszívódása, amelyek a ejteken keresztül közvetlenül a vérpályába szívódnak fel. A lipidek felszívádá ának vázlata a 2-142. ábrán látható. Fiziológiás körülmények között a lipidek emésztése és felszívódása teljes, a székletben gyakorlatilag nincs zsír. Steatorrhoea az az állapot, amikor nagy mennyiségű zsír jelenik meg a székletben, ami azt jelzi, hogy az emésztés és felszívódás folyamatának valamely eleme károsodott. Ez a máj, az epehólyag vagy az epeutak betegsége, a pancreas vagy a bélhámsejtek elváltozása következtében jöhet létre (2-143. ábra).

A foszfolipidek és szfingolipidek felépítése és jelentősége A foszfolipidek és a szfingolipidek a trigliceridektől eltérő tulajdonságú és fiziológiai jelentőségű lipidek. A trigliceridek az energiaraktározásban betöltött szerepük miatt el sősorban metabolikus jelentőségűek. A foszfolipidek és szfingolipidek ezzel szemben struktúr lipidek, amelyek nem kizárólag, de főleg a membránok alkotásában vesznek részt. Legfontosabb tulajdonságuk, hogy szemben az apoláros trigliceridekkel, egy molekulán belül hidrofób és hidrofil részekkel egyaránt rendelkeznek. Ez az amtipatikus sajátság mind a foszfolipideket, mind a szfingolipidcket jellemzi és meghatározza a molekulák legfőbb funkcióját is (2-144. ábra). Bár a foszfolipidek jeJen vannak a plazmában és az epében is, Jegfontosabb funkciójuk mégis az, hogy a membránok alkotásában vesznek részt (lásd a 4. fejezetet). A foszfolipidekben a sztingomielin kivéteJével az alapvegyület a foszfatidsav. A legfontosabb g licerofoszfolipidek szerkezetét a 2-9. táblázat mutatja. Az emberi szervezetben a membránok al-

BÉLLUMEN

EPE~

steatorrhoea

2-143. ábra. A steatorrhoea lehetséges okai

194

U))))))))o))))U))))))))))))))))))))))l)))))))))l)))))))))))))J))))))t))))))))o))))))))))))))))))))))))))))))))H)>>>> )>)>)))))))))))))))))U))))))))))>)>)>)U>)))))))Io)))))))

~ -~~~.. ~·~·~·· ·. "-

,

"

.-

. •' v,"~·~r~"' ~~;~~-·.·:~~- ·-. ... -~·-.

."

,

POLÁROS LIPIDEK

~ .._,._

. .

A!\1\' AG CSERE

2-144. ábra. A membránalkotó lipidek csoportosítása. A koleszterin részt vesz a membránok alkotásában. de a jelen felosztásból kimarad

l l foszfolipidek l

lglicerofoszfolipidek l

lszfingolipidek J

l szfingomielin

J

l glikoszfingolipidek

kotásában legnagyobb mennyiségben a foszfatidilkolin (más néven lecitin), a foszfatidiletanolamin (má néven kefalin) és a foszfatidilszerin vesz részt. Közülük a ftzio lógiás pH mellett a foszfatidi lszerin rendelkezik egy netto negatív töltéssel, amiért is savanyú foszfol ipidnek tekinthető. A másik két faszfalipid ikerionként v iselkedik. A foszfatidilinozitol a sejtmembránban játszik szerepet számos hormon és neurotranszmitter hatásának a közvetítésében. A foszfatidilglicerol, amelyben a foszfatidsavhoz egy glicerin kapcsolódik, v iszonylag nagy mennyiségben vanjelen a mitokondriumok membránjában. M ind a foszfatidilinozitol , mind a foszfatidi lglicerol savanyú foszfolipidek, neutrális pH-n egy netto negatív töltéssel rendelkez nek.

J

A kardiolipin savanyú tulajdonsága még kifejezettebb, mivel a molekula, amelyben két faszfaridsav kapcsolódik ö sze egy glicerinen keresztül, két negatív töltéssel rendelkezik. KardiolipiD főleg a mitokondriumok belső membránjában található. A foszfolipidekben a glicerin l . és 2. szénatomjához nem azonos zsírsavak kapcsolódnak, az l . szénatomon általában 16 vagy 18 szénatomos telített zsírsav, a 2. szénatomon pedig valarnilyen telítetlen zsírsav talá lható. A fel sorolt foszfol ipidekben a glicerin alkoholos OH-csoportjához észterkötéssel kapcsolódnak a zsírsavak. A plazmalogénben az l . szénatomhoz éterkötéssel kapcsolódik a hosszú szénláncú ( 18) enol (2-145. ábra). A mielinmembrán viszon)'lag nagy mennyiségű etanolamin plazmalogént tartalmaz, mig a kolin plazmalogén inkább a szívizom-

2-145. ábra. Etanolamin plazmalogén

#

O H2C

l

-o+ Ohl =

R2 - C -O- C - H

l

#

CH - (OH,)16 - - OH3

o +

H2C - O- Pl - 0-CH2 -CH2 -NH3

o-

>mmnm>> m»»»> m >>nnm>>m»»>»>»>>>>»>>»»>>»>>m)))H»>>>>»> mm>»»>>>»»>>>>>m>»>>>>>mm>»>>»» »>~»> »m»>

LIPIDEK ANYAGCSERÉJE

195

"

2~9. táblázat

A legfontosabb glicer~foszfolipidek felépitése

~o O H2CI - O-C- R1 ~

R2 - C-O- CH

0 ~ HC-0- P - 0 - R

l

l o-

2

3

DIGLICERID-FOSZFORSAV-ALKOHOL FOSZFATIDSAV

képlete

neve

+ -CH -CH-NH

l

2

A fosztolipid neve

szerin

FOSZFATIDILSZERIN

etanolamin

FOSZFATIDILETANOLAMIN

kolin

FOSZFATIDILKOLIN

inozitol

FOSZFATIDILINOZITOL

glicerol

FOSZFATIDILGLICEROL

foszfatidilglicerol

KAROlOLlPlN

3

cool l l

OH

OH

OH

----------------

H

- CH - CH - CH OH 2

----

l

2

_________________ OH

...._

- CH

l

2

HC - OH

O ~ H C - O - P - O-CH

l

2

l

o-

o

~ HC- O - C - R4

l

l

2

~o

H2C- O- C - R5

A~YAGCSERE

2-146. ábra. Trombocitaaktiváló faktor (PAF)

0 H2C- O- CH2- (CH 2), 6 ~ l CH -C-O-CH

o

l

3

~

H C-O-P 2

CH3

l

CH

l 3 t O-CH -CH -N -CH 2 2 l 3

O~

CH3

2-147. ábra. Dipalmitoil-lecitin. Tüdö-" surfactant"

ban található. Foszfolipidnek tekinthető a trombocitaaktiváló faktor (platelet activating factor; PAF). A P AF (2- 146. ábra) a polimarfonukleáris leukocitákban, makrofágokban és monocitákban keletkezik és innen szabadul fel antigénhatásra. A PAF a trombociták aggregác iój át és a trombocitákból szerotoninfelszaba dulást okoz, s szerepe van a gyulladá os és allergiás folyamatok létrejöttében. KülönJeges szerepet tölt be a d ipalmitoil-lecitin (2- 147. ábra), egy o lyan foszfatidilkolin , ame lyben a g licerin l . és 2. szénatomján a OH-csoportot pa lmitinsav észteresíti . A dipalmitoil-lecitin a lkotja azoknak az extracelluláris foszfolipideknek a 80%-át, amelyek a tüdőben az a lveolusokkal közvetlenül érintkező extracelluláris folyadékban találhatók. A dipalmitoil-lec itin ("surfactant") csökkenti a felületi feszültséget az a lveolusok felszínén, s ezálta l megakadályozza, hogy az alveolusok a kilégzés végére teljesen összeessenek. Ez a felületaktív hatás csak a dipalmitoi l-lecitint jellemzi; olyan foszfatidilkolin, amely nem tartalmaz két palmitin avat, nem rendelkezik ezzel a képességgel. A dipalmitoil-lecitin t a II. tlpusú pneumaciták termelik, s mennyisége az intrauterin é let

34. hetére éri e l azt a szintet, ami a tüdő norrná~ lis működéséhez szükséges. Ezenkor e.l őtt a tüdőben fő leg szfmgomielin szintetizálódik. Ha a "surfactant" hatás elégtelen, a tüdő éretlen a funkciója ellátására, és kialakul a respiratory distress syndroma. A fejlett országokban az újszülöttkori elhalálozás 15- 20%-át RDS okozza, ami azonban csak koraszütött csecsemőkbeo alakul ki. Az á llapot nagy biztonsággal előre jelezhető, ba az amnionfolyadékba n meghatározzák a foszfatidilkolin/sz fingornielin arányt és az 2-nél kisebbnek mutatkozik. Szóbajön ekkor a preventív beavatkozás szükségessége (exogén surfactant adás). Az utóbbi években közvetlenül m eghatározzák a dipa lmitoil-foszfatidilk olin, a foszfatidilglicerol, valamint a foszfatidilinozitol mennyiségét.

A foszfatidilkolin szintézise A foszfatidilkolin-sz iotézishez a ejteknek kolima van szüksége. A kolin e l sőso rban a táplálékból származik és a keringés útjánjut el a sejtekhez,

LIPIDEK A. VAGCSERÉJE

>> ~>>>>>>»H>>>>>,..,, >H> nu>>»>)>>>>>>>)>> >H))) n>>>).)»>>>n>>>>Hn>>>> n n>> n))))>H> >H>>>>>u n >H>>> Hh)) n •> >>>> >>>>>H>>>>>>>>> n>>>>>>

mában és az endoplazmás retikulumban egyaránt kimutatható. Az aktív enzim az endoplazmás retikulumban található, a citoplazmában lokalizálódó enzimkészlet raktárként szolgál. A szintézis utolsó lépését katalizáló enzim szintén az endoplazmás retikulum membrá njában helyezkedik e l és CMP felszabadulása közben a diacil-glicerol 3. szénatomján lévő OH-csoporthoz foszfodiészter-köt éssel kapcsolja a kolint és létrejön afoszfatidilkolin (2-148. ábra). Csak a májban alternatív lehetőség is van a foszfatidilkolin keletkezésére, mégpedig foszfatidil-etanolaminból három egymást követő metilálási reakcióban. A metilcsoportokat az S-adeno-

ahol a plazmamembránb an transzportfolyama tok biztosítják a kolin felvételét. Speciális rnembránokban, például a kolinerg neuronok preszinaptikus membránjában, ún. nagy affinitású (KM < l O IJ.M) kolintranszport-fo lyamat működik, ami fontos szerepet játszik az aceti lkolin szintézisében, a legtöbb sejtben azonban a transzport kis affinitású

(K\11 >l O !JM). A sejtekben a kolin foszforilálódik a kolin-kináz hatására (2- 148. ábra), amely a foszfolipidbioszintézi legtöbb enzimjétől e l térően, a citoplazmában foglal helyet A kolin-foszfátot a CTP:foszfoko lin-citidi li1-transzferáz alakítja tovább és CD P-kolin jön létre. Az enzim a ci top laz-

O

CH3

CH3

l CH3 -Nl

+ A T P - - - - • CH

-CH2 -CH2 -OH

CH3

ll

l

-CH - 0 - P - 0_ +ADP

- N~- CH

l

3

l

2

2

O

CH3

KOLIN-KINÁZ

kolin-foszfát

kolin - CTP: FOSZFOKOLINCITIDILIL-TRANSZ FERÁl

l~ CTP PP,

o

o

c~

~ ~ CH -N+-CH -CH - O - P -O-P- citidin

l

l

3

l o·

l

2

2

o~

CH3

COP-kolin

.._

COP-KOLIN: 1,2-DIGLICERIDFOSZFOKOLIN-TR ANSZFERÁl

l

~ 1,2-diacil-glicerol CMP

~o 0 H2C - O- C - R1 l ~ R -C-O-CH

CH

l

()

l

2

~

3

+

H C-O- P - O- CH - CH - N -CH 2

l

2

oFOSZFATIDILKOLIN 2-148. ábra. A foszfatidilkolin szintézise

l 97

2

l

CH3

3

198

)))))))))))) )))))) )))))))))) )) ))))>))) )) )))) )))) )))))))))) )) )))) )) )) )))) U)))))))))))))))>>))))))

)))))>>>>>)

u H))))))>>n>> U

H>>))))))

nU

>H>) > U))})))>>>>H))))))))))))>)

A.'IYAGC ERE

2-149. ábra. A foszfa. tidiletanolam ín- és a foszfatidilko lin-szintézis vázlata

COP-etanolamin

COP-kolin

-----digl icerid - - - - CMP

CMP

'T\

FOSZFATIDILETANOLAMIN

co,l

3 S-ad. metionin

FOSZFATIDILKOLIN

3 S-ad. homocisztein

májban

FOSZFATIDILSZERIN

zilmetionin adja, amelyből S-adenozil homocisztein keletkezik (2-l 49. ábra) a foszfatidile tanolamin-N-me til-transzfe ráz hatására. A foszfatidi lkolin szintéziséb en a sebességm eghatározó enzim a citidilil-tra nszferáz, amelynek regulációja több módon valósul meg. A meghatározó esemény az

enzim transzlokác iója a citoplazmá ból az endoplazmás retikulumb a, ami egyszersmi nd az enzim aktíválását jelenti (2-J 50. ábra). Ez zsírsavak vagy acii-CoA hatására jön létre, amelyek igy a foszfatidilkolin- zintézist serkentik. A zsírsavak azzal is aktiválják a foszfatidilkolin-szintézist, 2-150. ábra. A citidil· transzteráz regulációja

l CITOPLAZM A (inaktív)

ENDOPLAZ MÁS RETIKULUM (aktiv)

transzlokáció

zsírsavak

1

zsíracil-GoA

1

LIPIDEK\~' \ GC ER~:JE

199

hogy a belőJük keletkező acii-CoA a diacil-glicerol-szintézishez is hozzájárul, amire pedig szükség van a foszfatidilkolin-szintézishe z. A májban a zsírsavak tTigliceridszintézi re csak akkor haszná-

lódnak, ha a foszfatidilkolin-szintézis igényei már kielégítődtek.

A májban a citidilil-transzferáz regulációjában zcrcpct játszik a cAMP-függö protcin-kináz is. A

dihidroxi;.aceton:.fosZfat

Y. 7 Lmáj, vese, bél

Aq"P'.

ADP

zsírszövet

H2C-OH

l

O

HO-CH

~

l

H C-O-P - O

l o-

2

glicerin-3-fo-szfát aciltranszferáz l

t:

zsíracil-GoA CoA-SH

~o HC - 0 - C -R

21

HO -CH

~

l

1

O

HC-0- P - 0

l

'2

o 1-lizofoszfatidsav aciltranszferáz ll

t:

zsíracil-GoA CoA-SH

~o

~o

o

HC -0-C - R

21

0 1 ~ HC-0-P-0

j

2

o~

l

~ CDP-diacil- + R2 -C-o-cH glicerol

l

o

HC-0-C-R

21

Hp

l

2

H2C-OH

foszfatidsavfoszfatáz DIGLICERIO

FOSZFATIDSAV

l FOSZFOLIPIDEK l foszfatidilinozitol foszfatidilglicerol kardiolipin

2-151. ábra. A foszfatidsav és a diglicerid szintézise

l

R -C-O-CH

/ [TRIGLICERIDEK

~

l

l FOSZFOLIPIDEK l foszfatidilkolin foszfatidiletanolamin

200

)>1>>>nn>>>>~>>>>>H>>>>>>>>>>>>>)>)))))))J>))))))))>))))>>>H>>>>>)))>>>>>»>>>>>>>>>>>>>>>>>>>»>>HH>>>>>>»>))

)))))n))))))))))))>>))))))>)>>>>n>>H>>>>>>>>>>»>>>>>>

o l -oo·

~ NH -CH - CH -O-P T

3

2

2

foszfoetanolamincitidilil-transzferáz

~o

~o

NH'-CH -CH - 0 - P - 0 -P- citidin 3 2

2

l

o~

l

o·

COP-etanolamin etanolaminfoszfotranszferáz

f:diglicerid CMP

FOSZFATIDILSZERIN

2-152. ábra. A foszfatidiletano lamin szintézise

-"YAGCSERE

protein-kináz hatására az enzim inaktiválódik., mert az endoplazmás retikulum membránjáról disszociál, a protein-foszfa táz hatására pedig aktiválódik. A foszforilációdefo zforiláció való zínűleg nem közvetlenül a citidilil-transz ferázon történik, hanem egy közbülső szabályozó fehérjén, amelyről ma még közelebbi nem ismert. A foszfatidilkol in-szintézis a májban nemcsak a membránok felépítéséhez szükséges, hanem elengedhetetlen a lipidek szállítását végző lipoproteinek felépítéséhez is. Régi megfigyelés, hogy kolinhiányban a májban trigliceridek akkumulálódnak és zsírmáj alakul ki. Ennek oka abban keresendő, hogy a foszfatidilkolinszintézis ilyenkor gátolt, aminek következtében el őtérbe kerül a trigliceridek szintézise, ugyanekkor azonban csökken a lipoproteinek szintézise és így zavart szenved a trigliceridek elszáll ítása. Az eritrocitákat kivéve, csaknem minden sejtben folyik foszfolipid-sz intézis, amelyhez digliceridre van szükség. A digliceridszintézis, amint azt már korábban láttuk, a trig liceridek szintéziséhez is elengedhetetlen. A sejtekben a digliceridszin tézis lépései a glicerin-3-fos zfát keletkezé e után azonosak (2-151. ábra) . A glicerin-3-fos zfát a legtöbb sejtben gl icerinből a glicerinkináz hatására keletkezik, kivételt a z írszövet jelent, ahol a glikolízis intermedierj ébő l, a dihidroxi-ace ton-foszfátbó l redukcióval jön létre. A digliceridszin tézisben a két, nem specifikus aciltranszfcrá z á lta l beépített zsírsav, ami az l. szénatomon általában telített, a 2. szénatomon telítetlen, gyakran nem azono a foszfolipidekb en megtalálható zsírsavvaL Ennek az az oka, hogy a foszfolipidszintézisben utólag kicserél ődhetnek ezek a zsírsavak. Mivel a diglicerid közös intermedier a foszfolipidek és a trigliceridek szintézisében, a foszfatidsav-f oszfatáz enzim regulációja zcrepet játszik mindkét lipidféleség szintézisében . Az enzim aktivitá át növelik a legkülönféléb b stress körülmények, az alkohol fogyasztás és a glukokortikoi dok.

201

LIPID F.. K A1W.\G\. EIÜ:.JE

Egyéb foszfolipidek szintézise

A foszfatidilinozitol szintézisében az eddigieka stratégia, amenny iben CTP-vel nem az inozitol aktivált formája j ön létre, hanem C DP-dig licerid, ame ly a foszfatidsavból és CTPböl keletkezik (2-1 54. ábra). A CDP-diglicerid az inozitolla l reagál és a foszfatidilinozito l-szintáz ha tására kialakul a foszfatidilinozitol. A reakció az endoplazmás retik ulumban játszódik le. A foszfatidilinozitol számos foszforilá lt származéka megtalálható a plazmamembránban, ame lyek közül legnagyobb jelentőségű a foszfa tidilinozito l-4,5biszfoszfát. Hormonok és neurotranszmitterek egy része a sejtekben aktiválj a azt a foszfolipáz C enzimet, am e ly a foszfatidilinozitol-4,5-bisz foszfátbó l diglicerid és inozitol 1,4.5-triszfoszfát keletkezéé t katalizálja, amelyek másodiagos mcssengerként működnek. A foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát a foszfatidilinozitolból az endoplazmás retikulumban keletkezik két egymást követő fosz forilációs lépésben, a foszfatidilinozitol-4k1náz és a foszfatidilinozitol-4-foszfá t-5-kináz hatására (2- 154. ábra). A foszfatidilinozitol-metabo iizmus további részletei, ame lyek fontosak a hormon- és neurotranszmitter hatások közvetítésében az 5. fejezetben kerülnek ismerteté re. tő l e ltérő

A foszfatidiletanolamin szintézise hasonló lépésekben való ul meg, mint a foszfatid ilko liné (2- 149. és 2-152. ábra). A szintézishez itt is CTP-vel az etano lamin-foszfát aktiválód ik és a COP-etanolamin a digliceriddel reagál. Ez utóbbi reakciót az etanolamin-foszfotranszferáz kata lizálja, amely az endoplazmás retikulumban lokalizálódik. Kis menn yiségű fo zfatidiletano lamin a máj mitokondriumokban foszfati dil szerinbő l is keletkezhet dekarboxi lációval (2-149. és 2-1 52. ábra). A fosz fatidiletano lamin-szintézis regul ációj a sokkal kevésbé ismert, mint a foszfatidilkoliné. Valószínűleg a foszfatidiletanolamin-szintézisben fontos szerepet j átszik a diglicerid keletkezése. Glukagon, amely csökkenti a szintézis rende lkezésére álló dig ucerid mennyiségét, gáto lja a foszfatidiletano lamin szintézisét. Foszfatidilszerin-szintézis. Eml ős sejtekben a foszfatidilszerin majdnem kizárólag kicscré lési reakcióban keletkezik a foszfatidiletanolaminból (2- 153. ábra). A reakc ióban, ame ly reverzibilis, a foszfatidiletanolaminban az etanolamin a zennre cserélődik.

szerin

foszfatidiletanotamin

o

~o H2Cl - O - C - R1

~ R2 -C-O-CH

coo·

~o

l

l l

•

H C-0-P -0-CH - C - NH3 2

l

o· foszfatidilszerin

2-153. ábra. A foszfatid ilszerin keletkezése

2

H etanolamin

~o

~o

H C-0-C - R

o~

21

21

~ H C-O- P-O

l ~o ~o H2C - O - P - O - P - citidin

2

l

2

l

R - C-O-CH

o

l

2

o'\.

1

R -C-O-CH

HC-0- C -R

l o-

o

l o-


~o HC - 0 - C - R

o~

21

l

R - C-O - CH

~o HC - 0-P 0

2

1

l

2

o

OH

r

FOSZFATIDILINOZITOL foszfatidilinozitol4-kináz

foszfatidilinozitol4-foszfát-5-ki náz

~(

~o HC - 0-C - R

o 21

l

~

R2 - C-O-CH

l

~o

o

~

l o-

HC - 0 - C - R 21

l

R2-C - O-CH

~o

l

HC-0- P - 0 2

~ ADP

'\

ADP ATP

~o

ATP

HC-0- P - 0 2

~o

l

o-

O- P - 0

b-

foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát 2-154. ábra. A foszf at idilinozitol kelet kezése

foszfatidilinozitol-4-foszfát

LIPIDEK A '~' AGC ERÉJE

•>>H> >H>>>)> H n U H>>>) H>>>> •H) )) >> >> >) >>>>)))H~ •> >>H))>> n)))))) •> )) ))))))>>H >H>)))) n>>>>>>>>})>>)>>>>>))»>>))))>>>>>>))))>>U))))>)))})>>

203

foszfolipáz Az foszfolipáz A

o~

l

0

H

CH

R - C - O2

cl ol c"

2

l

#

R

l

o

H C -O- P - O- alkohol

l

2

ofosztolipid

#o O

~

HC - 0 - C - R

H2C - OH

21

l

R - C - O - CH

l

2 2

l

O

HO - CH

#o

H C - O- P -

1

l

# H C - O- P -O- alkohol

O - alkohol

2

o-

l o-

1-acil-lizofoszfolipid

2-acil-lizofoszfolipid

2-155. ábra. A foszfolipáz A 1 és foszfolipáz A2 által katalizáll reakciók

A foszfolipidekben az l . és 2. szénatomon található zsírsavak gyakran nem azonosak azzal, ami a szintézis során a molelru!ába beépült. Az acilCoA-transzferázok nem specifikus enzimek, a megfele l ő zsírsavakat utólag kell beépíteni. Ehhez a foszfolipáz A 1 és A 2 enzimek el őször e ltávolítják a meg lévő zsírsavakat a 2-155. ábrán látható módon. A foszfatidilkolinba n a 2. szénatomra gyakran arachidonsav épül be, amihez két lehetőség áll rendelkezésre. A foszfolipáz A 2 hatására keletkező 1-lizofoszfatidilko linra vagy egy arachidonsavat tartalmazó aci l-CoA-ró l vagy más, arachidonsavat tartalmazó foszfolipidröl cserereakció útján kerül az arachidonsav. A 2- I 56. ábrán látható reakcióban az arachidonsavat a foszfatidiletanolam in tartalmazza és ez a lizolecitin:lecitin-a cil-transzferáz (LLAT) hatására kerül át a lizofoszfatidilkoli nra. Ezzel a reakcióval analóg módon keletkezik a tüdő "surfactant", a d ipalmitoil-lecitin, ame lyhez a palmitinsavat a 1-palm itoil-lizolecitin zolgáltathatja

(2- l 57. ábra).

A plazmalogén szintézise dihidroxi-acetonfoszfátból történik, am elynek lépéseit a 2-/ 58. ábra mutatja. A szintézis lényegc az, hogy az l . szénatomra, a zsírsav helyére egy telített, hosszú szénláncú alkohol kerül , vagyis egy észterkötés helyett éterkötés j ön létre enzim álta l katalizált reakció során. Ma i ismereteink szerint emlős szervezetben ez az egyetlen példa ilyen típusú biokémia i folyamatra. Az uto lsó lépésben egy ún. kevert funkciójú oxigenáz hatására kettő kötés alakul ki. Az etanolamin beépülése a foszfatidil-etanola min szintézisénél leírtak zerint, azaz C OP-etanolaminból történik.

A szfingolipidek szerkezete és szintézise A szfingo lipidek a poláros, membránalkotó lipidekhez ta rtoznak, melyekben azonban az a lkoho lkomponens nem a g licerin, hanem a szfingozin (2- 10. táblázat). A szfingozin szerkezetileg némi-

204

>) )) > 1h))) )>~)l) )> t))))))) H t)>)>)>>))1) h)>)))>>>U u ) )

>•H>>))>> >~>>>> U>>)) ) >))))))))))>>>>> )) >)UH>))>)>)))) ))))H)))>)))))))> ) U >>>)))))))))))))> >))U))))) ) ))))>>>>>>

ANYAGC SERE

-f'o

T-o- c-R,

H2

HO - CH

O

CH3

~

l

li l

H C - O-P -O-C H -CH - N -CH 2 l 2 2

O

3

CH3

1-acil-lizofoszfatidílkolin arachidom l

fo

CoA-SH

r"' ldiletanolam•n

1-lizofos zfatidiletanolamin foszfatidilkolin

~o 14

ll

8

5

o

HC - 0 - C - R 2f

l

C- 0 - CH

O

CH3 1• HC - 0 - P-0- CH -CH -N -CH 2 l

r

-f'

2

o-

2

l

3

CH3

2-156. ábra. Az arachido nsav beépülés e a foszfatid ilkolinba

palmitoii -CoA

CoA-SH

2-157. ábra. A dipalmito il-lecitin keletkezé se

1-palmitoil-lizolecitin

1-palmitoil-lizolecitin

dipalmitoil-lecitin tüdő "surfactant"

glicerin-foszforilkolin

r

LIPIDEK A :'~o Y GC ERÉJE

205

H2C - OH

l C= l

O

21 o- c-

~o

C= O

HC-0- P - 0

1

~o -

l

l o-

2

~o R

Hc -

HC-0-P-0

l

2

o-

NADPH+H ' NADP .

zsíracil-GoA CoA-SH

---:j

.----!

---:j

.----!

COP-ETANOLAMIN

H2C - 0 - CH2 - CH2 - (CH2h5

l l

~o

-

CH3

HC- O- C - R2 H 2C - O- ~

~o

- O - CH2 -

CH2 -

NH3

o-

NADH+H•

NAD

~ cit. b5 d eszaluráz

H2C - O- CH = CH - (CH2J1s - CH3

l l

~o

HC - O- C-R2 H 2C - O - ~

~o

oplazmalogén

2-158. ábra. A plazmalogénszintézi s lépései

~

- O- CH2 - CH2 - NH3

206

2-1

1\'YAGC ERE

o. táblázat

A szfingolipid ek szerkezete

szfingozin-zsírsav-x --~-.---

x képlete

A szfingolipid neve

neve

~----------------~----------------~--------------------r--

-H

CERAMID

f.--- - - -

-

O

··

CH3

-1.

-

~ l+ - P -0-CH -CH -N-CH

l

2

2

O

l

3

CH3 CHP H

H

fosztekolin

SZFINGOM IELIN

L

glukóz

OH

CHPH

cerebrozidok

1 galakt; -

J---O

neutrális glikoszfingolipidek

H

H

OH

laktóz

l

-J

triszacharid ok, oligoszacha ridok GM2

gangliozidok

LIPIDEK

iWAGC ERÉJE

~UH))))) )))))))H)))))>))>)))))))U))) l ))) •>)))) >)))

leg hasonlít a glicerinhez, amennyiben az J. és 3. szénatomhoz alkoholos OH-, a 2. szénatomhoz azonban NH2-csoport kapcsolódik. A 2. szénatomon szabad NH 2-csoportot tartalmazó szfingozin az emberi szervezetben nem fordul elő, hanem csak származéka, amelyben az NH 2-csoporthoz hosszú szénláncú zsírsav kapcsolódik (savamid). Ez a molekula a ceramid, amely minden, a terrnészethen el őforduló szfingolipidnek építőe leme. A szfingozin transz-konfigurációjú, a kapc o lódó zsírsav pedig hosszú szénláncú, gyakran telített és meghatározza a molekula hidrofób karakterét. A szfingolipidek csaknem minden sejt membránjában jelen vannak, legnagyobb mennyiségben a központi idegrendszer fehér állományában. A szfingolipidek közül a szfingomielin az egyetlen foszfolipid, mivel a ceramid l. szénatomjához foszfodiészterkőtéssel kapcsolódik a kol in (2- l O. táblázat). A szfingomielin a foszfatidilko linhoz hasonló szerkezetü és tulajdonságú lipid, amely a sejtmembránok alkotórésze. Külöoöscn nagy mennyiségben található az axonokat körülvevő mielinhüvelyben. A neutrális glikoszfingolipidekben a ceramid l. szénatomján lévő OH-csoporthoz glikezido kötéssel egy vagy több szénhidrátegység kapc olódik. Ha a kapcsolódó szénhidrát monoszacharid, a molekulát cerebrozidnak nevezzük. Ez á ltalában galaktocerebrozid vagy g lukocerebrozid, külön megjelölés nélkül a cerebrozid elnevezés alatt galaktocerebrozid értendő . Ez utóbbi fontos alkotórésze az idegsejtek membránjának, míg a glukocerebrozid inkább mint intermedier fordu l elő komplex glikoszfingolipidek szintézisében és lebomlásában. A legkomplexebb szfingolipidek a gangliozidok, amelyekben a kapcsolódó szénhidrátok között mindig megtalálható a 9 szénatomos, pH 7,4-nél negatív töltéssel rendelkező N-acetilneuraminsav, azaz más néven sziá lsav (2-159. ábra). A gang l iozidok nevüket onnan kapták, hogy nagy mennyiségben találhatók az idegrendszerben, a ganglionsej tekben, azonban kevésbé jellemző az előfordu lásuk a nem idegi sejtek membránjában. Ma már nagyszámú gangliozid szerkezete ismert, amelyekből három jellemző látható a 2-1 O. táblázatban. Az elnevezésben az M azt jelzi, hogy amolekulában egy (mono) sziálsav található, a számokkal pedig a szénhidrátláncokat jelölik.

>>)) >> )> H>>>>)))))) ') >>)) >)>)>U)>))) )l>>>> )))))))) >) >))) )) )> >)))>))l >>))))))n))))))ll))>)\)))

207

cool

O= C

l

CH2

l

o~

H-C-OH

l

CH3 -C-N-C- H

H l

HO-C-H

l

H-C-OH

l

H-C-OH

l

CH2 0 H

2-159. ábra. N-acetil-neuraminsav (NANA). Sziálsav

A szfingolipideknek, ezen belül is különösen a glikoszfingolipideknek és a gangliozidoknak a sejtmembránokban nemcsak az a j e l entőségük, hogy a membrán szerkezetének kialakításában vesznek részt, hanem mint ejtfelszíni molekulák a felisrnerési folyamatokban játszanak fonto szerep et. Glikoszfingolipidek határozzák meg az emberi A, B és Ovércsoportoka t, amelyekben a jellegzetes szénh idrátláncokat a 2-160. ábra mutatja.

A ganglioLidok, amelyek funkciója ma még csak résLben i mert, receptorként szolgálnak különbözö toxinok és vírusok számára, szerepük ezért meghatározó a toxikus hatások közvetítésében. A vihrio cholerae toxinja, a choleratoxin pl. úgy jut be a sejtek be, hogy a toxin egyik alcgységét (B) a sejtek felszínén a GM 1 ganglioLid ismeri fel és köti meg, s ezt követően a toxin má ik, aktív alegységc (A) a sejtekbe penetrál. A ejtekben a toxin tartósan ak ti válja az adenilát-ciklázt (lásd 5. fejezet). ami a legkülönbözőbb kóros funkciókat eredményezi. A bélhámsejtekből például ennek eredményeként elektrolitok szekretálódnak a béllumcnbe, aminek következtében létrejön a cholera egyik legjellegzetesebb tünete, a diarThoea.

szfingolipidek szintézise (2-161 . ábra) és palmitoii-CoA-ból indul. A szintézisben a redukcióhoz N ADPH-ra van szükség, a zsírsav pedig aci l-CoA-ból épü l be. Je llegzetessége a szfingomielin szintézisének, hogy a kolin nem a A

szerioből

2-160. ábra. Az A , B és O vércsoportokat meghatározó szénhidrátláncok a glikoszfingolipidekb en

A antigén

B antigén

CDP-kolinból, hanem foszfatidi lkolinból zármazik é a reakcióta szfingomiclin-szin táz kata lizálja. A cerebrozidok é a gangliozidok szintéziséhez a szénhidrátok először UTP-vcl aktiválódnak, s a közvetlen szénh idrá tdonor az UDP-galaktóz, UDP-glukóz vagy más aktivált szénhidrát. A g lu kozi l-, illetve galaktozi l-transzferáz enzimek az endopla.t;más retikulumban lokalizálódnak. Normá lis körűlmények között a szfingolipidek szintézise és lebomlása egyensúlyban van. A lebontó enz imek hidro lázok, amelyek a lizoszómákban találhatók és lépésről lépésre, egyenként hidrol izálják a szfingolipidck a lkotórészeit A szfingolipidek szerkezetének megfelel ően az enzimek között a- és ~-ga laktozidáz, ~-glukozidáz, neuraminidáz, hexózaminidáz, szfingomielinrc specifikus foszfodiészteráz, valamint ceramidra speci fikus amidáz talá lható. Normálisan ezek az enzimek a szfingolipideket építő elemeirc bontják. Ha azonban a hidro lázok valamelyike genetikai okból hiányzik vagy elégtelenü l működik, az e nzim szubsztrá~a felhalmozódik és általában súlyos klinikai állapot jön létre.

A Niemann- Pick-betegségben szfmgomielin akkumulá lódik az agyban, a lépben és a

májban, mcrt hiányzik a sziingomiclinrc specifikus foszfod iészteráz, a szfingomiclinidáz. Az enzim egyik formája a lizoszomákban található, pH-optimuma a savas pH-tartományban van. Az agy szürkeállománya nagy mennyiségben tartalmaz nem lizoszómális enzimet (pH-optimum 7,4), különösen a bazális ganglionokban, amelynek aktivitása az agy fejlődé­ sével párhuzamosan nő. A betegség változatos klinikai megjelenésű és ismert olyan formája is, amelyben ismeretlen primer defektus következtében jön létre a szfingomielinfelsz aporodás. Az enzimdefcktus, amely szerencsére ritka, súlyos mentális retardációhoz és korai é letkorban bekövetkező halálhoz vezet. Gyakoribb a Tay-sacbs-kór, amelyben a hexózaminidáz A hiányzik, vagyis az az enzim, ame ly a gangliozidokban az N-acetiiD-galaktózamin és a D-galaktóz közötti kötést bontja. Az idegrendszerben felhalmozódnak a részlegesen lebontott gangliozidok, súlyos mentális retardáció, vakság alakul ki, sa gyermekek 3-4 éves kor előtt clha lá loznak.. A betegség viszonylag gyakori a kelet-európai eredetű zsidó populác ióban.

L IPIDEK ANYACC ERÉJ E

) ) ) H) >H~)))))) ) ))) ) ) )))) )') )) ))))l)))))))))))))))))\))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ) H >)))))>))>>

pa. . )

sze r n

)A

~------------------~-----------------~) }._.CoA-SH

+.

HC03 +-"'

szfinganin

l

O

~

KEVERT FUNKCIÓJÚ OXIGENÁZ

OH -CH- G:hlPCil:il- (CH2h2 -

R-C-

l N- CH H l

CH3 ceramid

CH2 0H U DP-galaktóz

foszfatidi lkolin diglicerid +-----;;?"

~---+UDP

O OH~CH-CH=CH-(CH:ih 2 -CH3 ~ l R-C-NH-CH

l

~o

H2C - O-~- O-CH2-CH2 - N~(CHah

o· szfingomielln

2-161 . ábra. A szfingolipidek szintézise

galaktocerebrozid

209

A ~\-\G CSI!: R E

Gauch er-kórban a glukoc crebroz idáz enzim elégtelensége követk eztében glukoc ercbrozid halmoz ódik fel a Lépben és a májban , amely egyébként nem vesz részt a sejtmem bránok felépíté sében, csak interme dierkén t szerepel má gl ikoszfingo lipidek metabo lizmusá ban.

A foszfolipidek és a szfingolipidek transzportja a sejtmembránba Al ö~szes po láros lipid a sejtekb en a si ma fe l zínü c ndo plaz má retikul umban szintc tizálód ik, a honnan e l kell jutniuk a plazma membránhoz és a/ intrace ll ulári organe ll umok mcmbránjáho z. Minthogy a lipidek vízben ros zul oldódó molekulák, e.r. a folyam at speciá lis transt;portokat igénye l, amelye ket ma még nem ismerü nk. Valós7ínü, hogy résL:ben mcmbránvezikulá k /állitjá k a lipideket a megfe lelő mernbránokho z, m ásrésl't o lyan citopla zm atikus fché1jé k, ame lyek fo~zfo lipidck et képesek megkötni és trans7portá lni.

A szter oidho rmon ok meta boliz musa t\ sztero idho rmonok a g lukoko rtikoido k, a m inera lkoni koidok és a nemi hormonok. E lncveLésük dominá ns biológiai hatásuk alapján történt: a g lukoko rtikoido k (egyebe k mc llett) a szénhid rátok anyagc scréjét, a minera lokorti koidok aL ásvány i anyagc serét, a nemi hormonok pedig a nemi müködéscke t befolyá solják. A glukok ortikoidok és a m inera lokortik o idok a mellék vescké regbcn , a nemi hormon ok kisebb részben a mc llékvcs ckércgbcn, nagyob brészt pedig a gonádo kban kele tkezne k. E fejezet ben történő tárgyalásukat az indokolj a, hogy mindcn sztero idhom1on sz intézisc koles7teri nböl történik. SLerke zetükben közö , hogy c iklopcn tanope rhidrof enantré n (szterá n) vázat tarta lma:tna k. A különbözö hom1onokban eltérő a s;;ub / titúciók száma, a k ettős kötések . záma, poz íciója cs konfig urációj a. 1\ C 18 és C 19 mcl i1-

csopor tok, amelye k a gyürűrends1er síkja elé irányul nak viszony ítási pontok ; azok a szubsz titúe iók, amelyek azonos irány ultságú ak ~- (vagy cisz), ame lyek a gyű rű síkja mögött helyezk ednek c l a - (vagy Jrans::) hc lyzctück. A kettős köté ·t és 111 he lyzetét a!)"" " jelö li. A s.r.énato mok záma segít a1. egyes csoportok kö7ötti cligazo dásban : a g lukokoi1iko ido k é a mi neralok ortikoidok 2 1 szénato mot, a nem i honmm ok közü l az androg ének 19, az ösztrog ének 18 zénatom ot tartalma7nak.

Szteroidhormonok szintézise a mellékvesekéregben A m ellékvc~ckéregben történik a glukokortikoid, a m ineralo kortiko id és néhány enyhén androg én hatású hormon zinté;;ise. A m inera lokortik oidok a zona glo merulo súban, a glukok ortikoi dok és a7 androg ének (cl ö orba n a dehidro epiand ro zteron) a zona faseiculatában és zona reticula risban kcletke.lnck . A szintézis egyes lépé ci és a;; interme dierek a 2- J62. ábrán láthatók. A szteroi dhormonok szintéz isének kö.t.ös prekurz ora a koleszt erin, a melybő l az o ldallán cot hasító enzim hatásár a, a me ly egy ci tokró m P450, prcgnc no lon keletke zik. A kolc zterin a ej tekben koleszt erin-észtcr fonnájában raktá rozódik , innen a ko lcsLtcrin-észtc ráLok hatá ára válik szabad dá. A pregnc nolonb ól progeszter on keletke zik a 3P- hidrox i-sztcro id-dehidrogenáz és a !)"q izomeráz hatására. A corpus lutcum ban, aho l szintén jelen vannak ezek az enzimek, a szintéLis ct.en a ponton részben megáll és túlnyom óan csak proges zteron keletke zik. A mellékvese kéregb en a p rogeszt eronbó l a tovább iakban vah'Y m inera lokortik oidok, vagy glukokortiko idok képzöd nek. 1\ :tona fascicu lata sejtjeiben, ahol jelen van a 17a.- hidroxi lá7 (sz intén c itokróm P-450), a szinté/ is a glukok ortikoid ok irányáb an folytató dik, a /Ona g lomeru lo ában, ahol ez az en7im hiányzi k, mincra lokortikoidok ke letkeznek. Mindké t irányba n résn vesL a további átalakí tásban a 2 1-hidro xiláz és a l l P-hidroxi láz (citokr óm P-450 enz imek). E:tek hatásár a a zona fasciculatában keletke zik a l egfőbb glukok ortikoid hormon , a kortiLoL A 7ona glomerulusába n a m ulti funkcio ná lis ll ~- hid roxi­ láz, amely nek 18-hidr oxi lá7 és oxidá/ akt i' itá~a is

U P ll> EK A'\ YAGCSER~:.J E

van, katalizálja a legfőbb mineralokortikoid, az aideszteron szintézisének utolsó lépését. Az adrená lis androgének keletkezéséhez is 17a-hidroxilázra van szükség, amelynek neme ak a progeszteron, hanem a pregnenolon i zubsztrá~a. A keletkező 17-hidroxi-pregneno lon nagy része a glukokortikoidszintézisben alakul tovább, de egy kis részéből az enyhén androgén hatású dehidroepiandrosztcron keletkezik. A 17-hidroxiláz rendelkezik az átalakuláshoz szükséges C t7-~o-liáz aktivitással is. A hatékonyabb androgén, az androsztendion vagy ebbő l a lakul ki, vagy a 17-hidroxi-progeszteronból. A mctlékvesében az androgének szintézise akkor kerül el őtérbe, ha valami lyen okból gátolt az intermedierek továbba lakulása a glukokortikoidok irányában. A szintézis intraccllulári san több kompartmentben történik, mivel az enzimek egy része a mitokondriumban, más ré ze az endoplazmá retikulumban talá lható (2- J63. ábra). A koleszterin a citoplazmából a mitokondriumba transzportá lódik és itt történik a minden szteroid szintézisének sebességél meghatározó koleszterin -t pregnenolon átalakulás. A 3P-hidroxi-szteroid-dehidro genáz, a ~ 5 .4- i zomeráz és a 2 1-hidrox iláz azonban az endoplazmás retiku lumban lokalizálódó enzimek. vagyis a pregnenolon továbbalakulása itt történik. A l l Phidroxi láz mitokondriális enzim, így a koJ1izolszintézis utolsó lépése újra a mitokondriumban történik. A zteroidhormonok lipofi l, membránpermeábilis molekulák, amelyek diffúzióval távoznak a sejtekbőL A szintézis szabályozása. Az elté rő funkc iójú hormonok szintézisénck szabályozása kü lönböző.

A glukokortikoidok szintézisének l egfőbb szabályozója a hypophysisben keletkező és a véráramma l a mellékveséhez száll ítódó adrenokortikotrop hormon (ACTH). A szabá lyozá vázlatát a 2- 163. ábra rnutatja. A szabályozásban döntő zerepet játszik a cAMP, amelynek szintje ACTHhatásra megemelkedik. A cAMP hatására aktiválódó protein-kináz A, foszforiláció segítségével enzimek és transzporterek müködését tudja szabá lyozn i. (Ezen folyamatok részletes tárgya lására az 5. fejezetben kerül sor.) A glukokortikoidok (és más szteroidhormonok) szintézisében az a meghatározó, hogy koleszterin álljon a szintézis rendelkezésére. ACTH hatására a zona fasc iculata sejtekben koleszterin mobilizálódik a koleszterin-észter-raktárból é fokozódik a ko leszterin mitokondriumba történő transzportja. A szabályozásban, ez idáig nem pontosan tisztázott módon, szerepet játszik az intrace lluláris Ca2 -szint változása is. Ugyanezeken a pontokon és ezzel a mechanizmussal történik a nemi hom1onok szintézi ének a szabá lyozása az ovariumban és a testisbe n, azonban ezt nem az A CTH , hanem a hypophysis megfel e l ő hormonjai, a lute inizáló hormon (LH) és a follicu lusstimuláló hormon (FSH) stimulálják. (Terhes ég alatt a placenta progeszteron zin tézisét a humán choriogonadotrop hormon szabá lyozza.) Az egyes honnonok szintézisét szabályozó szignálokat a 2-11. táblázat foglalja össze. A stimuláló hormonok a hypophys isbő l a hypothalamus által zintetizált ("releasing") hormonok hatá ára zabadulnak fel, amelyek szintézise csökken, amikor a plazmában a megfelel ő szteroidhormon sz in~e megemelkedik Így a keringés és több szerv közremüködésével, indirekt módon a szteroidho rmonok

2·11. táblázat. A szteroidhormonok szintézisének stimulálói Szteroidhormon

r

----;:intézis

he~-e- ~

- ~ ACTH

Stimuláló

T

-;ti~ulus eredete

kortizol

zona fasciculata

progeszteron

corpus luteum

LH

hypothalamus- hypophysis

tesztoszteron

Leydig-sejt

LH

_J hypothalamus-hypophysis

17~-ösztradiol

ovariumtüsző

aldoszteron

zona glomerulosa

i

hypothalamus- hypophysis

FSH

hypothalamus- hypophysis

angiotenzin ll

renin-angiotenzin rendszer

212

'iYACCSERE

KOLESZTERIN

cit P-450

~ x o o::

21 CH

o _ ___,.., J: - - - -• C=O b ,...._

l

;l

o

.,.-

HO PREGNENOLON

17-HIDROXI-PREGNENOLO N

DEH IDROEPIANDROSZTERON

!

1._,

~

3-!l-hidroxi·szteroid-dehidrogerulz_.l 6 t- A ' "-izomeráz

...

........,........._,..~~

CH3

CH3

l

r

C= O

PROGESZTERON

o

C= O

17-H lOROXI-PROGESZTERON

4

l\ -ANDROSZTEN-3, 17-DIO N

21-hidroxlláz

2-162. ábra. A szteroidhormonok szintézise a mellékvesekéregben. A ptros nyilak a mtneralokorttkotdok és a glukokortikotdok szmtézisútjál jelzik

LIPID EK A~ AGCSERÉJ E

n>>n))>>>•>>>>>>>>nu>n>>>>»>••>>u>>n>>h))>>>>>H)n>>>>>>n>>>HU>l))U>>>>>>»>n))h>>nn)>>>n>HJo>H•>>>>>J,,,,,,»>>>l)l>>>>n>>>>»>>

CH2 0H

CH2 0H

l

l C= O

C= O

o

o

r--

11-DEZOXIKORTIZOL

11-DEZOXIKORTIKOSZTERON (DOC)

ll

~-hidroxiláz

o

o KORTIKOSZTERON

KO RTlZOL multifunkcionális 11 ~-hidroxiláz ( 18-hidroxiláz és oxidáz aktivitás)

o ALDOSZTERON

2-162. ábra folytatása (A szteroidhormonok szintézise a mellékvesekéregben)

2 13

214

H>>>;)~))H)))))>H>)))))))))))))))))))))>)))))))))))))))))n)))>n>U)))))o)))))))))))))))))

)>))))))))))))))))))))))))))))))))>))))))))))H))))))))))))))))))))))))))))))))))

ATP

cAMP

ÉSZTEREK

l

'---ep --+

l

KOLESZTE~IN--::1 ÉSZTERAZ

l[

,

~- ~

zsírsav

ANYAGC ERE

2-163. ábra. Intracellulári s kompartmen tek részvétele a kortizolszint ézisben. A szintézis szabályozás a. Az adrenokortikotrop hormon (ACTH) a plazmamembránban receptoraihoz (R) kötódik, ami az 5. fejezetben részletesen leirt mechanizmussal a cAMP-szint emelkedését és a protein-kináz A akliválását eredményezi. A protein-kináz A foszforilálja és aktiválja a koleszterin-észterázt és stimulálja a koleszterin mitokondriumba történő transzportját

ENDOPLAZMÁS RETIKULUM PROGESZT ERON

11-DEZOXO KORTIZOL

t

n

17-HIDROXI-PROGESZ TERON

negatív feedback hatással gátolják önmag uk szi ntézisét. Ennek a rendszeme k a vázlatát a kertizol esetében mutatja a 2-164. ábra. A rendszer erősen l eegyszerűs ített, mert a kortizolszin tézisre a központi idegrendsz er is befolyást gyakorol: a fizikai és a pszichés állapot, a stress, a hő mérsékl et-válto­ zás, fertőzések és számos más tényező is, amelyekkel itt nem fog lalkozunk. A mineralkor tikoidok legfontosab b hatása az, hogy a vese disztá lis tubulusaiba n a Na+-transzportot fokozzák, vagyis Na+-retenciót okoznak. Szintézisük nek legfőbb stimulálója az angiotenzin ll , amely egy oktapeptid és hatását a zona glornerulos a sejtek membránjá ban l évő receptorán keresztül fejti ki. (A receptorakt iválás nem befolyásolja a cAMP-szintet, hanem az intracellulá ris Ca 2+-szint emelkedésé t váltja ki, lásd 5. fejezet.) Angiotenzi n II akkor keletkezik, amikor szüksé-

gessé válik a plazma Na -koncentrá ciój ának, illetve a vérnyomás nak az emelése {2-165. ábra). A plazma Na -koncentrá ciójának csökkenése vagy hypovolaemia a vese juxtaglome ruláris sej tjeiből ren int, egy proteázt szabadít fel, ami a keringésben a máj által terme lt, mintegy 400 aminosava t tartalmazó ang iotenzi negénbő l (ar globulin) egy dekapeptid et hasít le, amelyet angiotenzi n I-nek nevezünk. Az angiotenzin I-bő l az angiotenzinkonvertáló enzim (ACE) két aminosava t lehasít a C-tcrmina lis végről és angiotenzin II keletkezik. Az ang iotenzin II-bő l egy arninopept idáz hatására angiotenzin lll keletkezik, ami szintén hatékony stimulálója az a ldoszterons zintézisnek , azonban a keringésbe n az angiotenzin IT-nél sokkal kisebb rnennyiség ben van jelen.

LIPIDEK ANYAGCSERÉJE

» » » m»»»»m»» »» » »>>»»» >>>m>»»»»>>»>>m>»>>»»»>>l>>»>m» >»»»m» m>»»»1m»»»>m1m>»»>»>>»>»>» •»>

kortikotrop releasing hormon (CRH)

•

HYPOPHYSIS adrenokortikotrop hormon (ACTH)

MELLÉKVESEKÉREG kortizol

•

PLAZMAKORTIZOL

2-164. ábra. A kortizol-megemelkedett plazmaszint esetén - gátolja a CRH és az ACTH színtézisét (géntranszkripciót; lásd 3. fejezet) a hypothalamusban, illetve a hypophysisben

l

(plazma ~-glotiulin)

••nin +vese juxtaglomeruláris se1tek

ANGIOTENZIN l (Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe-His- Leu)

l

ANGIOTENZIN-KONVERTÁLÓ ENZIM (ACE) (tüdő, máj, endothelsejtek, vese stb.)

ANGIOTENZIN ll (Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe)

l

AMINOPEPTIDÁZ

2 15

Az angiotenzin II az aldoszteronszintézis stimulálása mellett nagyon hatékony vazokonstriktor is, ezért keletkezésének gátlása (ACE-gátlókkal) bizonyos típusú hypertensiókban vérnyomáscsökkentő hatású. (Az ACE-gátlók hatásához hozzájárul a vazodilatátor hatású bradik.inin elbontásának gátlása is, tekintettel arra, hogy az ACE nem specifikus lévén, a bradjkinint is elbontja.)

Az angiotenzinnel ellentétes hatású a pitvari nátriumürítő faktor (ANF), amely a pitvarban keletkezik és receptora található a zona glomerulosa sejtek membránjában. A receptor guanilát-cikláz-aktivitás al rendelkezik (lásd 482. oldal) és hatására csökken az aldoszteron szintézise és szekréciója.

A glukokortikoidok és a mineralokortikoidok inaktiválása és szállítása a plazmában A szteroidhormonok inak:tiválása, amelynek során a molekula a 3-ketocsoporton és az A-gyűrű­ ben redukálódik, elsősorban a májban történik és NADPH-val müködő reduktázok katalizálják A redukált (dihidro- és tetrahidro-) metabolitok glukuronsavval vagy szu1fáttal konjugálódnak, s vízoldékonnyá válva a vesében kerülnek ki választásra. A vérplazmában a szteroidok febérjéhez kötve szállítódnak. A mineralokortikoidok albuminhoz, a glukokortikoidok specifikus fehérjébez, a transzkortinboz (más néven kortikoszteroidkötő fehérje, CBG) kötődnek. A transzkortin köti még a dezoxikortikoszteront és a progeszteront is. A keringésben lévő kortizol kb. 8%-a szabadon található, s ez képezi a biológiailag aktív kortizolfrakciót. A szteroidborrnonok biológiai hatásukat specifikus receptoraikon keresztül fejtik h Receptoraikról, amelyek intracelluláris lokalizációjúak az 5. fejezetben külön szólunk.

ANGIOTENZIN lll (Arg-Val- Tyr- lle- His- Pro-Phe)

2-165. ábra. A renin-angiotenzin rendszer

A mellékvesekéreg-horrnonok szintézise számos okból zavart szenvedhet, s akár túlprodukció, akár csökkent szintézis bekövet-

2l 6

A N Y A G CS E RE

»»»>>>»»h>''»»''>>>>>»>mm>>>>>>>>>>>h>>n>»>»>>»>>>»>>>»»>>»>»»»>»>m>>»>m>>>>>>m»»>>»>n>»>>>>>>>>>»»»>>>>>>>»>>»»»>>>>»>»>>>»''

kezhet A kóros állapotok közül csak egy enzimdefektusról, a 21-hidroxiláz-elégtelenségről teszünk említést. Azokat az állapotokat, amelyekben genetikai enzimdefektus következtében elégtelen a kortizolszintézis congenitalis adrenalis hyperplasiáknak nevezzük, mert a csökkent kortizolszint a negatív feedback gátlás csökkenése következtében ACTH-túlprodukcióhoz és mellékvese-byperplasiához vezet. Az esetek 90%-ában az ok a 21hidroxiláz elégtelen müködése, ami lehet részleges vagy teljes. A 21-bidroxiláz elégtelen müködése következtében csökken a kortizo l és a mineralokortikoidok szintézise. A fokozott ACTH-stimulus viszont serkenti a koleszterin ~ pregnenolon lépésben azon intennedierek keletkezését (lásd 2-162. ábra), amelyek nem lévén más lehetőség, az androgének irányában alakulnak tovább. Az androgén-túlprodukció a külsö genitáliák férfi nemi j ellegű differenciálódását okozza és - nemtől függően különböző mértékben, de általában - már újszülöttkorban felismerhető jeleket okoz a genitábákon. Később korai nemi éréshez és nőkben férfias másod Iagos nemi jelleg kialakuláshoz vezethet. Ez az adrenogenitalis szindrómában nyilvánul meg, mint pl. virilismus, hirsutismus, jellegzetes kopaszodás, kis emlők stb. Az aldoszteron hiánya vagy erősen csökkent szin~e súlyos sóveszteséggel jár.

PROGESZ?fiERON 17~-HJDROXILÁZ 17-J}-HIDROXI-SZTEROID-

Leydtg

DEHIDROGENÁZ

OH

o TESZTOSZTERON vesicula semmalis prostata külsö genitáliák

So.-REDUKTAz (NADPH)

bőr

OH

A nemi hormonok szintézise A tesztoszteron a here Leydig-sej~eiben koleszterinből szintetizálódik, s a koleszterin ~ pregnenolon ~ progeszteron átalakulás analóg azzal, ami a 2- 162. ábrán látható. A további átalaku lást (2- 166. ábra) a 17a-hidroxiláz és a 1713-hidroxiszteroid-dehidrogenáz végzi és kialakul a tesztoszteron. Tesztoszteron keletkezhet a pregnenolonból dehidroepiandroszteronon keresztül is, amelyből e lőször androszténd ion (lásd 2-162. ábra), majd a 1713-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz hatására tesztoszteron keletkezik. A tesztoszteronból a herében csak kis mennyiségű, a célsejtekben (vesicula seminalis, prostata, külső genitáliák) nagyobb mennyiségű 5a-dihidrotesztoszteron ke-

o

H

5a-DIHIDROTESZTOSZTERON

2-166. ábra. A tesztoszteron keletkezése

letkezik, ami a tesztoszteron aktív rnetabolitja. Ebben az átalakulásban az A-gyűrűben levő kettős kötés redukálódik (2-166. ábra). A herében és

•

LIPIDEK ANYAGCSE RÉJ E

•> ,,>>n>>>>>>,.>>>> >>»>H>>>»>> >»>>H>>>>>>>»>>>>>>>>>»>>>»>>»>>»>>>>>>>>>H>»>>>>>>>>>>>>>>>>>>)>>>>>>> >H>>'>>>>»>>>>>>>>>> n»>>>>>>>H>

2 17

2-167. ábra. Az ösrlrogének szintézise

ANDROSZTENDION

~MATÁZ

/

o

OH

o

HO ÖSZTRON

TESZTOSZTERON

l

1

16o.-H IDROXILÁZ (máj)

AROMATÁZ

OH ····· OH

HO

HO 17[3-ÖSZTRADIOL

egyes célsejtekben a tesztoszteronból 17P-ösztradiol is keletkezik, amelynek során az A-gyűrű aromássá válik (2- 167. ábra). A tesztoszteronszintézist a hypophysis által termelt luteinizáló hormon szabályozza, ugyanolyan módon és receptorbatással, ahogyan az ACTH a glukokortikoidok szintézisét. A tesztoszteront a keringésben j órészt a tesztosztero n-ösztrogén-kötő globulin (TEBG), más néven a szexuálhormonokat kötő globulin (SHBG) szállítja, kisebb mennyiségben albuminhoz kötő­ dik. A keringésben l évő teljes mennyiség 97- 99%-a fehérjékhez kötve található, s csak néhány százalék van szabadon, ami a biológiailag aktív frakció.

ÖSZTRIOL

A tesztoszteronmetabolizmusban, amely el ső­ sorban a májban zaj lik, a 17. szénatomon oxidáció történik, az A-gyű rű és a 3-keto-csoport redukálódik. A kialakuló 17-ketoszteroidok androgén hatással nem rendelkeznek. A tesztoszteron és az 5a-dihidrotesztoszteron célsejtekben található receptorai az intraceilu Járis receptorok családjába tartoznak (lásd 5. fejezet). Befolyásolják a spermatogenezist, a szexuál is érést, a másodiagos nemi jelleg kialakulását, a szexuális magatartást és anabolikus hatásúak. A legfőbb női nemihormon, a 17P-ösztradiol az ovariumban keletkezik, de egyéb ösztrogének máshol is keletkeznek (pl. placenta, bőr, zsírszövet, máj). A szintézis kezdeti lépései koleszterinből azonosak a mellékvesekéreg szteroidjainak

218

i\~YAGCSERE

szintézisével. A további folyamatokat a 2- 167. ábra mutatja. Az ösztradiol az ovariumban főként a granulosasejtekben keletkezik, kisebb mennyiségben a corpus luteum is terrneli, ahol e lsősorban progeszteron szi ntetizálódik. (A férfi szervezetben is keletkezik kis menny1segu ősztradici a tesztoszteronból). Az ösztrogének legfőbb forrása posztmenopauzában a mellékvese eredetű androszténdion, amelyből aromatáz hatására ősztron keletkezik. A keringésben az ösztrogének ugyanahhoz a fehérjéhez, az SHBG-hez kötődnek, ami a teszto-

~C

szteront is köti, a progeszteron pedig a glukokortikoidokat is szállító kortikoszteroidkötő fehérjéhez kötődve szállítódik. Az ovariális szteroidok nem raktározódnak, a plazmaszint a menstruációs ciklus során változik, és tűkrözi az ovariumban folyó szintézist. Az ösztrogének és a progc zteron metabolizmusa a májban történik. A progeszteron metabolizmusa gyors (ezért a progeszteron orálisan nem hatékony), amelynek sorá n az A-gyűrű, a 3- és 20-keto-csoport redukálódik és glukuronsavval konjugálódik. Orális fogamzásgátláshoz olyan

~

CH

/

CH - CH -CH - CH -CH 2

2

2

3

~

CH3

3

l

HO 7 -dehidrokoleszterin

H3C

CH

UV-sugárzés

~

L

CH

3

CH-CH - CH -CH -CH 25

CH3

2

2

~

2

CH3

HO 0 3-vitamin (kolekalciferol)

l

C-25 oxidáció - májban C-1 oxidáció - vesében

HC

OH ~ l CH - CH - CH -CH -C-CH CH 2 2 2 l 3

3

CH3

HO 1,25-dihidroxi-kolekalciferol

=AKTIV HORMON

2-168. ábra. A 0 3 -vitamin és aktiv metabolitjának keletkezése

LIPIDEK ANYAGC E R ÉJE

219

progeszteronszármazékokat használnak, amelyek a májban kevéssé metabolizálódnak. Az ösztrogének glukuronsavval és szulfáttal konjugálódva választódnak ki a vízeletbe, epébe és a székletbe.

metabolit, az la,25-dihidroxi-kolekalciferol. Keletkezését a parathyroidhormon szabályozza, rnely stimulálja a 1a,25-dihidroxi-kolekalciferol szintézisét, míg hiányában inkább az .inaktív 24,25-dihidroxi-kolekalciferol keletkezik. A parathyroidhormon-elválasztást az alacsony szérumCa2' -szint váltja ki. A keletkező l a,25-dihidroxikolekalciferol mint szteroidhormon hat a bélhámsej tekben, és indukálja a Ca2 +-felszívódáshoz szükséges fehérje szintézisét. A csontokban a parathyroidhormonnal együtt egyensúlyban tartják a Ca2 ~-lerakódás és -felszabadulás folyamatát, a vese disztális tubulusokban pedig stimulálják a 21 Ca -reabszorpciót, vagyis a Ca2 +-kiüri.il~st gátolj ák. Az alacsony Ca 2+-sz int esetén végbemenő folyamatokat a 2-169. ábra mutatja. Amikor megnő a szérumban a Ca2+-koncentráció, csökken a parathyroidhormon-el választás, a 25-hidroxi-kolekalciferolbó l az inaktív 24,25-dihidroxi-kolekalciferol keletkezik és a Ca2+-forgalom a szervezetben ellentétesen változik azzal, a mi a 2-1 69. ábrán látható. A D-vitanlin-hiány súlyos formájában alakul ki a csontelváltozásokkal járó rac hi t is, i Iletve osteomalacia.

A 0 3-vitamin szintézise Koleszterinből történik a kalcium- és a foszfátmetabolizmusban alapvető szerepet játszó D 3-vitamin szintézise. A szintézis, amelyhez a 7-dehidrokoleszterin a közvetlen prekurzor, a 2-168. ábrán látható módon tötiénik. A bőrben a napsugár ultraibolya-komponense hatására alakul ki a D 3-vitamin, a kolekalciferol, amely azonban még nem a biológiailag aktív anyag. A D 3-vitarnin keletkezéshez elégséges, de egyszersmind szükséges is, hogy naponta lega lább 10- 15 percig a bőrt kis felületen (arc, kéz) napsugárzás erJe. 0 3-vitamin számos táplálékban megtalálható (tengeri halak, máj, tojássárga), amelyek alkalmasak arra, hogy a 0 3-vitamin-szükségletet pótoUák. A kolekalciferolból először a májban 25-hidroxi-kolekalciferol keletkezik, majd ebből a vese proximálís tubulusaiban alakul ki a hatékony

2

SZÉRUM Ca · -SZINT J..

PARATHYREOIDHORMON

t

~

l

1a.25-DIHIDROXI-KOLEKALCIFEROL t

/

!

2

Ca ·-felszabadulás a csontokból t Ca 2+

-kiür~lés a vesében .!.

2

Ca · -felszívódás a bélben

t

J

2-169. ábra. A kalcium-anyagcsere változása alacsony szérum-Ca2• -szint esetén

A fejezet megírásával kapcsolatban tett javaslatokért és kritikai megjegyzésekért a szerző köszönetet mond Dr. König Tamásnak, Dr. Szabados Györgynek, Dr. Tóth Miklósnak és Dr. Tretter Lászlóna k.

.4.

Az aminosavak anyagcseréje. Porfirin-anyagcsere

M achovich Raymund

Az aminosav-anyagcse re általános ismertetése Az aminosavak azonkívül, hogy a fehérjék épí tő­ eleme i, szerepet j átszhatnak a szervezet e nergiagazdálkodásában é kulcsszerepet tö ltenek be a nitrogéntarta lmú molekulák (pl. nukleotidek, porfiri nek, hormonok) szintézisében. Az amino avak szintéziséhez e lsősorba n széllhidrátokra és ni trogénre van szükség; szintézisük nagy menny i ségű A TP-t és közel 80 enzimet igényel. Az evolúció orán bizonyos sejtfé leségek elvesztették szintetizálóképességüket és az aminosavak egy részét kész formá ban veszik fel, amivel energiát takarítanak meg. Így például a bumán sej tek egyálta lán nem képesek egyes aminosavak szintézisére; ezeket esszenciá lis a minosavaknak nevezzük (2- 12. táblázat). Néhányat, ame lyet szemiesszenciá lis a minosavkén t tartunk számon, az emberi zervezet képes ugyan szintetizálni (pl. Arg), de a szintézis sebessége kicsi és így mennyiségük nem elégséges (e lsősorba n a fej lődésben lévő szervezetek számára). Azokat az aminosavakat pedig, ame lyeket a humán szervezet e legendő mennyiségben képes szintetizálni, nem esszenciális a minosavakna k nevezzük. A Föld légköre bőségesen tarta lmaz molekuláris nitrogént, ez azonban nem hozzá férhető az eukarioták és a legtöbb pro karióta számára, amelyek a nitregént csak reduká lt formában tudják felhasználni. A nitrogén redukciój a csak nagy nyomáson (a légköriné l 1O 000-szer magasabb), magas hőmérsékl eten (500 °C fe lett) és vas kata-

2-12. táblázat. Az emberi szervezetben leggyakrabban megtalálható aminosavak Nem esszenciális

l

---

Ala

alanin

As n Asp

aszparagin

Cys Gin G lu

aszpartát, aszparaginsav cisztein glutamin glutamát, glutaminsav

l Gly Pro

glicin prolin

Ser Tyr

szerin tirozin

l HGla• yl• Hyp•

---

l

A' g

l gamma-karboxi-glutaminsav hidroxilizin hidroxiprolin

____...

Szarniesszenciális arginin Esszenciális

l His Ile Leu

~sztidin oleucin leucin

Lys Met

lizin metionin

Phe Thr

fenilala nin treonin

l Trp Va l

l tripiofán valin

• Aminosavak, amelyek fehérjébe történő beépülésük után (poszttranszlációs módosulással) keletkeznek

A IJ~OSAVAK A~YAGCSERÉJE

)))))l))>)))))))))))))))))))) ))))))>)))))))))))))))))))))) )))))))))))))))),)>)))))))))) )))))))))))))))))n>>)))lHt>

lizátor jelenlétében következik be. Egyes organizmusok azonban, 1nint pl. a kékeszöld algák és többféle talajbaktérium is, rendelkeznek olyan enzimrendszerrel (nitrogenáz komplex), amely " helyettesíteni" tudja a magas nyomást és hő­ mérsékletet. A nitrogenáz komplex leglényegesebb komponense a nitrogerráz és reduktáz; ATP energia felhasználásáv al és 6 e- transzportja révén N2-ből NH4- -t képez. Az ammónia ezután már több úton is beépülhet organikus vegyületekbe. Mind prokariótákba n, mind eukariótákban központi szerepetjátszi k a glutamát-glut amin rendszer az ammónia beépítésében, majd mint aminedonor a transzfer reakciókban a különböző aminosavak szintézise során (lásd később). Az ember aminosavszük ségletét e l sősorban a táplálkozással biztosítja, bár bizonyos aminosavak szintézisére képes, valamint a saját febérjéinek lebontásából származó aminosavakat is újra felhasználhatja. Normál körűlmények között az utóbbiak 75%-a ismét fehérjék szintézisére fordítódik, míg csupán a fennmaradó 25% kerüllebontás ra energiát szeigáitatva vagy válik e lérhetővé speciális molek:ulák szintéziséhez. Jóllehet az emberi szervezetben mindig találhatók szabad aminosavak, azokból nem jönnek létre olyan energiaraktárak, rnint a zsírsavakból a trigliceridek vagy a glukózból a glikogén. Egy 70 kg-os embemek napi kb. 40 g fehérjére van szüksége. E légtelen febérjebevitel esetén a szervezet saját szöveti fehérjéit nagyobb mértékben kezdi lebontani, mint az a normális fehérjetumov er során történik, s a felszabadult aminosavak nagy mennyiségű energiaforrásként szolgálbatnak . A fehérjékbő l származó legjelentősebb energiaforrás az izomszövet (2-13.

táblázat).

2·13. táblázat Az energiaraktár ak

' (kJ) -

-r-

Szervek 1

v~~

maJ l agy

-

-

.• Glikogén 1 (glukóz)

'1 __. '

l

Zsír

megoszlá~ a

T-·--

Fehérj e

o

-+-250- - - -1-90 1680 30

1890

1680

o

o

izom 1 5040 1 zsfrszövet _ 340

1890 567000

J

1

100800 170

_j

))))))))).))U.),)))))>t

221

Fehérjehiányo s táplálkozásbó l származó orvosi problémák a "fejlett" társadalmakat alig érintik, ezzel szemben a harmadik vi lágban súlyos gondokat okoznak; általános energia- és proteinhiány a marasmus nevü kórképet hozza létre, míg a fehérjebevitel elégtelensége önmagában a kwashiorkort eredményezi.

A táplálékbó l származó aminosav ak. A fehérjék emésztése A táplálékkal elfogyasztott fehérjék a gastrointestinal is traktusban emésztő enzimek hatására kis peptidekre és aminosavakra degradálódna k. A peptidkötések vizes fázisban spontán hidrolízissei bomlanak:

o ll

R1 - C

o

-7- R + H 0 2

2

ll

- - + R1 -

l

C- OH + H2N-R2

H

A reakció irreverzibi lis Uelentős mértékben exergonikus), de sebessége a fiziológiás pH- és hő­ mérséklet-tar tományokban rendkívül kicsi. Katalizátorok jelenlétében azonban nagy mértékben felgyorsuL Ilyen katalizátorkén t szelgálnak a proteázok. Az emésztőtraktus proteázai hatásmechani zmusuk a lapján csoportosítha tók: O szerin-proteáz ok (az aktív centrumot Ser-HisAsp alkotja), 6 cink-proteázo k (az aktív centrumot Glu és Zn24 alkotja), C) karboxil-prot eázok vagy savanyú proteázok (az aktív centrumot 2 Asp alkotja). Mindhárom típusú proteáz müködésének lényege, hogy az enzim által felismert szubsztrátban az enzim aktív centruma és a peptidkötés szén-, illetve nitrogénatom ja között labi lis kötés alakul ki, és egy olyan intermedier jön létre, amely vízjelenlétében gyorsan hidrolizáL A működés egyszerű sémáját az 2-170. ábra mutatja, a szerio-proteáz ok részletes mechanizmus a a 1-22. ábrán látható.

222

)))))U))))) ) H)))n)) )) H>))))) U>>)))))))) ))))

>> >>)))))) >))))))))))))))) )) )))))))))))))))))))))))H)>>)))))))))) >U>))))))))))))))))))))>))))) >>))))))))))))>>)))))))>>>) )))

N-terminális

AN\' AGCSERE

- - -- - - - - - - - - C-terminális

szerin-proteáz

c

N

2-170. ábra. AL. emésziÖ lraklus szcrin- proleázainak hatás mecha nizmu a. A proteá7 swbsztrátkötö helye .. felismeri·· a hidroliLisre kerülö polipeptid ..megfelelő" aminosav-oldallán cát, amely az cn7imheL kapcsolódik. Ez a1. illeszkedés biL.tosítja. hogy a .,megfelelő" aminosav pepi id kötésben részt vevő C O csapon C-atomja a1 enzim aktiv celltrumába11févö Ser Off-csoportja kö:e/éhe keriif és a proteoli:ist eli11ditn /lukler~fil reakció támadáspontjimf s:::o/gál. (A katalitikus hely Ser-1 fis-Asp amilloSal'·ofda!láncokfimkcionális .. egl'Sége ··piro r s:ínnell'an kiemelve)

pepszinegén

Lys

l

Arg

l

Lys

hidrolízis

~-te~ N-terminális -

Lys-

Arg-Lys-L eu--lle

N-terminális -Lys-Arg -Lys- Le u

l

v r~~

C-terminális C-terminális

Ile

pepszin 2-171 . ábra. A pepszinegén aktiválódása. Az ábrán csak az aktiválás szempontjából fontos peptidrészlet látszik. Az ábra értelmezéséhez lásd a szöveget

.

AM INO AVAKANYAGC ERÉJE

A gyomor széles szubsztrátspecificitással renproteáza a pepszin (karboxil-proteáz), amely aromás aminosavak és dikarbonsavak melletti peptidkötéseket bont, elsősorban denaturált fehérjékben. Az enzim savanyú proteáz (pH-optimuma 1- 2 között van). Az optimális pH-t agyomor sósavszekréciója biztosítja, amely egyben felelős a fehérjék denaturációjáért is. A fehérjék degradálása "nagy" peptideket eredményez. delkező

Annak ellenére, hogy a fehérjék totális gastrectomia (a gyomor műtéti úton történő eltávolítása) után is lebomlanak (a gyomor nem esszenciális szerv a fehérjeemésztés szempontjából), a gyomor funkciózavarai különböző kórképekhez vezethetnek. Így pl. a fokozott sósavtermelés (bár a pepszin rnűködésének elő­ feltétele) gyomorfekélyt válthat ki, csökkent termelődése viszont gyomorcarcinoma kialakulásának kedvez. Mindkét szélsőséges eset emésztési zavarokban nyilvánul meg, melyekkel a klinikus gyakran találkozik. A gyomorfunkció károsodása, az intrinsic faktor elégtelenség következtében 8 12-vitamin-hiányt is eredményezhet, amely aminosavanyagcsere-zavarokhoz és a nukleotidszintézis elégtelenségéhez vezethet (lásd 2.5. fejezet).

A gyomorban kezdődön fehérjeemésztés a bélben folytatódik, ahol a legjelentősebb enzimek a tripszin, a kimotripszin és az elasztáz (szerinproteázok), illetve a karboxipeptidáz A (cinkproteáz). Ezek pH 7- 8 közegben aktív enzimek és az egyes fehérjeféleségekre nem specifikusak. Míg a karboxipeptidáz A a peptidek C-terminális végét ismeri fel, a tripszin Lys és Arg melletti kötéseket hidrolizál, a kimotripszin aromás aminosavak mellett bont, az elasztáz pedig G ly, A la, Ile és Ser melletti hidrolízist kata l izál.

A fehérjeemésztő enzimek aktivitásának szabályozása A nem megfelelő helyen és időben müködő proteázok súlyos károsodásokat hozhatnak létre a különböző szövetekben. A proteázok által okozott

223

destrukció és Önemésztődés ellen a szervezet főleg két módon védekezik:

O a gastrointestina lis proteázok inaktív prekurzorok (zimogének, proenzimek) formájában szintetizálódnak, amelyek megfelelő stimulusra aktiválódnak; 8 hatásos proteáz inhibitor rendszer müködik, amely a nem megfelelő helyen l évő enzimeket inaktiválja. A zimogének két okból lehetnek enzimatikusan inaktívak: O bár az aktív centrumuk kialakult, mégsem müködőképesek, mert a febérje egy másik része " lefedi" (pepszinogén), 8 az aktív centrum azért nem alakulhat ki, mert az azt a lkotó aminosavak távol vannak egymástól és csak a részleges proteolízist követő konformációváltozás után jöhet létre térbeli közelségük, illetve kölcsönhatásuk (tripszinogén, kimotripszinogén, proelasztáz, prokarboxipeptidáz A).

A pepszin zimogénj éből, a pepszinogénből (40 kDa), keletkezik (2-171. ábra). A pepszinogént a gyomor fösej~ei termelik, és szekréciój át a gasztrin indukálja. A pepszinogénben ugyan az aktív centrum már kialakult, de az aktivitásért felelős két aszpartát, a prekurzor távolabbi pozíciójában l évő argininekkel és lizinekkel ionos kötést képezve működésképtelen neutrális pH-tartományban. A savas pH (pH<5) hatására l étrejövő konformációváltozás során ezek a kölcsönhatások m egszűnnek és az aktív centrum hozzáférhet szubsztrátjaihoz, a savas közegben denaturálódott fehérjékhez. Az aktív pepszinogén még nem kell ően hatásos enzim, de Önemésztődés (egy Ile és Leu közötti peptidkötés hidrolízise) után a gátló szekvencia protealitikus e ltávolításával kialakul a végső szerkezet, amely jellemző a pepszinre (2-171. ábra). Az enterális proteázok zimagénjei a pancreasban szintetizálódnak és tárolódnak. Bélbe történő kiválasztásukat a szekretin és a kolecisztokinin (pankreozimin) indukálja, amelyek felszabadulását a gyomortartalom duodenumba érkezése váltja ki. Ezután a duodenumban termel ődö enteropeptidáz indítja el az aktiválási folyamatok sokaságát, ame-

r

ANYAGCSERE

224

lyek során el őszö r egy specifikus peptidkötés hidrolizálásával a tri pszinogént tripszinné alalátj a (2- 172. ábra), majd a keletkezett tripszin aktiválja az összes többi proenzimet a kimotripszinogént , a proelasztázt és a prokarboxipeptid áz A-t.

A pancreas zimcgének szintézisének és szekréciójának zavarai vagy elégtelen aktiválásuk a bélben az emésztési zavaroknak megfe l elő klinikai tüneteket eredményezhetnek. Más oldalról, pancreasban történő aktiválásuk a pancreas önemésztődéséhez és nagy mennyiségű proteolitikus enzim véráraroha jutásához vezethet,

amely távolabbi szövetek roncsalódását is kiválthatja. Ez utóbbi folyamat az alapja egy súlyos betegségnek, az akut pancreatitisnek, amely közel 30%-os mortalitással jár.

A pancreas-proteázo k aktivitásának szabályozásában részt vevő inhibitor rendszer két legjellemzöbb képvi.selöje a pancr eas tripszin inhibitor és az a.,-proteáz inhibitor (a. 1-antitripszin néven is ismert), amelyek akkor játszanak szerepet, amikor az enz imek nem az emésztő apparátusban rnűköd­ nek.

2-1 72. ábra. A trípszínogén aktiválódása. A tripszinogén szerkezetéböl csak az aktiválódás szempontjából fontos részek látszanak. Az aminosavak számozása az aminosavak fehérjeláncon belüli helyét jelenti: az aktív centrum kialakításáért felelős His, Asp és Ser a nat/v zimagénben egymástól távol helyezkednek el. A proteo/izist követő konformációváltozás teszi lehetövé egymáshoz közel kerülésüket, az aktiv centrum kialakulását

_f__ Val 1 -------· Lys6

enteropeptidáz lle7 ------- His45------· Asp90------- Ser183 ------tripszinogén

r Val ------- Lys6 1

tripszin

konformációváltozá s

AM IJ'IOSA VA K ANYAGCSERÉJE

)))))))) )))))))))))) )))))))))) )))))) )) )))))) )))))))))))))) )))))))) ))))))» )))))))) )))))))) )) ))))))»)) ))))))))))))))))))))>H)))))))))))>)))

225

PTI Lys-Aia

S~r .QH

o ll

HO , C

.·

(Met)-CH - CH - S - CH 2

2

ll

o

2-173. ábra. A pancreas tripszin inhibitor (PTI). A pancreas tripszin inhibitor egyik lizinje (Lys15) és a proteáz aktív centrumához közel elhelyezkedő aszpartát (Asp ,89) közölt ionos kötés jön létre

A pancreas tripszin inhibitor relative kis molekufehérje (6000 Da), amely nagy affinitással kötődik a tripszin aktiv centrumához (Kt- l o -lJ M) elektrosztatikus kölcsönhatásokon keresztül (2-173. ábra) . Az inhibitorban a proteáz hatására egy peptidkötés (LyswAla 16) ugyan elhasad, de a hidrolízis sebesség~i cs i: a' komplex féléletideje több hónap. Az a 1-proteáz inhibitor az ún. akut fázis fehérjék közé tartozik, amelynek szintézise és szekréciója a májban nagymértékben megnő gyulladásos fo lyamatokban (feltehetően a szervezet általános védekezési reakciójának részeként is szerepet játszik a szerin-proteázokkal behatoló bakteriális fertőzé­ sek elleni védelemben). Fiziológjás körülményele között a vérplazma proteáz inhibítorai közü l ez található a legmagasabb koncentrációban (~20 !J.M). Az a 1-proteáz inhibitor az eJasztáz J egjelentősebb latömegű

3

metioninszulfoxid

2-174. ábra. Az o.1-proteáz inhibitor (o.1-antitripszin; o.1PI). Az inhibitor kovalens komp/exet képez a szerin-proteázokkal (köztük az elasztázokkal is). Az enzim Ser hidroxilcsoportja és az inhibitor egyik proteolízis után szabaddá vált karboxilcsoportja közölt észterkötés alakul ki. Az inhibitor müködéséhez annak egyik metionja (Met358) szükséges. Ez a metionin oxidábilis, amikor is metionin-szu/foxiddá alakul

inhibitora, bár majdnem az összes - a vérkeringésben és szövetekben el őfordul ó - szerin-proteázt képes gátolni. Az inhibitor egy karboxilcsoportja és az enzim aktív centrum szerin hidroxilcsopo~ a között észterkötés alakul ki, amely csak rendkívül lassan hidrolizál (2-174. ábra). Az inhibitor Met35g-je nélkülözhetetlen az enzimhez történ ő kötődésben .

Dohányosoknál az inhibitorban a Met35& metionin-szulfoxiddá oxidálódhat és inaktiválódik (2-174. ábra). Az elégtelen inhibitor funkció veleszületett is lehet. Mindkét esetben az elasztázok kontrollálatlanul működnek, aminek legszembetűnőbb eredménye az emphysema (tüdőtágulás). Az elégtelen légző­ fe lület hajlamosít fertőzésekre, ami azután további patológiás folyamatokhoz vezet.

226

>> '>>>>>»>»»Hn> ))>)>»»n> n >H>>~>> n>>»>>>>>>>>>»>>HH»> •>»>>)))')»>>>>» >»>>»>>>>»>>»»H>» H))>>>>>»>»>>>»>>>»>>»»>»>»>n> >»>n»>>>»>>>>»>»>>

Az aminosavak transzportja A bél lwnenébe bejutott vagy fehérjéből keletkezett aminosavak és kisebb peptidek főleg Na+_ függő transzportfolyamattal a bélbolyhokba kerülnek. A bélhámsejtek citoszoljában a peptidek tovább hidrolizálnak aminopeptidázok, illetve di- és tripeptidázok közremű.ködésével, majd az amino-

savak a portális vérbe kerülnek. Aminosavak és csekély mennyiségű fehérje diffúzióval is átkerülhetnek a béllumenéből az érpályába; az ilyenjellegű abszorpció lényegtelen, viszont az immunválasz kiváltásához elégséges (így például az anyai ellenanyagok is így jutnak be az újszülöttekbe). Közvetlenül étkezés után a keringésbe felszívódott aminosavak jelentékeny része a májba kerül,

y-glutamlltranszpeptidáz

glutation (GSH)

glutationszintetáz ATP y-g! utamilcisztein

~

. Gly .____cys-Giy peptidáz ,

glutamilcisztein-

ADP

P,

sz~Cys ATP

/

Glu 5-oxoprolináz ADP

P,

H2C - CH2

l O= C ATP

Hp

1/ H C

"-N/ " coo l

H 5-oxoprolin

2-175. ábra. A gamma-glutamil-ciklus

A NYAGCS ERE

Ml O AVAK A:\'

GCSERÉJE

)) ) ) )UH))))))}))))))>>>> )HUJ.)))))) H>)>> H ))o)>)))))))) n)))))) )))H))>))))»>>)))))))})))))))))))))) n)))))>)))))))\)))))))))))})))))\>)

kivéve a Gln-t és az elágazó láncú aminosavakat, amelyeket a máj kevésbé tud transzportálni. Ennek eredményeként a periféria aminosavtartalma "meggazdagszik" leuci nben, izoleucinben és valinban, így ez a " keverék" szolgáltatja az aminosavakat a többi szövetek, mint pl. az izom, a zsírszövet vagy az agy számára. Amíg közvetlenül a táplálkozás után a szabad aminosavak milyenségét és mennyiségét a bélben emésztett fehérjék határozzák meg, később a máj és az izom funkciói tartanak fenn egyensúlyi állapotot Posztabszorpciós fázisban, jóval az étkezés után, az izombóljóformán az összes aminosavféleség fe lszabadul és bekerül a keringésbe. Az izomból szabaddá vált aminosavak 50%-a A la és Gin. Az alan in a májon keresztül bekapcsolódik a szénhidrát-anyagcserébe és ott glukózzá alakulhat (lásd a 2.2. fejezetben). A7 aminosavak hepatocitákba törté nő fel vételérc különbözö transzportrendszerek alakultak ki (legkevesebb 7 ilyen rendszer ismert). Ezek ; ömmel Na--ft.iggö trans7portmechanizmusok, ki véve az aromás aminosavak (Tyr, Phe, Trp) é az elágazó láncú aminosavak (Leu, Ile, Val) felvételére szolgáló rendszerekeL amelyek nem igényelnek nátriumiont. A transzportok kinetikai paramétcrci általánosságban azt jelzik, hogy a felvétel nagymértékben ftigg a7 aminosavak vcna portae-ban lévő koncentd1ciójától, mert a fiziológiás aminoa' koncentrációk l mmol/1 alatt vannak. míg a KM-értékek néhány mmol/1tartományba esnek. Ezalól ki vétel a glutamát (amely legalább egy nagy ágrenddel kisebb koncentrációban is felvételre kerül) és a valin (amely e ll enkező l eg, egy nagyságrenddel magasabb vérplazma konccntrációt igényelne a hcpatocitákba törté nő hatékony felvételéhez). Az aminoavfelvételek folyamatát tovább bonyolítja, hogy a transzportrendszerek hom1onálil> (inzulin, glukagon, glukokortikoidok, thyreoid) szabályozás alatt is állnak és az, hogy patológiá folyamatok (pl. diabetes mcllitu. ) is befolyásolják. E7en mechanizmusok biokémiai alapjai még nem pontosan ismertek.

Az aminosavak ejtekbe történő transzportjának egy másik (meglehetősen speciális) mechanizmusa a gamma-glutamil-ciklus (2-1 75. ábra) . A ciklus lényege, hogy a redukált glutation (glutamil-ciszteinil-glicin; GSH) glutamil gammakarboxil-csoportja és egy transzportáJt aminosav aminocsoportja között kötés jön létre a sejtmembránban, és így egy külsö aminosav a sejt citoszoljába kerül, ahol aztán felszabadul. A ciklus további része a hidrolizált GSH reszintézisét szolgálja. Egy c iklus végbemeneteléhez 3 ATP szükséges. Az e l ső lépést kivéve az összes reakció a

227

citoszolban játszódik le. Így a ciklus egyrészt aminosavfelvételt szolgálhat, másrészt, ami még fontosabb, a ciklusban működö enzimek Glu, Cys és Gly jelenlétében g lutationszintézist eredményeznek.

Az endogén fehérjék lebontása A szervezet a saját febérjéit is degradálja; a proteinek fé lé letideje általában 30 perctől 150 óráig változhat. Az így felszabadult aminosavak a fehérj ék reszintéziséhez vagy energiatermelésre haszná lódnak fel. A különböző szövetek fehérjéi extracellulárisan és intracellulárisan is hidrolizálódhatnak. Az extracelluláris fehérjéket a szöveti proteázok (kollagenázok, a matrix metalloproteázok, a katepszinek egy része, az elasztáz) képesek emészteni. Eze n enzimek is zimogén forrnában szintetizálódnak elsősorba n makrofágokban és neutrofilekben. A prokollagenázokat, a prometalloproteázokat e lsősorban a plazmi n aktiválja (további részletekért lásd a 6.3 fejezetet).

A szöveti proteázok szerepet játszanak a sebgyógyulásban, a bakteriális invázióban, valamint a tumorinvázió és metasztázisképződés során. A sebgyógyuláshoz elkerülhetetlen a roncsolt szövetek eltávolítása, aminek egyik részfolyamata a károsodott fehérjék, pl. kollagének, elasztin emésztése. A baktériumok és a tumorsejtek is csak úgy képesek invázióra, ha a környező szövetek, elsősorban a kötőszöveti elemek, megemésztődnek. A fehérjék intracelluláris degradációja során a vérplazma glikoproteinjei és a sejten belüli fehérjék nagy része a lizoszomákban katepszinekkel degradálódik. Az intracelluláris proteolízisek receptormediált endocitózissal vagy A TP- ft.iggő fehérjeemésztéssei kapcsolt folyamatok . O Receptormediált endocitózis. A vérkeringésben

elöregedett fehérjéket a májsejtek felszínén található receptorok " ismerik" fel. Azok a vérplazma-glikoproteinek, melyek cukorvázának végén sziálsav van, nem vagy csak kis affi-

228

n )))U))))) )) )))) >> >) )) >,)>>) >>>> >> » ))))))))))>>)))))))))))) )) )))))))) >))))>)))))))))) )) )))) )))))))) )))))Jo)))))) )) ) ) )) )))))) )) )) ) >))))) >))))>>)>)))))) ))))))))))>UH>))))))

A~YAGCSERE

2-176. ábra. Az asziálglikoprotein receptor szerepe. A fehérje szénhidrátláncának végén lévő sziálsaval (Sia) az endothel felszínén lévő enzim, a szialáz távolítja el

endothelsejt Sia

l l szénhidrát l fehérje Gal

7idrát-fehérje

nitás al kötödnek a májsejtekhez. Ha a sziálsav lehasad az endothel felszínén lévő szialáz enzim hatá ára, asziálglikoproteinek keletkeznek, amelyeket a májsejtek felszínén lévő receptorok felismemek. Az így megkötött fehérjék endocitózissal a lizoszómákba kerülnek, ahol aminosavakra bomlanak (2-176. ábra). Így szabályozódik a vérplazma-proteinek nagy részének élettartama, mint pl. a protein hormonoké, a növekedési faktoroké, illetve így kerülnek lebontásra az antigén- antitest komplexek, a virusok és a toxinok egy része. 6 ATP:függő fehérjeemésztés. A sejten belüli rövid élettartamú proteinek, abnormális fehétjék (pl. fehérjeszintézisben bekövetkezett hibák) és kárcsodott fehérjék (pl. denaturált vagy részlege en proteolizált fehérjék) ubikvitinhez kötődve kerülnek degradációra. Az ubikvitin viszonylag kis molekulatömegü protein (8500 Da), amelynek C-terminális glicinjének karboxile oportja és a lebontásra kerülö fehérje egy lizinjének s-aminocsoportja kö- zött izopeptidkötés jön létre (2-177. ábra). Az ubikvitin e l őbb több lépésben (a részleteket az

ábrán nem tüntetjük fel) aktiválódik ATP-veJ és · SH-tartalmú enzimekkel. Ezután az ubikvitin enzimkomplex rioésztercsoportja reagál a "felismert" fehérje lizin s-aminocsoportjával és ubilevitin- protein komplex jön létre. A felszabadult enzimek (enzim-SR) további ubikvitinmolekulákat aktiválnak, míg a komplexet specifikus proteázok hidrolizálják.

Az aminosavak sorsa Az aminosavak anyagcseréje során több olyan általános reakció játszódik le, amely mind az aminosavak szintézisében és lebomlásában, mind a nitrogént tartalmazó molekulák képződésében (pl. nukleotidszintézis) szerepet játszik.

Glutamát-dehidrogenáz A glutamát központi helyet foglal el az aminosavak anyagcseréjében. A Glu keletkezésében, illetve lebontásában a transzaminázok mellett a

A UNO AVAK ANYAGCSER ÉJE

2-177. ábra. Az ubikvitin (UB) mű­ ködése

N-terminális

UB

/

ul

u

c

enzim-SH

o ll

UB - C-:> - enzim

~. \ )~Cte~n enzim-SH

N-terminális UB

Gly

~t •

-rNH - LC.'"~ \ proteázok

degradáció

l

aminosavak

glutamát-dehidrogenáz játssza a kulcsszerep et (2-178. ábra). Az enzim részt vesz mind a katabolikus, mind pedig az anabolikus folyamatokban; szarosan kapcsolódik a citrátciklushoz a elsősorban Mükődése később). (lásd szubsztrátok [G lu, a.-keto-glutarát, NH4+ és NAD(P)H] koncentrációjától függ. A glutamát fő­ leg akkor szintetizálódik, amikor a szervezet enervannak, giaraktárai "feltöltött" állapotban állapot yos energiahián az viszont ak lebomlásán kedvez. Meg kell még jegyezni, hogy bár a glutamát-dehidrogenáz által katalizált reakciók reverzibilisek, a baktériumokban és a növényekb en inkább az aminosavak szintézisét (a nitrogén beépülését) szolgálják, az állati-embe ri szervezetben pedig e l sősorban a nitrogénelimináció útját jelen-

tik.

Transzaminázok A glutamáttal történő reakciók egyik legjellemzőbb közös vonása, hogy különböző ketasavak transzaminálási reakciók révén a glutamát aminocsoportját átvehetik és így például oxálacetátból Asp és piruvátból Ala keletkezhe t A reakciókat transzami názok (aminotranszferázok) katalizálják (2- 179. ábra). Az enzimek működéséhez piridoxál- foszfát (a B 6-vitamin foszfátszármazéka) szükséges (2-180. ábra). A piridoxál-foszfát többféle kötéssel rögzül a fehérje szerkezetébe (ionos és hidrofób kölcsönhatások, H-hidak). Az enzim egyik Lys-je és a piridoxál-foszfát közőrt Schiff-bázis jön létre, amely könnyen helyettesíthető szabad aminosavval. Ezután az aminosav és a piridoxál-foszfát kö-

230

)))))))))))))>>>>~))))))))>>)U)J,))))).-,H))))))>>U>)))))U>>>•>>)))n)))))))>>>))))>)))))))>)))>)))))))))H>)))))))))))))))))))))))))>)))))Jh>>>>H))))))>))>))))))))))))>)

coo

NAO(P)H+H•

l

CH2

l

+ NH

CH2

l

ANYAGCSERE

2-178. ábra. Az ammónia beépülése a -keloglutarátba és glutamátba

NAD(Pr

"'--/

+ HP

glutamátdehidrogenáz

C= O

tooa.-ketoglutarát

ATP

o

glutaminszinteláz

ll

C - 1\JH

l

CH2

l

ADP

CH2

P;

l

H - C - NH

tooGin

2-179. ábra. A leggyako-

coo-

cooAsp

l

l

CH2

CH2

l

C= O

l

l

coo-

coo

coo-

coo-

l

l

CH2

l

a-ketoglutarát

CH2

transzaminázok

CH2

l

C= O

l

coo-

H-

l Cl

NH 3

coo·

CH3

Ala

G lu

CH2

H-

l

l Cl

oxálacetát

l

H - C - NH

CH3

l

+

NH

coo-

3

C= O

l coo-

piruvát

ribb transzaminálási reakciók. A glutamát-o.-ketoglutarát átalakulás általában központi szerepet játszik a transzaminálásokban. A transzaminázok (amino-transzferázok) specifikusak az egyes aminosavakra

AMJNO AVAI< ANYAGC ERÉJE

)~))))o))))~) ~H>)))))}))))))))))})))))))))))))))))))>)))))}))))>))))))))))))))))))))))>)))))))))))))~))) )J)) H>))))))))))))))))>))))

H))))))

231

Schiff-bázis van der Waals kötések

+ NH3

+

NH3

l

R -c- coo 2

~

l

H '

E

/

C:-H

Lys

N

l

transzaminéz

{"

l cooR - cl

aldimin

l

R- c - coo-

(E)

l

H

ketosav

H/

/Lys~

Lys~

E

E

..

piridoxaminfoszfát

(\

CH N

ketimin

ll

R - C - COO

ketosav

2-180. ábra. A transzaminázok müködése. Az ábra az enzimműködéséért felelős szerkezeti részt mutatja. Az enzimen belüli piridoxál-foszfát és lizin közötti Schitt-bázis szabad aminosav (Rd jelenlétében elbomlik és az aminosav lép reakcióba a piridoxál-foszfáttal. Molekuláris átrendezödések után a ketamin hidrolizál R 1-ketosav keletkezik, mig az aminocsoport a piridoxál-foszfáton marad (piridoxamin-foszfát). A reakciósorozat reverzibilis és egy másik ketosav (R2-) magas koncentrációja eselén visszafelé játszódik le Rr aminosavat eredményezve

zött létrejött kötések átrendeződnek, végü l hidrolízis során piridoxamin-fosz fát jön létre, és az aminosavból keletkezett ketosav (R 1) leválik az enzi mrőL Ha egy másik ketosav (R2) magas koncentrációban van jelen, akkor a reakciósor el indul az ellenkező irányba, és az enzim piridoxamin-foszfátjához kötött aminocsoport átkerül a ketosavra. A reakciók végén az Rr csoportot tartalmazó aminosav szabaddá válile Ezzel a transzamináJási ciklus lezárul (lásd 2- 180. ábra). A végső

eredmény egy aminocsoport ki cserélődése: egy aminosavból ketosav és egy másik ketosavból aminosav keletkezik. A transzaminálással kapcsolatban nagyon kevés anyagcserezavar ismert, minden bizonnyal azért, mert a transzaminázok teljes hiánya nem egyeztethető össze az élettel. Figyelemreméltó még, hogy az aminotranszferázo knak klinikai

r

232

H)))))))))) ••

•> )))))) )))) )))~)))) )))))))))))))))))))) )) )))))))))) )))))))))))))))))))) ••)))))))))))))))))))))) )) ) J)))))))))))))))))))))) )))))))))J))))))))))))))))))))))))))))

diagnosztikai jelentőségük is van (SGOT vagy ASAT, szérum-glutaminsav-oxálecetsavtranszamináz, aszpartát-amino-transzferáz; SGPT vagy ALAT szérum-glutaminsavpiroszöJősav-transzamináz , alanin-aminotranszferáz). Különbözö szövetek károsodása során az elhalt sejtekböJ nagyobb mennyiségben szabadulnak fel és így koncentrációjuk megemelkedjk a vérkeringésben. Egyéb enzimaktivitások változásától függően diagnosztikus értéket jelent- betnek elsősorban myocardialis infarctusban és toxikus májkárosodásbao. Továbbá terápiásarr is felhasználhatók: esszenciális aminosavakból képzett ketasavak bevitelekor aszö-vetekben nonnálisan jelen lévő transzaminázok esszenciális aminosavakat produkálnak a felesleges ammónia felhasználásával. A reakció egyszerre jelent esszenciális aminosav pótlást és amrnóniamentesitést. A kezelésnek főleg vese- és májbetegségekben lehet lé~ogosultsága (lásd az aminosavkatabolizmust is).

Egy szénatomos csoportok transzfer reakciói Az egy szénatomos " töredékekre" az aminosavak anyagcseréjén kivül szükség v~n még a nitrogéntartalmú specifikus funkciót ellátó molekulák keletkezéséhez, a nukleotidek szintéziséhez és a makromolekulák posztszintetikus módosulásához. Az egy szénatomos töredékeket a tetrahidrafalát és az S-adenozil-metionin rendszer szolgáltatja. A tetrahidrofolát az egy szénatomos csoportokat, amelyeket elsősorban szerintől és hisztidintől kap, az N5 és NlO-hez kapcsolva szállítja {2-181. ábra). A szénalom redukáltsági állapotától függő­ en lehet metil (-CH3) , metilén (-CH2- ), fonnil (-CHO), formjmino (-CHNH) vagy metenil (-CH=). A legoxidáltabb formát (C02) a biotin szállí~a, míg a legredukáltabbat (- CH3) elsősorban az S-adenozil-metionin. A különböző redukáltsági fokú szénatomtöredékek egymásba átalakulhatnak, igy ezek donor és akceptor szerepeket is játszhatnak. Nemcsak a szénatomtöredék, hanem magának a folsav pteridingyűrűjének a redukáltsági foka is változhat.

/\N yAGcs ERE

A folsav a táplálékkal történő felvétel után az emberi szervezetben két lépésben redukálódik dihidrofolát-reduktázzal, először dihidrofolát, majd tetrahidrofolát keletkezik (a négy hidrogén a C7 és N8, majd C6 és N5 atomokra kerül a pteridingyürűben, lásd a 2-181. ábrát).

Folsavhiány a "harmadik világ" legáltalánosabb vitaminelégtelensége, de előfordulhat terhesség kapcsán és bizonyos betegségek folytán jóléti társadalmakban is (lásd még a 2.5. fejezetet).

Az S-adenozil-metionin a legjelentösebb metilcsoportdonor. Ezen funkciója mellett a homocisztein szintézisében is részt vesz, amely a Cys szintézis egyik komponense. A két folyamat az aktivált metilciklusban szarosan kapcsolódik, és maga a ciklus a tetrahidrofolát-rendszcrrel is társul (2-182. ábra). A tetrahidrafalát és az aktivált metilciklus között 8 12-vitaminnal működő enzim tartja a kapcsolatot. Az S-adenozil-metionin metildonor szerepét az teszi lehetövé, hogy az S-adenozil-metionin keletkezésével a metionin kénatomja, valamint az adenozin C5 atomja között történő reakció során, a kénatomhoz kapcsolódó rnetilcsoport kötéserőssé­ ge csökken. Ha megfelelő akceptor van jelen, akkor a metilcsoport arra átkerül, azok metilezését eredményezve. Ilyen lehet például a DNS, a rRNS, a tRNS, a noradrenalin, a foszfatidil-etanolamin, a kemotaktikus protein és még számos egyéb molekula.

A nem esszenciális aminosavak bioszintézise A Tyr kivételével a nem esszenciális aminosavak bioszintézise a citrátkörhöz, illetve a glikolízishez kapcsolódik és a glutamát centrális szerepet játszik a folyamatokban (2-183. ábra). Glutamát szénváza szükséges a Pro, Arg, Gin szintéziséhez, arninacsoportja pedig az Ala, Asp és az Asn szintéziséhez. A Pro és Arg szintézisében közös intermedier a glutamát-gamma-szemialdehid (Glu-ból történő szintézishez ATP és

AMI NOSAVAK

NYAGCSERÉJE

) ) )))))))>)))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

pteridin

fol át

HN~~~' ~ l )~C H 2

p-am1no~

1

N~

~N OH

CH2 lc N

glutamát

benzoát

?

0

4

233

//

/

~

o

coo·

ll

l

C - N - C - CH - CH

l

l

NADPH + H + ~

l

2

2

- coo·

H H

H

.-/l

NADP+

dihidrofolát-reduktáz

NADPH +H+ ~ NADP+

.-/l

NADH+ H+ NAD+

Gly

Ser

.V.'fi ~~

HC 2

N~

Hp

.V. 'fi CH

3

Nl ~

H

tetrahidrafalát (THF}

ATP

ADP+

~~ormiát

P, ~

r= O

o

"~~

l

H

110

Nl O-C-H

" 5+~

~

H-C

110

N-

10

N -formii-THF

2-181 . ábra. Különböző redukáltsági fokú folsavszármazékok. A folsav három fő alkotórésze a pteridinváz, a p-aminobenzoát és a glutamát. A folsava t a dihidrofolát-reduktáz két lépésben redukálja. A tetrahidrafo/át különböző mértékben redukált C1töredékei egymásba átalakulhatnak

234

ANYAGCSERE

coo

l + H N - C- H 3

:r) ~

l

CH2

l

CH2

P, P,

\t

s l

N

CH

akceptor

N

N

!

CH2

ATP

S-adenozil-metionin transzteráz

coo+

HN3

l Cl

+

H

5

N -metii-THF

"11

CH2

l

CH2

l

S Met

CH

CH

+

táplálék

H N- C - H 3

l

CH2

3

CH2

l

CH2

N-

l

l

homocisztein- H metiltranszferáz

cool

H N-

coo l C- H l

S - adenozin

S-adenozil-homocisztein

F

HP z

adenozin

l

CH2

l

SH homocisztein

2-182. ábra. Az aktivált metilciklus. Ametilcsoport átadása után az S-adenozil-metioninból S-adenozil-homocisztein keletkezik, majd hidro/ízist követően adenozin levá/ása után homocisztein marad vissza. A homocisztein felhasználódhat ciszteinszintézisre, de a ciklusban metilcsoportot vesz fel, amelyet metil-tetrahidrofolát szolgáltat és így metionin keletkezik. Az utóbbi reakciói egy Btr vitamin kofaktort tartalmazó enzim, a homocisztein-metiltranszferáz katalizálja (metionin-szintáz) (ennek jelentőségél lásd később, illetve a 2.5. fejezetben). A Met-böl ATP jelenlétében S-adenozil-metionin képződik és ezzel a ciklus záródik

~

AMINOSAVAK ANYAGCSER ÉJ E

)))) )) )) )))))))>)))) ))))))))

» )))))))) ~> ))))))))))»)U) •>>>))~t>»> )))U)))>)>) >H) ) ))))))))))) H))H H)))) >UH)>>>>>))>)>))))))>>)J)>>H>

235

glukóz

+ ~

+ + 3-foszfoglicerát ~ ~

~

piTá'

acetil-GoA

j Asp f

Phe* ----+!_ Tyr

oxálacetát transzaminálás

~ lCys J

Met*

citrát

l

( szukcinii-CoA

J

l

o.-ketoglutarát

~

transzaminálás

~@6]

.

~-....

[ Pro

l

~

Arg

l

2·183. ábra. A nem esszenciális aminosavak bioszintézisének kapcsolata a szénhidrát-anyagcserével. *A szintézishez két esszenciális aminosav is szükséges

NADPH szükséges), amelyből két lépésben Pro keletkezhet vagy ornitin egy újabb G lu részvételével (2-184. ábra). Az ornitinből Arg keletkezhet A Pro és Arg katabolizmus köztitennékei sok vonatkozásban megegyeznek a szintézis intermedierjeivel, a lebontási reakciósor Glu-t eredményez. A nem esszenciális aminosavak közül a Gln bioszintézise G lu-ból történik (a glutami n-szintetáz ammónia és ATP fe lhaszná lásával müködik, Lásd a 2-178. ábrát).

Az enzim a központi idegrendszerben is megtalálható és szerepet játszhat az ammónia agyi károsító hatásának csökkentésében (lásd még az aminosavkataboi izmus! is).

Az aszpartátból. tö rténő aszparaginszintézishez, az eddigiektől eltérően nem Glu, hanem Gln szalgáltatja az am idcsoportot humán sejtekben. A tirozin fenilalaninból (esszenciális aminosav) szintetizálódik a fenilalanin-hidroxiláz katalízisével (2- 185. ábra). A reakció oxigént és tetra-

236

ANYAGCSERE

Glu

ATP :?lglutamát-szemialdehid szintetáz

ADP y-glutamii-P genáz

NADP

NADPH+ H+: ? l y-glutamát-szemialdehid szintetáz NADP+ + P; a-keto~H Glu glutarát

o~ H/

1

3

_

C - CH2 -CH2 -CH -COO glutamát-y-szarnialdehid

"'--

~

J

aminotranszteráz

., H N - CH

t

NH3 CH2 -

l

CH2 - CH- COO omiti n

l

( orni~ H2C - CH2 / HC ~

"

CH- Coo·

"-+/

N H pirrolin-5-karboxilát

l arg1nin

NADPH+H+/ 1 p1rro . l'ln- 5- karbox1'lat' NADP+

reduktáz

2-184. ábra. A proli n és az arginin bioszintézise. A glutamát szemialdehid keletkezése két lépésbenjátszódik le. A szintetáz enzim elöször foszfátcsoportot transzferál A TP-ról a glutamát y-karboxi/-csoportjára, majd az aktivált karboxiicsoportot redukálja aldehiddé. Ezután az aldehid a primer aminnal (o.-amino-csoport) addicianál egyidejű H 20-eliminációva/. Ez utóbbi nem igényel enzimkatalizist. A prolinszintézis utolsó lépése a pirrolingyürü redukciója. A profin lebontása glutamáttá a y-g/utamil-P kivételével azonos közti termékeket eredményez, az enzimek és kofaktorok viszont eltéröek a szintézisben résztvevöktöl. Az argininszintézis irányába elöször ornitin keletkezik transzaminálással kapcsolt reakció során, amikor glutamát a.-ketoglutaráttá alakul (a transzaminázt ornitin-aminotranszferáznak nevezik). A reakció megfordítható, lehetövé téve prolin~omitin átalakulásokat. Az ornitin---targinin de novo szintézis az ornitincik/usban valósul meg

~

AMI~O AVAK ANYAGCSERÉJ E

)))) )) )) )) ))))))))))))>)))))>) )~ )) )) )))) >))) ) ) )) )))) )) )))) )) )))))))) )) >)))))))))H))))))))))))))))) )>) t))))))) U))>>>)~>>))>>>))))))))))))))

23 7

C fTH B fenilalanin-hidr oxiláz H20

DHB

coo +

l l

H N - C- H 3

CH2

Tyr

OH

O

H

H "~N) R l l

H,N~~N N

dihidrobiopteri n-

reduktáz

H NADPH+H+

l

H tetrahidrobiopt erin (THB)

H dihidrobiopterin (DHB)

2·185. ábra. A tirozin bioszintézise. A tetrahidrobiopterint (THB) és a dihidrobiopterint (OHB) az irodalomban BH4, illetve BH 2 formában is rövidítik

hidrobiopter int (THB) igényel. A THB-ből dihidrobiopterin (DHB) keletkezik, amely visszaredukálódhat NADPH-va l THB-vé dihidrobiopterin-reduktáz közrernüködésével.

Akár a fenilalanin-hidroxiláz, akár a dihidropteridin-reduktáz defektusa vagy a THB hiánya fenilalanin anyage erezavaráheL (phenylketonuria) vezethet (lásd az aminosavak kataboi izmusánál).

A G ly és Cys szintéziséhez Ser szükséges. A Ser származhat a táplálékból, hisz bőségesen fordul elő benne, de képzödbet a 3-foszfoglice rátból, illetve G ly-ból is (2-186. ábra). Aszerin fontos kiindulási anyag több más vegyület szintéziséhez; így Gly és Cys mellett, etanolamin, betain, kolin, szerin-foszfatidok, szfingozin is keletkezhet belő­ le. A Gly szerioből történő szintéziséhez tetrahidrofolát (THF) szükséges; a reakciót szerin-

238

Al'IJYAGCSERE

2-186. ábra. Aszerin bioszintézise

3-foszfoglicerát

3-foszfohidroxi-piru vát v - - viU

['---.. o.-ketoglutarát

Ser

3-foszfoszerin

2-187. ábra. A glicin bioszintézise

Ser THF

szerin-hidroximetil-transzferéz

glicinhasító

NAD+

? .

H2 0

Gly

NADH + H...

"-_enz;~

7

THF

s

.. 10

+ NH4

+

HC03

.

N , N -met1lén-THF

o.-ketoglutarát oxidáz G lu

cool C= O l H

glioxalát

NADt

NADH + H+

~L

yoo·

1

~ oxalát

AMI 'OSA VA KANYAGC ERÉJE

))))))))))))))))))))))))))))~)))))))))))))))))))))))))>)>)U)))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))H))))))))U))U)}))H))Hn>)))))))))H

239

a kcióval keletkezik a G ly (2- 187. ábra). A máj ban működő g licin-transzamináz defektusakor a glioxi látbó l nem keletkezik G ly, és a glioxilá t eloxidálódik oxaláttá, amely rosszul oldódi k és a vesében kicsapódhat (hyperoxaluria; vesekő­

hidroximetil-transzferáz katalizálja, amelynek során a Ser hidroxilcsoportja víz formájában távozik és a ~-szénatom metilén formájában a THF-ra tevődik át (2-187. ábra). A Gly-szintézis történhet HC03- - és NH/ -ból is; a reakciót a glicin-szintáz katalizálja NADH és metilén-THF jelenlétében növényi és bakteriáli s sejtekben. Ál lati szervezetekben a glicinhasító enzim elsősorban a Gly lebontását szolgálja, aktivitása sokszorosára nőhet éhezéskor (glukagon hatására).

képződés).

A szerin kondenzálódhat homociszteinnel is, ilyenkor cisztationin intermedieren keresztül cisztein és a -ketobutirát keletkezik (2- J88. ábra). A kétlépéses reakciót a cisztationin-szintáz és a cisztationin-liáz katalizálja.

Utóbbi defektusa cystationinuriához vezethet, míg a kondenzáló enzim elégtelen műkö-

Glicin szintetizálódhat még ko linból vagy etano la minból is. Az utóbb i jelentő égét orvosi s.~;empon tb61 az adja, hogy a bioszintézis utolsó lépésében g lioxi látból transzaminálási re-

2-188. ábra. A cisztei n bioszintézise. A homocisztein esszenciális aminosavbó/* (Met) szintetizálódik (lásd a 2-182. ábrát is)

\

homocisztein

Se r +NH

H

..OOC - Cl -

H

CH - CH - S

l

2

2

l

+

l

t NH3

H

o +

N~

H

l l

l l

-

-OOC - C - CH - CH - S- CH - C - COO 2

2

+NH3

2

H cisztationin

cisztationin-liáz

+

NH~

a.-ketobutirát

Cys

3

HO ~ CH 2 -C - COO~

ANYAGCSERE

dése homocisztein felhalmozódását eredményez heti. A vér emelkedett homociszteinszint je károsílja a trombomodulint (lásd 6.5. fejezet), amely thrombosist vált ki és a fokozott mértékben ki választásra kerülö homocisztein a oxidálódik homocisztinné vizeletben (homocystinuria). A poszttranszláció során módosult aminosavak szintézisét az orvosi szempontból releváns fejezetben tárgyalj uk, így a hidroxi-prolin és hidroxi-Iizin a 6.3., míg a gamma-karboxigl utaminsav a 6.5. fejezetben található meg.

Az aminosavak átalakulásai Az aminosavak felvétele és szintézise normál körülmények között egyensúlyt tart felhasználásukkal (fehérjeszintézis és nitrogéntartalmú biológiailag aktív molekulák képződése) és lebontásukkal ( energiaszolgáltatás). Az aminosavak katabolizmusáról általánosságban e lmondbatjuk, hogy az a-amino-csoportb ól ammónia keletkezik, a szénváz pedig a citrátcikl us ba kerül. A nitrogén sorsa

A legtöbb aminosav degradációjánál az első lépés a nitrogén eltávolitása. Ez történhet direkt, oxidatív dezaminálással, amikor ammónia kelet-

kezik, de leggyakrabban transzaminálással kezdődik és a közös intermedier a glutamát, amely a glutamát-dehidrog enázzal dezaminálódik (2- J89. ábra). A reakciók végeredményekén t Glu-ból ammónia és a-ketoglutarát keletkezik (transz-dezaminálás). Ammónia keletkezhet még a glutamin amidjából is; a glutamináz által katalizált hidrolízis során glutamát marad vissza. A szerin, a hisztidin és a treonin direkt dezamináJódhat dehidratázok katalízisével, amikor is szabad ammónia keletkezik. A fent leírt folyamatok elsősor­ ban a májban játszódnak le. Dezaminálás történhet azonban a vesében is. Az aminosavakból a-ketosavak keletkeznek és ammónia szabadul fel. A reakciót az -aminosav-oxidáz ok katalizálják, amelyek koenzime flavin-mononukle otid (FMN). A keletkezett FMNH2-t molekuláris oxigén oxidálja hidrogén-peroxidd á, amelyet végü l kataláz bont vízre és oxigénre. A vesében történő oxidatív dezaminálás lassú reakció és így az aminosavak katabolizmusa szempontjából kisebb jelentőségű. Az ammónia rendkívül fontos a szervezet számára, hisz nélküle nem történik nukleotidés aminosavszintézis és nem keletkezhetnek egyéb nitrogéntartalmú vegyületek. Az ammónia, más oldalról nézve viszont rendkívül toxikus, elsősorban a központi idegrendszer számára (hatásának pontos biokémiai mechanizmusa még nem ismert). Emelkedett vérplazmaszinlje hallucinác iót, tremort, zavartságat okoz, súlyos májbetegségekben pedig comát, majd halált eredményez.

aminosav

ketosav

2-189. ábra. Az aminosavak transzamlnálása és dezaminálása A bélből nagy mennyiségü ammónia kerül a vérkeringésbe

A~ILO AVAKANYAGC ERÉJE

)))) H H)) U ))))>)>>>>>>>>>»UUUU>

A központi idegrendszer működése közben folyamatosan képződik ammónia. Normál körülmények között ez a NH 4+ a glutamin-szintetáz katalízisével glutamint képez, amely a keringéssei a májba juthat.

Az ammónia eliminációja

Az emberi szervezet legfobb forrásai: Oa

zabad arnmániájának

•>>> ))))))))))))'))>)>U>>>))))))))>»>>>)) )>)) H n

H)))))))))))>))))>~)))) >)>• >})) >)}> ))))n )l

H)>H)

24 f

Az omitinciklus (,,ureaciklus'') Az ammón iaelimináció legjelentősebb útja az ornitinciklus, amelynek lényege, hogy ammóniából, bikarbonátból és aszpartátból urea szintetizálódik. A reakciók elinditásában, mint láttuk az előzőekben (2-189. ábra), kulcsszerepet játszik a g lutamát. A k:ülönböző aminosavak degradációjakor felszabaduló amrnóniát a g lutamát-dehidrogenáz az ornitinciklus számára teszi hozzáférhetővé. Az omitinciklus és az ureaszintézis teljes enzimrendszere csak a májban működik. A reakció lényege:

bélből történő

NH 3 közvetlen fel szívódása (főleg enterális baktériumok terméke; az összes szabad ammónia közel 40%-át alkotja), 6 különböző sejtek aminosavdegradác iójából származó ammónia, illetve a glutamát-dehidrogenáz által szolgáltatott N~. . . Ahogy már említettük, a szervezet számára létfontosságú a vérplazma-ammón iakoncentráció normál szinten tartása (<50 J..lmol/1). Erre több lehetőség is adódilc: O A máj az ammóniából ureát szintetizál, amelyet el sősorban a vese választ ki (az urea egy része azonban a bélbe kerül, ahol a baktériumok ureáza elbontja és az ammónia újra a vena portae-ba jut). 6 Az amrnóniából és a g lutamátból a májban is glutamin keletkezhet a pericentrális hepatocitákban, amikor a periportális hepatociták nem tudják kiszűmi a bélből felszívódott ammóniát. A reakcióta glutamin-szintetá z katalizálja, melynek KM-értéke ammóniára 180 )..lmol/1, glutamátra 5 mmol/1; tehát hatékony működésének előfeltétele a relatív magas szabadglutamát-koncentráció. A G in azután mint nem toxikus vegyület az ammónia szervek közötti transzportjában vesz részt (pl. májból vesébe). O A vese képes mind szabad ami nosavakat, mind ammóniát direkt is kiválasztani a vizeleten keresztül. O Nitrogéneltávolítást és így ammóniaterhelés csökkenését jelenti a kreatinin ürítése is. 0 A húgysav üritése pedig az ammóniaeltávolítás közvetett módja.

NH4 + + HC03 - + 3 ATP + 2H2 0 + Asp ~ urea + 2ADP + 2Pi + AMP + PPi + fumarát Tehát az ammónia eliminációjához aszpartátra és bikarbonátra van szükség. Az om itinciklus első reakc iója a karbamil-foszfát szintézise a mitokondriumban történik (2- 190. ábra). A reakciót a karbamil-foszfát- szintetáz katalizálja. A z NHr ból és HC03--ból keletkező karbamilcsoport és az ATP által szolgáltatott foszfátcsoport között nagy energiájú anhidridkötés alakul ki , amely biztosítja a további reakció energiaigényét Az így keletkezett karbamil-foszfát szintézise és lokalizációja e ltér a nukleotidek szintéziséhez szükséges karbamil-foszfát keletkezésétől. A nukleotid-anyagcsere során képződő karbamil-foszfát nitrogénje glutaminból származik és az enzim a citoszolba n talá lható (lásd még a 2.5. fejezetet is). Meg kell még jegyeznünk, hogy az ureaszintézis karbamilfoszfát-szintetáza nem NRt+-t, hanem NHr t használ szubsztrátként, vagyis a reakció egy proton leadásával kezdődik (ezt nem tüntettük fel az 2- 190. ábrán). Az ornitinciklus második reakciója egy transzfer, amelynek során o mitinbő l és karbamil-foszfátb ól citrullin keletkezik az ornitin-transzkar bamiláz jelenlétében. A citrullin ezután transzport folyamattal e lhagyja a mitokondriumot és a citoplazmában aszpartáttal kondenzálódik, a reakciót az argininoszukciná t-szintetáz katalizálja. A reakció nem megforditható mert az energiát szolgáltató A TP ~ AMP átalakulás után a pirofoszfátot a pirofoszfatáz elbontja. A termék, az argininoszukcinát-liázjele nlétében, fumarátra és argininre bomlile A reakciók eddig az arginin szintéziseként

2~2

)))) )) )) )) U )io)) ))))H)))) )l))>)))>))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))l) ))>H)))))))))))))>))))))))))))) >U>))))))))))))))))))))))))

n )l H))))>)))>))))))))))))) )l)))~)))) U

ANYAGCSERE

2ATP

~arbamil-foszfát-szintetáz

!-!CO

......---..~ 2ADP + P1

o

o

ll

ll o· - Pl -

0-C-NH ?

o·

karbamil-foszfát

ornitintranszkarbamiláz

mitokondrium citoszol

vese

\

citrullin vér

\

argininoszukcinátszintetáz

urea

coo·

+ l HN- C- H

l

3

(CHJ3

Arg

l

..-

NH

coo-

+ l H N- C- H

l

3

l

(CH2h

H2 N =C- NH2

l

coo·

NH

+

l

l l

H

CH2

l

H N = C- N -LC- H ?

l

coo· argininoszukcinát

coo· l

H- C

ll

C- H

l

·ooc fumarát

2-190. ábra. Az ornitinciklus

A~li~O AVA K A 'YAGCSER ÉJ E

243

is felfoghatók. Az arginin ezután argináz jelenlétében ureára és ornitinre hidrolizáL Ezen lépés jelenti lényegében az urea szintézisét, vagyis két molekula ammónia eliminációját Érdemes megjegyeznünk, hogy bár az urea két arninccsoport ja többféle aminosavból származ hat, azok glutamátorr és aszpartátoD keresztül kerülnek az ornitinciklusba. Az urea ezután a citoszolból a vérkeringésbe kerül, majd a vese kiválasztja. A vizeletben ürülő nitrogén 86%-át az urea szolgáltatja, míg a többit a kreatinin, ammónja, urát és egyéb. Az omitin ezután a citoplazmábó l visszakerül a mitokondriumba, és ott egy újabb citrullinszintézisben vesz részt. Ezzel a lépéssei zárul a ciklus, s mint látható, az ornitin hasonló szerepet tölt be az omitinciklusb an, mint az oxálecetsav a citrátkörben. Az arginin azonban nem feltétlenül alakul át ureává, hanem felhaszná lódhat más reakciókra is a szervezetben. Ilyenkor a ciklus működéséhez (az ammónia eltávolításáboz) azornitint de novo szintetizálni kell. Az ornitin glutamátból történő szintézise azonban lassú, aminek eredményeké nt, ba a ciklus argininszintézisre (nem ureaszintézisr e) használódik, csak akkor e légséges az argininszükséglet fedezésére, ha a szervezetben nem folyik gyors fehérjeszintéz is. Ezért terhességben vagy például növekedésben az arginint a táplálékkal kell biztosítani (szemiesszenciális).

2-191. ábra. Az ornitincildus a citrátkörhöz kapcsolódik. PEP: foszfoenolpiruvát. Az ábra könnyebb áttekinthetősége céljából nem tüntetjük fel, hogy az oxálacetát maláttranszporttal kerül a mitokondriumból a citoplazmába (lásd a 2.2. fejezetet)

Azzal, hogy az ureaszintézish ez aszpartátra van szükség, az ornitinciklus szorosan kapcsolódik a citrátciklushoz, mert az aszpartátot az oxál-acetát glutamáttal történő transzaminálá sa szelgáltatja (2-191. ábra). Minthogy lebornlásuk során a többi aminosav is bekerülhet a citrátkörbe, éhezés következtében nemcsak a G lu és Asp, hanem egyéb aminosavak is felelősek lehetnek az ornitinciklus fenntartásáért.

Az ureaszintézis szabályozása Az urea szintézisének semmiféle direkt feedback szabályozása nem ismert (csak nagyon magas ureakoncentrá ció - ami uraemiában fordulhat e l ő ­ gátolja az argininoszukcinát-liázt). Mégis, akkor mi szabályozza az urea és a vérplazma ammóniaszintjét? Enzimológiai lag az ornitincikl us reakcióiközü la leglassúbba karbamil-fosz fát képződése, vagyis ez a sebesség meghatározó reakció, amelyet a karbamil-fos zfát-szintetáz katalizál. Tehát az enzim aktivitását befolyásoló tényezők szabályozhatják az ornitinciklust és így az ammónia eliminációját Az omitinciklus nyilvánvaló szubsztrátjai az ammónia, a bikarbonát és az aszpartát Ezek a vegyületek azonban in vivo nem jelentik az ureaszintézis kezdetét, ru sz ezek az ami-

glukóz

+ l l

i rué;;;:

i/\ PEP

arnitinciklus

1 urea

acetil-GoA

244

))))•>}))))) )))))) H>))))))) tH • J) U))~U))) n)))) U l ) H))>U>))))))))))))))))>)))))))))>>))))))))))))))))>)))))))H)))))))))))))))H)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

nosavak degradációjának közti termékei. Vagyis az omitinciklus egyik szabályozási lehetősége, az runmánia mennyiségének változása, ami fiigg az aminosavak mennyiségétöl (proteolízis és transzportfolyamatoktól és azok szabályozásától), illetve az aminosavszintézis és -degradáció arányátóL Ami a karbamil-foszfát-szintetáz aktivitását módosító faktorokat illeti, a legismertebb az N-acetil-glutamá t, amely a karbamil-foszfátszintetáz allosztérikus aktivátora. Az enzim maximálisan aktív, ha l mol enzimhez l rnol aktivátor kötődik. Az N-acetil-glutamát nemcsak a karbamil-foszfát-szintetáz aktivátora, hanem a glutaminázé is (2- 192. ábra). Az N-acetilglutamát glutamátból szintetizálódik: Glu + Acetil-CoA ~ N-acetil-Glu + HS-CoA A reakciót a mitokondriális N-acetil-glutamát-

ANYAGCSERE

szintetáz katalizálja. Az N-acetil-glutamát koncentrációja függ az arginin koncentrációjától is, rnert az N-acetil-glutamát-szintetáz egyik legbatásosabb aktívátora az arginin. Már l O J.lll10l!l argininkoncentrációnál az enzim maximálisan rnüködik. Mi történik tehát, ha pl. az NH4+ koncentrációja megnő? A magasabb szubsztrátkoncentráció következtében több glutamát, N-acetil-glutamát és glutamin képződik (lásd a 2-192. ábrát). A magasabb N-acetil-glutamát-koncentr áció növeli a karbarnil-foszfát-szintetáz aktivitását, arninek eredményeként több a1nmónia alakul át ureává (felgyorsult ureaszintézis). A fokozott omitinciklushoz megnövekedett Asp-fogyasztás társul és ez ugyancsak az NH4 - -csökkenés irányába hat. Végeredményként az ammóniaszint visszaáll eredeti értékére.

2-192. ábra. Az N-acetil-glutamát hatásai

a..- keto-glutarát 4

glutamát~ dehidrogenáz

.,

..,...,---

HcoJ·\

(

2ATP

/'

/

fG karbamil-foszfátszintetáz

..

4

etu-grutamat

TooCH2

l

CH2

O

l ll H - C - NH - C -CH l 3 coo-

o· o-- pl o"

o ll

Asp

0 - C-NH 2

karbamil-foszfát urea

AMINOSAVAK ANYAGCSERÉJE

Bár az ureaszintézis teljes enzimrendszere csak a májban müködik, az omitinciklus egyes enzimei megtalálhatók más szövetféleségekben is. Nacetil-glutamát-szintetáz, karbamil-foszfát-szintetáz és ornitin-karbamil-transzferáz a vékonybél mucosájában citruBin szintézisét teszi lehetövé az ' argininoszukcinát-szintetáz és -liáz a vesében citrullinból arginint készít, az argináz jelenléte pedig különbözö sejtféleségekben omitin szintéziséhez vezet, amelyből poliaminok keletkezhetnek. Az argininből két lépésben citruBin is keletkezbet, miközben nitrogén-manoxid (NO) szintetizálódik. Az utóbbi reakcióút elsősorban az endothelsejtekben, a makrofágokban és az idegrendszerben játszódik le. A különböző utak egymással kapcsolódhatnak (2-193. ábra).

Az ornitinciklus fenntartása létfontosságú, hiánya nem egyeztethető össze az élettel. Így az ornítinciklus enzimdefektusait illetően csak részleges blokkokkal (például egy enzim KMvátozása) találkozhatunk. A különbözö enzimek defektusait különböző nevekkel illetik (l és ll típusú hyperammonaemia, citrullinuria, argininosuccinaturia, hyperargininaemia, argíninuria stb., attól függöen, hogy az ureaciklus melyik intermediere halmozódik fel nagyobb mértékben). A defektusok legjellemzőbb közös megnyilvánulása a vér és a liquor ammóniakoncentrációjának emelkedése és a jellegzetes klinikai tünetek megjelenése (hányás, görcsök, letargia, később krónikus fázisban EEG-elváltozások ' mentális retardáció). Kezelésként fehérjeszegény diétára van szükség, illetve az esszenciális aminosavaknak megfelelő ketcsavak szervezetbe juttatására; ezek transzaminálása csökkenti az ammóniaterhelést és pótolja az esszenciális aminosav hiányát.

2-193. ábra. Az ornitinciklus egyes reakcióinak előfor­ dulása különbözö szövetekben

·--e-í~~ < NO~ citruli~

Arg

Arg

~-

7

endothelsejtek, makrofágok, idegsejtek

NO

r:~ /

,

\ ornitin

~ KÜLÖNBÖZÖ SZÖVETEK

246

H,,..~,>>>»,, »n>> n»>>>>>>",,>H>>>»>H>>>»>>>>»»,",>>>>>>»»>H»H>>>>»H>>>»»>>»>>>))n>>>>>»»»n>>»»>>>>>>>>>>»>»H»>>>>»»>»>>>»>>>»>>>>»>)>>

Az aminosavak szénláncának sorsa és az aminosavakból képződő nitrogéntartalmú vegyületek

humán szervezetben a szerin elsősorban glicinné alakul áttetrahidrofolátjelenlétében (2-187. ábra). A glicin több speciális molekula szintézisében is részt vehet, így szükséges a glutation, a krea6n, a purinváz, a konjugált epesavak és a hem szintéziséhez is (lásd még a 2.4. és 2.5. fejezeteket is). A GlyNAD " és tetrahidrofolátjelenlétében HC03• és ~-'--ra bomolhat; a megfordítható reakciót a glicin-szintáz katalizálja (2-187. ábra). Az alanin transzaminálása piroszőlősav képző­ déséhez vezet (2-179. ábra). A szerio részt vehet transzaminálási reakcióban, amelynek során hidroxi-piruváton keresztül piruváttá alakul. Szerinből történhet Gly-, Cys-, etanolamin-, betain-, szfingozin- és foszfatidilszerin-szintézis is. Amikor szerioből kolin szintetizálódik, az első lépésben a Ser dekarboxilálódik, majd a keletkezett etanolamin meti lálódik 3 molekula S-adenozil-metioninnal és kolin, illetve 3 molekula S-adenozil-homocisztein keletkezik (2-195. ábra). A kolinszintézis az emberi szervezet számára nem feltétlenül szükséges, mert a táplálék általá-

Az aminosavak dezaminálásuk után részben acetoacetáttá alakulnak és zsírsav, illetve ketontest keletkezhet belőlük (ketoplasztikus aminosav: Leu, Lys), részben piruváttá, a.-ketoglutaráttá, szukcináttá vagy oxálacetáttá alakulnak és a vehetnek részt glukoneogenezisben (glukoplasztikus aminosavak: A la, Cys, Ser, Gly, Glu, Gin, His, Pro, Arg, Val, Met, Thr, Asp, Asn). Több aminosav azonban mind ketoplasztikus, mind glukoplasztikus is lehet (Trp, Tyr, Phe, De). Az aminosavak szénláncrészének és a glikolízis-citrátkör intermedierek találkozását a 2- J94. ábra foglalja össze.

A glicin, alanin, szerin és cisztein átalakulása Mind a négy aminosav 6sztán glukoplasztikus és lebontásuk piruvát képződéséhez vezethet, bár a

\

2·194. ábra. Az aminosavak szén· láncának sorsa; glukoplasztikus és ketoplasztikus aminosavak

Cys

Ala\ /

l;

j1r

~5

· \.

_.. piruvát - - - + acetil-GoA •t~~~--+lllo acetoacetii·CoA ___.ser Gly

f Trp

'\ T r Phe

citrátkör

Asn

'. .-Gin G lu

l

')~Arg Pro

metíl·maloníiCoA

(!\\

Val

Met

ANYAGCSERE

Thr

Ile

AMI NOSAVA K A ' Y A GCSERÉJ E

))))))n>)))))))))))))>))))))))))))))>))))))))))))>))))))))))))>))))))))))))))))))))))))>)))))))))U))))))l)))))))))))))))H)))))))))))).)))

coo+

H3N -

l CH l

CH2

l

OH

+

HCO-

.2 3

l H20

NH3 ~

CH3 1.. H3C - N - CH3

3 S-adenozil-metionin

l

l

CH2

l

CH2

CH2

l

OH Se r

l

CH2

3 S-adenozilhomocisztein

l

OH

etanolamin

kolin

2-195. ábra. A kolin szintézise 2-196. ábra. A ciszteinkatabolizmus két útja: a direkt oxidáció és a redukció. Az oxidációs út (vastag nyíllal jelezve) a gyakoribb. A deszulfatáció enzim nélkül is gyors reakció. A szulfitból tioszulfáton keresztül szulfát keletkezik, amely két A TP-vel reagálva ..aktív szulfátot" eredményez (lásd 2-244. ábrát). A 3-merkapto-piruvát redukcióját NADH-függ6 enzim is katalizálhatja; ilyenkor merkaptolaktát keletkezik (az utóbbit az ábrán nem tüntettük fel), amely a vizelettel ürül. Az ábrán a taurinszintézis is látható, amely ciszteinszulfinátból történik

2ú.,

o.-ketoglutarát

2 NADPH+~ ·) ~ cisztein- ' dioxigenáz

transzamináz Cys

2H 20 2 NADP+

C()()

l l

C= O

l cisztein-szulfinát

CH2

l

SH 3-merkapto-piruvát

c:o

a.-ketoglutarát

transzamináz

G lu

~. N+ CH .n~ 2

C~.z-

so;

l

S:P tioszulfát

taurin

coo· t

C= O

l

deszulfináz

CH3

piruvát

~-szu Ifi n il-pi ru vá t

so~

-+ s 0 2

szulfit

-+ so~

tioszulfát

-+ ..aktiv szulfát"

szulfát

247

248

n"'""'>»>m>>>»>>>>>>>>m>l>>>>>>>>>>m>>>»>>m>~>>~m>>>>>~>m>mm»»> ''''''"»m>~m»ll»ll »»»m»»m»mnm»m>m>»»» » » >»»»>» »»

ban elégséges mennyiségű kolint tartalmaz. Kolin szükséges a neurotranszmitter acetilkolin és némely foszfolipid szintéziséhez (lásd a 6.1. fejezetben). A ciszteinből két úton is keletkezhet piruvát (2-196. ábra). A reakció jelentöségét nem a piruvát keletkezése adja, hanem a cisztein lebomlásakor keletkező anorganikus szulfát, amely aktív szul fáton keresztül a szulfáttartalmú vegyületek (heparin, kondroitin-szulfát stb.) szintéziséhez járulhat hozzá. Ilyenkor az anorganikus szulfát elő­ ször ATP-vel reagál és 3'-foszfoadenozin-5'-foszfoszulfát ("aktív szulfát") keletkezik (lásd még a 2.5. fejezetet is). Jelenleg azonban még nem tudni, hogy az anorganikus szulfát hány százaléka származik a ciszteinböl, illetve a bélbőL A cisztein a glicinnel együtt részt vesz a glutation szintézisében is. A cisztein el őször g lutamáttal reagál, majd a termék glicinnel (mindkét reakció ATP-igényes); a reakciókat a glutamil-cisztein-szintetáz és a glutation-sziotetáz katalizálják (lásd 2-175. ábra). A keletkezett termék a redukált glutation (GSH). Oxidáció során két glutationmolekula S-S híddal összekapcsolódhat és oxidált glutation keletkezik (GSSG). Normál körülmények között az egyensúly a redukált forma irányában van eitolva 500: l arányban, és a GSH kencentrációja magas a sejtekben (-5 mM). A rendszer "szulfbidril puffert" képez, amely fontos szerepet játszik a fehérjék korrekt diszulfidhídJal kialakításában, valamint a különbözö detoxikációs reakciókban. A GSSG redukcióját a glutation-reduktáz katalizálja NADPH felhasználásával. A GSH oxidációja során a glutationpero.xidáz hidrogén-perexidot és egyéb organikus peroxidokat bonthat el, amelyek leülönben súlyosan károsítják a sejtmembránok lipidjeit és a fehérjéket is. Az enzim érdekessége, hogy aktív centrumában egy olyan ciszteinszerű aminosav van, amelyben kén helyett szelénatom található (ezen aminosav fehérjébe törtenö szállítását egy speciális tRNS végzi). A glutation továbbá részt vesz a májban történő detoxikációs folyamatokban is, amelyek során metabolitok vagy oldhatatlan és a szervezetre káros vegyületek kiválasztásra kerülhetnek (lásd 2.6. fejezet).

A NYA C CS E RE

A triptofán katabo/izmusa A Trp glukoplasztikus és ketoplasztikus is, mert katabolizmusa során Ala és acetoacetil-CoA keletkezhet (2- 197. ábra). A triptcfán 99%-a katabolizálódhat, míg l %-a szerotoninszintézisre használódik fel. A lebom lás meglehetösen bonyolult, sok lépésbő l álló folyamat. Az első lépés során az indolgyűrű bomlik fel és formi l-kinureninkeletkezik. A reakciót a triptofán-pirroláz, egy dioxigenáz enzim katalizálja. A második lépésben kinurenin keletkezik, miközben a forrnilcsoport tetrahidrofolátra kerül. Ezután a kinurenináz (B6-vitamin-kofaktorral működö enzim) lehasítja az alanint A reakciók ezután két irányban haladhatnak; az egyik út végterméke az acetoacetil-CoA (97%), a másiké a nikotinsavamid, illetveNAD t szintézise (3%).

A szerotooin szintézise során a triptcfán hidroxilálás történik, majd dekarboxilálás, és a termék az 5-hidroxi-triptamin (5-HT) - az aktiv vegyület (2-198. ábra). A triptofán-hidroxiláz működése tetrahidrobiopterin kofaktorhoz kötött. A szerotonin különféle biológiai reakciókban vehet részt; neurotranszmitter, vazokonstrikciót okozhat, növekedési hormon szekréciót válthat ki, szerepet játszik a testhőmérséklet és alvás szabályozásában, illetve olyan pszichés folyamatokban, mint például a hangulat vagy hallucináció. Hatását fokozni lehet olyan szerekkel, amelyek elbomlását gátolják, ún. MAO-inhibitorokkaL A szerotonin monoamino-oxidázzal (MAO) dezaminálódik és 5-hidroxi-indolacetáttá alakul át, amely biológiailag inaktív. indalgyűrűjén e l őször

Bizonyos betegségekben a szerotonin szin~e nagymértékben megnőhet az emberi szervezetben és a már fent említett változásoknak megfelelő szimptómákat okozha~a. Bizonyos bél eredetű rosszindulatú daganatokban, pl. argentaffinoma, a triptcfán 60%-a (a normális l% helyett) szemtoninná alakul. Az ilyen betegeken fokozott vazomotoros reakciók észlelhe-

A 11NO AVA K

~YAGCSER ÉJ E

n u» ••)) ,, u>> •> u))>> >• >n•>>,, ,, )) •> >> >>)) >• >>.,>H> )))l>> • ~>>H )l >u>>> )U)>•)) >> >>)))}>»> >> •> >> >> >> >>>>'t> l) >»•n»>>)>'',,,",,,>> n

2-197. ábra. A triptofán katabolizmusa. A hidroxi-antranilátból történő NAD-szintézis lépéseit, illetve az acetoacetiiCoA keletkezéséhez vezető 8 reakciói nem tüntettük fel. A lebomlás oxidációval (pirrolgyürü felszakadásával) indul, amelyet további oxidációs lépések, dekarboxilálások, redukciók és hidrolízisek követnek. A kinurenin képződése során a THF forrnilá/ása A TP-t igényel (az ábrán tüntetjük fel)

c;;oo+

l

H N- C - H

H3N-C- H

l

J

coo l

+

l l

CH2

CH.,

~

\.:.

~

C=

N

l

l l H H

H

Trp

+ + szerotonin

N-formil-kinurenin NADPH+H•

kinureninformamidáz

THF

(1%)

coo-

l

+

H N-C- H

l

3

CH2

o: H,

kinurenin

NADPH+H+

Ala

és kinurenináz NADP•

Q:H, 0H 3-hidroxi-antranilát

a-ketoadipát Lys

CH - C - CH - C - S - CoA 3

ll o

2

ll o

acetoacetii-CoA (96%)

249

l

coo-

coo·

l HN-C-H 3 l CH2 +

l HN- C-H +

l

3

HO

ll

~ ~

N

CH2

l N l H

l

H

5-hidroxi-triptofán

Trp

omás aminosav dekarboxiláz

co;

H

+ H2C-NH 3 l CH2

coo

l CH 2 HO

HO

l N

l

H

monoaminooxidáz (MAO) és aldehid-dehidrogenáz

5-hidroxi-indolacetát

l

7

H

szerotonin (5-hidroxi-triptamin)

2-198. ábra. Szerotoninszintézis és -lebontás

tök (rohamszerű kipirulás, tachycardia, fokozott bélperisztaltika stb.), amelyhez még a csökkent NAD+-szintézis miatt pellagraszerű tünetek is társulhatnak

A glutamin, profin, arginin, hisztidin és glutamát átalakulása Mind az öt am inosav glukoplasztikus, mert glutamáttá történő átalakulásuk után a Glu transzaminálással, illetve dezaminálással, a-ketoglutaráttá alakul, amely a citrátkör tagja (2-199. ábra). A glutamát, mint már többször említettük,

központi szerepetjátszik az aminosavak egymásba történő átalakulásában, a Gla (gamma-karboxiglutaminsav) képződésben (lásd 6.5. fejezet), az aminosavak transzportjában, a glutationszintézisben és az ornitinciklusban. A Glu a központi idegrendszer legjelentösebb excitátoros neurotranszmittere és belöle szintetizálódik egy másik, de gátló neurotranszmitter, a GABA. A Glu glutamát-dekarbo x:iláz katalízisével dekarboxilálódik és igy egy lépésben gamma-arninobutirát (GABA) keletkezik (2-200. ábra). A GABA inaktiválódása két lépésben történik a transzamináz és a szukcinát-szemialdehid-dehidrogenáz enzimek katalízisével szukcinát keletkezik (2-200. ábra). A glutamin az amjdcsoportját átadhatja többféle molekulának, miközben glutamát keletkezik; így

AMINOSAVAK ANYAGCSERÉJE

))))>)>)))))))H))))))))))))>)>)))))))l)))))))>)))))))))))))))>))))))))))))))))))))))))))))))>>U>t>>)>>>>))>U)~>)))) >>»>>)))))>))U}>>>)>

251

PIC = O

l

l

l

OH2

l

OH= CH-COO

CH2

l

HN ~N

l

HC-NH;

l

coo-

urokanát

H,O H0 2

glutamát-y-szemialdehid

+-- +-- Arg

urokanáz

l

NAD+ imidazolonpropionáz

dehidrogenáz NADH+H•

cooCH2

l l

NH

l

HC = NH

NH2

CH2

C= O

l

l CB

l

CH2

He - coo-

coo l

l

transzteráz

(""\ 5

THF N -formiminoTHF

N-formimino-glutamát

l

l

CH2

l

2+

·R<>l '-NH.,

coo

G lu

~

+..

NH4

glutamináz

CH2

l

+

HC -NH3

tooGin

a-ketoglutarát

2-199. ábra. Az arginin, a proli n, a hisztidin és a glutamin glutamáton keresztüli katabolizmusa (lásd még a 2- 184. ábrát is)

vesz részt a purin és pirimidin nukleotidok szintézisében (lásd a 2.5. fejezetben), illetve aminosavak képződésében. A Gin amidcsoportjának eltávolítása szabad ammónia keletkezéséhez is vezethet, illÍközben glutamát keletkezik; a reakciót a glutamináz katalizálja (2-199. ábra). A prolio lebomlása három lépésben glutamát-gamma-szemialdehid intermedieren keresztül

glutamátképződéshez vezet (2-199. és 2-184. ábra). Az arginin lebomlása is a glutamát-gammaszemíaldehid interrnedieren keresztül vezet glutamátképződéshez. Az Arg e l őször argináz katalízisével omitinné alakul (lásd ornitinciklus), amelyet azután egy transzaminálási lépés követ. Végeredményben egy omitin és egy a.-ketoglutarátból két

coo-

a-ketoglutarát

+ r H N - C- H 3

glutamátdekarboxiláz

l

CH2

Glu

\. )

l

transzamináz

CH2

CH

tooG lu

GABA (y-aminobutirát)

szukcinátszemialdehid NAD+

NADH+H+

dehidrogenáz

coo l

CH2

l

CH2

l

coo· szukcinát

2-200. ábra. A GABA szintézise és lebontása

molekula glutamát keletkezik (2-199. és 2- 184. ábra). Argininből, illetve ornitinből történik néhány poliamin szintézise is, így pl.

+

+

putreszciné H3N-(CH2),-NH3

spermi.di~é

1 spermme

A poliaminok eukariótákban növekedési faktorként szerepelhetnek, és részt vesznek a sej tnövekedés és -proüferáció szabályozásában , de pontos biokémiai szerepük és jelentőségük ma még nem ismert. Az arginin más biológiailag jelentős speciális molekulák szintézisének is kiindulópontja; Argból szintetizálódi.k a kreatin, illetve kreatinfoszfát. A kreatinszintézis első lépése transzamidinálás, amelynek során Arg és Gly-ből gua-

nidino-acetát keletkezik a vesében, majd a májban S-adenozil-metion innal történő metilezéssel kreatin szintetizálódik. Ez utóbbi reakciót guaniclinoacetát-metil-transz feráz katalizálja {2-201. ábra). Végeredményben a kreatin szintéziséhez 3 aminosav szükséges: Arg, Gly és Met. A kreatin ezután foszforilálódhat A TP-vel a kreatin-kináz hatására. A keletkezett savamidkötés magas csoportátviteli potenciálja révén energiát tárol. A reakció megfordítható. El sősorban az izomban és az agyban játszik szerepet a gyors ATP-reszintézisben. A kreatin spontán gyűrűvé záródhat (ez a nem enzimatikus reakció elsősorban az izomban történik) és az így képződött kreatinin (2-20 l. ábra) a vizeletben jelenik meg. A vesében történő kiválasztás ("kreatininclearence") klinikailag jól felhasználható a vesefunkció diagnosztikájában.

Az arginin átalakulásával kapcsolatban végezetül meg kell említenünk, hogy Arg-ből történik a

M II NOSAVAK A.'IIYAGCSE RÉJ E

>m» ''» » »>»>»>>>>>»»>>m »m>>m»»» >»>>»>>>»>»>>>>»>''>»>» ' ' » » » m »>»>H»»>m»»>>m '»»>>mm»m"''''

253

NH CH

l

CH

~

C=NH

CH

l

S-adenozilmetlonin

NH11

G ly

1-

l

arniti n

NH, 1 - + C=NH2

l

N - CH

l

3

CH2

CH2

coo-

coo-

l

coo Arg

j

guanidinoacetátmetiltranszteráz

NH

HC - NH

S-adenozilhomocisztein

l

guanidinoacetát

o o-- Pll -o-

H N

l

~C= O

HN = C/

\

HN

l

l

N

l

CH2

l

+

C = NH2 N - CH

l

CH3

3

CH 2

l

coo kreatinin

kreatin-foszfát

2-201. ábra. A kreatin-foszfát szlntézise és átalakulása kreatininné

nitrogéo-m onoxid (NO) képződése is, amelyrő l részletesen az 5. fejezetben szólunk. A hisztidin katabolizmusa szintén glutamát képződéséhez vezet. Az első lépésben hisztidáz (hisztidin -liáz) dezaminálj a a hisztidint, majd az urokanáz által katalizált H 20 beépülést követően az imidazolgyürü hidrolízisév el N-formiminoglutamát keletkezik mint köztitermék. Ez utóbbi egy formiminoc soport tetrahidrofo látnak történt átadásával glutamáttá alakul (2- 199. ábra). A hisztidáz enzim defektusa histidinaemiát eredménye z, amelynek érdekes tüneti megnyilvánulása, hogy j ellegzetes beszédzavarok lépnek fel.

A hisztidin dekarboxi lálása hisztamin képződé­ séhez vezet (2-202. ábra). A reakcióta hisztidind ekarboxilá z katalizálja több sejtféleségben is, így tüdőben , gyomorban , de legfőképpe n a hízósejtekben. Normál körülmény ek között a hisztamin a májban meti lálással és oxidációva l inaktiválódik.

A hisztamin különböző fiziológiás és patológiás hatással rendelkezik: érfaldilatációt okoz a kapillárisok ban, amely helyi oedemák kialakulását eredménye zi, illetve vérnyomáscsökkenéssel, súlyos esetben shock kialakulásával járhat. A bronchusokban konstrikció t vált ki, a

~.

!

coo

l H N-C-H 3 l

j

,r

hisztidin-de karboxiláz

2-202. ábra. A hisztamin szintézise

l + H-C-NH

+

__/

H

-

,r l

...

N~N-H

His

gyomorban HCI-szekréciót stimulál. Allergiás reakciók, illetve anaphylaxia során is hisztamin szabadul fel. Az orvosi beavatkozás egyik gyakori eszköze pl. allergiás reakcióban, vagy gyomor-hyperaciditasban a hisztaminreceptorok blokkolása. Növényekben hisztidinböJ történik az ergotalkaloidok szintézise is, amelyek gyógyszerként használva az uterus simaizomsej~e inek kontrakcióját váltják ki.

3

N~N-H

hisztamin

aminosav anyagcseréjében (2-203. ábra). A reakcióta metil-malonii-Co A-mutáz katalizálja, amelynek B 12-vitamin (kobalamin) a kofaktora. A B 12_vitamin azonban önmagában nem funkcionál; csak akkor lesz reaktív, ha ATP-vel reagálva B 12_koenzim lesz belöle (2-204. ábra). A metil-malonil-CoA-mutáz által katalizáltreakció lényege, hogy a metil-malonát egyik hidrogénatomja és a

o ll

- C- S-CoA

A metionin, treonin, valin és az izo/eucin katabolizmusa: a B 1z-vitamin szerepe Mind a négy aminosav lebomlásában közös, hogy metil-malonil-Co A, illetve szukcioii-CoA képződéséhez vezet (2- 194. és 2-203. ábra) és ilyen értelemben glukoplasztikus aminosavak. Az izoleucin katabolizmusa során azonban acetii-CoA is keletkezik, ezért ez az aminosav egyaránt glukoplasztikus és ketoplasztikus. A metionin katabolizmus kezdeti lépései megegyeznek a Cys szintézisével (2-188. ábra), melynek során a-ketobutirát keletkezik. Ugyancsak a-ketobutirát keletkezik a Thr-böl, úgy hogy dezaminálódik a treonin-dehidratáz hatására. Az a-ketobutirát oxidatív dekarboxilálás után propionil-CoA-vá alakul. Az Ile-ből több lépés után szintén propionii-CoA is képződik. Ezután a propionil-CoA-karboxiláz katalízise révén metilmalonil-CoA-vá alakul át. Ugyancsak metilmalonil-CoA keletkezik a valinból több intermedieren keresztül. A rnetil-malonil-CoA átalakulása szukcinil-CoA-vá már közösreakció mind a négy

csoport egymással helyet cserélnek (2-203. ábra). Ezen intramolekuláris átrendezödés több lépésben játszódik le (a részleteket nem mutatjuk be), amelyekben a mutáz enzimhez (a kobaltionon keresztül) kapcsolt B 12-koenzirn adenozinjának 5'-szénatomja (2-204. ábra) kulcsszerepet játszik. 8 12-vitamin a kofaktora még a hornociszteinmetil-transzferáz enzimnek az S-adenozil-metionin-ciklusban (2-182. ábra). A 8 12-vitamin anyagcserezavarai és annak következményei a 2.5. fejezetben kerülnek ismertetésre.

A fenifalailill és tirozin katabo/izmusa A fenilalanin katabolizmusa a Tyr képződésével kezdődik (2-185. ábra). Ezután mindkét aminosav sorsa közös; ketoplasztikus és glukoplasztikus aminosavak, mert fumarát és aceto-acetát keletkezik belőlük (2-205. ábra). Tirozinból történik a katecholaminok, a tiroxio és a melaoio szintézise. A katecholaminok (a dopamin, a noradrenalin és az adrenalin) szintézi-

AMI NOSAVAK A:'I YAGCSERÉJE

coo· l

C=O

l

CH2

l

acetii-CoA

CH3

CH3

l l

Cl-!2

a -ketobutirát

C=O

l

S -CoA propionil-GoA

ATP

HC03karboxiláz

ADP+P,

metil-malonii-CoA

l H l H- C l

O=y

metil-maloniiCoA-mutáz

H

l

-

C - COO

l"

H

1 Qx:iA szukcinii-CoA

2-203. ábra. Aminosavak, amelyek lebontása szukcinii-CoA képződéséhez vezet. Mind a négy aminosav (Met, Thr, Val, Ile) számos reakción keresztül (a könnyebb áttekinthetőség céljából nem tüntetjük fel) mefil-malonil-GoA szintéziséhez vezet. Ezután a metil-malonii-CoA szukcinii-CoA-vá alakul át. A reakciót a metil-malonii-CoA-mutáz katalizálja. Az enzim müködéséhez B,rvitamin szükséges

-..

256

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))H)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))>)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

l'-PP+P, H

H N - C - CH 2

ll

2

o

H

8 12-koenzim (5' -dezoxiadenozilkobalamin)

OH

2-204. ábra. A 8 12 -vitamin és a 812-koenzim

képződése

OH

ANYAGCSERE

A JINO ' AV KA. YAGCSERÉJE

>>>>~H> n>>''''>> n >>>H> >H>>>>> >H>>»>>>>>>>>>>>>>>>n>>))))).>))))))>>>>>>>>)H)>> n>>>>))>>>>>>> >>>>n> >>>>>»H>>> >~n n >>>H))>>>>

cool H N -C-H 3 l

H~O

+

ó

/

cool

+

H3 N-C- H

l

fsn1falaninhidto'Xfláz

CH2

giOU

coo l

u-ksto-

~ THB

C= O

l

CH2

tirozintranszaminéz

DHB

~

l._......,__..

OH

OH

p-hidroxifenilpiruvát

Tyr

Phe

i l~as~~;.bát]

piruvát

dloxigenáz

alanin

l~Hco;

coo l

C "'=-0

o

l

ó

257

o ll

l

o ll

CJ-CH,-C-0..

O =C

H'

~o CH -C

\ ioxigenáz

2

c ll

OH

o

homogentizát

maleilacetoacetát

GSH izomeráz

fenillaklát fenilacetát

coo· l ll

C- H H -C

too-

fumarát

acetoacetát

2·205. ábra. A fenilalanin és tirozin katabolizmusa (lásd még a 2·185. ábrát)

~.

"

o

25!!

A YAGC ERE

séről ,

lebomlásáról és funkcióiról a 6. J. fejezetben lesz szó. Itt csak a klinikai aspektusok megé1tése szempontjából említjük meg, hogy a tirozin átalakulása során DOPA (3 ,4-dihidr9xi-fenilalanin) keletkezik. Ezután a DOPA két reakcióúton is továbba lakulhat Egyrészt melanin (szőr-, szem- és bőrpigment) szintéziséhez vezet, másrészt dekarboxilezés el dopamint eredményez. Az utóbbi keletkezése a noradrenalin- és adrenalin-szintézis e lőfeltétele. A fenilalanin katabolizmusa során enzimopathiák következtében különböző anyagcserezavarok jöhetnek létre. Ilyenek a tyrosinaemiák, a phenylketonuria (PKU) és az alcaptonuria. (Az utóbbi volt az első felismert veleszületett enzymopath ia, amely az egy gén- egy enzim koncepció kiindulópontja lett.) A defektusok helyének követéséhez lásd a 2-205. ábrát. A tirozin katabolizmus enzimeinek genetikai defektusa tyrosinaemiát eredményez. Ritka, de rendkívül súlyos kórkép; májelégtelenséggel, " káposztaszagú'' lehelettel, szem, bőr és idegrendszeri károsodással társul és az enzimhiány mértékétől ftiggően egy, de legkésőbb l O éven belüli halált eredményez. A tünetek kifejlődésének pontos biokémiai oka(i) nem ismert(ek). A homogentizát-oxidáz defektusa a homogentizinsav felhalmozódásával jár, amely részben a kötőszövetekbe kerül és pigment formában tárolódik, illetve artbritist okoz, részben szekretálódik a vizeletbe, ahol állás közben oxidálódik és polimerizálódik (sötét színű vizelet; alcaptonuria). A betegség nem veszélyezteti az életet (a homogentizát felszaporodása nem jár tirozinfelszaporodással, s így nem alakul ki a tyrosinaemia). A fenilalanin anyagcserezavarok közül a phenylketonuria (PKU) a leggyakoribb kórkép (J :9000) Magyarországon (pl. Finnországban ritka). Létrejöhet (2-185. és 2-205. ábra) a fenilalanin-hidroxiláz defektusaként ("klasszikus PKU", hyper-phenylalaninaemia) vagy a tetrahidrobiopterin, illetve a dihidrobiopterinreduktáz képzés hiányosságainak következtében ("kofaktor defektusos PKU"). A fenilalanin egyik esetben sem tud tirozinná alakulni, fe lhalmozódik, illetve transzaminázokkal át-

alakul fenil-piruváttá, fenil-laktáttá és fenilacetáttá, és ezek az összes testfolyadékban megjelennek. Magas koncentrációjuk károsítja az idegsejtek myelinhüvelyét és szellemi fogyatékosságot eredményez (a károsodás létrejöttének biokémiai mechanizmusa még nem isme1t). A "kofaktor defektusos PKU" klinikai szimptómái színesebbek és súlyosabbak, mint a "klasszikus PKU-é", mert a kofaktorelégtelenség nemcsak a Phe és a fenilketontestek felszaporodását eredményezi, hanem a DOPA, dopamin és noradrenalin hiányos képzését is, hiszen a tirozin-hídroxiláz is elégtelenül műkö­ dik tetrahidrobiopterin hiányában. Továbbá nitrogén-monoxid és szerotonin sem képződik, mert szintézisükhöz szintén ugyanezen kofaktor szükséges (2-198. ábra). Elmegyógyintézetekben (pl. az USA-ban) az összes betegek közel l %-a phenylketonuriás volt korábban, 20-30 éves várható élettartammal. Haszületés után pár héten belül fehérjeszegény diétát állítanak be (amely csak minimális mennyiségű fenitalanint tartalmaz, mint esszenciális aminosa vat), és a többi esszenciális aminosavat, a szénhidrátokat és a zsírokat biztosítják, akkor elérhető, hogy a PKU-s betegek IQ-ja ("intelligeneiahányadosa" ) a normális értéket elérje (akár a 110-et is, különben 50 körülire csökken). Tehát a korai diagnózis (szürővizsgálat) fontos: a vér fenilalaninszintjének meghatározása, illetve a DNS-próba fenilalanin-hidroxilázra (a szürővizsgálat hosszú ideje már Magyararországon is kötelező).

A tiroxin is a tirozinból szintetizálódik. A pajzsmirigy egyik febérjéjében (tireoglobulin) lévő tirozin oldalláncok jódozódnak tiroid-peroxidáz katalíziséveL A jód a vérből keriil a pajzsmirigybe, ahol annak 30-szoros koncentrációnövekedése követke-zik be. A jódfelvétel feltétele a sejtmembránon található nátrium-j od id szimporter (NIS) jelenléte. Ezután két jódozott tirozinmolekula (továbbra is tireoglobulinban) szubsztitúciós reakcióval tetrajód-tironinné alakul (2-206. ábra), amely biológiailag még inaktív és csak akkor válik aktív hormonná, amikor a fehérjéből specifikus proteáz hatására kihasad és a véráramba kerül. A

AM I OSAVAK A. Y GCSERÉ.IE

+ NH3

l

o

HO

CH

- ccoo· 2 l H

tiroxin- 3,3',5,5'-tetrajód-tironm (T4)

táplálék ~

@

dehalogenáz

~Tr- "'

L_T y r - - proteáz j~

r, . vérkeringés

hypothalamushypophysis

~

thyraaidhormon ' receptor

DNS ~

2-206. ábra. A tiroxin képződése. Rövidftések: T4 (tiroxin), TBG (liroxinkölö globulin), TSH (thyreoidstimuláló hormon). T3 (3,5,3'-trijód-tironin), rT3 (reverz. 3,3', 5'-trijód-tironin)

jódozottság fokától függően egy molekula tironin három (3,3 ',5-trijód-tironin) vagy négy j ódatornot (tetrajód-tironin, tiroxin) tartal rnazhat (az orvosi gyakorlatban T 3 és T4 -nek nevezik); a vérben a

pajzsmirigyhotmonok 90%-a T4 formában fordul e lő. Élettartamát (féléletideje kb. 8 nap) a vérben egy fehérje, a tiroxinkötő globulin (TBG) határozza meg; a tiroxin a célsejteken disszociál a

l 260

A~ YAGCSE R E

u>>>>>>>>>»>>>>>>> n))>>)l >H>>>>> '>>l> n)>>>n n>)n >»>>H> u >H>)) >>n»>>>>>>>>>> n>>>H>>>>>>'l)>)>>>)))))>)>))) >H> >Hl))>>))>>>>>>)))>))))))))))))>>n t)>>>>>>>>>>n

TBG-rő l és egy dehalogenáz enz im a T 4-et T 3-má alakítja (az utóbbi féléletideje órás nagyságrendbe esik). A T3 konverzió során reverz T 3 is keletkezik (2-206. ábra), amely bio lógiailag inaktív. A T3 konverzió a hormonaktivitás gyors szabályozását teszi lehetövé, amelynek klinikai és diagnosztikai je l entősége van. A dehalogenáz által fe lszabaditott jód a vérkeringésen keresztül a paj zsmirigybe jut és újra felhasználódhat A sejten belül a T 3 a thyreo id-honnon-receptoron keresztül DNS-hez kötő­ dik, és számos sejtféleségben indukál különböző fi ziológiás vagy patológiás elváltozásokat (eddig több száz tiroxin által indukálható enzim ismert). A vér tiroxinszintje feedback mechanizmussal szabályazza saj át szintézisét. A T.t magas szintje gátolja a hypothalamus thyreotropin releasing hormon (TRH ) és a hypophysis thyreoid stimuláló hormon (TSH) kiválasztását, amely utóbbi serke nti a pajzsmirigyben a tiroxin szekrécióját

Az aszparagin és aszpartát metabolizmusa Az aszparagint az aszparagináz dezarnidálja és aszpartát keletkezik, amely transzaminálással az aszpartát arninotranszferáz (ASAT) hatására oxálacetáttá alakul és így a citrátkörbe kerül (2- 194. ábra). A transzaminálás a.-ketoglutarát ~ glutamát átalakuláshoz kapcsolódik (2-207. ábra). Az aszpartát részt vehet más transzaminálási reakciókban is; a glutamát mellett a legáltalánosabb transzaminálási donor. Aszpartát szolgálta~a az urea egyik nitrogénjét is, így az omiti nciklus az aszpartáton kere ztü l kapcsolódik a citrátkörrel (2- 19 1. ábra).

A leucin és lizin katabo/izm usa A tiroxin csökkent szintézise az alapanyagcsere lassulásához és a pszichés történések renyheségéhez vezet (gyennekkorban testiszellemi visszamaradottsággal jár), amelyet újszülöttkori szűrőv i zsgálattal (ma már kötelező) és T 4 -szubsztitúcióval lehet megelőzni . A jód hiánya a hipofunkciós struma kórképet (golyva) hozza létre. A fokozott tiroxintermelés (hyperthyreosis) viszont az anyagcsere-folyamatok felgyorsulását váltja ki, jellegzetes klinikai tüneteket okozva (Basedowvagy Graves-kór).

A leucin tisztán ketoplasztikus aminosav, mert katabolizmusa acetil-CoA-hoz, illetve acetoacetáthoz vezet (lásd 2-1 94. ábra). A Leu lebontása hat lépésben ját zódik le (ábrán nem tüntetjük fel). A második lépésben dekarbox ilezés történik, amelyhez NAD+-ra, koenzim-A-ra és a keto-izokaproát-dehidrogenáz komplexre van szükség. Az enzim defe ktusa az ún. ,.Maple Syrup" Uávorfaszörp) betegséget okozza; a Leu és a ketoizokaproát felhalmozódik a liquorban, a vérben és a vizeletben, miközben súlyos mentális károsodásokjönnek létre. Kelelés nélkü l egy éven belül halál következik be.

_.._,_,.._,.

~:

o

ll l

l

C - NH 2

H20

CH2

H-

l + C - NH l 3 cooAs n

2-207. ábra. Az aszparagináz

cool

+ NH4

~

aszparagináz

CH2 ~

H-

l + C - NH l 3 cooAsp

gluV" .. a-keto-

4

transzamináz (ASAT)

cool CH2

l

C=O

l

coooxálacetát

AMI 'O AVAI< A . VAGCSERÉJE

>•>>>>»»>>»>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>»>>>>>>>>>>>H>>>>>>>>>>»>>>>>>>>>>>»>>>>>>>>>>>>»>>>>>>>>>>Hnn>>>>>)>>>>>>>>>>>>>>.>>>>>

A lizin katabolizmusa is több lépésben történik és a negyedik lépés intermedierétől a Trp katabolizmusával közös az út (lásd 2- 197. ábra). Az aminosav anyagcserezavara során az emelkedett lizinszint (hyperlysinaemia) kompetitív módon gátolhatja az argináz aktivitását és hyperammonaemiát okozhat. Növényekben Jizinből alkaloidák szintetizálódnak, amelyeket a gyógyászatban felhasználnak. Lizinből történik a karnitin szintézise is. A kamitin a zsírsavak mitokondriumba történő szá llításában játszik szerepet (lásd 2.3 . fejezet).

Porfirinek és epefestékek A porfirinek metenilhidakkal összekötött pirrolgyűrükből épülnek fel, amelyek rövid szénláncú csoportokkal szubsztituáltak és jellemző rájuk, hogy a pirro lgyűrűk nürogénjei fémionokkal komplexet képeznek (2-208. ábra). A vastartalmú porfirinek alkotják a hemet, míg a magnéziumtartalmúak a klorofilleket. A hem kül önböző fehérjékhez kötődhet, hemoglobint, mioglobint, eitekrómokat vagy katalázokat alkotva.

2-208. ábra. A porfirinváz szerkezete. A porfirinvázat 4 pirrolgyürü alkotja, melyeket metenil- (=CH-) hidak tartanak össze. A pirrolgyürük rövid szénláncú csoportokkal (metil: -CH3, vinil: -CH=CH2. acetát: -CH2-coo·. propionát: -CHr CH2-COO' ) szubsztituáltak. A pirrolgyürük között fémion (metál; Me) helyezkedik el

26 1

A porfirinek szintézise Hem szintézisére az összes eml ős szövet képes, de emberben főként a csontve l őben és a májban folyik. A porfirinek szukcinii-CoA-ból és glicinből szintetizálódnak. Az el ső lépés, amely a hemszintézis sebesség meghatározó reakciója, a két molekula addíciója. Ezt a tennékek további kondenzációja követi , porfobilinogént eredményezve (2-209. ábra). Az enzimet, a 8-aminolevulinát-szintázt, amely az első lépést katalizálja, a hemszintézis legvégső terméke, a hem gátolja. A fent említett reakciók a mitokondriumban folynak. A következő három reakció (2-2 1O. ábra) a c itoszéiban játszódik le, amelyek során 4 porfobilinogén kondenzálódik három NH4 + kilépése melle tt és egy lineáris tetrapirrot keletkezi k, amely azután egy új abb NH 4 + távozásával gyűrűs szerkezetté zárul. A lineáris tetrapirro lgyű rűkön acetát (A) és propionát (P) szubsztituensek találhatók. A gyűrűvé záródásban két enzim működik közre, az uroporfirinogén 1-szintáz és az uroporfirinogén lll-koszintáz. A szintáz a gyűrű zárásakor megtartja a tetrapirro lgyűrűn elhelyezkedő szubsztituensek eredeti helyzetét és így egy izomer keletkezik, amelyet uroporfirinogén J-nek neveznek. A koszintáz közben két szubsztituens sorrendj ét felcseréli és egy másik izomer struktúrát hoz létre, az uroporfi rinogén Ill-at. A szervezetben nonnál körülmények között a szintáz és koszintáz összehangolva működi k és mindig uroporfi rinogén Ill keletkezik. A következő lépésekben dekarboxilezéssel és további oxidációkkal koproporfirinogén III, majd a mitokondriumban protoporfirin IX keletkezik. A reakciósorozat befejezéseképpen a ferritinből (lásd 2 később) kétértékű vasion (Fe +) épül be a protoporfirin IX molekulába a ferrokelatáz katalízisével, és létrejön a hem, amely a hemoglobin, mioglobin, citokrómok és peroxidázok prosztetikus csoportját képezi.

A hem szintézise során három enzim genetikai károsodása ismert (2-21 O. ábra). Az uroporfirinogén 1-szintáz defektusa esetén a májban és a vizeletben 8-amino-levulinát

- - - -- -

2 62

t))H>)) U)))> U~))))} H

H~))\ )H))))))) ))\)))))))))))))}))) ))))))')>)) >))H))))»H))> ) ) H•)) \ ) )))) >>)) >HH))))) ))H)))))n)))))}) h))),))))))) U •>)))) )) >>) )))) h))))))))))))

A NYAGC ERE

~Auk.qlmil fJ§iA

coo-

coo-

CH2

CH2

l

l l CH2 l

l

CH2

l

C= O

S-CoA

l

L

S -CoA

H

L

O= C * l

3

H N , · CH2

l

H

8~aminolevulinát­

szintáz 8-aminolevulinát (DALA)

glicin

2Hp

hem

COcJ

4 l l l


l

coo- cH2. l

l l l

l

CH2

CH2

l

'l

c--c

l \ \

ll

\

ll

, C

\

,.r,""'

\ \

'

'

CH

N

r

H

porfobilinogén

2-209. ábra. A porfobilinogén szintézise. Két malekuta szukciníi-CoA-ból és két malekuta glicinből két malekuta ö-aminolevulinát képződik, majd az utóbbi kondenzációja során 1 malekuta porfobilinogén szintetizálódik

és porfobilinogén halmozódik fel , amely az idegszövet kárositását, abdominális fájdalmakat és neuropszichiátriai szimptómákat eredményez, akut intermittens porpbyrinuria kórképet hozva létre. A koszintáz defektusa miatt az izomerizáció elmarad, így nem uroporfirinogen III, hanern uroporfirinogén I keletkezik és halmozódik fel a fogakban (amelyek ezért vörösen fluoreszkálnak UV -fényben), a bőrben (fényérzékenységet eredményezve) és a vizeletben (azt piros-

ra festve). Az eritrociták érési folyamata nem teljes, így a sejtek rövidesen szétesnek. A kórképet kongenitális eritropoetikus porphyriának nevezik. Az uroporfirinogén-dekarboxiláz elégtelen~ ség uroporfirinogén ITI-felszaporodást hoz lét~ re, porphyria cutanea tarda betegséget okozva.

Vasanyagcsere. A hem szintéziséhez szükséges vas a táplálékból Fe:! ' formában transzportálódik a bélmucosán keresztül. A vérkeringésben a vasat

,\\ti'>OSA\ ' \1\: " ' \(,

fRÉJf

263

A

p

p

A

p

A

p

A

N

N

l

l

l

H

H

H

N

lineáris tetrapirral T

•

~ uroporfirinogén I-

NH4 ~

~ szintáz

A

p uroporfirinogén l

uroporfirinogén lll

uroporfinnogén lllkoszintáz

N

N H

P - - . . - --1... NH

HN

H

N

N H2C

4Hco;

uroporfirinogéndekarboxiláz

p

A

koproporfirinogén lll

2Hco; 10 H

\1

koproporfirinogénoxidáz

hem

protoporfirinogén· oxid á z

N

protoporfirin IX --~---=---• ( ferritin (Fe

r(;)

ferryelaláz

2 ·)

l • !=e

N p

...___,#

l

r -

~

HC

r

2·210. ábra. A hem képzödése porfobllinogénekböl. Az uroporfinnogén l szmtéztse utan a továbbt reakciók részletett nem tűn· tetjük fel. csak azt a változást jelezzük, amely orvosi szempontból Jelentáséggel bírhat. Az uroporfirinogén lll az uroporfinnogén l-tól csak abban tér el. hogy az egyik pirrolgyúrü proptanátjának (P) és acetátjának (A) helyzete felcserélődik. Az uroporfirinogén-dekarboxiláz az acetát szubsztttuenseket dekarboxilálja, amelyek így metilcsoporttá alakulnak át. A következö lé· pések során további változások történnek (a porfinnváz deszaturációja és vinilszubsztituensek képződése). amelyek a protoporfinn IX kialakulása után már nem változnak. A protoporfinn IX és a hem szarkezeli váza és szubsztituciós csoportjai, a metil (M). a propionál (P) és a vmtl (V) azonos pozícióban vannak. a különbség csak a vas beépülésében található

26-'

)))))))))))))))) )))))) ))l>)))))))) )))))))))) )))))) )))))))))))))))))))))) )))))l)))))))))))))))))))))))))) l))))))))))})))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))))))

Fe 3 ~ formában egy glikaprotein (80 k.Da), a

transzferrio szállítja, amely a májban szintetizálódik. Egy molekula transzferrio két vasiont köt meg; a transzferrio egyrészt transzfer funkciókat lát el, oda szállítja a vasat, ahol szükség van rá, másrészt "védelmet" jelent a különböző sejteknek, mert a szabad vasion toxikus a szervezetre. A vérben, pH 7,4 közegben a vas rendkivül nagy affinitással kötődik a transzferriohez és a vassal telített transzferrio szintén nagy affinitást mutat a sejtek (elsősorban máj) membránj án lévő transzferrínreceptorhoz. A hármas komplex (vas- transzferrin- receptor) ezután endocitózissal a sejtek endoszamájába kerül, ahol a pH 5-6 közötti tartományban a vasion affinitása a transzferriohez

CD

l

vér

A~YAGCSERE

106 -szor kisebb, mint pH 7,4-nél. Így a vas disszociál és ferritinhez kötve tárolódik (2-211. ábra). A ferritin nagy molekulatömegü fehétje, amely 300~500 vasiont tud tárolni. A visszamaradt vasmentes apotranszferrin- receptor komplex a sejtből a felszínre kerül, ahol pH 7,4-nél az apotranszferrin és a receptor affinitása nagymértékben csökken; a vasmentes transzferrio (apotranszferrin) a véráramba kerül, núg a receptor a sejt külső felszínén marad. A körfolyamat bezárul; a vasmentes transzferrio újra vas-iont köthet meg és azt a receptorhoz szállíthatja. A körfolyamatot receptormediált endocitózisnak is nevezik, amelynek során pl. egy májsejt kb. 20 OOO vasiont tud transzp01tálni percenként.

CD

apotranszferrin

)H)))))))

transzferrin

pH 7,4

májsejt

endoszáma

pH 5-6

receptor- transzferrin komplex

ferritin

2-211 . ábra. A vas transzportj a. A vasionokaffinitását a transzferrinhez, illetve a receptor affinitását az apotranszferrinhez a pH határozza meg

A:\11 O A \'AK A 'W ACC ERÉJF.

>>>>>>n>>>>>>>>>>»>>>>>>>>>>>>>>»>>»>>»>>>>>>>>»>>>>»»»>>»>>>>>>>>»»»»>>>>H>>>>>>>>)>>>>>>>H,>>>>>>>>>>>>>»>>U>>n>t•>>>>>

A porfirinek lebomlása, epefestékek képződése

A vörösvértestek é letideje a keringésben átlag 120 nap (kb. 108 eritrocita pusztul el óránként), aminek eredménye, hogy közel 6 g hemoglobin bomlik le naponta egy 70 kg-os emberben. A porfirinek lebomlása a RES-ben kezdődik azzal, hogy ezek a sej tek felismerik a vörösvértestek öregedésével járó membránváltozásokat. A degradáció komplex fo lyamat eredménye, amelyben oxidációs és redukciós reakciók vesznek részt. A hem oxidációja még a globinhoz kötött formában kezdődik, s ennek eredményeként a porfirin gyű­ rűs váza fe lbomlik, verdog tobin keletkezik. Ezután 3 2 felszabadul a Fe ' -ion, miközben ferrivé (Fe } oxidálódik, majd a transzferriohez kötődve újra felhasználódik. Az utóbbi azért figyelemreméltó, mert a vasüritő mechanizmusok nagyon korlátozottak; e lsősorban vérvesztés során történik vasvesztés. A destabilizálódott gyűrű ezután lehasad a globinról és a fehérje proteolízissei aminosavakra bomlik. A porfiringyűrű pedig további oxidációs és redukciós reakciók során degradálódik a máj, a lép és csontvel ő RES mikroszómáiban. Az oxidációs lépéseket a hem-oxigenáz rendszer katalizálja és biliverdin keletkezik, míg a redukciót a biliverdin-reduktáz, bilirubint eredményezve (2-212. ábra). A biliverdin színe sötétzöld, a bilirubiné pedig narancssárga. Az utóbbi molekula ezután a vérkeringésbe kerül, ahol oldékonysága nagyon alacsony: a vérkeringésben album inhoz kötveszállítódik a májhoz. A bilirubin ezen formáját "indirekt bilirubinnak" is nevezik. J elentőségét a hem degradációján, illetve az epefestékek képző­ désén kívül az adja, hogy a bilirubin, hasonlóan a C-vitaminhoz, az E-vitaminhoz és uráthoz, erős antioxidáns. Az albumin- bilirubin komplex a májba facilitált transzporttal kerül, aho l a bilirubin fe lszabadul. A vízben rosszul oldódó bilirubin 2 propionátcsoportja 2 UDP-glukuronáttal konjugálódik UDP-glukuronát-transzferá z és -d izmutáz jelenlétében; a keletkezett bilirubin-diglukuronid már jó oldékonyságú és az epével kiürül (2-213. ábra). Az UDP-glukuronil-transzfe ráz a legkülönbözőbb gyógyszerekkel (pl. barbiturát) indukálható. A bilirubin konjugált formáját "direkt bilirubinnak" is nevezik a klinikumban.

265

A "direkt" és "indirekt" elnevezés a klinikai laboratóriumban használt kimutatási reakcióra utal ; a jól oldódó konjugált bilirubin könnycbben reagál a diazotált szulfanilsavval é ezért nevezik "direktnek". A konjugált bilirubin aktív transzporttal történő ürülése (májból kivá lasztása) a porfirinleboml ás sebességmeghatározó lépése. A bilirubin a bélben bé lbaktériumok által termelt enzimek hatására további átalakulásokon megy keresztül. Először a g lukuronát hidrolizál, majd a vinilcsoport etilcsoporttá redukálódik, majd újabb redukc iós lépések következnek, és urobilinogén keletkezik (2-214. ábra). Az urobilinogén egy része reabszorbálódik és visszakerül a májba, illetve a körülményektől fi.iggően urobilinné alakul (oxidáció), felszívódik, majd a vesén keresztül kiválasztódik. A v i sza nem szívódott urobilinogén a bélben szterkobilinné (redukc ió) alakul és a széklettel ürül. (Az urobilin és szterkobilin képletét nem tüntetjük fel.)

A porfirinek hibás anyagcserefolyamataival értelmezhető kórképek

A porfirin anyagcsere változásai többféle betegséggel kapcsolódhatnak részben oki, részben tüneti vonatkozásokban. A porphyriák többféle enzim genetikai károsodására vezethetők vissza. Az emelkedett 8-amino-levulinsav-szint, de általában a porfirinszintézis intennedierjeinek felszaporodása az idegsejtek károsodását okozza. Ennek eredményeként időnkénti abdominális fájdalmak lépnek fel (a klinikusnak differenciáldiagnosztikai problémákat okozva). Neuropszichiátriai szimptómák a lakulnak ki, így pszichés izgatottság, konfúzió, pulzusszám-emelkedés, hypertonia, általános gyengeség, illetve paralysis. Több történelmi személy furcsa viseikedé e (pl. S111art Mária és ITT. György király családjában előfordu ló elmezavarok) vagy az ún. ,.farka emberek" cselekedetei (foto zenzitivitás mian fokozott éjszakai tevékeny l.!g) a porphyria utólago diagnózisát teszi lehetövé. Újabba n Van Gogh-ró l is feltételezik, hogy porphyriában szenvedett.

"·

globin

N~ '----'-- V NADPH+H•

M

VM

P

P

MM

V

):::tö)::::J):::io l

H

l

H

l

H

l

l

H NADPH

H

biliverdin

l

H

W

bilirubin ("indirekt bilirubin")

2-212. ábra. A hem degradációja; a bilirubin képződése és transzportja a vérplazmában. Könnyebb áttekinthetőség céljából a hem porfirinvázának csak azt a részét ábrázoljuk, ahol a váz oxidáció során felnyflik

A~II~O AVAK A~\

GC ' ERÉJJ::

) )))))~))))))'))) ))))))))),U))UU)))))))U)))))))))))))))))Jo})))})))))))) ))})))))))))))))))))))))))))J\))))})))>>H)HH>))))

M

P

M

t JJÖ

R1

267

N

C

N

l

l

l

H

H

H

R2 UDP-glukuronát

bilirubin

UDP-glukuroniltranszferáz

coo

coo

o o ll

ll

l

l

o - c c- o HO

CH 2 CH2

l

l

OH ti~H

H

l

l

l

bél urabilinagen

H

H

H

epe

R2

N

C

N

R1

H

OH

bilirubin-diglukuronát (konjugált bilirubin, "direkt bilirubin")

2-213. ábra. A bilirubin sorsa a májban; az urobllinogén képződése. A bilirubin a májban UDP-glukuronáttal konjugá/ódik, majd a bilirubin diglukuronid aktiv transzporttal a bé/be ürül. (Az ábrán a bilirubinnak csak a reaktív részét tüntetjük fel)

E

M

N

l

H

N

H

E

M

M

H

H

o

p

p

M

l

H

2-214. ábra. Az urobilinogén. M: metil, E: etil, P: propionál

N

N H

l H

H

l H

o

268

)) >, >> >> >H>>>>»H>)) >> >>)))) >>O)))))))))) l))>))>))) )))) >U)))>)n )))U)))))))))>))))))) )H))))))))))) )))))))))))))))))))))))»))»)))U)))))))))>)))))))))))))))))))))))'))))

A klinikai tünetek kiváltásában szerepet játszó biokémiai mechanizmusok még nem ismertek. Az urop orfir inogének a látható fénytől (400 nm) reaktívakká válnak molekuláris oxigénnel; oxigéntartalmú szabad gyököket és egyéb reaktív oxigénszármazékokat hoznak létre, amelyek lizoszómakárosodást okoznak. Ennek eredményeképpen emésztő enzimek aktiválódnak és bőrkárosodásokat váltanak ki. Ez áll a "fényérzékenységi" betegségek hátterében (porphyria cutanea tarda). Nemcsak genetikai rendellenességek, hanem szerzett károsodások is előfordulhatnak. Mindehhez társul, hogy egyes külső behatások (pl. alkoholfogyasztás) következtében az enyhe enzimkárosodások különben tünetmentes állapotát a betegség kifejlődése váltja fel. A leggyakoribb elváltozások a fent említetteken kívül hepatocitákban és eritrocitákban fordulnak e l ő, mivel ezekben a sejtekben különösen intenzív a porfirinszintézis. Ó lommérgezés során pl. az Sli-reaktív ólom inaktiválhatja a porfobinilogén-szintázt és a ferrokelatáz enzimeket, ezzel a porfirin-anyagcsere zavarát és az ennek megfelelő tüneteket okozza. A porfirin anyagcserezavarai sárgaságot (icterust) okozhatnak, amelynek lényege, hogy bilirubin rakódik le a bőrben és a sclerában (a portinnogének színtelen, míg a porfirinek sárga színű vegyületek). A sárgaság különböző betegségek tünete lehet. Leggyakrabban a máj elégtelen működése vagy a vörösvértestek fokozott szétesése váltja ki. llemolitiku anaemia (a vörösvértestek érpályán belüli pus;rtulása) sorá n emelkedett a szérum " indirekt bilirubin"-, a vizelet urobilinogén- és a faeccs urobilin-, illetve szte rkobilinszintje, de nem e melkedik a v iteletben a bilirubin. lle pa titis, cirrhosis vagy mé rgck, mint pl. gomba, szén-telraklorid okozta májkárosodá okban e melkede tt el sősorba n az ,.indirekt bilirubin" és a "direkt

A\ YAGCSERE

bilirubin" szérums.ántj c .::s kislllértékben a vizelet urobilinogénj e, a vizeletben bili rubinjelenik meg, csökkent vagy nonnál viszont a s;;ékl et urobilin- és szterkobilinszintje. Elzáródasos icterusba n (mechanikus okok miaH: leggyakrabban epekő vagy panc reasfej-carcinoma követkettében) a szénnnban emelkedett a "direkt bilirubin"-szint, a vizeletben bilirubin jele nik meg, dc hiányzik a vi;;cletbcn és a székletben az urobilinogén, illetve a sztcrkobilin, mert a máj képes ugya n konjugált ("dire kt") bilirubint kés7ítc ni, de az nem kerül be a bélbe. (Ha u elzáródasos icterus hosszabb ideje áll fenn, a kkor májkárosodás IS létrejön, ame ly megnehezíti a pontos diagnózist. ) A laboratóriumi leletek különben log ikusan tükrötik a károsodás okát. Ismert újszülöttek fizio lógiás o;árgasága is; az UDPg lukuro nii-LranszferáL és a szekrécióért felelös enzimek szintézise a májban még nem történt meg, aminek következménye, hogy fokozott hemolíz is során a bilirubin nem kerül k iválasztásra (emelkedett az "indirekt bil irubin"). A rosszul o ldódó bilirubin pencu·ál az agy-vér gáto n és a mozgáskoordináció telj es zavarát okozhatja. M inthogy a bilirubin-anyagcsere cn:ómrendszcre fenobarbiturátta l indukálható, az ilyen csecsemőket korábban fenobarbituráttal kezelték. Úja bban kék fénnyel sugáronák be. mert a 420 4 70 nm tartományú fény a bőrben a bilirubin szerkezetében izomerizáci6Lhoz létre. Az így áta la kult nem konjugált (,.indirekt") bilirubin oxidálódik és elveszti toxikus hatását, mert glukuronidáció nélkül is kiürül a vesén és a bélen keresztül. A fen ti, aránylag gyakran előforduló károsodások mellett több ritka, örökletes enzimdefektus is ismert. Az UDP-glukuronát-transzferáz hiánya vagy csökkent mű­ ködése (l és II típusú Criglcr Nujjar-szindrómák), a bilin1bin májfelvétcl-.tavara (Gilbcrt-szindróma) vagy a konjugált bilirubin szekréciós zavara (Dubin- .lohnsonszindróma) s tb. Említést érdemelnek még a hem degradáció rendellenességeihez társu ló vagy attól független vasanyagcsere-zavarok is. Fokozott vérzékenység vagy vérveszteség (haemostasiszavarok, elhúzódó mc nstruációk stb.) vashiányos anacmiá kat okozhatnak. A vas tárolási rendellenességei pedig haemosidcrosishoz (a ferritin nem tud müködni. mert részlegcsen degradálódi k, a vasat azonban kötve tartja) vag} haemochromatosishoz (fokozott inlestinalis vasfelvétel és következményes szöveti vasfelhalmozódás) vezethetnek. A szabad vas, mint említettük, toxikus. el ősorban u máj ra (cirrhosis), a bőrre (pigmentációs zavarok) és a pancreasra (bronzdiabetes).

A fejezet megírásával kapcsolatban tett java latokért és kritikai megjegyzésekért a szcrző kös.~;ön c te t mond Or. Farkas Cyöngyinek, DL Kolev Kras.~;imirnak , Dr. König Tamásnak, Dr. L é ránt Istvánna k , Dr. Mészáros Károlynak, Dr. Sch uler Ágnesnek, Dr. Trette r Lászlónak és Or. Vodnyánszk) Lajosnak.

A nukleotidok anyagcseréje

f.

,,

.5.

Machovich Raymund

A nukleotidek széleskörű szerepetjátszanak abiológiai folyamatokban: O a DNS és az RNS prekurzorai,

6 energiaközvetítők (pl. A TP),

regulációs molekulák(pl. cAMP, cGMP, ADP), e koenzimkomponensek (pl. NAD, F AD, CoA), 0 származékaik a szénhidrát- és lipidanyagcsere intermedierei (pl. UDP-galaktóz, CDP-diacilglicerol). C)

Szintézisük és lebontásuk sebessége, illetve azok szabályozása nagymértékben eltér a különböző szövetféleségekben. Ez utóbbi orvosi szempontból figyelemreméltó: a nukleotidok anyagcseréjébe történő beavatkozás terápiás lehetőséget kínál bizonyos betegségek (pl. rosszindulatú daganatok) kezelésében.

A nukleotidok szerkezete A nukleotidek heterociklusos bázisból (purin vagy pirimidin), szénhidrátból (ribóz vagy dezoxiribóz) és foszforsavból épülnek fel: a bázis P-N-glikozid-kötéssel kapcsolódik a szénhidrát Cl-atomjához, a foszfát pedig észterkötéssel a szénbidrát C5 ' -csoportjához (2-2 15. ábra). A bázis-szénhidrát egységet nukleozidnak, míg a nukleozid-foszfátot nukleotidnak (NMP) vagy attól függően, hogy hány molekula foszfát épül be, nukleozid-mono-, -di- vagy -tri foszfátnak nevezik. A di- és trifoszfátokban a foszfátok savanhidrid-

(makro-erg) kötéssel kapcsolódnak egymáshoz. A purin és pirimidinbázisok szerkezetét a a 2-216. ábra szemlélteti. A nukleotidokban két planáris gyűrű, a ribofuranóz és a purin vagy pirimidin síkja található, amelyek egymáshoz képest közel vagy távol helyezkedhetnek el. A rotáció az N-glikozidos kötés körül történhet. Ha a purinbázisok N3 atomja vagy a pirimidinbázisok C2 atomja (2-215. és 216. ábrák) közel kerü l a szénh idrátgyűrűhöz, "sy n"-konformációról beszélünk (a 2-215. ábrán ez a szerkezet látható), haviszont a glikozidkötés körül 180°-0S elfordulás történik, a két planáris sík egymástól távol kerül, "anti" -konformáció jön létre. A nukleotidok ezen "mozgásképessége" jelentősen befolyásolja a polinukleotidok másadJagos szerkezetét. Bázisok és nukleozidok szabad fonnában kis mennyiségben találhatók a sejtekben; főleg a ribanukleozid-trifoszfátok dominálnak, amelyek mM-os koncentrációban fordulnak el ő. Az egyes nukleotidek, pl. az adenin nukleotidok koncentrációja meglehetősen állandó, habár ezen be lül az ATP, ADP és AMP aránya változó. A természetben a leggyakrabban el őforduló bázisok (2-216. ábra) mellett kisebb mennyiségben találhatók egyéb purin- és pirimidinbázisok is. Eddig közel 40-féle ritka bázist írtak le tRNS-ekben (biológiai szerepüket lásd később). Ritka bázis pl. a 6-dimetil-adenin, az 5-rnetil-citozin és az 5-hidroxi-metil-citozin (a purinbázisokban a szubsztitúció többnyire az aminocsoportokon történik, míg a pirimidinvázban az 5-ös szénatomon). A növényekben található, élettani hatással rendelkező

270

A:'IIYAGCSERE

adenin

_

~ M.

0

l /

észterkötés

.,

O-P - O - CH2

N~N

o

(

.

N-ghkoztd ) ~ -kötés 180

"

o OH

OH

OH

adenozm

OH

AMP (adenilát, adenozin-5'-monofoszfát)

2-215. ábra. Az adenilát szerkezeti elemei

o

>

~f'j

ll> ~N l

H-~

l

HN~~Nl 2

H

H adenin (A; 6-aminopurin)

guanin (G; 2-amino-6-oxopurin)

o

H-~> 0~ l l

H

l

H

xantin (X; 2,6-dioxopurin)

H -ó 0

N

l

H ci tozin (C; 2-oxo-4-aminopirimidin)

uracll (U; 2,4-dioxopirimidin)

2-216. ábra. Purin- és pirimidinbázisok szerkezete

tim in (T; 2,4-dioxo-5-metil-pirimidin)

NUKLEOTIDOK ANYAGCSERÉJ E

timin (laktám)

) ))))))))))))))))))))) ~>)) )))) )))) )))))) ) ))))))) ) ))))))))))))))) )))))) )) )) )) )))))) )) )))))))))))))))))) >))) )) )))))))))))))) )) ,, )))) )) ))))

timin {laktim)

2-217. ábra. A timin tautornér formái

metilált xantinszármazékok: kávéban a koffein (1 ,3,7-trimetil-xantin), teában a teofillin (1,3-dimetil-xantin), kakaóban a teobromin (3,7-dimetilxantin). Mind a purin, mind a pirimidinbázisok származékai laktám- laktim tautorner formában fordu lhatnak elő (2-217. ábra), de fiziológiás körülrnények között általában a laktám fonna dominál, amely a pirimidineknél az N-glikozid kialakulásának e lő­ feltétele. Orvosi szempontból a purinbázisok fontos tulajdonsága, hogy "rossz" az oldékonyságuk; ez különösen érvényes a xantinra és a guaninra, illetve származékukra, az urátra (húgysav). Az oldékonyságot a pH értéke nagymértékben befolyásolja, például savas pH-tartományban a húgysav és a xantin oldékonysága rendkívül alacsony. Ezen tulajdonság biológiai-orvosi jelentőségére, az ember számára kedvező vagy kedvezőtlen hatásaira a purin és pirimidin nukleotidek lebontásáról szóló fejezetrészben (lásd 242. oldal) még visszatérünk.

27 l

degradációjánál jelentösebbnek látszik a szövetekben (elsősorban a májban, lépben és vesében) végbemenő degradáció. A szöveti nukleozidázokkal történő hidrolízis dezoxi-ribózt és pirimidinbázisokat, mig foszfát j elenlétében történő foszforolízis purinbázisokat és ribóz-1-foszfátot eredményez. Mind a nukleozidok, mind a bázisok, a ribóz, a dezoxi-ribóz és a foszfát, újra felhasználódhatnak.

Orvosi szempontból fontos, hogy parenterálisan alkalmazott nukleozidok jól beépülnek újonnan szintetizálódott nukleinsavmolekulákba. Ez lehetőséget teremt a DNS14 szintézis követésére; 3H vagy C-jelzett dezoxi-timidin nukleinsavba történő beépülésének mértéke széles körben használatos in vitro és in vivo DNS-szintézis mérésére. Ha radioaktív izotóppal jelzett egyéb nukleozidokat alkalmazunk (pl. 3H-uridin), akkor az RNS szintézisre, illetve az uridin-foszfátok egyéb funkcióira (epefestékképzés, biotranszformáció, poliszacharid-szintézis stb.) kaphatunk információt.

Purin nukleotidok bioszintézise A purin nukleotidek bioszintézisénekjellemzöje, hogy a bázisok kialakulása ribózfoszfáthoz kötve

A mononukleotidok forrása A purin és pirimidin nukleotidek aminosavakból,

Cl -töredékböl, széndiox idból, ri bózból és foszfátból de novo szintetizálódhatnak minden emberi sejtben. Habár az emésztő apparátus bőségesen tartalmaz nukleázokat (ribonukleáz és dezoxiribonukleáz), foszfatázokat, nukleozidázokat, amelyek hatékonyan degradáUák a táplálék nukleinsavait, ezáltal lehetövé téve azok felszivódását, ez mégsem e légíti ki a legtöbb eukarióta sejt nukleotidigényét Az emésztőrendszer nukleinsav

2-218. ábra. A purinvázat alkotó atomok eredete. A számozás a bioszintetikus lépések időbeli sorrendiségét j elenti

..

272

>>>>»»>>>>>>>>>>»>>n>>>>»>>»>>»>>>>>>>>>>>>U>>»»>>>>»»>>»>>>>>>>>>>»»>>>>»>>»>>>>>>>>>>>>»»»U»>>»»»»>>>>>>>>>>»>>>>>>n»>>U>>>>>>>>))»>>>>>>n>>

AN\AGCSERE

o ll l

5'

-o-P-O-CH

o

2

o-

H <.t

1'

OH

H

OH

OH

ll

AMP PRPPszintetáz

o ll

O- P- 0-P-0

\./.

ribóz-5-foszfát (R-P)

o l

OH

OH

o

l

o

5-foszforibozil-1-pirofoszfát (PRPP)

r~

IMP AMP GMP

Gin

PRPP'----~-.. amidotranszteréz

l

HP pp G lu

o ll l

o --P-O-CH 2

o-

OH

OH

5-foszforibozil-1-amin (P-R-NH 2 )

2-219. ábra. A foszforibozil-pirofoszfát szerepe a purin nukleotidok szintézisében

történik és a dezoxi-ribonukleotid-mole kulák a már elkészült ribonukleotidokból keletkeznek. A purinváz kialakulását szolgá ló komponenseket szemiéiteli a 2-2 J8. ábra. A bioszintézis kiindulási vegyülete a glukóz direkt oxidációja során keletkező D-ribóz-5-foszfát (R-P). A ribóz-foszfáton azonban nem kezdődik el a nukleotidszintézis, hanem el őbb 5-foszforibozil-1-pirofoszfát (PRPP) képződik, amely makroerg kötéseket tartalmaz (2-219. ábra). Csak ezután történik a purinváz első tagjának szintézise, amikor glutamin jelenlétében 5-foszforibozil-1-amin keletkezik. Az utóbbi reakció során konfiguráció-

változás is történik: a C l a-helyzet a PRPP-ben ~-konfigurációjú lesz. A C-N glikozidkötés ~-kon­ figurációja je ll emző a tennészethen előforduló nukJeotidokra. A reakciók energiát és specifikus enzimeket igényelnek. Figyelemreméltó, hogy a PRPP és az 5-foszforibozil-1-amin szintézisét katalizáló enzimek, a PRPP-szintetáz (ribóz-foszfát-pirofoszfokináz) é a PRPP-glutamin-amidotranszferáz a nukleotidszintézis közti és végtermékeivel, az IMP-vel, az AMP-vel és a GMP-vel gátolhaták negatív feedback szabályozást eredményezve.

:"ll KLEOTIOOK

:'
>> >>>>>m>>»»m> >>» >>» >>>>>>>>>m>»>»>>m>m> >> >>>>»>>m>>>>>» » » >> >>>mm>>>m> » » »>>»>>>>>m» » >m »>>>n»»>

273

NH ~ l 3

CH2

foszforihozil-

5:.-foszforiboz.ilgllclnamid-

l O= C l N-H

szintetá~

l

amin

C - H fo&zforiboztl11 forrnilglicin0 amid

transzteráz

N- H

l

R- P

R- P

foszforibozll>gJicinamid

foszforibozil-formil~

glicinamidinszintetáz

o ll

-c

Q_

N

"-c/ "

ll

H C-H

/c~N/ l

NH2

R- P

ll

Asp ~

C- H

~

ll

o

am inaimidazolszintetáz

~

H2N

R- P

foszforibozil-aminoimidazolkarboxilát

ATP

C-H

/c~ /

amlnoimidazolkarboxiláz

ADP+P1 ATP

N H - C/ "

N- H

l

R- P

foszforibozii-aminoimidazol

foszforibozilformilglicinamidin

SZUkCinO. karboxamid-

ADP+P,

szintetáz

o

coo

ll

l

/ c

adeniloszukcinát-liáz (adeniloszukcináz)

H- C- N

l

foszforibozilaminoimidazolkarboxamid

..

l

CH2 H

l

coo fumarát foszforibozil-aminoimidazolszukcinokarboxamid

0

N' - formilTHF

==l

THF

o

o ll

inezinát (IMP)

C H- N/

l

formiltranszferáz

N

H20

"-c/ "

ll

C- H

H - C~ /C~/ N

N

l

R- P

~

~ IMPciklohidroláz (IMP-szintáz)

H2N /

ll c

N

c/ "

o

ll

ll

/

C-H

H - C ". /C~ N N

l

l

R- P

H

2-220. ábra. Az IMP szintézise

..

fosztoribozi lformami doimidazolkarboxamid

274

Al'iYAGCSERE

))))))H)))>))))))))))))))))))n>>>>>>>>>>>>>>>)>)))))))))))))U)>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>)))))))))))))))))>)n>>> )>)))))))))H>>>>>>>>>>>>>>))))))))))))))))))))))))))>>>>>>>>

A második enzim (az amidotranszferáz) gátolható Gln-analógokkal, amely hasznosítható kemoterápia során. ilyen vegyület pl. az azaszerin:

cooH-

l l

+

C - CH - O - C - CH - N=N

ll

2

NH 3 +

2

O

A purinváz bioszintézisének következő lépései során a foszforihozil-amin a glicin karboxiicsoportjával reagál, majd N l 0-formil-tetrahidrofolátból forrnilcsoport-átvitel történik a glicin- arnidribanukleotid szabad aminocsoportjára. A formilglicinamid egy újabb glutaminnal reagál, amelynek arninacsoportja a purinváz következő nitrogénjét (N3) szolgáltatja, majd kialakul az imidazolgyűrű.

A forrnilátási lépést kivéve az összes reakció ATP-igényes. A továbbiakban COrfixálás törté-

L\s )

adeniloszukcinát-

~szintetáz

H -ó:> l

H:)

IMPdehidrogenáz ~

R- P

GMP

IMP

AMP H

o

l

-ooc-cH2 -c- coo· l

•

N- H

co l

R- P

~N

H o~X) l

H

l

R- P

XMP (xantilát, xantozin-monofoszfát)

NH2

~

(X) l

R- P

AMP

GMP

(adenilát, adenozin-monofoszfát)

(guanilát, guanozin-monofoszfát)

2-221 . ábra. Az IMP átalakulása adeniláttá és guaniláttá

'UKLEOTIDO K Al VAGCSERÉJ E

)) )) )) )))))))))))))))))) )))) )))))) )))))))) )) )))) )))))) >))))))) )))))))) )) )))))))))))))) )))))) ' '))))))

nik (ami kivételesen sem biotint, sem ATP-t nem igényel), majd egy aszpartát szalgáltatja a purinváz N 1-atomját, végezetül egy újabb THF (N l 0-formil-tetrahidrofolát) által nyújtott C l-töredék lehetövé teszi az inozinsav (IMP) képződését (2-220. ábra). Az TMP bioszintézise energiaigényes; a reakciókhoz 4 ATP, illetve a PRPP szintéziséhez még további 2 ATP szükséges. A prokarióták ban minden egyes reakciót külön enzim katalizál, míg eukariótákban az evolúció során génfúzióva l multifunkcionális enzimrendszerek jöttek létre, melyek sokkal hatékonyabbak, pontosabba n és így "gazdaságosabban" szabályozz ák a szükséges metabolit intermedierek mennyiség ét. Eukarióták ban három enzimrendszer katalizálja az IMP bioszintézisét; az 5'-foszforibozil-amino imidazol-s zintetáz (a 2220. ábrán az első, a második és a negyedik reakciót), az 5' -foszforibozil-amino-imidazol-szukcinokarboxamid-szintetáz (az ötödik és a hatodik reakciót) és az IMP-szintetáz (a két utolsó reakciót). Orvosi szempontból figyelemre méltó, hogy a Cl-töredéket szállító THF a purin- és pirimidinbázisok szintézisében "elkötelezett" molekula; képződésének vagy a különböző redukáltsági fokú cl töredékek egymásba történő átalakulásának gátlásával a nukleotide k de novo szintézise is gátlódik. Gátlás történhet patológiás körülmény ek között, illetve orvosi beavatkozá s során (lásd ké-

»»»>)))))) ))» ))))))))))

)))))))))

275

nukleotid bioszintézis ezen szakaszában is található feedback szabályozás, nevezetesen az AMP az adeni loszukcinát -szintetáz aktivitását, a GMP az IMP-dehid rogenáz aktivitását gátolja.

Orvosi szempontb ól ismét megjegyzendő, hogy a GMP-szint etáz is, hasonlóan az amidofoszforiboz il-transzfer ázhoz, gátolható glutamin analógokkaL

Az adeni látból és guanilátbó l ezután ATP és nukleozid- monofoszf át-kináz, iIletve d i foszfátkináz enzimek katalízisév el nukleozid-trifoszfátok képződhetnek (2-222. ábra).

2-222. ábra. Purin nukleozid d i- és trifoszfátok képződése

Purin nukleotido k bioszintéz isének szabályozá sa

sőbb).

Az ATP és a GTP adenilát (AMP), illetve a guanilát (GMP) intermediereken keresztül IMPbő l szintetizálódik. Az IMP-ből adenilát vagy guanilát keletkezhet egy aminocsop ort beviteléveL Az egyik irányban a reakció aszpartátot és GTP-t igényel; az adeniloszu kcinát-szin tetáz enzim az inozinát-6-karbonil oxigénatom ját az aszpartát aminocsoportjára cseréli ki, majd az adeniloszukcinát-liáz fumarátot hasít le az adeniloszukcinátból, adenilátot eredménye zve (2-221. ábra). A másik irányban szintén aminosav az aminocsoport-donor, de aszpartát helyett glutamin reagál és a reakciót egy oxidációs lépés előzi meg. Az oxidációs lépés során az inozinsavb ól xanti lsav keletkezik (az inozinsavban lévő 6-hidroxip urint hipoxantinnak, míg a xanti lsavban található 2,6-d ihidroxipurint xantinnak nevezik). A GMP-szintézis reakcióit az IMP-dehid rogenáz és a GMPszintetáz katalizálják (2-221. ábra). A purin

Minthogy a purin nukleotide k de novo szintézise e nergiaigény es folyamat, érthető, hogy ha elegendő mennyiségű végtermék áll a sej tek rendelkezésére, további szintézisük felesleges. A szabályozásra többféle lehetöség is van. Az egyik a PRPP-szin tetáz és a PRPP-ami dotranszfe ráz feedback gátlása IMP és AMP, illetve GMP jelenlétében. Az amidotrans zferáz inaktív dimer és aktiv monomer lehet. IMP és az összes "A", illetve " G" nukleotid a dimer felé tolja az egyensúlyt, tehát gátol. A másik szabályozá si út az IMP-ből AMP- illetve GMP-szint ézis kontrollja; a GMP az lMP-dehid rogenázt, míg az AMP az aden iloszukcinát-szint etázt gátolja. Ezeket a negatív visszacsatolási szabályozá si módokat kiegészíti az, hogy az IMP-ből történő AMP-szint ézis GTP-t, a GMPszintézis pedig A TP-t igényel. Ez kereszt regulációt eredménye z és hozzájárul a két nukleotidkancentrác ió egymáshoz viszonyított egyens ú-

27 6

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

1

- - - - . - - . s~intetéz

+-- ---- ----

r-AT P

ANYAGC SERE

2-223. ábra. Purin nukleot idek szintézi sének szabály ozása. A visszacsatolásos gátlásokat (-), az aktiválásokat (+) szimbólumok jelzik

()

PRPP ~

l ~+-__"€_>..,_.._.__

------ -Ir+ transzteráz

~

szinte~MP~hidrogenáz

l

~ ~

GDP : 1 l 1

AMP

l l

~

GTP

ADP

ATP- --/

/--f -/ 1

J

l

~'

;TP~

1 l 1

~

AMP GMP=- :;.._-... .-

l l

GDP

' - -- - - - GTP

lyának fcnntartásához. A különböző szabály ozási foglalja össze a 2-223. ábra. A "mentő" (ún. alvage) mechan izmuso k is fontos szerepet játszanak a purin nukleo tidek anyagcseréjébcn. A purinbázisok és nukleozidok közvetlenül átalakulhatnak monon ukleoti dokká és így a nukleinsavak degrad ációja során keletkező purinbázisok újra felhasználásra kerülbetnek. A mentő utakat nagym értékbe n a polirno rfonukl eáris sejtek, az imrnunrendszer és az agy haszná lja fel. A purinbá zisok szárma zhatna k még a táplálékbó!, illetve az adenin az S-adenozil-rnetioninból is (lásd 2.4. fejezet) . A rnentő utak egyik típusa, amikor egy szabad purinbázis PRPP- tal reagál és monon ukleotid kelehe tőségeket

Jctkezik; a reakció hoz az energiá t a PRPP pirofoszfát hidrolí zise szolgáltatja. A reakciókat az adenin -foszfo riboziJ -transz feráz és a hipoxa ntin-gua nin-fos zforibo zil-tra nszferá z katalizálják, aminek eredmé nyekén t AMP és GMP, illetve IMP keletke zik (2-224. ábra). Ezen mechan izmusnak az ad különö sen nagy jelentőséget, hogy a PRPP menny isége a purin nukleotid bioszintézis sebe ségéne k Jegfőbb meghatározója. A PRPP menny iségét viszont az határozza meg, hogy mennyi az elérhető ribóz-5-foszfát és rnilyen a PRPP- szintet áz aktivitása. Az utóbbi nagymértékben függ a purin nukleo tidek koncentrációjától, mert az lMP és a GMP gátolja az enzim aktivitását (allosz terikus reguláció; 2-223. ábra). A mentő út

'il'KLF.OTIDOK i\ Yi\ GC ER ÉJE

2-224. ábra. Purinbázisok hasznosítása; .,mentö utak"

újra

277

))))))))t)))))))))))))))))))))))))))))))~))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))U))))U))))))))))))))))))))))) U))))))))))))))))))))

o

l ü-P - O

o

o

ll

o

l

l

O- P - O- P - 0

ll

ll

OH

Ol-!

o

o

PRPP

hipoxantin

adenin

~AMP további szabályozását jelenti, hogy az IMP és a GMP, illetve az AMP gátolj ák saját keletkezésüket hipoxantinból és guaninból, illetve aden inbő l (2224. ábra). Ezen mentő útról kihangsúlyozandó, hogy müködése hatékonyan gátolja a de novo nukleotid szintézist; (i) elhasználja aPRPP-t és (i i) a termékek, az AMP és a GMP gátolják az lMP szintézisét (2-223. ábra). Így tehát a nukleotidek de novo szintézise és a bázismentő út összehangolt működése nagy jelentőséggel bír. E nnek orvosi vonatkozásait lásd a nukleotidok katabolizmusánáL A mentő út másik típusa, amikor nem a szabad bázis, hanem a purin-ribanukleozid (adenozin és guanozin) A TP-vel foszforilálódik és A MP, illetve GMP keletkezik. A reakciókat kinázok (pl. adenozin-kináz) katalizálják, amelyek nem specifikusak a ribo- vagy dezoxiribonukleozidokra. Mennyiségi szempontból a ribo- és a dezoxiribonukleozidok direkt foszforilác iój a nem látszik olyan fontosnak, mint a foszforiboziláció út. Az emlős sejtek egy része (pl. agy, eritrociták, polimorfonukleáris sej tek, illetve általában a magasan differenciálódott sejtek) nem tudnak de novo purin nukleotidot szintetizálni, és szükségletüket exogén purin nukleozidok fe lvételével fedezik. Minthogy a ejtek foszfori láll nukleozidokat (nukleotidokat) általában nem tudnak a környezetükből felvenni c ak purinbázisokat vagy nukleoz idokat - , a

guanin

~\

transzferáz

e

IMP) PP,

GMP

nukleotidszintetizáló kapacitás né lküli sej tek nukleotiddal történő ellátásában a két mentő út lényeges szerepet j átszik. Emberben a táplá lék mellett a máj a nukleozidok fő forrása.

Pirimidin nukleotidok bioszintézise A pirimidinbázis vázatomjai karbamil-foszfátból és aszpartátból származnak (2-225. ábra). Bár látszatra a pirimidingyű rű szintézise egyszerűbb, mint a puriné, a valóságban mégis nagyon sok a kettő között a hasonlóság, mert a karbamil-foszfát szintéziséhez C0 2, glutamin és ATP, míg a timidin kialakulásához tetrahidrofolát is

2-225. ábra. A pirimidinvázat alkotó atomok eredete

Asp

c~ -, C 1

N

t

l

ll

l'

l

l

l l

l l

t

l

l

l

c

~

l

l

,,,''

c }

karba~~;~:>, foszfát

\__..-'

278

AN YAGCSERE

2~226. ábra. A citoszolban karbamil~foszfát-szintetáz ll

o l

~o

P - 0 - C -NH2

szintetáz ll

y

)ATP

~

PRPP

ll

o

2ADP

karbamil-foszfát

UTP

·o - c foszfát -

; ·

Asp----~~~~~--·~

o

~o

ll

/ c.. ._____

"'l

NH~

CH2

l

O=C H - C - coo· ...._____N/

aszpartáttranszkarbamiláz

ll

o

H -N dihidr~

orotáz

l

CH2

l

l

c

H -c-coo· ~........___ / O N

l

H

H

karbamil~aszpartát

dihidroorotát

dihidroorotát~ r:NAD+ dehidrogenáz

NADH+H'

o ll /c...._____ H -N

C- H

l

c

~........___

O

N

/

c-coo

l

H oratát orotát~ r : PRPP faszfari bozil~ transzteráz

PP,

o ll

/c...._____ H- N

C- H

l

ll

C

~........___

O

/

..

C- H

N

orotidilátdekarboxiláz

l R- P UMP

orotidilát,

(uridilát, uridin-S'~monofoszfát)

(orotidin-S'~monofoszfát)

2-227. ábra. Az UMP szintézise. A komplexekben müköd6 enzimeket külön jelezzük (sötétpiros satírozás)

müködő

r\UKLEOTIDOK ANYAGCSERÉJE

)> )) )) )))) )) )))) ))))))) ) )) )) )H))) )) )) )) ))>))))))) )) )) )))))) )) )))))))))))))))) )))))) )))) )))) )))))))) >))))))))) >))) )) )))) )) )))) )) )) ))))))

szükséges. Így a pirimidin- és a purinbázisok bioszintézisében a purin bioszintéziséhez szükséges Oly-t leszámítva az elemek közösek Az enzimek specificitásán kívül a legszembetűnőbb eltérés az, hogy a pirimidin nukleotidokban az N-glikozidos kötés (ugyancsak PRPP közvetítésével) a szintézis későbbi fázisában alakul ki, mint a purin nukleotidokban. A bioszintézis során először karbamil-foszfát keletkezik HC03--ból és glutaminbóL A reakcióhoz két ATP-re és karbamil-foszfát-szintetáz ll-re van szükség (2-226. ábra). A szintézis a citoszolban játszódik le. (Az ornitinciklushoz szükséges karbamil-foszfát a mitokondriumban szintetizálódik és nem Gln, hanem NH4 + szalgáltatja az aminocsoportot.) A citoszolban a karbamilfoszfát-szi ntetáz II allosztérikus regulátora az UTP, amely gátolja aktivitását, illetve a PRPP, amely stimulálja. A pirimidinbázis szintézisének következő lépése a karbamil-foszfát és aszpartát kondenzációja, majd a gyűrű záródása vízvesztés közben. A keletkezett dihidroorotsav ezután oxidálódik és oratsav keletkezik. A reakció oxidált NAD-ot és dihidroorotát-dehidrogenázt igényel (2-227. ábra). Az első három lépést prokariótákban három különböző enzim katalizálja; a már említett karbamil-foszfát-szintetáz, az aszpartát-transzkarbamiláz és a dihidroorotáz. Emlősökben a három enzim, hasonlóan a purinszintézisben résztvevő enzimkomplexekhez, multifunkcionális egységet képez: a három enzim egyetlen polipeptidláncon helyezkedik el (240 kDa) és mint CAD ismert az irodalomban. A pirimidin nukleotidok bioszintézise során csak ezután következik be a ribóz-foszfát kapcsolódása; a donor ismételten a PRPP. Az N-glikozidos kötés kialakulását az orotát-foszforibozil-transzferáz katalizálja. Az ezt követő dekarboxilálás révén UMP keletkezik. A két utóbbi enzim ugyancsak komplexet képez eukariótákban. A bioszintézis során képződött UMP ezután foszforilálódhat (2-228. ábra). Az UDP a dUDP és dTTP kiindulási vegyülete. Az UTP, azon kívül, hogy a nukleinsavszintézis egyik komponense, a CTP szintézisét is szo lgálja. Az UTP-ből Gln és ATP jelenlétében CTP keletkezhet A reakciót a CTP-szintetáz katalizálja (2-229. ábra). A reakciómechanizmus hasonló a

2-228. ábra. Pirimidin nukleozid di- és trifoszfátok dése

279

képző­

purinbázisok szintézisénél leírtakhoz, nevezetesen valamelyik aminosav szolgálta~a az aminocsoportot

o ll

/c"--.. H -N C-H

l O=C

ll C-H

"--..N/

l

R-PPP

Gin

G lu

NH2

l ~c"--.. N C- H l

ll

C C-H -t . . . . . . / O · N J

R-PPP

2-229. ábra. A CTP keletkezése

CTP (citidin-trifosztá t)

280

))))))))}>)))))l)))) )))))))))>)))))))))> ))))))H>))))})))),) ))))))))))>>>>))))

lU-RI

uridinkináz

T

ATP

)))))"J)}H))))))))) >)>n>>l))))))).))) ))))))))))))))))))))) Hl>))>)))))))))))))

citidinkináz

[UMP) ~ fCMPI

\

ADP

[ ATP

ADP'

2-230. ábra. Az uridin és citidin nukleozido k ,.mentö útj a". Az R ribózt jelent

Az uridin és citidin nukleotid ek egyik "rnen tő útját" az uridin-cit idin kinázok alkotják. A reakc iók eredmény eként a nukleoz idokból nukleozid -rno-

l

o·

+ PRPP ~ UM P + PP

1•

A pirimidin nukleotid ek szintézisé nek legfőbb feedback szabályoz ói emlős sejtekben a PRPP, amely stimulálj a, illetve az UTP, amely gátolja a karbamil-foszfát-s zintetáz II aktivitásá t (2-226. ábra). Továbbá az UMP gátolja az orotidilátdekarbox iláz aktivitásá t (2-227. ábra).

o·

l

l l M o-P - O-P - 0 ll ll

·o-r- o-r-o ll ll

o

AI'\YAGC ERE

nofo zfát képződik (2-230. ábra). A másik "mentő út" hasonlít a purinbáz isokná l leírtakho z (2-224. ábra), amikor i a pirimidin házi PRPP-tal reagál, pl. urac il

o

))))H)H)>n>))))

o

o

o

OH

H

NADPH +H+

2-231 a ábra. A ribonukleo tid-reduktáz. A reakció, amelyet a ribonukleotid-reduktáz katalizál, egy nukleozid-dlfoszfát redukciója, aminek eredményeként dezoxi-ribonuk/eozid-difoszfát keletkezik. Az enzim két alegységbő l épül fel; dimer szerkezetú. A kisebb alegység teszi lehetövé a nukleotid ribóz 2-oxigénjén ek eltávolítását. A nagyabbó alegység tartalmazza az -SH csoportokat, amelyek oxidáládásuk során a hidragént szolgáltatják, továbbá felelős a szubsztrát megkötésé ért, a specificitásért és az aktivitás mértékéért: a különbözö dezoxinukleotidok a/loszterikusan szabályozzák saját szmtézisüket. A múködés közben oxidálódott $ H-csoportokat a tioredoxin redukálja vissza, amely tioredoxin-reduktázzal és NADPH-va l kapcsolt reakció.

"i KLEOTIDO K A YAGC. EI~ ÉJE

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

)))))))))))))))))))))H))))))))))>>>~>>>>)>)1o))))))>>>>>>

Dezoxiribonukleotidok keletkezése A dezox iribonuk leotidok kialakulá sáért a ribonukleotid-redu ktáz komplex a felelős, amely csak olyan sejtekben aktív, amelyek sejtosztódás irányába elkötelezettek. A reakció lényege, hogy a

>>>>)>H>>>>>>>•>>>>>>

281

ribóz 2' szénatom ján lévő hidroxilcsoport redukálódik és az oxigén bő l víz keletkezik (2-23 J. ábra). A reakciót katalizáló enzimrendszer azonban több komponensből épül fel. A ribonukl eotid-red uktáz SH-tartalmú fehérj e, amely a tioredoxi n nevü kofaktorr al müködik. Az enzim működése közben

elsődleges

szabályozó hely

szubsztrátok ADP

COP UDP GDP

ATP

GDP

G

(G ADP

dGDP __. dGTP

J dADP __. dATP

2-231 b ábra. A ribonukleo tid-reduktá z szabályozá sa. Az enzim8 -alegysége tirozil-hidroxil-csoporto 2 n keresztül szabad gyök tipusú reakcióban vesz részt, amihez oxigénhez kötött vas kofaktorra van szükség. Az enzim aktiv centruma a két alegység (81 és 82) határán alakul ki úgy, hogy a katalízisben a 81-alegysé g két SH-csoportja is részt vesz. A 8 1-alegység egyben felelös az enzimaktivitás szabályozá sáért is. Az elsődl eges szabályozó helyhez kötődö ATP fokozza, míg a dATP gátolja az enzim aktivitását. A másodIagos szabálylozó hely (szubsztrát specificitásért felelős rész) komplikáltan müködik; az ATP, dAT P, dGTP, dTIP pozitfv és negatív allosztérikus hatásokon keresztül a szubsztráto k átalakításá nak arányát befolyásolj ák az ábra alsó részében jelzett módon .

... ... ... .. l

--------------~--~~~~~~

282

•>>>»>>,,.,,,,,,••,,>,,»>>>>>•,•>>»>>)))>>>>>>>»>>»)>>>n>>n>>Jo>>>>>»»>>•>»»>>>>•••>»>>>>•"»»n>>>>,>>>>>>>»»>>>>>>>>»>•»•>>>>>>>>>>>»»»>>»»>>»»»»>>

az SH-csoportok oxidálódnak (S-S). A kofaktor visszaredukálását eukariótákban glutation-reduktáz (prokariótákban tioredoxin-reduktáz) katalizálja, amely NADPH-ot használ hidrogéndonorként. Végeredményben a dezoxinukleotidok szintézise úgy írható le, hogy a ribóz hidroxilcsoportja redukálódik, és a reakcióhoz szükséges hidragént a N ADPH szolgáltatja. Az enzimrendszer, amely ezt a reakciót katalizálja, az összes nukleotidot szubsztrátnak tekinti, de csak akkor, ha azok nukleozid-difoszfát formájában vannak jelen. A ribonukleotid-reduktáz aktivitása komplikált módon szabályozód ik; a különböző nukleozidtrifoszfátok koncentrációjuktól fiiggően pozitív és negatív effektorként hatnak (2-23 1b ábra).

A dezoxi-timidilát (dTMP) és a timidin-trifoszfát (dTTP) szintézise A DNS-szintézishez szükséges timidin-trifoszfát két úton is keletkezhet Az egyik út a dUMP metilálása, amely a dTMP keletkezését eredményezi. Ametilcsoportot N 5,N 10-meti lén-THF szalgáltatja és a reakciót a timidilát-szintáz enzim katalizálja. A reakció szorosan kapcsolódik a folát oxido-redukc iós c iklusával, mert a tetrahidrofolát hidrogéndonorként is szerepel. A tetrahidrofolát nemcsak a C l -töredéket, hanem a transzfer reakció

során a metilén ~ metil redukcióhoz szükséges ' . szo l ga' l tatja; . tgy ' h.d 1 rogent IS az N 5-N 10-me t'1lén-tetrahidrofolátból dihidrofolát keletkez ik. A dihidrofolát tetrahidrofoláttá redukálását a NADPH-függő dihidrofolát-reduktáz katalizálja, míg a metiléncsoport szerinből származik (2-232. ábra; lásd 2- 181. ábrát is).

A reakció orvosi szempontból több okból is érdekes. Egyrészt a timidilát-szintáz enz im gátlása, másrészt a tetrahidro-dihidrofolát ciklus gátlása is csökkentheti a DNS-szintézisbez szükséges dTTP- szintet, amely sejtosztódás irányába elkötelezett sejtek (pl. rosszindulatú daganat sejtek, de a vérképző rend zer sejtjei is) proliferációjának gátlására felhasználható. Az első típusú gátlás mechanizmusát az 5-fluorouracil szemlélteti. Emberi szervezetbe juttatása után a sejtekbe kerülve a pirimidin nukleozidok foszforilációját katalizáló kinázokkal - A TP jelenlétében - a fluor-uridinszármazék is foszforilálódik és a keletkezett F-dUMP-t a timidilát-szintáz szubsztrátjának tekinti (2-233. ábra). A szubsztrát-enzim komplex kialakulása után azonban az enz im nem tudja e lereszteni " hamis" szubsztrátját, az-

o

o

ll

/

ll

C

-f' ............ /

C-H

N

l

P - dR

/

timidilát-szintéz

C-H

l

O

ll

c '-....

H- N

ANY AC CSERE

5

T\

10 -

N, N

•

ttlóo-

DHF

dUM P

Gly~THF Se r

2-232. ábra. A dezoxi-timidilát (dTMP) szintézise

c '-....

H- N

C-CH

l

"

C

0

~ --......... /

C-H

N

l

P-dR dTMP

reduktáz

3

~ U KLEOTIDOK AN YAGC ERÉ.JE

283

zal kovalens komplexet képez és elveszti katalitikus funkcióját ("szuicid enzim"). A második típusú gátlást a tetrahidrofolát-analógok (pl. metotrexat, aminopterin) szemléltetik, amelyek az N 5 ,N 10-metilén-THF reszintéziséhez szükséges dihidrofolát-reduktáz kompetitív gátlószerei (K; <10-9 M) és így teszik lehetetlenné a dUMP metilálását.

o ll

/ c.. . . . . _ H- N

C- F

l

C

~ .............

O

F-dUMP

ll

N

/

C- H

l

dR-P

E \

- SH

N' , N" -metilén-THF

o ll

THF

/ c..........._; F-dUMPenzimkomplex

H- N

C- F

C

C- H

l

A dTMP keletkezésének egy másik lehetséges útja a sejtek által feJvett dezoxi-timidin direkt foszforilációja. A reakciót a timidin-kináz katalizálja ATP felhasználásával. A két út pontos biológiai jelentősége ma sem ismert. Azonban bármelyik úton keletkezik is a dTMP, az timidilát-kinázzal, majd nukleozid-difoszfát-kinázzal tovább foszforilálódik. Foszfatázok jelenlétében azonban a timidin-mono-, di- és trifoszfátok defoszforilálód- hatnak. A reakciók sebességétő l függően a DNS-szintézishez szükséges dTTPszubsztrát a sejtek rendelkezésére állhat (2-234. ábra). Az enzimek aktivitása a sejtciklusoktól függően változik. A timidin-kinázzal történő timidilátszintézist "mentő útnak" is szokták nevezni.

cf"-N /~ l

E

s-

dR - P

A timidin-kináz lehetséges biológiai szerepén kívül (pl. tumorokban és proliferáló normál szövetekben is általában fokozott az aktivitása) az enzimaktivitás meghatározásának gyakorlati jelentősége is van. A medicinában széleskörűen elterjedt a különböző szövetek, sejtek DNS-szintézisének mérése. A módszer lényege, hogy a radioaktív izotóppaljelzett vagy 14 C) dezoxi-timidint a sejtek felveszik, majd foszforilálás után beépítik a DNS-be. A DNSbe történő radioaktív timidin beépülés sebessége hasznos információt adhat a DNS-szintézis-

CH

ről.

2-233. ábra. A timidilát-szintáz gátlása fluorouracillal. A szervezetbe juttatott fluorouracilból először F-UDP, majd abból F-dUDP, végül pedig F-dUMP lesz. A timidilát-szintáz 10 (E-SH) reagál az F-dUMP-vel -metilén-tetrahidrofolát (THF) jelenlétében. Az enzimről a .,hamis" szubsztrát nem disszociál, ezáltal inaktív enzimkomplex jön létre

rvs,N

2-234. ábra. A dezoxl-timidin-trifoszfoszfát képződése . A timidin di- és trifoszfát képződését kinázok, mig lebontásukat foszfatázok katalizálják; tehát a reakciók nemcsak a koncentrációktól, hanem a kü/önböző enzimek mennyiségétől és aktivitásától is függnek

284

»»»»>»»>»»»»»»»>»>»>>>>»>»»»>>»>>»»»>>>>>»»>>»>>>>>»>>»»>»>>>>>>»>>>>»»>>>»»>»>»>>»>»>>>>»»»»>>>>>»»>>>>>>>»»»»»»»»>»»>

Dezoxiribonukleotidok bioszintézisének szabályozása A D NS szintézis pontos szabályozásának egyik feltétele, hogy a különböző dezoxi-nukleozidtrifoszfátok, mint szubsztrátok, megfe l elő arányban álljanak rendelkezésre. Ezt a feltéte lt szeigálják a megl ehetősen komplex regulációs rendszerek. Ebben kulcsszerepet j átszik a ribonukleotid-reduktáz, ame ly a nukleozid-difoszfátokbó l készít dezoxi-nukleozid-difoszfátoka t. Az enz im működése azonban nagyon j ól szabá lyozott azáltal, hogy a különböző lehetséges termék ek az en zim regulátor alegységén keresztül egyes reakciókat aktiválnak, másokat gátolnak. A rendszer müködését szem lélteti a 2-23 l b ábra.

Nukleotidok bioszintézisét befolyásoló vegyületek. Terápiás felhasználás A kemoterápia törekvése, hogy nem kedvező proliferációs fo lyamatokat (pl. rosszindulatú daganatok, vírusok, autoimmun betegségek) gátcini tudjon. Ennek egyik útja a nukleotidek bioszintézisének befolyásolása. Természetesen hátránya az ilyen j ellegű gyógyszeres kezelésnek, hogy nemcsak a nem kedvező, hanem a fontos és "hasznos" funkciókat szolgáló és gyors DNS- tum overrel rendelkező sejteket (pl. vérképző-, bélhám-, ivarsejt, immunrendszer) is érinti. A fenti célt szolgáló vegyületek hatásmechanizmusának legtöbbször az az a lapj a, hogy a tennészetes anyagcseretennékekhez hasonló szerkezettel rendelkeznek és így a nukleotid-anyagcsere különböző enzimeinek reverzibilis vagy irreverzibilis gátlószerei lehetnek. Ilyenek a folsav-, a purin- és a pirimidinantagonisták, illetve -analógok. A timidilát szintézisénél már említett aminopterio a folsav antagonistája, mert a dihidrofolát-reduktáz a tetrahidrofolát mellett ezt is szu bsztrá~ának tekinti.

Al'\ Y AGCSER E

A folsav a"' ember számára vitamin, baktériumok azonban képesek szintetizálni és felhasználni saját nukleotid- és aminosav-anyagcseréjükböz. A szulfonamidok (2-235. ábra) a folsavban lévő p -amine-benzoesav (lásd 2.4. fejezet) analógjai, és így a bakteriális folsavszintézis gátlásával - a bakteriurnak osztódásának késleltetésével - antibakteriális gyógyszerként használhatók (A szulfonamid volt az első specifikus antibakteriális szer.)

2-235. ábra. A szulfonamidok szerkezete. Az R változtatható vegyületcsoportot jelent

A 6-merkaptopurin és származéka (pl. Imuran) a hipoxantin szerkezeti analógia (2-236. ábra). Foszforibozilálása hipoxantinguanin-foszforibozil-transzferáz jelenlétében (2-224. ábra) tioinozinsavat eredményez, meJy az inozinsav adeniláttá, illetve guaniláttá történő átalakulását gátolja (2-22 1. ábra).

2-236. ábra. 6-Merkaptopurin

A citozinmetabolizmussal interferáló antimetabolit származékok közül a citozin-arabioozid a legismertebb vegyület. Szerkezete

~UKLEOTIOOK ANYAGCS ERÉJ E

mindössze annyiban tér el a citozinétó l, hogy a ribóz helyett arabinóz a cukorkom ponens. A sejtekben foszforilálódik (lásd még a 2-230. ábrát) és igy mint a dCTP analógja, a ONSszintézis gátlószere. Az 5-fluorouracil, azon kivül, hogy a timidilát-szintáz inhibitora (mint ezt a tirnidilátszintézisénél már említettü k), beépül az RNS-be is, annak funkcióit gátolva. A herpesvir usok által okozott betegség ek kezelésére is felhaszná lhatók nukleozid analógok, amelyek a virusok timidin-k inázát felhasználva gátolják szaporod ásukat (a vírus timidin-kináz nem specifiku s, így a nukleozid analógoka t is foszforilá lja és az azokból képződött nukleozid-trifoszfá tok gátolják a DNSpolimerázokat). Ma ezek képezik a leghatáso sabb antivirá lis szereket (pl. "Acyclo G'', "Zovirax"). A felsorolt vegyülete ket csak pé ldaként említettük, hogy illusztrálj uk azokat a törekvése ket, amelyekk el az orvos a nukleotid -anyagcsere befolyáso lásán keresztül igyekszik a leukaemiá t és más rosszindu latú daganatos megbeteg edéseket gyógyítani . Ismételten hangsúlyo zni kell azonban, hogy ezen kezelések azon az elven a lapulnak, hogy a leggyorsabban osztódó sejtek károsodn ak a legnagyobb mértékbe n, de nem kizárólag. Így például a rákos sejtek pusztulás a mellett a bélhámsejtek és a vérképző rendszer elemei is károsodnak.

aminázo k (amino-h idro lázok) katalizálj ák (2-237. ábra). A dezoxi-nukleotidok lebontása is hasonló rnódon kezdődik. A dCMP-ből először dUMP keletkez ik, majd dezoxi-ur idin, de dezoxi-citidin intermed ieren keresztül is keletkezh et dezoxiuridin. A dTMP e l őször dezoxi-ti midinné a lakul át (2-237. ábra).

A purinbázi sokból emberben urát (húgysav ), míg a pirimidin bázisokból ~-aminosavak keletkeznek. Orvosi szempon tból a purinbázisok degradác iója két szempon tból is jelentős. A degradác ió végtermé ke az urát, vízben rosszul oldódó vegyület és az emberben egy nagyságrenddel magasabb a szérumsz intje, mint a többi emlősben . Koncentrációjának bármilye n okból bekövetkező további emelkedé se kóros. A magas szint ugyanakk or "előnyös" is lehet, ugyanis a bilirubin, a C- és E-vitami nok mellett az urát a legjelentő sebb antioxidá ns, amely szerepet játszhat a tumoros betegség ek kifejlődésé­ nek késlelteté sében vagy az emberi élettartam meghossz abbításáb an. Az emberrel szemben más emlősökben az urát tovább kataboliz álhat; urikáz enzim hatására (ez az emberben hiányzik) a puringyűrű felszakad és rendkívül jó vízoldéko nyságú vegyület, allantoin keletkezik, amely Jeiválaszt ásra kerül.

Purinbázisok lebontása

Purin és pirimidin nukleo tidek lebontása A purin és pirimidin nukleotid ek degradálá sa a foszfátcso portok eltávo lításával kezdődik. A reakciót nukleotidázok katalizá lják, aminek eredményeként adenozin , guanozin , citidin és uridin keletkezik. Az AMP az első lépésben dezaminálód hat is, és IMP keletkezé se után történik a foszfát leadása inozint eredmény ezve. Ha adenozin keletkezi k, akkor abból dezarninálás után inozin jön lé tre. A dezaminá lás i lépéseket dez-

A reakciók lényege az, hogy az adenozin ból inozin, majd az inozinból és a guanozinból is xantin keletkezik. Ez utóbbi oxidációj ával urát képződik . A reakciók több lépésben j á tszódnak le {2-238. ábra). Az adenozin ból először inozin keletkezik az adenozin -dezamin áz katalízise révén, majd a ribóz- 1-fo zfát lehasadás ával, amely reakciót nem specifiku s purin-nukleozid-foszforiláz katalizálj a, hipoxantin jön létre. A hipoxanti n a továbbiakban xantinná oxidálódi k; a reakcióho z oxigénre és xantin-o xidáz enz imre van szükség. A xantin-ox idáz hatására vízből és oxigénbő l hidrogén-pero xid keletkezik.

286

)) )))))))))) )))))))))))) )))) )))) )))))))))))) )>)))) >))))))))))))))) )))))) )))) )))))))))) ))}) )))))) )))l))))))))))))))))))))))))))))))))))))>))))))))»)))))))))))))))))))))))))))

H20

inozin

citidin

guanozin

~

ANYAGCSE RE

NH~

.J.

uridin

dezoxi-citidin

H,

6~ NH 4+

dezoxi-uridin

dezoxi-timidin

2-237. ábra. A nukleotidok degradálásának kezdeti lépései: a nukleozidok keletkezése

Guanozinlebontás esetében a reakció a ribóz- l-foszfát eltávolításával kezdődik, amelyet ugyancsak purin-nukleozid-foszforiláz katalizál, majd a következő lépés a dezaminálás, amelyet a guanin-dezamináz katalizál. A xantin végül 0 2 és víz fell1asználásával a xantin-oxidáz által katalizált rekacióban húgysavvá oxidálódik. A húgysav keto-enol tautornér formában jelenhet meg. A dezaminációs lépések során keletkezett ammóniából karbamid keletkezik az omitinciklusban, a xantin-oxidázok működése során keletkező hidrogén-peroxidból pedig kataláz hatására víz és oxigén képződik. Alacsony oldékonyságának következtében az urátszint emelkedése patológiás elváltozásokat okozhat; a tünetek egy részét a különböző szövetekben kicsapódott urátkristályok váltják ki. Egyik legjellegzetesebb tünetcsoporto t, a kösz-

vényt, az ízületekben felhalmozódott urát által indukált aspecifikus (nem bakteriális) gyulladásos reakciók idézik elő . A vesében felgyülemlett urát viszont vesekő panaszokat okozhat. A tünetek súlyosbodhatnak vagy enyhülhetnek az életformától vagy bizonyos betegségektől fiiggően; nagy mennyiségű purinban gazdag táplálék vagy olyan társult betegségek, melyek fokozott sejtszéteséssetjárnak (pl. Leukaemia, polycythaemia, krónikus nephritis) tovább terhelhetik a már amúgy is magas urátszintet Alkoholfogyasztás fokozza a glukóz direkt oxidációját, ami a ribóz-5-foszfát felszaporodását eredményezheti. Az utóbbi fokozza a foszforihozi l-pirofoszfát szintézisét, ez a purinszintézisnek kedvez és így további purintúltermelést okozhat. Hasonló következményekkel jár a glukóz-6-foszfatáz-deticieneia is (von-Gierke-kór); a felhalmozódó

~ KLEOTIDOK A:'I'YAGCSER~:JE

)) l))) )) I H))))))) ll ll . . ll)))))))))))) )))))))) )) )))) )))))) )))) )))) )) )) )))))) )) )))) )))) )))) ))))

> NH~N~N o

> ~~N

"::i

H;
> v:

~N

l

NH~N~N 2

H

purin-nukleozid -foszforiláz

o

H-N

hipoxantin

l

ribóz

ribóz-1 -P

guanin

l

H- N

l

2

p

~N

l

H -N

28 7

o

~N

guanozin

)))))) )) )) l)))l)))ll))>)))))))))>)))>))) )l

l

H,

guanindezamínáz

H

> o~~N o

~N

l

H -N

l

H

húgysav

l

H

húgysav

(enol)

(keto)

urát

2-238. ábra. A purin nukleozidok lebomlása; a húgysav képződése

xantin

2 88

))))l))),))))))) •> l)))))))))), )H))))))) >)l) )))Ul)))U))) ll)))))) ll l))) l))) )l))ll n))))>>» )l>ll) ))))))))))l> ll ll)) lll> l>)))>>> U>>>> ll >lll n)) ll ll>>>> ll))»>> ll >>»>H> l >l)

ribóz-5-foszfát fokozott PRPP-szintézist produkál. A purinbázis-anyagcserezavarok leggyakoribb oka azonban a PRPP-szintetáznak, a PRPP-amidotranszfcráz vagy a hipoxantinguanin-foszforibozil-transzferáznak károsodása vagy teljes hiánya. Ha a purin nukleotidek szintje emelkedik, az nom1ál körülmények között gátolja a PRPP-szintetáz és a PRPPamidotranszferáz aktivitását (feedback gátlás; 2-223. ábra); az enzimek bizonyos defektusa esetén (az allosztérikus alegység károsodása) azonban ez nem következik be, a magas nukleotidszintet követő fokozolt purinlebontás (urátképződés) meUé intenzív purin nukleotid szintézis társul. Ismert olyan enzimdefektus is, amely a PRPP-szintetáz hiperaktivitásával jár. Még frappánsabb tüneteket eredményezhet a "mentő út" károsodása, a hipoxantin-guaninme1t foszforibozil-transzferáz defektusa, ilyenkor a "felesleges" nukleozidok nem kerülnek újra felhasználásra és a nukleotidek lebomlanak fokozott urátképződést eredményezve. Az enzim teljes hiánya esetén (Lesch- Nyhan-szindróma) a fenti tünetek mellé bizarr pszichés magatattás i formák társulnak (agresszivitás, görcsök, öncsonkítás, illetve mentális visszamaradottság). A köszvény, legalábbis a húgysavfelszaporodás, klinikailag kezelhető allopurinollal vagy alloxantinnal. A gyógyszerek hatásmechanizmusa emlékeztet a timidilátszintáz fluordezoxi-uridinnel történő gátlására. Az allopurinol, illetve alloxantin a hipoxantintól és a xantintól csak abban különbözik, hogy a purinbázis 7 és 8 helyzetű két atomja felcseréJődött, mint azt a 2-239. ábra mutatja (lásd még a 2-238. ábrát is). A xantin-oxidáz mindkét molekulát szubsztrátjaként használja, de a xantin- vagy a hipoxantin-analóggal történő reakció után irreverzibilisen kötve marad, ún. "szuicid enzim". Az enzimmennyiség csökkenése csökkent urátképződésl eredményez (a PRPP-szint természetesen nem csökken). Ismert még az adenozin-dezamináz (2-237. ábra) és a purin-nukleozid-foszforiláz (2-238. ábra) hiánya, amely súlyos immun-

A;'IIYAGC SERE

deficienciát eredményez. Az ilyen betegekben a dATP és dGTP szintje százszorosára is emelkedhet. (Jelenleg 20 beteg gyerek ismert az irodalomban, akiket rekombináns enzimekkel kezelnek és jól vannak.)

2-239. ábra. Az allopurinol. A hatásmechanizmusért felelős szerkezeti része pirossal jelölve

Pirimidinbázisok lebontása A citidin és az uridin lebontá a közös úton történik, mert a c itidinből dezaminálással uridin keletkezik (2-237. ábra). Így a katabolizmus az uridin további degradációját jelenti. Az uridinbő l a ribóz- 1-fo zfát lehasadása után uracit keletkezik. Az uracit ezután redukálódik é dihidrouracil keletkezik. A reakcióhoz NADPH és pirimidindehidrogenáz kell (2-240. ábra). A heterociklusos gyű rű hidrolízis útján szétnyílik, így a dibidrouracilból N-karbamil-f3-alanin keletkezik; a reakciót a dihidropirimidináz katalizálja. Ezután újabb hidrolízis történik, Nl-14 és HC0 3- válik szabaddá, és f3-alanin keletkezik. A timidinbő l Limin keletkezik, miközben a dezoxi-ribóz dezox i-ribóz-1 - fosz fáttá alakul; a reakciót a pirimidin-nukleozid-foszfo riláz katalizálja. A timin lebontása ezután ha ontó reakciókkal történik, mint az uracilé; redukció után hidrolízissei a gyürű felhasad, majd újabb hidrolízissei itt is NH 4' és HC0 1- válik szabaddá, é f3-aminoizobutirát keletkezik (2-240. ábra). Ez utóbbi szintje a vizeletben megnőhet magas DNS-tartalmú diétán vagy tumoros betegségekben. A f3-aminoizobutirát ezután transzaminálódik metil-malonil-CoA-t eredményezve, amely azután szukcinil-CoA-n ke-

• UK LEüTID OK A\ YAGC 1:-, RÉ.II:

) ) )))) » ")))) )))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))>)))) )) )) )) ))

HN~CH,

Hoó~

uracil

o~)lH

l

l

H

H

NADPH +H ' ~ NADP'

'*'i

pirimid indehidr ogená z

o

dihidro uracil

H))~

NADPH +H~~ NADP

~

H - ó;H ,

dihidro timin

O

l

N

H

l

H

H dihidro pirimid ináz

N-karbamiiN-karbamilp-amin oizobut irát

P-alanin (ureido propio nát)

ureido propio náz

p-alanin

p-amin o-izob utirát

2-240. ábra. A pirimid inbázi sok lebom lása. Az uracil és a limin lebontásában hasonló enzimek müködnek közre

289

290

n n,,>>,, n u,.,, n •>>> ,H) l>~,,,>> >H),, >H>>>>> )))>))>H>,,>>>> •> >>>>» •> >>>~>u> u u>)>>,, n,,>>>> n>> n >H>>>>> n >>>>,,,, >>>>>UHU> nu>>>> >>>»H> >H)))>)>>»>»>>>n

nem tud közvetlenül átalakulni AMP-vé és vice versa, koncentrációjuk, a sejtek szükséglete szerint, kerülő úton mégis módosulhat. Mindkét molekula visszaalakulhat IMP-vé és abból új ra reszintetizálódhat (2-221. ábra). A két út kü l önböző, nem a reakciók megfordításáró l van szó. Az AMP és a GMP is dezaminálással alakul át IMP-vé, az első reakciót az AMP-dezamináz katalizálja, mig a másodikat a GMP-r eduktáz, amely NADPH-t használ. Ezen reakcióknak nemcsak a nukleotidanyagcserében van szerepük, hanem az izomban a dezaminá lás jelen tős hányadát is alkotják. A pirimidin nukleotidek is átalakulhatnak egymásba (2-24 1. ábra), s azok koncentrációi egyes reakcióiera pozitív vagy negatív effektorként hatnak. Mindezekből és a korábban bemutatott ribonukleotid-reduktáz komp likált szabályozásából (223 lb ábra) látható, hogy a sejtek számára mennyire fontos a nu kleotidkészletek mennyisége és egymáshoz viszonyított aránya.

resztül a citrátkörbe kerül. Az ammónia az omitinciklusban ureává alakul és így hagyja el a szervezetet.

Minthogy a pirimidinbázisok degradációja során keletkező intermedierek vizes fázisban j ól oldódnak, köszvényes j ell egű betegségek nem alakulnak ki. Ism ert a timidinszint megnövekedése a vérben, és megjelenése a vizeletben a dibi dropirimidináz (2-240. ábra) defektusa esetén. A kórkép epilepsia tüneteivel társul.

Nukleotidek egymásba átalakulásai

történő

Ahogy azt a purin nukleotidek szintézise során láttuk, az IMP-ből AMP és GMP lesz. Bár a GMP

cltl
2-241 . ábra. A pirimidin nukleotidok egymásba történő átalakulásai. A pozitív jel (+) aktiválást, a negativ(·) gátlást jelent

--•~~o ODP

l~

l l l

dCTP +--- dCDP

uridin

'

l '' ~

\ \

dCMP

UMP

~{)

j

•~~~~~-

\

\

\ \

\

dezoxicitidin

l

1

l \ / ~e~o~i\\ \ l /~mod'~~: '\\ l/
UDP - -+ dUDP ~ dUMP

{)..

i

!

dTMP +---

/

//

\ ,

\

dTDP /

~ dTTP

ANYAGCSERE

/

1

//

N KLEOTIDOK A1 VAGCSERÉJE

29 1

8 12-vitamin; metil-malonát-acidosis és anaemia

lódó intrinsic faktor (fehérje, 59 kDa) nélkül a táplálékban lévő 8 12-vitamin nem szívódik fel az ileumból. Totális gastrectomia (gyomor mű­ téti eltávolítása) ugyan összeegyeztethető az élettel ("nem esszenciális szerv" a táplálék emésztése szempon~ából), de az intrinsic faktor hiánya már súlyos problémákat okoz (lásd később). Normál körűlmények között a B rr vüamin transzportálódik a bél lumenéből és az ún. a transzkobalamin II révén a véráramba, majd a májba jut, ahol raktározódik {2-243. ábra). A 8 12-vitamin koenzim nélkül a metil-malonii-CoA-mutáz nem tud rnűködni; csökkent funkciója esetén a metil-malonil-CoA nem alakul át szukcinil-CoA-vá (2-203. ábra) és felszaporodása metil-malonát-acidosist eredményez. Az enzim teljes hiánya nem egyeztethető össze az élettel. A 8 12-vitamin másik szerepe a homocisztein-metil-transzferáz enzimfunkciójának biztosítása (2-182. ábra). Elégtelen működése (pl. 8 12-vitamin-hiány vagy koenzim-B 12-elégtelenség) esetén az N 5-metil-tetrahidrofolát nem tudja átadni metilcsoportját és felhalmozódik ún. folátcsapda" J'ön létre. Nem keletkezik ' " 10 10 elegendő N 5,N -metilén-THF, illetve N -for-

A nukleotid-anyagcsere több szinten is szorosan kapcsolódik az aminosav-anyagcserével. A nukleotidek szintézise aminosavakból történik, az aminosav-anyagcsere és nukleotid-anyagcsere a purinnukleotid-ciklus révén regulációs egységet is képez (2-242. ábra) . Ennek elsősorban az izomszövetben van szerepe. Az aminosav- nukleotid anyagcsere egy másik, orvosi szempontból is érdekes kapcsolata a B n-vitamin (2-204. ábra). A 8 12-vitamin két enzimnek, a metil-maloniiCoA-mutáznak (2-203. ábra) és a homociszteinmetil-transzferáznak is kofak:tora (2-182. ábra). Ez utóbbi tetrahidrofolát-függő enzimrendszert alkot (2-181. ábra). Láttuk azt is, hogy az aminosavakból történő nukleotidszintézis is tetrahidrofolát-függő.

Így nem meglepő, hogy a 8 12-vitamin hiánya vagy funkciózavara a nukleotid-anyagcserét súlyosan érinti és két kórképet is okozhat; anaemiát és metil-malonát-acidosist. A 8 12-vitamin felvételét és funkcióját több faktor is befolyásolja. A gyomorban szintetizá-

~Giu

/

tra~s~-

amm az

"" __ \

/

oxála~ fumarát

glutamátoxálacetátaminosav

tr/am~ ináz adenilátdezamináz

a-ketoglutarát

\

As p

adenilszukcinátszintetáz IMP

2-242. ábra. A purinnukleotid-ciklus (lásd még a 2-221. ábrát)

'

'

NH+ 4

292

>»»>»»» » >>>>>>» »»>>>»>m m >>>m>>m>mm>»>m> >»>»m»>>>mm >>mnm >H>>>>m>>>>»>>»>»>mm>»»>>mm> m> >»>>»>» >»»>»» >»»>>m»

ANYA GCSERE

~

8 vt\,Hnllltranszkobalamin ll (szállítás)

gyomor

transzferáz lipidanyagcsere

l

81

koenzim

P~P,

\ "-----. metil-malonii-CoA/

~ homocisztein

metil-malonil-1 CoA-mutáz

l

ho.m ocisztein\ N5-metil-THF metll-transzferáz " \ :

szukcinii-CoA

Met

l~ sz~~~~;is

nukleotidszintézis

citrátciklus

2-243. ábra. A 8 12-vitamin transzportja, aktiválása és szerepe. A táplálékból származó 8 12-vitamin az intrinsic faktorral a vérkeringésbe kerül, ahol a transzkoba/amin ll szállítja és juttatja el a májba. A 8 11-vitamin A TP-vel történő aktiválása után alakul ki a funkcióképes B 1r koenzim (2-204. ábra), amely két enzimnek, a metil-malonii-CoA-mutáznak (2-203.ábra) és a homocisztein-metil-transzferáznak (2-182. ábra) is a kofaktora

o l

ol

o

O=S -O - P - O-CH

"

o

n

o

2

ATP

H

O ATP

l

ADP

O= P -o-

l o-

2-244. ábra. Az adenozin-3'-foszfát-5'-foszfosz ulfát (..aktiv szulfát" )

képződése

OH

293

' \ G( SER~:JF:

Nl 1KLF:OTIDO h: \

ecooN

l

H PRPP::l nikotinét-foszforlbozll· transzteráz pp l

O

coo nikotinátmononukleotid

+

N

l

P- R ATP: : { adenililtranszferáz

o

ppl

, H -N oC ll

o-coo ·(l)

ADP+ P,

ATP

NH

~N

lll> N~

N

l

R-

P -

P -

l

l

R

P -

P -

R-

l

R

nikotinsavamid-adenin-dinukleotid (NAD •)

nikotinát-adenin-dinukleotid

ATP NAD+·kináz ADP

o

, oC-NH ll

N

o· l

o·· l

o- P - o - P ~ o

ll

o

NADP.

HO

OH

ll

o

O

OH

O

l

P -O

ll

o

2-245. ábra. A NAD• és a NADP• szintézise. A NAo• szintézise után történtk a ribóz 2'-hidroxi/csoportjának foszforilá/ása ATP felhasználásával, amikor a NA o•-ból NADP' keletkezik; a reakciót a NAD' -kináz katalizálja. Rövidítések: PRPP, foszforibozil-pirofoszfát; P" anorganikus foszfát

294

)) )) )~ ,))U)))))))))))))))))))))))))))))))))>)))))))))))))))))}) )))))))))))~)))))) >U))))))>)))))) ))>UH>

>>\) >>)))U)))))))>>)))) >))> >> >> >> >) u >UH>)) >HU>)) >>)>>>)H))> >>

Ai\ 'Y AGCSERE

H H H l l l

CH2 -C - C - C - CH2 - OH

l

l

l

OH OH OH riboflavin (82-vitamin)

ATP ADP

H

CH2 -

:i H

riboflavin-kináz

H

O

l l l C- C- Cl l l

l ll

CH2 - O - P-O

OH OH OH

ATP~

ribotlavin-foszfát (flavin-mononukleotid, FMN)

O

adenilil-transzferáz

PP, ~

H

H

H

l

l

l

l

l

l

o-

O

l

l

ll

ll

~2 - C - C -C- CH 2 - 0 - P - 0 - P

OH OH OH

O

O

O

OH

OH

flavin-adenin-dinukleoticJ (FAD)

2-246. ábra. A FAO szintézise és redukciója. Az első reakciótermékben a fiavinrész megegyezik a riboflavinban látható szerkezettel

,

KLEOTIDO K A~ YAGCSE R ÉJ E

295

CH3 OH

l

l

HO-CH - C - CH - C- NH - CH - CH - C002 l ll 2

CH3

pantotenát (85-vitamin)

2

O

:l

ATP

pantoten át-kináz

ADP

O

CH3 OH

l l

l

O - P - 0 - CH - C - CH - C- NH - CH l! 2

O

ll

CH3

CH - COO-

2

4-foszfopantotenát

2

O

ATP~ Cys ADP+P,

~ foszfopantotenil-cisztein-szintáz

o-

CH3 OH

l

l

l

O

COO

ll

l

o -- P - O - CH - C - CH - C- NH - CH -CH - C - NH-CH 2 2

~

ll

l

O

ll

CH3

l

O

CH 2

l

SH

HCO,

~

foszfopantotenil-cisztein-dekarboxiláz

4-foszfopantetein

ATP ~ PP, ~ adenilil-transzferá z detoszfo-C oA

ATP ~

N~

~N~ll N

N

O

ll

O

fl

OH

l

CH3

l

o· l

>

~N

ADP~ detoszto-CoA-kináz O

l

C -CH2 -CH2 -NH-C -CH-C -CH -O-P - O- P -O 2

l

~

l

l

~

ll

o

ll

o koenzim -A (CoA)

CH2

l Cf\ l SH

O

OH

l

O-P-O

ll

o 2-247. ábra. A koenzim- A szintézis e és képlete Először a paniolenál primer alkoholos hidroxilcsoportja foszforilálódik, majd karboxiicsoportja egy cisztein aminocsoportjával savamid kötést hoz létre. A következő lépésben a Cys dekarbox ilálódik és a foszfopantotein foszfátcsoportja A TP-vel reagál. Végezetül a ribóz 3'-szénatom hidroxilcs oportja foszforilálódik.

mil-THF és így a nukleotidok szintézise gátolt lesz, ami fóleg a gyorsan osztódó sejteket, pl. erythroblastokat érinti. Következményként az anaemiák egy fajtája alakul ki. A homocisztein-metil-transzferáz elégtelensége ernelkedett homocisztein- és csökkent metioninszintet is eredményezhet; az előbbi atherosclerosist (a homocisztein károsítja az endotheliumot; lá d 6.5. fejezet), az utóbbi neurológiai rendellenességeket válthat ki . Ha a 8 12-vitamin-hiány vagy a 8 1r koenzim szintéziséért felelős transzferáz enzim elégtelensége (a 8 12-vitaminból ATP felhasználásával nem keletkezik 8 12-koenzim) okozza a tüneteket, 8 12-vitamin adagolásával, illetve 8 12-koenzim im. injekciójával a betegség jól kezelhető.

A nukleotidok, mint a legkülönbözőbb funkciókkal rendelkező molekulák forrásai A nukleotidok alkotják a DNS és RNS-ek szerkezeti elemeit é az ATP révén központi szerepet játszanak az energiatárolás és -felhasználás folyamatában. A nukleotidok részt vesznek egyéb szintetikus folyamatokban is. A metilcsoporttranszport egyik főszereplője az S-adenozil-metionin (2-182. ábra). Az uraci tszármazékok közül az UDP cukorszár-

mazékai a glikogén, a diszacharidok, a glikoproteinek és a proteoglikánok oligoszacharid bioszintézisének részesei, míg az UDP-glukuronsav a bilirubin-anyagcserében és egyéb, elsősorban konjugációs reakciókban játszik szerepet. A CDP származékai a lecitin, kefalin, foszfatidil-inozitol, kardiolipin és a szfingozidok szintézisének részesei. A szulfátcsoportok proteoglikánokba történő beépülése a szulfát ATP-vel történő "aktiválását" igényli. A termék, az adenozin-3'-foszfát5'-foszfoszulfát (2-244. ábra). Az aktivált szulfát ezután a poli zacharidok alkoholcsoportjaival észterkötést hoz létre. A nukleotidszármazékok általános regulációs szerepet is betöltenek. A ciklikus AMP (cAMP; adenozin-3' ,5'-monofoszfát) és a ciklikus GMP (cGMP; guanozin-3',5'-monofoszfá t) adenilátcikláz és guanilát-cikláz katalízise révén A TP-ből, illetve GTP-ből keletkezik. Az enzimek komplex kölcsönhatásokon keresztül szabályozódnak, a termékek pedig a legkülönbözőbb sejtféleségekben intracelluláris szignálként, "second mcssengerként" szerepeinek Az energiaháztartáshoz szorosan kapcsolódó koenzimek ugyancsak nukleotidszármazékok. A NAD nikotinsavból (83-vitamin), PRPP-ból és ATP-ból szintetizálódik. Az amidcsoportdonor pedig Gin (2-245. ábra) . NAD szintetizálódhat triptofánból is (2-197. ábra). A FAD szintézise riboflavinból (8 2-vitamin) és ATP-ből történik (2-246. ábra). A koenzim A (CoA) pantoténsavból (85-vitamin), A TP-ből és Cys-ből szintctizálódik (2-247. ábra).

A fejezet megírásával kapcsolatban tett javaslatokért és kritikai megjegyzésekért a !lzer~:ő köszönetet mond Or. Bartha Katalinnak, Or. Kolev Kras.dmirnak, Or. Staub Máriának, Dr. Szikla Károlynak és Dr. \ 'odnyán Lajosnak.

Zkj

.6.

Biotranszformáció méregtelenítés

Mandl József

A szervezetbe a környezetből bekerülő és átalakított formában kiürülő anyagok sorsa különböző lehet: O A szervezet képes belőlük energiát nyerni: ezek a tápanyagok, az intermedier anyagcsere enzimeinek szubsztrátjai. 6 A szervezet nem képes belől ük energ iát nyerni, de rendelkezik o lyan enzimekkel, amelyek révén átalakítja őket. Így alkalmassá válnak arra, hogy a szervezetből kiválasztódjanak: ez tehát alapjában méregtelenítő funkció . Ezen funkciót megvalósító fo lyamatokat biotranszformációnak nevezzük.

Azok az anyagok, amelyeket a szervezet nem képes átalakítani és átalakítva kiüríteni, azok a szervezetre mérgezőek. A biotranszformációs reakciók közvetve kapcsolódnak az intermedier anyagcsere fo lyamataihoz, amennyiben ezen folyamatrendszer reakcióinak döntő többsége energiaigényes. A biotranszformációs reakciókat katalizáló enzimek szubsztrátjai főként olyan molekulák, amelyek kívü lről kerülnek a szervezetbe (xenogén, idegen eredetű anyagok). Számos endogén molekula is átalakul, illetve képződik azonban biotranszformációs reakció során. Ezek a biotranszformációs folyamatok leülönösen a szervezetben kémiai jelként vi selkedő, "szignál" rnolekulák (pl. számos hormon, neurotranszmitter) metabolizmusában játszanak szerepet Közülük is elsősorban azon szigná l molekulák metabolizmusában, amelyek intracelluláris magi

receptorok ligandjai. Ezért a biotranszformáció biológiai jelentősége a méregtelenítő funkció me ll ett a szignál molekulák szintézise és lebontása, inaktiválása. Szemben az intermedier anyagcsere igen specifikus enzimeivel, a különböző biotranszformációs enzimek, enzimrendszerek szubsztrátspecifitása általában sokkal szélesebb, egymást átfedő. Széles ·szubsztrátspecifitásuk révén alkalmasak arra, hogy ré zt vegyenek különböző anyagcsere-folyamatokban, bioszintetikus lépésekben (szteroidhormonok, katecholaminok szintézisének egyes reakciói stb.), lebontásokban (porfirin-anyagcsere, szteránvázas vegyü letek anyagcseréje stb.), valamint az idegen eredetű anyagok (pl. gyógyszerck) átalakításában is. További különbség az intermedier anyagcsere enzimeivel történő összehasonlításban, hogy a biotranszfonnációs enzimek igen alacsony szubsztrátkoncentráció mellett (l0-151o-6 M) aktívak (szemben az intermedier anyagcsere enzimeire jellemző 10·5- 10"2 M-lal). Az angolszász irodalomban a biotranszformációt gyakran gyógyszer- (drog-) metabolizrnusnak is nevezik. A német nyelvterületen ha ználatos Vcrstoffwechselung ("anyagcserésítés") találóbb elnevezés. A jelenlegi hipotézisek szerint a biotranszformáció eredeti szerepe a jel mctabolizmus. A gyógyszer-molekulák mint je leket " imitáló" molekulák lehetnek biotranszformációs enz imek szusztrátjai fenti sajátosságaik miatt. A biotranszformáció folyamatainak legfontosabb helye a máj parenchyma ejtjei. Ilyen reakciók azonban nemcsak a májban, hanem számos más

-.

298

>>>>>>>>>>>>>>>>))>>>)))>>>>>>>>>>>>>>H)>))>)))))))>>>>>>>>>>> >»>>>>>H>>>>>>>>>>>>>))))))))>>>>>>>>>)>))))))))>>>>>>>>>>>)))))))))>)>)))))))))))))))))))))~)))))))>>>>>))))

szervben is lejátszódnak (így a tüdőben, bőrben, bélben, vesében), biológiai funkciójuk részben még nem ismert.

A biotranszformáció folyamata A biotranszformációs folyamatokat három szakaszra osztják. Megkülönböztetnek előkészítő l. Fázist, konjugációs 2. fázist, transzport 3. fázist. Az első, előkészítő fázis reakcióinak kb. 90%-át monooxigenázok katalizálják; ily módon reaktív molekulák keletkeznek, amelyek képesek konjugálódni. A második fázisban a konjugációk 80%-át UDP-glukuronil-transzferázok végzik, a maradék 20% zömmel glutationnal, amjnosavval, szulfáttal történő kapcsolódás. Vannak molekulák, amelyek előkészítő reakciók nélkül is képesek konjugálódni, mert rendelkeznek olyan csoporttal, ami erre

ANYAGCSERE

őket

alkalmassá teszi; illetve bizonyos vegyületek az el őkészítő fázis után konjugálódás nélkül is képesek kiürülni a szervezetből. Biotranszformációs reakciók eredményeként általában egy adott vegyület oldékonysági viszonyai megváltoznak, a zsíroldékony vegyületek vízoldékonnyá válnak. Ez az oldékonysági változás lehetövé teszi, hogy a vegyület távozzon a szervezetből. Ez előtt azonban az általában konjugált vegyület transzporterek segítségéve! - harmadik fázis - kijut a sejtből. A transzport után (i) a már vízoldékony vegyület a vérpályán keresztül a vesébe kerül, ott aspecifLirusan filtrálódik és specifikus reabszorpciója nem lévén, a vizelettel a szervezetből kiürül; (ü) hepatocitákból szecernálódik az epecanaliculusokba, majd az epével a bélcsatornába kerül és a széklettel távozik a szervezetből (2-248. ábra). Az oxigerráció során keletkező (aktiválódó) reaktív, gyakran elektrofil molekulák azonban nem-

2-248. ábra. A biotranszfo rmáció két szakasza

l. fázis (elökészftö)

90% oxigenáció

vizoldékony ki üríthető

intermedier

("ea tiv, mstabil 80% glukuronidáció 1O% GSH-konjugáció ll. fázis (konjugáció)

konjugátum vizoldékony, kiüríthetö

redox ciklus szabad gyök

l l

vizelet

kovalens kötés - fehérjékhez -DNS-hez

epe -

toxicitás sejthalál mutációk malignus transzformáció

BIOTRAN ZFOR 'IÁC IÓ - MÉREGTEL ENÍTÉS

))))))))))))})))))))))) )>))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))) )))))))))))))):.>))))))

csak konjugációt katalizáló enzimek szubsztrátjai lehetnek, hanem spontán, nem enzimatiku s reakciékba is léphetnek. Ezekben a reakciókban igen reaktív, instabil intennedier ek, oxigéntarta lmú szabad gyökök keletkezhetnek. Az ilyen intermedierek kapcsolatba kerülnek makrornolekulákkal, hatásukra ún. adduktok alakulhatna k ki fehérjéket alkotó aminosavakon, nukleinsav akat alkotó házisokon. Ezek a (2-248. ábrán pirossal jelzett) nem enzimatikus reakciók képezik az így kialakuló citotoxikus, teratogén, karcinogén, mutagén folyamatok és hatások molekuláris alapjait. Ily módon egyes molekulák éppen a biotranszfo rmáció során "aktiválódn ak", illetve válhatnak toxikus szánnazékká.

A biotransz formáció első, előkészítő szakasza, a citokróm P450 enzimek A biotranszformáció előkészítő szakasza során az adott vegyület funkcionális csoportja(i) megváltoznak, új csoport(ok )jöhet(nek) létre. Konjugációra alkalmas csoport: karboxi l, SH, arnino, hidroxil alakul ki, vagy kerül az előkészítő reakció(k) folytán olyan pozícióba, hogy a vegyület

))))))))))))))))))))))

299

konjugációs enzimek szubsztrátja lehet. Konjugációra alkalmas csoport háromféle reakció következtében alakul ki: O oxidáció (zömében ox igenáció ), 6 redukció, O hidrolízis. A vegyületek döntő többsége oxigenálód ik az e]őkészítő fázisban, ezért részletesen az oxigenációval foglalkozunk. A biotranszformáció első szakaszában zajló oxidációs folyamatok at többkomponensű enzimrend szer katalizálja. Az enzimrends zer membránh oz kötött; a légzési láncra emlékeztető müködési és fe lépítési hasonlóság ok miatt mikroszom ális légzési láncnak nevezik. A májban az endoplazm ás retikulum teljes fehérjetarta lmának kb. 20%-át alkotják az ide tartozó fehérjék. Állandó és változó komponens ei vannak. Állandó komponens a NADPH-c itokróm P450-reduk táz, amely flavoprotein, és egy citokróm, az elektrontranszportban pontosan nem tisztázott funkcióval részt vevő eitekróm b5. Változó komponens a eitekróm P450 nevet viselö monooxige náz (a továbbiakban P450). Nevét onnan kapta, hogy redukált fonnájá-

NADPH +H NADP..-

oxidált A

/

~

NADPH-c1tokróm P450-reduktáz

oxidált D különbözö P450 izoenzimek oxidált E

oxidált A képe a 2-249. ábra. A NADP-citokr óm P450-redukt áz és a citokróm P450 enzimek elhelyezkedé sének sematikus izoenzimek mikroszómá lis membrán citoszol felé néző felszínén felülnézetbőL A, B, C, D, E: különböző cítokróm P450 szubsztrátjai

300

>H>)) ,>>> >• ', ,>>H>'' » '••• ,u>>>n >>n>>)))n>>>'>>H> >»U>»>>>>>>n >>>H>>> >n>>>>»>>>»»>>»>>>>>>»>>>>>>>> >n»>» >> >>>»>» >)))))>> » » » » >>» >»>>»>>»>>>>>» >>

nak CO-dal képzett komplexe 450 nm-nél mérve jellemző abszorpciós maximumot mutat. Jelenleg mintegy 650 P450 izoenzimet ismernek (2-249. áhra). Biotranszform ációs folyamatokat katalizáló kevert funkciójú oxigenázok esetén az e lektrondonor a NADPH. A NADPH-t oxidálja a NAOPH-citok róm P450-reduktá z, majd első lépésben a P450 hem Fe3 ' - ionját redukáUa Fe2' -ionra (2-250. ábra). A Fe21 -t tartalmazó P450 így képes Ort kötni. A kötődött Or t a második elektron átvitelével redukálja o2· --vé, s ezután kerül az egyik oxigénatom a P450 á ltal már megkötött szubsztrátra, a másikból pedig víz képződik. A rendszer mű.ködéséhez tehát NADPH és 0 2 szükséges, így fokozott biotranszfonn ációs igény (pl. száJnos gyógyszer bevitele) esetén a NADPHtennclésnek fokozódnia kell, illetve a máj oxigénfogyasztása is nő. Ez a rendszer 0 2-, illetve e lektron forrásként peroxidokkal is müködhet; ez esetben az oxigenációho z 0 2 és NADPH nem szükséges. Lipid-peroxid áció, amely egy patológiai folyamat, esetén van az ún. peroxid shuntnek el-

3

P-450-Fe l

ANYAGC ERE

sősorban je lentősége,

mivel ilyenkor a keletkezett lipid-peroxido k szubsztrátkén t szolgálnak. Az egyetlen elektron átvitele, amire a flavoproteinek alkalmasak, szabadgyök-k épzéshez is vezethet. Az o2·- (szuperoxid) anion képződése a rendszerben szintén káros folyamatok kiinduló pontja lehet. A különböző P450 izoenzimek szubsztrátspecificitásában számos átfedés van. Osztályozásu k az aminosavszek venciában talált azonosságok alapján tötténik. A P450 izoenzimek és evolúciójuk tanulmányozá sa a molekuláris biológia kedvelt objektuma. Az ő P450 gén minimum 22 exont tartalmcuott mintegy 3,5 milliárd évvel czelőu. A P450 izoen7imek eu ebből származó 13 gén "s7uper" család produktumai. A 13 c aládból 2 bakteriáli., 2 é l esztő, l rovar és 8 cm l őssejtekben a 8-ból 4 főként a máj parenchymasejtj eibcn expresszálódik. A biotran:.Lformáció reakciók st.empontj ából ez a 4, cl ősor­ ban a májban, dc kis mennyiségben a tüdőben, bélben. bőr­ ben é a vesében is exprcsszálódó géncsalád a jelentős. A7 elmúlt közel 400 millió év a szárazfóldi léttel összefüggő étket.ési szokásváltozá ·ok miatt a7 ezen géncsaládokba tartozó izocn7imek rendkivüli differenciálódás át eredménye7te.

+- - - - - -

AH

l

AH

P-450-Fe3~ l AOH

2

P-450-Fe 0 2 l AH

(:~~ ._--P-450-Fe3+..._ _ _ _ _ _~

2-250. ábra. Kevert funkciójú oxidáz-rendsze r müködése. Rövidítések: P450 Fe 3• , citokróm P450; FP, NADP-citokróm P450 reduktáz; AH, oxidálandó szubsztrát; XOOH, lipid-peroxid. Pirossal a szabadgyök-képződés lehetőségél jelöljük

BIOTRA.\SZFORl\1

\uó

\I ÉREG fELE. Í"l 1-:~

30 1

A differenciálódás l egfőbb mozgatója az a növényvilág, amely a szárazföldön már korábban elterjedt. A növényi tápanyagokkal együtt olyan rendkívül változatos, növényekben éppen biotranszformációs enzimek segítségével szintetizálódott anyagok is óhatatlanul bekerülnek az állati, illetve emberi szervezetbe, amelyekre a szervezetnek nincs szüksége, amelyekből nem képes hidragént kivonni, viszont ki kell ürítenie. Ezek a változatos szerkezetű molekulák így részben felfoghatók úgy is, mint a növényvilág védekezése az öt pusztító élőlényekkel szemben. A eitekróm P450 enzimek ugyanakkor az állatvilág védekezését is szalgálják a növényi eredetű "mérgekkel" szemben. A eitekróm P450 enzimek leghatékonyabb induktorai között szerepeinek a különbözö növényi (fokhagyma, káposzta, petrezselyem, répa, zeller, kelbimbó stb.) eredetű molekulák (indol-3-karbinol, diallil-szulfid, psoralen stb.). Hatásukra egyes P450 izoenz imek fokozottan expresszálódnak, mások expressziója ugyanakkor visszaszorul. Különböző táplálkozási szokásokat követő állatfajok összehasonlító vizsgálata alapján egyértelmű a növényi toxinak szerepe a eitekróm P450 c aládfa kialakulásában: a P450 izoenzimek száma a bevitt növényi toxinak számával együtt emelkedik. Kérdés, mit hoztak ebből a szempontból az elmúlt évtizedek? A kemizáció, a gyógyszerek elterjedése, a környezetszennyezés további kihívás, amelyhez az alkalmazkodást elsősorban a P450 enzimek teszik lehetövé. A P450 génc aládokat :.lámokkal jelölik. az alcsaládokat betü\·el, az egyes iLoenzunckct eLen belül ismét számmal (pl. CYP2E l). Az egyes géncsaládok, alcsaládok, illetve izocnLimck megismcré!>ébcn igen nagy szerepük volt egyes

gyógys7creknck, illetve ipa ri vagy más szempontból Iontos rnoleku láknak, amelyekkel eLen enzimek kép7Ödését indukálni lehelelL A CYP 1-gyel jelölt géncsaládba eddigi ismeretcink s;erint lcgal<íbb négy gén larto7ik. Produktumaik szubsttrátjai között S7ámos mutagén hatású policiklu. os aromás szénhidrogént, alap\etö fontosságú gyógy zereket találunk (bcnzpirén, tcofillin, phenacetin stb). Az ide tartozó izoenzimek többféle módon indukálhatók, így "klasszikus" induktorokkal (3-metil-kolantrén), vegyi pari technológiák kömyezetSLennyczö mclléktermékeként ismert dioxinszármazékokkal (2,3, 7 ,8-tetraklór-dibenLo-p-diox in, TCDD), c igaretta füsttel. Koincidencia van CYP l A l i7oenzim indukálhatósága és a bronchuscarcinoma jelentkezése kö7Ötl. AL ide tartozó izoenzimek jelentős része cxtrahepatikus. Élettani fu nkciójuk nagyrészt nem ismert. Tmlukálhatóságuk rendkívül nagymérvű. néha százszoros i~ lehet. A CY P2 géncsalád több alcsaládból á ll (CYP2A-11). A7 ide sorolható iloenzimek zubs;trátjat rendkívül különböző molekulák: !>Lámos sztero id hormon. illetve sztcroid gyógyszer [tesnoszteron-7-alfa és -15-alfa-hidroxiláció (CY P2A); progeszteron, D;-vitamin]. más gyógyszerek [ ?ámos antiepileptikum (CYP28); vémyomáscsökkentö, így a debrisoquinc (CYP2D); fájdalomc illapítók (paracetamol. nyugtatók, diazepamszármazékok tb. (CYP2E)]; policiklusos szénhidrogének [benzanlracén (CYP2B)] és a karcinogén ha tású nitrozamin-származékok (CYP2E). A CY P2E-hez tartozó izoenLimek felelösek aL aceton és etanol oxigenációjáért. Itt il> kimutathaló koincidencia az egyes iLoen7imek (CYP2D) indukálható ága és egyes rossLindulatú daganatok (máj és gastrointestinalis traktus carcinomái. bronchuscarcinoma) előfordu lá aközött. A géncsalád különbözö a lcsaládjaihoz soro lt ILOenzimek induktorai kö;ött szerepel a szintén " klasszikus" fenobarbitál, amely fénymikroszkóppal is látható prot iferációt okoz a sima felszínű endopla7más retikulumban (2-251. áhra), de induktor hatású a? etanol és az aceton is. Éhezésben és diabetes mellitusban a CYP2E i?oenzimek ugyane ak indukálódnak. A CY P3 géncsaládhoL legalább 3 gén tartozik az emberi szcrve7etben. Több antibiotikum, szteroid (pl. orális fogamzásgátlók), más gyógys7erek (pl. az immunszupprcsszí" c iklosporin, a nifedipin. a; c til -morfi n) oxigcnációjáét1 fele-

OH

H

NADPH

2-251 . ábra. A CYP28 és CYP2C induktor, illetve CYP28 szubsztrát fenobarbitál-hidroxilációja

302

lös i7oen7im sorolható ide. A te zto zteron-6-béta hidrox ilációját CYP3 izoenzim katalizálja. Ezeket az izoen7imekct e l sősorban s7teroidok indukálják. Igen fonto induktor a PC (pregncnolon- 16-alfa-karbonitril). A CYP4 géncsaládhoz tartozó izoenzimek klofibráual , egy antihyperlipaemiás gyógyszen el indukálhatók. Szubsztrátjaik e l sősorban endogén anyagok, különbözö zsírsavak, így a? arachidonsav, illetve az eikozanoidok.

A szubsztrátok sokfélesége miatt az oxidáció típusa szcrint is igen sokfélék a P450 típusú enzimek által katalizált reakciók, amelyek között van - többek között - aromás hidroxiláció (i lyen a 2-25 l. ábrán látható reakció), N-dezalkilálás vagy oxidatív dezaminálás.

A biotranszformáció második, konjugációs szakasza A biotranszfonnáció második szakaszában a vegyü letek aszerint, hogy milyen konjugálódásra alkalmas csoportot tartalmaznak, k:ülönböző endogén kofaktorokkal konjugálódnak. A konjugáció leggyakrabban g lukuronsavval, aminosavval, metil-, szulfát- vagy acetilcsoporttal, illetve glutationnal történik. A konjugációk viszonylag aspecifikus folyamatok: egyazon vegyület ugyanazon csoportja k:ülönböző csoportokkal konjugálódhat. A szalicilátok (Kalmopyrin, Aspirin stb.) alapvegyü letének, a szalici lsavnak a karboxiicsoportja pl. konjugálódhat akár glicinnel, akár g lukuronsavval , de a glukuronsavas konjugáció a szalicitsav OH-csoportjával is kialakulhat (2-252. ábra). A konjugáció a májsejten belül aszerint is változhat, hogy a citoplazmában vagy a mitokondri umban történik: a benzoesav a citoplazmában glukuronsavval konjugálódva benzoil-glukuronidot képez, a mitokondriumban g licinnel konjugálódva hippursavvá alakul. A leggyakoribb konjugációs folyamatok közül a glukuronidációval, a szulfatálással, a metilezés el és a glutationnal történő konjugációval foglalkozunk.

Glukuronidáció. A konjugációk közül a legjelentösebb reakció a glukuronidképződés . G lukuronsavas konjugációra a szubsztráton található szabad karboxil-, SH-, NH2-, OH-csoport egyaránt alkalmas. A glukuronsavat az UDP-glukózból képződő UDP-glukuronsav szolgáltatja. Egy mo-

Ai'
lekula glukuronid képződése tehát egy molekula glukóz-"veszteséget" jelent a máj számára. A különbözö szerkezetű szubsztrátok glukuronidációját különbözö UDP-glukuronil-transzferáz (UDPGT) izoenzimek katalizálják. Az UDPGT-k elsősorban a májban, kisebb mértékben a (külsö környezettel kapcsolatba kerülö) tüdöben, bőrben , vékonybélben, szaglóhámban expresszálódnak. A k:ülönbözö izomerek szubsztrátspecificitása eltérő, de itt is számos átfedés van. Az UDPGT-k az endoplazmás retikulumban található membránhoz kötött enzimek. Eddig 17 humán UDPGT-1 azonosítouak, amelyek két géncsaládba sorolhatók. Az l. géncsaládhoz tartoznak többek közöt1 a fenolok és a bilirubin glukuronidációjáért fe lelős izoenzimek. a II. géncsalád produkrumai első orban a szteroidok, epesavak glukuronsavas konjugációját katalizálják. Az azono géncsaládhoz tarto7Ó izoenzimek C-termináli doménjét kódoló cxonok azonosak. Ez felelős a membránhoz t.ö rténö kötödésért, valamim az UDP-glukuron av kötésért A szubsztrátkötésért fele l ős N-terminális régiót kódoló nukleotidszekvenciákban izoenzimenként jdentös különbségek vannak. A jelenlegi kutatások szerím a7 UDPGT-k aktív centruma az endoplazmás retikulum luminális kompartmcntjében van, így a glukuron idoJ.. tlll.:detkcmek. El sősorban

(egyes izoenzimek, pl. a bilirubinUDPGT kizárólag) a májban expresszálódnak. Egyes izoenzimeknek azonban élettani szerepe van más sejttípusokban, illetve méregtelenítéstöl független folyamatokban is. A szaglás mechanizmusában például az odoráns anyagok UDPGTszubsztrátok a szaglóhámban. A tennészetes, endogén szubsztrátok közül a legfontosabb a bilirubin glukuronsavas konjugációja. Ez a szervezet hem katabolizmusában meghatározó jelentőségű lépés, enélkül a bilirubin nem tud a szervezetböl kiürülni. A bi lirubinfelhalmozódásnak látható jelei is vannak, mint pl. icterus (sárgaság). A szabad és konjugált szérumbilirubin megbatározása a máj egyik alapvető funkciójáról ad számos esetben a klinikus számára nélkülözhetetlen információt. Az UDPGT-k induktorai több esetben a P450 induktorokkal megegyeznek (3-metil-kolantrén, fenobarbitál), de induktoraik száma és az indukció mértéke lényegesen kisebb.

Szulfatálás. Különbözö alkoholok, tiolok, fenolok, aminok (pl. thyroidok, szteroidok) a szulfatálást katal izáló k:ülönbözö szulfotranszferázok

BIOTRA

ZFOR:\IÁCIÓ - 1 ÉRECTELE~ÍTÉS

>))H)>))))))))))))))) ))>)))))U)))>))))))))))))))))))))))))))))))))) U U))>>>>>>H))))')H)>);)))>H>)))))H) )• )) )>

O

J0 J

cooOH

szaliciisav

o

Gly

ll

O

C

~

/CHz'-

coo

OH

coo

2-252. ábra. A szalicHsav konjugációja. A sza/ici/sav, amely számos gyógyszer alapvegyülete, különbözö csoportjain g/ukuronsavval és glicinnel egyaránt konjugálódhat (a könnyebb áttekinthetőség céljából a g/ukuronsavban a H-eket nem tüntettük fel)

szubsztrátjai. Eddig tíz humán szulfotranszferáz ismert. A reakcióban szulfátdonor a PAPS (3-foszfo-adenozin -5-foszfoszulfát), mely a szubsztrátokkal szulfátésztereket (2-253. ábra) és amino- szul-

fátokat (-NH-son képez. A PAPS szulfátból és A TP-bő l képződik. A szu l fát e l sőso rban kéntartalmú aminosavak (Cys, Met) oxidációjából szárma-

zik.

NYAGC ERE

o ll o-s -oll o

2-253. ábra. Az antihaszkoagulánské nt nált 3-hidroxi-ku marin szulfatálása

o 3-hidroxí-ku marin-szulfá t

3-hidroxi-ku marin

o o ll ll cH -o- P-o-s -o2

OH

l

o-

o-®

Glutationn al történő konjugáció . A szervezetbe kerülő elektrofil vegyületek (halogén-, nitrobenzol-származékok, aromás vegyületek) egy csoportja a májban glutationnal konjugálódik. (A glutation glutamátból, ciszteinből és glicinből szintetizálódik két lépésben 2 ATP segítségéve!; lásd 2- 175. ábra.) A glutationnal történő konjugáció a konjugáció k sajátos formája. A két szakaszban zajló folyamat első lépése a glutationnal való kapcsolódás. Ezt a konjugációt a glutation-Stranszferáz katalizálja (2-254. ábra). A konjugáció a cisztein SH-csoportján keresztül valósul meg. Ezt követően előbb a glicin majd, a gamrnaglutamil-transzpeptidáz hatására, a glutaminsav is lehasad a konjugált tripeptidről , és a konjugáció második lépéseként a megmarad t konjugált cisztcin aminecsop ortja acetilálódik. Az acetilcsoportot acetil-CoA szolgáltatja. A glutationnal történő konjugáció tehát egy aminosav és egy acetilcsoport beépítését jelenti molekulánként. Metilezés. A metilezés a konjugációk viszonylag ritkább formája, amelyben a szabad SH-, NHr és OH-csopor tok vehetnek részt. A metildonor a SAM (S-adenozil-metionin). (Ez a reakció a katecholaminok szintézisében és inaktiválásában ts meghatározó reakció; lásd J9- 20. oldal.)

ll

o

PAPS

A biotransz formáció harmadik , transzpo rt szakasza A harmadik szakaszban a konjugálódott molekula transzporterek közvetítésével szecemálódik a sejtből. A második fázis jelentősége ebben az értelemben az is, hogy konjugáció révén válik az immár vízoldékon y vegyület transzporter ligandummá. A harmadik fázis klinikai jelentősége miatt is igen intenzíven kutatott terület. Többféle fehérjét azonosítottak, mint anion- és kationtranszportereket. Legtöbb ismeret az ATPkötő, ún: ABC (ATP hinding casette) transzporterekről halmozódo tt fel. E fehérjék mutációi, illetve fokozott expresszió ja több betegség, illetve állapot (pl. cysticus fibrosis, multidrog rezisztencia) okozói. A multidrog-rez isztencia jelensége a rosszindulatú daganatos betegségek kemoterápiáj ában fonto . Több daganat ellenáll a daganatellenes gyógyszerterápiának. A gyógyszcrmolckulákat a daganatsejt transzporterek segítségével kipumpálja, így azok nem képesek cjtkárosító hatásaikat kifejteni.

Transzport ATPázok közé tartoznak; a folyamat során a transzporter foszforilálódik (P-típusú fehérjék). Az ide tartozó integráns, membrán kötött

BIOT RAN Z FORMÁCIÓ - M ÉREGT EL ENÍTÉS

)).))))))))))))))))))))))))) n)))))))))))U)))))))))))))) ))))))))U)))))))))H) ))))))))))))))H)>>H)))))))

o

ll

ll

NH - C - CH3

HN -C - CH3

N - C - CH3 OROOiáció

r

yGiu

lyGiu-Cys-Giy ,

CYP2t1

l S - Cys

l

OH

o

OH

305

o

o

ll

)))))))

paracetamol (acetaminofen)

Gly

Gly G lu

o ll

CH3 - C- S - CoA

o ll

HN - C - CH3

NH+ 3

l l coo-

S - CH -CH 2

o ll

CH3

HN -C - CH3

l

c= o l

NH

l l

S-CH - CH 2

3

coomerkaptursav

2-254. ábra. A hőcsökkentö fájdalomcsillap ító paracetamol konjugációja glutationnal

multidrog-rezisztencia pumpa fehérjék (MDR, MRP) közül többet leírtak, amelyek szerepet j átszanak glukuron avval, glutationnal konjugált vagy konj ugálatlan gyógyszerek és endogén molekulák (pl. bilirubin-gluk uronidok, epesavak, szteroidok) transzportjába n, szekréciójában. Májspecifikus formá ik a hcpatociták epecanaliculu s és laterális plazma me mbránjában találhatók. További részleteket lásd még a 4. fejezetben.

A biotranszformáció szabályozása A máj metabolizmusáról ismert, hogy a környezeti változásokat követve változik, és az is, hogy kapacitása adott körülmények között sokszoro ára fo kozható. Különösen érvényes ez a biotranszformációs folyamatokra. A bi otranszformáció szabályozása különbözö szinteken történik. A sza-

306

))))))))))))))))))))))))))))>))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))})))))))))))))))))))

bályozások jelentős részét a májban tanulmányozták, ismerték meg. A szabályozásban transzkripciós és poszttranszkripciós, valamint transzlációs és poszttranszlációs mechanizmusok is szerepet játszanak. A reguláció régóta ismert formája a transzkripciós szintü szabályozás, az enzimindukció. A k:ülönböző P450 enzimek aktivitása induktorok hatására 70-szeresre, az UDPGT-k aktivitása 3- 5-szörösre fokozható. Az enzimindukció azonban nemcsak xenogén induktorok hatására következik be. Születés után például számos biotranszformációs enzim indukálódik hormonhatásra. A biotranszformáció külőn­ böző típusú és funkciójú enzimeinek együttes indukciói a koordinált enzimindukció eklatáns példái. Ennek rnegfelelően egyes gyógyszerek többféle enzimet indukálnak, amelyeket különböző géncsaládokhoz tartozó, különböző kromoszómákon található gének kódolnak.

Biotrans7formáció enz imek koordinált indukc iójába n több trans?kripc iós fa ktor, illetve szignál transzdukc iós út s7crcp6t bi7onyí tották. A CYP l géncsaládhoz tartozó iLocn7imc k indukc iójá ban az Al IR-t (aroma tic hydrocarbon receptor) e l őször. mint (súlyo an toxikus környezetszennyező) aromás szénhidrogénc k hatását közvetítő receptort, majd később tra nszkripc ió faktort írták le. Az A HR fiziológiai funkc iój a. valamint te nné zetes induktora ma is ismeretlen, Lcgújabb kuta tások szcrint szerepe az e mbriogenezisbe n a la pvető, endogén ligandja ei koLanoid metabolit le het. AL A HR a bilL! l (basic he lix-loop-he lix) transzklipciós faktorok közé tartozik. Miután kis mo le kulasúlyú induktorát megköti, egy más ik biiLH fe hé rj ével, az ARNT-vel (aromatic hydrocarbon recepto r nuc lear translocator) dimert képc7vc k öt ődik s pecifi kus D S-szaka zokhoz (XRE .xcnobitic respon. Í \ e e lcmc nt). X RE sL:ekvcnc iák több gén 5' végi cnhancerében is e lö fordulnak, ezálta l segítik el ő ezen gének indukciój át a7 AIIR-ARNT hete rodimer bekötődésc utá n. A/ A RNT más transzkripció faktorokkal is dimert képczhc t, így több jelpálya komponen e. Az A HR ,.gene battcry"-he7 m inimum hét gén ta rtozik, köztük a C YPI A l. egy UGT és egy gluta tion-tra nszfcráL: i . Legismertebb induktonr a már e mlített dioxin, ame ly több szakma i közicmé ny és po litika i publicisztika tárgya egyben. Ez t tar1a lmaaa pé ldául a vie tnami háborúban növény irtóként ha. zná lt hírhedt ,.agent o ra nge": ez a j e le nl eg ismert leghaté konyabb rákke ltő a nyag. A d ioxin biológia i félé le tideje emberben 6- 50 év, 90%-a zsírszövetben ta lá lható, állati L:s írokka l is ke rülhet S7ervezctünkbe. A C YP2 géncsalád indukc iój ában részt vevő trans7kripc iós fak tor(ok)ról kevesebb aL ismeretanyag. Az az(oka)t kötő D -szekvencia a még bioké mikusokba n is meg levő ta lá lékonyság, \ alamint a "vezér" induktor fe nobarbitál jó-voltábó l a ,,barbie box"' nevet -v iseli. Ez a szekvencia neme ak CYP2

))))))))))))))))))>)))

ANYAGCSERE

gének. hanem többek közölt egyes UDPGT, va la mint MDR gének promoteréne k közelében is megtalálható. A CYP3 géncsalád indukciójában szereplő transzkripc iós fa ktor(ok) a szteroidrcccptorok kö7é tartoznak, míg a CYP4 géncsaládot indukáló gyógyszerck a PPA R (pcroxisome proliferation acti valing receptor) nevet vi se l ő transzkripc iós ra ktor ligandjai. Az indoktorok zöme, az intrace lluláris receptoroknak megfelelően z íro ldékony molekula. Újabban több e ikoL:anoidot azono ítottak, mint pl. a trans/kripc iós faktor (pl. A HR) ligandot.

Mind az előkészítő szakasz, mind a konjugációs szakasz általában k:ülönböző kofaktorokat igényel (NADPH, UDP-glukuronsav , PAPS stb). Ezen kofaktorok szintézise jelentős mértékben terheli a máj parenchymasejtjeinek intermedier anyagcseréjét Számos állapotban, például éhezés esetén a kofaktorellátás meghatározza a biotranszformáció sebességét. A NADPH-ellátás elsődleges meghatározója lehet az első szakaszban az előkészítő reakciók döntő többségét kitevő kevert funkciójú oxigenáz rendszer működésének. A második szakaszban a reakciók nagy többsége glukuronidáció, amelynek sebességét szintén determinálja az UDP-glukuronsav-ellátás. A kofaktorellátás fontosságát bizonyítja az a körülmény, hogy számos induktor a kofaktorellátást is indukálja. Például a citokróm P450-indukció rendszerint a NADPH-t termelő pentózfoszfát út dehidrogenázainak , valamint a malát enzimnek és az izocitrát-dehidrogenáznak az indukcióját is maga után vonja, illetve gyakran egyes UDPGT-k is ezzel együtt indukálódnak. A citokróm P450 enzimek indukciója fokozott hemszintézist is igényel. A szervezet hemszintézisének körülbelül J 5%-a a májban történik, s ennek körülbelül 65%-a a citokróm P 450 és mintegy 8% a citokróm b5 porfirinváz-igényét fedezi. A hemszintézis és a fehérjeszintézis a májban összehangoltan szabályozott. Számos induktor hatására a delta-arninolevulinsav-szintáz, mint a poríirinszintézis elkötelező lépésének enzime (lásd 2.4. fejezet) is indukálódik. Ez az indukció az összhang megbomJását is eredményezheti, hemtúlprodukcióhoz vezethet. A súlyos kömyezetszcnnyezési problémákat jelentő dioxin, különbőző vegyipari technológiák igen mérgező bulladéka például így is okoz megbetegedést, akut intermittáló porpbyriát. A máj oxigénfogyasztása is jelentősen változhat; gyógyszerterhelés hatására akár 30%-kal is nőhet.

BIOTRA~SZFOR JÁCIÓ - MÉREGTELENÍTÉS

)))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

A biotranszformáció biológiai jelentősége. Méregtelenítés. Klinikai vonatkozások A biotranszformációs enzimek "természetes", endogén szubsztrátjai a szervezetben különböző funkciójú molekulák, amelyek között vannak pl. hormonok (szteroidok, eikozanoidok), vitaminok (D-vitamin) vagy katabolikus utak termékei (aceton, bilirubin). A biotranszformációs enzimek által katalizált reakciók szerepet játszhatnak egyes molekulák szintézisében (pl. szteroidhonnonok szintézise a mellékvesében, epesavak szintézise és konjugációja, D-vitamin 25-hidroxilációja májban, LTD4 szintézise immunkompetens sejtekben stb.). A biotranszformációs méregtelenítő funkció a gyógyszerfogyasztás és a kemizáció korában adaptációs mechanizmusnak tekinthető. A biotranszformációs reakciók sokfélesége, az indukálhatóság lehetősége "survival value", a túlélés lehetősége a szervezet számára. Összességében, biotranszformációs reakciók következtében számos biológiailag aktív molek:ula inaktiválódik, majd kiürülésre alkalmas állapotba kerül. A biotranszformáció újabb megközelítések szerint az a folyamat, amely szabályazza a szervezetben képződő különböző biológiai hatású, más sejtek működését befolyásoló molekulák anyagcseréjét. Így a biotranszformációs enzimek biológiaijelentősége nemcsak a méregtelenítő funkció. Ezen túlmenően részt vesznek mind az endogén és idegen eredetű szabályozó, illetve receptorral rendelkező molekulák egy jelentős részének (pl. szisztémás és Lokális hormonok, szagérzékelést ki-

2·255. ábra. Nitrozaminszármazékok aktiválódása a CYP2E hatására

3o7

váltó molekulák) bioszintézisében, illetve katabolizmusában (pl. szteroidhormonok képződé­ sében és lebontásában). A lebontó folyamatokba történő bekapcsolódás "endogén méregtelenítésként" is felfogható. Az oxigenációt követő nem enzimatikus fo lyamatok következtében bekövetkező változások azonban éppen a méregtelenítéssel ellentétes toxikus hatásokhoz vezethetnek. Ily módon ugyanazok a "méregtelenítő" enzimek adott esetben más szubsztrátokat átalakítva inaktív anyagokat toxikussá tesznek. Az ily módon "aktivá lódó" anyagok je l l emző példái a nitrózaminszármazékok. A nitrózaminszármazékokat a CYP2E géncsalád izoenzi mei oxigenálj ák. Az oxigcnáció h atására ke letkező igen reaktív intc m1cd icr könnyen reakcióba lé p nukleinsavak bázisaival, fehé1jék a minosava ival (2-255. ábra).

A nitrózaminszármazéko k rákkeltő, karcinogén a nyagok, amelyek különbözö tápa nyagokbó l, élelmiszer-tartósító szerekből képződhetnek az emberi szervczetbcn (pl. a gy omorban). Karcinogén hatásuk moleku láris mechanizmusában a toxikus anyag a CYP2E által katalizáll reakció során képződő intcnnedicr. A CYP2E izoenzimeket az etanol, az aceton, az enz imfehérje s7intjén indukálja. Ezért alkoholizmusban, illetve a hyperacetonae miás állapotokban, ha egyidejűleg nitrózaminszármazékok is kerülnek a szcrvezetbe ez a folyamat is fel gyorsul.

A biotranszformációs fo lyamatok gyakorlati jenehéz tú lbecsülni. Korunkban a kórházban fekvő betegek átlag 5- l O fajta gyógyszert

lentőségét

R1 -N - R~

l

N

ll

o aikil-nitrózamin

CYP2E

spontán alkil-diazohidroxid reaktív addukt képző molekula

308

))))))H))))\•))))))))))U)))))))))))))•>>)))}>)U))>)U) ))H)))))))))))))))))l)))))))))))))))))))))Hl)))))))))))) )))))))U))))))))))))))))))>)))))))U)))))))))))))))))))) ))

szednek. A gyógyszerek számával az ellentétes gyógyszerhatások előfordulása ugrásszerűen megnő . Ennek az az oka, hogy a biotranszformációban részt vevő egymást átfedő széles szubsztrátspecifitású enzimek miatt különböző szubsztrátok együttes adásakor kompetíció alakul ki. Ez befolyásolja a gyógyszerek inaktiválását, ezzel a tényleges dózisát, toxicitását, így közvetve a hatását. Talán ennél is fontosabb körü lmény az, hogy a különböző szubsztrátok egyben különböző incluktorok is. Indukciós hatásuk viszont befo lyásol(hat)ja a betegen alkalmazott, többi gyógyszer metabolizmusát. Így például egyes induktor hatású győgy­ szerek elhagyása, az indukciót megszüntetve lassíthatja a másik gyógyszer lebontását: ennek következtében azonos dózisban, de más kombinációban adott gyógyszerek esetén túladagolási tünetek léphetnek fel (például antikoaguláns hatású kumarinszánnazékok adagolása igényel különös figyelmet ebbő l az aspektusból is). Tekintve, hogy ugyanannak az enzimnek természetes, endogén és xenogén szubsztrátjai egyaránt vannak, a kompetíció igen bonyolult példái adódhatnak (2-256. ábra).

Hasonlóan egyes más enzimekhez (pl. glukokináz), újszülöttek májában a biotranszformációs enzimek aktivitása alacsony, hiszen a "fiziológiás" indukció, a szülést követő hormonális változások egyik következménye még nem történt meg. Ez okozza az újszülöttek (elsősorban a koraszülöttek) hyperbilirubinaemiáját, ami igen veszélyes állapotot idézhet elő . Az újszülöttkori sárgaság kialakuJásában szerepet játszik a fokozott hemolízis is. A biotranszformációs enz imek alacsony aktivitása meghatározó körülmény nemcsak az újszülött (küJönös tekintettel a koraszülöttek), hanem a szül ő nő gyógykezelésében is. Számos halálos szövődmény forrása volt már ezen szempont figyelmen lávül hagyása (pl. morfium, chloramphenjcol a szülő nő szervezetéből a magzatba, illetve az újszülött szervezetébe kerülve ott nem tud lebomlani és ez végzetes szövődményeket okozott).

ANYAGCSERE

Az indukció terápiás lehetőséget is ad az orvos kezébe. A Gilbert-kór "fázis 2 biotranszformációs betegség" (amerikai statisztikák szerint ez a lakosság kb. 6%-át érinti), amelyben a konjugálatlan bilirubin koncentrációja megemelkedik a szérumban. Gi lbert-kóros betegeket fenobarbitállal kezelnek, mert a fenobarbital indukálja a bilirubin-UDPGT-t, így fokozza a bilirubinkonjugáció sebességét, tehát mérsékli a konjugálatlan bilirubin koncentrációjának megemelkedését a szérumban. A konjugálatlan hyperbilirubinaemiát okozó jóindulatú Gilbert-kór és súlyos neurológiai károsodásokat okozó Crigler- Najjar-szindróma mellett a már konjugált bilirubin transzportjának zavarai is bekövetkezhetnek. A Dubin-Johnson-, illetve a Rotor-szindróma konjugált hyperbilirubinaemiával jár. A hyperbilirubinacmiák egy részének hátterében a bilirubin UDPGT expressziójának zavara áll. Pontosan i merik emberben például, hogy a viszonylagjóindulatú Gi lbert-kórban vagy a okkal súlyo abb C rigler- Najjarbeteg égben az l. géncsaládhoz tartozó izocn7imet kódoló gén melyik exonjában van például C-T szubsztitució va~:,ry korai stop kodon. A Dubin-John on-szindrómás betegek májában az cxkréciós zavar pigmcntlcrakódást, májmcgnagyobbodást (hepatomcgalia) és változó inten7itású sárgaságot okoz. A beteg éget az MRP transzporterek családjába tartozó egyik fehérje génjének káro odott expressziója okozza. így ez "fázis 3 betegségnek" tekinthető.

A biotranszformációs enzimek aktivitása populációnként, nemenként és személyenként is rendkívül különböző és jelentősen változhat az életkorral. Ez mind populációk gyógykezelésekor, mind egyéni érzékenységek megállapításánál fontos körülmény, amelynek számos munka- és közegészségügyi stb. vonatkozása van. A genetikai polimorfizmus több fázis l. és fázis 2. biotranszformációs enz im esetében jól ismert és pontosan meghatározott [PM, poor (lassú) metabolizer; EM, extensive (gyors) metabolizer fenotípusok). A Gilbert-kór például gelíetikai polimorfizmus következményének is tekinthető. A genetikai polimorfizmussal szorosan összefiiggő indukálhatóság, a kémiai karcinogenezisbenjátszott szerep több gyakorlati kérdést is felvet, így például egyes szürő-

BIOTRA~ ZFORMÁCIÓ -

IÉREGTELENÍTÉS

)))))U)Hn>))))))))))))))))))))))))))U))))))))))))))))) >)n))})))))))H>)))))))))))U)t))))>))))t))))U))))))))

exogén drog (aktiv)

endogén szignál molekula (aktiv vagy aktiválás előtt)

~

~

farmakológiai - esetleg szignál hatás receptora

fázis l enzimek

oxigenált drog (lehet inaktív vagy aktivált)

1\ \l

addukt képzés

309

L

szignál hatás receptora

oxigenált szignál molekula (aktivált vagy inaktív)

redox ciklus l fázis ll l _:nzimek

kémiai karcinogenezis (citotoxicitás)

konjugált szignál molekula (általában inaktív)

konjugált drog (általában inaktív) fázis lll transzporterek

kiüríthetö konjugált termék (inaktív)

kiüríthetö konjugált drog (inaktív)

2-256. ábra. A biotranszformáció folyamatainak és hatásainak összefoglalása

Az "oxigéntoxicitás" vizsgálatok szükségességét. Ugyancsak előre­ vetíti az ún. individuális, személyre szabott gyógyszerterápia lehetőségét.

Az intermedier anyagcsere alapfolyamata az oxigénmolekula redukciója. Ez a redukció a citokróm oxjdáz által katalizált reakcióban négy elektron

3 to

) )H))))')))))))))))) ))))))))H)))))))))) )))))U))))))))))))) )))))))))))))))))))

)))}))))))))))))))) ))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))

2-257. ábra. Az oxigén redukciója

felvételóv el megy végbe (lásd 2. 1. fejezet), eredményeké nt H 20 képződik. Több évtizede megismertek azonban o lyan állapotokat és fo lyamatok at, amikor tökéletlenül redukált oxigénsz ármazékok j önnek létre (2-257. ábra). A tökéletlenül redukált ox igénszármazékok egy része egy vagy több párositatlan spinű elektront tartalmaz atom- vagy molekula orbitá lon, azaz szabad gyök. Ezek igen reaktív származékok; a szakiroda lom ROS (reaktív oxigén species) vagy ROI (reaktiv oxigén intermedier) névvel illeti őket. A legfontos abb bio lógia ilag j e lentős ROS molekulá k: o;- (szuperox id-anion; enzimreakc iók és nem enzimatik us spontán fo lyamatok során keletkezik), OH. [hidroxilgyök; természetes (pl. kozmikus) és mesterséges (pl. gamma-s ugarak) sugárzás hatására v íz hasításáv al képződi k] , No· (élettani és patológiai j e l entőségű mediátor, amely enzimrea kcióban képződik , lásd 5. 1. fejezet); illetve a fenti de finíc ió szerint nem szabad gyök H20 2 (egyaránt képződik spontán és enzimatik us úton). Ke letkezésü k és biológia i szerepük megítélés e ma sem egységes. E nnek számos oka van. Többek között a következők: (i) az oxigén hiánya és többlete (a hypoxia és hyperoxia) egyaránt veszélyek et hordoz. Egyes kézikönyvek a görög mitológiát, a két "klasszik us", elkerülendő veszélyhe lyzetet (Scy lla és Charybdis) hívj ák segítségül e jelenség szemléltetéséhez. A ROS keletkezé se összefügg fiziológiá s, de gyakran pato lógiás állapotok kialakulá sával. (ii) ROS keletkezhet nem enzimatik us úton. Ezért kia lakulásában a "kémiai baleset" elmélet, mint legfontosabb etiológia i tényező korábban szinte egyedura lkodó volt, és korábban meghatár ozta a szabad gyökökrő l kia lakított egyoldalú biológiai szemléletet (iii) Bár azt régóta ismerik, hogy ROS enz imatikus úton is keletkezh et, de ennekj el entő­ ségét inkább egyes részfo lyamatokra (pl. fagocitóz is) korlátozták. A közelmúl t kutatásai

l

)))))))))))))))))))

AJ\ y ACC ERE

azonban gyökeres en változtatj ák m eg e szemléletet Több j elátviteli folyamatban bizonyítják ROS meghatározó részvételé t, szabályoz ottságát (pl. N O). A ROS-t antioxidá ns enz imek, anyagok fo lyamatosan inaktiválj ák, e liminá lják. Ha az antioxidáns mechaniz musok nem tudják ezt a funkeiét betölteni súlyos károsodá sokat okozó állapot, " oxidatív stressz" alakulhat ki. Ebben az állapotban spontán nem enzimatik us folyamato k sorozata történik. E nnek eredmény eképpen a legkülönbözőbb típusú molekulák, így nukleinsa vak, lipidek, fehérjék, szénhidrátok alakulnak át, változnak meg; ezért az oxidatív stresszben bekövetkező károsodá sok a l egkülö nbözőbb folyamato kat indíthatják e l, pl. m utagenezis, karc inogenezis, membrán károsodá s, lipid-pero xidáció, fehérjeox idáció és fragment áció.

ROS

képződése

nem enzimat ikus úton

A nem enz imatikus úton keletkező részleges en redukált oxigénsz ármazéko k keletkezé se a patológia tárgyköré be is tartozik. A folyamatban a Fe-atom fontos szerepet játszik. Különböz ö Fe2+ -komplex ek, így nukleotid Fe2+ -komplex ek (pl. ADP-Fe 2+) 0 2-nel reagálva hoznak létre részlegesen redukált oxigén származé kokat A hemoglobin Orfelvételekor a mikroszomális e lektron-tr anszportl án cban, i Iletve a légzési láncban " mell éktermék ként" o; keletkezhet O~ keletkezhet kinoidális szerkezet et tartalmazó v~gyületek enzimatik us metabolizmusa során a keletkező szemikinonok nem enzimatik us autooxidációj a folyamán. Több szemik inon lehet szabadgyök-kép ző ily módon (2-258. ábra).

a. b. c.

o;

Fe2+ + 0 2 ~ Fe3+ + Fe2+ + H 20 2 ~ FeJt + OH- + OH. (Fenton-reakc ió) o; + H20 2 ~ 0 2 + OH-+ OH• (Ha ber- Weiss-rea kció)

A belégzett levegő Ode 1- 3%-ban o; -ná alakul. A " normális" o; -terme lés évente kb. 2 kg. Krónikus gyulladás okban ez amennyiségjóval nagyobb.

BIOTRANSZFOR JÁCI Ó - M ÉREGTEL ENÍTÉ

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))Jo))))))))))))))))))).

3

cit P450(Fe 2

•)

P450(Fe ') 0 \

\ \

o

-

311

XAH A OH +

H2 r

',,e

~

o kinon

2·258. ábra. A szemikinonok enzimatikus úton

szemikinon

történő

keletkezése és autooxidációja

ROS képződése enzimatikus úton

0 -aminosav-oxidáz) á ltal katalizált reakciókban és H 20 2 tennel ődi k. Más enzimatikus reakciókban is átmenetileg ke letkezhet a reakc ió során o; ' pé ldául a mikro zomális légzési táncban, azonban normá lis körülmények köző rt ez ne m zabadul fel. Prooxidáns enzimnek tekintik az NO-szintázt is (lásd 5. 1. fejezet). A ke letkezett szabad gyökök más szabad gyökökkel é nem gyökökkel reagá lhatnak, így további szabad gyökök képződhetnek é reakciósorozatok indulhatnak. Ezek között a lipidperoxidáció és a DNS-károsodások patológia i j elentősége em elendő ki. Lipidperox idáció a rán a reaktív szabad gyök H-t von el tö bbszörösen te lítetl en (membrán- vagy lipoprotein) zsírsav o lda llánctó!. Ennek következtében membránkárosodások j önnek létre, LDL-peroxidáció alakul ki. Mindezen fo lyamatok az atherosclerosis k ialakulásában, az ischaemiás károsodások patomec hanizmusában (stroke, myocardia lis infarctus) j e len vannak. Reaktív O H" hatására mutációkra vezető DNS-bázis-károsodások (pl. 5-hidrox i-

o;

Enzimatikus úton O:t és H 20 2 terme l ődh et. Fagocitózisra képes sejtekben fedezték fel a NADPH-oxidázt. M ai tudásunk szerint - bár el ő­ fordulása nem univerzáli s - számos szövet tartalmazza, sőt több növényben is kimutatták. Flavoprotein ; tehát olyan prosztetikus csoporttal rende lkező fe hérje, ame ly egy elektrontranszfert is képes katalizálni .

A reakcióban NADPH az e lektrondonor. Főként a plazmamembránban található. A NADPH-ox idáz antipatogén enz im, mikroorganizmusok hatására aktiválódik és a terrnékeként képződő ROS károsítja, megöli a baktériumokat Nem m egfelelő működése esetén (krónikus granula rnatosus betegségek) az i s métlődő fertőzések halálhoz vezethetnek fiatalkorban. A F AD, illetve Ma-tartalmú xantin-oxidáz, valamint a flavin-oxidázok (pl.

..

3 12

)))))))))))))))))))))))))>)))))))))))))))))>))))))))))))) )))))))))) ))))))))))))))))))))))H))))))))))))))))))))))))))))))))> )))))))))))))))))))))))))))))))))))))))>)))))))H)

metil-uracil) 8-hidroxi-uracil kialakulásának folyamata jól ismert. Egészséges emberek vizeletében ezek mennyisége kimutatható, valószínüsítve a jelentős szám ú "oxidatív találatot" naponta, illetve feltételezve egy hatékony repair mechanizmus védő hatását.

ANYAGCSERE

glutatton·peroxldáz

2GSH

GSSG

A ROS eliminálása Az oxigéntartalmú szabadgyökök eliminálása enzimatikus és nem enzimatikus uton történhet: a. A közvetlen enzimatikus út tehetőségei a szuperoxid-dizmutáz, a kataláz és a peroxidáz által katalizált reakciók. A minden aerob szövetben megtalálható szuperoxid-dizmutáz az alábbi reakciót katalizálja:

glutation-reduktáz

NADPH+ H

glukóz-6-foszfátdehidrogenáz

6-foszfoglukonát

Így a szuperox id-anion redukálódik, illetve oxidálódik. A citoplazmában Cu-, illetve Zn-, a mitokondriumban Mn-tartalmú izoenzimek vannak. A peroxidáz szintén elterjedt enzim az élővilág­ ban. Különösen jelentős a vörösvértestek, trombociták, leukociták peroxidáztartalma. A peroxidáz által katalizált reakcióban a hidrogén-peroxid, illetve a lipid-peroxid vízzé redukálódik. Glutation-peroxidáz esetében az elektron/ hidrogén donor a redukált glutation, az enzim pedig szelént tartalmaz (2-259. ábra). Szelénhiányos táplálkozás esetén a peroxidszint emelkedik, ami szövetkárosodást okoz. A redukált glutation szint csökkenéséhez vezető állapotok, rnint például a glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz-hiány a glutation-peroxidáz elégtelen működésén át az oxigéntartalmú szabad gyökö k felhalmozódását eredményezik. Ezért j elentős a peroxidáz szerepe a membránlipidek, illetve a hemoglobin épségének védelmében a vörösvértestekben. A kataláz elsősorban a májban, vesében és a vér alakos elemeiben található. Hemoprotein, főleg a peroxiszómák tartalmazzák. Segítségével a hidrogén-peroxid vízzéés oxigénné alakul.

NADP

glukóz-6-foszfát

2-259. ábra. A glutation-peroxidáz által katalizált reakció. GSH, redukált glutation; GSSG, oxidált glutation

A fentieken kívül közvetve antioxidáns hatású enzimek többek között egyes, konj ugációkat katalizáló UDP-glukuronil-transzferázok, a glutationS-transzferázok, a kinonokat két elektronnal redukáló NADPH-kinon-oxidoreduktáz, a glutationreduktáz, mivel megelőzi k, gátolják a ROS keletkezését. b. A nem enzimatikus úton tö rténő szabadgyök-eliminációban az antioxidáns hatású anyagok játszanak je l entős szerepet. Kiemelkedő fontosságú a C-vitamin és az E-vitamin, valamint a glutation. Az antioxidán ok standard redoxpotenciálja alapján egymást redukálni képesek (2-260. ábra). Az E-vitamin el ső orban a rnembránkomponensek védelmében fontos antioxidáns. Természetes antioxidáns a már említett ubikinon (lásd 2.1 fejezet), a bilirubin, a retinol (A-vitamin), az urát és számos más molekula. Az antioxidáns hatású gyógyszerek adása igen fontos terápiás lehetőség.

BIOTRA, SZFORMÁ lÓ - M ÉREGTELE 'ÍTÉS

GSSG

aszkorbát

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))>)))))))))))))))))))))))

2GSH

dehídro-aszkorbát

2-260. ábra. Természetes, antioxidánsok "hierarchiája"

nem

enzimat ikus

Az oxigéntartalmú szabad gyökök sejtkárosító hatásai több m ódon jelentkeznek. A különbözö membránlipidek, lipoproteinek peroxidálódnak. Lipidperoxidáció (2-261. ábra) következtében, a membrán permeabilitási viszonyok megváltoznak, a membránban elh e lyezkedő enzimek inaktiválódnak. A különbözö aktív reakcióképes gyökök kovalensen kötödnek fehérjékhez és nukleinsavakhoz, így enz imeket inaktiválnak, illetve mutagén, teratogén, karcinogén hatásúak. Szabad gyökök képződésével magyarázzák az öregedés mechanizmusát is, a lipid-peroxidok és fehérjék oldhatatlan komplexeket, granulumokat képeznek, amelyek lerakódnak.

313

Á tmeneti oxigéne llátási zavarokkal járó állapotok (infarctus, szer vtranszplantáció, sebészi beavatkozások) ismert szövödményc az ischaemia-reperfusio szindróma. A vérellátás (ox.igénellátás) helyreállítása jelentős további szövctkárosodást eredményez, oxidatív stressz a lakulhat ki. Ilyen tipusú károsodások léphetnek fel szívben (pl. infarctus), agyban (agyi vascularis katas7tr6fák), vesében, májban (transzplantáció), belekben (műtéti következmények). Az intenz ív ATP- Iebomlás, fokozódó xantin-oxidáz-aktivitás, illetve más mechanizmusok (citoszolba történő kalciumkiáramlás hatására fokozódó leukotriénsziotézis leukociták adherenciáját, kitapadáát, a NADPH-oxidáz-aktivitás emelkedését okozza) szabad gyökök képződéséhez vezetnek. amelyet az oxigénellátá, j avulása jelentősen fokoz . M indez lipid-peroxidációt, membránkárosodást, enzimek inaktiválódását stb. okozza. Az oxidatív stre sz megelőzésérc számos szintetikus antiox idánst, xantin-oxidá.t-bénitókat, kalc iumcsato ma-blokkolókat, vas kelátorakat stb. alkalmaznak.

Összefoglalva, az oxidoreduktázok által katalizált reakciókban, valamint nem enzimatikus úton a sejtekben oxigéntartalmú szabad gyökök keletkezhetnek, amelyek ha felszabadulnak, spontán nem enzimatikus folyamatokat indítanak el. Eliminálásuk részben antioxidáns enzimekkel, illetve más antioxidáns hatású anyagokkal történ ik. Az oxigéntartalmú szabad gyökök többféle mechanizmussal sejtkárosító hatásúak és a génexpresszió szintjén is befolyásolják a sejtek működését. Az intracelluláris redox status változásainak szerepe a génexpresszió szabályozásába n egyike a legfontosabb kutatási irányoknak napjainkban. Számos transzkripciós faktor aktiválása hypoxia vagy éppen a hyperoxia következménye, az esetek egy részében, más tényezök közöttegyes ROS molekuJák megjelenése, koncentrációjának vá ltozása kimutatott, illetve közvetve bizonyított. Az NFKB (nuclear factor KB), AP- l (transcription factor activating protein-l) hyperoxia (oxidatív stressz) esetén; a HIF- la (hypoxia inducible factor-l alpha) hypoxia hatására aktiválódik kötödik megfele l ő DNS szekvenciákhoz. Oxidatív stresszben például citokinek (pl. rnacrophage colony stimulating factor), növekedési faktorok, adhéziós molekulák, enzimek (pl. a hem-oxigenáz vagy az antioxidáns szuperox iddizmutáz) fokozott indukcióját mutatták ki, s ebben az NFKB és AP-l szerepét. Hypoxiában pedig a bHLH fehérjék családjába tartozó HIF- l a dimert

314

xc_

)))))))) )))))> )))))) )) ) ) ))))))))))l) )))))))) >)))))))))>))))) ) ) )))))))))))))))))) )))))))))) )))))))))) ) ) )))))))))) )) ) ) )l)))))))))))))))))))))))}))))))))))))))))))))»))))))))) )

NADPH+H:

x

NADP

cit. P450 reduktáz FAO P450 red~ktáz FADH2

3

cit. P450(Fe 2

AOH +

~

1/2 HP2 + 1/2 O

·) X A H

P450(Fe +)0

'

XPP- F···

A ' YAGC ERE

O,

H, O

XPP-rY 2+

XPP- Fe 0~

XPP- Fe'•o, /

2-261. ábra. A lipidperoxidáció folyamata. XPP, nukleozid-difoszfát; L, többszörösen telltetlen zsírsav a membránban. A membránhoz kötődö kevert funkciójú elektrontranszport-láncban a NADPH:citokróm P450-reduktáz FADHrről egy elektron transzferrel redukálódhat nukleozid ditoszfát-vas komplex is. Az XPP-Fe 2 + már képes az 0 2 megkötésére és ezáltal molekulán belüli átrendezódássei jön létre az igen reakcióképes XPP-Fe3•o2· komplex, amely nem enzimatikus reakciók sorozatával lipid-peroxidok képződéséhez vezet

képezve az ARNT-vel a HRE (hypoxia responsive element) nevet viselő DNS- szekvenciához kapcsolódik, amely több gén promáterében megtalálható. Ezeket a géneket oxigénszenzitív géneknek is nevezik. Hypoxiában például ily módon fokozódik több fehérje expressziója. Ezek közé egyes növekedési faktorok (pl. VEGF, vascular endothelial growth factor), transzporterek (pl. GLUT-2), enzimek (pl. laktát-dehidrogenáz) tartoznak.

Több beteg ég patomechanizmusában bizonyított e transzkripciós faktorok mediálta szignál transzdukciós utak módosulása, illetve ennek közvetett hatása, így például diabetes mellitusban, ischaemiás szívbetegségekben, egyes neurodegeneratív betegségekben, számos krónikus gyulladással járó kórképben. Ezért gyakorlati jelentőségük igen nagy új gyógyszerek kutatásában, illetve a kóros/normális folyamatok megismerésében.

A fejezet megírásával kapcsolatban tett javaslatokért és kritikai megjegyzésekért a szerző köszönetet mond Dr. Bánhegyi Gábornak, Dr. Braun Lászlónak, Dr. C ala Miklósnak és Dr. Kardon Tamásnak

Az anyagcsere össze hango lt szabályozása

.7.

Mandl József

Az anyagcsere szabályozása több szinten megvalósuló fo lyamat. A különböző egymásra épülő regulációs mechanizmus ok jelentik végül az e szabályozások eredményeké nt megvalósuló integrációt. A sejt szintjén megvalósuló integráció kapcsán áttekintj ük az intermedier anyagcsere fontosabb elágazási pontjait, a sej t redox homeosztázisát. A szervezet szintjén megvalósuló integráció tárgyalása kapcsán az anyagcsere egyes fontosabb sejt-, szövet-, szervspecifik us sajátosságaival foglalkozunk. Tekjntettel a máj kitüntetett funkciójára, kiemeit részletességg el tárgyaljuk a máj működését.

A sejt intermedier anyagcse réjének integrációja és a szabályoz ás szempontjai Az intermedier metabolizmus feltétele a folyamatos energia transzformáció, A TP-termelés. A megtermelődött ATP sejttípusonké nt különböző mértékben különböző célokra fordítódik. A legfontosabb felhasználási területek a következők: kontraktilitás, aktív transzport, szignál amplifikáció, bioszintézis. Az energiatransz formáció és -felhasználás folyamatainak szabályozása általában enzimaktivitá s szabályozáson keresztül valósul meg. A metabolikus szabályozás eszközei:

O Allosztérikus kölcsönhatások, amelyek rendszerint az intracelluláris szubsztrátkoncentráció

szintjén szabályoznak Az allosztérikus effektor hatással bíró szubsztrátok általában a sejt metabolizmusának aktuális állapotát (ATP/ADP, NAD+/NADH arány stb.)jelzik. Az ilyen típusú szabályozások legfontosabb célpontjai a reakciósorozatok "elkötelező", irreverz ibi lis reakciói (pl. foszfofruktok ináz I, 8-amino-levulinsavszintáz acetii-CoA-ka rboxiláz, karnitin-palmitoil-transzferáz) vagy más irreverzibilis reakciók (piruvát-kináz, piruvát-dehidrogenáz). 6 A poszttranszlác iós kovalens módosítások zömében fehérj efoszforil áció - révén megvalósult enzimaktivitás-változások rendszerint nem az intracelluláris metabolizmus aktuális állapotának " üzenetét" közvetítik, hanem extracelluláris szignálokat, amelyek a szervezet energiaállapotának megfelelően változtatják az intracelluláris enzjrnek aktivitását (pl. piruvátkináz, glikogén-foszforiláz, glikogén-szintáz, foszfofruktokináz 11, acetil-CoA-karboxiláz, fenilalanin-hi droxiláz, hormonszenz itív lipáz). Hormonok, neurotranszm itterek több esetben ilyen mechanizmus okon keresztül hatnak. C) Az enzimaktivitás szabályozásán ak további fontos lehetősége az enzimek mennyiségén ek szabályozása. Ez a génexpresszió szintjén történő szabályozástj elent (Az éhezés vagy a túlzott táplálékbevitel, illetve a táplálék összetétele hatására több enzim indukálódik, például foszfoenol-piruvát-karboxikináz, glukóz-6-foszfátdehidrogenáz, glukokináz, piruvát-kináz, malát enzim, citrát-liáz, acetii-CoA-ka rboxiláz, zsírsav-szintáz). Mint látható, a szabályozások

3 16

))))>)))))))))))) )))))))))))))))))) )))))))))))))))))) )))IH»H>))))))) )I)))))))))))))))H

egymásra épülnek. Egy enzim aktivitását szabályozhatja allosztérikus hatás, poszttranszlációs módosítás vagy reguláció történhet a génexpresszió szintjén is. 0 Rendkívül fontos körü lmény a sejten belüli kompart mentaliz áció a szabályozásban. Az ún. elágazási pontok esetében a különböző enzimek által katalizált reakciók eredmény eként olyan intermedi er képződik, ,amely más kompartmentbe transzportálódik. Igy az elágazási pont egyben abban az értelembe n is elágazási pont, hogy az adott molekula metabolizmusa a továbbiakban mely kompartrnentben zaj lik. A kompartm entek közti kapcsolatot a transzportrendszerek biztosítják. Igen fontos, hogy számos esetben a lebontó és szintetiku s folyamatok külön komparte mentekbe n zaj lanak (pl. zsírsav-szintézis és -lebontás). 0 A folyamatok elkülönültsége egy szerven belül a szervet alkotó sejtek között is kialakul, ami a szerv, illetve a szerveze t szintjén megvalós uló regulációt szolgálja (ilyen pl. a glukokor tikoidok és a mineralokortikoidok szintézise amellékvesekéreg külőnböző részeiben).

)))))»>>m>»»> >»»»»m>»»»m m>m»»»m»»»» >»»»>>»»»»»»

AI'IYAGCSERE

Elágazási pontok a sejtek intermedier anyagcseréjében Az anyagcserében a kataboliz mus konvergenciája és az anabolizmus divergenciája az elágazási pontok szabályozásán keresztül valósul meg, ami a sejt (szervezet) igényei szerint változik. A bioszintézishez bioszintetikus prekurzo rok kellenek. A bioszintetikus prekurzo rok száma alacsony, e folyamatok zöme a gli kolízis és a citrátciklus intermedi erjeiből indul. A katabolik us és anabolikus utak találkozá si pontjai az intermed ier anyagcse re elágazás i pontjai. A különböző elágazási utak, közvetlenül vagy közvetve "elkötelező", rendszeri nt irreverzibilis reakcióka t katalizáló enzimek belépését jelen tik. A reakciók sok esetben azt is eredményezik, hogy az adott metabolit a sejten belül belép egy másik kompartrnentbe. Glukóz-6 -foszfát a sejtben a glukóz felvétele után, a glikogén lebontása során vagy a glukoneogenez is intermedierjeként képződik. A glukóz-6-fos zfát metaboliz musa különböző kompartmentekbe való kerülést és különböző funkciójú reakcióutakba való belépést eredmény ez (2-262.

-

sejtmem

UOP-glukóz •4-- glukóz-1-foszfát

l/

fruktóz -6-foszfát glukóz-6-foszfát

glikogén

6-foszfoglukonolakton

t

0

1l®

piruvát

pentóz-5-foszfát

2-262. ábra. A glukóz-6-foszfát képződés~nek. és továbbataku.lá~ának f?nt?sabb útj~i../ . ~e.xok!~ui= (glu~~k~~~~) által katallzál~ re~.kció, :!. a g Iukó: 6:fos=fátá= á twl katafi=ált reakcio, J . .fos=fog/uko=-l=ome~·a::. alta/ ka~a~1=all 1 ec~ÁCIO, 4 ghkoh.1s. 5. gluk.;neogl.'

glukó=-6:/ós:föt-dehidro gená: által katali=tilt reakció. 7. fos:(ogluko mw cc alta/ katah=alt reakciÓ

ne.ls, 6

•

l

BIOTRAN ZfOR IÁCIÓ -

IÉ: REGT ELE ' ÍTÉ

)))))))) )))) )) )))))) )) )) )))))) )))) )))) )))) )))))))))))) )))))))))))))) )) )) )) )))))))))) )))) )))))))) )))))) )))) ))))))))

ábra). A glukóz-1-foszfáttá alakulás az UDPglukóz képződéséhez vezet, ami bioszintetik:us utak, mindenekelött a glikogénszintézis lehetöségét jelenti. A fruktóz-6-foszfáttá alakulás e l sősor­ ban a glikolízis, mint főként katabolikusnak tekintett út kezdete. A g lukóz-6-foszfát, ha transzportálódik az endoplazmás retikulum luminális kompartrnentjébe, akkor a májban a glukóz-6foszfatáz szubsztrátja lesz, amely glukózszekréciót, a sejtből történ ő kilépést és egyben tápanyag-transzportot tesz lehetövé más sejtek számára. Végül a pentóz-foszfát-útb a történő belépés bioszintézist, illetve a reduktív bioszintézishez szük:séges NADPH regenerálást biztosít. Piruvát elsősorban a glikolízis során glukózból és más monoszaharidokbó l képződik. A piruvát további metabolizmusa a sejt, illetveszövet típusától és metabolikus állapotától fiigg (2-263. ábra). Meghatározó körülmény, hogy belép-e a mitokondriumba vagy a citoszolban marad. Az esetek egy részében ez egyben az aerob és anaerob metabolizmus találkozási pontját is jelenti. A mitokondriális metabolizmus lebetöségét az 0 2

317

jelenléte adja. A citoszolban maradó piruvát laktáttá redukálódik, ami a sejt metabolizmusa szempontjából zsákutca, illetve a katabolizmus végállomása; a szervezet szempontjából viszont megtere mti a piruvát transzportjának lehetöségét más sejtekbe (pl. izomból a májba, a Cori-kör részeként). Ebben az értelemben ez a piruvát mint glukogénprekurzo r megőrzése. A máj számára az izmokban képződő laktát a glukoneogenez is fontos prekurzora. A piruvát- ala nin átalakulás a szénbidrát és az aminosavanyagcse re kapcsolatát biztosítja. Több aminosav katabolizmusa ezen a transzaminálási reakción keresztül kapcsolódik a metabolizmushoz, illetve ez a reakció több aminosav de novo szintézisének is lépése. A piruvát mitokondriális metabolizmusa a glukogén és ketogén metabolizmus szétválása. Míg az acetii-CoA keletkezése a glukogénprekurzo r irreverzibilis elvesztése, a piruvát--oxálacetát átalakulás az új glukózszintézis lehetőségének megtartása. igy a piruvát-dehidroge náz komplex által katalizált reakció a glukózdependens sejtek számára (központi idegrendszer) alapvető, a szervezet g luko-

glukóz (monoszacharidok)

~ sejtmembrán

mltokondrlum

r

piruv~ acetii-CoA

oxálacetát

2·263. ábra. A piruvát k épződ ésén ek fontosabb útjai és további metabolizmusa. / . Glikolizis. 2. a pimvát-delticirogemí= á/w/ katali=ált oxidCitÍv dekCirboxile=és. 3. a piruvát-karhoxi/á;: által kCI/CIIi:!ált karboxile:és. 4. trans=ominálás. 5. !Ciktát-dehidrogená:: által katali::ált oxidoredukció

3 18

»>»>»»m»»»»>»»ll>»>mm»>»>~>>>>»>>>>m»»ll>>»»>»m>»»»>>m>>>»>>mmm>>>>>>>>>»>>>»»>>>>>>>>>>>>~>>>>m»»>>>m>m>>>>>m»>>»>m

génmetabolitjai anyagcseréje szempontjából (első­ sorban a máj ban) rendkivül fontos szabályozási, elágazási pont. A piruvát-oxálacetát reakció a citrátkör jelentős a naplerotikus folyamata, amelyet az acetil-CoA serkent. Acetil-CoA a mitokondriumban képződik el ső­ sorban a piruvát ox idatív dekarboxilezése és a zsírsav-oxidáció, valamint egyes ketogén aminosavak lebontása során (2-264. ábra). A keletkezett acetilcsoport a citrátkörben oxidálódhat, ez esetben energia termelődik vagy citrát formájában a citoszolba transzportálódhat, ahol a zsírsav- és a szteroidszintézis előanyaga lehet; ennek a transzportnak energiaraktározó és bioszintetikus funkciója van. Az acetil-CoA-ból a májban ketontestek képződhetn ek , ez az átalakulás szintén tápanyag-átalakítás, -ellátás, végső soron energia transzfernek is tekinthető, amennyiben az acetilcsoport a ketontestek révén a májból más szervekbe, szövetekbe j ut. Ennek az útnak a jelentősége éhezésben megnő.

A N Y A GCS li: RE

A sejtek redox homeosztázisa A redox homeosztázis fenntartásához, valamint a bioszintetikus fo lyamatokhoz általában szükség van redukáló ekvivalensekre, mivel szárnos bioszintetikus folyamat redukció. A sej t redox állapota a sejten belüli különböző redox rendszerek aktuális helyzetétől függ. Ezek a rendszerek összefüggenek egymással, a bioszintetikus, valamint más, nem energiatermel ő folyamatokhoz szükséges " redukáló erő " (reductive power) fo lyamatos újratermelése azonban a sejt redukáló ekvivalens integrációján belül elkülönült rész. A bioszintetikus folyamatokat katalizáló oxidoreduktázok koenzime általában a NADPH. A szintézis és a degradáció a redukáló ekvivalensek anyagcseréjében is különvált; a NAD /NADH és a NADP+/NADPH arány nem szükségszerűen azonos irányban változik (lásd 2. 1. fejezet). A NADPH-termelést táplált állapotban a citoszolban a pentóz-foszfát-út biztosítja. A pentóz-foszfát-út során glukóz-6-foszfát terhére redukálódik a

p

iru~

zsírsavak

~

mitokondrium

acetii-CoA

® \

oxálacetát

--1--- - - - - - - - - - citrát\

citrát .,..

oxálacetát

~®

acetil-CoA

zsirsavintézis \

izocitrát

\

citrátciklus reakciói

koleszterinszintézis

2-264. ábra. Az acetii-CoA képződésének fontosabb útjai és to vábbalakulásának le h etősége. 1. Piruvát oxidatlv dekarboxilezése, 2. zsírsav-oxidáció, 3. a citrát-szintetáz által katalizá/t kondenzáció oxálacetáttal, 4. ketontestek szintézise, 5. A TP:citrát-liáz által katalizá/t reakció

BIOTRANSZFORMÁCIÓ - MÉREGTELENÍTÉS

))))))))))U)))))H)))))~>•>>)>)))H))))t))))HH>>))))))))U>n>>\)))))t)H)))))))))ll)))n))))))>)))))))))))))))

NADP+. A NADPH-termelés másik l ehetősége mitokondriumból szánnazé szubsztrátellátást igényel (2-265. ábra). A citoszolban az izocitrátdehidrogenáz, valamint a malát enzim játszik ebben szerepet. A NADP+-redukc ió nemcsak a citoszolban, hanem a mitokondriumban is megtörténik NADH-ból transzhidrogenálással. A sejtek redox homeosztázisában igen fontos az intracellul áris redukált glutation szint fenntartása. A redukált g lutation kofaktora az oxigéntartalmú szabad gyökök eliminációjában részt vevő glutation-peroxidáznak (lásd 2.6. fejezet), emellett elektrondonor nem enzimatikus folyamatokban is. A redukált glutation regenerálását a glutationreduktáz katalizálja. A glutation-reduktáz flavoprotein. Az elektrondonor, NADPH, e lőször a glutation-reduktáz prosztetikus csoportját, a FAD-ot redukálja, majd innen kerül át a hidrogén az oxidált glutation diszulfidkötésére, reduká lt glutation képződik (lásd 3 13. oldal).

JJ9

A redukált glutation szintézisének legfontosabb he lye a máj. Koncentrációja a hepatocitákban 2- l O mM között ingadozik, éhezésben alacsonyabb. A redukált glutation szinuszoidális transzporterrel a májszinuszoidokba transzportálódik, illetve kanalikuláris transzporterrel mediá lt transzport útján az epébe kerül. Innen exportálódik rnind a vérrel, mind biliáris úton a felhasználás legfontosabb helyeire, a vesébe, a tüdőbe, illetve a belekbe. Ez összefügg a kéntartalmú aminosavak szervezetbeli homeosztázisával, mivel a máj a szervezet ciszteinraktára. Éhezésben és májbetegségekben a glutationszintézis és -export csökken. Több kóros állapotban ismert a redukált glutation szint csökkenésének szerepe a patagenezisben, így pl. a felnőtt respiratory distress szindrómában, a gastrointestinalis traktus több betegségében (pl. fekélybetegség).

mitokondrium u-ketoglutarát

Í

malát

+ - - - - - - -+-- - - - - - - a-ketoglutarát

t-- NADPH f'- - NADP

izocitrátdehidrogenáz

izocitrát

,/ citrát - ---+-----.citrát

'yacetit-CoA oxálacetát oxálacetát

acetii-CoA

~ + - - - - - - - --+-- - - - - -

piruvát

r===

malát

l

- NADP NADPH

malát enzim

piruvát

2-265. ábra. NADP• redukció a citoszolban a mitokondriumból származó szubsztrátok terhére

l

320

})) H))))))))))})))))))))))))>))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))>)))))))) )))))))))) H))>>>))))))))))))))) n)))))>>>)))))) )H, >U>l)))))))>>))))))))))~>))

Az anyagcsere szabályozása a szervezet szintjén- éhezés, táplálékbevitel A szervezet szintjén az anyagcsere két "szé lső" állapota az éhezés és a táplálék felvétele. A táplálékfelvétel esetében a cél a felvett táplálék felhasználása, raktározása, rnig éhezés esetén a raktárokból történő tápanyag mobilizálása. Az emberi szervezet rendelkezik azokkal az energiaraktárakkal, amelyek segítségével nemcsak az étkezések közti "ébezéseket", hanem jóval tartósabb éhezést is átvészel. A gyors, azonnal mobilizátható energiatartalék a szervezetben a glukózraktár, a májglikogén. A szervezet időben lassabban mobilizálható energiaraktárai a trigliceridek a zsírszövetben, majd a mobilizálható fehérjék a vázizomban. Éhezésben a legfontosabb feladat a vércukorszint fenntartása. Éhezésben ezért a glukogénprekurzo rok megtartása igen lényeges. Ehhez a máj részben a glukóz szintézisével és szekréciójával járul hozzá. Ennek során kb. 24 óráig a májglikogénraktár (kiürüléséig), illetve hosszabb távon a glukoneogenezis áll rendelkezésre. Emellett a máj a ketontestek termelésével alternatív tápanyagforráshoz juttatja az agyat, ahol így csökken a glukózfogyasztás. Egy 70 kg-o ember mozgósítható energiatartalékai az alábbiak: májglikogén: izomglikogén glukóz: zsírszövet-zsír: izomfehérje:

70 g

1200 kJ

120 g

2000 kJ 750 kJ

20 g 15 OOO g

565 OOO kJ

6000g

100 OOO kJ

A napi energiaigény 6700-lO OOO kl Ebből következik, hogy az azonnal a vérben, illetve testfolyadékokban rendelkezésre álló glukóz rnint energiatartalék jelentéktelen. A szervezet anyagcseréje több szerv, illetve szövet összehangolt müködését igényli . Ebben a legfontosabb a máj szerepe. A máj

A máj szerteágazó funkciói az interrneclier anyagcsere integrációjában az adaptáció kulcsszó-

•> )))) )) ))))))

ANYAGCSERE

val jellemezhetők. A szervezetben betöltött funkcióit négy csoportba szekták sorolni: O Integráló funkció a különböző tápanyagok anyagcseréjének alakításában. Ez alkalmazkodás az éhezés, valamint a táplálékbevitel állapotaihoz; ebben a fejezetben elsősorban ezzel a funkcióval foglalkozunk. 6 A szervezetbe kerülő nem tápanyag, valamint a szervezetben keletkező, az energiatranszformációban közvetlenül részt nem vevő molekulák metabolizmusa, eliminációj uk előkészítése. Ezzel a tankönyv külön fejezete foglalkozik (lásd 2.6. fejezet). E funkció ellátása azonban energiaigényes, így több ponton kapcsolódik az első funkcióboz. A biotranszformáció változásával képes a máj alkalmazkodni idegen anyagok (pl. gyógyszerek) fokozott beviteléhez vagy endogén toxikus állapotokhoz (pl. icterus). @ A szervezet nitrogénegyensúlyának fenntartása - ureaciki us. A máj ezen funcióját más fejezetben tárgyaljuk (lásd 2.4. fejezet). A májműködés felborulásának, a májcoma klinikai tünetegyüttese kialakulásának éppen e funkció kiesése az egyik legjellemzőbb oka. O A plazmafehérjék szintézisével a szervezet homeosztázisának fenntartása. Ez teszi lehető­ vé többek között a szervezet alkalmazkodását különböző kóros állapotokhoz (pl. fertőzések). E funkció egyik legfontosabb aspektusával, a máj szerepével a hemosztázis fenntartásában a tankönyv egy másik fejezete (lásd 6.5. fejezet) foglalkozik. A máj ugyan altruista szerv, valamennyi funkció azonban jel entősen befolyásolja a máj "saját" anyagcseréjét A májfunkció jelentős részének ellátása összefügg a máj anatómiai helyzetével, keringési viszonyaival. A portalis érrendszer sajátosságaiból adódóan a per os szervezetbe kerülő anyagok felszívádásuk után a májon keresztül kerülnek a keringésbe. Ez a májnak egy "clearance"-szerü szerepetad mind a táplálékok, mind az idegen eredetü molekulák vonatkozásában. A vena portae glukózkoncentrác iója 10- 12 mM is lehet, ami jelentősen lecsökken, rnire a májon át a vér a vena hepaticae-ba, majd a vena cava inferiorba jut. Ugyanez érvényesül az ammónia, vala-

BIOTRANSZFORMÁCIÓ - MÉREGTELENÍTÉS

)))))))) )))))))))))))) )) )) )) )))))))) )H)>))»>))))))))))>>)))))>)))))))))))))))))) l)))))))))))>)))))))))))))))))))

mint más, idegen eredetű molekulák: esetében is. A perctérfogat mintegy 30%-a megy át a májon. A rnájlebenyek szerkezete a vena portae-n beáramló kiindulási anyagok, illetve a vena hepaticán kikerülő termékek teljes elkülönülését, egy vegyi üzem szervezettségét, biztosítja. A májműködés megértésének további fontos szempontja az epeszekréción keresztül a vérkeringés és a bélcsatorna kapcsolata. Ily módon a májon keresztül a vérből a bélcsatornába kerülhetnek kü lönböző anyagok. A máj éhezésben fokozza a glikogenolízis, g lukoneogenezissebességéta glukóztermelés érdekében. Fokozódik a zsírsav-oxidáció a saját, megnövekedett energiaigényének fedezésére, valamint a ketontestképzés fokozása m iatt. Táplálékbevitel esetén a máj a glikogenezis fokozásával feltölti az éhezésben csökkenő glikogénraktárait A megfelelő glikogénszint fenntartása igen fontos a májfunkciók ellátásában. A "felesleges" táplálékot zsírsav-szintézisre basználja fel, amelyet trigliceridként a zsírszövetben raktároz. Ezen funkciók ellátását az alábbi molekuláris mechanizmusok segítik elő. Táplálékbevitel esetén valamennyi tápanyag felszívódás után, a vena portae-ba kerül és átmegy a májon. Ez az "első kör" főként az "extra cukor" felvétele és hasznosítása miatt fontos. A vena portae már említett magas glukózkoncentrációja a vena hepaticae-ben már jelentősen lecsökken a hepatocitákban található nagy kapacitású glukóztranszporter (GLUT-2) és a glukokináz müködése miatt. A gluk:okináz csak glukózt foszforiláló enzim. Funkciója, szemben a hexokinázéval az, hogy a táplálékfelvételnél jelentősen megemelkedő glukózt foszforilálja a hepatocitákban. A glukokináz szü letés után indukálódó enzim. Új szülötteknél még kis mennyiségben expresszálódik. Ez is oka annak, hogy az újszülött nem képes hosszabb éhezésre, mivel a máj nem tudj a hirtelen fel venni a táplálékbevitellel bekerülő "extra glukózt". Májon kívül g lukokinázt még a pancreas P-sejtjei ta rtalmaznak, ahol "glukózszenzor" szerepet tulajdonítanak neki.

A máj glukózfelvevő képessége igen fontos a vércukorszint szabályozásában. Májelégtelenségben ezért egyaránt kialakulhat hyper- és bypoglykaemia. A glukokináz a magas véruk:orszint csökkenését szolgálja. Közvetve a vércuk:orszintet csökkentő

321

mechanizmus a glikogénszintézis lehetősége is. Hyperglykaemia az egyik legfontosabb serkentője a máj glikogénszintézisének (lásd glikogén-anyagcsere szabályozása) . A máj a táplálékbevitellel felvett "extra glukózból", amit nem glikogén formájában tárol, triglicerideket szintetizál, amelyeket VLDL-ben exportál. Fokozott szénbidráttartalrnú táplálkozás esetén a zsírsavak kb. 30%-a a májban termel ődik. A máj piruvát-dehidrogenáz által katalizált reakció meghatározó pont a glukogén szubsztrátok ketogénné alakulásában. A szervezetnek a vércukorszint fenntartása érdekében glukoneogenezis prekurzorokra van szüksége, azonban az energia tárolása trigliceridek formájábanjóval előnyösebb . A probléma az, hogy a trigliceridek érdemleges mennyiségben nem alakíthatóak át (vissza) glukózzá. Ezért, ha glukogénszubsztrát ketogénné (piruvát-acetil-CoA-vá) alakul, az többé nem használható g luk:oneogenezisre. Éhezésben, diabetes mellitusban, hyperacetonaemiás állapotokban az acetonból biotranszformációs reakciók segítségével glukóz képződhet, de ez mennyiségileg nem pótolja a glukogénprekurzorok hiányát.

A glukogén szubsztrátok fokozott lebontása miatt megemelkedik a piruvát koncentrációja, a piruvátból keletkezett acetii-CoA citráttá alakul, a citrát transzportálódik a citoszalba és gyorsul a zsírsavszintézis. Hepatocitákban rnind az inzulin-, mind a piruvátkoncentráció emelkedése fokozza a piruvát-dehidrogenáz defoszforilációját, tehát aktiválja az enzimet (lásd 2.1. fejezet). Táplálékbevitel esetén az anabolikus folyamatok legfontosabb serkentője az inzulin. A táplálékfelvétel esetén érvényesülő legfontosabb metabolikus utakat a 2-266. ábra foglalja össze. Éhezésben a máj energiaszükségletét zsírsav-oxidációval fedezi. Erre fedezet a megemelkedett szérum FFA, amelynek kb. 50%-át a máj veszi fel. Kamitinszint-csökkenéssel j áró állapotokban (pl. hemodialízis miatti ka mitin vesztés) csökken a béta-oxidáció a májban. Ennek hatására emelkedik az FF A, és csökken a ketontesttennelés, mert kevés az acetii-CoA. Emiatt csökken a glukoneogenezis is (a pimvát-karboxiláz allosztéri kus aktívátora az acetil-GoA), ami hypoglykaemiát okozhat. A béta-oxidáció csökkenése az izomban izomgyengeséget és myoglobinuriát okoz.

322

H•)))))))))))) ~)H))))H)))))>)>))))>J)H•»•>n»H>HH)))>)>>>>>>>H>)))))))))))))H))))o)))))))>)>)>))))>>)>H)))l>)>>>>))))))))l)))))) l )l))))))))))))H)))))))))l)))))))))

ANYAGCSERE

agy

co2 + HP

r

glukóz máj glikogén<~~~~~lllll--- glukóz-6-P +--~_....,.--

~

l

glukóz

izom

------r--•

piruvát

glukóz-6-P~ glikogén

~

laktát +--+ piruvát

~

~

acetil-GoA/ aminosavak -+fehérjék

acetil-GoA

~

zsírsavak

~

trigliceridek + VLDL

- - - --1--__. VLDL

•~

zsírsavak adipoeita

glukóz

zsírsavak

• l

glicerin-3-P

~

trigliceridek

2-266. ábra. Metabolikus kapcsolatok a fő energiafogyasztó és -termelő sejtek (szövetek) között táplálékfelvétel esetén

A máj glukózszekrécióját két fo lyamat biztosítja, a glikogenolízis és a glukoneogenezis. A legfontosabb glukoneogenezis prekurzorok a laktát (izomszövetből és vörösvértestekböl), glicerin (zsírszövetből) és a glukoplasztikus aminosavak (izomszövetből). A glikogenolízis és a glukoneogenezis serkentése a májban együtt reguláit, szemben az izomma!, ahol a glikogenolízissel glikolízis történik egyidejűleg. Ezért is fontos, hogy a zsírsav-oxidáció fedezi a hepatocita energiaigényeit, mivel a glukoneogenezis miatt a glikolízis éhezésben csökkent intenzitású. A glikogén-szintáz és -foszforiláz, a foszfofruktok.ináz II és a fruktóz 2,6-biszfoszfatáz, valamint a piruvát-kináz koordinált cAMP-dependens szabályozása, amelynek legfontosabb mozgatója májban a glukagon, ezt az összerendezettség biztosítja. Mindez kiegészül a

zsírsavak citoszolból a mitkondriumba történő transzportjának cAMP-függő serkentésével (karnitin-zsíracil-transzferáz). Ezzel párhuzamosan a kovalens módosítások a zsírsavszintézis és koleszterinszintézis elkötelező enzimeit gátolják (acetiiCoA karboxiláz, j3-hidroxi-j3-metil-glutaril-CoAreduk:táz). Az éhezés esetén érvényesülő legfontosabb metabolikus utak a 2-267. ábrán láthatók. Hormonok és az étrend jelentős szerepet játszanak több szabályozó enzim, így például a glukokináz, piruvát-kináz génexpressziójában is. Indukálódó enzimek táplált állapotban a N ADPH generáló enzimek, acetil-CoA-karboxiláz, a zsirsavszintézis enzimei. Éhezésben a foszfoenolpiruvátkarboxikináz, glukóz-6-foszfatáz indukálódik a glukoneogenezist elősegitendő.

323

BJOTRANSZFORMÁCIÓ - MÉRECTEL ENÍTÉS

fedezi. Éhezésben a zsírsavoxidáció preferált; ezzel csökken a glikolízis és így a glukózfogyasztás. Az izomsejtek glikogéntartalma jelentős; a szervezet glikogéntar talmának mintegy háromnegyede az izomszövetben található. Ez a glikogén azonban nem tartalék a vércukorszint fenntartása szempontjából, mivel az izomban nincs glukóz-6-foszfatáz, ezért nem tud glukózt szecernálni a vérbe. A glikogén lebontása az izomsejt saját, izomkontra kcióhoz szükséges intenzív energiaigén yét fedezi. Ennek megfelel ően a működő izomban a glikolízis a glikogenolizissel párhuzamo san reguláit, a piruvát termelése meghaladha~a a citrátkör felvevöképesség ét, illetve a működő izomban a kantrakciók miatt átmeneti oxigénhiány léphet fel. Ez a mitokondriumban aNADH-oxidáció csökkenéséhez és a laktáttermelés fokozódásához vezet. A vérbe került laktátot a máj veszi fel (Cori-kör). A piruvát májba jutásának másik útja az, amikor transzaminálással alaninná alakulva kerül a vérbe

A máj aminosavak lebontásából is képes funkcióit ellátni. A glukoplasztikus aminosava k glukoneogenezis prekurzorok; a ketogén aminosavakból a máj ketontestet termel. A:z. arninacsop ortok az ureaszintézissel távoznak. Összefoglalva, a máj glikogén-, illetve triacilglicerol-készlete energiatartalék az egész szervezet számára. A máj képes glukóz-, ketontest- és zsírsavszintézisre, illetve exportra. Éhezésben a máj glukózt és ketonteste ket termel, illetve exportál; táplálékbe vitelkor zsírsavaka t. Ennek megfelelően éhezésben a glikogenol ízis, glukoneogenezis, ketogenezi s dominál, a glikogenez is, glikolízis, Upogenezis gátolt.

Izom

Az izomsejt energiaszü kségletét glukóz-, zsírsav-, ketontest- (elsősorban a szívizom) fe lvétellel

ragyl

l

C02 + H20

glukóz

ll

j

ketontestek

adipoeita

2-267. ábra. Metabolikus kapcsolatok a

fő

energiafogy asztó és

-termelő

sejtek (szövetek) között éhezésben

ANYAGCSERE

324

és veszik fel a hepatociták. A májban mind a laktát, mind az alanin glukózprekurzor. Az izomszövet ily módon jelentős energiatartalék a szervezet szempontjából, amennyiben mobilizálható fehéjetartalma a legmagasabb a szervezetben. Az izomszövet transzaminációs kapacitása nagy, a szervezetbe kerülő aminosavak egy része a vázizomban és a szívizomban bomlik le. Éhezésben az inzulin plazmakoncentrációja csökkent. Inzulin rnint anabolikum, proteolizisgátló, ezért hiányában a proteolízis glukoneogenezis prekurzorokat szabadít fel a máj számára. Az izomszövetben éhezésben proteolízissei keletkezett aminosavak részben az izomszövetben bomlanak le. Nagyobb rnennyiségben alanint, glutarnint és glicint szekretál az izom. A többi aminosavból részben piruvát és a-keto-glutarát képződik, amelyekből aztán alanin és glutamin keletkezik. A szecemálódott glutam in zöme a bélepitheliumban részben lebomlik, alanin, valamint N H/ kerül vissza a vérbe, majd jut a májba. A glutamin átalakulása a citrátkörbe n oxálacetáton, majd foszfoenolpiruváton, piruváton keresztül törté nik. A képződött piruvát transzaminálódik ala ninná.

Ketontestek felvételével csökken a vázizomban a proteolízis és igy a febérjevesztés. Az izom metabolizmusa az igénybevételtől függően jelentősen változik. Nyugalmi állapotban a vázizom a teljes 0 2-fogyasztás kb. 30%-áért felelős, aktív izornmunka esetén ez 90%-ra is emelkedhet. Az izom foszfokreatin formájában ATP-t képes "raktározni" és igen rövid ideig a foszfokreatin terhére ADP-t foszforilálni. A foszfokreatinraktár kiürülése után a fő energiaforrás a glikogén. In te nzív izommunka eselénjelentős izomfá radtság lé p fel, ami átme netileg alkalmatlanná tehe ti az izm ot a kontra kció ra. Ennek oka az intramuscularis pH c ökkenése. Egy mo lekula glukóz ké t molekul a laktáttá alakítása két H' fe lszabadulását eredmé nyezi a gliko lizis során. Intenzív izomműködés eseté n a pH 6,4-re csökkenhe t. Fe ltételezik, hogy ezen a pH-n a foszforuktokináz már ne m képes működni , így a g likolíz is átme netileg leáll. Ezt a sej t "önvédelmi" reakciójának tekintik, mi vel a foszfofruktoki náz így nem fogyaszt több ATP-t és az ATP-szint oem esik tovább.

A szívizom működése állandó, és teljesen aerob. Ezt lehetövé teszi a mitokondriumok igen magas száma. A szívizom energiatartaléka igen csekély, kevés foszfokreatin, illetve glikogén áll rendelke-

zésre. Ezért a szívizom folyamatos zsírsav-, glukóz-, illetve ketontest-, valamint 0 2-ellátást igényel. A szívizom-anyagcsere ezen sajátossága jól magyarázza az átmeneti vérellátási zavar (ischaemia) veszélyét (szívinfarctus).

Agy (központi idegrendszer) Az agy anyagcseréje rendkívül intenzív. Az agy a testtömeg kb. 2%-a, mégis nyugalomban az egész szervezet által elfogyaszton oxigén 20%-át használja el. Az oxigénfelhasználás független az agy különböző rendeltetésű igénybevételétől, alvás alatt sem csökken. Az agy tápanyag-szükségletét elsősorban glukóz felvételével fedezi. Nem rendelkezik tápanyagraktárral, nincs jelentősebb olyan glikogén-, fehérjevagy lipidraktár, ami akár csak rövid időre fedezbetné az agy táplálékszükségletét. Ezért állandó folyamatos glukózellátásra szorul. Ha a glukózellátás akár csak egy rövid idő re is kiesik (például agyi vaszkuláris történések), ez az adott agyszövet irreverzibilis károsadását okozhatja. Az agy a szervezet legnagyobb glukózfogyasztója. Nyugalomban ez kb. az egész szervezet glukózfogyasztásának 60%-át jelenti. Az agy ATP-szükségletét oxidatív foszforilációval fedezi . Az igen intenzív sejtlégzés és 0 2-fogyasztás szükséges a NaJ<.-'-ATPáz rnűködéséhez (lásd 4. fejezet). Éhezésben alternatív tápanyagként a ketontestfogyasztás emelkedik meg, ez részben kiváltja a glukózt. Hiába van az éhezésben megemelkedett FFA-szint, a zsírsavak a vér-agy barrieren nem tudnak áthaladni, a ketontestek viszont, mint vízben igenjól oldódó molekulák, eljutnak az idegsejtekhez. Ily módon a májban nemcsak a glukózszelcréció, banem a ketontesttermelés is nékülözhetetlen az agy energiaszükségletének kielégítéséhez.

Zsírszövet A zsírszövetben tárolt trigliceridek jelentik a szervezet legfontosabb energiatartalékát Egy 70 kg-os férfi három hónapig is kibirja energiabevitel nélkül (természetesen nem számítva más tényező­ ket pl. vitaminhiány, nitrogénegyensúly). A zsírszövetet alkotó adipociták metabolizmusa (glikolízis, citrátkör, oxidatív foszforiláció) igen in-

BIOTRANSZFORMÁC IÓ - MÉREGTELENÍTÉ

)>,H))}))))))),)))))) ) J l))) l) 1))))))> )))) )))) l))))))))) )))))l l)))))\))))))) ) )))> )))

tenzív. A főként a májban termelődött és VLDLben ide szállított zsírsavak az adipocirákban raktározódnak észteriftkálódás után. Az ehhez szükséges glicerin-foszfát a dihidroxi-aceton-f oszfát redukciójával keletkezik, amely a g lukózból induló glikolízis intermedierje. Ezért adipocirákban a glukóz is szükséges, trigliceridképződéshez NADPH-igényüke t a pentóz-foszfát-út fedezi. Trigliceridek folyamatosan hidrolizálódnak zsírsavakra, glicerolra és újra képződnek. A hidrolízis első lépését a hormonszenzitív lipáz katalizálja. A felszabadu ló glicerin az adipocirákban nem tud foszforilálódni , mert hiányzik a glicerin-kináz. Mind a glicerin, mind az FFA a májhoz szállitódik. A glicerin glukoneogenezis prekurzor a májban. Az elhízás (obesitas) gyakori probléma. Az elhízás okai különbözőek. Hormonális okokból történő elhízás esetén (pl. Cushing-kór) a fehérjekatabolizmus fokozódik az izmokban, az aminosavakból zsír képződik, ami az adipocitákban rakódik le. A zsírszövetben a hormonális szabályozás a horrnonszenzitív lipáz aktivitásának szabályozásán kívül is több enzim mű.ködését befolyásolja. Foszforilációs szabályozás alatt áll pl. a piruvátkináz, acetil-CoA-karbox i láz. A fő hormonális szabályozó a glukagon/inzulin arány. É hezésben a lipolízis, táplálékbevitelné l a lipogenezis dominál. Összefoglalva, különböző típusú sejtek, szervek, szövetek összehangolt, szabályozott müködésének eredményeképpen a szervezet sejtjei számára a tápanyagok fe lvételének l ehetősége biztosított. A kalorikus homeosztázis azt teszi lehetövé, hogy függetlenül a táplálékbevitel, illetve az éhezés aktuális állapotától, a vérben a szükséges tápanyagok - elsősorban a glukóz - szin~e a sejtek szükségleteinek megfeleljen. A vércukorszint ingadozása a táp lálékbeviteltől függően viszonylag kicsi (lásd 2.2. fejezet). (Patológiás körülmények között, l 5 rnM alatti vércukorszint esetén az agy nem megfelelő tápanyagellátása miatt o lyan fokú hypoglykaemiás coma alakul ki , ami glukóz adása nélkül fatális, 30-40 mM körüli vércukorszint viszont hyperglykaemiás, hyperosmolaris comát okoz.) A zsírsavak koncentrációja ugyanakkor táplálékbevitelkor alacsony (kb. O, 14 mM) tartós éhezésben azonban egy nagyságrenddel magasabb (l ,2- 1,4 mM). A kü l önböző ketontestek koncentractOJa táplálékbevitelkor szintén alacsony (0,03- 0,4 mM), éhezésben viszont akár két nagy-

325

ságrenddel is magasabb (l ,3- 6,0 mM). A vércukorszint állandóságát és az alternatív tápanyagforszabályozását az koncentrációjának rások inzulin/glukagon arány változása biztosítja, amely kb. egy nagyságrenddel alacsonyabb éhezésben, mint táplálékbevitel esetén (0,50-0,05).

Az anyagcsere integrációja patológiás állapotokban Számos olyan anyagcserezavar alakulhat ki, amelyben a metabolizmus integrációja felborul és a folyamatok egyensúlya megváltozik. Az inzulinfüggő diabetes mellitus az anyagcsere szabályozásának súlyos zavara, amelyet a katabolizmus túlsúlyajellemez. Az egyik legfontosabb szabályozó hormon az inzulin hatása nem érvényesül ezért magas vércukorszint esetén a m áj éhező májként viselkedik: glukoneogenezis és ketogenezis dominál. Ismert az inzulin glukokinázt indukáló hatása, így inzulin hiányában a máj nem képes a vércukorszintet csökkenteni (extra glukózfelvétel, glikogenezis, lipogenezis), sőt növeli azt. Inzulin hiányában a periféfiás sej tek - elsősorban az izom- és zsírszövet - glukózfelvétele csökken (lásd GLUT-4; 2.2. fejezet), ami szintén emeli a vércukorszintet. Az inzulin, mint anabolikus hormon kiesése izomban proteolizist, zsírszövetben lipolízist eredményez. A proteolízis fokozza a máj glukogén aminosavellátását , s így a glukoneogenezist. A zsírsav-kencentrá ció a vérben nő, a ketontesttermelés fokozódik. A ketontest-túlterme lés ketoacidosist okoz. A zsírsavtúlkínálat miatt a zsírsavak észteriflkálódnak és fokozódik a májban a VLDLszintézis és -szekréció. Hypertriglycerida emia alakul ki, mert a lipoprotein-lipáz működése az emelkedett VLDL-szintet nem képes csökkenteni illetve a kiJomikron katabolizmus ugyan' ezen okok miatt bekövetkező zavara miatt hyperchilomicron aemia jön létre. Az inzulindependens diabetes oka az inzulinszintézis és -szekréció súlyos zavara a pancreas P-sejtjeiben. A betegség k itinikai képe inzulin adásávaljelentősen javul, mert az inzulin csökkenti a

·,

vércukorszintet a glukózfelvétel fokozásával, a glukoneogenezis és proteolízis, gátlásával. A lipolízis gátlása a ketoacidosist szünteti meg. Reye-sziodrómábao, amely v írusfertőzése­ ket követő súlyos gyermekbetegség, a máj integráló funkciój ának teljes zavara alakul ki. A hepatociták mitokondriumaina k müködése felborul: a zsírsav-oxidáció elégtelenül müködik, nem termelődik karbamil-foszfát és omitin, valamint oxál-acetát. Feltételezik a karbamilfoszfát-szintetáz I, a piruvát-dehidrogenáz, a piruvát-karboxiláz és az adenin nukleotid transzporter hiányos működését. A fentiek következtében többek között emelkedett FFAszint (zsírsav-oxidáció zavara), hypoglykaemia (glukoneogenezis zavara), hyperammonaemia (ureaszintézis zavara) alakul ki. Ez idegrendszeri tünetekkel is jár, agyi funkcióká-

rosodások, oedema, coma következményekkel. Számos májbetegségben súlyos anyagcserezavar jöhet létre. M ivel csak a máj képes ureatennelésre, az aminosavmetabohzrnus zavara alakul ki. Krónikus májbetegségekben , például cirrhosisban (a máj kötőszövetes átépülése, parenchymakárosodás) a májkárosodás a portalis keringés zavarával is társul, mindez hyperamrnonaerniát okoz. Az ammón ia központi idegrendszeri hatásai miatt cornatosus állapot jöhet létre. Az akut májkárosodásoknak is jellemző tünete a hyperammonaemia. A májkárosodások másik jellemző tünete a bilirubinkonjugác ió zavara, s az ennek következtében fellépő hyperbilirubinaemia, ami szintén súlyos idegrendszeri károsodásokhoz vezethet.

endoplazmatikus retikulum

NAD

mitokondrium

2-268. ábra. Az etanol metabolizmusa

peroxiszóma

BIOTRA NSZFORMÁCIÓ - 1ÉREGT EL ENÍTÉS

Az alkoholizmusban kialaku ló májkár osodás szintén a májme taboliz mus zavará ra vezethető vissza. Az etanolb evitel egyebe k mellett jelentős és nem regulái t energia bevitel is (az etanol energia tartalm a 7,1 kcal/g (27 kJ/g). Az etanol acetald ehiddé , majd acetátt á oxidáló dik, és eközbe n NADH keletke zik. Az intenzi v NADH-képződés megvá ltoztatj a a NAD+/ NADH arányt. Ez elsősorban a zsirsav oxidációt csökkenti, amely hosszú távon a triglice ridek felhalm ozódás át idézi elő a hepato citákban, s zsírmáj alakul ki. A glukon eogenezis gátlása éhezési hypogl ykaem iát okoz, valamint a laktátk oncent ráció emelke dését. Ez acidosist eredmé nyezhe t. A magas NADH szint gátolja a citrátkö rt, ugyana kkor az acetilCoA-koncentráció magas. Az acetald ehidkoncentráció emelke dése addukt képződéshez (lásd 2.6 fejezet ) vezet, amely tovább i májkárosodások kiindul ópontja lehet. Az etanolm etaboli zmus másik útja a kevert funkciójú oxigen áz CYP2E l izoenzi m (lásd

Ajánlott irodalom az " Anyagc sere"

című

2.6. fejezet ) által kataliz ált reakció (2-268. ábra). Ez szintén acetald ehidet, majd acetátot eredmé nyez, azonba n ez NADP H-t fogyasztó reakció. Az endopl azmati kus retikulu m rnembr án kötött CYP2E l izoenzi m KM értéke etanolra egy nagysá grendd el magasa bb (8- 12 mM), rnint az alkoho l-dehid rogená zé (0,2- 2 mM). Ez a reakció út elsősorban fokozo tt alkoholfogy asztás esetén, alkoho lizmus ban jelentős, az etanol ezúton befolyá solhatj a gyógys zerek metabolizrnusát, adverz gyógyszerhat ásokat, karcino gének aktivál ását, más toxikus hatások at okozha t. A különböző könyvekben MEOS (micro somal ethano l oxidizi ng system = mikros zómáli s etanol oxidáló rendszer) néven is szereplő rendsz er induká lható különböző módok on és anyagokkaL Így indukálódik éhezés ben, diabete s mellitu sban, hyperacet onaem iás állapot okban is. A fentiek en kívül az etanol a kataláz enzimnek is szubsz trátja.

fejezethez

Biochemistry, Ed. L. Stryer, W . H. Freeman and Company, New York, N. Y. USA, 1995. Textbook of Biochem istry, wi th Clinical Correlat ions, Ed. T . M. Devlin, Wiley-L iss Publication, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, S ingapore, 1992. Biochemistry, A case-ori ented approach , Eds. R. Montgomery, T. W. Conway , A. A. Spector, The C. Y. Mosby Compan y, St. Lous, Baltimo re, Philadelphia, Toronto , 1990. The metabolic basis of inherited disease (Vol. I-11.) Ed . C. R. Scriver, A. L. Beaudet, W. S. Sly, D. Vale, McGraw-Hill Informat ion Service Compan y, 1995.

A genetikai információ tárolása és kifejeződése

3. FEJEZE T

3.1. DNS: replikáció és hibajavít ás (repair) (Faragó Anna) A DNS szerkezete A DNS repllkációja prokariótákban Az eukarióta kromoszóma szerveződése Az eukarióta sejtben történő replikáció néhány jellegzetessége A sejtciklus szabályozása és a tumorszuppresszor gének által kódolt fehérjék szerepe a sejtciklus szabályozásában Az extranukleáris DNS A DNS károsodásainak javítása: repair mechaniz musok Mutációk Rekombináció 3.2. RNS: transzkr ipció és a transzkr ipció szabályo zása (Faragó Anna) Az RNS típusai A transzkripciós egység és a transzkripció menete prokariótákban A transzkripció szabályozása prokariótákban A polipeptidláncokat kódoló gének transzkripciója eukariótá kban és az elsődleges transzkriptum érése Eukarióta transzkripciós faktorok A riboszóma-RNS és tRNS transzkripciója eukariótá kban 3.3. A vírusgenom replikáci ója és az onkogén ek (Faragó Anna) A vírusgenom A bakteriofágok replikációjának litikus és lizogén útja Állati vírusok replikációja Onkogéneket hordozó retrovírusok és a celluláris protoonkogének 3.4. Fehérjeszintézis: a transzlác ió mechani zmusa és a polipepti dlánc további sorsa (Faragó Anna) A kódszótár A transzlációs apparátus komponensei A polipeptidlánc szintézisének mechanizmusa A fehérjék sejtorganellumokba irányítása és a transzláció utáni módosulások Fehérjeszintézis a mitokondriumokban 3.5. A laborató riumi géntechn ika (rekomb ináns DNS-technológia) módszerei (Faragó Anna) Restrikciós endonukleázok és restrikciós térképek A DNS bázisszekvenciájának meghatározása

... ... ... .. l

----------------~~~==~~1

Rekombináns DNS és klónozás, a génkönyvtár fogalma Nukleinsavak bázisszekvenciájának azonosirására szolgáló módszerek Kromoszómaséta A cDNS és a cDNS-könyvtár Expressziós vektorok és fúziós fehérjék Eukarióta vektorok és expressziós rendszerek "Riporter gének" Irányított in vitro mutagenezis Polimeráz láncreakció (PCR) "Antiszenz" nukleinsavak Transzgénikus állatok A DNS-chip

DNS: replikáció és hibajavítás (repair)

.1 •

Faragó Anna

A DNS szerkezete A biológiai információt az egyik generációtól a másikra örökítő DNS szerkezete lehetövé teszi az információ majdnem tökéletesen stabit formában történő tárolását, pontos megkettözödé sét és átadását. A DNS kémiai szerkezete ugyanakkor magában rejti az evolúcióban fontos szerkezetválto zás lehetöségét is. Az információ nemcsak a fehérjék szerkczetére vonatkozik, hanem módot nyújt azok szintézi ének mennyiségi és időbeli szabályozására is, így végső soron a sejtek csaknem valamennyi funkciója a DNS ell enőrzése alatt áll. A fehérjék szerkezetére vonatkozó információ hárombetűs genetikai kód formájában tárolódik és adódik át. A prokariórák és eukarióták genetikai infotmációját hordozó anyag (genom) a DNS, vírusokban a genom lehet DNS vagy RNS. Az információára mlás iránya kevés kivételtől eltekintve: DNS

~

RNS ~ fehérje

(A kivételckrc, amikor RNS-ről DNS felé áramlik az információ később részletesen kitérünk).

A nukleinsavak nukleotid egységekbő l álló polimérek. A polírnérek építőelemei RNS esetén adenin, guanin, citozin- vagy uracitbázist tartalmazó ribonukleotid ok, DNS esetén dezoxi-ribonu kleotidok amelyek urac it helyett timinbázist tartalmaznak. A polimerek váza a nukleotidek foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolódó ribóz (RNS) vagy dezoxi-ribóz (DNS) részeiből

áll, a fo zfodiészterkötés az egyik nukleotid cukorkomponensén ek 3 ' OH-csoportja és a következő nukleotid cukorkompon ensének 5'0H-ja között található. A szerkezet változó része az egymást követő nukleotidek bázisainak a sorrendje, ez a bázissorrend hordozza az információt. A polinukLeotid-lánc nem szimmetrikus szerkezet, végei különböznek egymástól. A lánc egyik végét képező nukleotid cukorkom ponensének 5 'OH-ja többnyire foszfáttal észteresitett fonnában van, ez az ún . 5' -vége a polinukleotid nak, míg a másik végét alkotó nukleotid cukorkompon ensének 3 ' OH-ja többnyire szabad, ez a 3' -vége a molekulának. Általánosan elfogadott konvenció alapj án a polinukleotid-lán c irányuJtságát úgy tűntetik fel, hogy a polinukleotidok bázisainak sorrendjét az 5' -végtől a 3'-vég felé írják fel {3-1. ábra). Neutrális pH-n, v iszonylag maga sókoncentráció mellett az egyedüláll ó polinukleotid-lánc fl ex ibilis heliká lis szerkezetet a lkot. A DNS azonban kevés kivételtől eltekintve nem egy zálú láncként fordul el ő, hanem két e llentétes irányuJtságú (antiparallel) pol inukleotid-lán cból á lló kettős helix. A két lánc egy (képzeletbeli) közös tengely körü l van feltekeredve, a tekeredés a leggyakrabban előforduló szerkezet, az ún. B forma esetében jobbmenetes. (A B forma tekinthető a fiziológiás DNS-szerkeze tnek.) A foszfát-egysé gekkel összekötött dezoxi-ribóz-egységekből álló váz a kettős spirál külső részén, míg a purin- (adenin, guanin) és pirimidin- (timin, citozin) bázisok belül találhatók. A bázisok síkja merő l eges a spirál tengelyére, a cukoregysége k síkja majdnem derékszöget zár be

332

GENETIKA I INFO RMÁCIÓ TÁ ROLÁSA ÉS KJFEJEZŐDÉSE

>>»>»•»»»>>»>»»»>>>•n>»u>»H»»>»>>»> ..>»>»>>»»•»»»>H>>»»»»»>

5' vég

o -o -

l

N~ ~

5'

P - O- CH

ll

o

2

4'

•. )

O O

-O -

citczin

N

H

l 5' P -O-CH ll 2

o

> NH~N~N o

H~ N

o

l

H HN

guanin

2

o

s·

-O -

P - O- CH

ll

2

o O

H 5'

l

o

-O-P -O-CH2

ll

o OH

H 3' vég

c

A

3'

5'

J-1 . ábra. A DNS

elsődleges

szerkezete

T

3' p

p

G

p

5'

OH

5'

5'

ACGT

ON : REPLIKÁ C IÓ ÉS HIBAJAV ÍTÁ

E

c:

-.:t_ ("')

10 pár B DNS

ZDNS

ADNS

l

B DNS

_l

3-2. ábra. A kettős hélix modellje

a bázisok síkjávaL A kettős spirá l átmérője 2,0 nm, az egymá t követő bázisok távolság a a tengely mentén 0,34 nm és (átlagos an) 36°-kal vannak elfordulva egymás hoz képest. A helikális szerkeze tben egy teljes fordulat l O nukleoti degység et igényel, a heliká lis szerkez et mindké t láncon (a tengely rnentén) 3,4 nm-nyi távolság onként ismétlődik

(3-2. ábra).

A két láncot egymás hoz a komple menter bázispár ok (adenin- timin, illetve guanin- citozin) között kialakul ó hidrogén hidak rögz ítik. Az egymást kiegész ítő bázispár ok szigorú specific itása (komple mentari tása) az informá ció stabilitásának, illetve továbba dhatósá gának lényege . A komplementarit ás oka, hogy csak az egymás sal szembe n beilleszkedő adenin és tim in , illetve guanin és citczin megfel el ő csoportj ai kerülnek abba a helyzetbe, hogy egymás sal hidrogé nhidaka t tudjanak alkotn i. A DNS-be n az egyébké nt szabad állapotban enol-ox o tautomé riát mutató báz isok oxoformában fordulna k elő . Az enol-ox o tautomé ria egyensú lyának az oxoforrn a fel é történő eltolódá sa a DNS szerkeze ti stabilitá sának egyik alapja, a bázisok nagyon ritkán, de mégis előforduló enolfor-

mája l ehetőséget nyújt az evolúció ban fontos spontán szerkezetváltozá sra. Az oxocsop ortok ugyanis H-akcep torként, míg a bázisok NHrod alláncai hidrogé ndonork ént szerepe lnek. Ezen túl, a timin pirimidingyűrűjének N3-ja és a guanin purinvá zának N l -atomja hidrogé ndonork ént (ezek eredetileg NH-cso portok), míg az adenin purinvá zának Nl-atom ja és a citczin pirimidi n gyűrűjének N3atomja hidrogé nakce ptorkén t viselked ik. A timin- adenin báz ispárt kettő, míg a guanin- citczin bázispárt három hidrogénhíd rögzíti egymás hoz. Az egymás sal szemben levő nukleotidek glikezidos kötései közötti távol ág szigorúan meghatá rozott (1 ,085 mn), csak egy purin- és egy pirimidi ngyűrű tud egymás sal szemben e lhe lyezked ni (3-3.

ábra). Az egymás mellett elhe lyezkedő komplem enter báz ispárok közti hidrogé nhidak egymás t stabilizálják. A natív DNS szerkezetét melegítéssel denaturálni lehet. A hőmérsékl et emelése megbon tja a hidrogé nhidaka t és a DNS báz isösszetételére jellemző h őmérsékleten a két lánc elválik egymás tól. (Azt a hőmérsé kletet, ahol a bázispár ok közötti hidrogé nhidak 50%-a megbom lik a DNS "olva-

334

G ENETIKA I INFORMÁC IÓ TÁROLÁSA ÉS KI FEJ EZŐDÉSE

a

c

A

3'

3'

T

G 3'

szekvencia

3'

p

5' vég

5'

5'

pApCpGpT

5' 5

OH

. ACGT

3

,

o

l

C

N

N~ó '5c........--7"

~~

II

HC ~3)c........__

guanin

H ' N/

~~

e CH 9/

H2N

l~

c

_.......... CH3 C

N~4 ' CH

citozin

)

~c-. . . . . 1 /c

o 3'

5'

b

1: ) JS

~c .........._ 1/ CH

~

o

~

l

c, 4

eCH

NH2

ll

N

tim in

II

N

o /

ll

C N ó' 5c ........--7"

/c~3)c........__ 9 /

~

N

H ,

váz

5'

NH2

adenin

3' vég

OH

5' nagy árok

,,, .. ------l

-....,,

10,85Á 1,08 nm

l

'~< l ---------- >,'l , kis árok 3·3. ábra. A DNS komplementer láncait összetartó hídrogénhidak. Az (a) ábrán a bázisok hidrogéndonor, illetve hidrogénakceptor csoportjait tüntettük fel, a (b) ábrán az antiparallel láncok közti kapcsolat planáris modellje látható

ON :REPLIKÁCIÓ ÉS HIBAJAVÍTÁ

dáspontjának" nevezik.) A komplementer bázisszekvenciákat tartalmazó nukleotidláncok egymás iránti affinitása azonban olyan nagy, hogy az elválasztott láncok megfelelő körülmények között ismét egymásra találnak és pontosan illeszkednek egymáshoz. A komplementaritás ugyanilyen vonzerőt jelent akkor is, ha nem két DNS-lánc, hanem DNS-RNS vagy RNS-RNS láncok talá lkoznak. Ez a jelenség az alapja a hibridizáció leh etőségének. Komplementaritás szempontjából az RNS-ben található uracilbázis ugyanúgy viselkedik, mint a D S-ben található timin. Vizes oldatban és in vivo túlnyomórészt a DNS kettős helix fentebb jellemzett B formája fordul elő. Ebben a formában a kettős helix külső részét képező dezoxi-ribóz-foszf át-váz csavarulatai között két, ugyancsak helikál is árok helyezkedik el, az egyik szélesebb {nagy árok), mint a másik {kis árok, 3-2. ábra). Ez abból adódik, hogy a g likozidos kötések a párokat alkotó bázisok és a hozzájuk tartozó cukoregységek között nem pontosan egymással szemben helyezkednek el, az egyik o ldalon 180° -nál nagyobb, a másik oldalon 180° -nál kisebb szöget zárnak be egymással. Azon az oldalon, ahol a bezárt szög nagyobb, található a nagy árok, a másik oldalon a kis árok. A DNS-hez közvetlenül kapcsolódni képes fehérjék egy jel entős része bizonyos meghatározott bázisszekvenciájú részeket ismer fel a DNS-en. Ezek a fehérjék fő­ ként a nagy árokban tudnak kapcsolatot kialakítani a kettős heli x belső részét a lkotó bázisok megfelelő csoportjaival. A környezet alacsony sókoncentrációja és nedvességtartalma mellett a DNS B-formája átalakulhat A-formává, ebben a formában nem l O, hanem ll nukleotid a lkot egy csavaru latot, és a helix megrövidül. A C-forma nagyon hasonlít az B-hez, egy csavarulatot 9 bázis a lkot. A Z (vagy "zig-zag") DNS nevét onnan kapta, hogy benne a polinukleotid-vázat alkotó szerkezet cikk-cakkokat alkot. A Z-formában a helix balmenetes, a DNS sokkal hosszabb és vékonyabb mint a B-formában, 12 bázi pár hoz létre egy teljes csavarutatot és csak egy árok található rajta. A nagy árok rnintegy kipúposodik és konvex szerkezetet alkot. A Z-forma kialaku lásának kedvez, ha purin és pirimidin nukleotidek egymást vá ltva fordulnak elő a DNS egy rövidebb szakaszán, a Z-forma általában egy-két tucat nukleotidot érintő szakaszon találha-

tó. Azt feltételezik, hogy a DNS-szabályozásért felelős régióiban van szerepe a Z-formának. Z-formát stabilizáló tényező a guanin- és citczinbázisok posztszintetikus metileződése. A kettős szálú DNS hajlékony szerkezet, e l őfor­ dulhat cirkuláris vagy lineáris formában. A mag nélküli, {prokarióta) sejtek DNS-e cirkuláris, a sejtmaggal rendelkező (eukarióta) sejtek nukleáris DNS-e lineáris molekula. A zárt, cirkuláris DNS (illetve az a DNS-szakasz amelynek végei valamilyen módon rögzítve vannak), topológiai izoméreket képez. A topológiai izomérek úgy jöhetnek létre, hogy a zárt kettősgyűrű a térben a saját tengelye körül feltekeredik, szupertekercsek (szuperhelix) keletkeznek. (Nyitott végükön nem rögzített molekulák spontánul újra kitekeredhetnek, a zárt kettősgyűrű vagy a láncok mindkét végének rögzítése esetében azonban erre nincs l ehetőség. A zártság mindkét láncra vonatkozik, ha az egyik láncon törés van, a molekula kitekeredhet.) Azokat a molekulákat, amelyeken ilyen szupertekercs nem található relaxált DNS-nek nevezik. A szupertekercsel ődés lehet azonos irányú a kettős spirál csavarulataival, ilyenkor pozitív szupertekercsről beszélünk vagy ezzel ellentétes irányú, ez a negatív szupertekercs. A pozitív szupertekercsben kialakuló feszü lések a helikális szerkezetet

relaxált

negatív

pozitív

szupertekercs

szu pertekercs

3-4. ábra. A DNS topoizomérjei

336

>>»•>»)>»>»>»»>»»)>»»»»»»>»»»>»>n»»»» »»»»>»»>>»»>H»>»»>)

még zártabbá, tömörebbé teszik, míg a negatív szupertekercs lazítja, kitekeri a két láncot egymásból. Topológiai izoméreknek nevezik azokat a DNSmolekulákat, amelyek csak aszupertekercs szerkezetében, mértékében vagy hiányában különböznek egymástól (3-4. ábra). A negatív szupertekcrcs kialakulása fontos azokban a D S-t érintő fol yamatokban, amikor a két szál időleges kitekeredése szükséges. A tekercselés! végző, illetve azt feloldó enzimek a DNS-topoizomerázok. A topoizimerázok mőkö­ désük közben a kettős láncú DNS egyik száJát (1. típusú topoizomerázok) vagy mindkét láncát (TI. típusú topoi zomcrázok) idől egcsen clhasítják, majd a molekula megfel e lő átalakulása után a láncot ismét egyesítik. A topoi zomeráz I a DNS relaxációját katalizálja, a topoizomeráz U negatív szupertekercsct vezet a DNS-be. A negatív szupertekercs kialakítása energiaigényes folyamat, az energiát ATP hidrolízise biztosítja. D S-giráznak nevezik azt a ll. típusú bakteriális topoizomeráz!, amely az ATP hidrolíziséből származó energia terhére a baktériumok zárt gyűrű alakú kettős helixébc negatív szupertekercseket vezet, és el ősegíti a DNS replikációját

A DNS replikációja prokariótákban Minthogy a DNS két lánca egymással komplementer bázisszekvenciával rendelkezik, a replikáció szempontjábó l mindkettő tartalmazza ugyanazt az információt. A DNS replikációj ának lényege, hogy a kettős spirál két lánca egymástól szétválik és külön-külön mindkettőrő l , mint mintáró l (template) megszintetizálódik egy komplementer bázisszekvenciájú, antiparallel lefutású új lánc, tehát az eredeti kettős Láncú DNS-sei teljesen azonos két új molekula keletkezik. A két új DNS-molekula egyik-egyik lánca a mintául szolgáló és teljes egészében megő rzött szül ői lánc és csak a másik szál szintetizálódik újonnan, mindig egy-egy nukleotidegységgel hosszabbodva. Ezért a replikációt szemikonzervatívnak nevezik. Az elkülönült sejtmaggal nem rendelkező prokarióták lényegesen egyszerűbb sejtek, mint az eukarióták. A molekuláris biológia fejlődésének e l ső fázisában prokariótákon nyert adatok szolgáltak ismereteink alapjául, amelyeket csak később egészítettek ki az eukarióták bonyolultabb viszonya it tükröző eredmények. A replikáció alapvető problémáinak megértéséhez a prokariótákban törté n ő DNS-szintézis jó madelit nyújt.

GEN ET l KAl INFORMÁCIÓ TÁROLÁSA É Kl FEJ EZÖDÉSE

Amintául szolgáló DNS-lánccal komplementer, új DNS-lánc szintézisét a DNS-polimeráz enzimek (DNS-dependens DNS-polimerázok) végzik. A bakteriális polimerázok közül a DNS-polimeráz lll-nak nevezett enzim felelős a replikációért, míg az el sőként megismert DNS-polimeráz l enzim a DNS sérüléseinek helyreállításában (repair) játszik szerepet elsősorban, bár a replikáció egyik segédenzimeként is müködik. A DNS-polimeráz l enzim háromféle katalitikus aktivitással rendelkezik. Szintetikus aktivitásán kívül van ezzellátszólag ellentétes, polinukleotidokat hidrolitikusan hasító nukleáz aktivitása is, ez utóbbiból kétféle aszerint ' ' hogy a DNS lánc 5 '- vagy 3 ' -végéről hasít le nukleotidot (korrekciós 3' -5 '-exonuklcáz és hibajavító 5 '-3 '-exonukleáz aktivitás). Egyetlen polipeptidláncból áll, mindháromféle katalitikus aktivitásáért ugyanaz a polipeptidlánc felelős. (A polipeptidlánc megfe le l ő helyen történő hasításával, mesterségesen olyan fragmentumhoz lehet jutni, amely az 5' ~3' irányú exonukleáz aktivitást elvesztette, csak a másik két aktivitását tartotta meg. Ezt a laboratóriumi géntechnikában gyakran használt DNS-polimeráz I fragmentumot nevezik Klenow-fragmentnek). A DNS-polimeráz III kétféle katalitikus aktivitással rendelkezik, szintetikus és 3' -5 ' -exonukleáz aktivitással, 5' ~3' irányban nem hasít le nukleotidot. A replikációkor folyó DNS-szintézisért felelős DNS-polimeráz Ilf több, részben azonos, részben különböző alegységből álló aszimmetrikus molekula (4-4 alegység azonos, a többi kü lönbözik). A nukleinsavak szintézise mindig az 5'-végüktől a 3' -végük irányában történik. A szintetikus reakció mind a 4 különböző dezoxi-ribonukleozid5'-trifoszfát (dNTP-ok, azaz dATP, dGTP, dTTP, dCTP), továbbá magnéziumionok és a mintául szolgáló (template) DNS egyidejű jelenlétében megy végbe, mindez azonban nem elégséges a DNS-polimeráz szintetikus aktivitásához. A DNSpolimerázok nem képesek rnegsziotetizálni egy nukleotidlánc e lső néhány nukleotidegysége közti foszfodiészterkötéseket, hanem indító láncot (primer) igényelnek. Az indító lánc lehet a mintául szolgáló DNS-sei komplementer DNS- vagy RNS-lánc, amelynek utolsó nukleotidja szabad 3 'OH-val rendelkezik. Ehhez kapcsolódik a szintézis során az el ső dezoxi-ribonukleotid 5 ' OHcsoportját észteres ítő foszfát, pirofoszfát lehasadá-

DN : REPLI KÁCIÓ É HIBAJ AVÍTÁS

3-5. ábra. A DNS-polimeráz l. aktivitásaL (a) Szintetikus aktivitás és (b) nukleáz aktivitások. A 3'-5'-exonuk/eáz aktivitás az utolsóként beépülő nem komplementer nukleotidot hasítja le ( a szintetikus aktivitás során elkövetett esetleges hiba ko"ekcióját szolgálja). Az 5'-3'-exonukleáz aktivitás komplementer, de valamilyen okból mégis eltávolításra szoruló DNS-szakaszon mOködik és a kihasitott szakaszt a szintetikus aktivitás azonnal pótolja (például az RNSindító darabok eltávolítása során)

>> ,, ~> >> >> >>·~»»»))H>> n))»>>>>»>>>)>>>>>>»))>>»>>>~>>H,.>>>>))>>>>»»>>>>• >> >>>> )))))))} >>>> '>»>>n»>>>>>>>>»>>•)»

a

3'

337

tempiát

~

~

~

~

5'

OH

primer

PP-P

OH

tempiát

3' ~

~

~

~

p

primer

b

5'

3'

5'

3'

G G

c

G

c

G

·G

c

G

G

c

G

G G G

3

• OH

G 3'

5'

G 3'-5'-exonukleáz

5'-3'-nukleáz 5'

5'

338

mnmi»»H>m>»»»>»>»>»»>»>»>>>»>>l>»»»»»l»»»»»»>»>>>>»l»»>

sa me llett. Ezután egyenként csatlakoznak a következő nukleotidegységek a komplementer mintának megfelelő módon. DNS(n nuklcoud cgys6g) + dNTP ~ D NS(n+lnukleoud cg)"\~g) + PP,

A mintául szolgáló DNS-szál és a képződő új szál antipara llel lefutású, tehát amíg a szintézis 5'-t3' irányú, a minta olvasása a komple menter láncon 3' -t5 ' irányban halad. A DNS replikációjának nagyon ponto nak kell lennie, a má olá közben bekövetkező esetlege hibákat ki kell javítani, a nem komplementer háziok beépülé ét meg kell akadá lyozni. Baktériumokban ezt maga a DNS-polimeráz végzi e l, "korrekció "3'-t5' exonukleáz aktivitása segítségéve!, amely az esetleg beépülő nem komplementer nukleotidot hasítja le. A szintézis során beépített utolsó nukleotid bázisa és a minta komplementer bázisa között kialakuló hidrogénh idakat érzékelni képes a prokarióta DNS-polimeráz, a zintézist csak akkor fol ytatja, ha a hidak kialakultak. Ha a hidrogénhidak nem alakulnak ki, ez azt

OH

p

p

OH

G EN ETJKAI INFORJ\IÁC IÓ TÁ ROLÁSA ÉS Kl FEJEZŐDÉS E

j e lenti, hogy az utolsóként csatlakoztatott nukleotid hibás, bázisa nem komplementer a minta megfelelő bázisávaL Ilyenkor a polimeráz az utolsóként létrehozott foszfodiészterkötést hidrolitikusan e lhasítja, ezen a módon a hibás .nukleotidot eltávolítja és csak ezután fo lytatja a szintézist ugyanazon a helyen. A prokarióta DNS-po limeráz l hibajavító 5'-t3' irányú nukleáz aktivitása viszont komplernenter kettős szálú régiókban képe hasításra, a DNS egyidejű szintézise közben. A DNS-replikác ió bonyolult fo lyamatában (mint ez később látható lesz) erre az aktivitásra is szükség van (3-5. ábra). A DNS-polimerázok nukleotidokat csak úgy tudnak összekötn i, hogy egy szabad nukleozid 5' -trifoszfát a- helyzetű foszfátját kötik hozzá a polinukleotid láncvégi 3 'O H-jához, az a - és P-foszfátok közti pirofoszfátkötés hidro lízise és a (p,y-helyzetű) pirofoszfát lehasadása közben. Nem képesek azonban összekötni a 3'0H-véggel egy o lyan nukleotid 5 ' -foszfátját, ame ly nukleotid már egy DNS-lánc első tagja (azaz 5' -vége). Ezt a reakciót, amely csupán egyetlen foszfodiészterkötés kialakulását j elenti , viszont ezzel ké t DNS-láncot kapcsol össze (vagy egyet kör alakúvá tesz) a DNS-Hgáz nevü enzim végzi (3-6. ábra). A reakció energiaigényes, prokariótákban NAD+ hidrolízisének a terhére megy végbe. A DNS-ligáz tevékenységére nemcsak a replikációban, hanem a " repair" és a rekombinác ió mechanizmusában is szükség van, a rekombináns géntechnikában igen gyakran használt enzim. (A kettős szálú DNS egyik láncán el őfordul ó egyetlen faszfediészterkötés hiányát, amelyet a DNS-Iigáz szüntet meg, " ni ck"-nek nevezik.) A prokarióta genom zát1, cirkuláris DNS-molekula, a melyen a replikáció startpontja pontosan meghatározott he lyen van. A cirkuláris prokarióta D S kapcsolatban van a plazmamembrán bel ső oldaláva l. Bár a prokarióta D S-t szabad D S-nek tartják, újabban találtak olyan fehérjéket prokariótákban is, amelyek az eukarióták hisztonjaira emlé keztetnek.

p .. nick" (bemetszés)

3-6. ábra. A DNS-Iigáz aktivitását igénylő bemetszés

A replikáció a cirkuláris DNS-en a startponttól kiindulva halad e lőre a kör mentén mindkét irányban és végződ ik a kör stat1pontta l szemben levő részén (3-7. ábra). A replikáció e l őreha l adásakor a szü lői kettős szálú DNS fo lyamatosan felnyílik A replikációs villa a felnyí lás helyén kialakuló Y

r DN :REPLIKÁCIÓ É HIBAJAVÍTÁ

)))) >)))))))

·~,)))))H)),))) )))U) H>))))))))))) )U)» ln)))))))))))>>)) U

~..-.-,....,...,.-,.

+ 5. 3'

szál (lagging strand) j

késlekedő

vezető

szál (leading strand)

3·7. ábra. A cirkuláris prokarióta DNS replikációja és a replikációs villa

alakú képzödmény, ame lynek e lágazódó szárait a már mcgszintetizá lódott két új DNS kettős lánc alkotja, középsö szárát pedig a még érintetlen szülöi DNS. A köralakú DNS két irányba induló replikációjakor mindig két replikációs villa halad előre, egy az óramutató járásával megegyező, egy pedig azzal ellentétes irányban (miközben a még érintetlen szülöi DNS hossza egyre csökken). Ha bármelyik replikációs vi lla előreha ladását külön vizsgáljuk, nyilvánvaló, hogy a két új DNSszál szintézise nem történhet teljesen azonos módon. A replikáció startpontját a mintául szolgáló szülöi DNS egyi k láncának 5'-vége a másiknak 3'-vége szolgáltatja. A DNS-polimer áz, amely az új DNS-t 5'~3 ' irányban épiti fel, a komplementermintátcsak 3 '--+5' irányban tudja leolvasni. Folyamatos szintézis, ame lynek iránya megegyezik a replikációs vil la előreha l adásának irányával, csak arról a zülöi láncról mint mintáról történhet. amelynek a startpontban 3 ' -vége van. Az errő l a mintáról fo lyamatosan szintetizálódó új láncot ve-

339

láncnak nevezik (leading strand). A startpontban 5'-véggel rende lkező szülöi láncról azonban nem szintetizálódh at DNS ugyanebben az irányban, erről a mintáról a szintézis vi szafelé, a startpont irányába n foly ik megszakításo kkal, rövid (l 000- 1500 nukleotidnyi) DNS-darabok keletkezése közben. A darabokban szintetizálódó DNSláncot késlekedő láncnak nevez ik (lagging s trand). A DNS-polimeráz nem képes elindítani a lánc szintézi ét, indító láncot (primer) igényel, ame lynek szabad 3 ' OH-csoportja van. Az indítólánc 4-10 nukleotidhoss zuságú, a mintával komplementer RNS-lánc, amelyet egy primáznak nevezett RNS-polimeráz szintetizál. (Az RNS-polimerázoknak nincs szükségük indítóra.) A vezető lánc szintéziséhez elég egyetlen indító a startpontnál, míg a késlekedő lánc minden darabjának szintéz ise egy indító RNS-lánc szintézisévcl kezdőd ik. Ilyen módon a kés l ekedő lánc szintézisckor átmenetileg néhány tagú RNS-lánchoz kapcsolódó 1000- 1500 nukleotidnyi DNS-darabok {Okazakifragmentumo k) jönnek létre. A replikációhoz az eddig említetteken kívül még más fehérjék is szükségesek. Az Escherichia coli baktériumban (ez a leggyakrabba n vizsgált prokariótamode ll) a replikáció startpontján (origo) levő meghatározott bázisszekvenc iájú DNS-szakaszhoz (oriC) több molckula dnaA-nak nevezett fehérje kötödik. A dnaA fehérje kötödé éhez negatív szupertekercs szükséges. A dnaA indítja cl a replikációhoz szükséges fehérjék együttese á lta l a lkotott szerkezet (repliszóma) kialaku lását, és elősegí ti a kettős helix kinyílását (a DNS lokális "olvadását") egy néhány száz nukleotidot érintő szakaszon, amelyen egy " iniciációs buborék" képződik. A komplexhez dnaC fehérje segítségével dnaB fehérje kötödik, ez utóbbinak a két láncot széttekerö, helikáz aktivitása van (3-8. ábra). A repliszóma maga e l őtt szarosabbá teszi a "DNS-fonato t", az á llapot hasonlít a pozitív szupertekercshez. Ezért szükséges a DNS széttcke redését megkönnyítő negatív szupertckercs ck bevezetése a DNS-be. A replikációt a DNS-giráz (ll. típusú topoizomeráz ) segíti, amely ATP energiájának terhére negatív szupertekercs ek kialakulását katalizálja. Az iniciációs buborékban a széttekeredett szülöi DNS kétszálát egyszálú formában stabilizá lni kell, ezt az egyes láncú

zető

START

H)') n)))))))>>))))))))))))))))}) ))))}))»)>)))))>))))))

340

»»»•»>>>m>>>>H»»H»>•>>>»»>> •mm»>>>> >m>>»nm>Hm>m»mH>>>>>

GENETIKAI INFORMÁC IÓ T ÁRO LÁ A ÉS KJFEJ EZÖ DÉSE

vezető

5' 3' dna A

dna A

dna A

dna A

Ori C

~ ~56'

~ (::-~ .... l dna A-aggregátum

/

"'

"ó b b ' k lniC1ac1 s u ore

--

dna 8 -dna C komplex

dna A-fehérjék ledisszociálnak a DNS-ről

J

3-8. ábra. A replikáció lniciációja prokariótában

DNS-hez kötődö speciális fehérj emolekulák (hélix destabilizáló HD-nek vagy SSB -nek nevezett molekulák) végzik. Az iniciációs "buborék" megj elenése után kezdődhet az első indító RNS-láncok szintézise. (A két replikációs villát véve figyelembe mindkét irányban a vezető szálnak megfelel ő láncon.) A dnaB-dnaC komplexhez négy másik fehérje kötödik (N fehérjék), majd ezekhez csatlakozik az indító szintézisét végző primáz (dnaG-nek is szekták jelölni). Az így kialakuló szerkezet a primoszóma . A primoszóma megkezdi az RNS indítólánc szintézisét a vezető láncon, csatlakozik hozzá a DNSpolimer áz III és a rep fehérj ék. Ez utóbbiaknak helikáz aktivitása van, és a DNS további széttekeréséért fe l elősek. (Ezt az "operatív" fehérjeegyüttest nevezik repliszómának, mindkét replikációs viliában egy-egy repliszórna működik.) A

szál szintézisét irányító minta DNS-szálon a DN S-polimeráz III folyamatosan haladhat tovább a replikációs villa haladásának megfele lően, amint a helikázok széltekerik a szülő i DNS-t és az SSB-fehérjék sta bilizálják a széttekert láncokat. Topológiailag sokkal bonyolultabbak a viszonyok a kés lekedő lánc szintézisekor. A primáz a dnaB-dnaC komplex segítségével az origótól kb. l OOO nukleotidnyi távolságban a késlekedő lánc mintájául szolgáló DN S-hez kötődik, és visszafelé, a replikációs villa haladásával ellentétes irányban megszintetizálja az első Okazaki-fragmentum néhány nukleotidból álló RNS indítóját Ennek 3 ' OH-jához csatlakozva a DNS-polimeráz Ill ugyancsak a replikációs villa haladásával ellentétes irányban folytatja a fragmentum szintézisét. A primáz eközben továbbcsúszik a DNS-minta mentén a replikációs villa haladásának irányában és újabb l 000- 1500 nukleotidnyi távolságban ismét visszafelé szintetizál egy újabb néhány tagú indító láncot, amelyet a DNS-polimeráz III ismét folytat. A fo lyamat érdekessége, hogy egyetlen molekula DN S-polimeráz TIT szintetizálj a mind a vezető, mind a késlekedő láncot, amelyek szintézise ellentétes irányban folyik. A DNS-polimeráz Ill több alegységből álló, két aszimmetrikus karral rendelkező molekula, egyik karja a folyamatos vezető láncot, a másik karja az ezzel ellentétes irányban növekvő Okazaki-fragmentumokat szintetizáUa. Ez csak úgy lehetséges, hogy az Okazaki-fragmentumok szintézisekor a késlekedő lánc mintájául szol.gáló szülő i DN S átmenetileg hurkot képez, és visszafelé hajlik. A visszafelé hajló hurok mentén a DN S-polimeráz UI a replikációs villa haladásának irányában haladhat a kés l ekedő szálon is (miközben a szintézis tényleges iránya ezzel ellentétes, 3-9. ábra). Az Okazaki-fragmentumok fo lyamatos nukleinsavlánccá történő alakítása és az RNS-indíték eltávolítása a következő lépés, itt van szükség az 5' -3' -exonukleáz aktivitással rendel kező DNSpolimeráz I közreműködésére. A második Okazaki-fragmentum addig szintetizálódik, amíg 3 ' OH-vége el nem éri az első fragmentum RNS-indítójának 5' -végét. A második fragmentum szintézisének befej eződésekor a DNS-polimeráz I 5' ~3 ' irányú (hibajavító) ex o nukleáz aktivitása segítségével egyenként lehasítja a ribanukleotidegységeket az el ső fragmentumról, és helyüket a

DNS: REPLIKÁCIÓ ÉS HIBAJAVÍTÁS

)) )) )))) )) )) )) >)>))) )))) )))) )))) )))) >))))H)))>)))>))))))))))))))) H)))))))))))))))))))>))))))~))))))))))))) J>>))> U,,))))'))))))))

3-9. ábra. A replikációs villa haladása

replikáció iránya

34.,

Ori C

Ori C dna B-dna C komlex HD fehérjék rep fehérje (helikáz)

megfelelő

dezoxi-ribonukleotid-egységekkel pótolja. Ez azért lehetséges, mert ehhez a művelethez most már az indítót a második Okazaki-fragmentum láncvégi szabad 3 'OH-ja szolgálta~a. Ilyen módon mintegy meghosszabbítódik a második fragmentum az előző fragmentum első dezoxi-nukleotid-egységéig. Ekkor már minden nukleotid a helyén van, csupán egyetlen foszfodiészterkötés hiányzik ("nick" van a DNS-szálon). A DNS-polimerázok azonban nem tudják összekötni az RNS-indító helyére utolsóként beépített egység 3'0H-ját a következő nukleotid 5'-foszfátjával. Ezt a reakciót (a "nick" megszűntetését) katalizá lja a DNS-Iigáz (3- l O. ábra). A fenti folyamat minden Okazaki-fragmentnél ismétlődik. A két replikációs villában szintetizálódott láncok egyesítését az origónak megfelelően, illetve a replikációs villák találkozásakor ugyancsak a ligáz végzi. A prokarióta sejt a nagy cirkuláris DNS-en kívül (ezt nem egészen pontos szóhasználattal a baktérium kromoszómájaként is szakták emlegetni és pl. az Escherichia coliban mintegy négymillió bázispárt tartalmaz) rendelkezhet még a nagy DNS-től elkülönülő, kisebb (néhány ezertől százezer bázispárig terjedő) ugyancsakköralakú DNS-sei is. Ezt a kis cirkuláris DNS-t plazmidnak nevezik. A

plazmidok a nagy DNS-től függetlenül is replikálódhatnak, így egy-egy baktériumsejt tartalmazhat akár száznál több másolatot is egy adott plazmidbóL A plazmidok három típusát különböztetik meg: az F vagy szexfaktort, az R vagy rezisztenciafaktort és a kolicinogén faktort, amely a kolicm nevű toxin produkciójához szükséges néhány génből áll. Az F vagy szexfaktornak a baktériumok konjugációjában van szerepe, az F plazmidot tartalmazó baktériwnot (F+) hím jellegűnek tekintik. Az F+ baktérium kis nyúlványa segítségével összetapad az F- (nőnemű) baktériummal (ezt a folyamatot hívják konjugációnak), az F plazmid egyik DNSszáJa felnyílik és az összetapadás helyén képződő csatornán keresztül átjut az F- baktériumba. Ott megszintetizálódik a komplementer lánc és a konjugáció után az F- baktérium is F+ baktériummá alakul. Az F plazmid integrálódhat a nagy DNS-be is annak pontosan meghatározott helyén. Az integrált F faktort hordozó baktériumot Hfr baktériumnak nevezik. A Hfr baktérium konjugáció során a teljes kromoszóma egyik láncát át tudja adni az Fbaktériumnak, ahol az kiegészül a komplementer lánccal és l ehetőség van a saját és újonnan kapott DNS rekombinációjára. (A prokarióta genom hap-

342

GENETIKAIINFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KJFEJ EZÖDÉSE

l)))l»»>»>»»>»»>m»»»»>»>»»l»»»»»»»>>ml>»lll»>>>»»»>»>m>»

p

p

RNS primer

p 2. Okazaki-fragment

1. Okazaki-fragment

DNS-polimeráz l 5'-3'-nukleáz aktivitás és szintézis

2

p

p

4

3

p

5

p

7

6

p

p

8

p

p DNS-Iigáz

3-10. ábra. Az Okazaki-fragmentumok egyesítése

loid, ilyenkor átmenetileg diploiddá válik.) Az E. coliban 90 perc alattjut át a teljes genomnak megfe l e l ő egyik lánc a Hfr sej tből az F- sejtbe, az integráció helyétől kiindulva. (Ilyenkor utoljára az F faktornak megfele lő szakasz jut át.) A DNS-nek a szexfaktor segítségével történő bejuttatását egy baktériumba szexdukciónak nevezik. Az R faktor olyan géneket hordoz, amelyek különbözö antibiotikumok elleni rezisztencia kialakulásához szükséges fehérjéket kódolnak. A nagyobb R plazmidok rendelkeznek azokkal a génekkel is, amelyek lehetövé teszik, hogy egyik baktériumból a másikba átjussanak (reziszten-

cia-transzfer faktor). Ilyen módon az egyik baktérium átadhatja a másiknak azt a képességét, hogy a baktériumellenes gyógyszerként alkalmazott antibiotikummal szemben ellenálló legyen. Az R plazm idokat a rekombináns géntechnikában gyakran alkalmazzák gének átvitelére vektorként (lásd később).

A rezisztenziafaktorok érdekes példáját mutatják az "ugráló gének" jelenségének. Az "ugráló gének" (transzpozonok) mobil genetikai elemek, olyan DNS-darabok, amelyek másolatai a DNS egyik helyéről a másikra vagy egyik DNS-rő l a másikra kerülhetnek A transzpozonok hossza kü-

ON : REPLIKÁCIÓ É HIBAJAV ÍTÁS

)))))))))U)))))))))))))))))))))))H))))HH>)))))}))))))))))))U> >>>>>>>>)>>>>>>n>nnHn>>•)h>>>>Hn)>>H>H>>> >)>>>>>>>>>n

lönböző lehet, egyesek csupán két-három gént hordoznak, mások ennél lényegesen több gént is tartalmaznak. Minden tra nszpozon tarta lmaz legalább egy olyan gént amelyik a transzpozáz enzimet kódolja, ez az enzim katalizálja a beéke lődés biokémiai reakcióit. Tarta lmaz továbbá a két szélén bizonyos forditottan ismétlődő szekvenciákat, amelyek a gazda-DNS-hez való beilleszkedéshez szükségesek (inzerciós szekvencia).

A rezisztenciafaktorok olyan transzpozonokból állnak, amelyek közül az egyik pl. a peniciHint és cefalosporinokat bontó ~-laktamáz enzimet kódoló gént tartalmazza, a másik a klóramfenikol-acetil-transzferázt kódoló gént, amely a klórarnfeni kol nevü antibiotikumot inaktíválja, vagy olyan foszfotranszferáz génjét, amely a neomicint és gentamicint rnódosítja. Egyetlen R piazroidon több ilyen transzpozon is jelen lehet. Orvosok gyakran megdöbbenve tapasztalják, hogy egy baktériumtörzs egyszerre lesz rezisztens igen sok antibiotikum ellen.

Az eukarióta kromoszóma szerveződése

A maggal rende l kező eukarióta ejtekben a DNS mennyisége és a kettős spirál szerkezetének további szerveződése más, mint a prokariótákban. Az emberi sejt kb. ezerszer annyi DNS-t tartalmaz, mint az E. coli sej t (J 09 nagyságrendű bázispárt). Az eukarióta DNS nem egy molekula, hanem annyi, ahány krornoszóma van a sejtben (az emberi sejtben 46). Nyugvó, nem osztódó sejtben minden kromoszóma egy molekula lineáris DNS-nek felel meg. A DNS az eukarióta kromoszómában nem szabadon fordu l el ő, hanem fehérjékke l képez komp lexet és többszörösen feltekered ve igen kompakt szerkezetet alkot. A komplex szerkezete változik a sejtciklus folyamán. Mitózis közben a legkompaktabb a kromoszóma szerkezete, a mitózisok közötti ún. interfázisban lazább a szerkezet, de a DNS ilyenkor is sokszorosan fe ltekeredett állapotban van. (Az egy sejt 46 kromoszomájában található, összesen kb. 180 cm hosszú emberi DNS interfázisban l00---1000-szer, mitóziskor kb. l O 000-szer rövidebb). A DNS sokszoros feltekeredése több célt szolgál. Egyrészt a hosszú DNS moleku la "összecsomagolását" biztosítja, másrészt a feltekeredés módjának,

343

a lazább vagy tömörebb szerkezetek váltakozásának meghatározó szerepe van a génaktivitás szabályozásában. A DNS-hez kapcsolódó fehérjék egyrészt hisztonok, másrészt a sokkal nagyobb változatosságot mutató nem hiszton fehérjék. A hisztonok igen nagyszámú molekulája kapcsolódik a DNS-hez, míg a nem hiszton fehérjék heterogén, kü lö nböző funkciókkal rende l kező fehérjepopulációt alkotnak. Ebbe a csoportba tartoznak a DNS és RNS szintézisében részt vevő fehérjék és azok is, amelyek a génkifejezőrlés szabályozásában j átszanak szerepet. A nem hiszton fehérjék egyik-másik típusából esetleg csak néhány molekula kapcsolódik a DNS-hez. A hisztonok bázikus fehérjék, amelyeknek az am inosavszekvenciája nagyon hasonló az egymástól távoli fajokban is (az evolúció során konzervatívan megőrzött szekvencia) mutatva, hogy valamilyen alapvető feladatot töltenek be minden eukarióta sejtben. Négyféle hiszton mol ekula (H2a, H2b, H3, és H4) tartozik az ún . "corehisztonok" közé, ezek molekulatömege l O és 20 kDa között van. A H2a és H2b bázikus aminosavai között a lizin van túlsúlyban, a H3 és H4 pedig argininban igen gazdag. A hisztonek polipeptidláncának N-terminális és C-terminális szakasza igen bázikus, a középső szakasz kevésbé poláros je llegű. Ez a szerkezet lehetőséget nyújt mind a DNS-hez, mind egymáshoz és más fehérjékhez való kapcsolódásra. A kromoszóma szerkezetének alapja a nukleoszóma, amely a DNS-en kb. 200 bázispáronként ismétlődik. A négy "core-hiszton" két-két molekulája (együttesen nyolc molekula hiszton) alkot egy-egy korongszerü képződményt, amelyre a DNS rátekeredik kb. 150 bázispár hosszúságban, a "core-hiszton"- DNS komplexet hívják nukleoszómának. Két nukleoszóma között kb. 50 bázispárny i hosszúságú " kapcsoló DNS" van. A nukleoszómaszerkezet a DNS teljes hossza mentén kialakult, gyöngysorszerü képződmény (átmérője ll nm). Az ötödik fé le hisztonmolekula a Hl -hiszton, részben a DNS-hez, részben a core-hisztonokhoz kapcsolódva, közel húzza egymáshoz és bonyolultabb szerkezetbe rendezi a nukleoszómákat (3-ll. ábra). A Hl-hiszton kb. 2 1 kDa molekulatömegü, lizinben igen gazdag fehérje. A hisztonok közül ennek az aminosavszekvenciája a legkevésbé konzervatívan megőrzött. A

344

)l)))) l))))))> )}l)))))))))))))))))))))))>))))))))))))))))))))))))) ))) )))} ) )) )> )})) )) )) ))

GENETIKAIINFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

Az eukarióta sejtben történő replikáció néhány jellegzetessége

3-11 . ábra. Az eukarióta kromoszóma

szerveződése

Hl-hiszton szerin, illetve treonin oldalláncai közül némelyek foszforilálódhatnak k:ülönböző proteinkináz enzimek hatására. A foszforilációnak reguláció szerepe van abban, hogy a H 1-hiszton mennyire kompakt szerkezetet rögzít. (Mitóziskor pl. a H 1-hisztonok erősen foszforilált állapotban vannak.) A H 1-hisztonok által tömörített kromatinrost még kompaktabbá válik azáltal, hogy egymás me ll ett elrendezőrlő hurkokat képez, ezek 300 nm átmérőjűek, azonban még mindig az extendált kromoszómának felelnek meg. Az extendált kromoszóma további hurokképződésse i kondenzált szerkezetet alakít ki. Mitóziskor ez a szerkezet még tovább kondenzálódik. A rnitózis metafázisából ismert 1400 nm átmérőjű tipikus kromoszóma két molekula DNS-t (két kromatidot) tartalmaz. A kromoszóma kondenzáltsági foka az interfázisban nem mindenütt azonos. A heterogenitás eddig ismert okai között számon tartják az egyes hisztonmolekulák oldalláncainak kovalens módosulása it (acetiláció, foszforiláció, ADP-riboziláció), az ubikvitin nevű fehérje kötődését, a hisztonmolekulák variációi t (pl. H l-hisztonnak léteznek o lyan variánsai ugyanazon sejtben, amelyek aminosavszekvenciája néhány aminosavban különbözik egymástól) és különböző nem hiszton fehérjék jelentétét

Az eukarióták DNS szintézisének menete elvileg hasonlít a prokariótákéhoz, néhány lényeges különbség azonban megfigyelhető . Az eukarióta DNS nem cirkuláris, hanem lineáris és sokkal hosszabb, mint a prokarióta genom. A replikáció a hosszú DNS-molekula mentén egyszerre sok startponton indul meg, mindenütt két irányban, " replikációs buborékok" keletkezése közben (3- 12. ábra). A vezető szál és a késlekedő szál szintézisét nem ugyanaz a DNS-polimeráz molekula, hanern két kü l önböző enz im végzi, az o.-DNS-polimeráz a késlekedő szál, míg a o-polimeráz a vezető szál szintézisét katalizálja. (A f3-polimeráz a DNS-t ért károsodások javításában, a repair mechanizmusban vesz részt, a y-polimeráz az extranukleáris DNS-t szintetizálja.) Az eukarióta DNS-pol imerázoknak nincs saját exonukleáz aktivitásuk, a 3'~5' hibajavítást és az indító RNS-darabok kimetszését önálló nukleáz enzimek végzik, amelyek azonban a DNS-polimerázzal kempiexet képeznek. Az eukarióta DNS-l igáz nem NAD+, hanem ATP hidrolíziseközben működik.

s

3'

llllllllllllllllllllllll

y

5'

START

START

régi hiszton

\

START

__

új hiszton

__....,.--,...

5' 3'

új hiszton

3' 5'

régi hiszton

3-12. ábra. A lineáris eukarióta DNS-replikációja

DNS: REPLIKÁCIÓ ÉS HIBAJAVÍTt\

A2 eukari óta D S egyes bázisainak posztszinletikus metilációja a génexpresszió szabál yozásában játszhat szerepet.

A nukleoszómaszerkezet kia lakulásá hoz szükséges hisztonok, a fehérjék többségétő l e ltérően , az S fázisban szintetizálódnak, szintézisük szigorúan koordinált a DNS replikációjávaL A hisztonak megoszlása az új DNS-láncok mentén tulnyomórészt konzervatív, zömében az összes régi hiszton arra a DNS-re kerül, amely a vezető láncot tartalmazza, és az összes újonnan szintetizált hiszton a késlekedő szá lat tartalmazó DNS-szakaszon foglal helyet. A hosszú lineáris DNS-t tartalmazó eukarióta kromoszóma végeit teleméreknek nevezik. A telemérekben a DNS 3 ' -végének megfel elő szál "túlnyúlik", a túlnyúló egyes lánc rövid, guanin nukleotidban gazdag, kétszer ismétlődő szekvenciákat (telomér szekvenciákat) taJtalmaz. A replikációk közötti időszakban a túlnyúló lánchoz egy telomervégi fehérje kötődik. A teleméreknek speciális feJadata van a kromoszóma végeinek véde lmében, nélkülük a kromoszóma a replikáció során egyre rövidül ne. A lineáris DNS replikációja a késlekedő lánc 5' -végén ugyanis spec iá l is problémát vet fel. A láncvégi RNS-indító kimetszése után nem pótlódik a helye DNS-sei és így a kés lekedő lánc rövidebb lesz, mint a minta DNS. Azért, hogy emiatt információt hordozó nukleotidszekvenc ia ne vesszen el, egy sajátságosan működő te lomcráz enzim meghosszabbítja a késlekedő szál mintájául szolgáló lánc 3 ' -végét. A késlekedő láncon az ennek megfelelő komplementer szekvenciára nincs szükség, ezért nem károsodik a DNS, ha a késlekedő lánc 5' -vége a szintézis során rövidebb lesz. A telameráz enzim " prosztetikus csoportként" egy RNS-darabot tartalmaz, és ennek az RNS-nek megfel elő komplementer DNS-sei hosszabbítja meg a DNS 3 ' -végét. (A telomcráz enzim müködése az egyik példa arra, hogy DNS szintetizálódhat RNS-minta alapján). A telomcráz enzim aktivitá ának eredményekel a telomer szekvenciák a kromoszómák végén a kétszer i s métl ődő szekvencia egységet még sokszorosan ismét l ő láncot alkotnak, amelyek rövidü lése az egymást követő rcplikációk során nem okoz kromoszómakáro odást. A felnőtt soksej tű szervezet differenciált szomatikus sejtjeiben a telomcráz enzim már nem expresszálódik, ezekben a sejtekben már nincs telomeráz aktivitá . Ezért feltételezik, hogy fel nőtt emberi szervezetben a már megszintetizálódott telomer szekvenciák

hossza meghatározhatja a szomatikus sejtek további replikációinak azt az elvileg lehetséges max imális számát, amelyekben az információt hordozó kromoszómavégek még nem károsodnak. Ez a feltételezés még további megerősítés­ re szorul, azonban tény, hogy a szomatikus sejtek rosszindulatú daganatscjtté tört-n ő transzformációjakor a telomcráz aktivitás általában ismét megjelenik a sejtben

A sejtciklus szabályozása és a tumorszuppresszor gének által kódolt fehérjék szerepe a sejtciklus szabályozásában A nukleáris DNS replikációja eukarióta sejtekben az egyes sejtek é letének csupán bizonyos szakaszára korlátozódik. A két mitózis közötti interfázisnak nevezett id őszak három szakaszra 'oszlik. A mitózis után a sejt G I-fázisba kerül, ebben az időszakban szintetizálódik a sejtre jellemző fehérjék többsége. A sejtciklus hosszú ágát általában a G 1-fázis hosszúsága határozza meg. A G l -fázist követi a DNS replikációjának id ősza ka, ezt S-fáz isnak nevezik. A replikáció befejeztével a (már kétszeres DNS-mennyiségg el rende lkező) sejt felkészül az osztódásra. A DNS replikációja és az osztódás megkezdése közötti időszak a 02-fázis (3- 13. ábra). A sejtciklus egyes fázisai csak megbatározott feltételek mellett követhetik egymást, az egyes fázisok egymásba törté n ő átmenete le szigorúan szabályozott. Ha e szabályozásba va lami hiba csúszik, kontroll né lkül szaporodó sejtek vagy súlyosan károsadott sejtek jöhetnek létre. A magasab brendű , soksejtű szervezetekben a sejtek egy jelentős része nyugvó, nem szaporodó sejt. Ezek a sejtek a G 1-fázisból, a G J -fázis speciális változatának tekinthető GO-fázisba jutnak, ahol a differenciáltságuknak megfele lő funkciókat ellátják. GO-fázisban levő, nyugvó sejtek bizonyos esetekben extracelluláris kémiai jelek hatására ismét visszakerülhetnek a G l -be és szaporodó sejtekké válnak. A sejteknek a GO-fázisból a szaporodási ciklusba j utását stinmlá ló kémiai szigná lok a növekedési faktorok (és a citokineknek nevezett anyagok közül némelyek). A növekedési faktorok á ltal szolgáltatottjelek et a sej t belseje, majd a DNS felé, sok fehé1jébő l álló, bonyolult szigná l transzdukciós rendszerek közvetítik. (Ezek ismertetésére az 5. fejezetben kerü l sor.) A polipep-

346

GENETIKAJ INFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

>>>>>>»>>>>»>>>>>>>>»>>>>>>»»>>»>>>>>>>))))))))>)))))l)H)l)))))>)))))))))))))))))>)

a

- -- -·

~

növekedési faktorok

- MG)t

G1/S kontrollpont

G/ M kontrollpont

l lG,tM

s

G,

l

interfázis

b

ciklin B- CDK1

kontrollpont

s

G,

G2

Mu- -

! C

~

l~

p21

l

~ l p53 1

~~

p27

A

ciklin E-CDK2

G,/S kontrollpont

G,

s

- - - - - - - - --1----"""1-- -- + - - - Mu- -

®V

i

G, - - - - - - - - - - - - + S

3-13. ábra. A sejtciklus kontroll pontjai és tumorszuppresszor gének által kódolt fehérjék szerepe a sejtciklus szabályozásában. (a) Két mitózis (M1 és M/1) közötti interfázis szakaszai a kontrollpontokkal, (b) a G2/M átmenetet elősegitő ciklinprotein-kináz komplex (CDK1 : ciklindependens protein-kináz 1), (c) a G1/S átmenetet elősegítő ciklin-protein kináz komplexek (CDK2: ciklindependens protein-kináz 2, CDK4: ciklindependens protein-kináz 4) és az ezek aktivitását gátló fehérjék. A p53-fehérje a p21-fehérje szintézisét elősegftő transzkripciós faktor. Az Rb-fehérje foszforiláfatlan formája gátolja a G1/S átmenetel, foszforilá/t formája nem rendelkezik gátló hatással. A bekeretezett fehérjék tumorszuppresszor gének termékei. (d) az Rb tekérje foszforilációja az E2F transzkripciós faktort felszabadítja az inaktív Rb-E2F komplexből. Az E2F aktiválódása elindftja az S fázist

DN : REPLIKÁCIÓ ÉS HI BAJAViTÁS

)U)))>)))))))))))))))l)))))))))>H~>)H))))>))))))))))))))))))))))))))))))U)))))H>t)>)))H))))))>>H»>)))))~)))}))>>>>hhH)>

tid természetű növekedési faktorokat, illetve az általuk szolgáltatott jeleket közvetítő fehérjék szerkezetét kódoló gének között sok olyan van, amelynek meghibásadása kontro llálatlan sejtszaporodáshoz, rosszindulatú daganat képződéséhez vezethet. Az ép sejtben jelen levő, a növekedés fiziológiás stirnulálását szolgáló fehérjéket kódo ló géneket, amelyek szerkezetének vagy expressziójának hibája daganatok képződését idézi e l ő, protoonkogéneknek nevezik. A sejteJeius maga ugyancsak többszörös szabályozás alatt áll. A szabá lyozás egyik katrollpontja a G l IS fázis határán, a másik a G2/M határán van. A szabályozásban ciklineknek nevezett fehérjék (ezek szintézise és lebontása a sejtciklusnak megfelelően ismétl ődik) és a ciklinek által szabályozott, ún. ciklindepende ns protein-kinázok vesznek részt. A G2/ M határán működő szabályozási rendszert ismerik részletesebben, amelyért a ciklin B-nek nevezett fehérje á ltal aktívá lt cikJindependens protein-kináz l felel ős. A ciklindependens protcin-kináz l mennyi ége gyakorlatilag azonos a teljes sejtciklusan keresztül, azonban önmagában inaktív. A ciklin B a mitózi közben degradálódik és csak az S-fázisban szintctizálódik ismét. A ciklindependens kináz l-nek bizonyo oldalláncán (Thr-16 1) fo zforilálódnia kell ahhoz, hogy stabit ciklin-B-protein-kináz komplex jöjjön létre, ez a komplex azonban inaktív az S- és G2-fázisban, mert az enzimnek két másik oldallánca is foszforilálódva van (Thr-14, Tyr- 15), ezek foszfori lációja akadályozza az ATP kötődését az enzimhez. A G2/M határán e két utóbbi oldallánc defoszforilálódik, ekkor az enzimkomplex aktív lesz. Foszforilálja a H l hisztonokat, a magmembrán és citoszkeleton fehérjéit, amelyeknek módosulásai cgitik el ö a mitózist. Az enzimkomplex aktivitásátaciklin B degradációja zünteti meg, a kináz ismét inaktívvá válik. Ennek az enzimnek a szabályozása biztosítja, hogy a mitózis nem ke7dödhct meg azel őtt , mi elő tt a DNS-replikáció tökéletesen befejeződött volna. A ciklindependens protcin-kinázokat fo zforiláló és defoszforiláló enzimeket a ejt "órájának" is tekinthetjük.

A G l /S határán történő szabályozás orvosi szempontból még fontosabbnak látszik. Ez az a pont, ahol egy sej t végleg elköte lezi magát a szaporodásra. A Gl/S átmenet szabá lyozásában a ciklin D és E, a ciklindepend ens protein-kináz 2 (Cdk2) és a ciklindependens protein-kináz 4 (Cdk4) vesz részt, ezek e l ősegí tik az átmenetet (A mechanizmust itt erősen leegyszerűsítve tárgyaljuk, nem minden komponensét ismertetj ük). Az S fá z is megindulásában egy E2F-ne k nevezett transzkrip-

347

ciós faktornak van központi szerepe, ez aktiválja azokat a géneket, amelyek a DNS-replikác ió megindulásához szükséges fehé rjéket kódolj ák. Az E2F transzkripciós faktort azonban inaktív komplexben tartja a retinablastorna gén á ltal kódolt retinablastorna vagy Rb fehérje. Ha a ciklinekkel aktivált Cdk2 és Cdk4 foszforilálja az Rb fehérjét, az Rb fehérje- E2F komplex szétesik, és az így felszabadu ló E2F elindíthatja az S fáz is programját. Az Rb fehérje foszforilác iója tehát egy nagyon fontos regulációs pont a G l -ből S fázisba tö rténő átmenetben. A foszfori láció gátlása a sejtet visszatartja a G 1 fázisban addig, amíg a tiz iológiás sejtproliferáció körülményei között erre szükség van. Az Rb fehérje foszforilációját gátló legi mertebb fehérjék, a molekulatömegük a lapján elnevezett p 16 és p21 fehérje . A p2 1 fehérje menny iségét transzkripciójának sebessége határozza meg. Azt a transzkripciós faktort, amelyik (többek között) a p2 1 expresszióját is indukálja p53 feh érjének nevezik (3- 13ábra). A sejtciklus szabályozásáról további részletek olvashatók az 5.2. fejezetben. A retinablastorna fehérjét, a p l 6 fehérjét és a p53 fehérjét kódoló gének ún. tumorszuppresszor gének. A tumorszuppresszor gének tennékei a sejtproliferációt gátolják, ezeknek a géncknck, illetve az általuk kódolt fehérjéknek nem a túlzott aktivitása (mint a protoonkogének esetében), hanem éppen akiesése vezet daganatsejtek képzödéséhez. A retinoblastoma gén kiesése (mindkét allélen) a retina fejlődésének bizonyos fázisában már önmagában is daganatot hoz létre (innen az elnevezése), más sejttípusokban csak a többi tumorszuppresszor gén kieséséhez hasonlóan, csupán egyike a daganatsej t képzödését e l ő­ idéző több tényezőnek. A p53 gén meghibásodását a humán daganatok közel 50%-ában megfigyelték, míg a p 16 fehérjét kódoló gén kiesése a humán tumorok mintegy 70%-ában előfordul.

Az extranukleáris DNS E ukarióta sejtekben található DNS a magon kív ül is, a mitokondriullJokban és a növények klorop lasztiszában. A mitokondriá lis DNS a prokarióta DNS-re em lékeztető c irkuláris forma, a mitokondrium febérjé inek mintegy 5%-át kódolja (a

348

))U}))H))})))t't))))))))'t))))n)))))))))))))}'t))))))))))))))).)))))))H))))))))))))))'))))

többit a nukleáris DNS). Ezenkívül a mitokondriumokban folyó önálló fehérjeszintéz ishez szükséges riboszóma RNS-ek és tRNS-ek szerkezetéhez szi.ikséges információt is tartalmazza. A mitokondriális DNS a sejtciklustól függetlenül replikálódik és a petesejt citoplazmáj ából kiindulva anyai úton öröklődik. További részleteket lásd a 6.6 fejezetben. A DNS-szekveneia-vizsgálatok legújabb módszerei, ameegy ké őbbi fejezetben lesz szó, lehetövé tették a mitokondri ális D S szerkezetének felhasználását antropológiai kutatásokban. (A mitokondriális DNS leljes szekvenciája ismert.) Ezeknek a vizsgálatoknak az alapján alkották meg az "Éva-hipotézist", amelynek feltevése szerint a ma élö egész emberiség egy kb. 200 OOO évvel ezelőtt Kelet-Afrikában él ő asszonytól származik. lyekről

A DNS károsodásainak javítása: repair mechanizmusok A DNS szerkezetének megőrzése az örökl ődés alapja, a DNS azonban sérülékeny vegyület. Sérülését okozhatják ionizáló sugárzások, UV - fény, kémiai hatá ok. Ezen hatások következtében bázisok változhatnak, elveszhetnek, faszfediészterkötések elhasadhatnak, a szálakon belül vagy a szálak között keresztkötésekjöhetnek létre. Ezek a hibák meglehetős gyakorisággal létre is jönnek. Ha a károsodás egy adott szakaszon a DNS-Iá ncnak csak az egyik szálát érinti, ez a replikáció e l őtt a legtöbb esetben még javítható, mert az épségben maradt komplementer szál még ő rz i az eredeti információt, amely a javítás (repair) mintájául szolgál. Ha ajavitás a replikációig nem következik be, a hiba a replikáció során rögzül az érintett szálat tartalmazó új utód DNS-nek már mindkét láncán megváltozik a DNS bázis-szekvenciája, ilyenkor mutációról be zélünk. A DNS sérüléseit el ő idéző kémiai anyagok illetve sugárzások mutagén és karcinogén hatá uak. A repair bizonyos hatásfokkal megy végbe, mennél több helyet érint a DNS-t éJt károsodás, illetve mennél gyakrabban történik károsodás, annál kisebb a va lószínűsége annak, hogy a hibák kivétel nélkül javításra kerülnek. Ez az oka annak, hogy a sérüléseket kiváltó tényezők túl nagy dózisa, vagy túl sokszor történő ismétlődése erősen megnöveli a mutációk va lószínüségét. A csírasejtek DNS-ét

GENETIKAI [ll.rFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KJFEJEZÖDÉSE

érintő

mutációk megváltoztatják a generációrólgenerációra öröklődő információt. Az állati szervezet egyes szomatikus sej tjeiben l étrejövő mutációk egyrészt elő idézhetik a sejt életfolyamatainak károsodását, csökkent funkciójú vagy életképtelen sejteket bozhatnak létre, ezek elpusztulnak. Másrészt viszont, a má r említett protoonkogéneket és tumorszuppresszor géneket érintő mutációk kontroltálatlan sejtszaporodáshoz vezethetnek, az ilyen módon kárcsodott sejtek nem pusztulnak el, hanem éppen ellenkezőleg, daganatok kiindulásául szolgálnak. A p53-ként ismert tumorszuppresszor gén termékének egyik funkciója éppen a repair elősegítése, a szornatikus mutációk elkerülése. A p53 fehérje aránylag kis mennyiségben fordul el ő a sejtekben normál körülmények között, de pl. az UV -fény által okozott DNS-károsodás hatására mennyisége erősen megnövekszik és a sejtciklusnál ismertetett mechanizmus segítségével a sej teket nem engediS fázisba jutni addig, amíg a repair nem történt meg. Ha v iszont a sérülések olyan nagyok voltak, hogy nem javíthatók, elősegíti a sejtek programozott halálát (apoptózisát). Ez magyarázatul szeigál arra, hogy magának a p53 génnek a meghibá odása ITIÍértjárul hozzá olyan gyakran a további szomatikus mutációk és így tumorok kialakulásához. Géntechnikai módszerek segítségével állatok csírasejtjeiben is működésképtelenné lehet tenni egyes géneket, ezt nevezik a gének kiütésének (knoek-out). A " knock-out" állatok minden sejtj ében károsodik a kérdéses gén. Ez éri ntheti vagy csak az egyik szülötöl örökölt aliélt (heterozigóta), vagy a gén mindkét allélját {homozigóta). A p53 fehérje károsadott génjét hordozó "knock-out" egerek életképesek, azonban bennük tumorok kialakulása sokkal gyorsabban és nagyobb val ó zínű éggel megy végbe, mint a kontroll állatokban. Ismeretes olyan ö rökletes emberi génkárosodás is, amikor az egyén egyik p53 génje nom1ális, a másik allé! viszont mutáns. Ezekben az egyénekben a tumorok kialakulása sokkal gyakoribb, mint az átl ag népességben.

A leggyakoribb DNS-károsodások közé tartozik a depurinizáció, a bázisok oldalláncainak dezaminációja, timin dimérek képződése, nukleotidek kiesése vagy feles leges nukleotidek beékel ő­ dése, a lánctörések, láncok kereszkötései stb. A javítás (repair) folyamatokban specifikus glikozidázok, specifikus endonukleázok, prokariótákban a DNS-polimeráz l, eukariótákban a P-DNS-polimeráz és aDNS-ligáz vesznek részt.

DNS: REPLIKÁC IÓ ÉS HIBAJAVjTÁS

))))))))))))))>>>>))U)))))))))))))))})))))l))>))))))))))))))))))))))H~>)>H))H>)H)

Igen gyakori sérülés az egymás mellett, azonos láncban levő timinbázisok UV-fény hatására történő dimerizációja. Az egymás mellett l evő timinek 5. és 6. szénatomjai között kovalens kötések alakulnak ki (3-14. ábra). (C itozinok és timin-citczin párok között is kialaku lhat a dimerizáció, de liminpárok esetében a leggyakoribb.) Prokarióta sej tek többféle mechanizmussal rendelkeznek a pirimidin dimérek eltávolítására a DNS-ből. Az egyik mechanizmus, amely kizárólag prokariótákban található, egy fotoaktivált enzim segítségével (dezoxi-pirimidin-fotoliáz) müködik. Ez az enzim a látható, kék fény hatására aktiválódik és képes elvágni timinpárok között kialakult kovalens kötéseket. Egy másik mechanizmus gyakorlatilag azonosan működik prokariótákban és eukariótákban. Egy specifikus endonukleáz felismeri a kovalensen összekötött bázisokat (fe l teh ető leg azok terjedelmes szerkezete miatt), és a sérült nukleotid 5'-foszfátját a sérülés elötti nukleotidda l összekötő, illetve a sérült nukleotid 3 ' 0H-ját a sérülés utáni nukleotiddal összekötő foszfodiészterkötéseket elhasítja. Ezá ltal a sérült nukleotidokat e ltávolítja a DNS-Iáncból. (A DNS-Iáncban képződő egy vagy néhány nukleotidnyi hiányt "gap "-nek nevez ik.) A hiányt a DNS-polimeráz I (prokariótáknál) vagy a B-DNS-polimeráz (eukariótáknál) a komplementer láncnak megfelelően " befoltozza", minden lépésnél az újonnan beépített nukleotidek 5' -végén alakítva ki a foszfod iészterköté t. Mikor minden nukleotid a helyére került, az utolsó foszfodiészterkötés hiányzik ("nick" van a láncon), ennek a kötésnek a kialakulását a DNS-Iigáz katalizá lja. Az UY-fény által okozott módosulásokat fe lis me rő specifikus endonukleáz öröklete hiánya okozza a xeroderma pigmentosum nevü betegséget. Ez az UV pecifikus endonukleáz valószínüleg nem egyetlen enzim, hanem többtagú enzimkomplex. A komplex valamely tagjának genetikai károsodásával született egyének bőrén a napsugárzás e l őbb a bör elváltozásaihoz, majd bőrből kiinduló rosszindulatú daganatok kifej lődéséhez vezet.

A depurinizáció ugyancsak gyakori károsodás, savak vagy hő hatására fordul elő (gyakorisága átlagosan 104 purinbáz is naponta, sejtenként). Ilyenkor az adenin- vagy guan intartalmú báz isok g liko-

HJ))))))))))))

)))))))))).)U)))

» )lo)))}

349

p

o

ll

Cdezoxi-ribóz -

l

H .... N

\ c=

N

\H

c= c

l

adenin

o ····

"'

CH3

p

o

ll

Cdezoxi-ribóz -

l

H .... N

\ C=

N

\H

c- c

l

adenin O····

"'

CH3

p

o

ll

H .... C- N

dezoxi-ribóz -

\ C=

N

\ c-c l H

adenin O ····

"'CH3

3-14. ábra. Timin dimérek

z idos kötése hasad el é bázis nélküli dezoxiribóz-fo zfát marad vi sza a láncban. A dezaminálódás bekövetkezhet spontán, ionizáló sugarak, alkilá ló szerek stb. hatására. A dezam iná lódás a DNS-ben " idegen" báz isok megjelenésél eredményez i. Az adenin dezaminálódása hipoxantint, a guanin dezaminálódása xantint eredményez. Az adenin esetében a változás a hidrogéndonor NHr csoport helyett hidrogénakceptor oxocsoportot hoz létre és megváltoztatja a nukleotid komplementaritását. Javítá nélkül ez a vá ltozás mutációhoz vezet.

350

GENETIKA II NFORMÁClÓ TÁ ROLÁSA ÉS KIFEJ EZŐDÉSE

5' GATCTA 3'

j dezaminálás

C.-+U

3' C TAGAT 5' 5' GAl(Q)A

3'

l

glikozidáz

3'

c

T

G

A

p

... p

A T

G

c

T

G

A

G

T

A

p

OH

T A

T 5'

A

T

l ... p

endonukleáz

A

... p

3' c G

s·

A

·~·

p

l 3'

T

A

T

Ugyancsak megváltozik a c itczin komplementaritása dezaminálódás hatására. A citczin dezaminációj ának eredményeként uracil képződik, az uracil v iszont nem guanint vonz komplementer bázisként, mint a c itozin, hanem adenint, a timinhez hasonlóan. Javítás nélkül az uracit megjelenése szintén mutációt idéz elő. A DNS-ben azonban az uracit is idegen bázis. A repair specifikus glikozidázai az idegen bázisoka t, köztük az uracilt is fe lismerik és g likozidos kötésüle elhasításával eltávolítják a DNS -bő l. A genetikai kód a DNS-ben azért használ timint a hasonló komplementaritás ú uracit helyett, hogy a c itcz in dezaminálódásából származó gyakori h iba j avítható legyen, a timin használata biztonsági berendezésnek te kinthető. A z egyes bázisok kémia i módosulásait megszűn ­ tető repair mechanizmusok lényegében hasonló elv alapján működnek. A sérü lt bázist tartalmazó nukleotid fe lismerése és a glikozidos kötés hasítása a leg lassúbb lépése a fo lyamatnak. Ezután egy bázis nélküli dezoxi-ribóz-fosz fátot fel i merő specifikus endonukleáz (AP-e ndonukleáz) kimetszi a nukleotidmaradvá nyt, majd a DNS-polimer áz befo ltozza a "gap"-et és a DNS-Iigáz megszünteti a " nick" -et (3-15. ábra).

DNS-polimeráz

A

T

p

G

A T

c

OH

3'

T 5' A

.. p

DNS-Iigáz

p

3-15. ábra. Repair enzimek szerepe

c

T

G

A

G

A

c

T

p

A

T

T

A

5'

w

DN :REPLIKÁCIÓ É HIBAJAVÍTÁS

)))) )))) )) )) )) )) )) )) il)) >H> )))H))) H)))))))>))~))) >•)) )> )))))))))) )))) )))) )) )) )) ,")))~)))))l) H ))))H)))) J)))))))))))))))))))))

DNS-polimerá z esetlege tévedésének (rossz bázispárok kialakulásána k) az utólagos j avítása a "mismatch repair". Dacára a DNS-szintézis nagyfokú hűségének, ame lyet a 3' -5' korrekc ió exonuk leáz aktivitás j elentösen fokoz, mégis e lő­ fordul, hogy a replikáció orán nem a megfe le lő bázist tartalmazó nukleotid épül be. (Egy lehetséges oka a rossz párosadá nak a bázisok átmenetileg el őfordul ó enol-tautomé r fom1áj a, lásd később.) A korrekt bázispára odás hiányát a repair mechanizmus érzéke li ugyan, azonban információt kell kapnia arról is, hogy a rosszul ill eszkedő két bázis közül melyik a hibás és mely ik a jó. Ez az informác ió a repli kációt követő rövid időszakban (néhány másodpercig vagy néhány percig) még rendelkezé re áll. Az ép lánc felismeréséhe z a DNS meti lációj a nyúj t segítséget. A szülöi DNSlánc bizonyos specifikus nukleotidszek venc iákná l - ez az E. coli baktériumban például minden GATC szekvenciában előforduló adenin meti lálva van, a meti láció az újonnan szinte tizálódott zálon csak pár perc késéssel történik meg. Ameddig az új lánc nincs metilálva, egy specifi kus enzimekbő l álló enz imrendszer felismeri a rosszul i ll eszkedő nukleotidpárt és pé ldául E. coli-ban a legközelebbi még nem metilá lt GATC szekvenciánál e lmetszi az új láncot. A hibát i tartalmazó hosszú (E. coliban kb. l OOO nukleotid hosszuságú) láncdarabok kimetszése és az így keletkező hiány szülö i lánc a lapján történ ő pótlása a "mi match repair". Ez a fajta javítás, a hosszú darabok pótlása miatt nagyon kö ltséges a sej t számára. Éppen ennek a pazarlónak tűnő m echanizmusnak a fenntartása mutatja, hogy menny ire fontos a DNS-replikác ió fol yamán el őfordul ó esetleges hibák javítása. A hu mán "mismatch repair" enzimeinek a genetikai károsodását, rossz funkcióját tartják felelösnek az öröklődő vastagbélrák (HNPCC) iránti hajlam kialakulásáért.

Mutációk Ha a DNS sérü léseit a repair enz imek nem javítják ki a replikáció előtt, vagy a hiba a replikáció közben történik, megváltozik a DNS mindkét lán-

35 J

cának bázisszekvenc iáj a. Ilyenkor mutációról beszélünk. Egyetlen bázispár változása a pont- mutáció. Ha az eredeti bázispár helyére egy másik bázispár kerül, ez szubsztitució. A szubsztitúc ió Ichet tranzíció, ha a változás során egyik pirimidinbázis helyét a másik pirimidin bázis, vagy egy ik purinbázis he lyét a másik purinbázis fogla lja el. A bázisok dezaminá lása tranzíc iót idéz el ő. A tranzíció e l ő fordulha t spontán is (minden külsö károsító tényező nélkül). A sp ontán tranzíció előfordulási va lószínűsége kicsi, azonban mégis előfordul (különböző fajo kban 10-8- 1o - IO bázispár/ replikációra becsülik, egy 9 bázispárból álló DNS minden tizedik l0 re plikációj a során egyszer e l őfordul. Az evolúc ió során ennek a mutációs hányadosnak komo ly j elentősége van.) Oka a bázisok enol-oxo tautomériáj a. A DNS-ben az oxoforma fordul el ő és a komplemente r bázisok közötti hidrogénhídkötések kia lakításában az oxocsoport hidrogénakce ptor szerepet játszik. Az enolos hidroxilcsopo rt nem h idragén-akcep torkén t, banern hidrogéndono rké nt szerepel, ezért az enolformában l evő bázisnak más a komplementaritása, mint az oxoformában l evő­ nek. Ha a replikáció pillanatábana mintául szalgáló láncon például egy guanin ene la lakban va n, ennek komplemente reként a DN S-polimeráz nem c itozint, hanem timint fog beépíteni . A DNSpolimeráz továbbhaladás a után a mintául szolgáló guanin már hiába változik v issza oxoformába, az új láncon citozin he lyett ott van a timin. A hibát a " mismatch repair" még kijavíthatja. Amennyiben azonban ez nem történik meg, az új láncot ért változás a következő replikáció során rögzül és véglegessé vá lik a guanin- c itoz in helyett timin- adenin tranzíció (3- 16. ábra). Az enolforma megjelené ének valószínüségét az ionizációs sugárzások fokozzák. A transzverziós j ell egű szubsztitúc ió, amikor egy pirimidin he lyén egy purin van (vagy fordítva) a DN S-ben, a DN S-po limeráz hibás müködésébő l e red . A szub ztitúciós mutációk me llett léteznek olyan pontmutációk is, ame lyeket egy-egy nukleotid kiesése (deléció) vagy egy-egy nukleotidtöbblet beé pülése (inzerció) hoz létre. Ha a deléció vagy inzerció a DN S-fehérjéket kódoló szak aszain történik, kereteltolódá ssal j áró (frame-shift) mutációkról beszélünk (3-17. ábra).

352

GENETIKAI INFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

))))))))))H))))))))))))))))))))))))U)>>'>>)))))))))))))))))))))))))))))))))>>>)))))))))))

3-16. ábra. A G-C ~ T-A spontán tranzícíó mechanizmusa

3'--C-5' oxo

l

5'- G- 3'

5'- G- 3' 3'- C- 5' - - <

3'- C- 5'

tranzíció

5'- G- 3'

!

5'-A-3' 3'-T-5' enol

en ol l

l

5'-G-3'

5'-G-3' 3'-C-5' - - <

<

3'-~-5'--< 5'-G-3'

3'-T-5'

.. 5'-G-3'

ox o l

5'- G- 3' 3'-C-5'

3'-C-5'

5' -G- 3'

3'-C-5' 1. replikáció

2. replikáció

A genetikai kód tulajdonságainak ismertetésére a fehérjeszóló fejezetbeo kerül sor. A kereteltolódás megértéséhez csupán a genetikai kód azon tulajdonságát kell figyelembe venni, hogy három egymás mellett levő nukleotid (kodon) kódol egy aminosavat és a kodonok fo lyamatosan, közbeiktatott nukleotid nélkül ("vcsszőmentesen") követik egymá t. Ha egy n számú kodont tarta lmazó sorból kiesik egy nukleotid, ez a mutáció hel yétől kezdődően eltolja a trinukleotidok keretcit és ezért a mutációtól disztálisa n minden kodon megváltozik. Ugyanez történik akkor is, ha egy számfeletti nukleotid beépi.ilése okozza a tri nuk leotidok kereteinek elcsúszását. sz intézi sről

Deléciót idézhet el ő a depurinizáció, mert az ilyen sérülést tartalmazó mintáról történő szintéziskor a depurinizáció helyén a DNS-polimeráz egy nukleotidot nem épít be az új száJba. Inzerciót okozhatnak bizonyos aromás gyűrüs molekulák (pl. akridin festékek). Ezek beékelödnek a DNS szomszédos báz ispárjai közé (interkaláció) és megzavatják a DNS-polimeráz működését, amely ezeken a helyeken egy számfeletti nukleotidot épít be az új láncba.

Napja inkban rengeteg kémiai anyagot használunk gyógyszerként, élelmiszer-ipari adalékanyagként, kozmetikai- és háztartási szerként, mezőgazdaságba n gyomírtáként stb. amelyek szervezetünkbe kerülnek. Ezért még akkor is, ha ezen anyagoknak rövid idő alatt nincs egészségkárosító hatása. tudnunk kell, hogy nincs-e genetikai károsodást előidéző vagy karcinogén hatása. A prokarióta sejtekben könnyen kimutatható rnutagén hatás és a karcinogén hatás közölt szoros az összefiiggés. A mutagén hatás kimutatásának az egyik legegyszerű bb módj a az Ames-próba.

Az Ames-próba az ún. szuppresszor mutáció jelenségén alapul. Szuppresszor mutációnak nevezzük azt a második mutációt, amelyik az el ső mutáció által okozott genetikai változás megnyilvánulását megszűnteti. A második mutáció szuppresszor hatásának a mechanizmusa igen sokféle lehet, történhet az e l ső mutációval érintett génben vagy azon kívül. Az Ames-tesztben használt (Salrnonellák közé tartozó) laboratóriumi baktériumtörzs egy genetikailag pontosan feltérképezett mutáció következtében elvesztette azt a képességét, hogy hisztidint tudjon e lőállítani ún. hisz-

DN :REPLIKÁCIÓ ÉS Hl BAJ VÍTÁS

3-17. ábra. Kereteltolódáss al járó mutációk

5' TTT,TC T ICCAIG T ~A 3' 3' AAAAGAGGT CAAT 5'

DNS

5' u uuluculccA!G u u !A 3'

mRNS

NH2 -

P he

Se r

Pro

Val

-

COOH

deléció és kereteltolódás

(---.)

5' T T T IT T C ICA GITT A l 3' 3' A A A A A GG T C AAT 5'

DNS

5' uuul u u c !cAG!uuAI 3'

mRNS

NH2 -

P he

* P he

•

* Glu

* Le u

-

COOH

DNS

5' u u u l G) u e iu c e iA G u l u A 3'

mRNS

tidinhiányos mutáns. Ez a baktérium csak akkor növekszik, ha táptalajában hisztidin van. Mutagén anyag hatására igen ok é sokféle mutáció alaku l ki, ezek között lehet olyan szuppresszor mutáció is, amelynek következtében a baktérium ismét képes lesz hisztidint előáll ítani és kívülről adott hisztidin nélkül szaporodni. (A használt baktériumtörzs repair rendszere szándékosan tönkre van téve ' hogy a mutagén anyag á ltal okozott DNS-vá ltozás ne kerüljön javításra, és a baktérium felszínérő l hiányzik a lipopoliszaharid réteg, hogy a vizsgált anyag könnyebben bejusson a baktériumba .) Az Ames-próba lényege annak v izsgálata, hogy egy kérdéses anyag hatására l 09 hisztidinhiányos baktériumból hány alakul át hisztidint terme lni képes baktériummá, azaz hány baktérium lesz képes szaporodni hisztidin nélkül. A zervezctünkbe kerülö anyagok egy része eredeti romlájában nem karcinogén, azonba n a máj biotranszfom1ációs enzimeinek a hatására átalaku lhat mutagén hatá úvá. Ezért az

o

Phe

fehérje

inzerció és kereteltolódás (+----)

5' T T~ g T c iT c c l A G TI T A 3' 3' AA C AGAGGT CA AT 5'

NH2 -

fehérje

Val

o

o

Se r

Ser

-

COOH

fehérje

An1es-próbában használt anyagok induká lt citokróm P450 rendszert tartalmazó májkivonattal történt kezelése után is megviz gálják azok mutagén hatását.

Rekombináció Rekombinációnak nevezzük egy új DNS-molekula képződését különböző eredetű DNS-darabokból. E tág meghatározá on belü l az á lta lá nos genetikai r ekombináció a homológ DNS-szakaszok cseréjét jelenti két kettős szálú szülői DNS között, ennek létrehozásában speciá lis enzimrendszerek vesznek részt. A rekombináció fogalomkörébe tartozó más fo lyamatok nem homológ DNS-szakaszokat érintenek. Ez utóbbiak közé tartozik pl. a tra nszp ozíció, azaz egy gén mozgása egyik DNS-molekuláról a másikra, vagy ugyanazon kromoszóma egyik hel yéről a má ikra (a transzpozonoknak nevezett mobil genetikai e lemeket a bakteriá lis plazm idok ismertetésekor említet-

354

~••mmm>»»>>»»»»>»»>»»»>»»»>»»»m•»»>»>»)l>»»»»»»>»»>»

tük). Rekombiná ciós folyamat a működökép es immunglob ulin gének kialakulásá nak mechanizmusa, a vírusokból származó DNS integrálód ása a gazdasejt genomjába (lásd vírusokró l szóló fejezetben) és a laboratóriumi DNS-techn ika (lásd a hasonló című a lfejezetben ) is. A rekombináció létrehozhat új génkombinációkat, illetve a génátrendeződésnek szerepe lehet a génexpress zió szabá lyozásában is. Itt csupán az á ltalános genetikai rekombiná ció repairben játszott szerepét hangsúlyozzuk. Ha a DNS egy szakaszán mindkét láncot károsodás éri, a hiba a már ismert repa ir rendszerek ke l

G ENET IKA I INFORMÁC IÓ TÁROLÁSA ÉS KI F EJ EZŐDÉ E

nem j avítható, mert nincs olyan ép szülői lánc, amely a javításhoz mintaként szolgálhat. Hyenkor a sérült DNS-mo lekula és a homológ szakaszt tartalmazó ép DN S-mole.kula közötti általános genetikai rekombinác ió l ehetőséget teremt a repairre. A z érintett helyet tartalmazó homológ DNS-szakaszok egyik láncának cseréje egy ép láncdarabo t j utta t a sérült DNS-be, és így az ép láncok alapján a hiba m ár 1nindkét DNS-rnole ku lában javítható. Különösen gyakori ez a folyamat a replikáció során kialaku ló két azonos kromatid között, ha valamilyen mutagén hatá éri a ejtet (testvérkro matid csere).

RNS : transzkripc ió és szabályozá sa

3.2.

FaragóAnna

Az RNS típusai Prokariótákban é eukariótákban, amelyekben a genetikai információt hordozó anyag (a genom) DNS, a kettős szálú DNS egyik láncáról a komplementaritás elve alapján átíródó, majd a szintézis után még bizonyos módosulást szenvedő ribonukleinsavmolekulák többféle típusával találkozunk. A fehérjék szerkezetére vonatkozó genetikai információt a DNS-től a fehérjeszintéz isért felel ős apparátushoz, a riboszomákhoz a mRNS (messenger RNS) szállítja. A ribaszamák szerkezetének részét képező RNS-molekulákat rRNS-nek (riboszóma-RNS) nevezik és a hárombetűs genetikai kódot a megfelelő aminosavszekvenciára átfordító, adapter molekulák a tRNS-ek (transfer RNS). Eukarióta sejtekben a mRNS kialakulása bonyolultabb folyamat eredménye, mint a prokariótákban. Az eukarióta sej tek magjában található bnRNS- (heteronukleáris RNS-) molekulák egy része az érett mRNS-molekulák előanyagának tekinthető. Az snRNS-molekulák (kisméretü nukleáris RNS) az eukarióta rnRNS érésében játszanak szerepet, az scRNS-molekulák (kisméretű cito, plazmai RNS) a szekretálódó fehérjéket szintetizáló riboszómákat irány ítják az endoplazmás retikulumhoz. A ci toplazmai sejtorganellumokban (állati sejtekben a mitokondriumokban) levő DNS speciális, a nukleáris eredetűtől eltérő rRNS-eket és tRNS-eket kódol, melyek az organellumon belül lezaj ló fehérjeszintézis komponensei.

A ribonukleinsavmolekulák egyes típusai (első­ sorban a tRNS és az rRNS) az adenin-, guanin-, citozin- vagy uracilbázissa l rendelkező ribanukleotidokon kívül még más, módosított nukleotidokat is tartalmaznak (3- J8. ábra). Különösen ok módosított, úgynevezett ritka bázis található a tRNS-ekben, míg az rRNS-ben gyakori a ribózegységek rnetileződése a 2'0H-csopO!ton. A transzkripció során a még nem módosított nukleotidek épülnek be az RNS-be, a nukleotidek átalakulására poszt-transzkripcionálisan kerül sor. A prokarióta és az eukarióta erederu RNS eddig ismert formái egyszálúak és lineárisak. Elsődleges szerkezetüket a meghatározott bázisszekvenciával rendelkező, foszfodiészterkötésekkel összekapcsolt polinukleotid-lánc jelenti, ezen túl másodlagos, bizonyos esetekben (pl. tRNS) harmadlagos szerkezettel is rendelkeznek. A bázisok között fellépő intramolekuláris kölcsönhatások helikális szakaszokat vagy hajtűszerű képződményeket hozhatnak létre. Hajtű szerű képződmények ottjönnek létre, ahol a molekulán belül komplementer b~zisszekvenciájú szakaszok találhatók. Ezek egymással a bázispárosadá nak megfelelően hidrogénh idakat képezve, rövidebb-hosszabb kettős hélix szerkezetet alkotnak, melynek egyik végén a nem komplementer bázi okat tartalmazó nukleotidek gyakran burkot formáinak. A nem komplezerkementer szakaszokon kialakuló helikáli zetet az adenin-, guanin- és citczinbázisok közötti, nem hidrogénhidakból álló kölcsönhatások hozzák létre (3- 19. ábra).

356

GENETIKAI INFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KI FEJEZŐ DÉSE

»»»»»»»»>»>»»»»»»»»»»>»»>»»»»»>»»»»»»•>H»>»»»»»>»>

o

ll H C-N

/ 2 .3 \ 4C=O \6 s/

HN 1

c===c

o

o HOCH2

OH

OH

OH

5,6-dihidrouridin (UH2)

OH

5-metil-uridin (ribotimidin) (T)

CH3

o

~N

HN;l3~9 'll ') N

OH

N

'\. / N

pszeudouridin ('l')

CH3

N~r) ~ ~3~9

o

X~')

5

8

11

N

"N

~3~9

CH -N

N

l

3

o

OH

N

CH3

o

HOCH2

HOCH2

OH 6

OH 6

N , N -dimetiladenozin (m~)

3-18. ábra. Módosított bázisokat tartalmazó nukleozidok

OH 2

OH 2

N , N -dimetilguanozin (m2G)

R.!~S: TRANSZKRJPC IÓ ÉS SZABÁLYOZÁSA

~))))))) )))))))))))))))))))))))})))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))}))))))))))))))))))))))

3-19. ábra. Az élesztősejtből izolált tRNSAla bázisszekvenciája (a) és térbeli szerkezete (b)

r

a

3' OH

357

aminosav

kötődésének helye

© fJ0

foszforHált 5' vég

------- 5'

p

c pszeudouridinhurok

pszeudouridin

antikodon

IV. pszeudouridinhurok

~~

antikodonhurok

-

IL

J

358

,.",",,,,,",,".,".,mn>>m»>»»>»>>mmm>»>»>>»»m»>>>""''"'"'"'

A transzkripciós egység és a transzkripció menete prokariótában A prokarióta és eukarióta genomról folyó transzkripció során másolás c ak a kettős szá lú DNS bizonyos, meg határozott szakaszainak egyik száláról történik, ez a lánc szolgál az átíródás mintájául (template). Az RNS szintézisének iránya 5'~3', a minta leolvasása 3'~5' irányban történik. A komplementaritás elve alapján szintetizálódó RNS-molekula palaritása és bázisszekvenciája azonos lesza mintául szolgáló DNS-szállal komplementer másik DNS-lánccal (azzal a különbséggel, hogy a DNS-ben taláLható timintartalmú nukleotidok helyét az RNS-ben uraciltartalmú nukleotidok foglalják el). A két DNS-szál közül, megegyezés alapján, pozitiv, kódoló (sense) szálnak azt nevezik, amelynek bázisszekvenciája megegyezik az RNS bázisszekvenciájával, a mintául szolgáló DNS-lánc a negatív (template, antisense) szál. (Egy génszakasz szekvenciájának leírásakor, ugyancsak megegyezés szerint, csak a pozitív szálnak megfel elő szekvenciát adjuk meg, balróljobbra 5'~3' irányban). A genomon az egyes transzkripciós egységek orientációja különbözhet egymástól. Míg a DNS bizonyos szakaszán elhelyezkedő egyik transzkripciós egy ég számára az egyik DNS-szál tartalmazza a pozitív szálat, egy másik DNS-szakaszon elhelyezkedő, másik transzkripciós egység számára a pozitív szá lat a másik DNS-lánc jelenti. A cirkuláris prokarióta genomon az óramutató j árásával megegyező irányú a transzkripció a genom egyik szakaszán, míg egy másik szakaszon, ahol a másik DNS-lánc jelenti a pozitív szálat, a transzkripció az óramutató járásával ellentétes irányban folyik. A DNS-dcpenden RNS-polimerázok a DNSminta jelenlétében, azzal komplementer, antiparallel RNS-láncot szintetizálnak a négyféle ribonukleozid-trifoszfátból (NTP-ből , azaz ATP-ből , GT P-bő l , CT P-bő l és UTP-ből) . A reakcióhoz Mg1+ -ionok is szükségesek. Az RNS-polimeráz hatására egy ribanukleotidegység szabad 3 'OH-csoportja és a belépő, új riba nukleotid egység 5' -foszfátja között foszfodiészterkötés alakul ki, miközben egy pirofoszfá t lehasad:

GEN ET l KAl INFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFE.JEZÖDÉSE

RNS(n nuklcolldcll)'ség)

+ NT P ~ .RNS(n+ l nuklcoudcgys~g) + PP,

Az RNS-polimerázoknak, a DNS-polimerázokkal ellentétben, nincs szükségük indító láncra. Az RNS-polimerázok abban is eltérnek a prokarióta DNS-polimerázoktó l, hogy nincs nukleáz aktivitásuk, ezért a szintézis közben bekövetkező esetleges hibákat nem képesek javítani. Az RNS átirása a DNS-ről ezért nem történik annyira hűen, mint a DNS replikációja, viszont ez nem is okoz olyanjelentős károsodást, mint a DNS szintézisében bekövetkező esetleges hiba, hiszen egy RNS-molekula hibáját · egy következő RNS-molekula helyes transzkripciója hatástalanítja. A prokarióta RNS-polimeráz szerkezetét és müködését az Escherichia coli nevű baktériumból izolált enzim vizsgá latából ismeijük. Az E. coli DNS-dependens RNS-polimeráz több alegységből épül fel. Az ún. "core" enzim négy alegységből áll, cx.2PW szerkezetű, a P' a DNS-hez való kötődésben, a Pa nukleozid-trifoszfátok kötésében játszik szerepet. A "core" enzimet egy szigmaalegységnek nevezett fehérje egész!ti ki holoenzimmé. A szigma- alegység feladata a transzkripció specifikus iniciációs helyének a felismerése a DNS-en. A transzkripció specifikus iniciációs helyét tartalmazó DNS-szakaszt promoternek nevezik. A szigma-alegy ég fe l e l ős azért, hogy az RNS-po limeráz a promoterszakaszon kötődjék a DNS-hez és a megfel elő helyen kezdje el a másolást, csak az egyik láncról és c ak egy irányban. A szigma-alegység a promoteren l evő specifikus bázisszekvenciát ismeri fel. A prokarióta genom minden transzkripcióra kerül ő egysége egy promoter régióval kezdődik (a pozitív DNS-szálat véve alapul, a promoter a transzkripciós egységek 5'-végén található). A promoter régió nem kódol feh érjét hanem a DNS-dependens RNS-polimeráz bekötődésén ek helyét tartalmazza, és ezen kívül elhelyezkedhetnek raj ta még más specifikus báz isszekvenciák is, amelyekhez olyan fehérjék kötődnek, amelyek a transzkripciós egység átíródásának a sebességét befolyásolják. A promoter régiót követik a transzkripciós egységen a struktúr gének. Struktúr géneknek nevezzük a genom azon szakaszait, melyek egy-egy adott polipeptidláncot kódolnak. Az egy-egy polipeptidlánc szintéziséért felelős DNS-szakaszok zerkezete a prokarióta genomban

RN : TRAN ZKRJPCIÓ É

ZABÁLYOZÁ A

folytonos, ezeket cisztronokna k is szokták nevezni. A prokarióta genomban egy-egy polipeptidlánc struktúr génjébő l (cisztronjából ) csak egy talá lható. Jellegzetes prokarióta saj átosság - eukariótában nem fordul el ő - a policisztronos transzkripciós egység. Ez azt jelenti, hogy prokariótákba n gyakran egyetlen promotertő l kiindulva, folyamatosan kerül transzkripcióra egy több polipeptidlánc szerkezetét kódoló mRNS (policisztron os mRNS). (Prokariótákba n gyakran, de nem mindig, egy-egy azonos anyagcsereúthoz tartozó több vagy összes enzimet egy-egy hosszú, policisztronos mRN S kódol). A különböző transzkripc iós egységeket irányító promotereken az RNS-po limeráz bekötődésére szolgáló szekvenc iák hasonlítanak egymásra (hasonlítanak az ún . "consensus"-szekvenc iához), de nem teljesen azonosak egymással (3-20. ábra). Azokat a promotereket, ame lyeknek szekvenciája megegyezik a "consensus" szek venc iával, erős promoterekne k, ame lyeknél e szekvenc iákban előfordulnak k isebb-nagyob b e ltérések, gyengébb promoterekn ek nevezik, az e lté rés mértéke szerint.

nuk leotidokat negatív számokkal, a startponllól lefelé található nuk leotidokat pozitív számokkal szokták jelölni. A prokarióta promoteren a + l -es nukleotidtól fel felé kb. 1O és kb. 35 bázispámy ira két "con ensus" szekvencia talál ható, a - 10-es szekvencia (Pribnow boxnak i nevezik) TATAAT és a - 35-ös szekvencia TTGACA (3-20. ábra).

A promoter erős vagy gyenge karaktere már önmagában is meghatározha tj a az álta la irány ított s truktúrgén ekrő l fo lyó transzkripc ió sebességét. Az erős promoterek iránt az RNS-polimeráz szigma-alegysége nagyobb affinirást mutat, mint a gyenge promoterek iránt, gyakrabba n bekötödik ezekhez a promoterekhe z az RNS-polimeráz, mint a gyengébbekh ez, ezért időegység alatt több mRNS szintetizálódik az erős promoterekke l rendelkező transzkripciós egységekről , mint a gyengébb promoterek irányítása alatt á llókróL Ha kizárólag a promoter gyenge vagy erős karaktere befol yásolja az RNS-polimeráz bekötődését és az RNS-szintézis sebességét, konstitutív mRNSszintézi sről (és azt követően konstitutív fehérj eszintézi sről) beszélünk. A konstitutív szintézis azt j e lenti, hogy a prokarióta sej t é letciklusa alatt az ill ető mRNS (fehérje) egyenl etes sebességgel szintetizálódik. Konstitutív erős pro moterre l rende lkező struktúrgén egyen letes ütemben sok fehérjemolekula szintézisét, a konstitutív gyenge promoterrel rendelkező struktúrgén egyenletes ütemben szintetizálódó , kevés fehérjemo lekula képződését teszi lehetövé.

A promoter régió nem átíródó szakaszát követő, átíródó zakasza scm kódol még polipeptid láncot, a m RNS 5'-végén ezért a struktúrgénekről á tíródó szekvencia előtt , egy néhány nukleotidból álló nem kódo ló szakasz található. Az el ső át~ródó _nuk leotidnak megfelelő nukleotidot szokták + 1-gyel Jelölm, ez a transzkripció startpontj a. A startponttól felfelé (a transzkripciós egység + D S szálának 5' -vége felé) levő

3-20. ábra. A prokarióta promoter

B

C

A, B, C struktúrgének

promoter A 5'-..__. _ ________ _____. . _ -- 3· +DNS

3' ------..-.......v--......--.v--...--.._j...-.....__,.,..

5' -DNS (templát)

-35 ...-10 ... +1

5'

-t-----J- --- 1-----1-- 3' a

b

c

mRNS

A szigma-alegység által felismert promoter szekvenciák Standard consensus szekvencia 5'

fVVVV"

TTGACA -35

JVVVV\/VV'

TATAAT -10

·,

~

3' (+DNS)

360

»>>>»»»»>»>»>~>»>»»>>»»>•m»»n>»»I>»>>»>>»>»»>H»»>m••n»>m>

GE NETIKAJ INFORM ÁCIÓ TÁ RO LÁSA ÉS Kl FEJ EZŐDÉSE

Az Escherichia coli baktériumban találtak o lyan transzkripciós egységet is (ún. hőshock fehé1jék génjeinél), amelyek prorooterei más faj ta szekvenciákat tartalmaznak. Ezen gének transzk ripciójához az E. coli baktérium egy másik szigma-fakto rt is tartalmaz.

A transzkripció a transzkripci ós egység 5' -végén, az RNS-polimeráz pro moteren történ ő bekötődéséve l és a transzkripció iniciációjával kezdő­ dik, az elongációval folytatódik, s a transzkripciós egység átírása után, annak 3' -végén tenninálódik. Az iniciáció e lső lépése, az RNS-polimeráz heloenzim bekötődése a promoterhez, egy zárt promoter kempiexet eredményez. Ennek átalakulása hozza létre a nyitott promoter komplexet, melyben a DN S kettős l á nc széttekeredik egy rövid szakaszon. A széttekeredés szükséges ahhoz, hogy a mintaszálról a komplementer RNS-lánc szintézise megindulhasson. Az újonnan szintetizá lódó RNS-be be lépő első nukleotid általában purinbázist tartalmaz, az RNS 5' -végi nukleotidja vagy pppA vagy pppG. A z iniciáció befejezését az el ső, láncvégi nukleozid-trifoszfát 3 ' OH-ja és a bel épő második nukleotid 5' 0 H-ját észteres ítő foszfát közti foszfodiészterkötés kialakulása jelenti. Ezután a szigma-faktor disszociál a komplextől , s a transzkripció elongációját az RNS-polimeráz "core"-enzim folytatja tovább. Az elongáció a szintézis helyén a DNS kettős­ lánc rövid szakaszának folyamatos széttekeredésével, a - DNS szál és a vele komplementer naszcen s RNS közti hibrid kialakulásával, majd az RNS leválásával és a DNS visszatekeredésével jár. A DNS rövid szakaszán a DNS széttekeredése és a

hibridképződés

következményeként kialakuló "transzkripciós buborék" halad lefelé a transzkripciós egységen a pozitív DNS-szál 5' -végétő l a 3' -vége felé (3-2 1. ábra). Minthogy a prokariótáknak nincs sejtrnagjuk, prokariótákban a transzkripció és transzláció térben nincs szétválasztva. A nascens mRN S 5' -vége felől a mRNS-ről már elő bb megindul a polipeptidlánc szintézise, még miel őtt a mRNS 3' -vége teljesen megszintetizálódna. A transzkripció terminációját némely esetben kizárólag a transzkripciós egységek végén (a +DNS szál 3 -végének m egfel e l ően) e lhel yezkedő specifikus term inációs nukleotidszekvencia segíti elő, míg más transzkripciós egységek transzkripciójának tenninációjához a terminációs szekvencián kívül még egy rho-fehérjének nevezett terminációs faktor is szükséges. A transzkripció terminációjakor az RNS-DNS hibrid disszociál és az RNSpolimeráz leválik a DNS-rő l. A rho-fehérjére nincs szükség akkor, ha a transzkripciós egység olyan terminációs szekvenciával rendelkezik amely az RNS-re átíródva annak 3'-végén haj tűszerű képződményt hoz létre. A termináció érdekessége, hogy a terminációt előidéző aktív jel mindkét esetben az RNS-en jön létre. A rho-fehérje az RNS-en ismeri fe l a terminációs szekvenciákat és a rho-independens termináció is akkor következik be, amikor a terminátor szekvencia átíródott az RN S-re. A hajtüszerü képződmény kialakulása egy speciális RNS-szekvencia következménye. A transzkripciós egység végén, az utolsó vagy egyetlen struktúrgén után elhe lyezke-

3-21 . ábra. A transzkripciós buborék

RNS-polimeráz

3'

_. 5'

elongáció helye RNS-polimeráz mozgásának iránya

RJ S: T RANSZKRIPC IÓ ÉS SZABÁLYOZ ÁSA

DNS

. ..

GC-

gazdag régió

-; ....

AT·

gazdag régió

-''-

+

l l

C C C A C A

p

T T C C G c T G G c G G c A T T T T A A C T T T C T T T A A T G A

G G G T G T c G G c G G T c A A G G C A

r

C

c '-'

T A A A A T T G A A A G A A A T T A C T

l l

3-22. ábra. A transzkripci ó terminációs szekvenciája és a stabil hajtüszerű szerkezet a mRNS végén (E. coli triptcfán operon)

mRNS

5'

l

c c c A c u G c c G c c A G u u c c G c u G G c G G c A u u u

/c~

u

c

(

)

U G "-...G•C/

y

l l

OH

A•U

3'

l l

c ·G l l C·G l l G•C l l C•G l l C •G l l G •C

5' - C - C - C - A - c - u ..J '-- A - U - U- U- U- OH 3'

dö. már nem kódoló D S GC-gazdag régiójában l evő palindrom zerkezetet AT-ben gazdag régió követi. A palindrom szerkezet olyan DNS-szekvenciákat jelent, amelyek az egyik DNS-száJon balról jobbra és a komplemente r D S-szálonjobbról balra olvasva azonosak. A transzkripció terminációját e l őidéző, viszonylag hosszú palindrom szekvencia átíródása az R S-re, azon egymással komplementer szakaszokat eredményez. A komplementer bázisok között az RNS-molekulán belül kialakuló hidrogénhidak hozzák létre a hajtüszerü képzödményt, amelynek 3' -végén néhány uraciltartalmú nukleotid található. Ez a képzödmény megakadályozza az R S további átíródását és leválasztja az RNS-t a DNS - rő l (3-22. ábra).

Riboszóma -RN S gén (a fehérjék struktúrgénjeivel ellentétben) nem egy, hanem több van a prokarióta genomban (E. co liban pl. 7 ilyen gén talá lható). A riboszóma- RNS génről átíródó RNS még nem a kész rRN S, hanem az elsődleges transzkriptum további módosuláson rnegy keresztül, hogy kialakuljon az érett rRNS . Ugyanez vonatkozik a tRNS-re is. Prokariótában háromféle érett rRNS-t ismerünk, ebből kettő, a 23S rRNS és az 5S rRNS (nagyságukat szedimentá ciós koefficiensük alapján határoz-

362

»>>~»»»»>~»»»»>»»»»>»»>>»>>»»>>>»>>»»>>>»»>»»>»>»>»»»>»>»>

zák meg), a riboszóma nagy alegységéhez tartozik, a 16S rRNS a kis alegység komponense. E. coliba n a háromféle rRNS a megfelelő transzkripciós egységrő l nem külön-külön, hanem egy hosszú, folyamatos e l sődleges transzkriptum formájában szintetizálódik. Ez az el sőd l eges transzkriptum tartalmaz még egy tRNS-nek megfelelő szakaszt is, és a különböző rRNS molekuláknak, illetve a tRNSnek megfelelő szakaszokat közbeeső RNS-szakaszok ("spacer régiók") választják el egymástó l. Más transzkripciós egységekrő l többféle tRNS szintetizálódik hason ló módon, hosszú, elsődleges transzkriptumként. A riboszóma-RNS-eket kódoló transzkripciós egységek promctere erős promoter. Az elsődleges transzkriptumból a megfeJelő darabok kimetszése nagyon precízen történik. Ebben a kimetszésben egy kisméretű RNS is szerepet játszik, amely bizonyos esetekben fehérje nélkül is képes katalizálni az el sődleges transzkriptum hasítását. (Az ilyen enzimszerűen viselkedő RNS-t nevezik ribozimnek. A ribozimek felfedezése komoly érvet jelent amellett, hogy az élet keletkezése során a l egős ibb információs makromolekula az RNS volt.) Az e lsőd leges transzkriptum hasításán kívül a rRNS és a tRNS még más módosulásokon is keresztülmegy. A rRNS házisai közül némelyek metilálódnak, a tRNS-ben a metilált bázisokon kívül még más, speciális módosulások is előfordul­ nak, így a ritka bázisok sorába tartozó, timin, hjpoxantin utólagos módosulással alakul ki a tRNS-ben (lásd a 3-18. és 3-19. ábrákat is), és posztszintetikus módosulás a pszeudouridin szerkezet kialakulása is. A tRNS-ek 3' -végére ugyancsak utólag kerül a tRNS-re jel l emző CCA nukleotidhármas.

A transzkripció szabályozása prokariótákban Prokariótákban a mRNS életideje rövid (a félpercekben mérhető), és a fehérjék proteolitikus bontásának a sebessége kicsi. A prokarióta sejtben található egyes fehérjék mennyiségét ezért el sősorba n az azokat kódoló mRNS-ek transzkripciójának a sebessége befolyásolja. A transzkripció sebessége általában a transzkripció iniciációjának a sebességével szabályozódik, de ismerünk példát é letidő

C ENETIKAI INFORM.ÁC IÓ T ÁRO LÁ SA ÉS Kl FEJ EZŐDÉSE

a tJ:anszkripció idő előtti tenn inálódásával működő szabályozási mechanizmusra is. Konstitutív mRNS-szintézis esetén a promoter erős vagy gyenge jellege meghatározza, hogy idő­ egység alatt sok vagy kevés mRNS szintetizálódik, de a konstitutív szintézis nem reagál a környezet, a baktérium számára hozzáférhető tápanyagok minőségének vagy koncentrációjának változásaira, a szintézis üteme a sejt élete folyamán egyenletes. A prokarióta genom transzkripciós egységeinek egy nagy részéről azonban nem folyik állandó, konstitutív mRNS szintézis, hanem a környezeti változásoknak megfe lelően a transzkripció időnként meggyorsul, máskor nem vagy alig folyik. Ezekben a transzkripciós egységekben a transzkripció iniciációjának sebességét bizonyos regulátor fehérjék szabályozzák, amelyek a transzkripciós egység promcterén vagy a promoter- és a struktúrgének között levő DNS-szakaszon elhelyezkedő specifikus DNS-szekvenciákat felismerve a DNS-hez tudnak kötődni és az RNSpolimeráz tevékenységét befolyásolni képesek. A regulátor fehérjéknek legtöbbször allosztérikus ligandjaik vannak, amelyek a regulátor fehérjéhez kötődve, és annak konformációját megváltoztatva pozitív vagy negatív irányban befolyásolják a DNS-hez való kötődés képességét. A környezet, a táptalaj változásait az allosztérikus ligand megjelenése, koncentrációjának emelkedése vagy csökkenése j elzi a regulátor fehérje számára. A regulátor fehérjét kódoló gént, amely elvileg a genomon bárhol, sőt (például kísérletes úton parciálisan diploiddá változtatott prokariótában) egy másik DNS-molekulán is elhelyezkedhet, transz-regulációs elemnek nevezik. A regulátor fehérje szerkezetéért fel e l ős struktúrgén (transz-elem) azért helyezkedhet el bárhol a DNS-en vagy akár egy másik DNS molekulán is, mert a regulátor fehérje a citoplazmában szintetizálód ik, sa citoplazmán keresztül haladva elérheti a számára specifikus DNS-szekvenciát, amelyhez kötődni képes. Azoknak a DNS-szakaszoknak azonban, amelyekhez egy ilyen regulációs fehérje kötődik és ilyen módon befolyásolja az adott transzkripciós egység transzkripciójának sebességét, a transzkripciós egységgel azonos DNS-molekulán, pontosan meghatározott helyen kell lenniük. Ezeket a DNS-szakaszokat nevezik cisz-regulációs elemeknek. Ezek nem kódolnak fehérjét. Prokariótákban a

RJ S: TRANSZKRIPC IÓ ÉS SZABÁLYOZÁSA

cisz-elemek az általuk reguláit transzkripciós egység közvetlen közelében, annak promcterén vagy a promoter- és az azt követő struktúrgének között foglalnak helyet. A prokariótákban e l őfordu l ó, transzkripciót szabályozó fehérjék egy csoportját represszor fehérjének nevezik. Egy-egy represszor fehérje az esetek többségében csak egyetlen transzkripciós egység müködését szabályozza, mégpedig azt, amelynek promoteré n, iIletve p romotere és az azt követő struktúrgének között egy bizonyos, csak az illetőrepresszo r fehérj e által fel ismerhető, specifikus bázisszekvenciával re n delkező cisz-regulációs elem, az operátor található. Az egyik vagy másik traoszkr.ipciós egységet szabályozó, egymástó l eltérő szerkezetü represszor fehérjék közös sajátossága, hogy saját operátor régiójukban a DNS-hez kötőd ve az érintett promoterről induló transzkripciót meggátolják. Az egy bizonyos bázisszekvenciájú operátor és az ahhoz kötődö specifikus represszor fehétje szabályozó tevékenysége alatt álló transzkripciós egységet nevezik operonnak. (Legtöbbször egy-egy policisztronos egységrő l van szó.) A ki.i lönböző policisztronos operonole általában egy-egy anyagcsereút egymást követő enzimeinek struktúrgénjeit tartalmazzák és azok transzkripciójának koordinált szabályozását teszik lehetövé. (A legjobban ismert operonok közé tartozik pl. a laktóz metabolizmusában részt vevő enzimeket kódoló laktóz operon, az arabinóz nevü cukor metabolizmusában részt vevő enzimek szerkezetéért fe le lős arabinóz operon, a galaktóz átalakulását katalizáló enzimek génjeit tartalmazó galaktóz operon vagy a triptcfán bioszintézisééit felelős enzimek génjeit tartalmazó triptcfán operon stb.). A represszor fehétj ét magát kódoló struktúrgén, a regulátor gén transz-elem, a reguláit transzkripciós egységen kívül helyezkedik el a DNS-en, saját (gyakran konstitutíven müködő, gyenge) promoterrel rendelkező, önálló transzkripciós egységként. A represszor fehérje megfel e l ő formája igen nagy affinitással kötődik a DNS-hez a számára specifi kus operátor régióban, ezért az egyik vagy másik represszor fehérj ébő l sejtenként már néhány molekula is elegendő a szabályozáshoz. A represszor fehérjék működésének módja különbözik aszerint, hogy a környezetben nem mindig jelen levő, de időnként megj e lenő tápanyag, illetve a

baktérium számára mérgező anyag lebontásában szerepet j átszó enzimek operonjának működ ését szabályozzák, vagy egy, a baktérium által elöál lított anyag például egy am inosav bioszintézisében részt vevő enzimek génjeinek transzkripcióját reguláiják A lebontó fo lyamatokat katalizáló enzimrendszerek (ún. adaptív enzim rendszerek, induktív enzimrendszerek) génjei által alkotott operonole operátor régiój ához a specifi kus represzszor fehé1j e csak szabad formában vagyis csak akkor képes kötődni és a struktúrgének transzkJ·ipciój át megakadályozni, ha a kérdéses tápanyag, illetve a baktérium számára mérgező anyag nincs jelen. Ilyenkor ezekre az enzimekre egyáltalán nincs szükség, esetleg néhány molekula terme l ő­ dik bel ől ük a sejtben. A lebontásra váró kis molekulatömegü anyag (esetleg a1mak valamilyen közvetlen származéka) az induktor molekula, ez a megfel el ő represszor fehétj ének az allosztérikus ligandj a. Ha az induktor megjelenik a környezetben, majd azt követően a prokarióta sejt belsejében, kötődik a számára specifikus rep resszor fehérj éhez és kialakul az induktor- represszor komplex. Az induktor által okozott konformációváltozás következtében a represszor fehérje már nem kötőd ik a DNS-hez, ezért az operátorról disszociál. Ha a represszor disszociál az operátorró l, az érintett operon a transzkripció gátlása (a represszió) alól felszabadul. Megindul az egységhez tartozó struktúrgének transzhipciój a, majd ennek következményeként az érintett enzimek szintézise. A táptalajban új onnan megjelenő a nyag lebontásához szükséges enzimek ezért rendelkezésre fognak állni (a prokarióta sej t adaptálódik a környezet változásához). Egy-egy enzim vagy enzimcsoport szintézisének szelektív fokozódása az indukció. Az operátorhoz kötődö represszor fehérje RNS-polimeráz müködését gátló pontos mechanizmusa operononként valamelyest különbözhet. Az induktív szabályozás egyik legjobban ismert pé ldáj át muta tó laktóz (!ac-) operon el rendeződé­ sét, a promote r szerkezetét és az RNS polimeráz működését sztérik usan gátló lac-represszor elhelyezkedését az operátor régión a 3-23. ábra szemlélteti. Bioszintetikus utak enzimei génjeinek szabályozásánál az érintett operon represszor febérjéje másképpen viselkedik. Ezeknél az anyagcsereutaknál a reguláció célj a az, hogy az alapállapotban funkcio-

364

GENET IKAI i NFORMÁCIÓ TÁ ROLÁSA ÉS KI FEJ EZŐDÉSE

•

A transzkripciós egység szerkezete 5' 3'

Ip' il e oil z ~

'i

l

3' 5'

a

start helye

~

~ mRNS

imRNS

z

~

y

a

o

~ffi

lac represszor fehérje 5' 3'

I p'

5' 3'

IP

il

p

&El z

y

a

l

p

o

lz

y_

a

induktor

•• •

1

i

ffi

b

A lac promoter nukleotid szekvenciája 5' TTACAC ~ TATGTT ~ 3' - 35 régió Consensus

-10 régió (erős

promoter) szekvenciája

5' TTGACA ~ TATAAT ~ 3'

- 35 régió

- 10 régió

A cAMP- CAP komplex, az RNS-polimeráz és lac represszor helye a promoter-operátor szakaszon

l

~start mRNS

z

~

+1

-87 cAMP-CAP -49 -48 RNS polimeráz +5 -3 represszor +21

._....

átfedés

3-23. ábra. A laktóz (lac-) operon szerkezete és működé­ sének szabályozása. (a) A laktóz operonban (a +DNS szál 5 '-végétő/ a 3'-vég felé) a promoter (p) és operátor (o) után következnek a koordináltan szabályozott struktúrgének, ezek a ~-galaktozidáz (z), a permeáz (y) és transzacetiláz (a) enzimeket kódo/6 gének. Az operátor palindrom bázisszekvenciáját felismerni képes lac-represszor fehérjét kódoló struktúrgén (i) másik transzkripciós egységhez tarlozik, saját promotere (p') van, amely konstitutlv, gyenge promoter. Ezért a represszor fehérjéből egyenletes sebességgel kevés szintetizálódik (a tetrarner szerkezetű fac-represszor fehérjéből mintegy 10 molekula van egy E. coli sejtben). A represszor fehérje affinitása az operátorhoz igen nagy. Az operátor és az RNS-polimeráz bekötő­ désének a helye részben átfedi egymást, tehát ha a represszor fehérje az operátorhoz kötődik, az RNS-polimeráz működése sztérikusan gátlódik. Az induktor (p-galaktozid-származék) kötődése a represszor fehérjéhez (mind a négy alegységhez egy-egy molekula) erősen csökkenti a represszor affinitását az operátorhoz, ezért az induktor-represszor komplex a DNS-ről disszociál. {b) A /ac promoter (p) maga is gyenge promoter, a transzkripció iniciációjának a gyakoribbá téte/éhez, az RNS-polimeráz bekötődé­ sének elősegítéséhez egy másik fehérjének, a cAMP-CAP komplexnek is a promoterhez kell kötődnie. A CAP dirnér szerkezetű fehérje, két molekula cAMP-t köt. A cAMP-CAP helye a promoteren (ugyancsak palindrom szerkezetű), pontosan az RNS-polimeráz bekötődésének helye előtt van (+1 az első átlródó nukleotid helye). cAMP nélkül a CAP nem képes a DNS-hez kötődni l

R ' : T RANSZKR IPC IÓ ÉS ZA BÁ LYOZÁSA

)) ., )))) >) )) )))))) )) )))) >) )) )) )) )) )) )) )) )}l))))))) .. ))))))))))))))))>))))>))))>)) )))))))))>))>)))))>)>))))))) )))))))..

náló operonról ne tötténjen mRNS-szinté zis akkor, ha az operon á lta l kódolt enzimek működésén e k végtennéke fe leslegben van jelen a sejtben. Ezeknek a transzkripc iós egységeknek a represszora önmagában nem tud az operátorhoz kötödni, csak akkor, ha allosztérikus ligandjával, a kor ep reszszor molekulával ke mpiexet képez. A korepresszar a kérdé es bioszintetikus út végterméke. Ameddig ez az anyag a sej tben a szükséglethez képest nincs fe leslegben, a transzkripció foly ik. Ha a korepresszar koncentrác iója a sejtben a szükséglethez képest megnövekszik, kia lakul a rep reszszor- korep resszor komplex, ame ly az operátorhoz kötődve megakadá lyozza az érintett gének transzkripciój át Ennek következmén yeként a bioszintetikus út enzimeinek szintézise leáll (represszív szabályozás). Az aminosavak bioszintézisében részt vevő enzimeket kódoló transzkripciós egységeket nem kizárólag, illerve bizonyo transzkripciós egységek esetében egyáltalán nem represszor fehérjék szabályozzák, ha nem a meginduló transzkripció idő előtti terminációjá nak lehetősége a struktúrgének átíródása e lőtt, a D S-en el helyezkedő, fel tételes terminációs helyként vi el kedő attcnuátor régió segitségével. Az attenuátor a promoter után (a tripiofán operonban a promoter és operátor után), a struktúrgének előtt helyezkedik el. Az attenuátorral történő szabályozás kizárólag a prokarióták aminosav-hioszintézi ében részt vevő egyes bioszintetikus utak (p l. triptofánszintézis, hisztid inszintézis stb.) e nzimei szintézisébe n szerepet játszó mechanizmus, amelyre az ad lehetőséget, hogy a prokariótákban a transzkripció térben é időben nincs elválasztva a polipeptidlánc szi n tézisétől , a transzlációtóL Amennyiben a kérdéses aminosavból elegendő mennyiséggel rendelkezik a ej t, a transzkripció az attenuátor régiónál tenninálódik, és a struktúrgének nem íródnak át. A jelzést nem maga az aminosav, hanem az illető a minosavval töltött tRNS megfelelő mennyisége adja. Ha a töltött tRNS menny isége nem elég nagy a fehéijeszintézi hez, a transzkripció túlha lad az attenuátoron és a struktúrgének átíródnak.

A represszor fehérje-operá tor D NS-szakasz közti kapcsolat az érintett transzkripciós egység negatív szabályozásá t jelenti, minthogy a represszor a transzkripció inic iációját gátolja. A prokarióta transzkripció szabályozásáb an azonban szerepet játszik a pozitív r eguláció is. Ismerünk olyan regulátor fehérjéket amelyek a transzkripció iniciációját elősegítik. Ezek egyik Jegismertebb pé ldája a cAMP-akcep tor fehérj e (CAP). A cAMPakceptor fehérje a llosztérikus ligandja a cAMP. A

365

pozitív szabá lyozá ért, vagyis az RNS-polimerá z e lősegítéséért a cAMP- CAP bekötődésén ek komplex fel elős. A cAMP- CAP komplex ugyancsak specifikus DNS-szekven c iát ismer fel, amely nemcsak egy, hanem több transzkripciós egység promcterén is megtalá lható. Ezekről a transzkripc iós egységekrő l csak akkor foly ik mRNS-szintézis, ha a sejtben a cAMP-ke ncentráció elég magas. A cAMP- CAP komplex álta lában olyan indukc ióval szabá lyozott opere na k transzkripcióját seg íti elő, ame lyek bizonyos, a táptalajban nem á llandóan je len levő, csak id őnként megje lenő cukrok lebon tásáért fel el ős enzimeket kódolnak (pl. laktóz, arabinóz, galaktóz). Ezen operonok működéséhez nem el egendő a specifikus induktor j e le nléte, az opera na k csak akkor m ű ködnek, ha a specifikus induktor és a cAMP is egy id ejűl egje l en van. Ez csak olyankor fordul el ő, ha a táptalajban a megfe l elő cukor megjelenik, de ugya nakkor nincs j elen glukóz. H a a táptalajban glukóz is van, a glukóz transzportja csökkenti a cAMP-szintet, nem a lakul ki a cAMP-CAP komplex, és az illető operon akkor sem müködik (a pozitív reguláció hiánya miatt), ha a másik cukor (pl. laktóz) induk torként a specifikus represszor fehérj ét az ope rátorról e ltávolította (és így a negatív regulációt megszüntette). Ez aztjelenti, hogy a bak térium szíve ebben használja fel a g lukózt a többi cukroknál és csak g lukóz hiányában fa nyalodik másik fajta cukor felhasználására, ame lynek lebontása több új enzim szintézisét i gény l ő, nagyobb energ iabefektetés cl járó fo lyamat. Amennyiben viszont tényleg szükéges a másik cukor fe lhasználása, akkor ezt igen j ó hatásfokka l képes megtenn i. A g lukóznak a többi cukor lebontásáért felel ős enz imek szintézisét gátló hatását (ame ly a cAM P-szint csökken tésén a lapul) katabolitrep resszióna k nevezik. A cAMP- CAP komplex álta l fe lismert specifikus DNS-szakaszt és ennek e lhelyezkedésé t a laktóz (lac) operon promc terén a 3-23. ábra mutatja. A prokarióta transzkripc ió szabályozásáb an részt vevő regulátor fehérjék gyakran o ligamer szerkczetűek és az általuk a DNS-en felismert szekvenciák gyakran szimmetrikus szerkezetű palindromokat alkotnak. A palindrom DNS-szekvenciákban az egyi k láncon, illetve egy vagy néhány nukleotidpár közbeiktatásá val a másik láncon (mindkettőn 5' ~3' irányban, tehát egymás al e ll enkező irányban olvasva) ugyanaz a bázissorrend

·,

GENETIKAI INFORM1\CIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

található. Ez a szerkezet lehetövé teszi a szimmetrikus szerkeze tű oligemerek elhelyezkedését. Bár a prokarióták génexpressziójának szabályozása túlnyomórészt a transzkripció szabályozásán alapul, kivételek is vannak. Ezek közé a kivételek közé tartozik a riboszómafehérjék sz intézisének a szabályozása. A ri beszórnák a baktérium száraztömegének csaknem 40%-át teszik ki , komponenseik szintézisének koordinált szabályozása nagyon fontos . A riboszómafehérjék génjei mintegy 20 kül önböző tran zkripciós egységben lokalizá lódnak, ezen fehérj éknek egymáshoz képe t megfelelő arányban kell szintetizálódniuk. A riboszómafehérjék szintézisének szabályozása főként a transzláció szabályozásának segítségével történik. A riboszóma-RNStranszkrip ciójának szabályozását az ún . sztringens kontroll biztosítja. Ha a baktérium éhezik és nem rendelkezik elég aminosavval a fehérjeszintéz ishez, a tRNS-ek nem töltődnek aminosavva L A töltetlen tRNS kötődése a kész riboszomákhoz egy érdekes nukleotid, a guanozin-3 ',5' -tctrafoszfát (ppGpp) szintézisét idézi elő. A ppGpp segíti elő a riboszóma-RNS transzkripciójának gátlását, ilyenkor több riboszóma nem keletkezik.

A polipeptidláncokat kódoló gének transzkripciója eukariótákban és az elsődleges transzkriptum érése Az eukarióta genom és az eukarióta gén szerkezete is bonyolultabb, mint a prokariótáké. Míg a prokarióta gén folyamatos, az eukarióta gének szerkezetében a polipeptidláncot kódoló régiókat megszakítják olyan DNS-szakaszok, amelyek az érintett poli peptidláncot nem kódolják. A kódoló DNS-szakaszokat exonnak, míg az exonok közé illeszkedő, a kérdéses pohpeptidláncot nem kódoló, annak kész, érett mRNS-ében már nem megtalálható bázisszekvenciákat tartalmazó szakaszokat intronnak nevezik. Az intronok hosszúsága többszöröse lehet azon exonszakaszok együttes hosszának, amelyeket megszakítanak. Az exon- intron szcrkezetnek nagy szerepe van a fehérjék evolúciójában.

Ellentétben a prokariótákéval, az eukarióta genom egy jerésze nem kódol fehérjét. (Az emberi sejtek D S-ének megközelítően csak l 0%-a kódol fehérjét, e7 kb. 50 OOO génnek felel meg. ) A nem kódoló D S- zakaszok között találhatók olyanok, melyek bázisszekvenciája csak egyszer fordul el ő a genomon. Ezek lehetnek pszeudogének, amelyek szekveneiája hasonlít egyes működő gének szekvenciájára, de olyan mutáeiót hordoznak, ami miatt nem fejezödnek ki. A legtöbb esetben azonban nem ismert ezen szekvenciák funkciója. Szemben a prokarióta D S-sel. amelyben csak nagyon kevés többször ismétlődő zekveneia található. az eukarióta DNS jelentős része tartalmaz ismétl ődő szekvenciákat. Ezen szekvenciák lehetnek csupán néhá nyszo r i smétlődő szekvenciák, mint például a hisztonokat kódoló gének vagy a riboszóma-RNS-eket kódoló gének, amelyekből több azonos is talál ható az eukarióta genomon. Az ismétlődő szekvenciák túlnyomó része azonban nem kódoló D S-szakasz. Ezek közölt vannak néhány százszor i smétlődő szekvenciák, amelyek valószínű leg a transzkripció zabályozásában részt vevő elemek. Az eukarióta genom egy jel e ntős részét azonban, ún. egyszerű szekvenciák többezersze•·, akár milliószor ismétl ődő elemei alko~ák. Az egyszerü szekvencia egy néhány (pl. 6) nukleotidból álló sorrendet jelent, amely speciesenként kűlönbözik. Az egyszerű szekvenciák egymás után többször ismétlőd­ nek, és ez az ismétlődő zerkezet a genomon több helyen i megtalálható. Ezen szekvenciák nem íródnak át, valószínüleg a kromoszómák zcrkezetének a szerveződésében van szerepük , a kromoszómák centromerjeiben és telomérjeiben koncen tráltan vannak jelen. lentős

Eukarióta sej tek magjában a transzkripciót három különböző DNS-d ependens RNS-polimeráz végzi. Az RNS-polimeráz l a riboszóma-RNS-ek szintéziséért felelős (pontosabban a riboszómaRNS-ek közül három, a kis alegységhez tartozó 18S és a nagy alegységhez tartozó 5,8S és 28S rRNS szintéziséért) és a nukleoluszban működik. A fehérjék szerkezetét kódoló gének transzkripcióját az RNS-polimeráz Il végzi, míg a tRNS-ek és az SS rRNS átíródásában az RNS-polimeráz lll-nak van szercpe. Az RNS-polimeráz ll jellegzetessége, hogy a gy ilkos galóca nevű gomba toxinja, az a-amanitin már nagyon alacsony koncentrációban erősen gátolja az akti vitását, míg a po limeráz Ill csak mé rsékelten. a polimeráz I pedig egyáltalán nem érzékeny e toxinra. A mitokondriumokban a nukleári s en zimektől különböző, speciális RNS-polimeráz működik, a mitokondriális DNS-ről fo lyó transzkripcióért fele l ős.

A transzkripciót eukariótákban és prokariótákban is az aktinomicin D és a rifamicin nevű anti-

R.'l : TRA~SZKRI PC I Ó

lS SZABÁLYOZÁS \

>»•»» » >»»>>>» >>» >m >»>>»»»>>»>>>»>»>>>>>>»»»>»>»>» »>>>>>>»>»>»>>>»>>>»>>>>>>>>»>> >> >>>>>>

biotikurnak gátolják. Az aktinomicin D kettős­ láncú DNS-hez kötőd ve akadályozza a transzkripciót. A ri famicin fél zintetikus változata, a rifampicin eukariótákban nem, csak prokariótákban gátolja a transzkripció inic iác ióját. A fché1jéket kódoló gének transzkripciójának iniciációja eukariótákban lényegesen bonyolultabb, mint prokariótákban. Az RNS-polimeráz II önmagában nem tud a promoterhez kőtődni. Bekötődéséhez elengedhetetl en a promoteren levő specifikus D S- zaka zekhoz (cisz-elemekhez) kötődö, transzkrip-c i ó t e l ő egítő fehérjék (transzkr ipciós faktorok) jelenléte. A reguláit génhez közel, annak 5' -végén e lhe l yezkedő promoter régión kívül másféle specifikus bázisszekvcnciáva l rendelkező cisz-elem, az "erősítő DNS-szakasz", (cnhancer) is kőz rernűk ődik a transzkripció e l őse­ gíté ében. Az enhanccr DNS-szaka z a reguláit géntől távolabb {többszáz vagy akár ezer nuk leotidnyi távol ágban), a gén 5'-végének vagy 3·-végének irányában, vagy esetleg a gén köLepén l evő, polipeptidláncot nem kódoló intronban is clhelyezkedhet, é ugyancsak a transzkripciót e l őse­ gítő fehé1jék (specifikus transzkripciós faktorok) kötődésérc szolgá l. A promoteren elhelyezkedő ci z reguláció · elemekkel ellentétben, amelyek c ak 3 '- irányban hatnak, az enhancer elemek 5' - és 3'-irányban is kifejthetik hatásukat. Újabban "csendesítő'' (silcncer) cisz regulációs elemeket is megfigyeltek, amelyekhez egyes gének tran zkripcióját spec ifikusan gátló rchérjék kötődhetn ek .

Az eukarióta gének promc terén leggyakrabban megtalálható, az obligát tran. zkripció faktorok kötődésérc szolgáló "conscnsu. " szekvenciák: a (start nukleotidtól kb. 25 nuk leotidnyira felfelé található) "-25 SLekvcncia", az ún. T ATA-box 3-24. ábra. Egy eukarióta gén promotere. A promoteren több transzkripciós faktor képes kötődni specifikus szekvenciákon, amelyek egymással és az RNS-polimerázzal kölcsönhatásba lépve segítik elő a transzkripció iniciációját. A GRE-vel jelzett elem azokon a promotereken van jelen, amelyek regulációjában egy cAMP-dependens protein-kináz által foszforilá/t transzkripciós faktor is részt vesz

3 67

(T ATAA1A '\ ), és az ettő l felfelé, különböző

promotereken kü l önböző távolságokban elhelyeznem minden gén promoterében megtalálható CC-box és CAAT -box (GGTcCAA TCT). Etcken kívül még promoter c aportonként más-más specifi kus DNS-szckvenciá al rendelkező ci z-elemek (respon ivc elemek) i szalgálhatnak az il l ető promcterre j ellemző , pccifikus transzkripció · faktorok kötődés6 re (3-14. áhra). A transzkripció iniciációját e l ősegítő fehérjék nemcsak a DNShez, hanem egymá. hoz és az RNS-polimeráz ll-höz is kö tőd nek . ked ő,

A/. R S-polimcráz ll l müködésénck a polimerút l és 11-löl j cllcg7ctcsségc, hogy a7 iniciációt elősegítő fché1j ék nem a kódoló szakasz 5'-végén clhclyczkcdö promotcrcn, hanem a kódoló DNS biLonyos szakaszán kötöd nek a DNS-he;.

e ltérő

A L eukarióta gén tran ·zkripciójakor kel etkező

RNS még nem a mR , hanem az el sőd l egc transzkriptum (heteronukleáris RNS, hnRNS). A z e l sőd l eges tra nszkri ptum nem csupán a kódoló, exonoknak meg fe le l ő nukleotidszekvcnciákat tartalmazza, hanem a közéjük i ll eszked ő, a kérdéses polipeptidlánc szerkezetét ncmkódoló, intronoknak m eg fe lel ő szekvenciákat is. Az eL öd leges transzkriptumnak egy érési folyamaton kell kereszti.ilmcnnie ahhoz, hogy egy polipeptidlánc szintézisét irányitan i tudó, folyamatos, kész mRNS- é alakuljon. Az érés i folyamat lépé ci közé tartozik az RN 5'-végének módosulása, azaz a Ca p-képződés, a 3 '-vég módo ·ulá:,a, aLaz a poliadcnj lsav (poliA) fa rok kialakulá a é az intronoknak megfel el ő RNS-darabok pontos kimetszése az exonoknak meg fe l elő részek ugyancsak pontos összcillcsztésével. Ez utóbbi fo lyamatot "splicing"-nak nevezik.

transzkripciós faktorok

~ !

p

!

\

5'

~~~~~~~~~~~~~~~~·

3'

3'

--------~~------~--------~----~

5'

i

RNS-polimeráz ll

cAMP reszponzív elem CRE

GENETiKAI 11\FOR..'\IÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZÖDÉ E

a

oH

Cap

p

OH

\ b

......

vágási szignál NS-polimeráz

7-metil-guanin vágás és poliadeniláció (specifikus endonukleáz és poli-A-polimeráz)

AAAAAA(A)n·OH 3' 5' Cap - - - AAUAAA mRNS/prekurzor

3-25. ábra. Az eukarióta mRNS 5'-végének és 3' -végének transzkripció után i módosulásai. (a) (b) az RNS 3'-végének elmetszése és a poli-A-farok kialakulása

Az cl ödleges transzhiptum 5' -vége eredetileg egy purin-nukleoz id-trifoszfát (pppA vagy pppG). A "Cap"-képzödés után nem lesz szabad 5' -vége az RNS-nek, mert egy GTP-ből származó, módosult nuk leotid kerü l a lánc végére 3'~ 5 ' pozícióban. Az új láncvégi nukleotid egy olyan mcti lezödölt (7-metil-guanin-tartalmú) guanin nukleotid, melynck 5'-foszfátja pirofoszfátköté sei kapc olódik az eredeti láncvégi nuk leotid P-he l yzetű fosz-

Cap-képződés

az 5 '-végen:

fátjához. Az eredeti szekvencia első és második ribóza ugyancsak meti lezödik (3-25. ábra). A "Cap" védi a mRNS-t a lebomlástól és szük égesa tran zlác ió iniciációjához. A "Cap"-képzödé el őbb mcgtörténik, mint ahogy a transzkripció terminál ódik. A poli-A-farok kialakulása a tran zkripció terminálását követően megy végbe. A transzkripció term inálásához szükséges jelnek át kell íródnia

2

RN : TRAN ZKRIPCIÓ 1<:

ZABALYOZ1\SA

,)))))))))))))) •> )HH))))) )U)>H))))))))))))))))))U))> ) )))))))t)>>))))))))))))H·)))))U)))>))))))))))) i)))))))))>~>))

az RNS-re, ez az AAUAAA zekveneia és poli-A-helynek nevezik. A poli-A-helyet egy specifikus endonukleáz enzim az RN -cn i meri fel. Az AAUAAA szekvencia átíródá a után egy kb. 20 nukleotidból álló szakasz következik (terminátor régiónak megfe l e l ő szakasz), ennek átíródá a után az endonukleáz elvágja az el ődleges tran zkriptumot é a transzkripció befejeződik. E7után a poli-A-polimeráz nevü enz im egyenként, ATP-ből , egy kb. 250 nukleotidból álló láncot szinretizá l az R S 3' -végére. A spljcing mechanizmu ának, azaz az intronoknak megfel e l ő RNS-sza kaszok kivágásának é az exonoknak meg fele lő RNS-szakaszok ös zeiilesztésének rendkívüli pontos ágga l kell végbemennie, hi zen egyetlen nukleotidnyi elcsúszás a nuk leotidtri ple tbő l álló kodonok határainak clcsú-

3-26. abra. Az eukarióta gén exon-intron szerkezete és a splicing mechanizmusa. (a) A mode/1 gén exonjai (E) és intronjai (l) a transzkripció során átmásolódnak és az elsődleges transzkriptumban, 11/etve az 5'-vég és 3'-vég módosulásai után a mRNS prekurzorban még az intronoknak megfelelő szekvenciák is megtalálhatók. A splicing segítségével az intronszekvenciák kimetszésre kerülnek és az érett mRNSben az exonok folyamatos szekvenCiát alkotnak. (b) Az In tronok a splicing folyamata számára consensus szekvenciákkal rendelkeznek (5'-splice-hely, 3 '-splice-hely, elágazódási hely). Az elágazási hely egyik nukleotidjának szabad 2'0 H-ja megtámadja az intront az 5'-oldalon levő exonnal összekötő foszfodiészterkötést. Az 5'-oldalon levő exon Igy felszabaduló 3'0H-ja megtámadja az mtront a 3'-oldalon levő exonnal összekötő foszfodiészterkötést. Az eredmény a két exon darab közti foszfodiészterkötés kialakulása és a hurokszerü szerkezetté alakuló intron eltávolítása

szásához és így egy teljcsen más polipeptidláncot kódoló RNS kialakulá ához vezethet. Az intronoknak meg felelő szaka zok ponto kimetszésében három kitüntetett nukleotid zekveneia játszik szerepcl, az 5'-splice hely (az intronnak meg fe le l ő szakasz 5'-végén), a 3' -splice hely (az intronnak m egfe l el ő zakasz 3' -végén) é az elágazódás i hely (20- 50 nukleotidnyira 5' -jrányban az intron 3' - végétő l ). Splicing csak akkor történhet, ha a7 el sődleges transzkriptumon mindhárom hely megtalálható (ahány intron van az el sődl cge transzkripnlmon, annyiszor). Az öss7es gerincesek intronjainak kitüntetett szckvenciái hasonlítanak egymásra (consensu szekvenciák) és az összes eukarióta sejteké megegyezik abban, hogy az intron 5'-végén GU, 3- végén AG található (3-26. ábra). (Természetesen a consensus szekvenciák

a

gém E1 5'

E1 Cap ...__.-

11

E2

12 E3

13

11

E2

12 E 3

13

----

E4

.....-

3'

E4

poli-A

l

mRNS prekurzor

splicing

5'

E3 Cap

E4

3' poli-A

1

mRNS

b

intron

i

5' splice hely

5'

i

elágazódási hely

i

3' splice hely

~

exon~

l 3' exon

PCj 2 ' OH

intron

369

elágazódási hely

13' exon

3' 0H

~

l"o"V"p 5' exon

intron

elágazódási hely

\rE ETIKA I 1 '\FOR~I ÁC I Ó TÁROLÁ ..\ÉS K IFEJEZÖDÉ E

>>>»H>))))>>)) >>)))))>>>>> >>>> » >>>>))H))))))))))>>>> )))>))» >> >> >>)))))) )))))) )))) )) ))

370

ennél ho!)szabbak.) A kitüntetett splicing szekvcnciákon kívül az intron nukleotid zekvcnciája a splicing szempontjábó l érdektelen, az intron hoszsLa lehet 50 nukleotid vagy akár l OOOO nukleotid.

Ezek köz ü l az egyik az 5' -spi ice helyet, a má ik a 3'- plice helyet, a harmadik az elágazódási helyet ismeri fel, de a splicing mechan izmusában még további néhány snRNS ( nRN P) is szerepe t játszik.

A spi ic111g mccham;musát a; indítja cl, hogy az c l ága~:ódá­ ~i helyen lc\Ö adenin nukleotid 2'01-1-ja megtámadja az intron 5·_, égén le' ö nukleotidot és fos7fodié))lterkötést létc-;ít annak 5"-fos7latjá' al. Al intron huroks;crü kép7Ödményt alkot, míg a; intron 5'-végén IC\Ő exon ( 1. exon) 3'-végi nukleotidjának 3 'OTl-ja átmenetileg s7abaddá válik. A; l. exon s;abad 3 "Oli-ja c;után megtámadja a7 int ron és a ::!. C\On kö;ötti foszfodté:-.;terkötést. A7 mtron lchasad és ktalakul a fovfodié:.Ltcrkö tés a1 l. intron 3"011-ja és a 2. intron 5'-lo-;tfátja kö;ött (3-26. ábra).

A splicing mcchaní7musának tanulmányozilsa vezetett a r íbozimok fclfcde7é éhez. A ribos7óma-RNS spl icingja u Tetrahymena ne\ ü egysejtű élőlényböl izolált rendszerben guanin nuklcotidok jelenlétében fehérje nélkül is \égbcmegy. a Tetrahymena rRNS prekur~or saját maga képes katalizálni a fos7fodiészterkötés megrelelő hel yen törté nő bontását és megfelelő helyen annak kialakulását. Ehhe? a folyamathoL a7 intron s7erkcLctének nagy ré 7e, é!> aL R speci ál is má ~odlagos és ha rmadlago szerke;cte is szükségcs. b a7 RNS-nukleáz és -polim..:rá/ aktivit{tssal rendelkelik nemcsak saját magán, hanem biLonyos cxogén oligonukleotidok esetében i~, tehát "alódi enzimnek tekinthetö.

A splicing mechanizmusában az snR NS-ek (k i mérctü nukleáris RNS-ck) jál. zanak szercpct. Az snR -ck fchétjékkel komplexet képezve kis nukkári ribonukleopro tein-részecskéket (snRNP) alkotnak. Az snRNS-eket U-RNS-eknek is nevezik, magas uracittarta lmuk miatt.

Az alternatív splicing lehető ége ad magyarázatot arra a jelenségre, hogy eukariótákban egy adott DNS-szakasz nem minden esetben kódol kizárólag egyetlen polipeptid láncot Ezért is bonyolultabb a

DNS

5'

exon 2

intron

exon 1

l

i

1

l

terminálási jel ,.b"

l - - .a' l--

terminálási jel ,.a"

intron 3' splíce hely

intron 5' splice hely

terminálás ,.a" jelnél exon 2

intron

exon 1

3' hnRNS

l

l

3'

5' exon 2

exon 1

Cap ~

poli-A

1

terminálás "b" jelnél intron exon 1

"a" fehérje

5'~ 3' hnRNS

l

5' splice hely Cap ~

mRNS

poli-A

mRNS

1 "b" fehérje

3-27. ábra. Az alternativ s plicing egyik lehetséges mechanizm usa. Az "a''jelnél történő terminá/ás után az intron szabályosan kivágódik és az érett mRNS szerkezetében a két exon szekvenciája található. A "b" jelnél történő terminá/áskor az intron 3'-splice-he/ye és a második exon nem íródik át. A 3'-splice-hely hiányában az introndarab nem vágódik le, az érett mRNS az első exon és az introndarab szekvenciáját tartalmazza. Az "a" fehérje számára intronként viselkedő DNS-darab a .b" fehérje számára kódoló szekvencia (exon)

R'i :TRA~SZKRIPCI Ó É~ SZABÁLYOZÁSA

)) )) ))))))))))))))))>H>>>>>))))))))))>>) ))) )U))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))) >H)))))))))))>)>>

gén meghatározása eukariótákban, mint prokariótákban. Ezekben az esetekben nem arról van szó, hogy két, egymástól telje en különbö7Ö polipeptidláncot kódol ugyanaL a DNS- zakasz, csak arról. hogy a két pol ipeptidlánc egyik vagy másik rés7e (pl. C-terminális amino avszekvcnciája) különbözik egymá étól. Alternatív splicing esetén az egyik polipeptid szempontjából intronként viselkedő DNS-szakasz (vagy annak egy ré ze) a másik polipeptidlánc számára kódoló zekvenciaként viselkedik és benne marad annak érett mRNS-ében. A 7 alternatív splicingjelenségére j ó példa a7 immunglobulinok nehé? láncának 1intézisc. Egy bi1onyos nehéz lánc 7intctizálódhat olyan C-tenninális szekvcnciával, amely igen sok hidrofób ami nosavat tanalmaz, ilyenkor, a7 immunglobulin a pla7mamcmbránho7 kötve marad. AL -tenninálistól számított "lekvencia nagyobb részén a;onos nehéz lánc szintcti7..álódhat olyan C-terminális snkasszal is. ame ly róként hidrotil ami nosavakatlarwlmaz. ilyenkor a; immunglobulint a ejt s7ckrctálja. Az alternatív splicing úgy jöhetlét re. hogy ebben a; esetben a D -en a tra n zkripció számára két terminációs jel van és a transzkripció valamilyen rcgulációs mechanizmus hatására vagy az egyik terminációs helyen, vagy a másikon fejeződik be. A 7 e l ső tern1inációs jel a7 utoló intronon, a második tcrn1ináció jel az a;t követő exon után található. lia a transzkripció megáll az első tcnninációs helyen, valahol a; intron köL.cpén, az R Sc ak az 5'- ·plice helyet tartalman:a a 3'-splicc helyet nem, ezért az introndambnak megfelelő szekvencia nem vágódik Ic aL RNS-rő l. -ben ez az introndamb kódoló szekAz így képződő mR venciaként vi clkedik. ez felelős a C-terminális amino avzek\·eciáén. Ita a transzkripció a második tenninációs helyen áll meg, a teljes intron, majd az azt követ ő exon is átíródik. Ilyenkor azonban az intronnak mind az 5'-, mind a 3'-splice-helye megjelenik az R S-en. ezért az intronnak megfele lő szakas? kivágódik és a polipeptidlánc C-tennináli zekvenciáját az átíródon utolsó exon kódolja (3-27 ábra).

Bizonyo fehérjék esclén a sok exon- és sok intronS7ekvcnciát tartalma7Ó egyetlen fajta e l sődl eges transzképződésérc i l e h etősége t ad. kriptum többféle mR1 sejttípustól fúggöcn különbözhct a splicing.

A splicing mechanizmusának károsodása isme11 néhány betegségben. A thalassacrnia (a hemoglobin egyik vagy másik limca színtézísénck zavara) egyes fonnáiban a hemoglobin egyik láncát kódoló gén egyik intronján mutáció miatt egy új splicc hely alakull ki, amely aberrált splicinghoz, kóros mRNS-hcz és a poli peptidlánc szinlézisének korai befejezödéséhc7 vezet. A szis7témás lupu erythematosus ncvű autoimm un beteg égben a kismérctü ribonuklcoprotcin-részecskék egyik csoportja ellen termel a beteg ellenanyagot, amely igen sok S7övet kóros elváltozásüt okoaa.

J7 J

Eukarióta transzkripciós faktorok Az eukarióta gén transzkripciójának snbá lyo?úsa több S7intcn szcrvczödö, bonyolult folyamat, amelyet sokka l kevésbé ismerünk még, mint a prokar·ióták génexpressziójának ·zabályo7ását. Eukariótákban egy gén vagy géncsoport trans7kripciójához szük éges cL ö feltétel a gén környezetében l evő kromatin szerkezctének az aktív, tran zkripció zámára hozzáférhető állapota. J\7 "aktív kromatin" , zerkezete la7ább. mint a transzkripció szempontjából inaktív kromatiné. Egyrészt a promcterek bizonyos zakaszai egyáltalán nem rendezödnek nuklcos7ornákba, másrészt a tran zkripcióra kerülö ré ·z nuklcos1omélba rendeződő s7akaszán a nuklco zornák nem alkotnak zoros . truktúrát. mint az inaktív o lyan kromati nban. A kromatin lokális e lrendeződ ésé t minden valószínűség szerint ·pcciúlis, az ill e tő sejt differenciáltságának megfelel ő fehérjék irányítják. A DN mct ilációjának ugyane. ak 'an s7crcpc a génexpress z ió szempontjából aktí , illet\ c inaktív régiók kia lakulá ában. Az RNS-polimeráz ll bckötödését elősegítő obligát rran zkripció faktorok mcl lctt, amelyek a p romoterek speeiális szekvenciáihoz (TATA-box, GC-box, CAAT-box) kötődnek, az egye. géncsoportokra jellemző, más. spccifiku tran zkripció faktorokra is szükség van (3-24. ábra). (A transzkripciós faktorok 7Crkezctét kódoló gének a tran z regulációs elemek.) A gén vagy géncsoport transzkripciójának speci1iku szabályozását előse­ gítő specifikus cisz-elem (reszponzív elem) a gén promoterén vagy a géntől (a DNS lineáris zerkczetét véve figye lembe) távolabb clhelyc?kcdö c nhanccrcn talá lható. Ezekhez a cis7-elcmckhc7 kötödnek a pecifikus tran zkripciós faktorok. (A kromatinhurkok elrendezödé c lehetövé teszi. hogy az cnhanccr régióban, il letve a promoteren kötődö fehérjék egymással és a7 R S-polimcrá7 ll-vel is kapcsolatba kerüljenek.) Egy adott trans7kripciós egység tran. zkripciójának regulációjáért több tran zkripciós faktor kölcsönhatása IC!clös. Reszponzív elemnek azokat a specifikus consensus DNS-szekvcnciákat nevezik, amelyeket egy-egy pccifiku kémiaijelre adott sej tválas7ban érintett gének promcterén vagy cnhancerén találtak. llycn reszponzív elemek pl. a cA MP-s7int emelkedés hatására indukálódó génekre jellcnvö

GE'IF.TIKA I INFOR~IÁC I Ó TÁROL,\ SA

c isz-elemek (CRE, cAMP-re zponzív elem) vagy a ztcroidhormonok által reguláit gének specifikus c isz rcgulációs elemei (szteroid reszponz ív elemek), a nö ekcdé i faktorok által regulá it génekre jellemző c isz regulációs elemek (szérum reszponziv e lem, AP-l hely) stb. Ezek l O nuk leotidnál nem hosszabb, specifikus nukleotidszekvcnciáva l rendelkező szakaszok. A nukleotidszekvenciát a megfelel ő reszponz ív e lemekhez kötődö specifikus transzkripciós faktorok i merik fel. Ezek rendszerint a DNS nagy árkában elhelyezkedve képe ek iono köté ekkel, van der Waal -köté ekkel vagy hidrogénhidakkal kapcsolatot létes íteni a megfelelő nukleotidokkaL A reszponzív elemekhez kötődö transzkripciós fakto rok szcrkczetét és müködését a kémiai jelek különféle módon szabályozhatják. Bizonyos e etekben a kémiai j el közvetlenül, allosztériku ligandként fejti ki hatását (pl. szteroidhormonok esetében), más csetekben egy szignáltovábbító mechanizmus eredményeként fehétje foszforiláció- dcfoszforiláció útján (pl. cAMP-szintet e melő jelek esetében). Szerepe lehet e kettő kombinác iójának i és nagy jelentősége lehet a tran zkripciós faktorok müködésének szabályozásában ma még nem ponto an i me11 fehérje--febérje kölc önhatá oknak. A transzkripc iós faktorok nagyon gyakran dirnérként fejtik ki hatásukat, kia lakul hatnak egyetlen tran zkripciós faktor két molcku lájából álló homodimérek, dc gyakori jelen ég, hogy két különbözö transzkripciós faktorból alaku l ki egy heterodimér. Egy kém iaijellel szabá lyozott transzkripc iós faktor regu láihatja egy más ik transzkripciós faktor génjét is, ilyen módon rcgulációs kaszkádok alakulhatnak ki. A transzkripciós faktorok közölt o lyanok is vannak, amelyek az általuk reguláit gén transzkripc ióját nem elősegítik. hanem akadályozzák. A lcgújabb megfi gyelések azt mutatták, hogy az eukarió ta gének transzkripciójának szabá lyozá. ában fonto zercpc van a hisztone k accti lációjának és dczacetilációjának is. A bisztonok acetilációj a megbontja a nukleoszóma szerkezetet és ez szükségcs a transzkripció iniciációjához. A T A T Aboxhoz kötődö obligát transzkripciós faktorok és az egyes gének promcterén vagy cnhancerén elhel yezked ő rcszponzív elemekhez kötődö specifikus transzkripciós faktorok közti kapcsolatot koa ktiváto r fehé rj ék hozzák létre. Ezeknek hiszton-

F:.

KIFEJEZÖDÉ E

acetiltranszferáz aktiv itása is van, így cgyré zt elő­ segítik az RNS-po limeráz ll bekötődését, másré zt e lvégzik a hi sztonek acctilc7ését i . A DNS-hez kötőd ö fehérjék zcrkezeti motÍYUmaik alapj án többfé le csoportba soro lhatóak. Ezek a zerkezeti sajátságok a helix- kanyar-helix motívum, a c inkujj motívum és a lcucinc ippzár motívu m. A helix-kanyar -helix zerkc7etű fehérjékre jell em ző egy rövid alfa-helik:,lli rész, amely a D S nagy á rkába illeszked ik. ahol a nukleotidokkal kölcsönhatá ba lép. majd egy má odik rövid alfahel ikális szerkezetü része a Ichérjének csupán részben fek zik be a nagy árokba. Ezek a fehérjék, amelyek többnyire dirnérként kötödnek a DNShez, megfe l e lő motivumaikkal egymással szomszédos nagy árkokban he lyezkednek e l (3-28a ábra). A cinkujj al rende l kező fehérjékre je l l emző i smétl ődő szerkczetben található négy, speciáJisan elrendezett Zn2 ' - io nt kötő amino av-oldallánc, a négy o ldallánc le het 2 hisztidin és két cisztein vagy négy c isztein. Két-két Zn~' - iont k ötő egymáshoz közeli oldalláncot kb. 12 aminosav-oldallánc választ e l a távolabbiaktóL Az ilyen módon kia lakuló motívumnak van egy alfa-heljkális szegmentjc, amely képes kapcsolatot kialakítani a DNS nagy árkában található nukleotidokkal (3-28b ábra). A DNS-hez kötődö fehérj ékre jellemző harmadik motívum a lcucincippzár . A leucinc ippzár-szcrke7et nem a DNS-hez történő kötődésben já tszik sLercpct, hanem a fehé rjemolckulák dimerizációjában, minthogy a DNS-hez kötőd ö rcgulációs feh érjék dimerizációja igen gyakori jelenség. A lcuc inc ippzár úgy alakul ki, hogy a fehérje al fa-hclikális snkaszán legalább négy Icucin he lyezkedik cl, amelyeket egymástól hat-hat más aminosav vála 7 1 cl. Így az a lfa-hélix minden második csavarulatáná l egy leuci n kerül a helix ugyanazon olda lára. li a két ilyen szerkezetet tar1almazó fehérjcmolekula kerül egymás mcllé megfe lel ő pozícióban, a Icucin o lda lláncok egymás közé ékclöd ve öss7cta rtják a két fehérjemolekulát (3-28c ábra). A cippzár mo tívum közelében báz ikus amincsa ak talá lhatók, amelyeknek a DNS-hez történő kötődésben van zerepük. A liganddal regulá it transzkripciós faktorok (transzaktivátor fehérjék) csoportjába a sejten belül elh elyezked ő horm o nrecep tor o k tartoznak. Ligandjaik nélkül c?ck aktivá latlan á llapotban

Ilii

R, S: TRAN ZKRIPC IÓ ÉS ZABÁLYOZÁ A

b

helix-csavar-helix motívum

""'fehérje monomer

/ fehérje - - - monomer

Zn

Tyr

c

rendelke3-28. ábra. Az eukarióta DNS-hez kötődö fehérjék közös szerkezeti motívumai. (a) Helix-kanyar-hefix szarkezettel fehéqék rendelkező ral leucincippzár (c) szerkezet, cinkujj (b) , nagyárokban zá dimer fehérjék elhelyezkedése a DNS dimerizációja

vannak, egyesek a eitoszolban , mások a sejtmagban helyezkedn ek cl. A megfelel ő hormon kötödése specifikus receptoráh oz átalakítja, aktíválja a reccptort, ame ly azután a DNS-en a specifikus re zponzív elemhez kötődve e lő egíti (illetve egyes esetekben gátolja) bizonyos gének transzkripcióját Ebbe a csoportba tartoznak a sztcroid-

hormonok receptorai, a thyreoideahormon reeeptora, a D-vitamin- receptor, a rcténsav (A-vi tamin-szárm azék) receptorai és az aril zénhidrogén-rceepto r. A fo zforiláeió- defo zforiláeió egítségével szabá lyozott transzkripc ió faktorok (transzakti vátor fehérjék) száma va l ós7ínűleg sokkal nagyobb,

~~~~-----------------------37-t

»»>)) )))) )))) )))))))))) )) ))))))

)) )) )))))))))) )) )))))))) )) )))))))}))))>))))))))) )))))) )))

noha még csak keveset ismerün k közül ük pontosan. Ebbe a c oportba tariozik p l. a cAMP-dependens protein-kináz á lta l foszforilá lt transzkripció. faktor (CREB-nek nevezik azt a transzkripciós fa kto rt, amely a C RE-hez, azaz cA MP reszpo nzív elemként ismert consensus szekvenc iához kötődik ). A fos és jun fehérjék (az A P- l-nek nevezett cisz rcgulációs elemhez kötőd ö fe hérjék) ugyancsak transzkripciós faktorok, a sejtpro liferációt erk entő extracelluláris kémiai je lek hatáára meginduló bonyolult folyamat eredménycként fo z forilálódnak, és a sejtproliferációban részt vevő gének műkődésén ek szabá lyozásában van szerepük. Orvos i szempontbó l ki eme lkedő jelentőségű a p53-nak nevezett fehérje, ame ly többek között egy sejtproliferációt gátló fehérje (p2 1) génjének a transzkripció faktora (lásd a sejtciklus szabályozása). A p53 szerkezctét kódoló gén (transz regulációs DNS-e lem) tumorszuppresszor gén , vagyis olyan gén, amelynek de léciój a vagy károsodása a rosszindulatú daganatok kia lakul ásának egyik fon tos molekul áris kompo nense. Egy m ásik tumorzup- presszor a retinoblasztoma gén á ltal kódolt fehérje vagy Rb-fehérje nem aját maga transzkripciós faktor, mégis van transzkripc iót szabályozó hatása. Az Rb-fehérje komplexct képez egy olyan transzkripc iós faktorra l, amelynek fe ladata a G 1-fázisbó l az S- fáz isba történ ő átmenetet el őse­ g ítő fehérjék génje ine k aktiválása. Az Rb-fehérj e inaktív komplexben tartja ezt a transzkripc iós taktort és ilyen módo n gátolja a G 1/S átmenetel. Az Rb- fehérjének a G l fázis végén bekövetkező többszörös foszforilációj a megszűntcti az Rb-fehérjc kapcsolatát a transzkripciós faktorra l, az fe lszabadul a gátlás alól és igy megszűnik az Rb-fehérj e sejtc iklust gátló hatása. (Az Rb-fehérje és a G 1/S átmenetet indukáló E2 F transzkripciós faktor kapcsolatát a 3- 13. ábra mutatja.)

A p53-nak nevezett (53 kDa nagyságú fehérje) transL.kripciós faktorjelentőségét az adja, hogy az ezt kóJoló (c1 17-es kromoszómán elhelyezkedő) gén tmindké t alié it érintő) szoma tikus mutációi a legkülönfélébb humán daganatok mintegy 50% -ban kimutathatók és a daganat kifejlödéséne k egyik okaként szerepelnek. A gen csírasejtben előforduló, örökletes (csupán egyik alleiba n megtalál ható) mutációi is ismertek. A z ezt a fajta mutációt hordozó egyének egészségesen fejlődnek, de nagy va-

G ENETIKAI INFORJ\IÁC IÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉ E

lószí nűségge l

be tegs7cnek meg ro ·sóndula tú daganato betegségben még 30 éves koruk előtt, mert az épen maradt allé! szomatikus mutációja a p53 funkciójának kieséséhez vezet. A p53-as fehérje kicsése további s.w matikus mutác iókat idéz elő. E fe hé1jéoek eddig ismert fö f1mkciój a (mo lekuláris mechanizmusát lásd a sejtciklu · snbál yozásánál), hogy lassítja a sejt proliferációját, a G l-fázis határán késlelteti a7 átmenetet az S-fázisba mindaddig. míg a DNS-t é rt károsodások nincsenek kijaYítva. DNS-t károsító sugárzások hatásá ra a p53 mcnnyisége megemelkedi~. Ha a DN S-t ért károsodások me nnyisége. nagysága olyan nagy. hogy ne m kija víthatók , a p53 a sériill sejt apoptozisát (a sejt programmozott halálát) idézi elő, ilyen módon akadályozva meg a sétiil t sejt daganatos átalakulásá t.

A riboszóma-RNS és tRNS transzkripciója eukariótákban Az eukarióta riboszóma négy kü l önböző RNS-l áncot taria lmaz, ebbő l három, a 28S, az 5,8S és SS a riboszóma nagy a legységéhez, a 18S pedig a ri boszóma k is a legységéhez tartozik. A 28S, 5,8S és l 8S rRNS-ek egyetlen e l sődl eges transzkriptumként (45S) szintctizálódnak az RN S-polimeráz l segítségéve!, és ebbő l hasadnak k i a megfe lelő darabok. Az ezeket kódoló gén többszörösen ism étlődi k az euka rióta gcnomban. Emberben a 13., 14., 15., 2 1. és 22. kromoszóma ún . " nukleoluszszervező" régiój ában (mindegyik kromoszomán tö bbszörösen), egymá után helyezkednek c l a riboszóma-RNS-gének és az interfázisú kromalinban a megfel el ő kromoszomáknak ez a része jól e lkül önül ő szcrkczctct alkot, ez a nukleolusz. (A ha ploid genom összesen kb. 200 rRNS-gént tartalmaz.) A :.ejtek RNS-tartalmának legnagyobb része rRNS. illet,·c tRl'IS. (Egy mRNS-röl egymás utá n igen sok fehérj ema lekula szin tcti7álódhat, egy adott m RNS-böl rehát sokkal kevesebbre van szi.i kség. mint egy rRNS-böl, amely önmaga vesz részt a szcrkezet kia lakításában.) Bé kapetében a riboszóma-RNS-génnel kapcsolatban ismert egy spcciális j elenség, a génamplifikáció. A béka szomatikus sej~ei kb. 500 rR S gént tarta lma7nak. A megtermékeny ített pere ejt osztódása}tl)r azonban ez nem elég a riboszómák megfelel ő gyors színté~i sf>hez. ll venkor s7elektiv gén okszorozódá · (gén!'1mp!ifikáció) történik, extrakromos7omáli DNS képt:ödik, amely csak a rRNS-gén! tarta lma7Za ( milliós nagyságrendű másola tot), ezekről már megfel e l ő sebességgel zintetizálódhat az rRNS.

L

R. S: TRAN ZKRIJ>CJÓ ÉS SZAHAL YOZÁSA

)))) )))) >))))) »>»>)) )) )) )) )))))))) )))))>)))))) ))>) )))))) )))) )))))))))) )) )) )))) )))) )) >))) )))))))))) )))))))) )))) )) ))))

A nukleoluszban elhe lyezkedő rRNS transzkripciós egységek el rendeződésé t a 3-29. ábra mutatja. Az egymás után következő transzkripciós egységek között nem átíródó, e lkül önítő, "spacer" régiók találhatók. Az egyes transzkripciós egységek promoterei a transzkripciós egységet megel őző spacer régióban találhatók, közel a transzkripciós egységhez. Specifikus transzkripciós faktor segíti az RNS-polimeráz l bekö tődését. Valami vel távolabb, ugyancsak a spacer szakaszon e lh e l yezkedő enhancer régió is hozzájárul a transzkripció iniciációjának a gyorsításához. A rRNS-génekrő l a transzkripció nagy sebességge l megy végbe. Az R S-polimeráz l egy 45S nagyságú e lsődl eges transzkriptumot szintctizál, me l ybő l több lépésben kerülnek kimetszésre a véglege hosszúságú darabok (3-29. ábra). A kimetszésben specifikus fehérjék és RNS-ek, pl. egy ribanukleáz P-nek nevezett ribozim segédkezik. (Mint már említettük, a Tetrahymcna ncvü egysejtű rRNS-ének önsplicingja volt az egyik leg lényegesebb megfi gyelés, amely a ribozimok felfedezéséhez vezetett.) Az érett rRNS-ben, különösen a nagyobbakban gyakori poszttranszkripciós módosulás a ribózegységek metilációja. A riboszómák képződésé nek fo lyamata azonnal megkezdődik , amint a 45S rR S-prekurzor megszintetizálódott. Ekkor kialakulnak a nukleoluszban a nagy nukleáris ribonukleoprotein részecskék (lnRNP), melyek a 45S RNS-en kívül a citoplazmából a nukleoluszba kerül ő riboszómafehérjéket, a nukleoluszon kívül szintetizálódott 3-29.ábra. A riboszóma-RNS transzkripciója eukariótákban. A nukleoszomában levő transzkripciós egység 455 nagyságú prekurzor RNS-sé íródik át. Ezen belül található a 185, az 5,85 és a 285 rRNS-ek szekvenciája és közöttük átíródó elválasztó (spacer) szakaszok vannak. amelyek az elsődleges transzkriptumból kivágódnak. Emberben a 13.• 14., 15.. 21 . és 22. kromoszóma nukleoszomában levő részén több rRNS transzkripciós egység található egymás után sorozatban, a transzkripciós egységek között nem átíródó elválasztó szakaszok (spacer) találhatók. (Az SS rRNS-t kódoló DNS önálló transzkripciós egység. nem a nukleoszomában helyezkedik el és ugyancsak több példányban fordul elő)

375

SS rRNS-t és a 45S RNS éréséhez szükséges RNS-, illetve fehétjemolekulákat tartalmazzák. A nagy RN P-ből e l őször a riboszómák 18S rRNS-t tartalmazó kis alegységei jutnak ki a citoplazmába, a sejtmag pórusain keresztül. A l egvégső lépések, melyek a két riboszóma-alegységet éretté, fehérjeszintézisrc alkalmassá teszik, a citoplazmában történnek. A riboszómák nagy (60S) és kis (40S) a legységc csak akkor asszociál egymássa l, amikor a riboszóma elkezdi egy poli peptidlimc szintézisét. Az 5S rRNS és tRNS-ck génjei nem a nukleoluszban helyezkednek el. Ezek transzkripcióját az RNS-polimeráz LII végzi. A tRNS-ck transzkripció utáni érése az el sődl eges transzkriptum hasítását, utólagos nukleotid addíciót és a nukleozidole módosulását igényli. Az el sőd l eges transzkriptum mind 5'-, mind 3' -végén hosszabb, mint a végleges tRNS. Az 5' -vég fe lesleges szakaszának eltávolításában a ribanukleáz P n evű ribozim is részt vesz. A 3' -végen a felesleges szakasz eltávolítását a minden tRNS-en megtalálható CCA-OH vég szintézise követi. A tRNS-ek nukleotidjai tartalmazzá k a legtöbb módosul ást az ö szes RNS-molekulák között. (Több mint 60-féle módosulás ismert, létrej öttükhöz kb. l 00 különféle enzimatikus reakció szük éges.) A nuk leozidok bázisa inak és ribózegységének a metilezésén kívül olyan bázisok és nukleozidok is találhatók a tRNS-ekben, amelyek más RNS-molekulákban nem fordulnak elő (pl. hipoxantin, dihidrouracil, pszeudouridin) (3-18. ábra).

átífódó spac~r

1es

ls.sJ

2ss

5' ~ 3' rRNS

18S

ss

45S rRNS prekurzor

28S

DNS 5'

3'

3'

5' transzkripciós egység

transzkripciós egység nem átírádá spacer

transzkripciós egység

A vírusgenom replikációja és az onkogének

.3.

Faragó Anna

A vírusgenom nukle insavból és azt körülvevő fehérj ekö pen ybő l á lló részecskék. (Az egyedi részecske neve virio n). Nem rende lkeznek cncrg iaszolgáltató é fehérjeszintetizáló rend zerre l, ezért c ak él ő ejtben képe ek önmaguk reprodukciój ára, abszolút paraziták. A baktériumokban él ő ködö vírusoka t bakteriofágokna k nevezik. Ellentétben a pro karió rákka l és euka riótákkaL a virusok genetikai info nnác iój át ho rdozó nukle inav nem m inden vírus e erében k et tős szálú DNS, a vírusgeno m okkal nagyobb vá ltozatosságot mutat. A k ettős zálú DN S-en k ívül bizonyos vírusokban egyszálú DNS, másokban egyszá lú vagy A v irusok

fertözőképes

3·1 . táblázat. Néhány reprezentatív virus genomja Nukleinsav

Reprezentatív vírus

Egyszálú DNS

cpX174 fág

Kétszálú DNS

polyamavírus

-l

l adenovírus 2 T 4 fág -Egyszálú RNS

5

30

l

150 4

R2 fág

4 4

poliovírus influenzavírus Kétszálú RNS

-

6

l Rous-sarcoma vfrus l

l

Gének hozzáve· töleges száma

fág

Q~

reovirus

l

8 12

L- l 22

l

két zálú RNS tölti be a genetika i info m1ációt hordozó nuk lein av zcrcpél. A viru geno m nagysága is kü lönbözö lehet, vannak csupán 4-5 gént tartalmazó v íru o k é vannak több S7áz génnel rendelkezők. (Néhány vírus genomjának nagyságát az 3-l . táhlá::at szcmlélteti.) Az RN S-genomma l re nde lk ező virusok replikációj ához o lyan enzimekre is szi.ikség van, amelyeknek a gazda ejt genomjának replikációj ában ninc szerepük . A tisztán RNS-vírusok replikác iójához az R NS-dependens RNS-polimeráz (replikáz) szükséges, m íg a retrovírusok replikációjában az R NS-dependens ON -polimeráz (reverz transzkriptáz) vesz ré zt. Ezeket az enzimeket (illetve a replikáznak legalább egy alegységét) a m egfe lel ő vírusgenom kódolja. A vírusok köpenyél á lta lában egy- vagy kétfajta fehérje nagyszámú ma lekutájának együtte e alkotja. A fehérje a legy égek zabályos geometriai alakzattá állnak ö sze, a viria na k köpenye ezért leggyakrabban vagy hengeres-spirális. vagy ikozahédrális szerkezctct alko t. Bizonyos v irusok geno mja még további e ltéréscke t i mutat a pro kariórák é eukarió ták genetikai anyagának vi e lkedésétö l. A kis. egy zálú R S(+ RNS) genommal rendelkező bakteriofágok között vannak o lya nok, mclyek átfedő géneket tarta lmaznak, mert a ki RNS-molekula csak így ké pes raktározni az in formációt. Az á tfedő gének c etében neme a k a transzkripció kezdeti po ntjai , hanem a k ül ö nböző génekhez tartozó kodonok leolvasásának keretei is e le. úsztak egymá hoz képest (3-30. ábra).

FEHÉRJE Z I TÉZI.

+RNS köpeny fehérje

-

replikáz alegység

5'

egyik olvasási keret

3' A fehérje

lízis fehérje

--másik olvasási keret

3·30. ábra. Átfedő gének egy kis RNS-tág genomjában. A +RNS egyrészt mRNS-ként szolgál, másrészt mintaként a -RNS szintéziséhez. A -RNS-ről azután sok új +RNS szintetizálódik. A kis RNS-genom összesen négyféle fehérjét kódológént tartalmaz. A köpenyt 180 azonos molekula (14 kDa nagyságú) köpenyfehérje és egy molekula A fehérje (érési fehérje, 38 kDa nagyságú) alkotja. Ezeken kívül a fág genom kódolja a replikáz enzim egyik a/egységét (a többi a/egységet a gazdasejt eredetileg más funkciójú fehérjéiből alakítja ki a fág) és a baktérium lízisét előidéző fehérjét. Ez utóbbi fehérjét kódoló gén csak a köpenyfehérjét és a replikáz a/egységet kódoló gének egy-egy szakaszát átfedve fér el. Az olvasás kerete (a kodonok kerete) azonos az A fehérJe és a lízis fehérje génjei számára és egy másik olvasási keret alkalmazható a köpenyfehérjét és replikáz a/egységet kódoló génekre

A bakteriofágok replikációjának litikus és lizogén útja A bakteriofágok repi ikác iója kétféle módon is bekövetkezhct, az egyik (litikus út) a gazdasejt azonnali pu ztulásával jár, míg a má ik (l izogén út) a gazdasej tet generációkon keresztül nem károítja. A bakteriofágok replikációjának litikus útját jól szern lélteti az E chcrichia coli baktérium T4-fágjának szaporodása. A T4-fág a bonyolultabb zerkezetü vimsok közé tartozik, ikozahcdrális feje, farka és farokrostjai vannak. A T4-fág genomja kettő zá lú DNS, teljcsen kitölti a köpenyfehérjékbő l álló ikozahcdrális fej belsejét. Az E. coli baktérium fertőzésekor a T4-fág a farokrostjai segít égével a baktérium kül ső membránjának egy specifikus helyéhez kötőd ik é kizárólag a meztelen DNS injektálódik a baktérium ej tbc. Pár perccel azután, hogy a fág- DNS a baktériumsejtbe jutott, a baktérium saját DNS-ének, RNS-ének és febérjéinek a szintézisc leáll és megkezdődik a vírus komponenseinek a zintézise. A víru -D S átve zi az irányí tást é a baktérium minden szintetizáló apparátusa a vírus zaporodásának a szalgálatába ál l. A T4-DNS ál tal kódolt gének három csoportba tartoznak: azonnali korai, kés leltetett korai é kéöi gének. A kora i gének rő l már akkor fo lyik tran. zkripció, mi e l ő tt még a rág DNS-repi ikációja mcgtörténik. A korai gének kódo lják azokat a fe-

hérjéket, amelyek lcá1lítják a baktérium saját makromolekuláinak aszintézi ét és lebontják a gazdasejt DNS-ét. A ké ő i gének transzkripciója a fágDNS replikációját igényli. Ezek kódolják többek közt a köpenyfehélj éket és egy lizozim enzimet, amely a baktérium sejtfalát képes clbontani. A virion fehérjekomponensei szigorúan meghatározott sorrendű lépésekben á1Jnak össze a végső szerkezetté. A fág-DNS replikációj a és a virion alkotórészeinek az összercndeződése után a lizozim kilyukasztja a baktérium sejtfa lát, és az érett virionok újabb infekciórakészen kijutnak a külvilágba, miközben a baktériumsej t 7étcsik (bakteriolízis). Vannak olyan bakteriofágok i , amelyek - a körülmén yekt ől függően - két különböző életutat választhatnak. Követhetik az e l őbb ismertetett liti kus utat, amely a fertőzé után rövid id ő n belü l a ga7dasejt pusztulásához vezet, de vá la zthatnak egy olyan utat i (lizogén út), amelyik nem öli meg a gazdasejtet azonnal. Azokat a fágokat, amelyek nem mindcn c etbcn pusztítják el a gazdasejtjükct, temperált fágoknak nevezik. A temperált fágok viseikedé ét j ól zemlélteti az E. coli baktérium A.-fágjának szaporodás i c iklusa. A A.-fág kettős száJú DNS-c a virionban lineáris. a gazdasej tbe jutva cirkulári formává alaku l. A cirkulári ON rcplikálódhat öná llóan, ehhez részben a aját maga által kódolt fehérjéket, részben a gazda ejt aját fchérjéit ve zi igénybe é ebben az e etbcn a fág a

378

GE, ETIKAII NFOR\1;\CJÓ TAIWL;\ SA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

A. DNS cirkuláris forma

E. coli DNS

integráció (

)

kimetszés

profág _ _ ___.

profág

bal oldali operátorok

A.-represszor génje

~s·

~s·

bal oldali transzkripció iránya

A.- represszor mRNS

cro mRNS irány s· ~

jobb oldali operátorok

cro gén

3-31 . ábra. A /.-tág integrációja az E. coli baktérium DNS-be és a profág szerkezete. A baktériumban cirkulárissá alakuló fág-DNS a specifikus PIP' szekvencia segítségével integrálódik a bakteriális DNS galaktóz és biotin operanak közötti szakaszán, ahol a bakteriális DNS egy specifikus B/B' szekvenciát tartalmaz. A profág génjei köz ül ezután csupán a i.-represszor fehérjét kódoló gén kerül expresszióra. A i.-represszor fehérje sztérikusan gátolja a saját génjétől jobbra és balra elhelyezkedő, egymással szemben orientált gének lranszkripciójál, a jobb oldalt, illetve bal oldali operátor régiókhoz kötődve, amelyek mindegyike 3 kötőhellyel rendelkezik a represszor számára. (A 1.-represszor affinitása a legnagyobb az 01 kötöhelyekhez). A /...-represszor mennyiségének valamilyen a baktériumol érő károsi tó halás miatt bekövetkező csökkenése a cro gén derepresszióját idézi elő. A cro gén által kódolt fehérje a 1.-represszorfehérjét kódoló gén represszora, ezért a cro gén derepressziója a 1.-represszor szintézisének a megszű­ néséhez, és a fág többt génjének a derepressziójához vezet. A profág átvált a litikus ciklusba

! A.- represszor fehérje

litikus utat vá lasztja. Bizonyos körűlmények között azonban a fág DNS-replikáció helyett, rekombináció segítségével integ rá lódik a gazda DNS-be a baktérium genomjának egy po ntosan meghatározott he lyérc (3-31. ábra). (Ez a hely a baktérium kromo zómáján a galaktóz o peron és a bio tin opero n között helyezkedik el.) Az integrá lódott fággenom a profág, é a baktérium amelynek kromoszom ája most már a profáget is tartalmazza a lizogé n baktérium. A profág stabilan m egmarad a baktérium-ON -be integráltan mindaddig, míg egy pecifikus enz im - ame ly a kihas írását kata lizálja nincs jelen. Ezt az enzimet a profág kódolja, de a ha ító enz im génjének transzkripc ióját é így az enzim szintézisét a A. represszor fehérje megaka-

dályozza. Mindaddig, míg a ha ító enz im genJC repre szálva van. a pro fág együtt replikálódik a gazda-DNS-sei, ezért a baktérium minden utód sejtjének geno mja tartalmazni fogja a profáget anélkül, hogy ez a sej t kárcsodá át okozná. A lizogén baktérium utódai sok o ztódáson kere ztül áltozat\anul fennmaradhatnak. A profág álta l kódolt fe hérjék köztil ilyenkor kizárólag a A.-represszor génje kerül tran 7kripcióra. A meg z intetizá lódon A.-represszor fehérje a profág operátor régióihoz kötődve megakadályozza az összes többi fág fehérjét kódoló lraszkripciós egység tran zkripcióját. Ha a A.-rcpresszor fehérje moleku lá inak 7áma c ökkcn a baktériumsejtben (bizonyo környezeti válto7ások, UV -be ugárzá stb. hatására), az el ő gén, amely a repres zió a lól

FEHÉRJESZI~TÉZI S

)))) )))))) )) )) )) )))) )))))))) )))) )))))))))))) )) )))))) )))) )))) )))))))) )) )) ) ))) )))) )))) l)))))))))))))))))))))))))))))))>))))) )) )))) )))) ))}> )))))))))))))))) )) )) )) )>))

felszabadul egy cro fehérjének nevezett, más ik represszor fehérjét kódoló gén. A cro fehérje a A.-represszor génjének transzkripc ióját gátolja, és nem engedi, hogy több A.-rcprcsszor szinterizálódjék. Ezen a ponto n a lizogén út irrcverzíbili en átvált litikus úttá. A A.-reprcsszor fehérje hiányában a profág többi génje a represszió alól fe lszabadul , megszintctizálódik a profág kiha ítását kata lizá ló enzim és a fág- DNS a baktérium - DNS-bő l kiszakadva, önáLló, gyors rep likác ióba kezd. A virionok alkotóeleme inek összercndeződése után a gazdasejt lizál és a virionok a környezetbe kerü lnek (3-31. ábra).

Állati vírusok replikációja A vírusoknak nemcsak a genetikai anyaga változatos, de replikációjukhoz, illetve annak gyorsításához i megl eh etősen vá ltozatos trükköket alkalmaznak. Minthogy szaporodásukhoz - a baktériumoktól cltérően - a gazdaszervezet saját sejtjeinek molekuláit, a gazdasejt saját fehérjeszintetizáló apparátusát veszik igénybe, továbbá nem rendelkeznek olyan a gazdasejtjétől biokémiai lag teljesen különbözö komponenssel, mi nt a baktériumok sejtfala, az olyan típusú antibiotikumok, mint amelyek a baktériumok szaporodását gátolják vagy képesek megölni a baktéri umokat a gazdaszervezet lényege káros ítása nélkü l, a víru ok ellen nem hatásosak. Az emberi szervezetet megtámadó vírusok elle ni gyógyszeres védekezésre csupán az egyes vírustípusok szaporodására jellemző, speciális moleku láris trükkök megismerése adhat reményt. A DNS-geno mma l re ndelkező virusok egy fogékony gazdasejtbc jutva á ltalában öná llóan, a gazdasej t geno mjától ftlggetlenül replikálódnak és rövidebb vagy hosszabb idő alatt a gazdasejt károsodását, esetleg lízisét okozzák, miközben az új virionok a kö rnyezetbe kerü lnek. (Az áll ati sejtek vírusai a T4-fágtól e l térőe n nem csupán ameztelen D S-t juttatják a sejtekbc, hanem fehérjekomponenseket is.) Vannak azonban a DNS-vírusok között ún. t r a nszformá ló D NS-vírusok, például a polyomavírus, vagy a s imianvírus (SV40 v írus), amelyek a fertőzött sej tek csak bizonyos típu a iban járják végig a sza porodás szokásos, öná lló

3 79

replikác ióval járó cik lusát, ezeket a gazdasejteket permisszív gazdasejtnek nevezik. Más sejttípusokban, az ún. n em permisszív gazdasejtek ben ezek a vírusok nem képesek önállóan szaporodn i, a nem permisszív gazdasejtben a fertő­ zés után nem képződnek utódvirionok. A nem permisszív gazdasejtek egy nagyon kis hányadában (egyetlen sej tben mintegy százezer sejt közül ) azonban a transzformáló DNS-vírusok genetikai anyaga integrálódik a gazdasejt DNS-ébe és rövidebb vagy hosszabb idő alatt a gazdasejt ro szindu latú tumorsejtré történő transzform ációj át okozza. A transzfom1á ló DNS-v írusok, pl. SV40 genomja a temperált fágokkal ellentétben, nem egyetlen, meghatározott helyen integ rálódik a gazdasej t DNS-ébe, hanem több hely közül is választhat véletlenszerűen . Az integrálódott víru -DNS a gazda-DNS-sei együtt replikálódik és az utódsejtek valamelyik kromoszómáj a ugyancsak tattalmazni fogja az integrá lódott provírust Gyakran nem a teljes vírusgenom, hanem annak csak egy része integrálódik. Az integrálódott vírusgenom á ltal kódolt fehérjék egy része fo lyamatosan expresszálódik. A v írus fehérjék közül némelyek a gazdasejt tumorszuppresszor génjeinek produktumával, pl. a p53 fehérjével, Rb-feh érj ével kornplexet képeznek és így megakadá lyozzák a tumorszuppresszor gének feb érjéinek müködését. (Az SY 40 vírusnak ilyen módon visel kedő fehérjéjét nagy T a ntigénnek nevezik. A nagy T antigénnek permisszív gazdában is van szerepe, itt a v írus-DNS replikációjának iniciác iójá hoz szükséges komponens.) Mi nthogy a tumo rszuppresszor gének által kódol.t fehérjék lassítj ák a sejtpro li ferációt, akadályozzák az átmenetet a G l fáz isból az S fázisba, funkc iójuk kicsésc a kompl ex-képződés miatt a sej tproliferáció gyorsuLásához vezet. Ez a provírus szemszögébő l nézve el őnyös, hiszen ilyen módon a provírus repLikációja is gyorsu l. A gazdasejt azonban elveszíti azt a kontroll mechanizmust, amely akadályozza a DNS replikációjának megkezdését mindaddig, amíg a DNS-t ért károsodások nincsenek kijavítva és így védi a sejtet a szomatikus mutációk kialakulása e llen. A szomatikus mutációk gyakoriságának emelkedése fontos komponense a rossszindulatú daga natok kialaku lásának. A tumor zupprcsszor gének fchérjéi müködésénck gátlása a va lószí nű oka a transzformál ó DNS-vírusok által (hosszabb

380

) ))))))))))>H>>>)))))))))))>>>>>>>)))>)HH)))))))))))) ))))))))>)>)))))))))l)))))))))))))

GEI'iETIKAIINFOR.\IÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS K I FEJEZŐDÉSE

idő

alatt) elő idézett daganatsej tté történő átalakulásnak. Az RNS-genomot tartalmazó állati virusok replikációja szempontjából megkülönböztetünk tisztán RNS-viru okat é retrovírusokat. A tisztá n RNS-vírusok genomjának replikációját az RNSdependens RNS-polimer áz (replikáz) végzi. Ezeknél a vírusoknál a mutációk gyakorisága nagy, mert az RNS-polimeráznak nincs hibajavító nukleáz aktivitá a. A tisztán RNS-vírusoknak a rcplikációs stratégiája kü lönbözik a zerint, hogy a vírusgenom egyszálú + RNS, egyszá lú - RNS vagy kettő szálú RN S. A gazdasejtbc jutolt egyszá lú

+ RNS betöltheti azonnal a mRNS zercpét is, és a vírusreplikációho1: szük éges peciáli fehérjék. pl. a replikáz en?im szintézisét is biztosítja. A replikációhoz meg kell szintetizálódnia a komplementer, azaz - RNS-Iáncnak, majd errő l másolódhat gyors ütemben a7 új + RNS-genom. A - RNS-gcnommal rendelkező virusok genomja nem használható mR S-ként, ezért ezeknek meg kell szintetizá lniuk a komplementer + RNS-láncot, mi e l őtt bármilyen viru fehé1je-szintézise ·orra kerülne. A - RNS-genomma l rendelkező vírusoknak ezért a fertőzéskor a gazdasej tbc kell juttatniuk a replikáz enzimet i . K ettős szálú R S-vírusok esc-

vírusfertözés

1. sejt kettős

szálú RNS

aktív kettős szálú RNSdependens protein-kináz

~

~

interferon szintézis és szekréció

ATP

l

ADP

aktív ribanukleáz L rRNS, mRNS - - - - - - -• oligonukleotid

interferon

~

~ §}---®

7'\

vírusfertözés 2. sejt

2. sejt - - - - - - - - -

indukció

kettős

oligo-A-szintetáz (inaktív)

•

szálú RNS

oligo-A-szintetáz (aktív)

ribanukleáz L (inaktív)

~

oligo-A kettős

szálú RNS-dependens protein-kináz (inaktív)

~ ribanukleáz L (aktív) protein-kináz

(aktfv)

3-32. ábra. A gazd aszervezet

kettős

szálú RNS által kiváltott védekezési mechanizmusa a - és P-interferonok segitségével

FEHÉRJ ESZII\'l É:Z I.

>>>>»>> >> >>>>>>>>>>n>>»>>>>>>>>>>>>»»>>>>>>>>>>n>>>>»>>>> n»n >>>U>>>>>>>>>>>>>>>>>>>n>>»>>>>»>>>>>>>>n>>>> •>>>n>>>>>>n»>>>>>> •>>>>>>>>>u n •> >>>>

tében i el őbb a mRNS-ként szolgáló + RNS-t kell meg zintctizá lni, mielött a teljes geno m replikációjára or kerülne. T i ztán RNS-vírusok repl ikációja közben átmeneti leg, mindcn e etben meg kell jelennie a kettős szálú RNS-nek. A kettő zá lú RNS megjelenése a gazda ejtben, a gazdaszervezet védekezési reakcióját váltj a ki, amelyet az interferonok közvetítenek (3-32. ábra). A gazdaszervezet 'írusfenö7ését követően, ke ttős s7álú R S megjelenésérc bi.wnyos sejuípusok a citokinek családjába tar1o7Ó, mtcrfcronolo.nak ncve7ett fehérjéket ~zintet izál­ nak é~ stekretálnak. (Leukociták által s7intctinílt a.-. fibroblasttok által ~.dntetizáh ~-és limfociták által :tintctizált immun-. más né\Cn y-interferonok különbö7tcthctök meg. C7 utóbbiak hatásmechani7mu a sokkal több komponenst tartalma7.) A7 mtcrferonok a gazdas1en e7ctmá!., még nem fertötölt sejtjeiben három en7im szintézisét indukálják: egy 2',5'-oligo-adenilát- (oligoA) szintetáz enzimét. egy spCCJfiku . oligoA-dependens endonukleáz en7imét (ribonuklcáz L) és egy specifikus. kettő s szálú RN -dependens protcin-kiná.lét. A három enzim a szintézist követően nem aktív, dc jelenlétük a sejtben egy vi ruscllcnes készültséget jelent. lia at ilyen módon felkészült sejtben a vírusfertözés kö' ctkCLtébcn megjelenik a kettős szálú R S, müködni ketdenek e1ek a1 enzimek is. Ekkor aktiválódik a ke llős szálú R -dependens protein-kináz, amely a gazdasejt fehétjes7inteti7áló rendszerének egyik fonto fehérjckomponen ét (az elf-2 iniciációs faktort ) foszforilálja és így inaktíválja. Ezzel a sejtben a fehérjes7intézis leáll és nem kép7ődnek a v í-

3-33. ábra. A humán immundeficiencia virus (AIDS vírus) szerkezetének vázlatos képe

381

rus szaporadá ához szükséges komponensek. A kettos s7álú RNS aktíválja az oligoA-szintetá7 en7imet is, a g) orsan szintetizálódó oligoA vi. zont az oligoA-dependens ribonuk leá7l aktiválja. A mRNS- és a rR -molckulák a nbonukleáz hatá!.ára degradálódnak é· a fenőzö tt sejt nem tennel új virionokat. A fenti mechani7rnus a7 interferonok hatásának csupán egyik komponense.

A retr-ovírusok fe lfedezése vá ltoztatta meg (részben) a genetikai információ áram lásának irányáró l korábban a lko to tt centrális dogmát, miszerint a genetika i információ iránya DNS~ RNS~ fehérje. Az RNS-genommal rendel kező retrov írusok esetében ugyanis a genetikai infom1áció zám1azik a kerül DNS-re, innen RNS-rő l retrovíru elnevezés. A7 RNS-mintáról tö rténő DNS- zintézist az RN -dependcn DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) katalizálja, e7t az enz im et a retrovírusok genomja kódolja. A retrovírusok geno mja egys7á lú + RNS-molekula, amelynek két azonos kópi áját tatialmazza a v irio n. Az RNS egy ikozahedráli fehérjeköp ennyel van körül véve. A köpenyen belül található a reverz transzkriptáz enz im is, amelyet a virion a gazdasejt fertözésekor ugyane ak a gazdasej tbe j uttat. A köpe ny körül egy lipid ke ttősréteg he lyezkedik e l, ame ly glikoprotein-"tü kéket" tartalmaz. A g likop rote inek a víru geno m á lta l kódolt fehér-

382

))))))))))» >»> ))")) ))>)))))))))))))))))))))))))))))))))))))>)))))))))))))))))>)))))))))

j ék, a lipid kettős réteget a v irion az e l őző gazdasejt membránjából "rabolta". A retrovírusokra jellemző szerkezetet mutatja a humán immundcftícicncia vírus (HlV, AIDS vírus) képe (3-33. ábra). A retrovírusok é letc iklusa akkor kezdődik, amikor a vírus glikoproteintüskéi egít égével egy fogékony gazda ejtnek e glikoproteinrc érzékeny receptorához kötődik. Ezután a vírus és gazdasejt lipidmcmbránja összeolvad és a virion be l ső a lkotóelemei a sejt belsejébe kerülnek. A retrovírusok szaporodásának kötelező, e lkerülhetetlen feltétele a vírusrészcc ke + RNSgenomjáról a reverz transzkriptáz egít égével másolódó kettős szálú DNS integrálódása a gazdasejt gcnomjába. A reverz transzkriptáz álta l katalizált folyamat bo nyo lult, több l épésből áll. A fertőzés után a + RNS-Iáncról el őször a - DNS-lánc szintetizálód ik meg, m ajd a DNS- R NS hibridből az RN S legnagyobb része lebontásra kerül. Ezután az eiké züiL - DNS-Iáncról máso lódik a +DNSlánc. Mint mindcn DNS-polimeráz, a reverz transzkriptáz is primert igényel, az el ső néhány nukleotid közti foszfodiészterkö téseket nem tudja mcgszintetizálni. A retrovírusok érdekes trükköt alkalmaznak ennek a problémának az áthidalására;, a - DNS-lánc szintézisekor a primer szerepét egy tRNS 3 'O H-vége szolgá ltatja. A + DNS-szál szintéziseko r az eredeti vírusgenomból származó RNS-mo lek ulának egy nem lebontott kis darabja szalgá ltatja a primert. Végül mind a maradé k +RNS-lánctó!, mind a tRNS- tő l megszabadul a kettős szálú DNS. A lineáris RN S DNS-sé történő átírásában jelentős tényező , hogy a retrovírusgenom mind az 5'mind a 3' -végén tarta lmazza ugyanazt a szekvenc iát (R-szekvenc iának nevezik). A reverz tran zkriptáz müködését kísérő bonyolult folyamatok eredményeként az eikészü lő DNS kettős helix hosszabb lesz, mint az eredeti + RNS-genom, az R-szekvencián kívül még két másik, eredetileg csak az RNS egyik, illetve másik végén szercpl ő szekvenc ia is mcgduplázódik, így az c ikészü lő DNS mindkét végén tarta lmazni fogja ugyanazt a hosszabb zekvcnc iát (hosszú, terminá lis ismét l ő­ dés, L TR-szekvenc ia). A kettős szálú DNS c irkuláris formát vesz fe l, a gazdasejt magjába jut és integrálódik a gazdasejt geno mjába. Az integrálódás véletlen szerű e n , kü lönböző helyeken tö rté nhet, ahol a gazdasej t genomjában TCAG

GE 'ETIKAII N FOR~IÁCIÓ TAROLÁSA ÉS KIFEJEZÖ DÉ E

szekvencia van. Ellentétben a transzformáló DNS-virusokkal, retrovírusok esetén az integráció gyakori sága igen nagy, a fertőzött sejtek igen nagy hányadában mcgtörténik. A transzkripció, illetve a + RNS vírusgenom sokasodása, amely ugyancsak valódi transzkripciónak tek inthető, csak az integrálódott provírusról indul el a gazdasejt enzimeinek a segítségéveL Az L TR szakaszoknak nagy szerepük van a gazdasejt DNS-be tö 11énő integrációban és a transzkripció szabályozásában is. A retrovírusgenom és a vi rion a lkotórészeinek mérsékclt ü temű szintézise nem jár együtt a gazda ejt pusztulá á al, a legtöbb rctrovírus nem öli meg a gazdasejteL A virion összeáll , majd a gazdasejt mcmbránjának egy részén kid udorodik és a gazdasejt plazmamembránjának lipid kettősrétegébő l egy darabot kiszakítva kerül a külvilágba. (A gazdasej t líziséhez csak a vírus nagyon gyors szaporodása vezet.) Mérsékelt ütemben szaporodó retrovírus a gazdasejt DNS-ébe integrálódva, provírusként a gazdasejt szaporodáakor generációról-generációra öröklődik é az utódsejtekben is jelen van.

Az emben fertőző retrovírusok közül az orvostudomány számá ra legfontosabb a már említett HlY, az AIDS virusa (3-33. ábra). Az AIDS ví rus fert őzésre legfogékonyabb sejttípus a T4 limfocita. A T4 limfociták nevüket egy sejrmembránjukban jell ernzően jelen b ő (T4 anti gén nek) nevezett fehérjéről kapták. EL.ck a sejtek az immunrendszerben életfontosságú feladalot látnak cl a B limfociták és más T limfociták müködésének előse­ gítéséveL Az AIDS vírus membránburok glikoproteinjei közüla gp l 20-nak nevezett fehérje nagy affin itással kötődik a T4 antigénhez és a7 ilyen módon a T4 sejtmembránjához kötődö' írus fertőzni képc.5 a T41imfocitákat. A gazdasejtbc jutva, a reverz transzkriptáz által katalizált folyamatok után a gazdasejt DNS-ébe integrálódva azután provírus fonnájában hosszú ideig jelen lehet úgy, hogy a ví rushordoL.ó szervezctct látszólag nem betegiti meg, bár a fertőzést követő néhány hetes periódus után a fertőzött egyén s7ervczetében a vírusfehérje kimutatható. A hordozó T 4 limfociták aktiválódásával egyidejűleg a provírus is aktiválódik, a virionrészecskék szintézise erősen meggyorsul és a T41imfocita elpusztul. i.\ gp 120 fehérje más módon is működésképtclenné tudja tenni a T4 sejtckct, több T4 sejtet mcmbránjánál összekötve szincieiumokat alakít ki. A T4 sr:jtek működésképtclen­ sége vezet az immunrend zer összcomlásáhoL. és a betegség kialak.ulásához. A betegek az immunrendszer összeomlását követő másodiagos fertőzések következtében halnak meg. Bár a T4 li mfoeita a legfogékonyabb

FEHÉRJE ZINTÉZI

383

gazdasejt az AIDS vírus számára, néhány más sejttípus is megfertőződi k az A fOS betegség folyamán. A gp 120 fehérjét kódoló gén mutáeióinak frekvenciája igen nagy, ezért a HIV ellen való oltáshoz az ellenanyag termeltetés egyeniöre nem látszik megvalósíthatónak. Az AIDS vírus ellen alkalmazott gyógyszerek főkén t a reverz transzkriptáz aktivitásának gátlására irányulnak. Ezek a vegyületek meglehetösen toxikusak, általában gátolják a mitokondriumokban levő DNS-polimerázt is.

Onkogéneket hordozó retrovírusok és a celluláris protoonkogének Különböző

állati sejteket fertőző retrovírusok genomjai olyan géneket hordoznak, amelyek az integrálódott provírusról folyamatosan transzk:ripcióra kerülve, a gazdasejt rosszindulatú daganatos sejtté történő transzfom1ációját elői déző fehéijék szintézisét teszik lehetövé. A daganatos átalaku lás az ilyen típusú vírusokkal fe 1iőzött sejtekben - e llentétben a transzfom1áló DNS-vírusok által okozott folyamattal - a fertőzés után gyorsan bekövetkező, akut változás. A retrovírusok által hordozott akut transzformációt elő idéző géneknek (onkogének, v-one gének), illetve az álta luk kódolt fehérjéknek a megismerése nagymértékben járult hozzá a daganatos betegségek kialakulásának molekuláris mechanizmusáról rendelkezésre álló ismeretekhez. Az első megi mert, akut transzfom1ációt okozó retrovírus, a madarakat fertőző Rous-sarcoma vírus genomjának szerkezetét a 3-34. ábra mutatja.

3-34. ábra. Egy onkogént hordozó retrovirusgenom (madár sarcoma vírus) szerkezete. Az 5'- és 3'-végeken jelen lévő ismétfödö R szekvenciák, illetve az U5 és U3 szekvenciák a reverz transzkriptáz által létrehozott szerkezetben az LTR- (hossszú terminális ismétlő­ dés) régiók kialakításában vesznek részt. A PBS-szakasz a reverz transzkriptáz primeréül szolgáló tRNS kötődésének helye. A köpenyfehérjéket a gag, a reverz transzkriptáz enzimet a pol és a külsö burok fehérjéit az env gén kódolja. Az src gén a vírus által hordozott onkogén, egy protein-tirozin-kináz enzimet kódol

A + RNS-genom csupán néhány fehérjeszerkezetet kódológént tartalmaz. Az 5'-, illetve 3'-végen elhelyezkedő, a provírus L TR-szekvenciájának kia lakításában részt vevő régiók között találhatók a köpeny és a külső burok febérjéit kódoló gének, a reverz transzkriptáz génje és az src-gén, amely a Rous-sarcoma vírus á ltal fertőzött á llatokban felelős a rosszindulatú daganatok kialakulásáért, illetvc sejttenyészetekben a fertőzött sejtek transzformációjáért. . Más állatfajták daganatait előidéző retrovírusok esetében más-más transzformációért fe l el ős gént (onkogént) talá ltak, ezeket többny ire az állat és a betegség nevét jelző betűnevekkel nevezték el (3-2. táblázat). A legtöbb retrovíru csupán egyetlen transzformációért felelős gént tartalmaz. Az igazi meglepetés akkor érte a kutatókat, amikor kiderült, hogy a retrovírusok daganatos betegséget okozó onkogénjeivel homológ bázisszekvenciát mutató gének minden egészséges sejtben megtalálhatók. Ezeket a minden egészséges sejtben megtalálható, a vírus onkogénekkel (v-one génekkel) homo lóg bázisszekvenc iát mutató géneket protoonkogéneknek (c-one géneknek) nevezték el. A protoonkogének által kódolt fehérjék intenzív vizsgálata felderítette, hogy a cclluláris protoonkogének olyan fehérjéket kódolnak, amelyek a sejtek fiziológiás proliferációjának és differenciálódásának a szabályozásában vesznek részt. Mint azt egy későbbi fejezetben (lásd 5. fejezet) részletezzük, a protoonkogének által kódolt fehéJjék között vannak ún. növekedési faktorok, ame lyek a sejtproliferáció extracelluláris jeléül szolgá lnak, vannak olyanok amelyek e növekedési faktorok

+RNS 5 • l R l U 5 tBS l gag l

pol

en v

src

l

U3 R

1 l 3'

DNS (_) 3 , lt --+--t---t---tl....::g:.a.::=. g-;l--=-p_o_l -+-en_v_

+-1_ sr_c-ll --l--+--1l

5,

1 u 1R 1u l 3' 3

LTR

5

384

GENETiKA I INF0Rl\1ÁCIÓ TÁ ROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

)uu»»>»»»»»>»»»»>l»»l»>»»»>>»»>>»»»»»>»>>»>u»»»»>»»»»

3-2. táblázat. Néhány retrovirus onkogén (v-one gén) által kódolt fehérje

-

he-. - - -F-e--

---.l__,.......__ ,~-~------~-O~.n_. ,_k~o~g-é_"-_-_ -:_-"""~--___ r-je~~~~~~~-~~~~~

l

Retrovlrus

majom sarcoma

Növekedési faktor

sis

Növekedési faktor receptora

erbB

madár erythroblastosis

Nem receptor protein-tirozin-kináz

src

Rous madár sarcoma

GTP-kötő

H-ras K-ras

Harvey rágcsáló sarcoma Kirsten rágcsáló sarcoma

fos myc

FBJ osteosarcoma madár myelocytomatosis

fehérje

Transzkripciós faktor

receptoraként működnek, vannak olyanok, amelyek a növekedési faktor- receptor komplex sejt belseje felé irányuló bonyolult j e ltovábbító rendszerében játszanak szerepet (speciális GTP-kötő fehérje és különböző protein-kinázok) és vannak közöttük a növekedési j elre möködésbe jövő génszabályozó fehérjék (transzkripciós faktorok) (3-2. táblázat). Ezeknek a fehérjéknek a müködése a sej tproliferáció fiziológiás szabályozása során nagyon pontosan koordinált. A retrovírusok által hordozott v-one gének az egészséges sej tek protoonkogénjeinek mutációt szenvedett és az eukarióta gének exon- intron szerkezetét e lvesztett, intron nélküli vá ltozata i. Akut transzformáló hatásukba n kü lön böző tényezők játszanak szerepet. A kódoló gén szerkezetét érintő mutáció következtében nem tökéletes fe hé1jék szintézisét idézik el ő, hanem olyanokét, amelyek regulációj ukat elveszítve, a fiziológiás jel hiányában is permanensen aktív állapotban taltják a sejt proliferációját előidéző, bonyolult jelrendszert A provírus gén állandó expressziója miatt e fehérjék mennyisége is több lehet, mint amennyi a fiziológiás növekedéshez szükséges, illetve a vírusfertőzés következtében olyan sejtekben vagy olyan időpon tokban is expressziéra kerü lhetnek, amikor erre fi ziológiás körülmények között nem volna l ehetőség. A kórosan fokozott sejtproli feráció vezet az akut daganatos transzformációhoz bizonyos sejtekben. Maguk a retrovírusok kevés esetben okoznak emberben daganatos megbetegedést, a v-one gé-

nek illetve az ezekkel homológ celluláris protoonkogének felfedezésének azonban óriási jel en tősége van a daganatos megbetegedések patomechanizmusának a felderítése szempon~ából. Ezen gének megismerését követően emberi daganatok sejtjeiben is analizálni kezdték a protoonkogéneknek megfelelő géneket és már az eddig analizált esetekben is az derült ki, hogy az emberi tumorok kifejlődésének nagyon fontos komponense a protoonkogének átalakulása onkogénekké szomatikus mutáció következtében. Az onkogénné átalakult gén fehérjéje ebben az esetben is permanensen aktivált álla potba hozza a sejtproliferáció fiziológiás körűlmények között szigorúan szabályozott jeirendszerét Emberi tumorok kifejl ődésekor á ltalában nem egyetlen gén mutációjáról van szó, hanem a regulációban szerepetjátszó több gén egymást követő sérü lésérőL A szomatikus mutációk gyakoriságának növekedése (UV-sugárzás, ionizáló sugárzások, mutagén kémiai anyagok a tápanyagokban vagy környezetben, a DNS repair mechanizmusának öröklött gyengesége vagy sérülése stb.) növelik a protoonkogének onkogénekké történő átalakulásának va l ószí n űségét. A mutációk bekövetkeztének valószínüségét a tumorszuppresszor gének által kódolt fehérjék csökkentik. Ennek a ténynek az ismeretében könnyen érthető, hogy a tumorszuppresszor gének Iciesése azok saját mutációja miatt vagy a transzformáló DNS-vírusok tumorszuppresszor gének febérjéit közömbös ítő fehérjéi elősegítik a protoonkogének esetleges átalakulását onkogénckké.

FEH ÉRJE Z INT ÉZ IS

J))))))))))))))))))) H))))))))))l))))) )l)})))))))') l)))))))))))})))))n))')))) )'f)) )) >)o))}))))) H)) \l>))))))))) >l)) )))))H) l))))))) )l)))))))) U)))))))))) >HH) )) )) H

A protoonkogének közül eddig a növekedési faktorok jeltovábbító rendszerében szerepet játszó GTP-kötő fehérjét kódoló r as gén mutációit találták meg leggyakrabban (a vizsgált daganattípusok mintegy 30%-ában). E mutációk gyakoriságának az is oka lehet, hogy az emberi genom három kül önböző ras gént (H-ras, K-ras, N-ras) tartalmaz (mindháromból két-két allélt). Az emberi daganakban eddig talált, egyik Leggyakoribb mutáció a p53 szupprcsszor gén károsodása (mintegy 50%-ban for-

385

dul el ő). Gyakori a p53 és ras mutációjának együttes el ő­ fordu lása. Még gyakoribb a p 16 tumorszupprcsszor gén mutációja.

Az állati retrovírusok v-one génjei valamikor a gazdasejtek c-one génjeiből eredhettek (amelyekhez az integráció révén jutott közel a provírus), az evolució során intronj ukat elvesztették és mutációkat szenvedtek.

3.4.

Fehérjeszintézis: a transzláció mechanizmusa és a polipeptidlánc további sorsa FaragóAnna

/1. kódszótár A transzkripc ió, illetve eukariótákban az e lsődl e­ ges transzkriptum érése után a fehérjék szcrkezetére vonatkozó genetikai információ a mRNS nukleotidsorrendjében j e lenik meg. Az egyes aminosavakat a mRNS 5' -vége fe lő l a 3' -vég irányában egymást folyamatosao követő nukleotidhármasok határozzák meg, az egy-egy aminosavnak megfelel ő nukleotidhármast nevezik kodonna k. A mRNS-ben j elen l evő 4 különböző bázis mindegyike a kodonban 3 lehetséges helyen fordulhat e l ő. Ennek alapján összesen 64 különböző kodo n j ön létre, viszont a febérjékbe csak 20 aminosa v épül be. A 64 lehetséges kodon közül 3 nem j e lent aminosavat ( UG A, UAG, UAA, ún. nonsense kodonok, stopkodonok) ezek a polipeptidlánc szintézisekor a szintézis végének helyét mutató stopjelek. Az AUG kodon metioninnak fe le l meg, azonba n az A UG kodonnak kitüntetett szerepe is van. Az AUG kodon j elzi ugyanis a mRN S-en a polipeptidlánc szintézisének startpontját A polipeptidlánc zintézise orán az e l ső beépü l ő, a polipeptid N H 2-végén elhelyezkedő aminosav mindig metionin (prokariótákban a metionin formi lezett származéka, N-formil-metionin ). A startkodon e lő nukleotidjátó l a stopkodonig tart a polipeptid láncra vonatkozó olvasási ker et. A többi 60 kodon o z lik meg J 9 ami no av között. Ebbő l következ ik, hogy az egyes aminosavakat egynél több kodon képes meghatározni (a genetikai kód "degenerá lt"), egy-egy kodon azonban mindig csak egy bizonyos aminosavnak felel meg. A metioninon és triptofá non kívül minden

aminosavnak egyné l több kodonja van (3-35. ábra). A genetika i kód univerzális, néhány kivételtő l eltekintve minden é lő l ényre ugyanaz a kódszótá r érvényes. A kivételek közé tartozik néhány, az evolúc ió "zsákutcáj ának" tartott egysej tű organizmu , illetve az eukarióta sej tek ej torgane llumaiban e l helyezkedő fehérjeszintetizáló apparátus (ez utóbbira még visszatérünk.)

elsö hely 5' vég

harmadik hely 3' vég

második hely

u

c

A

G

u

u

P he P he Leu Leu

Cys Tyr Ser Se r Tyr Cys Se r STOP STOP Se r STOP Trp Pro Pro Pro Pro

His His Gin Gin

Arg Arg Arg Arg

u

c

Leu Leu Leu Le u

Th r Th r Th r Th r

As n As n Lys Lys

Ser Ser Se r Se r

u

A

Ile Ile Ile Met

Ala Ala Ala Ala

As p As p Glu Glu

Gly Gly Gly Gly

u

G

Val Val Val Val

3-35. ábra. A kódszótár

c

A G

c

A G

c

A G

c

A G

FEli ÉRJESZINTÉZI

A transzlációs apparátu s komponensei A nukleotidsorrend aminosavs orrenddé történő átfordításához szük ég van egy adapter molckulára, amely pontosan felismeri az adott kodont, és a kodon által jelzett aminosava t a megfelelő helyre ille zti. Az adapter szerepét látja el a tRNS molekula. A tRNS-ekbe n ta lálható komplemen ter és nem komplemen ter nukleotid zakaszok által létrchozott másodiagos szerkezet sikbankive títve lóhere alakú (lásd 3- 19. ábra). Minden tRNS-ben található három nagyobb, jellegzetes szerkczetű hurok (T., U. és IV. hurok), míg egy kisebb hurok szerkezete variábi lis (III. hurok). A tRNS 5' -vége foszforilált, 3 'OH-végén minden tRNS CCA nukleotidsorrenddel rendelkezik. ez a transzkripció utáni módosulás ként rakódik a molekulára . A tRNS három dimenziós térbeli szerkezete a már ismert kölcsönhatá sok miatt L a lakú, az 5'-vég és a 3' -vég egymáshoz közel kerül és komplemen ter bázisok révén hidrogénhi dakat alkot egymással. A 3'-vég CCA nukleotidja i már nem vesznek részt a komplementer szerkezetbe n, az adenilsav szabad 3'0H-jához vagy 2'0H-jáho z kötödik az adott tR S-molekula által szállított meghatároz ott aminosav. A tRNS a hidrogénhi dak miatt meglehetösen rideg sze rkezetű, csak a CCA vég mozgékony. A CCA végtő l az L a lakú térbeli szcrkezetb cn legtávolabb el helyezkedő hurok az antikodon hurok (ll. hurok). Ez hét nukleotidb ól áll, de magát az antikodont, amely a tRNS á ltal szállított am inosavat meghatároz ó kodont felismeri a mRNS-en, három nukleotid alkotja. Egy adott tRNSmolekulában levő antikodon nukleotidtr ipiet komplementer az á lta la felismert kodonnal és azza l antiparallel irányban illeszkedik össze. Ez az összeilleszkedés teszi lehetövé, hogy a polipeptidláncba a megfelelő aminosav épüljön be. Az antikodon 5' -oldalán mindig egy pirimidint tartalmazó nukleotid, 3 '-oldalán általában egy módosított purint tartalmazó nukleotid helyezkedi k el. A lóhere alakúnak ábrázolt tRNS-mole kulákban az 5' -végtől indulva megfigyelhető L hurokban mindig megtalálha tó egy dihidrourac il tartalmú nukleotid, míg a TV. hurok jellegzetes sége a timidin-pszeud ouridin-citi din szekvencia, amelyet egy purintartalmú nukleotid követ. A különböző

tRNS-mole kulák nagyságána k vá ltozatosság át (65- IlO nukleotid) elsősorban a IfJ. hurok nagyságának variábilitás a okozza. A tRNS-ek zerkezctc lehetövé tesz i az am inoacil- tRNS kapcsolat kialakulását katalizáló, az adott tRNS-re és a hozzátartozó amincsavra egyaránt specifikus aminoaciltRNS-szint etázhoz történő kötődést és a fehérjeszintézisbe n részt vevő riboszómák kal való kapcsolatot is. Az aminosava kat jelentő különbözö kodonok száma nagyobb, mint egy adott sejtben (eukarióta citoszolban ) található különböző tRNS-ek száma. Minden am inosavnak má -más tRNS-mole kula felel meg, azonban nem minden kodonhoz tartozik egy másik tRNS. Az azonos ami nosavat je l ző különböző kodonokat, ba azok csak 3. betűjükben különböznek egymástól, gyakran (de nem mindig) ugyanaz a tRNS-mole kula ismeri fel. E jelenség magyaráza tául a kedon- antikodon közötti speciál is kapcsolat, a kodon- antikodon lötyögés zolgá!. A kodon- antikodon kapc olatban a komplementer, antiparallel nukleotido k elrendezöd ésc nem olyan szigorú mint a DNS kettős hélix esetében, hiszen itt csupán három bázispár alakul ki, és a me llettük l evő nukleotide k nem alkotnak olyan szoros, zárt szerkezetet , mint a DNS-ben. Ezért a kedon- antikodon kapcsolat egyik szélén, amely a kodon 3. helyen levő báz isa és az antikodon l . helyen l evő bázisa között jön létre, a DNS-ben soha el ő nem forduló bázispáros adások is megengede ttek. Ilyen "lötyögős" szerkezetek a lakulnak ki akkor, ha az antikodon l. helyén l evő bázi a uracil (ez aszokásos adeninen kívül itt, még a guaninnal is tud hidrogénhi dakat képezni), ha az antikodon l . helyén guanin van (ez itt, a citozinon kívü l még uracillal is tud kapcsolatot teremteni) és ha az antikodon l . helyén l evő nukleotid inozin av. (Ez a nukleotid a nukleinsav ak közül csak a tRNS-ben fordul elő, posztszinte tikus módosulás útján alakul ki. Az inozinsavb an levő hipoxantin különbözö elrendezödés ben az uracillal, citozinnal, de még az adeninnal is képes hidrogénhi dak kialakításá ra, mert a kodon- antikodon szerkezet szélén a purin- purin kapcsolat nem ütközik olyan ztérikus akadályokb a, mint a D S-ben.) Az ilyen antikodonnal rendelkező tRNS-ek kettő vagy három, egymá tól csak harmadik betűjükben különbözö kodont is képesek felismemi. Az egy azono tRNS á lta l feli mert különbözö kodonok természetcsen

L

..

388

,.,",,.,.",.,.,".,,.""),.,.,.,,,>»>)»>>m>»»•>»>>m»>>>)>m>»>»mn»»»

ugyanazt az aminosavat jelentik. Azoknak az aminosavaknak, amelyeknek kodonjai nemcsak a 3. betűben különböznek egymástól, egynél több tRNS-ük van. A tRNS csak az antikodonnak megfelelő kodont ismeri fel és bei lleszti a 1nRNS által meghatározott helyre az általa szá ll ított aminosavat Ha kísérleti úton összekapcsolnak egy tRNS-t a nem a specificitásának megfe lelő aminosavval, akkor az hibás aminosav beépülését segíti el ő a polipeptidláncba. Egy bizonyos tRNS-molekula és az antikodonjának megfelelő aminosav közti kapcsolat kialakulásának specificitásáért az aminoacil-tRNS-szintetázok felel ősek. Az aminoaci l-tRNS kialakulása két lépésben végbemenő folyamat, a köztitennék azonban nem disszociál Je a reakciót katalizáló aminoacil-tRNS-szintetázról. Az első lépés az aminosav aktiválása A TP segítségéve!, e reakció eredményeként am inoacil-AMP képződik és pirofoszfát hasad le az ATP- bő l (tehát két magas energiájú foszfát hidrolízisével kell számolnunk). Az aminoacil-AMP-ben az aminosavak karboxilcsoportja és az AMP foszfátcsoportja savanhidridkötést alkot egymással. A második lépés az aktivált aminosav átvitele a specifikus tRNS-re, az AMP lehasadása közben. Az aminosav karboxi lcsoportja ekkor a tRNS 3 'CCA végén levő

a H-

adenilsav ribózának 2' vagy 3 'OH-jára kötődik észterkötéssel (3-36. ábra). Ez a kötés - el térően a Jegtöbb észterkötéstől - makroerg, az e kötésben konzervált energia a polipeptidlánc szintézisekor használódik fel. Az aminoacil-tRNS-szintetáz által katalizált reakciók netto egyenlete a következő : A TP + aminosav + tR S ~ aminoacil-tRNS + AMP + PP, Az egy bizonyos aminosavnak megfelelő kodont feli smerő tRNS-t az aminosav fel ső indexbe tett rövidítésével szoktuk jelezni, pl. tRNSA1\ tRNS 11", míg az aminosav és a tRNS közti észterkölés kialakulásának (a töltött tR S-nek) a j elzése pl. alanil-tRNSA1", izoleucil-tRNS 11e stb.

Minden aminosavat saját, csak rá specifikus aminoacil-tRNS-szintetáz köt a megfelelő tRNShez. A fehérjeszintézis genetikai kódhoz való hű­ ségét kizárólag az aminoacil-tRNS-szintetázok nagyfokú specifitása biztosítja. A tRNS azt az aminosavat segíti beépíteni a polipeptidláncba az antikodonja által felismert kodonnak megfelel ő pozícióba, amelyiket a szintetáz hozzákötötte, csak a specifikus aminoacil-tRNS- zintetáz ismeri fel egyszerre az adott aminosavat és a neki megfelelő tRNS-t. Az aminoacil-tRNS-szintetázok a sejt legnagyobb specifitású enzimei közé tartoznak. A megfelelő tRNS fel ismerése kön nyű feladat, mert

b

R

l Cl

GENETI KAI INFORMÁCIÓ TÁ RO LÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

i~oleucln

specifikus ,

aminoacil-tRNS-szintetá~

NH 2

C= O l

valin

---.,J---

ATP

~PP;

o

izolaucin specifikus aminoacil-tRNS-szlntetáz

vali n~AMP valin + AMP +

~

r

Hp

. tRNS'Ie

izolaucin specifikus aminoacil-tRNS-szintetáz

3-36. áb ra. Az aminoacil-tRNS kialakulása. (a) Aminoacil-tRNS szerkezete, (b) az aminoacil-tRNS-szintetáz hibajavító mechanizmusa

FEHÉRJESZI NT ÉZI S

a különbözö aminosava kat szállító tRNS-ek bázisszekvenciáj a különbözik egymástól. Nehezebb pontosan felismern i az egyes aminosavakat, mert bizonyos aminosavak szerkezete meglehetös en hasonlít egymáshoz (pl. izoleuc in- va lin). Az a minoacil-tRNS-s zintetázok kettős szürövel rendelkeznek. Az esetleges (ritkán) elkövetett hibás reakciók korrigálásá ra egy második szubsztrátfe lismerö helyet is tarta lmaznak. Ha véletlenül egy téves aminosavat aktiválnak (pl. az izoleucinra speciftkus enzim a val int), a specifikus tRNS Uelen 11 esetben tRNS c) kötődéseko r hidrolizáljá k a hibás kötést. (Az aminoacil- tRN S-szintetáz oknak ez a sajátossága emlékeztet a DN S-replikáci óná l megismert hibaj avító készségre, 3-36. ábra). A polipeptidlá nc z intézise a riboszómá k segítségével zajlik. A riboszómák egy kisebb és egy nagyobb al egységbő l á lló ribonukleoprotein-részecskék, amelyekne k prokariótákban, illetve eukariótákban megtalálha tó formá i különbözne k egymástól. A prokarióta riboszóma aktív, asszociált szerkezete (70S riboszóma ) molekulatö mege kb. 2 800 OOODa, hossza 29 nm, szélessége 2 J nm. A nagyobb a legység (50S alegység) két rRNS-t, a mintegy 120 nukl eotidból á lló SS rRN S-t és a mintegy 3000 nukleotidb ól álló 23S rRN S-t ta rtalmazza és ezeken kívül még mintegy 34 különbözö fehérjét. A kisebb alegységben (30S alegység) egyetlen, kb. 1500 nukleotidb ól álló 16S rRNS van és kb. 2 1 fehérje. Az eukarióta riboszóma (eltekintve a mitokondriumok ban levő riboszómát ól) nagyobb és több komponens böl á ll. Az eukarióta riboszóma nagyobb alegysége (60S a legység) három mo lekuJa rRNS-t tarta lmaz. Ezek közül az egyik egy nagy, kb. 5000 nukleotidb ól á lló 28S rRNS, a másik kettő ki ebb, 160 nuk leotidból álló 5,8S, illetve 120 nukleotidbó l álló SS rRNS. A nagyobb a legységhez kb. 45 fehérjemo lekula tartozik. A kis alegység (40S alegység) egyetlen, kb. 2000 nukleotidb ól álló J 8S rRN S-t és mintegy 33 különbözö fehérjemolekulát tartalmaz. Az aktív, asszociá lt szerkezet (SOS riboszóma ) hossza 32 nm, szélessége 22 nm. A transzláció ban éppen részt nem vevő, inaktív riboszómák két alcgysége egymástól disszociá lt állapotban van. A polipeptidl ánc szintézisének iniciációjak or a két alegység egyesül és kialakul az aktív riboszómas zerkezet, a polipeptidlánc sz intézisének term inációj akor pedig a két a legység ismét

di sszociál egym ástó l. A fo lyamatos fehérjeszin tézist a két riboszóma-alegység ciklikus asszociác iój a és disszociációja (ismétlődő riboszóma ci.klus) kiséri . A mRNS 5'-vége fe l ő l 3'-végének irányában folyamatosan , megszakítá s nélkül kódolja a polipeptidláncot annak NH 2-végétöl kezdődően a C OOH-vége felé. A prokarióta mRNS, a pol icisztronos prokarióta transzkripc iós egységeknek megfe lelöen gyakran policisztro nos mRN S, vagyis több, különbözö polipeptidl ánc szerkezetére vonatkozó információ t hordoz. A mRNS 5' -végén levő nukleotidsz aka z még nem tartalmaz po lipeptidsze rkezetet kódoló információ t, az inform áció a startjelül szolgáló AUG kodonnál kezdő­ dik. Az AUG kodont megelőző puringazda g régióban 3- 9 bázis komplemen ter a prokarióta ri b oszóma kis alegység 16S rRNS-ének 3'-végével és így e l ősegíti a riboszóma kis alegység a szociád ój át a mRNS-sel. Egyben azt is meghatároz za, hogy a mRNS-en el őforduló metionint kódoló A UG kodonok közül me lyik az e l ső polipeptidl ánc startpontjá t jelző iniciátor kodon . Az el ső polipeptidnek megfel el ő szakasz a polic isztronos mRNS-en egy stopkodon nal fejeződi k be. Nem ritka, hogy a nagyobb biztonság kedvéért több stopkodon követi egymá t. A po licisztrono mRNS-en a stopkodont néhány nukleotidn yi távolságban követi a k övetkező polipeptid zintézisének startpontjá ul szolgáló AUG, majd a másod ik po lipeptidlánc végét j e lző újabb stopkodon. A s tartjel és stopjel annyiszor ismé tlődi k, ahány polipeptidláncra vonatkozó információ t tat1almaz a mRNS. A mRNS 3'-vége túlnyúli k a kódoló régión. Az eukarióta mRNS mindig csak egyetlen polipetidlá ncra vonatkozó info rmációt hordoz. Az e ukarióta mRNS 5'-végén Cap ta lálható és ugyancsak tartalmaz egy nem kódoló szakaszt a szintézis startpontjá t j elentő AUG kodon e lőtt. A polipeptidl ánc befejezését je l ző stopkodon után, a 3' -végen ismét egy nem kódoló szakasz és a poliA-farok ta lálható. A transzlációhoz vagyis a po lipeptidlánc szintéz iséhez a fentebb említett komponens eken kívül m ég különbözö enzimek, illetve transzláció s faktoroknak nevezett fehérjék szükségese k. A prokariótákba n és eukar iótákban ta lálható transzlációs faktorok kül önböznek egymástól, az euka-

·,

390

•> m

••»> "'' m

''"" m»> m •• >>>»">>»>~>~m>•> >))>)))))))>>»>>>

rióták fehé1jeszintézisében lényegesen nagyobb számú fehérjekomponens vesz ré zt, mint a prokariótá kéban. Ezek csoportosítása aszerint történik, hogy a transzláció melyik szakaszában van szerepük.

A polipeptidlánc szintézisének mechanizmusa Miközben a mRNS-ben kódolt információ a mRNS 5' -vége fe löl a 3' -vég irányában fordítódik Ic, a polipeptidlánc az NH 2 -végé től a COOH-vége fel é növekszik. A polipeptidlánc szintézisében megkülönböztetünk iniciációs, elongációs és terminációs lépéseket A szintézis menetét a p rokariótákban meg ismert egyszerűbb mechanizmusen mutatjuk be. A polipeptidlánc szintézise az iniciációs komplex kialakulásával kezdődik. A mRNS a riboszóma kis alegységéhez kötődik, a polipeptidlánc startjelét alkotó AUG kodonhoz az iniciátor-tRNS antikodonja illeszkedik, az így kialakuló szerkezetet nevezik 308 iniciációs komplexnek Az iniciátor tRNS metionint szállít, azonban prokariótákban az iniciátor tRNS által száll ított metionin aminecsoportja formi l eződik. A metionin formileződé e a metionin iniciátor tRNS-hez kötött állapotában megy végbe. A láncköz i metionineket ugyanesk AUG kódolja, azonban a láncköz i AUG kodonboz egy más ik tRNS szállítja a nem formilezett metionint. (Az iniciátor tRNS jelzése tRNSfMc', a láncközi metionint szállító más ik tRNS jelzése tRNSMc1.) A 30S iniciációs komplex kialakulásához GTP, továbbá speciális fehérjék, az ún. iniciációs faktorok szükségesek. Prokariótában három iniciációs faktor ismert Uelzésük IF I, IF2, l F3). Az IF3 megakadályozza, hogy az üres 30S és 50S riboszóma alegységek egymáshoz kötődjenek. Az IF2 GT P-kötő fehérje és segíti a mRNS és az iniciátor tRNS (formil-metionil-tRNSfMet) kötődését a 30S alegységhez. A mRNS és az iniciátor tRNS bekötődése után az 50S riboszóma alegység is csatlakozik a 30S alegységhez, a GTP ezen fol yamat közben hidrolizál és az inic iációs faktorok lcdisszociálnak. A GTP hidfolíz isét az 50S alegységhez tartozó fehérjék segítik eiő. A most már teljes riboszómát tartalmazó 70S iniciációs komp-

GENETLKAI INFORMÁC IÓ TÁROLÁSA ÉS Kl FEJ EZŐDÉSE

lexen két kötőhe l y alakul ki, a P (pcptidil), illetve A (aminoacil) kötőhel y. Az AUG kodon é a hozzá illeszkedő formil-metionil-tRNSfMct a P kötőhel yre kerül. Az A helynek megfelelően helyezkedik el a polipeptidlánc második aminosavának kodonja. Ezzel megtörtént a polipeptidlánc szintézisének iniciációja (3-37a ábra). A polipeptidlánc szintéz isének elongációj a c iklikusan ism étlődő három lépésből áll (3-37b. és 3-37c. ábra), a c iklus annyiszor ismétlődik, ahány peptidkötés van a polipeptidláncban. El ső lépésként e l őször a polipeptid második aminesavát hordozó aminoacil-tRNS kötődik be az A (aminoacil) kötőhelyre, a második kodonnak megfelelő pozícióba illeszkedve. Az a minoacil-tRNS bekötődése GTP-t igényel, a bekötődésnél az EF-Tu nevű a

GDP IF,, IF2, IF3 , GTP---<<

30 S iniciációs komplex

70 S iniciációs komplex

b EF-Tu + GTP EF-Ts

----<~

GDP

~

3-37. ábra. A p olipe ptidlánc szintézisének menete prokariótáb an . (a) Az iniciációs komplexek, (b) a P (peptidil-) és A (aminoacil-} kötóhe/y, és (c, a túloldalon) az elongáció lépései

FEHÉRJ E ZI NT ÉZI s

))))))))))))) )>)))> >)))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))> » »l)I)))))))))))H)))))))))))))))))))) ))))))))>I " " " >))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

c EF-Tu }+ GTP~ ~ EF-Ts

1.

l

l

ll

HC -

NH -

CH

NH2 -

CH

l

l C= O

C= O

l

l

o ~...--------- A hely

o ~~

P hely

P,

R,

R,

O

GDP

-..---.- .,. .-.---.~-t"'Rf"M. ,.~"~'--t.---.,-~-'t"R__Ni/_~s.---.--.,...-.---.---.----.-

5 •..,...,

A U G X X X Y Y Y

3,

2. (peptidil-transzferáz)

R2

R,

O

ll

HC- NH -

l

l

CH- C - NH -CH

l

ll

C= O

O

l

o

2 (RNS 5'"T,-,.--.--,.--r--..--..::-.~~---.--' ~~""""""'-.---.----.--,.--.--,.--rA U G X X X Y Y Y

~

P hely

. ...--------- A hely

3'

3. EF-G+ GTP GDP 1. EF-Tu } +GTP ____;t ~ EF-Ts

l

l

l

ll

HC- NH -

ll

CH

NH2 -

CH-C-NH- CH O

l

l C=O

C= O

l

l

~et \ ~ 5,

P hely

P,

R3

R2

R,

O

O O A hely ~~

.--.--, "'" ,,-,.---,----,--,.---,~-t"'R"T~j"~"-·) _,.,-~-t,R_._N~Sr---.--.-r--'

A U G

X X X y

y

y

3,

391

GENETIKAI INFORMÁC IÓ TÁROLÁSA ÉS KIFE.JEZÖDÉSE

elongációs faktor segédkezik . Az EF-Tu egy GTP-kötő fehérje, abekötődés folyamán a GTP-t hidrolizálja és a GDP kötve marad rajta. Az EF-Tu GDP-vel alkotott komplexe inaktív és így nem tud részt venni a következő aminoacil- tRNS bekötődé­ sének folyamatában. Egy másik elongációs faktor, az EF-Ts szükséges ahhoz, hogy az EF-Tu-ról a GDP disszociáljon és az EF-Tu ismét GTP-t tudjon kötni . Az EF-Tu GTP-GDP kötő ciklusa nagyon fontos komponens e a transzláció hűségének. Ez a ciklus ugyanis bizonyos időt vesz igénybe és ez az időmennyiség szükséges ahhoz, hogy az A helyen elhelyezkedő kodonhoz a megfelel ő antikodon illeszkedjék. Ha a kodonhoz véletlenül egy olyan antikodon illeszkedik átmenetileg , amelyikne k csak két betűje komplemen ter, még van idő a disszociáci óra mielőtt ténylegesen bekötődne a hibás tRNS. Az EF-Tu nem tud kapcsolatb a lépni a formil-met ionil-tRNS IMct_molekulával, ezért soha nem szállítj a az iniciátor tRNS-t az A he lyre. A ciklikusan GTP-t, illetve GDP-t kötő fehérjék kül önböző típusainak (GTP-kötő fehérjék, G fehérjék) és a GDP disszociációját elő egítö peciális fehérjéknek (exchange fehérj6k) igen fontos szcrcpük van a sejt különböző folyamatainak szabályozá ában, c kérdés részletes ismertetésérc még visszatérünk (elsősorba n az eukarióta sejtek extracellulári s jelre adott vá laszának mechani zmu ánál). A GTP-kötő fehérj ék gua nilkötő helye konzervatíva n megörzödött évmilliárdok on keresztül.

Az e longáció második lépéseként a P helyen l evő iniciátor tRNS (formil-metionil-tRNStMet) és az A helyen bekötött aminoacil- tRNS á ltal hordozott amine avak közőrt létrejön az el ső peptidkötés. A második aminosav aminecsop ortja peptidkötés t alkot a formil-metionin karboxilcsoportjával, ennek a kapcsolat a megszűnik következté ben formil-metionin és az iniciátor tRNS CCA végén levő OH-ja között. A peptidkötés kialakulása külön energiát nem igényel, mert az aminoacil- tRNS (jelen esetben a formil-met ionil-tRNS fMct) kialakulásakor felhasználó dott A TP aminoacil- tRNS kötésben konzerválódott energiája hajtja a reakciót. A peptidkötés kialakulásá t a riboszóma 50S alegység saját fehérjéi közé tartozó peptidil-tr anszferáz katalizálja. A peptidkötés kialakulása után a második aminosav tRNS-éhez kötve helyezkedi k el a kéttagú peptid a riboszóma A kötőhelyén . Az e longáció harmadik lépése a transzlokáció, amelynek során a riboszóma elgördül a mRNS-hez

képest. Az AUG kodon és az üres iniciátor tRNS legördül a P helyről , a P helyre a második aminosavnak megfelel ő kodon és a kéttagú peptidet hordozó tRNS kerül. Ugyanakko r az A helyen megjelenik a lánc harmadik aminesavá t meghatározó kodon. A transzlokác ió ugyancsak egy molekula GTP hidrolízisét igényli és a harmadik prokarióta elongációs faktor az EF-G (transzlok áz) segédkezik a fol yamatban. A transzlokáció után az e longációs ciklus három lépése ismétlőd i k minden újabb aminosavn ál egészen addig, amíg a polipeptid lánc utolsó aminesavá t hordozó tRNS és e hhez kötve a teljes polipeptidlánc nem kerül a P helyre. Ekkor következik a polipeptidl ánc szintézisén ek termináció ja. Amikor az utolsó aminosavn ak megfelelő kodon az utolsó tRNS-sei együtt a P helyre jut, az A helyen megjelenik valame lyik a stopkodono k közül. A stopkodonn ak mcgfelel ően nem kötődik újabb tRNS a riboszómáh oz az A helyre. Ehelyett a termináció s faktorok (release faktorok) kötődnek (az UAG esetében RF l, az UGA esetében RF2, az UAA esetében bármelyik a kettő közül). A termináció s faktorok kötődésének hatására a peptidil-tra nszferáz lehasítjaa polipeptidláncot az utolsó (P helyen levő) tRNS-ről. A polipeptidl ánc fel szabadul és a riboszóma szétesik alegységeire. A szétesett riboszóma elkezdheti egy újabb polipeptidl ánc szintézisét. A polipeptidl ánc szintézise peptidkötés enként 4 makroerg kötés hidrolíziséb e kerül. Ebbő l 2 az e longáció során hidrel izálódó 2 GTP-ből származik, 2 pedig az aminoaci l-tRNS kialakulása kor AMP-vé és pirofoszfáttá hasadó ATP hidrolízi éből adódik. A polipeptidl ánc iniciációja 3 makroerg kötés hidrolízisé vel emeli a teljes lánc szintézisén ek energiaigén yét, 2 az iniciátor aminoaci l-tRNS kialaku lá ához, l a bekötődéséhez szükséges. Egy riboszóma kb. 80 nukleotidn yi he lyet foglal el a mRNS-en. Amint az e l ső riboszóma a mRNS leolvasása közben elhagyja az első, kb. 80 nukleotid hosszúságú szakaszt, egy második riboszóma is megkezdhe ti a mRNS leolvasását, illetve a polipeptidlánc szintézisét. Ezután egy harmadik, negyedik stb., annyi riboszóma, amennyi elfér az adott rnRNS-en. A mRNS-sel ilyen módon összefűzött riboszómák alkotják a poliszómá t (3-38. ábra). A fehérjeszintézis közben mindig poliszó-

FEHÉRJESZINTÉZIS

3-38. ábra. A poliszóma az egyes riboszómákon szintetizálódó (növekvő) polipeptidláncokkal

5' mRNA

mák alakulnak ki . A poliszáma szerkezete stabilizálja a mRNS-t. A prokariótákban a transzkripció sem időben sem térben nincs elválasztva a transzlációtóL A transzkripció során képződ ő mRNS 5'-végén már kialakulhat a poliszómaszerkezet az egyre növekvő polipeptidláncokkal, mikor a mRNS 3' -vége még nincs teljesen megszintetizálva és a mRNS 3' -vége még nem disszociált le a DNS-ről.

Eukariótákban a transzláció lépései elvileg hasonlóak a proka riótában folyó transzláció lépéseihez, bár a prokariótákétól eltérő riboszómák és a prokar iótákénál sokkal j elentősebb számú transzlációs faktor vesz részt a folyamatban. Az eukarióta sejtekben is AUG a polipeptidlánc startpontját jelző iniciátor kodon, amelyhez az iniciátor tRNS (tRNSfMet) szállítja a m etionint. Eukariótákban azonban a tRNSIMet által szállított metionin nem formileződik meg a prokariótákéhoz hasonló módon, mivel eukariótákban az ezt a reakciót katalizáló enzim hiányzik. Az eukarióta mRNS csak egyetlen polipeptidláncot kódol, ezért csak egyetlen startkodont tartalmaz, ez a m RNS 5' -végéhez legközelebb eső AUG. Az eukarióta mRNS-en az iniciátor kodont nem e lőzi meg puringazdag régió, a 40S riboszóma ki s alegység a mRNS 5 'Capjéhez kötődik és a 3' -irányban mozogva keresi az első AUG-t. Ez a mozgás ATP hidrolízisével j ár. A nagyszámú eukarióta transzlációs faktor vagy az iniciációban (eukarióta iniciációs faktorok, el F),

COOH

vagy az elongációban (eukarióta elongációs faktorok, eEF), vagy a tenn inációban és a polipeptidlánc felszabadításában (eukarióta release faktorok, eRF) segédkezik. E csoportokon belül az egyes faktorokat számokkal jelölik. (Eukarióta iniciációs fa ktorból pl. kilencet ismernek és közüJük néhány több al egységből álL) Az eiF2 az iniciációban szerepet j átszó egyik fehétje, amely az iniciátor tRNS (metionil-tRNSfMct) bekötődését segíti elő. Az eiF2 foszforilációja és defoszforilációj a fontos komponense eukariótákban a transzláció szabályozásának. Az el F2 foszforilálva inaktív. Az interferonok által indukált kettős láncú RNS-dependens protein-kináz (lásd 3.3. fejezetben) ezt a fehérjét foszfori lálja és így gátolja a fehérjeszintézist, amíg a kettős láncú RNS j elen van a sejtben. Retikulocitákban, ahol a fehérjeszintézis 90%-át a hemoglobin fehérjekomponensének a szintézise teszi ki, ugyancsak az elF2 reverzíbilis foszforil ációj a regulálja a hemoglobin globinláncának a hem szintézisével koordinált sebességgel történő transzlációj át (ha nincs j elen szabad hem az eiF2 egy specifikus enzim segítségéve! foszforilálódik és ezétt inaktiválódik, nem szintetizálódik felesleges globin. A szabad hem a specifikus protein-kinázt gátolja, amíg egy specifikus foszfatáz defoszforilálja az eiF2-t). Az e LF2 egy GTP-GDP kötő fehérje, a foszforilált eiF2 nem tudja a GDP-t GTP-re cserélni , ezért inaktív.

394

A fehérje foszforilációnak másféle mechanizmussal is lehet szerepe a transzláció sebességének szabályozásában. Ismeretes olyan protein-kináz is, amely a riboszóma kis alegységének egyik febérjéjét foszforilálja és a növekedési faktorok által kiváltott sejtválasz egyik lépéseként aktiválódik.

A diphtheria nevü betegség (amelyet a Corynebacterium diphtheriae okoz) egyik súlyos komplikácjója a fehérjeszintézis gátlásával magyarázható. A gátlás okozója egy cxotoxin (érdekes módon a baktérium lizogén törzsének a fágból szánnazó müködő génje kódolja), nem immunizált egyénben gyakran halálos szövőd­ ményhez vezetett. A diphtheria exotoxin egyik komponense segíti a sejtmembránhoz való kötődést, míg a másik komponense bejut a sejtbe. A sejt belsejébe jutó komponens egy olyan enzim, amely a NAD+-bóllehasitja a nikotinsavamidot és a maradék ADP-ribózt kovalensen az eEF2 transzlációs faktor egy módosult hisztidin oldalláncához köti. Az ADP-riboziJáció következtében az eEF2, amely az elongáció transzlokációs lépésében vesz részt, irreverzíbilisen inaktiválódik és így a fehérjeszintézis az érintett sejtben leáll. Baktériumok exotoxinjai gyakran hasonló jellegű katalitikus aktivitást mutató enzimek, amelyeknek szubsztrátiai különböző GTP-kötő fehérjék.

A fehérjeszintézis mechanizmusában részt vevő komponensek mük:ödésének a gátlása az egyik igen gyakran használt fegyver a kórokozó baktériumok ellen. A módszer alapjául az szolgál, hogy a prokarióták és eukarióták riboszómái és transzlác iós faktorai ki.ilönböznek egymástól és így bizonyos vegyületek gátolják a fertőzést okozó baktériumok transzlációját és ezzel szaporodását (bakteriosztatikus hatásúak), míg a gazdaszervezet sejtjeinek citoszoljában folyó fehérjeszintézist nem károsítják. Bizonyos gombák által termelt vegyületek, illetve ezek szintetikus származékai és továbbfejlesztett módosulatai tartoznak az antibiotikumok ezen csoportjába. A sztreptomicin gátolja az iniciációt és a mRNS téves leolvasását, kódtévesztést okoz prokariótákban. A riboszóma kis alegységének egyik fehérjéje (S 12 fehérje) felelős a sztreptomicin hatásáért, az e febéljében bekövetkező mutáció sztreptomicinrezisztenciához vezethet, sőt, a mutált baktériumok egy csoportja csak sztreptomicin jelenlétében szaporodik.

GENETIKAIINFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

A neomicin és a gentamicin ugyancsak a kis alegységhez kötődik, de a sztreptomicintől eltérő helyen. Ezek az antibiotikumok is kódtévesztést és így hibás transztáciét okoznak. A tetraciklinek a prokarióta riboszóma kis alegységéhez kötődve az aminoacil-tRNS-ek bekötődését gátolják. A klórarnfeni kol gátolja a prokarióta riboszóma nagy alegységének peptidil-transzferáz aktivitását. Az eritromicm ugyancsak a nagy alegységhez kötődve gátolja a transzlokációt. A prokarióták fehérjeszintézisét gátló antibiotikumok használatánál figyelmet érdemel, hogy az eukarióta sejtek mitokondriumaiban levő transzlációs apparátus komponensei eltérnek a citoszolban találhatótól és hasonlítanak prokarióta megfelelőjükre. Ezért nem állítható, hogy ezek a gyógyszerek egyáltalán nem káros.ítják a gazdaszervezetet és csak a feltételek mérlegelése mellett használják azokat.

A transzlációt eukarióta sejtekben gátló vegyületek nem gyógyszerek, de fontos szercpük volt a fehérjeszintézis mechanizmusának a megismerésében és a sejtmű ködés szabályozásának a tanulmányozásában. Ezek közül a vegyületek közül említést érdemel a purornicin, ame ly rnind a prokarióták, mind az eukarióták transzlációját gátolja. A puromicin szcrkezetc emlékeztet az aminosavat hordozó tRNS 3 '-végére és aminocsoportja hozzákötödik a P helyen levö peptidiltRNS utolsó aminosavának karboxilcsoportjához. Ezután azonban a puromicinre végződő peptidnek disszociálnia kell a riboszórnáról és így korai láncterrninációt okoz. A cikloheximid a klóramfenikol analógjaként viselkedik eukariótákban, gátolja az eukarióta riboszóma nagy alegységének peptidil-transzferáz aktivitását.

A fehérjék sejtorganellumokba irányítása és a transzláció utáni módosulások Az újonnan szintetizálódó nascens fehérjék olyan jeleket tartalmaznak, amelyek meghatározzák, hogy az adott febérje hol fog elhelyezkedni a sejtben. Baktériumokban, pl. E. coliban a fehérjemolekulák nagy része a citoszolban marad, más része a plazmamembránba, a külső membránba, esetleg a kettő közötti térbe kerül vagy kikerülhet a

FEHÉRJESZINTÉZIS

>> >> >> » ••>> >H> ~l>> n H»>>>>>>>>>n))H>» >>>>))>>>H>))>> u~>,)>>)>>>»» >h> H>>>>>> >•))» >»>>>>))) >»> )~ >>>>h)> ~• >>n)))))))>>>>>)>>>)))>))>>)>>>)))l >H>))

sej tből a kömyezetbe. Eukarióta sejtekben a fehérjék irányítása még sokkal nagyobb változatosságot mutat. A fehé1jék egy csoportj a itt is a citoszo lban marad, más csoportjaik a plazmamembránba integrálódnak, a lizoszómák komponensei lesznek, szekretálódnak a sejtből, illetve a sejtmagba vagy a mitokondriumokba (növényekben a kloroplasztokba is) kerülnek. Az eukarióta sej tek kü lönböző stratégiát alkalmaznak a fehérjék különböző sejtkompartmentekbe irányitására. A citoszolban maradó fehérjék a citoszolban levő szabad riboszómákon szintetizálódnak. Ugyanitt szintetizálódnak a mitok ondriumokba illetve a sejtmagba kerülő fehétjék is. Ezek am inosavszekvenciája azonban valamilyen specifikus je let tartalmaz, amelynek alapján a megfelelő sejtkompartmentbe keri.ilhetnek, és aktív (energiaigényes) mechanizmus segíti elő odajutásukat Ezzel szemben azok a fehérj ék, amelyek a lizoszómákba kerülnek vagy a plazmamembrán integráns részei lesznek, vagy szekretálódnak, nem a citoszolban l evő szabad riboszómákon szintetizálódnak, hanem a durva endoplazmás retikulum membránhoz kötött riboszómáin. A j elzés, melyet ezek a polipeptidláncok tartalmaznak, a durva endoplazmás retikulum membránjá n keresztül annak lumenébe irány ítja az eikészülő fehérjét. Ez a fajta j elzés nagyon ős i . Baktériumokban, melyek nem rendelkeznek endoplazmás retikulummal, a szabad riboszómákon szintetizálódó fehé rjék közül hasonló j e lzés alapján választódnak ki azok a febérjemolekulák, amelyek a plazmamembrán felé veszik útjukat. Az endoplazmás retikulum az eukarióták membránkomponensének m integy fe lét teszi ki . Egyik részéhez riboszómák kötődnek, ezért ezt morfo lógiai képe a lapján durva endoplazmás retikulumnak nevezik, míg a sima endoplazmás retikulum nem tartalmaz riboszómákat. A riboszómák, ame lyek az endoplazmás retikulumhoz kötődnek, minden tulajdonságukban hasonlóak a szabad riboszómákhoz. Az éppen szintetizálódó polipeptid lánc tartalmazza azt a je let, amelynek a lapján a szintézisben részt vevő riboszóma az endoplazmás retikulum membránjának kül ső (c itoszol felé néző) oldalához kötődik. A j el a készülő polipeptidlánc NH 2 -végéhez közel található aminosavszekvenc ia, amely egy sor hasonló módon szintetizálódó fehérje malekuta analízise a lapján l3- 36 aminosavhosszú-

39 5

ságú. Ez a szignál peptidszekvencia a polipeptid N-term inálisáboz közel tartalmaz legalább egy pozitív tö ltésű aminosavat, maj d egy 10- 15 aminosavbó l álló, nagyon hidrofób j e ll egű szakasz helyezkedik el a .közepén. Általában ala nin, valin, izoleucin, leucin, fenilalanin fordul el ő ezen a szakaszon. A szignál peptid C-tenninális végén általában öt, va lamelyest polárosabb am inosavegység taJálható és a szek venc ia egy hasítási hellyel fejeződik be. A szignál peptidet tarta lmazó ún . prefeh érj éről annak posztszintetikus módosulása során egy szignál proteáz enzim lehasítja a szignál peptidet. A szignál peptid a kész, például szekrécióra kerü l ő fehérj én már nem ta lá lható meg. (Ismertek kivéte les esetek, pl. a tojásalbuminban a szignál szekvencia nem a polipeptidlánc N-terminálisán, hanem a febélje belsejében ta lálható és nem vágódik Ici a fehérj ébő l. ) A szignál peptidet tartal mazó prefehérj e nem tévesztendő össze a profeh é~ék kel. Profehérjéknek azokat a fehérjéket nevezik, amelyek inaktív fonnában szinteti zálódnak és a szintézisük után a megfelelő helyen (esetleg sejten belül, mint a proinzul in- inzulin, dc gyakrabban szekréciójuk után mint az emésztő enzi mek, véralvadásban részt vevő fehé~ék stb.) limitált proteolízis segítségével aktíválódnak (lásd 1.2. fejezet). A proenzimek (pro fehérjék) szintézise során általábaJl pre-profehérje képződi k, a szignál peptid lehasadása után alakul ki a profehérje.

A szignál peptid felismerésében és a szigná l peptidet tartalmazó fehé1jét szintetizáló ribaszámá nak az endoplazmás retikulumhoz irányításában egy kis citoplazmai ribo nukleoprotein részecskének, a szignálfelis merő részecskének van szerepe. Ez a részecske egy kb. 300 nukleotid hosszúságú ribonukleinsavból és hat kü lönböző febérjemolekulából á ll. A ribonukle insav olyan nukleotidszekvenciákat tartalmaz (Alu-szekvenciákna k nevezik őket), amelyek az eukarióta DNS gyakran ismét l őd ő szekvenciái közé tartoznak. A sz igná lfel i smerő részecske szarosan kötődik azokhoz a riboszómákhoz, amelyek éppen egy szignál peptiddel rendel kező fehérjét szintetizálnak, de ne m kötőd i k más riboszómákhoz. Miután a szignál peptidnek megfel el ő szakasz megszintetizálódott egy szabad ribaszámán a citoszolban, a szignálfe lismerő részecske a ribaszámához kötődik és átmenetileg megállítja vagy lassítj a a polipeptidlánc elongációj át A képződő k omplex az endoplazmás retikulum membránjához diffundál, a melyen a

396

, •>> )) >>)))) ))))))))n ))))U))>))>)))>))))'))>>))))))))>>>))))>)>)> )H)l>))>))>>)))))>>))))

D o~

S' Cap-

L).

GENETIKAIINFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

\

AAA3'

+++

.&.

kis citoplazmai ribonukleoproteint felismerő dokkoló fehérje

endoplazmás retikulum lumen citoszol

szignál peptid szekvencia kis citoplazmai ribonukleoproteinrészecske

endoplazmás retikulum membrán

szignél

pepti~

riboforin

3-39. ábra. A szignál peptidszekvenciával rendelkező fehérjéket szintetizáló riboszómák endoplazmás retikulumhoz irányitása és a polipeptidlánc transzlokációja a lumenbe

szignálfelismerö részecske számára egy speciftkus receptor (dokkoló fehérje) található. A részecske ehhez a dokkoló fehérjéhez kötödik, miközben a riboszóma, amely a készülö polipeptidet hordozza, továbbítódik a fehérj ét az endoplazmás retikulum lumenébe irányító transzlokációs szerkezethez. Ez a szerkezet két membránfehérjéböl áll, nevük riboforin l és riboforin TI (3-39. ábra). A transzlokáció az endoplazmás retikulum membránján keresztül aktív folyamat, A TP hidrolízisével jár és a polipeptidlánc további növekedésével egyidejüleg történik. (A transzlokációt az könnyíti meg, hogy az éppen szintetizálódó szakasz még nem csavarodik fel úgy, mint a kész fehérjében). A transzlokáció után az endoplazmás retikulum Jumenében a fehérj ék posztszintetikus módosulásokon mennek keresztül. Az N-terminális szigná l peptidszekvenciát tartalmazó prefehérj ékről a szignál peptid egy specifikus proteáz hatására Jehasad és a fehérjék glikozilálódnak. A prokariórák az eukariótákhoz hasonló szigná l pe ptidszekvenciákat használnak arra a célra, hogy a plazmamembránon áthaj tva a baktérium kü l ső membránjába vagy a két membrán közötti térbe juttassák a fehérjéket. A he lyükre került fe hérjékrő l a szignál peptidszekvencia ugyancsak lehasad.

A transzláció utáni módosulások bizonyos típusai a citoszol szabad riboszómáin szintetizálódó fehérjék éréséhez is szükségesek. A kész, funkcionáló fehérjéknek, enzimeknek legtöbbször nem formil -metionin (prokariótában), illetve metionin (eukariótában) az N-terminális aminosava, holott szintéziskor mindig ez az aminosav jelenik meg az NH2-végen. A formi l-metionin egyrészt deformilezödik a prokariótákban található defonnilezö enzim segítségéve!, másrészt a láncvégi metionin vagy az első egy-két láncvégi am inosav lehasad az aminepeptidázok hatására. Mind prokariótákban, mind eukariótákban a láncvégi metionin némelykor előbb lehidrolizál a polipeptidláncról, mint annak szintézise be fejeződik. A metionin mellett a 2. he lyen levő alanin például e lőseg íti a metionin lehasadását és ugyanakkor az alanin aminocsoportja acetilálódik, tehát a fehétjének nem lesz szabad N H r vége. Az endoplazmás retikulumhoz kötött riboszómákon szintetizálódó fehérjék közül sokban alakul nak ki diszulfidhidak a megfe lelő pozícióban levő SH-csoportok oxidációja révén, részben az egyes polipeptidláncokon belül részben a több polipeptidláncbó l áll ó fehérjék láncainak összekapcsolására. A megfelel ő SH-csoportok közötti

FEHÉRJESZINTÉZI

)H) U)))))))) )UH>)) n)))))) H)))) t))>)>))>)))))))))))))))))>>)) )H> )))UUH> >) ) >)'>)) ))>> >))) )> )) >)))))>))H>)))))))))> n t))))>)>)))>)) t)>))}))))))))))>>))))>)

kapcsolat kialakulását a protein-diszulfid-i zomeráz enzim ("tekeráz") segíti. Ugyancsak egy enzim segédkezik a polipeptidláncba beépült prolinok melletti peptidkötések cisz-transz izomerizációjában. Ahhoz, hogy a fehérjemolekulák stabil, natív harmadlagos szerkezete kialaku ljon, el őbb az egész polipeptidláncnak meg kell szintetizálódnia. A polipeptidlánc megfel e lő konformációjának kialakulásában molekuláris chaperonoknak nevezett fehérjék vesznek részt. A molekuláris chaperonok olyan fehérjék, amelyek más fehérjék instabil konformációban levő formáihoz kötődve , elősegítik a stabil, natív szerkezet kiala kulását. (Erre nemcsak a polipeptidlánc szintézisekor lehet szükség, hanem például egy hőhatás, ún. hőshock következményeinek kivédésénél is. A molekuláris chaperonok csoportjába tartozó fehérjék egy részét hőshockfehérj éknek nevezik.) A riboszómákhoz asszociált molekuláris chaperonoka frissen szintetizálódó (nascens) polipeptidlánc N-terminá lis szakaszához kötődve megakadályozzák annak idő előtti, nem a natív szerkezetnek megfe lel ő összetekeredését. Egyes fehérjék a szintézisük után hosszú szénJáncú zsírsavakkal acileződnek. A kovalensen kötött palmüil-, famezil- , geranilgeranil-, illetve mirisztilcsoportoknak fontos szerepük van abban, hogy olyan fehérjék, amelyek nem integráns részei a membránoknak, a mebránhoz tudnak kihorgonyozódni. A fehérjék mintegy 30%-a foszforilálódik. A foszforiláció némely esetben hozzátartozik a fe-

O H ll l O-- P - O - CH - CH - C - CH l 2 2

-o

l

hérje végleges szerkezetéhez, rníg az esetek nagyobb részében regulációs szerepe t játszik. Bizonyos fehéljék (kollagén) érése során a lizin és prolin o ldalláncok módosulhatnak (hidroxi-prolin, hidroxi-lizin alaku l ki). Speciális, nem a fehéljemolekula éréséhez tartozó módosulástjelent a transzglutamináz enzim által katalizált reakció, amely az egy ik polipeptidlánc glutaminjának amidcsoportját cseréli egy másik polipeptid li zin oldalláncának N H-csoportjára és így keresztkötések jöhetnek létre fehérje molekulák között. Egyes enzirnmo lekulák posztszintetikus módosulásának tekinthető a kovalensen kötött prosztetikus csoportok kapcsalódá a is.

Az endoplazmás retikulumhoz kötött riboszómákon szintetizá lódó lizoszomális, plazmamembrán és szekretálódó fehérjék á ltalában gl ikoprote inek. A glikoproteinek kova lensen kötött szénhidrátkomponensének a kialakulása több lépésben történik, ezek közül az el ső az endoplazmás retikulum lumenében megy végbe. Az oligoszacharidegy ségek a polipeptidlánchoz vagy egy a zparagin oldalláncon N-glikozidos kötéssel vagy szerin, treonin olda lláncon 0-glikozidos kötéssel kötődnek . Az N-glikozidos kötések kialakulása során első lépésként egy 14 tagú oligoszaharid kötődik a fehé rjék specifikus szekvenciával körülvett aszparaginjához (core-glikoziláció ). A reakciót egy transzferáz enzim katalizálja, a 14 tagú "egységcsomagot" a dolikol-foszfát szá llítja (3-40. ábra). A dalikol-foszfát 15- 19 izoprénegységből álló, hosszú, apoláros lipid. A segítségével aktivált core-oligoszaharid-egység a polipeptidhez kötő­ dik, a dalikol-pirofoszfá t pedig felszabadul. A glikopratein core-oligoszaharid -egységének vé-

4 2

J 97

l

CH3 CH3 l l CH - CH=C - CH -CH - CH = C - CH3 2 2n 2

CH3 al.2

Man - Man ~ a. 1,2

al ,~

16 Man

Ma n - Man a 1.2

(Gich- Man -

u 1.2

Man -

~1 .6

O ~

1.4

~

1,4

ll

O

ll

Man - GicNAc - GicNAc - O- P - O - P -O - Dal

Man

/a 1.3

l o-

l o-

3-40. ábra. A dalikol-foszfát és a dalikol-foszfát által szállított oligoszacharid "egységcsomag". Rövidftések: Man, mannóz; Gic, glukóz, GlcNAc, N-acetil-glukózamin

398

>»» nn»n»>»>»»»>»>»>M»>»»»•»>»mmmmn>»•>»»m•>»>~>»>»>>>

gén levő három g lukózegységet és egy maonézegységet még az endoplazmás retikulum lumenében levő enzimek lehidrolizálják, így továbbítérlik a fehérj e a Golgi-komplexbe. A Golgi-komplexnek két fontos feladata van. Egyrészt szerepe van a g likoproteinek szintézisében, minthogy az N-glikozidos kötésben l evő o ligoszacharidegységek itt médosulnak és az 0-glikozidos kötésben levők itt alakulnak ki. Másrészt a Golg i-komplex feladatai közé tartozik a fehérjék válogatása és irányítása rendeltetési helyükre. A membránzsákocskákbó l álló Golg ikomplex három kompartmentre di fferenciálódott. A cisz-kompartment közel van az endoplazmás retikulumhoz, ez fogadja az endoplazmás retikulumból szám1azó, fehérjéket tartalmazó, me mbránnal határolt transzfer hólyagocskákat A középső kompartmentet követi a transz-kompartment, amely a fehérjéket továbbítja rendeltetés i helyükre. A kül önböző kompartmen tek között, i lletve a Go lg i-ko mplextő l a plazmamembránhoz stb. ugyancsak transzfer hó lyagocskák szállítj ák a fehérjéket. Ezek a transzfer hó lyagocskák aszerint, hogy rnely kompartmentek között szállítanak, különböznek egymástól (3-41. ábra).

3-41 . ábra. A Golgi-komplex

bazolaterális plazmamembrán

GENETIKAI INFORMÁC IÓ TÁROLÁ A É KIFEJEZŐDÉSE

A glikoproteinek szénhidrátegységei a Golgi minden kompartrnentjében módosulhatnak, ezt a folyamatot nevezik terminális glikozilációnak. A cisz-Golg i-kompartmentben mannózegységek hasadnak le azoknak a fehérjéknek az oligoszacharid oldalláncairól, amelyek a plazmamernbránba vagy szekrécióra kerülnek. A középső Golg i-ban N-aceril-glukózamin- és fukózegységek rakódnak az oligo zacharid oldalláncra, a transz-Golgi-kompartmentben galaktóz és sziálsav adódik az oldallánchoz. Az o ldallánc végleges fo1máj át részben a fehérje konformációj a, részben az határozza meg, hogy a Golgi melyik részében alakul ki . A cisz-Golgi-kompartmentbe n kapj ák meg a jelzést azok a fehérjék, melyek a lizoszornákba kerülnek. Egy rendkívül specifikus fosz fotranszferáz enzim alakítja ki a mannóz-6-foszfátot ezen fehérj ék (lizoszomális enzimek) g likoprotein o ldalláncán. A m annóz-6-foszfát szolgál a továbbiakban irán yító j elül ezeknek a fehérjéknek a kiválogatására és lizoszómákba való transzportjára. A mannóz-6- foszfátot egy receptor ismeri fel, amely a fehérjéhez kötőd ik és a komplex körül kialakuló hó lyagocska kapcsolatba kerül egy speciális

FEHÉRJESZINTÉZIS

)))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))}))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

transzport hólyagocsk ával, melynek belsejében a pH alacsonyabb. Az a lacsonyabb pH-n a receptor disszociál a mannóz-6-f oszfáttal jelzett fehétjéről és a transzport hólyagocsk a a lizoszómákka l fúzionál. A mannóz-6-f oszfát foszfátját még az a lacsony pH-jú transzport hólyagocsk ában lehasítja egy foszfatáz. A plazmamem bránba kerülő és szekretálód ó fehérjéket általában nem a g likaprotcin saj átságuk irányítja a megfelelő helyre, ezeknél a fehétjéknél az ol igoszaharid oldallánc más célt szolgál. Az endoplazmá retik ulumban megjelcnő, hidrofób jellegű integráns mcmbrán fchétjék a pl azmamembránba jutnak, a jól oldódó, hidrofil fehérjék pedig a szekréció z ákoc kákba. A szekréciós zsákocskák különbözőek aszerint, hogy a szekréció konstitutív (á llandóan azonos sebességge l folyik, mint pl. a májsejtek által szekretált fehérjék nagy részénél) vagy reguláit (pl. az emésztő enzimek proenzim formájánál) . Ha a fehérje nem tartalmaz valami lyen peciáli · jelet, akkor a konstitutív szekréciós hólyagocsk ába kcri.il. A polipeptidlá nc tran zláció utáni kovalens módosulásai közül em lítést érdemel még a bonyolult glikozil-foszfatidilinozitol- (GPI) csapott kötő­ dése a COOH-ten ni nál is amino avhoz. A GPl-t kötött fehétjék a sej tmembrán extracellulá ris fe lszinére kerülnek. A mitokondri umok febérjéinek egy kisebb része magában a mitokondri umban, lényegesen nagyobb része a citoszol szabad riboszómái n szintetizáló dik és innen jut a mitokondri umba, ahol elhelyezke dhet a külső mcmbránb an, a két membrán közötti térben, a belső membránb an vagy a matrixban. A fehérjék mitokondri umba irányítása is a pol ipeptid -terminális zaka zán levő spcciális peptid zckvenciával történik, amelyik nem hasonlít az endoplazmás retikulumba irányító szekvenciá hoz. A mitokondr iális belépő szekvencia sok pozitívan töltött aminosava t és sok szerin és treonin oldalláncot tartalmaz. Azok a fehérjék, amelyek a külső membránba kerülnek két pozitív tö ltést tatialmazó szakasz között egy " horgonyzó" szekvcnc iával rendelkezn ek. A többi fehétje a protongrád iens terhére jut rendeltetés i helyére, ahol a mitokondri ális belépő szekvencia lehasad a polipeptidl áncról. A ejtmagba jutó fehérjék, ki étel nélkül a citoszol szabad riboszómái n szintctizáló dnak. (A magmembr án kül ső és belső rétegc az endoplaz-

399

más retikulum membránna l, a két réteg közötti perinukleáris rés az endoplazm ás retikulum Iumcnével mutat folytonossá got.) A magmembr ánon nyílá ·ok, pórusok varmak, a melyek á tmérője 0,7 nM. Ki fehérjék, mint amilyenek a hisztonok, könnyen átjutnak a pórusokon, a nagyobb fehérjék azonban csak akkor, ha pecifikus jelet tartalmaznak. A nukleáris lokalizáció jele egymá l követő ö t bázikus am inosavat tartalmazó szekvencia , amely nem a fehérje N-termi ná lisán helyezkedi k cl és nem vágód ik Ic a fehérjérő l célbaérkez ése után. A jelzést tatialmazó febérje átjuttatása a nukleáris pórusokon bonyolult folyamat, egy pccifikus GTP-kötő fehérje is részt vesz benne.

Fehérjeszintézis a mitokondriumokban A mitokondri um (növények ben a kloroplaszt is) ö ná lló genetikai rendszerrel rendelkezik és osztódással szaporodik . Az emberi mitokondri um cirkulá ris DNS-t tattalmaz, amely a nukleáris DNS-től ft.iggetlenül replikálódi k, és mintcgy l %-a a sej t DNS-ének (átlagosan) . A mitokondri ális fehérjék egy részét a nukleáris DNS kódolja, a mitokondriá lis DNS 2 rRNS-gént , 22 tRNS-gént és 13 fehérjét kódoló gént tartalmaz. A mitokondri um saját fchétjeszin tctizáló apparátusa teljcsen e ltér az eukarióta sejt citoszoljáb an talá lható transzláció s berendezéstő l é a prokariótákéra em lékeztet, a riboszómák a prokariórákéra hasonlitana k. A citoplazmá ban levő 31 -féle tRNS-sci szemben a mitokondri umokban c ak 22 tRNS talá lható. több a "kodon antikodon lö työgést" mutató tRNS, mint a citoszolban . Az é l ővilág teljes egészében univerzális genetikai kód nem tökéletesen érvénye a mitokondri umokra, 4 kodonnak más az értelme. Az UGA stopkodon a mitokondri umokban triptofánt jelent és nem a poli peptidlánc végét jelzi. Az AUA az univerzális kódban izoleucint, a mitokondri umban mction int jelent. Az arginin kodonjai közül kettő. az AGA és AGG viszont a m itokondrium ban nem argini nt kódo l, hanem stopkedonk én t szolgá l. A mitokondriáli mRNS 5' -végén nem jelenik meg Cap, de a 3'-végén megtalálha tó a poli-A- farok. A tran zláció a matrixban folyik.

A laboratóriumi géntechnika (rekombináns DNS-technológia) módszerei

.5.

FaragóAnna

A e lmúlt hú z évben a m olckuláris biológia által kifej lesztett módszerek addig sosem látott ütemben vitték e l őre az é l ő szervezetekkel foglalkozó tu dományokat, ezen belül az e lméleti orvostudományt A rekom bináns DNS-technológiát a 20. század má ·odik felében zaj ló m á odik ipari forradalom egyik csúc technikáj aként tartják számo n, várható hatását az e mberiség é lctére az e lektronika megjelenésének hatásához hasonlítják. A molekuláris biológia módszerei ma már e lkerülhetetlenül jelen vannak a7 e lméleti orvostudomány modern kutató laboratóriumaiban , fo nto komponensei a gyógy zcrgyárak álta l alkalmazott technológiáknak. és mindezen túl megjelentek a klinikai gyakorlatban i . A következő évtizedben minden bizonnyal mélycn beépülnek a diagnosztikába, és talán a terápia egyes területcin is rutin zerüen a lkalmazhatóak Ic znek. M indcz szükségessé teszi az orvosok számára a mo lekuláris bio lógiai mé dszerek alapfogalmainak ismeretét.

Restrikciós endonukleázok és restrikciós térképek A restrikciós endonukleázok a DN S-t speci liku nukleotid zckvenciáknál hasító enz imek, amelyek fe lfedezése fontos szerepe t j átszott a laboratóriumi géntechnika meg indulásában. A restrikc iós e ndonukleázok a természetben a baktériumok fágok c lleni védekezésének eszközei. Bizonyos baktériumokban bizonyos fágok ne m tudnak zaporodni , ezt a j elen éget nevezik restrik-

c iónak. A re trikeióért specifikus cndonukleázmetiláz enzimpárok fe l el ő ek, ame lyek a DNS-en azonos nukleotidszekvenciát ismernek fel. A restrikc iót az enzimpár endonukleázkomponense biztosítja. am ely ha megta lá lja az idegen DNS-en a zámára spec i lik u nukleotidszckvenciát, elhasítja a D NS-t. A hasítás a DNS mindkét zálát érinti. A restrikció metiláz fe ladata a baktérium saját DN S-ének megóvá a az endonuklcáztó l. A metiláz ugyanazt a nukleotidszekvenc iát ismeri fel, mint aj át endonukleáz pá1ja, és a ba ktérium D S replikációj a után azonnal metilálja a felismert szakasz bizonyos nukleotidját A gazda ejt DNS-e ezért az endonukleáz álta l felismerh ető szakaszon metilá lt és ez megakadá lyaza az endonukleáz tevékcnységét. (A metil czéshez S-adenozil-metionin adja a metilcsoportot.) A z a fág, ame lynek DNS-e a baktériumban található restrikc iós endonukleázok által fe lismert nukleotidszekvenciákat tartalmazza, az ado tt baktériumban nem szaporodhat. Az azonos DNS-szekvenciák at fel ismerő restrikciós endonukleáz-metiláz párok tö bbféle csoportja (I., lJ. és lll-as típusú) ismert, ezek közül csak a lJ . típusba tartozó enzimpárok endonukleáz tagjait haszná lják a D NS- pecifi kus nukleotidzekvenciánál történő laboratóriumi hasításához. Az ebbe a csop ortba tartozó endonukleáz-metiláz párok egymástól elkülönülve megjelenö, önálló aktiv itással rendelkező enz imek, amelyek katalitikus aktivitásukat azonos nukleotidszckvencián fej tik ki . E csoport tagjai a D NS-cn zimmetrikus szerkezetü , álta lában 4- l O nu k leotidegységből álló palindrom szekvenc iákat i memek fel é az

LABORATÓRIU ll GÉJ'\TECHNIKA

>>>>H)))))))))))) l)))))>>l>>>>>)))))))))))) •)>) )) )))))Hl ))))>>>>>>>>)>)))) )))H))))))))))>>> n))>)))))))))))>> >H)))l)

hasítás helye

+

5' .... GAATIC .... 3' l l lll 3' .. .. CTTA.AG .... 5'

t

hasítás helye

5' .... G3'

l

l 3' .... CTTAA5'

5'AATIC .... 3' l 3'G .... 5'

3-42. ábra. A ragadós végeket generáló restrikciós endonukleázok müködése. A restrikciós enzimek ll. típusába tartozó egyik enzimpár által felismert szekvencia és az endonukleáz által katalizá/t reakció során képződő ragadós végek

endonukleázok a két DNS-láncon egymá sal zemben ellentétes irányban e lhelyezkedő két azono szekvencia azonos nukleotidja mellett hasítanak {3-42. ábra). Kül önbözö baktériumok különbözö nukleotid zekvcnciákat fel ismerő restrikciós endonukleáz-metiláz párokat tarta lmaznak. Ha egy bizonyos restrikciós enzimmel elhasított DNS-en a hasítási helyek éppen egymással zemben helyezkednek cl, tompa végek képződnek. Azonban gyakran e l őfordul , hogy a két láncon keletkező metszéspontok között néhány nukleotid távolság van, ezétt a metszett végek egymástól való eltávolodása után néhány nukleotidhas zú ágú egyszálú végek alakulnak ki, a komplementer szakasz a másik DNS-darabon található. Minthogy a komplementer egyszá lú láncok egymással nagy affinitással alakítanak ki kapcsolatot, ezeket a képződményeket " ragadós DNS-végeknek" nevezik. Laboratóriumi körülményck között, ha két különböző DNS-moleku la (pl. egy prokarióta plazmid és egy eukarióta k.romo zóma-DNS) hasítható egy bizonyos restrikciós endonukleázzal, jelezve, hogy a restrikciós enzim számára feli smerhető nukleotidszekvenciát mindkét DNS tartalmazza, akkor mindkét DNS-molekulán kialakulnak olyan ragadós végek, amelyek egymással is komplementerek. A két kü l önböző DNS-molekulából Látmazó komplementer, "ragadós", egyszálú végek önmaguktól képesek egymással összeille zkcdni . Az így, spontán összei ll eszkedő végeken a DNS-ligáz segítségével kia lakítják a hiányzó foszfodiészter-

>>»>H> >HH>

40 J

kötést (mindkét láncon egyet-egyet) é így el őá llít­ ható a két különböző molekulából származó DNS-darabokból az új, rekombináns DNS-molckula. A restrikciós endonukleázokat ezért a rekombináns DNS-molekulák készítésének (génscbészetnek) egyik alapvető eszközeként tartják számon. A különböző baktériumok által tcm1elt, különböző specifikus szekvenciákat fe li sm erő re trikciós enz imekbő l ma már száznál többet jellemeztek, tisztítottak és ezek kereskedelmi forgalomban kaphaták. (Az egyes endonukleázokat az őket tcm1elö baktérium nevébő l szám1azó betűkkel jelölik és róma i számokkal jelzik, ha egy baktérium több fajta restrikció endonukleázt tartalmaz. Például az EcoRJ az E. coliból származó GAA TTC zckvenciá t felis merő cndonukleáz, az Smal egy Salmoncllából származó, a CCCGGG szekvenciánál hasító endonukleáz, a Hindili a Haernaphilus influenzae-bő l származó, AAGCTT szekvenciánál hasító enzim stb.) Rekombináns DNS-molekulák készítésén kívül a DNS nukleotidszekvenciájának analízisérc is fe lhasználják ezeket az enzimeket Kivála ztanak egy endonukleázt, amelynek a hasítási helyét tarta lmazó szekvencia ismert. Ha ez az enzim képe elha ítan i egy ismeretlen nukleotid zekvenciájú DNS-t, jelzi, hogy a DNS a hasítás helyén milyen szekvcnciát tartalmaz. Mennél hosszabb egy bizonyos restrikciós enzim által feli mcrt szekvencia, annál kisebb a valószínűsége annak, hogy egy adott DNS-szaka zon ez a zekveneia e lőfordu l , vagy többször is előfordul. Több restrikció endonukleáz egymást követő alkalmazásával restrikciós térképet lehet készíteni a DNS-rő l. A kérdé es ON -szakasn egy restrikciós cn/immel emésztik. majd a képződő fragmentumokat agarÓ7-gélelektroforézis segitségével mérct szerint szélvá lasztj ák és a7 egyes fragmenrumok pozícióját (hosszát) detektálják. (Ezt c l lehet végezni etidium-bromid-festéssel n uoreszccncia alapján, de megkönnyíti a té rképezést, ha a DNS 5'-végét radioaktív fos z fát segitségével megjclölik, mert igy a gélclek troforézi el szélvá lasztoll fragmentumok autoradiográfiája alapján könnyü kimutatni azokat a fragmentumoka t. amelyek az 5'-véget tartalmazzák.) A7 emé 7tés idejének válto7latásával el lehet é rni. hogy a lehetséges hasitási he lyek kö/ül csak az egyiken (véletlenszerűen valamelyiken) \'agy mindegyiken megtörténje n a hasítá . A kül önböző módon vég/ett hasit<Ísokban kapott fragmenrumok hossza és S7áma alapján a kirakós játékokhoz hasonlóan lehet egymás mögé rendeln i a DNS darabjait és megha tározni a restrikciós s7ekvencia po-

(

~0 2

)))))))))) )) )))))))) )))))))))))))))) )) )))))) )))))))) )))))))) )) )))))))) )) )))))))) ))))))))))

GE ETIKAI INFOR~IÁC IÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

/Íctóját. A müvcletcl több, különbö7Ö restrikciós cnLimmcl megismétel\ c a~.: ismert s7ehcnciák előfordulásának helyéről réstictes és a DNS-szakaszra jellem7Ö !..épet lehet nyerni (3-43. ú/wa.)

A restrikc iós térképek egyrészt bevezethetik a DNS szekvenciájának részlete ebb viz gá latát, másré ·zt cgít. égükkel könnyen kimutathatók két vizsgálandó DNS-darab szekveneiájában megje lenő hason lóságok, de méginkább a biztos eltérések. Ezzel a módszerrel v izsgálták például a mitokondriáli. DNS-ck evolúcióját és megállapították, hogy a pon tmutációk valószínüsége az evolúció orán tízszer nagyobb volt, mint a genom iá lis DNS-é. Ha egy mutáció egy restrikciós helyet érint, az endo-

nukleáz azon a helyen nem hasít. Másrészt, a mutáció létre is hozhat új hasítás i helyet. Bármelyik eset következik be, megváltozik a restrikciós enzimckkel kapott fragmentumok száma és hossza. Ezen a jelenségen a lapul az RFLP-térkép (restriction fragment length polymorphi m), amely két egyed DNS-e közötti különbségeket mutat ki. E lőfordu l , hogy egy restrikciós hely mutációja és egy bizonyos gén mutációja egybeesik, vagy olyan közel vannak egymáshoz, hogy a7 általános genetikai rekombináció eseményei orán chasem válnak szét egymástól. Ez e etben a restrikció változá (re trikció marker) használható a gén mutációja á ltal okozon betegség diagno ztikájában is.

v izsgálandó DNS (10 100 nukleotidegység)

teljes

emési

részleges emésztés

kapott fragmentumok (n ukleotidegység) kapott fragmentumok (nukleotidegység)

1200 = A 2200 = B 2600 = c 4100 = D

1200, 2200, 2600,4100

3800, 4800, 6300,6000 8 900 3800 =A+C 4800 = B+C 6300 = B+D 6000 = A+B+C 8900 = B+C+D

féhetseges sor end: A~ C - B - D

D --~I A~~-C-4~-B~~--~ rrestrikciós hasítási helyek

DNS

3-43. ábra. Resrikciós térkép készítésének vázlata. A vizsgálandó DNS-t elkülönTtik (megtisztílják) és a tisztított DNS-ből származó mintákat egy restrikciós enzimmel különbözö ideig emésztik. Ezáltal részlegesen vagy teljesen emésztett mintákat kapnak, vagyis olyanokat, amelyek csak a DNS-en jelen levő restrikciós szekvenciák egyikénél vagy másikánál, vagy mindegyikénél elmetszett DNS fragmentumait tartalmazzák. A darabokat hosszúságuk szeríni agaróz-gélelektroforézissel szétválasztják. A gélelektroforézis után az etidiumbromiddal festett DNS-fragmentumok UV-fényben kimutathatók és a kapott kép alapján a darabok hosszúsága meghatározható. A teljes emésztés során képzödnek a legkisebb DNS-darabok, a részleges emésztés ezek különböző kombinációjából származó hosszabb darabokat hoz létre. A különböző kombinációjú darabok és a legkisebb darabok hosszának összehasonlitásával lehet kikövetkeztetni, hogy a legkisebb darabok milyen sorrendben követik egymást. Ebből meghatározható a restrikciós hasftási helyek pozíciója a vizsgált DNS-darabon. A gyakorlatban a fenti folyamatot többféle tfpusú restrikciós enzimmel megismételve készülnek a restrikciós térképek

ll

LABORATÖ Rl

ll GÉNTEC HNIKA

)))))))))))) ))))))))))))))) ))))))))))))))) ))))))))))))))) )))))))))))))))

A DNS bázis szekv enciá jának meghatározása A restrikciós enzimekkel e lhasítot t DNS kisebb, néhány száz nukleo tidhoss zúságú fragme ntuma i bázisszekvenciá jának megha tározás ára kétfé le módszert is haszná ltak: a specifikus kémia i hasítás módszerét (Maxam- G ilbert) és a didezo x i-módszert, a megsza kított enzima tikus szintézis segítsé gével kapott fragme nturna k analízisét (Sange rmódszer). A nagyobb DNS-mo lekulát restrikc iós enzimek kel kisebb darabo kra hasítják és a restrikciós fragmen tumokat szétválasztják . A specifikus kémiai hasítás segítsé gével történő analízis hez a két kül önböző speci fitású restrikciós endonuk leáz á lta l kihasíto tt, vizsgálni kívánt DNS-darab egyik vagy másik lá ncának 3 ' -végét 32 szelektíven megjelölik egy P-velje lzett foszfátot tartalmazó dezoxi-ribonu kleotid segítsé géve!. (Nemcsak a 3' -véget, az 5'-lánc véget is meg lehet jelölni.) Egy-egy kísérle tsoroza tban csak azt a láncot analizálják, am elynek a vége a radioak tív j elzést kapta, a két lánc hődenaturác ióval szétválasztható. A vizsgálni kívánt lánc kémia i hasítás ához a 3' -végen radioak tívan j elzett prepará tumot négy részre o ztjá k. A specifikus ké miai hasítás során az egyik vagy másik bázist hasítják le az N-gl ikozidos kötésné l és a sérült nukleo tid az alkalmazott feltételek me llett a láncbó l kihasad . A négy elkülön ített mintában végbem enő specifi kus reakciók eredmé nyekén t egy-eg y minta mindig az egyik fajta bázis h asításá val kapott eredmé nyt mutatja. (Az egyik reakció elegyb en mindké t purin hasad, a másikban pre ferenciálisan a guanin , a harmadik reakció elegyben mindkét pirimid in, a negyedi kben prefere nc iálisan a c itozin hasad le. Az első é másodi k minta különb ségébő l az adeninre, a harmadik és negyed ik minta különbségéből a timinre vonatkozó adatoka t lehet leolvas ni.) A hasítást e l ő idéző ké miai reakció t olyan feltételek mellett engedik végbem enn i, hogy csak részleges hasítá történje n, vagyis a lehetsé ges több hasítási hely közül egy molekulában mindig csak kevés helyen (a sok moleku lát tartalm azó mintában statiszt ikus megosz lásban mindig más-más pozícióban levő nukleo tidná l) történje n meg a reakció. Az egy-eg y minta k ül önböző pozíció ban l evő nukleotidja i kihasírása révén ke letkező, kül önböző

))))))))))))))) )))))))))))»)) ))))))))))))))) )))))))))))))))

))

403

számú nukleo tidegys égeket tartalmazó egyszá lú lá ncdarab okat poliakrilamid- géle lektroforézis seg itségév el szétválasztják . (Ez az e ljárás a nukleotidlánc hosszú sága alapján választja szét a frag32 mentumokat) A radioak tív P-jelzé s a lánc 3' -végén lehetöv é teszi, hogy a 3' -végtő l számíto tt kül önböző szárnú nukleo tidegys égnyi távolsá gban végbem enő hasítás ok révén kapott, különböző hosszú ságú fragmenturnak pozíc iój át a gélen autoradiogr áfia segítsé gével kimuta ssák. (A láncvég et és így radioak tív jelzést nem tartalmazó fragme nturna k nem látható k.) A négy mintáb an a négy kül önböző nukleo tid kihasír ásával létreho zott fragmenturna k hosszú ságábó l a szekvencia leolvas ható. A kérdése s bázis e l őford u lásána k helye a szekvenciá ban a kihasírásával képződ ő fragme nturnak nukleo tidegys égeinek a száma + l (3-44. ábra). A megsz akított enzima tikus szintéz is segítsé gével történ ő analízis során egy egyszá lú vagy hődena turációval egyszá lúvá tett DNS-lá nc szekvenc iájának megha tározá a a komple menter lánc szekve nciáján ak a megha tározás án alapul. A komple menter láncot indító (prime r) jelenlé tében , a DN S-polim eráz f segítsé gével (általáb an nem a telje polime ráz l enzim me!, hanem az 5' -3' exonuk leáz aktiv itást elveszt ett Klenow -fragm entumma l) szinteti zálják, a DNS- zintézis megsza kításához didezo xi-ribo nukleo tidokat ha zn álnak. Ezekbe n a nukleotidokba n a ribózna k nemcsa k a 2'-, hanern a 3'-szénatomjá n is hiányz ik az OHcsopor t, ezért ha a DNS-p olimerá z beépíti ezeket a nukleotidlánc ba, a lánc tovább i szintéz ise megsza kad, mert a követk ező nukleo tiddal a faszfed iészterk ötés nem tud kia lakulni . A sz intetizá lódó új lánc 5' -végét jelölik meg radioak tív foszfáttal, az így előkész ített prepará tumot itt is négy részre osztják . A négy minta m indegy ikéhez hozzáa dják az enzima tikus z intézishez szüksé ge kompo nenseket, köztük mind a négy dezoxi-ribonukleotid ot és minden mintáh oz egy-eg y k ülön böző bázist tarta lmazó didezo xi-ribo nukleo tidot. Az adott didezoxi-riba nukleo tid a DNS-p olimerá z l által katalizált reakció ban kompe tál a megfel e lő dezoxi ribonukleotidd a l és beépül a láncba. A feltételeket úgy választják meg, hogy a beépülésa lehet éges helyek egyiké re vagy másiká ra statisztiku s val ószínűség szerint történje n meg. A beépülő didezo xi-nukleotid megsza kítja a zintéz ist és a radioaktívan jelölt 5' -véget tarta lmazó

404

G.ENETIKAI INFO RM ÁC IÓ TÁROL1\ A ÉS KIFEJEZŐDÉSE

)))))))))))))))>)))))H)))))H•))))))'t))>)))>>)))))))))))))))))))))))))))))))))>)))))))))))

restrikciós hely l 5' GGCC - - - - - - - - - - - - - - 3' 3' GACT 5'

3

7

[u- zP]dG

jelzés

G A+G C+T C

9

8 7 6

5 --4 3 2

1 tagszám

5' GGCC 3'

+

kémiai hasftás

G A+G C+T C

14 13 12 11 10 - -·-

[u- 32P]dCTP

DNS-polimeráz segitségével

5' GGCC - - - - - 3' 3' GACT 5'

+

~estrikciós hely ll

G A+G C+T C

poliakrilamid gélelektroforézis autoradiográfia 5' T

~

14 13 12 11 10

c

A G T A A

9

8 7 6

c

G A T

5

4

c

3 2 1

T G* 3'

3' GACT 5'

G A+G C+T C

-----

---- - --

5' G G

c c

A G A T

c ---G --T T ---- A

tagszám

C*

3'

5'GGCCAGATCGTTAC* *GTCTAGCAATGACT5'

3-44. ábra. A DNS bázisszekvenciáj ának meghatározása a kémiai hasítás módszerével. A tisztított, kettős láncú DNS-ből két különböző restrikciós enzim segítségével kihasitott darabot két részre osztják. Az egyik az egyik DNS-szál, a másik a másik szál vizsgálatára szolgál, a kétféle restrikciós enzim használata miatt a két szá/5'-végén maradó rövid egyszálú szekvencia nem azonos. Az egyik mintában az egyik, a másik mintában a másik szál 3'-végét meghosszabbítják egy-egy radioaktiv jelzést tartalmazó nukleotiddal. (Az egyik minta az egyik DNS-szál, a másik a komplementer DNS-szál szekvenciájának meghatározására szolgál, az egyikben pl. guanint tartalmazó, a másikban citozint tartalmazó nukleotid adja a 3'-vég radioaktiv jelzését.) Mindkét radioaktívan jelzett mintát négy részre osztják. A négy alminta mindegyikében más-más bázisra specifikus kémiai hasítást alkalmaznak, amelynek eredményeként a megcélzott bázist tartalmazó nukleotid a láncból az egyik vagy másik helyen kihasad, és különböző hosszúságú fragmenturnak jönnek létre. A DNS két szálát ezután denaturációval elválasztják. Igy mindkét láncból (külön-külön almintákban) olyan radioaktívan jelzett egyszálú fragmentumok képződnek, amelyek 3'-végi első (radioaktív) nukleotidjának a bázisa ismert és a fragmenturnak hossza poliakrilamid gélelektroforézis és a gél-autoradiográfiája alapján a 3'-vég felől meghatározható. (A hasadás során a radioaktiv 3'-véget elvesztő fragmentumoka gé/en nem mutathatók ki. Ugyancsak nem mutathatók ki a jelen levő, de a kérdéses mintában radioaktív jelzést nem kapott komplementer DNS-szál fragmentumai). Az egyik lánc négy különböző specifitású hasításából származó négy almintában kapott fragmenturnak hosszából a kihasadt nukleotid helye, ennek alapján a bázisszekvencia leolvasható. (Ha pl. a citozin kihasitása révén kéttagú, hattagú, tizenkéttagú stb. fragmenturnak képződnek, akkor a citozin a láncban a harmadik, hetedik, tizenharmadik stb. nukleotid volt. Azért végzik elmindkét lánc szekvenciájának meghatározását, hogy az egyik láncon kapott eredmény helyességél a komplementer láncon ellenőrizzék)

fragmentum uto lsó, 3' -nukleotidja lesz. Az előző módszernél ismertetett gélelektroforézis alkalmazásával meg lehet állapítani a négy mintából, hogy egy-egy bizonyos bázist tartalmazó didezoxi-nuk-

leotid hány nukleotidegységbő l álló fragmentumokat eredményezett. A fragmentum nukleotidjainak számajelzi a kérdéses bázis helyét a komplementer lánc bázisszekve nciájában.

LA BORATÓRJ UMI GÉNTEC HNI KA

))))))))}))))} )))))))))) ))))>)))))))) ))))))))))))) ))))))))))))))) ))))))))))))))) >)))))))))))))) )))))))))U))>)>))))))))))))))) ))})))))

A didezoxi-nukleotidokkal történő megszakításen alapuló DNS-szekvenálás ma már automatizált. Létezik olyan módszer is, amelyik a fragmentum ok pozíciójának jelzésére nem radioaktivitást használ, ha nem a négyféle nukJeotidnak megfelelő négy mintában nukleotidonként ká lönböző szineket mutató kémiai jelzést alkalmaz A színes jelzés után a négy minta együtt kezelhető, mert a DNS-fragmentumok hossza alapján történő szétválasztás után minden szín egy másik nukleotidnak felel meg. Az egyes színeket mutató láncok pozíciójának sorrendj e alapján a szekvencia leolvasható

Rekombináns DNS és klónozás, a génkönyvtár fogalma A rekombináns DNS-technológia kialakulásához az a lehetőség vezetett, hogy különböző DNS-molekulák restrikciós endonukleázokkal meghatározott nukleotidszekvenc iáknál szelektíven elhasíthaték és a különböző molekulákból származó darabok összeilleszthetök, majd a DNS-ligázzal kovalensen összekötbetők. Az ilyen módon elöállított DNS (rekombináns DNS) sokszorosítható elkü löníthető azonosítható a bel ő l e kihasí' ' tott darabok tisztíthatók, szekvenciájuk meghatározható. Rekombináns DNS készítésének többféle célja lehet, az első feladat egy kiválasztott DNS-darab sokszorosítása. A sokszorosítás történhet baktériumokban (klónozás), ehhez olyan DNS-ko nstrukciót kell előá ll ítani, ame ly a baktériumokba n gyorsan replikálódik. Erre a célra a vizsgálni kívánt DNS-darabból és egy baktériumba könnyen bejuttatható, ott gyorsan replikálódó vektor DNS-ből kelllétrehozni a rekombináns DNS-t. A vektor szerepét betöltheti egy plazm id-DNS. A plazmidok csak 5- 10 OOO bázisnál nem hosszabb DNS-darabok esetén jó vektorok, ennél nagyobb DNS-szakaszok esetén más vektorra l, pl. fág-DNS-sel kell dolgozni. Gyakran használt vektor az E. coli baktérium A.-fágja. A leggyakrab ban használt vektorok közé tartoznak azok a plazmidok, amelyek antibiotikumok elleni rezisztenciáért fele lős géneket hordoznak és febérjeszintézist gátló antibiotikumokjelenlétében is gyorsan képesek replikálódni. A vektorba épített DNS-t egy transzformációnak nevezett müvelet segítségével juttatják a baktériumba. Kétértékű kationok (Ca2+, Mg2+) hatására a baktérium membránja átmenetileg permeábilis lesz kis DNS-

405

molekulákra, ezért a baktériumok egy részébe bejut a rekombináns plazmid, majd a baktériumsej tben gyorsan replikálódik. A rekombináns DNS-t tartalmazó transzformált baktériumok könnyen kiválaszthaták az eredeti baktériumpopulációból, ha olyan antibiotikumot tartalmazó táptalaj on növesztjük a baktériumokat, amelyek ellen csak a vektorként haszná lt plazmid által hordozott gének álta l kódolt fehérjék okoznak rezisztenciát. Ilyen esetben kizáró lag a transzformált baktériumok szaporodnak. Előfordulhat, hogy egy vizsgá ln i kívánt DNSmo lekulán egy adott specifitású restrikciós endonukleáz által feli smerhető nuk leotidszekvencia egyáltalán nem fordul e lő, egyszer fordul e lő vagy többször fo rdul elő. Tem1észetesen olyan restrikciós enzimet kell kiválasztani, ame ly a rekombináns DNS készítéséhez használt ki indulási DNS-molekulákat hasítani képes. Ha a v izsgál n i kívánt DNS-szakaszt tartalmazó DNS-t (pl. egy eukarióta sejt teljes genomját) a kiválasztott restrikc iós enzim sok helyen képes e lhasítani, sok különböző DN S-fragmentum jön létre, amelyek azonban hasonlítanak egymásra abban, hogy azonos " ragadós egyszálú végeket" tartalmaznak. Ha a vektorként haszná lt cirkuláris plazmidot is elhasítjuk egy helyen ugyanazzal a restrikc iós enzimme!, akkor a hasítás helyére az eukarióta DNS-bő l származó restrikciós fragmentumok bármelyike (vé l etlenszerűen) beépülhet Az ilyen módon készített rekombináns plazmidpopul áció kül önböző molekulákból fog á llni, aszerint, hogy a vektorba melyik fragm en tum épült be. Természetesen az is előfordulhat, hogy a plazmid-DNS a hasítás helyén ismét he lyreállítódik ané lkül, hogy az idegen DNS beépülne, ezért a plazmidpopuláció nem rekombináns molekulákat is tartalmazni fog (3-45a

ábra). Az utóbbi években rekombináns DNS készítéséhez nem kizárólag a restrikciós enzimek által generált " ragadós véggel" rendelkező DNS-darabokat tudják felhasználni, a DNS-darabok összeillesztésére más lehetőségek is vannak, pl. a DNS-fragmentumok végére poli-dAdT farkat illesztenek vagy kémiailag szintetizált kapcsoló szakaszokat stb.

Hajói választottuk meg a használt restrikciós enzimet, olyan rekombináns plazmidpopulációt kapunk, amelynek tagja i együttesen a kiindulási eukarióta genom minden darabját tartalmazni fog-

406

GENETIKAII NF0Rl\1 ÁCJÓ TÁROLÁSA ÉS KI FEJ EZŐDÉSE

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))

3-45. ábra. A klónozás folyamata. (a) Rekombináns DNS készítése egy vizsgá/ni kivánt gént tartalmazó genomiá/is DNS-ből és egy vektorként használl plazmidból. A plazmid az arnpicil/in elleni rezisztenciáért felelős gént tartalmazza (amp gén) és egy hasítási helyet a használt restrikciós endonukleáz számára. A ragadós végüknél összeilleszkedő DNS- darabokból a DNS-/igáz folyamatos láncokat hoz létre. A képződő rekombináns plazmid egyedei különbözö genomiá/is DNS-darabokat tartalmaznak. (b) Génkönyvtár létrehozása. Egy alkalmas, ampicillinre érzékeny baktériumtenyészet transzformációja a rekombináns plazmid preparátummal. Az egyik baktériumba az egyik fragmentumot hordozó plazmid, a másikba a másik fragmentumot hordozó plazmid stb. jut be. A baktériumokat arnpiciflint tartalmazó táptalajra oltva, csak a transzformált baktériumok növekednek. Az ilyen módon sokasitott transzformált baktériumtenyészet alkotja a génkönyvtárat.

Jrestrikciós ! endonukleázzal

hasitési hely

l am p gén

1 ._. hasitás restrikciós endonukleázzal

.... ._. 2

3

... n

n számú DNS-fragmentum

o

am p gén

(c) A vizsgá/ni kivánt DNS-darabot plazmidok különbözö DNS-fregmentumokkal tartalmazó klón kiválasztása a génkönyvtárból. A baktériumtenyészet egy kis részét megfele/6 hfgításban szilárd táptalajra oltják. Minden egyes baktériumból oszlódása során egy elkülönülő telep jön létre. Az agargélen elkülönülő telepekből pontosan ugyanabban a pozícióban, ahogy a táptalajon e/helyezkednek, másolatot (replika) készítenek egy nitrocel/ulózmembránra, amelyen a DNS hibridizációs próbája elvégezhető. A kiválasztani kívánt DNS egy szakaszával komplementer, radioaktívan jelzett oligonukleotid vagy hosszabb nukleinsavlánc szolgál próbaként. A nem hibridizáló, felesleges próbát eltávolítják, majd a nitrocellulózmembránról aularadiográfiás képet készítenek. Ha a kívánt DNS-darab jelen volt valamelyik telepben, a kérdéses telep (klón) az autoradiografiás kép alapján az agargélen azonosftható, onnan izolálható és tovább szaporftható. Ha a kivánt DNS-t a telepek közül egy sem tartalmazza, a génkönyvtár-tenyészetből újabb mintát kell szilárd táptalajra vinni és az eljárást addig ismételni, mig a kívánt DNS-darabot hordozó baktériumból származó telep a szilárd táptalajon azonosítható

ják. (Az egyik fé le rekombináns plazmid az egyik darabot, a másik a másikat, igen nagy számú különböző fragmentumot igen nagy számú külön böző rekombináns plazmid molekula hordoz.) A telje genom darabjait hordozó plazmidpopuláció val transzformált baktériumpopuláció egyes egyedeibe az egyik plazmid jut be, másokba a mflsik plazmid stb. A transzformált baktériumok összes egyedét figye lembe véve, a teljes eukarióta genom mindcn egyes darabját tarta lmazó plazm id bejuthat a baktériumokba. Ha egy baktériumba er;~/ hiznnyos rekombináns plazmid bej utott, ezen baktét iumegyed replikációja során kapott mmClen utód tartalmazhatja ugyanazt a rekombináns DNS-molekulát. A transzformált baktériumok szaporodása

után kapott baktériumpopulációt, amelynek egyedeiben együttesen a vizsgálandó genom összes géndarabjának a másolata megtalálható, nevezik gé;~könyvtárnak.

A génkönyvtár előá ll ítása okkal könnyebb feladat, mint a viz gálni kívánt DNS-darabot tartalmazó rekombináns plazmiddal transzformált baktériu megyed szaporodása révén létrejövő klón (azonos DNS-L tartalmazó utódok) kiválasztása. Erre a célra egy olyan próbát kell használni, amely biztosan jelzi, hogy a kívánt DNS-darab a génküny-v'tárt Jlkotó baktériumpopulác ió mely egyede ibő l származó klónban található meg. Hosszadalmas munkával kell megvizsgáln i, hogy a génkönyvtár egyes baktériumainak szaporodása révén

LABORAT ÓRI Ml GÉNTEC HNIKA

transzformált baktériumok

nem transzformált baktériumok

rekombináns plazmid

egyedeiből

származ ó telepek

~

nitrocellulózmembrán (másolat) / plazmid

c: 32

•O

·O N

ro

E

!

amplicillint tartalmazó táptalaj

..... l

cn

hibridizáció radioaktf van jelölt próbával

ro t

l9

~

z

Cl ;t; Q)

cn ~

~~

l ll l

l osztódás

transzformált baktériumok

l

génköny vtár

baktériu mtelepe k közül pontosan me lyik az, amelyet éppen a vizsgální kívánt DNS-da rabot hordozó bakté riumo k alkotnak. A kívánt DNS-da rab jelenlét ének jelzésére a hibridizáció jelenség én alapuló módszereket haszná lják a leggyakrabban (3-45b és c ábra). A k ívánt klón megtalá lása után az abbó l származó baktériumokat tovább szaporítják, majd izolálják a baktériá lis DNS-tö l a most már sokszor osára növeked ett mennyis égü rekombi náns plazmid ot. Ha a cél a DNS-da rab nukleoti dszekve nciáj ának vizsgála ta, akkor a vizsgálni kívánt DNS-da rabot az eredetile g használt restrikciós endonukleázzal képződő , elkülönül ő

Q)

~

!

autoradiográfia

•

röntgen-/ ---· l film

L ___ ___ ___ ____

kimetszik a vektorbó l és megtisztítják a vektor DNS -tő l.

Hosszab b DNS-sz akaszok klónozá sához fág vcktor-D NS segítség ével készíten ek m eg fe l e l ő rekomb inánst. A fág DNS-bő l a végein levő bizonyos szakasz ok (cos) kerülnek bele a konstrukcióba, ezek közé a karok közé 25- 50 OOO bázisho szszúságú DNS-da rabok is be illeszthe tők, így alakulnak k i a cosm idna k nevezet t szerkez etek. A cosrnid mindig tartalma zza a bakteriá lis replikációs origet is. A cosmíd szerkez et biztosítj a a baktériu msej tben a replikác ió leh etőségét.

408

»))))»» ))))))))))>)

)))>))))))))))))»>>)) )))))))) ))))>))))))))))) ))))))))))))))))))))))

Nukleinsavak bázisszekvenciájának azonosítására szolgáló módszerek Specifikus DNS- vagy RNS-szekvenciák jelenlétének a jelzésére, azonosítására vagy mennyiségük kvantitatív meghatározására radioaktívan jelzett nukleinsav vagy oligonukleotid próbákat használnak. Gyakran ezen próbák létrehozása a legnehezebb feladat a klónozás technológiájában. Az egymással komplementer nukleinsavszálak erősen vonzzák egymást és megfelelő körülmények között stabil kettős láncot alakítanak ki egymással. A DNS-sei (annak egyik táncával) egy kívülről adott nukleinsav vagy oligonukleotid csak akkor tud kapcsolatot létesíteni, ha a kettős szálú DNS-t e l őbb denaturáljuk, vagyis a két láncot egymástól elválasztj uk. Ekkor hozzáadva a próbaként használt nukleinsavláncot és megfelelő körülményeket létrehozva, ha a használt próbánkkal komplementer bázisszekvencia található a DNS-ben a ' kívülről adott molekula és a vizsgált nukleinsav között a kapcsolat bizonyos valószínűséggel létrejön. A mesterségesen létrehozott komplementer lánckapcsolatot nevezik hibridizációnak. Ha a próbaként használt egyszálú nukleinsav radioaktívan jelzett, csak akkor és ott alakul ki radioaktív jelzést mutató kettős lánc, ahol a próbával komplementer szekvencia talá lható. Az egyes láncú fel nem használódott próbát eltávolítva, a kettős láncban megjelenő radioaktivitás mutatja a komplementer szekvencia létezését, sőt, bizonyos feltételek mellett ennek mennyisége kvantitatíven is meghatározható. A hibridizációt különböző körülmények között létrehozva különbséget lehet teJmi a tökéletesen komplementer, illetve attól kis mértékben különböző, de többé-kevésbé mégis hibridizáló homológ szekvenciák között. A megfel elő próbák létrehozása nehéz munka. Gyakori módszer, pl. hogy egy fehérjét megtisztítanak, egy kisebb darabjának az aminosavsorrendjét meghatározzák és a kódszótár alapján visszakövetkeztetnek arra, hogy ezt a darabot milyen nukleotidsorrend kódolja. A megfe lel ő szekvenciájú rövid oligonukleotiddarabot kémiai úton megszintetizálják és radioaktívan jelzik (egy 20-25 tagú oligonukleotid DNSszintetizá torban könnyen megszintetizálható. Minthogy a genetikai kód degenerált, vagyis egy ami nosavat nem csupán egy fajta kodon határoz meg, az összes lehetséges változatot figyelembe vevő oligonuklcotidkeveréket, ,.degenerált oligonuklcotidokat" állítanak elő.) Ennek a próbának a segítségével már ki lehet választani a gén könyvtárból a kérdéses

GENETJKJ\II NFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJ EZŐD ÉSE

fehélje génjét vagy géndarabjait tartalmazó klónokat Ezek felszaporítása és izolálása után meg lehet határozni a gén, illetve gén környezetének teljes szckvenciáját (ebből a fehérje teljes aminosavszekvenciájára, illetve a génexpresszió szabályozásában szerepet játszó nukleotidszekvenciákra lehet következtetni), ki lehet mutatni, ha a genomban a kérdéses febélje génjével homológ szekvenciájú (ugyanabba a családba tartozó) másik gén található stb. Különböző hosszúságú restrikciós DNS-fragmentumok közül egy bizonyos, vizsgálni kívánt DNS-darab kiválasztására, illetve azonosítására szolgál a Southern-blot módszer. A b lottolás a denaturált, egyszálú, a gélelektroforézissel hesszuk szerint szétválasztott DNS-darabok átvitele egy nitrocellulózmembránra, amelyen a nukleinsav erősen kötődik, és az ilyen rnódon rögzített molekula további analízisre alkalmassá válik. Az agaróz-gélelektroforézis után, a hosszúságuk szerint különböző pozícióban elhelyezkedő DNS-darabokat tartalmazó géllapot szü rőpapí rra helyezik, közvetlenül a gél tetejére egy nitrocellulózmembránt tesznek, majd e fölé ismét szűrőpapirt helyeznek. Az alsó szűrőpapírréteget egy koncentrált sóoldattal nedvesítik. A koncentrált sóoldat a kapillaritás elve alapján keresztülnyomul a gélen, majd a nitrocellulózmembránon és eljut a felső szürőpapírrétegi g. Eközben a DNS-t az agaróz gélből mintegy átmossa a nitrocellul ózmembránra, ahol az erősen megkötődik, minden DNS-darab pontosan abban a pozícióban, ahogyan a gélen elhelyezkedett, ezért nukleotidjainak száma meghatározható. A nitrocellulózon fixá lt DNS-darabok közül hibridizáció (megfelelő próba) segítségével kíválasztható a kérdéses DNS-fragmentum. Hasonló eljárás segítségévellehet kiválasztani és kimutatni egy bizonyos RNS-molekulát is például egy sejtkivonat összes RNS-ei közül. Az RNS analízisére szolgáló analóg módszert Northern-blot eljárásnak nevezik, ez a módszer megkönnyíti a génexpresszió vizsgálatát. Hibridizáció segítségével meg lehet határozni egy kérdéses DNS-szekvencia helyét a kromoszómán, a sejten belül. Ezt az eljárást in situ hibridizációnak nevezik. A sejtet nagyon rövid ideig magas pH-jú oldattal kezelik, ezalatt a DNS két szála szétválik (a DNS denaturálódik), majd apróbát hibridizáltatják a komplementer szekvenciájú DNS-szakasszal. Az in situ hibridizációhoz használt próbákat ma már inkább kémiailag jelölik,

LABORATÓRIUM I GÉNTECH NIKA

)))))U)>»>)))))))))))))))))))) >U>>))>>>))))>>>>))>>))>>)>))>>>>) )))))))))))))>>>))))))H>>>)>>>>>

mint radioaktívan, olyan nukleotidot is tartalmaznak, amelynek oldallánca módosítva van. Az ilyen oldalláncot egy specifikus immunglobul in felismeri, és a Westem-blot e lj árásnál is használt rnódszer (lásd később) segítségével a hibridizáció helyét láthatóvá lehet tenni.

a

409

Kromoszómaséta A DNS szekvená lása csak rövidebb (néhány száz nukleotidot tarta lmazó) szakaszokka l lehetséges, a te Ues gének ennél j óval hosszabbak. A restrikciós enz imek hasitási helyei véletl enszerűen he lyez-

b

ismeretlen szekvenciájú kromoszómadarab

t

>»>))>>>> >>)) >)u))>>>>))) >>>>h>

próba l.

restrikciós hasítási helyek

t ==~ t=---~t~t~====~~ r~ átfedő

restrikciós fragmenturnak A

A , B , C, D ...n fragmentumot hordozó génkönyvtárból "B" fragmentum klónozása próba ll. segítségével B

B

c D

c::::==::;~

=

.,B" fragmentum tisztítása

szekvenciájának meghatá-

próba 111. rozása - próba lll. készítés A, B, C, D ... n fragmentumot hordozó génkönyvtárból A fragmentum klónozása próba l. seg ftségével génkönyvtár fág vektorral agargéllítikus foltokkal

nitrocellulózmembrán (másolat) hibridizáció próba l. segítségével autoradiográfia

A, B, C, D ... n fragmentumot hordozó génkönyvtárból .,C" fragmentum klónozása próba lll. segítségével

c W4iiiYRWVfW«Xl<~ l

.,C" fragmentum tisztítása szekvenciájának meghatározása

1

XXX

próba IV.

röntgenfilm .,A" fragmentumot hordozó fág klón

3-46. ábra. Kromoszómaséta. (a) Az első gén klónozása és analfzise. A kromoszóma-DNS egymássa/ átfedő szakaszokat is tartalmazó restrikciós fragmentumait fág vektorba ültetik és a rekombináns fággal egy alkalmas baktériumtenyészetet transzformálnak (génkönyvtár kialakitása). A transzformáció sikerét, a fág jelenJétét egy-egy baktériumban, illetve a belőle kifejlődő klónban a szilárd táptalajra oltott összefüggő baktériumtenyészet litikus foltjai alapján mutatják ki. A litikus foltokat tartalmazó baktériumtenyészetről másolatot (replika) készítenek nitrocellulózmembrán ra, és az első génszakasz azonosítására rendelkezésre á/16 próba l. segitségével hibridizálnak. A keresett gén jelenJétét a nitrocellulózmembrán a utoradiográfiája során a röntgenfilmen megjelenő folt mutatja. A folt elhelyezkedése alapján azonosítják a szilárd táptalaj litikus foltjai közül azt, amely az első génszakaszt hordozó fágokat (klónt) tartalmazza. Innen a fág visszanyerhető és tovább szaporítható, majd az eredetileg használt restrikciós enzimmel a kromoszómális gén vagy géndarab kihasítható, tisztítható és bázisszekvenciáj a meghatározható. Egy újonnan meghatározott szakaszának bázisszekvenciája alapján készül az ezzel komplementer próba ll. (b) A próba ll segítségével egy második, az elsővel átfedő részt tartalmazó géndarabot azonositanak a génkönyvtárból hasonló módon. Sokszorosítás és tisztítás után analizálják a második géndarabot is, és most már ennek egy újonnan meghatározott szakaszával komplementer oligonukleotidot készítenek, ez a próba lll. Ezzel egy újabb átfedő génszakaszt azonosítanak a génkönyvtárból stb. Az eljárást annyiszor és addig ismétlik, ameddig átfedő szekvenciákat tartalmazó egymást követő kromoszómadaraboka t lehet találni a génkönyvtárban

41 o

)))))))))))))))))))))))))> )))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))))))))))))))))))

GENETIKAII NFO RMÁC IÓ TÁROLÁSA ÉS KI FEJEZŐDÉSE

kednek el a DNS-en, ezért a restrikciós fragmenturnak sem feJtétlenül tartalmaznak egy teljes gént, esetleg annak csak egyik vagy másik darabját a gén e l őtti vagy mögötti DNS-szakasszal együtt. A teljes génszakaszok vizsgálata, illetve annak felderítése, hogy az egyes gének és azokat regulátó elemek hol és hogyan helyezkednek el a kromoszómákon, hosszú DNS-szakaszok analízisét igényli, ez csak a különböző módszerek kombinációjával és ismételt alkalmazásával lehetséges. A kromoszómasétának nevezett eljárásra az ad módot, hogy egy génkönyvtár készítése során a használt restrikciós enzim nem minden DNS-molekulán hasítja el az összes lehetséges hasítási helyen a DNS-t, hanem bizonyos statisztikai valószínűséggel egymással valamelyest átfedő DNSdarabok keletkeznek és épülnek be a vektorba. A génkönyvtárból egy hosszú DNS-szakasz egymást követő, de egymással átfedő darabjai, egyik a másik után, külön-külön klónozbatók és analizálhatók. Ha két egymással átfedő DNS-darab közül az egyik azonosításához szükséges próba rendelkezésre áll , akkor ez a darab klónozható és az ilyen módon sokszorositott DNS-darab szerkezete a nal izálható. A restrikciós térkép elkészítése után e darab egy részérő l radioaktívan jelzett komplementer nukleinsav készíthető , amely a továbbiakban ismét próbaként használható. Amennyiben ez a próba tartalmaz egy átfedő DNS-darabnak megfelelő szekvenciát, akkor segítségévet a génkönyvtárból kihalászható, klónozható és azonosítható ezt az átfedő szekvenciát ugyancsak hordozó, az első darab fo lytatását jelentő DNS-szakasz is. E másodikként klónozott és analizált darab egy szakaszáról megint próba készül, amelynek segítségével a folytatást jelentő harmadik DNS-darab is azonosítható. Természetesen csak abban az esetben, ha van a génkönyvtárban olyan restrikciós fragmentum, amely a folytatást képező harmadik DNS-darabon kívül a másodikként klónozott DNS-darabba! átfedő szakaszt is tartalmaz. A fenti lépések ismétlése igen hosszú, összefüggő DNS-szakaszok pontos analízisét is lehetövé teszi (3-46. ábra).

ciáját nem magán az RNS-en végzett vizsgálatokkal határozzák meg. A mRNS-ről reverz transzkriptáz segítségével komplementer DNS-t készítenek (ez a cDNS), a cDNS-molekulákat ugyanúgy be lehet építeni egy vektorba és klónozni lehet, mint a genomiális DNS fragmentumait (A reverz transzkriptáz müködéséhez szükséges primer előállítását leegyszerüsítí az eukarióta sejtek rnRNS-einek 3' -végén jelen levő pol i-A-farok). Bizonyos sejtek differenciáltságuk eredményeként egy bizonyos febérjéből igen nagy mennyiséget termelnek, az ezen fehérje szintéziséétt felelős mRNS a sejt összes mRNS-ének nagyobb részét teszi ki. Ilyen esetekben könnyebb előállítani a kívánt cONS-t. Azonban gyakran indutnak ki a sejt teljes mRNS-készletéből, a reverz transzkriptáz által végrehajtott reakció után minden mRNSmolekuláról képzödhet cDNS. Az ilyen módon létrejövő cDNS-keveréket vektorba ültetve olyan rekombináns DNS populáció jön létre, amelynek egyedei más-más cDNS-darabot tartalmaznak, szerenesés esetben minden fajta mRNS-molekulának megfelelő cDNS vektorba jut. Ha ezzel a vektorpopulációval transzformálnak egy baktériumtenyészetet, az egyes baktériumsejtekbe másmás cDNS-t tartalmazó vektor kerülhet. A teljes transzformált és szaporított baktériumpopulációt, amelynek tagjai együttesen tartalmazzák az eredetileg felhasznált sejt minden működő génjéről származó mRNS-nek megfel el ő cONS-t, cDNSkönyvtároak nevezik. A cDNS-könyvtárból a kívánt DNS-darabot hordozó klónt a gén azonosításával kell kiválasztani. Ez történhet radioaktívan jelzett komplementer nukleinsav próba segítségével hibridizációval vagy a kódolt fehérje megjelenésének alapján. cDNS-t készítenek akkor is, ha egy eukarióta mRN S-nek megfe l el ő fehérjét baktériumokkal akarnak terrnelterni nagy mennyiségben ipari célokra (pl. polipeptid hormonokat gyógyszerként). Fehérjemoleku lák teljes aminosavszekvenciájára ma már leggyakrabban a kódoló cDNS nukleotidszekvenciájából következtetnek.

A cDNS és a cDNS könyvtár

Expressziós vektorok és fúziós fehérjék

A DNS-szekvencia-meghatározás egyszerűsége és a DNS-klónozás által nyújtott sokszorosítás leh etősége miatt mRNS-ek, vírus-RNS-ek szekvcn-

A rekombináns-DNSkészítésének gyakori célja egy gén működésének a tanulmányozása vagy egy

LABORATÓRIUMI GÉNTEC HNIKA

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

kívánt fehérje tem1eltetése. Ezekben az esetekben olyan vektorokat kell alkalmazni, amelyek nemcsak bejuttatják a kívánt DNS-szakaszt egy sejtbe, ahol az replikálódn i képes, hanem lehetövé te zik a gén vagy génszakasz expressziój át, a mRN S, illetve a DNS által kódolt fehérje termelődését is. Expressziós rendszerként nemcsak bak tériumokat használnak, eukarióta gének esetén e l őnyösebbek lehetnek az eukarióta expressziós rendszerek, mcrt azok tartalmazzák az RNS, illetve fehérjék posztszintetikus módosulása ihoz szükséges komponenseket Bizonyos vírusokkal fertőzött rovarsejtek gyakran szelgálnak fehérjeterme ltetéshez expressziós rend zerül. Ahhoz, hogy egy eukarióta gén egy baktériumban expressziéra kerülhessen, bizonyos feltételeknek meg kell fele lnie. A gén elötti DNS-szakasznak tartalmaznia kell a bakteriális RNSpolimeráz szigma-faktora számára fe li sm erhető promotert és esetleg még más regulációs elemeket is. A tran zkripcióra kerülö szakasz sem á llhat k izárólag a fehérjére vonatkozó információbó l, met1 a bakteriá lis mRNS 5' -végén a riboszómához való kötödést és megfe lelő orientációt biztosító szekvencia van. E problémák megoldására készítenek olyan rekombinán DNS-t, amely fúziós fehérjét kódol. Pé ldául a fág vekto r tarta lmazza a !acoperon promoterét és az azt követő ~-galaktozidá zt kódoló gén egy ré zét, és ehhez csatlakozik a megfelelő orientác ióban az eukariótából származó cDNS. Ilyenkor az expressziós rendszerül szolgáló baktériumban olyan fúz iós fehérje szintetizálódi k, amelynek amine terminális szakaszát a ~-ga l akto­ zidáz enzim egy darabja képezi és ez fo lytatódik a kívánt po lipeptid lánccal. A megszintetizá lódott fúziós fehérjébő l annak tisztítása után kémia i vagy enzimatikus módszerre l le le het hasítani a tennelterni kívánt fehérjét. A fú ziós fehérjék egy részét többszörös rekombináció val létrehozott ravasz konstrukciók kódo lják. A baktériális fe hérjék extracelluláris térbe tö11énö szekrécióját (az eukariótákhoz hasonlóan) szigná l peptidszekvenc iák egitik e lő. Ha a fúziós fehérjét kódoló konstrukció tartalmazza (a megfelel ő he lyzetben) a szignál szekvenc iát is, akkor a termelterni kívánt fehérjét a baktérium szekretálja és sokkal könnyebb elkülöníteni a bakteriá Ji fehérjéktőL

4l l

Eukarióta vektorok és expressziós rendszerek Számos olyan vektort is ki fejlesztettek, amelyek eukarióta expressziós rendszerek létrehozására is alkalmasak. Az eukarióta sejtek transzfekciója (a DNS bejuttatása, a baktériumok transzformáci ój ával analóg folyamat eukarióta sejtek esetében) különbözö módon tötténhet. Az egyik legegyszerűbb, bár nem a legnagyobb hatásfokú módszcr a rekombináns DNS kalcium-foszfát segítségével történő csapadékká alakitása in vitro sejttenyészetbő l származó sejtek felületé n. Az így kezelt DNS egy része endoc itózis segítségével bejut a sejtekbe és a sejtmagba kerül. Más esetekben a sejtek membránját e lektromos úton nagyon rövid időre kilyukasztják, a DNS bejut a sejtekbe és a sejtek az on csoportja, amely túlé li a beavatkozást, expressziós rendszerré alakul. Az eukarióta expreszsziós vektorok között gyakoriak az eukarióta sejteket fertőző DNS-vírusok és retrovírusok [papovavírus, simianvírus 40 (SY40), a Rous sarcomavírus vagy a humán cytomegalovírus] genomjából készült kons trukciók. Ezekből származnak azok a regulációs elemek, ame lye k az expresszié t biztosítják, e regulációs elemeket á lta lában valamilyen antibiotikum elleni rezisztenc iáért fe le l ős gént is hordozó plazmidvekto rba ültetik. (E konstrukciókat úgy készítik el, hogy ne tartalmazzák az e redeti v írusgenom minden komponensét és csak kontrollá lt körülmények között szaporodjana k. A rekombináns DNS-techno lógiát álta lában csak o lyan feltételek és megszorítások között szabad a lkalmazni, hogy ne hozhasson létre új fertőző, az é l ővil ágra ártalmas szerkezeteket.) Az eukarióta sejtek transzfekciója során bekerült idegen DNS integrá lódhat a saját genomba, ekkor stabil, a sej tosztódás során expressziós képességét megőrző rendszer képződik. Ha a DNS nem integrálódik, hanem különálló DNS-ként (episzóma) v iselkedik, az cxpresszió csak átmeneti, a transzfektá lt sej t az idegen DNS-t nem tudja utóda iba átörökíteni. A transzfeletáJt sej tpopulációból ugyancsak ki kell választani azokat a sejteket (klónokat), amelyekben a bevitt gén működik. A képződő rnRNS a már említett Northern-blot segítségével kimutatható. A szintetizálódó febérje kimutatására többféle módszer szolgálhat, ezek között csak nagyon ritkán van lehetőség a fehérje enzimaktivitásának

4 12

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))).)))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))

közvetlen mé résére. Az egy ik leggyakrabban haszná lt, immunológia i reakción alapuló eljárást Western-blot módszem ek nevezile A blottolás itt is a nagyságuk szerint SOS poliakrilamid-gélelektroforézissel (SOS-PAGE) szétválasztott fehérjemolekulák nitrocellulózmemb ránra történő juttatását j e lenti. A fehérjék b lottolása elektromos úton történik. A nitrocellu lózon a gélelektroforézissel kialakult pozíc ióban rögzült fehérjék közül az Elisa-eljárássa l analóg immunológ iai eljárássa l mutatják ki a kérdéses fehérjét (3-47. áhra).

SOS poliakrilamid-gélelektroforézis

!

3

"Riporter gének"

4

5

M

kDa

200

-

1 116 67 45 30 20

....

.......

-

immunreakció és autoradiográfia

b kérdéses fehérje specifikus antitest (nyúl IgG) nyúligG elleni antitest (kecske IgG) peroxidáz enzimmel konjugálva ~

Az eljáráshoz a fehérjél spccifikusan felismerni képes antitest zükségcs, amely reagál a fchérjével, és így a kimutatni kívánt fehérjecsík pozíciójában szintén rögzül a membránon. A specifikus antitesttel történő reakciót egy második antitest segítségével teszik láthatóvá. Az el ső antitestre specifikus második antitest kovalens kötéssel hordoz egy jelző enzimet (legtöbbször peroxidázt vagy foszfatázt), amelynek aktivitását produk rumának színrcakciója vagy fluores7cenciája alapján nabryon könnyű kimutatni. Ha például egy emberi sejtből zánnazó fehérjét egy nyúlból nyert, a kérdé e fehéljére specifikus immunglobulin G segít égével akarnak azonosítani, a második reakcióban olyan másik á llatból szám1azó antitcstet használnak, amely felismer minden nyúlból szánnazó lgG-mnlekulát, de kizáró lag a nyúlból szánnazó IgG-t. Ilyen második, jelzö antitesteket ipari méretekbcn állítanak el ö é forgalmaznak. A7 első reakció után a membránt a második antitesttel kezelik, amely viszont kizáró lag az e lsőként használt antitestet felismerve és ezzel reagá lva ugyancsak rögzül a megfel elő pozícióban. A hordo7ol1 enzim szub ztrátját a membránra j uttatva a képzödő színes vagy nuoreszkáló (autoradiografálható) produktum csíkszerű megjelenése, po7Íciója és intenzi tása mu tatja a vizsgálni k ívánt fehérje jelenlétét, pozícióját (nagyságát), illetve mennyiségét (3-47. ábra).

blattolás

nitrocellulózmembrán 2

GENETIKAI I NFOR IIÁC IÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJ EZŐDÉSE

peroxidáz szubsztrát jelenlétében

~* fluoreszkáló produktum --+ autoradiográJ fia

** * 3-47. ábra. Western-blot. (a) A vizsgá/ni kivánt sejtek lizátumában levő fehérjék SOS poliakrilamid-gélelektr oforézise és blotto/ása nitrocellulózmembránra. (b ) A kérdéses fehérje kimutatása

Bizonyos esetekben egy gén expresszióját vagy egy génszakasz regulációs szerepét ún. r iporter gének segítségével v izsgá lják. A leggyakrabban haszná lt riporter gén a klóramfenikol acetiltranszferáz enzimet (CAT) kódoló plazmid gén. Egy eukarióta promoter viseikedé ét, a pm rnotert szabályozó komponensek jelenJétét vagy hiányát például vizsgálni lehet, ha a pmrnotert a CAT -gén e lé ültetik és az ilyen módon el őá llított plazmiddal transzfektálnak egy eukarióta sejtet. A CA T aktivitása nagyon könnyen mérh ető, eredetileg nem termelődik eukarióta sejtekben, csak a bevitt génkonstrukc ió hatására. Ezért a vizsgálni kívánt promoter fun kcióképességét, iIletve az azt regulá ló komponensek j e lenJétét vagy viselkedését a CAT enzim megjelenése és mennyisége jól mutatja.

Irányított in vitro mutagenezis Egy klónozott DNS bizonyos kiválasztott szakaszán vagy egyetlen nuk leotidján végrehajtott változtatás, mutáció (site d irected mutagenesis) segít felderíteni a kérdéses DNS-szekvencia regulációs szerepét, vagy ha kódoló régióban ta lálható,

LABORATÓRIUMI GÉNTECHNIKA

)))) )))~))))))))))')))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))) ))))))))))))))))))))

a fehérje megfelelő aminosavainak jelentőségét a fehérje funkciójában. Kontrollált, előre tervezett mutagenezisről van szó, egy darab DNS-t beillesztenek (inzerció) vagy kivágnak (deléció), vagy éppen kicserélnek egy másik szekvenciára. (Megválasztott szekvcnciájú oligonukleotidok kémiai szintézise megoldott probléma, ahhoz, hogy az oligonukleotidból a kérdéses polinukleotid DNS szintetizálódjék és tovább replikálódjék, a rekombináns DNS-technika segítsége is szükséges. Az irányított mutagenezis több lépésből álló eljárás.) Az ilyen módon mutációt szenvedett DNS-t expressziós rendszerbe juttatják, ahol a mutáció következményei megfigyelhetők.

Polimeráz láncreakció (PCR) Egy kívánt DNS-szakasz homogén fonnában szaporítása klónozás útján hosszú és munkaigényes folyamat. Az elmúlt évtizedben DNSpolimeráz I. segítségével egy olyan módszert is kidolgoztak (polimeráz lánc-reakció, PCR), amely nagyon gyorsan, automatizálva is képes egy kívánt DNS-szakasz akár milliószoros mennyiségre történő sokszorosítására, feltéve, ha annak szekvenciája vagy legalább az elején és végén levő szekvenciája ismert. A szekvencia ismeretében DNSszintetizátorban két olyan 20- 25 tagú egyszálú oligonukleotidotkészítenek, amelyek komplementerek a kérdéses DNS-darab egyik, illetve másik láncának 3'-végével, ezek töltik be a primer szerepét. A reakcióelegy tartalmazza a sokszorosítani kívánt DNS-mintát, a nagy moláris feleslegben levő primercket, a négy dezoxi-ribonukleo zidtrifoszfátot és egy olyan DNS-polimerázt, amely igen magas hőmérsékletű hőforrásokban élő baktériumból származik (Taq polimeráz), és ezért nagy a hőtürése. Aktivitását megőrzi olyan hőmérsékle­ ten is, amikor a DNS denaturálódik. A reakcióelegyet kb 95 oc emelve a DNS denaturálódik, két lánca elválik egymástól. A reakcióelegyer alacsonyabb hőfokra hütve a nagy moláris feleslegben levőszintetikus primer molekulák hibridizálnak a megfelelő lánccal. A reakcióelegyet a polimeráz aktivitásának megfelelő hőmérsékleten tartva az enzim megszintetizálja a primerek folytatását képező láncokat és így az eredeti DNS megkétszereződik. Egy újabb ciklus e lindítható a

413

reakcióelegy ismételt felmelegítésével. Ekkor az újonnan szintetizált DNS-molekulák ismét denaturálódnak és így az eredetinél már kétszer több mintát (temp late) szolgáltatnak a reakcióhoz. Hűtés után a nagy feleslegben jelen levő primer ismét hibridizál a megfelelő láncokkal és a polimeráz reakció végbemegy, ennek végén a DNS mennyisége ismét megkétszereződik. A ciklus 20-25-ször ismételhető, a folyamat végén a DNS mennyisége 211-szeresére növekszik, n a ciklusok száma (3-48. ábra). A polimeráz láncreakciót ma már rutinszerűen használják a diagnosztikában és az igazságügyi orvosi gyakorlatban, ahol nagyon kis mennyiségű anyagból (pl. egy hajszálból vagy egy csepp beszáradt vérbő l) kell kiindulni. Fontos szerepe van az evolúciós vizsgálatokban, és gyakran alkalmazzák az irányított mutagenezis stratégiájában is.

történő

"Antiszenz" nukleinsavak A DNS két száJa közül az értelmes, kódoló, "szenz" (sense) szálnak a nukleotidszekvenc iája megegyezik a 1nRNS nukleotidszekvenc iájával. A mRNS-sel komplementer, természetes vagy mesterséges eredetű nukleinsavláncot, amely a kérdéses mRNS-sel hibridizálni képes, "antiszenz" nukleinsavnak nevezik. Egy mesterséges eredetű "antiszenz" (antiscnse) RNS-láncot juttatva egy sejtbe, szelektíven lehet megakadályozni annak a génnek az expresszióját, amelyrő l az eredeti mRNS szintetizálódik, mert az antiszenz lánccal történő hibridizáció gátolja a mRNS által irányított fehérjeszintézist. Ez a módszer segítséget nyújt az egyes fehérjék sejten belüli funkciójának vizsgálatában. Különösen ígéretesnek tűnik az antiszenz RNS felhasználása az egyes vírusok elleni küzdelemben, ahol a sejtb~n termelődő vírus-RNS-t kell szelektíven inaktíválni. Antiszenz RNS-t elő lehet állítani egy sejtben klónozási technikávaL Ha egy gén t (cDN S-t) egy expressziós vektorba annak promotere után nem a természetes orientációjában, hanem fordítva ültctnek be (ez technikailag lehetséges), akkor a fordított génrő l az eredeti génhez viszonyítva antiszenz RNS fog szintetizálódni az ezzel a vektorral transzfektált sejtben. (A fordított orientációjú gén DNS-szálai közül most az lesz a kódoló, + szál,

GE ETlKAII Nf'ORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

>»»mnmm>>>m»>»»m»mm>Hn»>>>>>>m>>>>>»m>m»>>>»»»>>»»m

5' ====

3'

5'

UJ 5'

- 5'

+ + 3' 3'11 ll ll ll !lll l 5'

1.

5'

5' r. 3'

3'

u 111111111 5'

2.

3'

3.

5'

5' -

5'

3'

első

5'

lll~::;;::;:::=

3'

ciklus

3'

W5·

5' 3' 3'11111111111 5' 3'

5' 5'

3'

3'

5'

lllllllllll 5·

5'

m

3'

5' 3' 3. II I II JI! ll l 5.

3'

3'

W5'

3'

5'11111 1111

mJJJJJJ"";." 3.

3'

5' 3' ll l

3' 5'1l11Jllllll

második ciklus

5'

3'

5' 3' 3'1 11111 11111 5, 3' 5' 3' 3· 11111 i ll l 5·

3'

5' 3' 3'1111111115' 5' 3' 3' 1111 111111 15'

5'

3'

5'

3'

3'

5'

5'

- 3' W 5'

5' 3'1l l 5'

harmadik ciklus

+

n ciklus

DJ]J]J]]5, 3' ~:lJ]]]]]]]

W 5' !l l

5'111 111111

OJJJJJJJ ;: 3' 5,111 111111

W5· 3'

3'

11111111111 5. 3' 3'

m

3'

5'

3'

m

3'

5'

5' 3'

3'

5' 5'

W 5'

3'

l]]]]]]]] 5' 3' 3' 5'1l lllllllll

LABORATÓRJUMI GÉ TECHNl KA

)))mmm H>lH»m>>>">»>> >»>» >>»»>>>> m>>>>>>>»m> >>m»>>»»mm>> "

amely eredetileg a m inta (template) szerepét betöltő komplementer, -szál volt.) Ezenn a helyen említjük azt a kisérleti irányvonalat is, amelyet tripla-hélix géntcrápiának neveznek. A módszer a DNS-nek azt a tulajdonságát használja ki, hogy a kettőslán­ cot stabiliziló hidrogénhidak kialakulása után, bizonyos bázispárok még képesek további hidrogénhidakat is kialakítani egy harmadik bázissal (Fioogsteen hidrogénhidak). A legstabilabban a G kőtödik a GC párhoz és a T az A T bázispárhoz. Ennek a mechanizmusnak az alapján rövid, génspecifikus szekvenciájú oligonukleotidok a DNS nagy árkában elhelyezkedve, a megfelelő rövid szakaszon stabil D S tripla-hélixet hoznak létre. Replikáció közben a tripla-héfix kitekeredik, azonban a tripla-héfix szerkezet megakadályozhatja a transzkripciós faktorok bekötődését és a gén expreszszióját.

Transzgénikus állatok Az eddig a fejezerig tárgyalt módszerek során idegen géneket vezetnek be baktériumokba, illetve egyedi, szomatikus eukarióta sejtekbe. E módszerek lehetőséget teremtenek arra, hogy a kérdéses gén müködésének hatását vizsgálják egy bizonyos sejtben. Ha egy gén funkcióját egy állat teljes szervezetében kívánják vizsgálni, a kérdéses gént egy megtermékenyített petesejtbe kell bevezetni. Annak az állatnak, amely ebből a petesejtből kifejlő­ dik, minden sejtje tartalmazni fogja az idegen gént. Az ilyen módon kifej l ődő állatokat nevezik transzgéoikus állatoknak. Arra a kérdésre, hogy egy bizonyos gén az élet szempontjából mennyire fontos fehérjét kódol , il letve hogy a gén által kódolt fehérje elvesztésének milyen következményei lehetnek az élő lényre nézve, az ún. knock-out állatok tudnak felvilágosítást nyújtani. Ezeket az állatokat úgy hozzák létre, hogy a megtermékenyített petesejtbe a kérdéses saját gén elrontott változatát vezetik be, és a rossz gén az általános genetikai rekombináció fo lyama-

'''"''' "''''' >H» »>> » »»

415

tá ban ki cserélődik az eredeti génneL Ha a gén által kódolt fehérje hiánya összeegyeztethető az é lettel, é letképes állat jöhet a világra.

A DNS-chip A laboratóriumi géntechnika, a DNS-sokszorosítás és szekvenciameghatározás automatizálása lehetövé tette egy-egy é l ő l ény teljes genomja szekvenciájának meghatározását. Az E. coli és néhány egyszerűbb eukarióta szervezet genomjának felderítése után nagy sebességgel halad előre a humán genom program, amely a legközelebbi időkre í.géri a teljes emberi genom nukleotidszekvenciáján ak ismeretét. Ez azonban m ég nem jelenti azt, hogy a genom minden szakaszáról azt is tudni fogjuk, hogy mi a funkciója, például történik-e róla egyáltalán expresszió vagy nem. Mind a genom további vizsgálatának, mind az eddigi és ezutáni ismeretek gyakorlati alkalmazásának lehetőségét kiszélesíti az új találmány, a DNS-chip. A DNSchip (DNS mikroelrendezés) egy adott vizsgálati anyagban előforduló többezer nukleinsavmolekula hibridizáción alapuló szekvenciaazonosítását teszi lehetövé, egymással párhuzamosan. Az ex presszió rnonitorozásán kívül a különböző egyének DNS polimorfizmusának tanulmányozására (DNS ujjlenyomat) és az egyes egyének különböző génjeiben levő mutációk analízisére is rendkívül nagy hatásfokú módszert szalgáltat kis mennyiségü vizsgálati anyag felhasználásával. A DNS-chip egy kis alapterü letű (gyakran nem több mint 1,5- 2 cm2 ) lemez, amelyik cellákra van osztva ( az egyes cellák mérete lehet pl. 50 x 50 J.l.m) és a cellák mindegyikéhez egy mási k, szintetikusan e l őá ll ított oligonukleotid néhány százezer molekulája van odaerősítve. A különböző oligonukleotidokat tartalmazó cellák sorokat alkotnak,

3-48. ábra. Polimeráz láncreakció. A sokszorosítani kivánt DNS-szakasz mindkét láncához dezoxiribonukleotid primert készítünk, ezt nagy feleslegben adjuk a reakcióelegyhez. (A kis nyilak a sokszorosítani kívánt DNS-szakasz kezdetét és végét mutatják). A ciklus lépései: l. DNS kettőslánc szétválasztása magas hőmérsék l eten , 2. alacsonyabb hőmérsékleten a primer hibridizál a minta-DNS komplementer szakaszával, 3. a DNS potimeráz a számára megfelelő hőmérsékleten megszintetizálja az új DNS-láncokat. A kialakuló DNS kettősl áncokat a következő ciklus el ső lépéseként ismét szét kell választani és a folyamat megismétlődik Az első néhány ciklus után, a ciklusok számának növekedésével a két primerrel pontosan baltatárolt DNS-szakasz mennyisége növekszik a legjobban

GENETIKAII NFORMÁCIÓ TÁROLÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE

416

DNS-chip 1,28 cm egy-egy cellához több százezer azonos oligonukleotid rögzltve, minden cellához másféle

cella 50 J.lm

- 1 -1- -

'--- '----

l több tízezer cella

vizsgált minta: egyszálú nukleinsavak biotinnal jelezve

ha a mintában lévő valamelyik nukleinsav valamelyik cellán komplementer láncot talál, ott hibridizál

111 streptoavidinhez kötött fluorescens festék~ streptoavidinen keresztül a biotinhoz kötődik

,,,

a fluorescencia mintázatát és erősségét számítógépes műszer értékeli DNS-chip

3-49. ábra. A DNS-chip

&Ci

LABORATÓRI UM I GÉNTECHN I KA

n>>,~ >HU>))))))))))))))))>)>>~>>>)))) ))l) >H> )H)))))>> )))))l))l)ll)))))) l)))})

tetvezett, meghatároz ott elrendezésben. A vizsgálni kívánt nukleinsavakat egyszálúvá kell tenni, és jelölni kell. (Jelölni lehet radioaktivi tás alkalmazásával is, de mostanába n a radioaktivitás alkalrnazásán ak elkerülésére nagyon gyakran használják a biotin és az avidin nevű anyag egymás iránti rendkívül nagy affinitását. A mintához kovalens kötéssel biotint erősitenek, az avidinhez pedig fluoreszcen s anyagat kötnek.). A mintaanyagban levő egyszálú nukleinsav moleku lák sokaságát megfelelő körülmény ek között összehozva a DNS-chippe l, a mintában levő nukleinsav molekulák közül azok, amelyek valamelyik cella oligonukleo tidjaival komplementer szekvenciá t

előre

)H))l>H>l))l)))))))) >)l)>>>> )))l >U) >>>>H))))))>)

41 7

tartalmazn ak, hibridizálni fognak a megfele lő celJán levő oligonukle otidmoleku lákkal. A nem hibridizáló nukleinsavm olekulákat le lehet mosni a lemezrő l. A hibridizáci ó tényét és erősségét mutatja a vizsgálni kívánt nukleinsav jelzése (pl. ha biotinnal voltjelölve a minta, a hibridizáció után a biotinboz avidinnel kapcsolódó fluoreszcen s festék). A jelzés által adott mintázatot (amelyik a hibridizáló oligonuk leotidokat tartalmazó egyes cellák elrendeződ éséből ered) egy műszer leolvassa és értékeli. Így egyszerre több ezer oligonukleotid-szekvenciáról lehet kideríteni, hogy el őfordult-e a vizsgált mintában vagy nem. (3-49. ábra).

A 3. fej ezet megírásával kapcsolatba n tett javaslatokér t és kritikai észrevételek ért a szer zö köszönetet mond Dr. Bauer Pálna k, Or. Krajcsi Péternek, Dr. Vá radi Andrásnak, Szpaszokuk ockaja Tatjaná na k.

Ajánlott irodalom

D A and RNA: Molecules of Heredity Flow of Genetic lnfonnation Exploring Gencs: Analyzing, Contrueting and Cloning DNA Genetic lnfonnation: storage, transmission and expression in Luhert Stryer: Biochemistry. W. H. Freeman and Company, ew York, 1988 D A: The Replicativc Process and Repair by Stelios Aktipis RNA: Structure, Transcripition and Posttranscriptional Modification by Francis J. Schmidt Protein Synthesis: Translation and Posttranslatio nal Modifications by Dohn Glitz Regulation of Gene Expression by John E. Donelson Recombinant DNA and Biotechnology by Gerald Soslau in Thomas M. Devlin editor: Textbook of Biochemistry witb Clinical Correlations. Wiley-Liss, Inc., USA, !992 Information Pathwaysi n Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. Cox: Principles of Biochemistry. Worth Publishers, Inc., USA, 1993 Basic Genetic Mechanism Control of Gene Expression Recombinant D A Technology Cancer in Bruce Alberts, Dennis Broy, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, James D. Watson: Molecular Biology of the Cell. Garland Publisbing Inc., New York and London, 1994 Animal Cell Cycles and Their Control by Chris Norbury and Paul Nurse in Annual Rev. Biochem. 1992, 61, 44-70. Genes That Can Antagonize Tumor Development by George Klein: FASEB J. 1993, 7, 82 1- 825. Principles of CDK Regulation by David O. Morgan: Nature, 1995, 374, 13 1- 133.

A membránok szerkezete. Membrántranszport-folyamatok

4. FEJEZET

4.1. A membránok szerkezete (Adám Veronika) A membránok kémiai összetétele Membránlipidek Membránfehérjék 4.2. Membrántranszport-folyamatok (Adám Veronika) Facilitált diffúzió A transzportfolyamatok energetikája Aktív transzport Na~+-ATPáz- Na ~+-pumpa A transzport ATPázok csoportosítása Másodlagos aktív transzport. A glukóz Na+-ftiggő transzportja ABC fehérjék. Multidrog-rezisztencia Ioncsatornák A sejtek Ca2+-transzport-rendszerei. Ca2+-homeosztázis , Az intracelluláris Ca2+-koncentráció emelkedését kiváltó,szignálok és mechanizmusok Az intracelluláris Ca2+-koncentrációt csökkentő mecbaniz,pmsok

4.1 •

A m·e mbránok szarkezet

Adám Veronika

A membránok olyan dinamikus struk:túrák, amelyek elhatárolják a sejteket a környezetüktől , a sejten belüli, a különböző intracelluláris kompartmenteket pedig egymástól. A szerkezeti elhatárolás mellett a membránok a korlátozott permeabilitás következtében megakadályozzák az ionok és molekulák szabad diffúzióját és ezáltal biztosítják az intracelluláris tér és az intracelluláris kompartmentek sajátos összetételét. A membránokban ugyanakkor speciális transzportfolyamatok teszik lehetövé, hogy a sejtek hozzájussanak a szük:séges anyagokhoz, másokat pedig eltávolíthassanak. Fontos szerepet játszanak a sejtek energiatermelésében, a sejtek közötti kommunikációban : szinte minden sej tfunkció feltétele, hogy szerkezetileg és funkcionálisan ép membránok biztosítsák a megfelelő intracelluláris környezetet.

mitokondrium belső membránja, ahol viszont a fehérjék vannak túlsúlyban, s ez tükrözi a belső membrán komplex funkcióját a sejtek anyagcseréjében és az A TP-szintézisben. Kis mennyiségben szénhidrátok is jelen vannak a membránban. Ezek soha nem szabadon, hanern vagy lipidekhez, vagy fehérj éhez kötve fordulnak elő. A 4-1. táblázat néhány membrán lipid és fehérje összetételét mutatja.

Membránlipidek A membránok 7,0-9,0 nm vastagságú képződ­ mények, amelyek alapszerkezetét egy lipid kettős réteg alkotja, s ebben, különböző mélységig ágyazódva találhatók a fehérjék {4-l . ábra). A kettős ré-

A membránok kémiai összetétele A sejtrnembránok komplex funkciója a sajátos kémiai összetételből és szerkezeti tulajdonságokból adódik. A membrán alapszerkezetét lipidek és fehérjék alkotják, leegyszerűsítve azt szokták mondani, hogy körülbelül azonos arányban. Ez általában igaz a sejtek plazmamembránjára, azonban nagyon nagy eltérések lehetnek a különböző membránok között a speciális funkciónak megfelelően. Egyik végletnek tekinthető az egyes neuronokat határoló myelinmembrán, ahol a lipidek aránya a 80%-ot is eléri, ami jól szolgálja a myelin védő, szigetelő funkcióját. A másik véglet a

Lipid

Fehérje

(o/o)

(o/o)

Szénhidrát

(o/o) Myelin Hepatocita plazmamembrán Szarkoplazmás retikulum Mitokondrium külsö membrán Mitokondrium bel ső membrán

75 39

54

20

5 7

32

64

4

46

50

4

23

75

2

422

»»>>>>>»>l»»»>m»>>»mm>m»»ml»>~>>m>>>m»»>»m>>>»»>>>~»H>I>

4-1. ábra. A membrán alapszerkezete. A fluid-mozaik mode/1

teg (kb. 4,5- 5,5 nm) mint membrán alapszerkezet a membránalkotó lipidek molekuláris sajátosságából következik. A membrán alkotásában alapvető szerepet a foszfol ipidek játszanak, azaz a foszfogliceridek és a szfingomielin. A foszfogliceridek közüla foszfatidilkolin, a foszfatid iletanol-amin 1 a foszfatidi lszerin, a foszfatidi linozitol és a kardiolipio a legjelentősebbek, amelyekrő l a 2.3. fejezetben szóltunk. A gl icerofoszfatidok közös jellemzője, hogy bennük a glicerin l. és 2. C-atomját hosszú szénláncú zsírsavak észteresítik, a 3. Catomhoz pedig foszforsavon keresztül valamilyen alkohol kapcsolódik (4-2. ábra). Az l . C-atomon

POLÁROS RÉSZ

M EM BRÁJ'IOK - M EMBRÁNTRANSZPO RT-FOL Y AMATOK

általában telített, a 2.-on telítetlen zsírsav található, s bizonyos törvényszerűség van abban, hogy melyik foszfolipidben melyek ezek a telített, illetve telítetlen zsirsavak. A foszfatidi lkolinban általában sok a palmitinsav és a linolsav, míg a foszfatidiletanolamin és a foszfatidilszerin különösen gazdag arachidonsavban. A telítetlen zsírsavak kettős kötése körüli cisz-konfiguráció következtében a szénhidrogén lánc megtörik, ennek a membrán fluiditás szempontjából van jelentősége (lásd később). Úgy tűnik, hogy bizonyos összefüggés van a táplálékkal elfogyasztott és a membránban található zsírsavak összetétele között. Ha a táplálék elsősor­ ban telített zsírsavakat tartalmaz, a membránfoszfo lipidekben is megnő a telített zsírsavak aránya, míg a telítetlen zsírsavakban gazdag étrend növeli a membránokban a telítetlen zsírsav arányát. Ismeretes, hogy a telítetlen zsírsavak fogyasztása kedvezően befolyásolja a plazmakoleszterin-szintet és valószínűleg nem kedvez a trombociták aggregációjának, azaz csökkenti a coronariabetegség ek valószínűségét. Nem tisztázott, hogy ez a hatás összefügg-e a sejtmembránok megváltozott zsírsavösszetételéveL A foszfolipidek amfípatikus tulajdonságúak, a molekulában poláros és apoláros csoportok egyaránt megtalálhatók. A poláros molekularészt a foszforsav és a hozzákapcsolódó csoport jelenti, ezt a molekula " fej"-részének is hívják, míg a zsírsavak hidrofób tulajdonságúak. Ábrázolásuk gyak-

HIDROFÓB LÁNC

4-2. ábra. A foszfogliceridek általános képlete és szokványos jelölése a membránokban

MEMBRÁNOK KÉMIAI ÖSSZETÉTELE

423

ran egyszerűsített formában a 4-2. ábrán látható módon történik. Ugyanez az amfipatikus tulajdonság jellemzi a szfingomielin t is, amelyben a poláros rész a foszforsav és a hozzákapcsolódó kolin. A membránokban a foszfolipidek olyan kettős réteget alkotnak, amelyben a poláros csoportok a vizes közeg, vagyi:; az extracelluláris és az intracelluláris tér felé, míg a hidrofób oldalláncok egymás felé fordulnak (4-1. ábra). A töltéssel rendelkező részek a vízzel poláros, az oldalláncok pedig egymással hidrofób kölcsönhatásb a lépnek. A szerkezct így nagyon stabil, s az utóbbi kölcsönhatás azt is biztosítja, hogy a víz gyakorlatilag kiszarul a kettős réteg belsejéből. A sejtmembránokban koleszterin is jelen van, amelynek orientációja ugyanezen törvényszerűség alapján történik: a poláros3-0H- csoport a felszín felé fordul és kölcsönhatásb a léphet a foszfolipidek poláros csoport- jával, míg az apoláros gyű rű és a szénhidrogénlánc a membrán belsejében a foszfolipidek zsírsav oldalláncával lép kölcsönhatásb a.

Az egyes foszfolipidek és a koleszterin aránya eltérő a különböző típusú membránokba n, de az egyes egyének között nagyfokú hasonlóság van az adott membrántípu s lipidösszetéte lében. A legnagyobb egyéni variáció a plazmamemb rán lipidösszetételébe n lehet, mivel ezt a táplálék zsírsavösszetétele is befolyásolja. Koleszterin és szfingomielin legnagyobb arányban a plazmamemb ránban található, míg kardiolipin jórészt csak a mitokondrium bel ső membránban fordul el ő. A g licerofoszfolipidek közül minden membránban a foszfatidilkolin van túlsúlyban (4-3. ábra) . A lipid kettős réteg létrejötte a foszfolipidek amfipatik:us tulajdonságáb ól következik és ez érvényesül akkor is, ha foszfolipidek vizes közegbe kerülnek. A foszfolipidek o ly módon orientálódnak, hogy apoláros lipid oldalláncaika t a vizes közeg elöl elrejtsék, poláros csoportjaikk al pedig a víz felé forduljanak. Megfelel ő kancentráció és hő mérsékl et esetén spontán módon ún. micellák j öhetnek létre, amelyekben az egyetlen lipidréteg a

o/o 100

E E

K

K foszfa

szen

50 szftngom elm

foszfatid etano am n

toszfal dllkolin

o plazmamembrán

durva felszina endoplazmás retikulum

milokondrium külsö membrán

mitokondrium belső

membrán

4-3. ábra. Néhány sejtmembránba n a lipidek aránya. A piros a foszfolipideket, s ezen belűl az egyes jelölések a megfele/6 foszfolipideketjel zik. K; koleszterin. E; egyéb lipidek (koleszterin-észterek, gangliozidok stb.)

424

)) ))}))))))) )) )) )))))) ))))}) )))))) )) )) )))))})) )) )))\) n))) n ))))))))))))))))))))))) ) )))

•>

poláros csop01tjai a felszín felé, az apoláros oldalláncok a micella belseje felé orientálódn ak (4-4. ábra). A foszfolipid kettős réteg kialakulása szintén spontán folyamat. A stabit struktúrát az oldalláncok közötti apoláros, valamint a poláros csoportok és a víz között létrejövő poláros kölcsönhatáso k hozzák létre. ln vitro körűlmények között, vizes közegben olyan foszfo lipidstruktú rák is létrehozhat ók, amelyekben a foszfolipid kettős réteg záródik és vezikulák, ún.liposzó mákjönnek létre (4-4. ábra). A liposzómák létrejöttéhe z a vizes közegbe tett foszfo lipideket ultrahanggal kell kezelni, s kialakulnak a kb. 250 nm átmérőjű gömböcské k. A különbözö foszfolipid-összetételű liposzómák kal jól vizsgálható k a lipid kettős réteg tulajdonság ai és mivel a lipidrétegbe alkalmas körűlmények között fehérjéket is be lehet építeni, transzportf olyamatok, membránen zim- és receptorfun kciók is modellezhetök.

MEMBRÁNO K - MEMBRÁNT RANSZPOR T-FOLYAMA TOK

Potenciális an nagyon jelentős lehet a liposzómák felhasználá sa az orvosi gyakorlatb an. Mivel a liposzómák keletkezése kor a vizes közeg, amelyben a foszfolipid eket elegyítették a liposzómák belső terébe zárva, "csapdában " marad, létrehozhat ók olyan liposzómák , amelyek tetszőleges enzimeket vagy gyógyszere ket tartalmazn ak. Jövőbeni jelentőségűket az adja, hogy a liposzómák kal célzottan lehet gyógyszereket a megfelelő szervekhez eljuttatni (pl. specifikus antigének vagy felismerő anyagok liposzómam embránba ültetésével) , amelyek a sejtmembr ánnal fuzionálva a gyógyszert közvetlenül a kívánt sejtekbe juttatják. Így a nem kívánatos, sokszor nagyon súlyos toxikus mellékhatások csökkenthetők, amelyek pl. a daganatellenes terápiában komoly problémát jelentenek. Antibiotiku mok, vírus- és gombaellen es szerek liposzómáb an történő alkalmazás a stabilabb koncentrác iót biztosíthat a plazmában , s javulhat azoknak a gyógyszere knek a hatékonysága is, amelyek egyébként túl gyorsan metabolizá lódnak. A liposzómák tehát új lehetőséget jelenthetne k a terápiában, bár felhasználásuk e téren még csak a kezdeti stádiumban van.

micella

bilayer

liposzóma

4-4. ábra. Vizes közegben létrejövő foszfolipidképződ­ mények

A membráno k két rétegében a foszfolipid ek eloszlása nem azonos, ami a fehérjék eltérő orientációjával együtt (lásd késöbb) meghatároz za a membráno k aszimmetr iáját. A plazmamem bránokban általában a szfingomie lin és a foszfatidilkolin inkább a külső rétegben, a foszfatidiletanolamin és a foszfatidils zerin a belső rétegben, rníg a koleszterin egyenletese n, a membrán mindkét rétegében megtalálható. A lipid kettős rétegben az egyes foszfolipidek nagyfokú mozgékony sággal rendelkezn ek, mivel a foszfolipid ek között nem kovalens kölcsönhat ások működnek. A foszfolipid ek zsírsav oldalláncai egymáshoz képest elmozdulhatnak, a foszfolipidmolekulák a saját tengelyük mentén rotálhatnak és a membrán síkjában elmozdulh atnak (4-5. ábra). Ezek a mozgások, amelyek a másodperc töredékei alatt végbemenn ek, a membránn ak nagyfokú dinamizmust adnak, megteremt ik a membránfe hérjék mozgásáboz is a lehetőséget és ez együttesen a

MEMBRÁNOK KÉMlAl ÖSSZETÉTELE

)) )) )))) )) )))U)))))))))))))))}) )H}>))))))))) ))o))))))))))))))))))))))))>))))>)))))))) )1)) )) )) )} )) )))) )))))) )) )))) )) )>)))) )))) ))

oldalláncok mozgása

rotáció

•

•

laterális diffúzió

425

A membrán fluiditást befolyásolja a lipidek összetétele is. A foszfolipidekben a telitetlen zsírsavak jelenléte a fluiditást fokozza, mert a kettős kötések törést okoznak az oldalláncban, s ez megakadályozza az oldalláncok közötti túl szaros kapcsolat létrejöttét. Ezzel szemben nagy mennyiségű telített zsírsav a membránokban a fluiditást követ' kezésképpen a permeabilitást is csökkenti. A membránfluiditás mértékét jelentösen befolyásolja a koleszterin. A merev szteránváz, amely a zsírsav oldalláncok közé ékelődik, kettős hatású. Egy kevéssé fluid membránban a koleszterin a fluiditást növeli azáltal, hogy a zsírsav oldalláncok közötti kölcsönhatásokat csökkenti, míg egy nagymértékben fluid membránban a koleszterinjelenléte a fluiditást csökkenti, mert korlátozza a zsírsav oldalláncok szabad mozgását.

Membránfehérjék

flip-flop (ritka)

4·5. ábra. A foszfolipidek mozgásai a membránokban

membránok alapvető tulajdonságát, a fluiditást biztosítja. A foszfolipidek átjutása a membrán egyik rétegéből a másikba ("flip-tlop" mozgás) nagyon korlátozott, mert ehhez a foszfolipidek poláros csoportjának át kell hatolni a membrán hidrofób belső közegén, ami termodinamikailag nem kedvező folyamat. A membránokban a lipidek mozgékonysága a hőmérséklettől és a lipidek összetételétől ftigg. A fázis-átalakulási hőmérséklet alatt a membrán merev, ún. gélkristályos állapotban van, amelyben a lipidek mozgása rendkívül korlátozott. A hőmér­ séklet emelésével az ún. folyadékkristály állapot alakul ki, amelyben a fluiditás növekszik. A lipidek, illetve a lipidek és fehérjék közötti kölcsönhatás különbözősége miatt a membránok egyes területei közötteltérő lehet a fluiditás mértéke. A szervezetben a normális testhőmérsékleten a membránok általában folyadékkristály (fluid) állapotban vannak. Minél inkább fluid egy membrán, annál nagyobb a permeabilitása.

A membránban a lipid kettős rétegbe ágyazódva helyezkednek el a fehérjék. Singer és Nicolson dolgozta ki azt a membránmodellt, az ún. fluid-mozaic modellt, amelyet később a legkülönbözőbb kísérteti módszerekkel igazoltak, s amely szerint a lipid kettős réteg nem folyamatos, hanem a lipidszerkezetbe különbözö mélységig ágyazódva fehérjék épülnek be (4-1. ábra). A membránfehérjék csoportosítása aszerint történik, hogy milyen erőtelj es behatással vonhaték ki a membránból. A perifériás mebránfebérjék viszonylag enyhe kezeléssel, pl. a pH változtatásával vagy különbözö ionerősségű sóoldatokkal kinyerhetők, s ez a lipid kettős réteg integritását nem befolyásolja. Az integráns fehérjék, csak erőtelj es kezelés, pl. detergensek vagy szerves oldószer hatására távolithaték el, amely a membránt is tönkreteszi. Az integráns fehérjék a membránból kinyerve vízben általában oldhatatlanok. Azok a fehérjék tudnak a membránba integrálódni, amelyek egyegy szakaszon hidrofób aminosav oldalláncokat tartalmaznak (pl. alanin, valin, leucin, izoleucin), s így a lipid kettős rétegben a hidrofób zsírsav oldalláncokkal kölcsönhatásba léphetnek. Az integráns membránfehérjék egy része csak egyetlen szakaszon éri át a membránt, mint pl. az eritrocitákban található glikoprotein, a glikoforin vagy az LDLreceptor-fehérje. Egy kb. 25 aminosavból álló

426

>»>>•>>>>»>»•>>•»»»>»»>»>»>>>»>>•»»»>>»»»>>>>»»»>>»>m>m>>»>»>>>

a.-helix-szakasz elegendő ahhoz, hogy a membránt átérje. Számos membránfehérjében több olyan szakasz van, amit jórészt apoláros aminosavak alkotnak, s éppen ezért ezek több transzmembránrégióval rendelkeznek, amelyeket a Lipid rétegből "kilógó" hajtűszakaszok kötnek össze (4-6. ábra). Ilyen, több transzmembránszakasszal rendelkező fehérje pl. az eritrociták bikarbonát- klorid anioncseretranszportere, a B-adrenerg receptor vagy a Ca2+-ATPáz. A 4-6. ábra az egy transzmembránszakasszal rendelkező glikoforin- és a 12 transzmembránszakasszal rendelkező glukóztranszporter sémáját mutatja. A perifériás membránfehérjék a lipid kettős réteghez lazán kapcsolódó, vizben oldékony fehérjék. Rögzülhetnek a lipidekhez elektrosztatikus

MEMBRÁNOK - MEMBRÁNTRANSZPORT-FOLYAMATOK

kölcsönhatások révén, kapcsolódhatnak integráns membránfehérjékhez vagy valamelyik végükön egy rövid hidrofób szakaszon beépülhetnek a membránba (4-7. ábra). A periféfiás membránfehérjék kapcsolódásának egy sajátos módja történik a glikozil-foszfatidilinozitol horgonyou keresztül. A fehérjék a C-terminális aminosavval faszfoetanol-aminon keresztül egy rövid szénhidrátlánchoz kapcsolódnak. A szénhidrátlánc, amelyet glikánnak hívnak, mannózokból, galaktózból és glukózaminból á ll. A glikán kovalens kötéssel a lipid kettős rétegben elhelyezkedő foszfatidilinozitol inozitolrészéhez kapcsolódik (4-7. ábra). Ily módon rögzítődik a sejtmembránhoz például az acetilkolin-észteráz és az alkalikus foszfatáz. Azok a fehérjék, amelyek foszfatidilinozitolon keresztül

4-6. ábra. Integráns membránfehérjék a lipid kettősrétegben

4-7. ábra. Perifériás membránfehérjék

INTRACELLULÁRIS

---------

MEMBRÁNOK KÉMIAI Ö

ZETÉTELE

kapcsolódnak a rnembránhoz foszfolipáz C hatására (amely a foszfát és a glicerin 3-0H közötti kötést hidrolizálja; lásd 5. fejezet) felszabadíthatók. Tekintettel arra, hogy ezt az enzimet bizonyos receptorok aktiválják, a fehérjemobilizálásnak szerepe lehet a hormonok és neurotranszmitterek hatásának közvetítésében. Egyes perifériás fehérjékhez az N-terminális glieinen keresztül mirisztát (14 C-atomos telített zsírsav) kapcsolódik és ez rögzíti a fehézjét a plaz mamembrán citoplazmatikus felszínéhez. Így rögzül pl. a p21 ras fehérje a plazmamembrán belső felszínéhez. A membránfehérjék egy része glikoprotein, amelyekben kovalens kötéssel szénhidrátok kapcsolódnak a fehérjékhez. A membránok szénhidrát alkotórésze így glikoproteinek (kisebb részben glikolipidek) részeként fordu l elő. A szénhidrátláncban glukóz, galaktóz, N-acetil-glukózamin, N-acetil-galaktózamin, mannóz, fukóz és sziálsav található. A szénhidrátok a plazmamembránban mindig az extracelluláris oldal , az endoplazmás retikulumban pedig a luminális oldal fe lé orientálódnak. A legtöbb plazmamembrán-receptor és transzport fehérje glikoprote in. A membránfehérjék hozzájárulnak a membránok fluiditásához és a membránaszimmetria kialakulásához egyaránt. A fehérjék a fluid lipid kettős rétegben laterálisan elmozdulhatnak, bár ez a mozgás lassúbb, mint a foszfolipidek laterális mozgása. Integráns fehérjék diffúzióját a membránban látványosan demonstrá lták egérbő l és emberbő l származó sejtek fúziójávaL A sejtek antigén tulajdonságú membránfehérjéit előzőleg olyan markerekkel jelölték, amelyek fluoreszcens mikroszkóp alatt eltérő színt mutattak. A sejtek fúziója után a mikroszkóp alatt a két szí n az új sejt két felénjó l elkülönült, azonban mintegy 40 perccel a fúzió után a kétféle szín, azaz a két sej tből származó két különböző fehérje egyen letes eloszlást mutatott az új sejtmembránjában (4-8. ábra). Bizonyos fehérjék esetében az elmozdulás i lehetőség korlátozott és az eloszlás a membránban nem random, hanem szigorú fu nkcionális szervezettség szerint történik. Erre a legjellemzőbb példa a mitokondrium bel ső

421

humánsejt

egérsejt

l 4-8. ábra. A plazmamembrán-fehérjék laterális diffúziójának ki mutatása humán - és egérsejtek f úziójávaL A fehérjéket fajspecifikus antigénekkel, majd fluoreszcens mikroszkóp alatt eltérő szInt mutató markerrel je/ölték. A fúzió után a két szín random elhelyezkedést mutatott a sejt felszfnén.

membránban helyezkedő elektrontranszport-lánc, amelyben az egyes funkc ionális egységek meghatározott szervezettségben kapcsolódnak egymáshoz. Más fehézjék intracelluláris struktúrákhoz rögzülnek, ami szintén gátolja a szabad elmozdulást. A membránfehérjék változatos orientác iója a membránok aszimmetriáját eredményezi. Mint láttuk, a membrán két rétegében el térő a foszfolipidek összetétele, ami önmaga aszimmetriát okoz. Ehhez j árul az integ ráns és perifériás fehérjék eltérő extracelluláris és intracell uláris felszínéből és a glikoproteinek szigorú orientációjából eredő további aszimmetria.

·,

4.2.

Membrántranszportfolyamatok

Adám Veronika

A membránok szelektív barrierek. Így lehet összefoglalni azt a kettősséget, hogy a legtöbb anyag átjutása a membránon erősen korlátozott, ugyanakkor a sejtek életében szerepet játszó anyagok felvétele és leadása biztosított. A sejtmembrán lipid kettős rétegének korlátozott permeabilitása adja a membránok barrier tulajdonságát, így a töltéssel rendelkező és poláros anyagok gyakorlatilag nem vagy csak nagyon limitá lt mértékben képesek áthaladni. Ez a nagyfokú impermeabilitás abból adódik, hogy jelentős energiát igényel a poláros csoportok átjutása a lipid kettős réteg be lső, erősen hidrofób közegén. Egyszerű

diffúzióval gázok (molekuláris 0 2 , N2 , metán stb.) jutnak át a membránon. Permeabilis membrán a zsírban oldódó, töltéssel nem bíró anyagok számára, mint amilyenek pl. a zsírsavak vagy a koleszterin. Exogén, lipidoldékony anyagok is átjutnak a membránokon, s ennek terápiás (pl. altatók, gáz narkotikumok) és toxikus (pl. szerves foszfát növényvédő szerekkel történő kantamináció) jelentő­ sége egyaránt nagy. Vízben oldódó és töltéssel rendelkező anyagok átjutása a membránokon erő­ sen korlátozott. Ez alól kivételt maga a víz képez, ami szabadon permeál, ha a membrán két oldalán ozmotikus különbség áll fenn. A víz és más kis po-

4-9. ábra. A koncentrációgrádiens irányában történő anyag· mozgás a membránokban, néhány példával

c, > C:z c,

egyszerű

diffúzió

02

N2 lipidoldékon y apoláros molekulák

facilitált diffúzió

glukóz

MEMBRÁNTRANSZPORT-FOLYAMATOK

))l>))))<))))))H)))))))))))))) >)~H))) 0))>>))))))))))))))))))))>>,~ )J )HH) ))1) )) )) >)J)>>)) )t))>)>>>)))>))>))))>>))))))))

láros molekulák valószínű leg azokon a résekenjutnak át, amelyek a membránban a foszfolipidek zsírsav oldalláncának mozgásaközben időről időre keletkeznek.

Facilitált diffúzió Az egyszerű diffúzió, amikor tehát egy anyag a koncentráció-grádiens irányában szabadon penneál a membránon keresztül, a szervezetben nagyon korlátozott mértékben áll csak rendelkezésre. A legtöbb anyag - tápanyag, metabolit, ionok - átjutását a membránban fehérjék biztosítják, melyeket transzportereknek, magát a folyamatot pedig transzportnak nevezzük. A transzportot, amely fehérje közreműködésével a koncentrációgrádiens irányában történik, passzív transzportnak, más néven facilitált diffúziónak nevezzük. A facilitált d iffúzió {4-9. ábra) sok szempontból hasonlít az enzimreakciókhoz, bár a folyamatban nem keletkezik új termék. A transzporterek megkötik a szubsztrátot, azaz a transzportátandó anyagot A felismerés speciftkus sztereokémiailag is, a transzport gátolható kompetitív és nem kompetitív módon egyaránt. A transzport sebessége ábrázolható a transzportálandó anyag koncentrációjának függvényében, s az összefüggés telitési görbét rnutat (4-10. ábra). Az ábrából megállapítható a

transzpo1t maximális sebessége és (a MichaelisMenten-állandó analógiájára) a transzport Kcértéke. Facilitált diffúzióval az anyagok mindig a koncentrációgrádiensnek megfelelő irányban mozognak, legfeljebb addig, amig az egyensúly kialakul a membrán két oldalán. Anyagok sejten belüli akkumulációja, azaz az extracellulárisnál magasabb kancentráció elérése facilitált diffúzióval nem lehetséges. A transzporterek integráns membránfehérjék, általában több transzmembránrégióval, amelyben hidrofil aminosav-oldalláncok hozzák létre azt a csatornát, amelyen az anyagok áthaladhatnak. A facilitált diffúziéra példa az eritrociták membránjában lévő glukóz-t r anszporter (GLUT-1), amelynek feladata az eritrociták fo lyamatos glukózellátásának biztosítása. A glukóztranszporter 12 transzmembránszegmenttel rendelkező fehérje, amelyen keresztül a glukóztranszport sebessége 50 000-szer nagyobb, mint a lipid kettős rétegen keresztül történő diffúzió. A transzporter D-glukózra specifikus, K 1-értéke 1,5 mM (L-glukózra a Kcérték >3000 mM), s 5 mM plazmaglukóz-kancentráció mellett biztosítja az eritrociták glukózfelvételét. D-galaktóz és D-mannóz is kötődik a transzporterhez, de a K1-érték sokkal magasabb. Fruktóz gyakorlatilag nem transzportálódik ezen a módon, az eritrociták valószínűleg egy k:ülön transzporterrel veszik fel a fruktózt.

EGYSZERŰ DIFFÚZIÓ

FACILITÁLT DIFFÚZIÓ Q)

Q)

Ol

Ol

•Q)

•Q)

Q)

Q)

cn cn

cn cn

.o

.o

Q)

cn

~

429

Q)

cn

Vmax

t

- 2-

o

Q.

N

Q. N

-

-

cn c

cn c

~

~

Kt transzportálandó anyag koncentrációja

koncentrációgrádiens

4-10. ábra. A facilitált diffúzió és az egysze rű diffúzió sebességének és a transzportárandó anyag koncentráci ójának összef üggése. K, a transzportátandó anyagnak az a koncentrációja, amelynél a transzport a maximális sebesség felével működik

430

lH)))))))))))))})))))~-.,))))))

))))))))))))))))))))))H)))>))))))))))))))))))))Htl)))))))

Szintén az eritrociták membránjában található egy másik fontos transzporter, amely a széndioxid-transzportbanjátszik szerepet (4-ll. ábra). A kJorid-bikarbonát cseretranszport HC0 3- és cr ellentétes irányú transzportját végzi az eritrociták membránján keresztül, a koncentrációviszonyok által meghatározott irányban. A szervekből , a katabolizmus során keletkező co2a kapillárisokba kerül, ahol az eritrocitákba diffundál. Az eritrocitákban a szénsavanhidráz enzim hatására H 2C03 keletkezik, amely reakcióban l s-on belül - azaz rövidebb idő alatt, mint amit a vér a kapillárisokban tölt - egyensúly alakul ki. A H2 C03 spontán reakcióban, gyakorlatilag azonnal disszociál, HC03- és H+ keletkezik. A HC03- a klorid- bikarbonát cseretranszporton keresztül visszakerül a plazmába, s így szállítódik a tüdőbe. Mivel a HC03- jobban oldódik a plazmában, mint a C02, az

MEMBRÁNOK- MEMBRÁNTRANSZPORT-FOLYAMATOK

eritrocitáknak ez a funkciója lényegesen megnöveli a vérplazma szén-dioxid-szállító kapacitását. A tüdőben a HC03- a cseretranszporton ellentétes irányban transzportálódva v isszakerül az eritrocitákba, ahol a fenti folyamatok ellentétes irányban zajlanak le, co2 keletkezik, ami diffúzióval elhagyja az eritrocitákat és kilégzésre kerül. A plazmában szállítódó co2 80%-a kerül így a perifériáról a tüdőbe, s ehhez a folyamathoz esszenciális a HC03--Cr cseretranszport, vagy másnéven anion-cseretranszport működése. A transzporter amit neveznek még band 3 fehérjének is, az SDS poliakri lamid gélen elektroforézissel látható helyzete rniatt - integráns membránfehérje, valószí nűleg 12 transzmernbránrégióval rendelkezik. A transzport során nem történik netto töltésváltozás a mernbrán két oldalán, vagyis a folyamat nem elektrogén.

4-11 . ábra. HC03 --Cr cseretranszport az eritro citák mem bránjában és a COr szállilás

perifériás kapillárisok

l plazma l

T

co;

H

cr

szénsavanhidráz

l eritrocita l

tüdő

co;

H

cr kilégzés

l plazma l

l eritrocita l

L

~IEMBRÁNTRANSZPORT-FOLYA tATOK

A mitokondriumok belső membránja is számos olyan transzporterrel rendelkezik (lásd 2. l . fejezet), amelyen az anyagok koncentrációgrádiens irányában történő transzportja történik. Ezek is, a HC03 - Cl cseretranszporthoz hasonlóan többnyire két anyag egyidejű, ellentétes irányú elmozdulását teszik lehetövé. Az ilyen transzportokat kotranszportnak nevezzük, szemben az egyetlen anyag transzportját végző uniporttal. A kotranszport, ha az anyagok azono irányban transzportálódnak, a szimport, ha ellentétes irányban, akkor az antiport nevet visel i.

A transzportfolyamatok energetikája A transzportokat jellemzi az a szabadenergia-változás, ami akkor történik, amikor egy anyag a membrán egyik oldaláról, ahol Ct koncentrációban van, átkerül a másik c 2 koncentrációjú oldalra. Töltéssel nem rendelkező molekulák esetében a szabadenergia-változás csak a két kencentráció arányától függ és a következő képlettel fejezhető ki:

llG'= 2,3 RT log [c 2 J [cl J ahol R az egyetemes gázállandó (8,315 J/mal· K), T az ab zolút hőmérséklet (K), [ct] és [c2] az illető anyag koncentrációja a membrán két o ldalán. Ha az anyag a nagyobb koncentrációjú oldatból az alacsonyabb koncentrációjú közeg felé transzportálódik (ct > c 2, a transzport iránya Ct ~ c2), a óG' negatív, s ez azt jelenti, hogy passzív transzport történik, ami energiafelszabadulással jár. Ha a transzport c 2 ~ Ct irányba történik a tiG' értéke pozitív, azaz szabadenergia-növekedés történik. Az ilyen transzportot aktív transzpOlinak hívjuk és feltétele az, hogy valamely más folyamat fedezze a tran zport energiaigényét Ionok transzportja esetén nem egyszerűen a koncentrációgrádien határozza meg a tiG' érté két, hanem a membrán két oldalán lévő eltérő polaritásból adódó membránpotenciál is, azaz

431

tiG' = 2,3 RT log [c 2 ] + zf\:l' [cl J

ahol z az ion töltése, F a Faraday-állandó (96 480 JN·mol), o/ pedig a membránpotenciál (V). Egy ion transzportjának az energiaigényét tehát az elektrokémiai potenciál, azaz a koncentrációkülönbség és az elektromos potenciálkülönbség együttesen határozza meg. Passzív transzport eseté n az ion az elektrokémiai grádiensnek megfelelő irányba transzportálódik, míg aktív transzport esetén ezzel ellentétesen. Az aktív transzporthoz ionok esetében is energia befektetése szükséges.

Aktív transzport A sejtek fiziológiai működéséhez elengedhetetlen számos olyan transzport működése, amelynek segítségével anyagok a koncentráció- vagy az elektrokémiai grádienssei ellentétes irányban mozognak. A legtöbb ilyen transzport közvetlenül kapcsolt az ATP terminális foszfátjának hidrolíziséhez, ami a transzport energiaigényét fedezi. Ezek az ún. elsőd leges aktív transzportok. Ilyen a plazmamembránban található, a sejtek Na t é K+eloszlását meghatározó Na K -ATPáz vagy a sejtek ca- ' homeosztázisában fontos szerepet Jalsza Ca2+-ATPáz. Vannak o lyan transzporterek, amelyekben az ATPhidrolízisenem közvctlenül része a folyamatnak, hanem az aktív transzport energiaigényét az fedezi, hogy egyidejűleg egy másik anyag az elektrokémiai grádiensnek megfelelő irányban transzportálódik, vagyis egy exergon ikus folyamat történik. A legtöbb ilyen transzporter a sejtek plazmamembránjában a nátriumion-grádienst használja fel és Na+ egyidejű transzportja történik a ej tekbe. Minthogy a Na+-grádiens fenntartása A TP energiájának a terhére történik, az ilyen transzportokat másodiagos aktív transzportnak nevezzük. Másodlagos aktív transzporttal tÖJiénik pl. a glukóz és bizonyos aminosavak felszívódása a bélhámsejteken keresztül vagy számos neurotranszmitter transzportja az idegi membránokban. Az aktiv transzportokra egyébként ugyanaz jellemző, mint a facilitált diffúzióra: a transzporter specifikus a szubsztrátra, specifikusan gátolható és működése telitési kinetikával írható le. ..,

•l

l

432

)))) )))) )))))))) )) )) )))))))))))) )) )) )))))))))))))))))))))))) )))})))) )))))))))) )))))) )))) ))

Az élő sejtekje ll emzője, hogy belső terükben az egyes ionok koncentrációja lényegesen eltér az extracelluláris közegben található ionkoncentrációktóL Ehelyütt csak a Na+ és K+ e loszlásról lesz szó, a melyekről ismert, hogy nagyságrendbeli e ltérés van az intracelluláris és extracelluláris koncentrációik között (4- 12. ábra). A Na ~ 140 mM koncentrációban van jelen a plazmában, míg intracelluláris koncentrációja a kü l önböző sejtekben l 0- 15 mM, szemben a K '"-mal, amelynek koncentrációja a plazmában 4 mM, intracellulárisan pedig 140- 150 mM. Ez az ioneloszlás meghatározó a sejtek nyugalmi potenciáljának létrejöttében, ami - 60 és - 90 m V közötti tartományb an van. A nyugalmi potenciál megközelíti a K ' -egyensú lyi potenciált, vagyis a K ' -eloszlás a plazmamembrán két oldalán közel egyensúlyi helyzetet jelent. Na ' -ra nézve azonban a koncentrációkülönbség és a belső negatív potenciál együttesen olyan jelentős e lektrokémia i grádieost jelent, ami - a korlátozott plazmamembrán-permeábilitás ellenére - a Na+-t a sejtbe hajtja, s ezzel párhuzamosan K+ lép ki a sejtből. Ha ez a fo lyamat nem kompenzálódna, a sejtek képtelenek lennének az ioneloszlást és így a nyuga lmi potenciált fenntartani, s ez a sejt halálát jelentené. A Na+K '"-ATPáz - mely minden sejt plazmamembránjában jelen l évő enzim - feladata, hogy a Na+-ot visszapumpálja az extracelluláris térbe, a K '-ot pedig a sejtbe. (Ezért nevez ik ezt a transzportrendszert Na+K+-pumpának, vagy egyszerűen csak Na •-pumpának.) Az elektrokémiai

MEMBRÁNOK - MEMBRÁNTRANSZPORT-FOLYAMATOK

grádiens ellenében történő iontranszporthoz az energiát az ATP hidrolízise biztosítja, amely szintén a Na+K+-ATPáz hatására megy végbe (4- 12. ábra). Az enzim fontosságát jelzi, hogy a sejtek a teljes ATP-termelésnek mintegy 30%-át e funkció fenntartására fordítják (ideg- és izomsejtekben 65- 70%-ot). Az enzim működése úgy is felfogható, mint ami az A TP-hidrolízis energiáját egy iongrádienssé alakítja, amely számos sejtfunkcióhoz közvetlenül hasznosítható (lásd másodiagos aktív transzportok). A Na • K ' -ATPáz integráns fehérje a plazmamembránban, amelyet intrace llulárisan a Na •, extracellulárisan aK • aktivál ; az enzim müködéséhez mindkét ion együttes hatása szi.ikséges. Műkö­ dé ·e közben ATP-r hidrolizál és az enzim egy meghatározott aszparaginsav oldalláncon foszforilálódik. Az enzim két ki.ilönböző konformációban létezik, ezeket E 1 és E 2-vel jelöljük. Az E 1 konformációjú enzim az intracelluláris oldalon köti a Na+-ot, az ATP-t hidrolizálja és foszforilálódik (4-!3. ábra). Az E 1-P foszfoenzim konformációváltozással átalakul , miközben a Na' -t a sejtből kipumpálja. Az E 2-P foszfoenzim köti a K+-ot az extracelluláris oldalon és az enzim defoszforilálódik. Miközben az eredeti konformáció visszaalaku l, az enzim a Kt-ot a sejtbe transzportálja. A legtöbb sejtben az enzim egy ATP-molckula hidrolíz isével párhuzamosan 3 Na ' és 2 K"' transzportját végzi. Ez extra pozitív töllések megjelenését okozza az extracellu láris közegben, amely néhány m V -tal közvetlen ül hozzájárul a nyugalmi potene i-

4·12. ábra. A Na•K•-ATPáz mükö· désének sémája. Extracelluláris és intracelluláris Na+- és K' -koncentrációk

2K•

[K\

4 mM

MEMBRÁNTRAN ZPORT-FOLYAMATOK

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))»))))))))>)))))))»)) ))>)»»

433

transzmembránszakasszal rendelkezik, amelyeket 20-25 aminosav a lkot. Az a-alegység egy nagy citoplazmatikus része tartalmazza az ATPkötőhelyet és azt az aszparaginsav oldalláncot, ahol az enzim foszforilá lódik. Az a és P-alegységek modelljét a 4-15. ábra mutatja.

p~ E2

•4----...;;::::"---- E2-P 2K+

4-13. ábra. A Na·~·ATPáz működésének egyes lépései

álhoz, ezért a pumpa e lektrogén. A Na +K+-ATPáz működésének ma l egva l ószínűbbnek tartott rnodelljét a 4- 14. ábra mutatja. Az enzimfehérjét két alegység alkotja; az aalegység (J 12 k.Da) rendelkezik a katalitikus sajátsággal, míg a P-alegység (35 kDa) feltehetően a megfelelő membránorientációhoz szükséges. A transzportfunkció működéséhez mindkét alegységre szükség van. Az a-alegység l O, a p egy

Az enzim specifikus gátlói az extracelluláris oldalon kötődni képes ún. szívglikozidok, amelyek szteránvázas vegyületek és a terápiában kiterjedten használatosak a szívműködés fokozására. Az egyik legaktívabb vegyület az ouabain vagy sztrofantin G (4-16. ábra). Hatása azzal magyarázható, hogy a Na'1<.+-ATPáz gátlás következményeképpen emelkedik az intracelluláris Na+-koncentráció, ennek hatására a két irányban műk.ödni képes Na+-Ca2+ cseretranszporton keresztül (lásd a lább) Ca2+ lép be a sejtekbe, s közvetlenül ez felelős a szívizom-kontrakció fokozásáért (4-1 7. ábra) .

Az a-alegység több izoformában létezik (a 1, a 2 , a 3), amelyek el térő érzékenységűek a szívglikozi-

4·14. ábra. A Na•K•-ATPáz mílködésének modellje. 1. A/apá/lapot, 2. Na • megkötése az intracelluláris oldalon, 3. ATP hidrolizise, foszfoenzim kialakulása, 4. Na •-kipumpálás, konformációváltozás, 5. 1\ megkötése az extracelluláris oldalon, 6. defoszforiláció, 7. 1\-bepumpálás, az eredeti konformáció kialakulása

6

r

434

nn>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>»>>>>H>>»>>»>>>>>>>>»>>>>>>»>>>>>>»>>>>»>>>>>>»>>

M E 1BRÁNOK - MEMBRÁNTRANSZ PO RT -FOLYAM ATOK

4-15. ábra. A Na•K+-ATPáz alegység szerkezete (a) és a transzmembránszakaszok modellje (b)

a EXTRACELLULÁRIS

~~r?

~gg

INTRACELLULÁRIS

b ~-alegység

ATPkötöhely

4-16. ábra. Az ouabain (sztrofantin G) képlete

o

H

OH

OH

OH

ME~IBRÁNTRAN ZPORT-F OLYAMA TOK

)))) )))) )))) )))))))) )) )) >))))) )) )) )) )))))))»)))))))ll) ) )) )))) )))))) )))))) ) ) )) )))) )))) )) )) )))))))) )))))))))))) )) )))) ))))))

435

mechaniz musa. Az ábra értelmezé sé4·17. ábra. A sztrofant in G hatására létrejövő szívizom -kontrakció legvalószínűbb hez lásd még a szöveget

dokkal szemben és különböző arányba n fordulna k elő az egyes szövetek ben. Ez valószínűleg fontos szerepetjátszik a szívglik oz idok meUékh atásaina k kialakulásában.

A transz port A TP ázok csoportos ítá sa

..

A Na +K+-ATPáz -hoz hasonló an néhány más ATPáz is úgy működik, hogy az iontrans zportta l párhuzamosan az enzim foszforilálódik és defoszforilálódik . Ezeket P típusú ATPázo knak nevezzük. Közös jell emzőjük , hogy integrán s membránfehérjék, foszforilációjuk egy meghatá rozott aszparag insav oldalláncon történik , aminoavsorren djükben nagyfokú hasonló ság van és mindegyik gátolható a foszfát analóg vanadát tal 2 (HVO/ -). P típusú ATPáz a Ca ' -ATPáz, amely a plazmam embránb an, valamin t az endopla zmás (és szarkoplazmás) retikulu m membrá njában ta lálható és az intracell uláris Ca 2 · -koncen tráció szabály ozá2 sában j átszik szerepe t (lásd Ca • homeos ztázis). Hasonló működésű a gyomor parietáli s sejtjeiben

található K+H •-ATPáz , amely a lumenbő l K •-t pumpál a sejtbe, a sejtből pedig H +-t a lumenbe , s ezálta l a gyomomedv savas pH-jána k létre hozásában van meghatá rozó szerepe. Eltérő, de mindezideig nem egészen tisztázo tt mechanizmussa l működnek azok az ATPázo k, ame lyek az intracell uláris organel lumok - lizoszómák , endoszó mák, szekréc iós és szinapti kus vezikulá k, Golgi komplex - me mbránjá ban találhatók és protont transzportálnak. Ezek a V típusú ATPázo k (vakuo1a), amelyek nek az a feladata, hogy a citoplaz máénál a lacsony abb pH-t hozzana k létre ezen organell umok belsejéb en. A szekréc iós vezikulá k vagy a szinaptikus veziku lák például a kialakul ó protong rádiens terhérc veszik fel az egyes hormon okat és neurotra nszmi ttereket, ahol ezek raktároz ódnak (lásd 6.1. fejezet). A V típusú ATPázo k nem foszforil álódnak és nem gátolhat ók vanadát taL Végezet ül az ATP ázok egy harmadi k csoportj ába tartozik a mitokon drium belső membrá njában található F típusú ATPáz, amely a protono k transzm embrán, koncent rációgrádiens irányába n történő áramlás ával párhuza mosan az A TP -

436

>>>>»>>>»m>>>>>>>mm>» >>»>> >>>>>>>>m»»»>>»>>>>m>mm>>>»>»»>>>>>>»>

ADP+Pi-ból történő - szintézisét katalizálja. (Eredetileg ezt energy-coupling factornak tartották, innen az elnevezés.) A transzport ATPázokhoz sorolhatók azok a plazmamembrán-fehérjék, amelyek a multidrugrezisztencia kialakulásáért felelősek (lásd később) .

Másodlagos aktív transzport. A glukóz Na+-függő transzportja A Na1<.+-ATPáz által fenntartott Na+ kencentráció grádiens egy olyan potenciális energiaforrás, amelynek terhére lehetövé válik anyagok grádiens ellenében történő transzportja. A 4-18. ábrán néhány olyan transzport, illetve funkció látható, amelyek közvetlenül a Na+-grádienst veszik igénybe. A Na+- W cseretranszport, mely a Na+-belépés terhére H+-t pumpál ki a sejtbő l, fontos szerepet j átszik a sejten belüli intracelluláris pH és a sejttérfogat szabályozásában. A Na+- Ca2+ cseretranszport (lásd később) a sejtek Ca2+-homeosztázisának fenntartásában ve z részt. Na+ egyidejű transzportjával történik a glukóz és bizonyos ami-

MEMBRÁNOK - MEMBRÁNTRANSZPORT-FO LYAMATOK

nosavak felszívódása a bélhámsejteken keresztül, és számos neurotranszmitter felvétele az idegsejtekbe. Közvetlen ül a Na+-belépés váltja ki az idegés izomsej tekben a depolarizációt. A Na+-függő glukóztranszportera vékonybélben az epithelsejtek luminális membránjában helyezkedik el. A transzporter l: l arányban Na+-ot és glukózt köt, a Na+ az elektrokémiai grádiensnek megfelelően a sejtbe transzportálódik, s ez lehető­ vé teszi a glukóztranszportot akkor is, amikor a kencentráció a sejten belül nagyobb, mint a lumenben. A glukóz az epithelsejtet a basalis membránon keresztül a kapill árisok felé hagyja el faci litált diffúzióvaL A sej tekbe felvett Na+-ot a Na 1 K+-ATPáz pumpálja ki az interstitiumba. Ennek folyamatos müködése esszenciális a glukózfelszívódás biztosításához (4- 19. ábra) . Fontos aspektusa ennek a transzportnak, hogy a Na ' felszívódását is lehetövé teszi. Ebből a szemponból a transzporter működése kritikus olyan állapotokban, amikor a szervezet diarrhoea (hasmenés) következtében nagy

neurotranszmitterek

depolarizáció

4-18. ábra. Néhány sejtfunkció, amely a Na•-grádiens hasznosításával működik. 1. Na ..- f1 cseretranszport 2. Na ..- Ca2 • cseretranszport 3. Bizonyos monoszacharidok és aminosavak transzportja. 4. Egyes neurotranszmitterek transzportja. 5. Depolarizáció a neuronokban és izomsejtekben

MD1BRÁNTRAN ZPORT-FOLYA JATOK

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

437

béllumen

jt

kap illáris

4-19. ábra. Glukózfelszívódás a vékonybélepithel-sejteken keresztül

mennyiségű

folyadékot és sókat veszít. Ez történik cholerában, a Vibrio cholerae fertőzés következtében. A kórokozó toxinja, a cholera toxin ADP-ribozilálja az adenilát-ciklázt aktiváló Gs fehérjeu-alegységét (lásd 5. fejezet) és elcktrolitszekréciót okoz. A sók és a folyadék pótlása ilyenkor kritikus a beteg élete szcmpon~ából. Kihasználva a glukóz és a Na+ kotranszporiját, a korszerű terápiában a sók (Na, Kt, Cr) mellett az orálisan alkalmazott oldat glukózt is tartalmaz, ami gyorsítja a Na+-felszivódást. Na -kotranszporttal történik az epithelsejteken kere ztül egyes am ino avak felszívádá a is, továbbá a vesetubulus-sejtekben a glukóz visszaszívása.

ABC fehérjék. Multidrog-rezisztencia A plazmamembránban találhatók olyan fiziológiá , patológiás é terápiá zempontból egyaránt nagy jelentőségű speciá lis transzporterek, amelyek az ún. ABC fehérjék csa ládjába tartoznak.

Az ABC fehétjékhez el té rő szerkezetű fehérjéket sorolunk, ame lyek mi ndegyikére j ellemző azonban, hogy felépítésükben hat transzmembránszakaszt tartalmazó transzmembrán domének és citoplazmatikus nuke lotidkötő dornének vesznek részt. (Az A TP kötőhely jellegzetessége miatt kapták az angol szakirodalomban az "ATP hinding cassette" fehérje e lnevezést.) A ma ismert ABC fehérjék e ltérő funkciókat láthatnak el, de legtöbbjükre az a jellemző, hogy ATP hidrolízisének terhére, aktív transzporttal különböző anyagokat pumpálnak ki a sejtekbő L Ezek lehetnek ionok, aminosavak, fehérjék, foszfolipidek, szteroidok, epesavak, toxinok, antibiotikumok, tumorellenes szerek. Az emberi szervezetben található ABC fehérjék a szerkezeti és funkcionális saj átosságok a lapján több csoportba sorolhatók. Orvosi szempontból is nagyon je l entős a multidrog transzporter (MDR l vagy másnéven P-glikoprotein), amely az epithelsejtek apikális membránjában ta lálható. Vázlato szerkezetét a 4-20. ábra mutatja. Különösen jelentős a P-glikoprotein előfordulása a vékonybél epithelsejtek luminá lis membránjában, a hepatociták canalicularis membránjában és az agyi kapilláris endothelsejtekben (vér- agy gát). Olyan, a sej tek számára toxikus hatású anyagok kipumpá-

438

)))))))))))))))))>))))))>))) ))))))))))))))))))))))))))))) )))))))>))))))))))))))))))))) ))))

M EMBRÁNOK-M EM BRÁNTRANSZP ORT-FOLYAMA TOK

4-20. ábra. A P-glikoprotein modellje a plazmamembránban

"ATP-kötöhely/

lását végzi, amelyek e ltérő szerkezetűek lehetnek, de közös jellemzőjük, hogy hidrofób karakterűek. A P-glikoprotein fiziológiás jelentősége valószínűleg az, hogy védi a szervezetet és a sejteket a táplálékban és a környezetben előford ul ó toxikus anyagokkal zem ben. Tumor ej tekben a kemoterápiás kezelés során gyakran fordul elő a P-glikoprotein fokozott expressziója, melynek következtében a sejtek kipumpálják a daganatos betegségek kezelésében alkalmazott citosztatikum okat, nagymértékben Jerontva ezáltal a kezelés hatékonyságát. Emiatt a kezelés során szükségessé válhat újabb és újabb, eltérő szerkezetű gyógyszerek bevonása a terápiába. Fontos tulajdonsága a transzportemek, hogy gátolható: az alkalmas gátlészerek megtalálása jelentős hatássallehet a daganatterápi ára, mert ezek a szerek fokozzák a citatoxikus hatású drogok akkumulációj át a daganatos sejtekben. A hepatociták canal icularis membránjába n található további ABC transzporterek, a foszfolipidek (MDR 3), illetve az epesavak (BSEP, "bile salt export pump") epébe történő kiválasztásáb an játszanak szerepet. A tumorsejtek citosztatikum ok iránti érzéketlenségének kialakulásában jelentős szerepet játszik egy másik transzporter is, a multidrug-re zisztencia fehérje (M RP l ), amelynek specificitása nem korlátozódik a hidrofób karakterü molekulákra. Epithelsejtekben a bazolaterális membránban lokalizálódik. A multidrug-rezisztencia fehérjék családjába tartozik az a transzportcr is (MRP2),

amely a g lutation és a glukuronsava s konjugátumok epébe történő kiválasztásához szükséges. A transzportert kódoló gén mutációja következtében jön létre a Dubin- Johnson-szind róma, amelyre jell emző, hogy nem történik meg a konjugált bilirubin szekréciója az epébe. (Erről részletesebben a 2.6 fejezetben szólunk.) Szintén nagy jelentőségű egy másik ABC fehérje, az ún. CFTR fehérje (cysctic fibrosis transmembrane conductance regulator), ami tulajdonképpen kloridcsatorn a és az intracelluláris ciklikus AMP hatására kinyílva kloridáramlást tesz lehetövé az elektrokémiai grádiens irányában. A transzportert kódoló gén mutációja következtében jön létre a cysticus fibrosis. Jlyenkor a kóros transzporter (az esetek 70%-ában egy fenilalan in-hiány) e l sősorban a légutak és a gastrointestin al is traktus epithelsejtjeiben okoz hiánytüneteke t Ennek az a következmén ye, hogy sűrű nyák halmozódik fel a légutakban, a pancreasveze tékben, ami következményes fertőzéssel, illetve a légutak, a pancreasvezeték elzáródásával és magzati bélelzáródással járhat. Orvosi jelentősége miatt meg kell még említeni azt a transzportert, amely a retinában található (retinális ABC transzporter), és ma még nem tisztázott mechanizmus sal fontos szerepet játszik a fotoreceptoro k homeosztázisában. A retinális ABC transzporterek mutációja felelős számos, nagyon súlyos ö röklődő szembetegség (pl. retinitis pigmentcsa bizonyos formáinak) kialakulásáért.

MEl\fBRÁNTRAN Z PORT -FOL Y A MATOK

:l

>»»»»>mm>>>m>>>»> >>»>»>>»»>>»>m>»>»>>m>»>m»m>>»>>>»»>>>»»>>>»>>m>>>H»>>»>>>»>H»>

Egy legújabban fe lfedezett ABC transzporter (A BCA l) feltehetően a celluláris koleszterin transzportért fe lelős.

4-2. táblázat. Néhány fontosabb lonofór

Az ionofór

A transzportált

jellege

l o_n_ - --1-----

Ioncsatornák

mabil carrier

Nigericin Valinamicin

Monens~

A 23187

mabil carrier

K•

j

Na'IH' _ __ Ca 2~/2H•

mabil carrier mabii carrier

7 tében pl. 2· 10 N a+ls). A folyamat nem telíthető, az ionáramlás az extracelluláris koncentrációval arányos. A csatornák sze lektíven átjárhatá k egy-egy ionra. A specific itást gyakran az ionok mérete és töltése határozza meg. Egyes antibiotikumok, amelyeket ionofóroknak hívunk, ionok átha ladását teszik lehetövé me mbránokon keresztül. Ezek vagy ún. mobil carrierek, a melyek az iont megkötik és a membránban di ffundálva viszik az egyik olda lról a másikra, vagy csatornaképző iono fórok, ame lyek a m embránban csatornát képezve átengednek ionokat a koncentrációgrádiens irányába n. Az ionofórok egy-egy ionra zelektívek. Néhány iono fórt és a transzportáJt ionokat a 4-2. táblá::at mutatja. A mobil carrierek megkötik a szállírandó iont, a mi e lveszti hidráthurkát és pé ldául a K+-ionofór valinomic in esetén egy hidrofób hurokba kerül

4·21. ábra. A feszültségfüggö ioncsatornák (a) és a receptor ioncsatornák (b) modellje

b

l

csatamaképző

Na•, K•, H•

A transzporterektő l e ltérő mechanizmussal mű­ ködnek azok a membránfehérjék, ame lyeken keresztül, mint egy hidro fil csatornán, ionok áthaladása lei1etséges. Az ioncsatornák integráns membránfehérjék, am elyek konformációváltozása nyitja, illetve zárja a csatornát. Attól függően, hogy milyen szign ál nyitja a csatornát, a legtöbb eddig megismert ioncsatorna két csoportra osztható (4-2 1. ábra). A csatornák egy része a mcmbránpotenciál-változásra reagál, ezek a feszültségfüggő csatornák. Ezek el sősorban a neuronok, izomsejtek és egyes szekréciót végző sejtek membránjában találhatók. A feszültségfüggö csatornák közül a Na"' -csatornáról és a Ca 2+csatomáról részletesebben később (441 . oldal és 6. 1 fejezet) lesz szó. A csatornák másik csoportja egyszersmind receptor is, amely a m egfe l e lő agonista hatására válik átjárhatóvá. Ezek a receptor ioncsatornák. Legismertebb ioncsatorna az acetilko lin nikotinreceptora, errő l és más ioncsatornákról szintén másutt lesz részletesebben szó (6. 1 fejezet). A csatornákon ionok kizárólag a koncentrációgrádiensnek megfelelő irányban haladnak át és az ionáramlás rendkívül gyors (a nikotinreceptor ese-

439

ion

l

-~~J mJJ

440

)) )))))) )))) )))))) )))))) )) )))))))))))))) )))) )))))) )))))))))))))))))) )) )) )))) )) ))))))))))))

MEMBRÁNOK - MEMBRÁNTRANSZPORT-FOLYAMATOK

4-22. ábra. Valinomicin-K• komplex. L: laktát; H: D-hidroxi-izovalerát

o

L-valin

N

o-valin ~ 0 N

H K

l

H

H L

o

o~

o

o-valin

(4-22. ábra). A lipidoldékony komplex a membránban diffundálni képes. Egyes ionofór antibiotikumok antiporterként müködnek (A 23187, monensin, nigericin) és H t-t szállítanak valamilyen kationnal ellentétes irányban. A csatornaképző ionofórok nem diffundálnak a membránon keresztül, az ion az ionofór által alkotott póruson halad át. Az ionofórok kis molekulatömegű anyagok, esetleg peptidek (pl. gramicidin) . Hasznos kísérleti eszközök a sejtek ionösszetételének változtatására.

A sejtek Ca 2+ -transzport-rendszerei. Ca 2 + -homeosztázis 2 A Ca ...-transzport-rendszerek azétt érdemelnek külön említést, mert az intrace lluláris Ca2+ reguláló szerepet tölt be al apvető sejtfolyamatokban, mint amilyen pl. az anyagcsere, az izomkontrakció vagy a szekréció. A Ca2+ reguláló szerepét az teszi lehetövé, hogy a sejteket érő szignálok egy része az intracelluláris Ca 2 ~ -koncentrációt változtatja meg,

amit egyébként számos, a plazmamembránban és az intracelluláris organellum membránjában található Ca 2 t -transzport-rendszer müködése szabályoz. A sejtekben a nyuga lmi intracelluláris Ca2 ' kencentráció 0, 1 11M körül van, míg az extracelluláris kencentráció mM-os nagyságrendű. Ez a négy nagyságrendnyi koncentrációkülönbség és az intracelluláris - 60 és - 90 mV közötti nyugalmi potenciál nagyon jelentős bajtóerő az extracelluláris Ca2 +-belépés irányába. A plazmamembrán nyugalmi körűlmények között csak nagyon korlátozottan permeábilis a Ca2...-ra, azonban a sejtet érő stirnulusok átmenetileg nagyfokú Ca2+-áthaladást engedhetnek meg a plazmamembránon keresztül, ami megemeli az intracelluláris szabad Ca2- koncentrációt. Ez utóbbi nemcsak az extracelluláris Ca2-+ belépésének, hanem az intracelluláris kompartmentekben jelen lévő Ca2 ' citoplazmába kerülésének is lehet az eredménye. Ehelyütt áttekintjük azokat a folyamatokat, amelyek a nyugalmi intracelluláris Ca2+-koncentráció fenntartásában és az átmeneti intracelluláris Ca 2 ~ -koncent-

MEMBRÁNTRAN SZPORT-FOLY A MA TOK

))))))))))))))))))))))))))))) )))))))) ))))))))))))))))) ))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))>)))))))))))))))))) )))))))))))

ráció emelkedésében szerepet játszanak. A Ca 2+ mediátor szerepével az 5. 1 fejezet külön is foglalkozik.

441

- hatása, amelyek a plazmamembránban receptorokhoz kötődnek, s ez - meghatározott receptorok esetében - egy több lépésből álló reakc iósort elind ítva végül is Ca 2+-koncentráció-eme lkedéshcz vezet. Ebben része van az endoplazmás retikulumból felszabaduló, valamint a plazmamembránon keresztül a sej tbe áramló Ca2+-nak egyaránt. Van néhány olyan receptor is, ame ly önmaga ioncsatorna és a receptor- agonista kölcsönha tás eredményeké ppen nyílik (4-23. ábra) . A receptorokho z kapcsolódó Ca2+-szignált a későb­ biekben (5. 1 fejezet) részletesen isme1tetjük. A feszültségfüggő Ca 2+-csatornák. A depo larizációra aktiválódó, Ca 2+-ra permeábilis csatornák az excitábilis sejtek membránjába n talá lhatók és az ál tal uk létrehozott Ca2+ -szigná l fontos szerepe t játszik a neurotranszmitterek felszabadulás ában, a simaizom-kont rak cióban és számos hormon szekréciójában. Ez a csatorna a támadáspontj a sok fontos, a terápiában használatos gyógyszernek is. A Ca21 c atornák heterogén fe hérjepopulációt j e lentenek, ame lyek e ltérő összetételben találhatók a különböző szövetekben. A csatornák biofizika i és farmako lógia i tulajdonsága alapján jelenleg négyféle, jól ka rakterizált Ca2.. -csatornát lehet elkülöníteníte ni

Az intracelluláris Ca 2•-koncentrác ió emelkedését ki.váltó szignálok és mechanizmusok

A sejtek Ca2+-homeosztá zisának fenntartásába n számos membrán (plazm amembrá n, az endoplazmás és szarkoplazmá s retikulum membránja, a mitokondrium be lső membránja) és kompartment (extracelluláris és intracelluláris tér, endoplazmás retikulum és mitoko ndrium) vesz részt. Azok a fiziológiás j elenségek, amelyek a citoplazma szabad Ca2...-koocentrációj ának az emelkedését okozzák vagy a plazmamemb rán vagy/és az endoplazmás retikulum membránjána k Ca2+-transzportját változtatják meg. Kétfé le fiziológiás szignál hatá ának közvetítésében van központi szerepe a Ca2+nak. Az egyik az e lektromos szigná l, amikor a sej tek nyugal mi potenciálja csökken, ami kinyitja a plazmamembrá n feszültségre érzékeny Ca 2 1-csatornáit, s ezen keresztül az e lektroké mia i grádiensnek megfelelően átmeneti Ca2.. -belépés jön létre. A másik az extracelluláris kémiai anyagok - hormonok, neurotranszm itterek és modulátorok

(4-3. táblázat) . A T csatornák - szemben a má ik hárommal - kis küszöbpotenc iálná l aktiválódnak. Gyors inaktivá-

ca2 + receptorcsatorna DEPOLARIZÁCIÓ l=-

feszültségfüggö Ca2 +-csatornák

HORMONOK NEUROTRAN SZMITTEREK J MODULATOROK j

+

+

ca2_+_ _-=:::--+

receptorok

Ca2 +-csatornák

ca2 + 4·23. ábra. A citoplazma Ca2•-koncentrácíój át növelő fiziológiás körűlmények. Az ábra vázlatos összefoglalás, a G fehér· jék-foszfolipáz C- IP3 (inozitol 1,4,5-triszfoszfát) rendszert az 5. fejezetben részletesen tárgyaljuk

ME lBRÁN OK - M E 1BRÁNTRANSZPORT-FOLYA 1AT OK

>m>>>>n»>>>>mnm>>>mm»m>m>>>»>>>>m» >>>> >>>m >»>>>>l>>>>>m>>>m>>

442

feszültségfüggő Ca2• -csatornák néhány biofizikai és farmakológiai sajátossága ~

4-3. táblázat. A és lokalizációja

__._j

___

es_d_e-~-o-la--r-i~zá-~:_k--i_c-s~i~-T

___

Aktiváláshoz szüks_é_g...

l

nagy

-'

L

l nagy

N

l

nagy- - P-

ció mértéke ----l

Inaktiválás

gyors

nagyon lassú

lassú

alig

Kadmiumgátlás

rezisztens

szenzitív

szenzitiv

szenzitív

Gátolható

amilorid

dihidropiridin

(1)-COnotoxin

Lokalizáció

endokrin sejtek

endokrin sejtek

neuronok

szívizom

szívizom simaizom

endokrin sejtek

--

L

simaizom neuronok

l

----;

<1)-agatoxin Purkinje-sejtek és egyéb központi idegrendszeri neuronok

hará ntcsfkolt izom

l neuronok

lódásuk miatt kapták a nevüket (transient). Az L csatornák lassan inaktiválódnak (long-lasting) és jellemzöjük, hogy az l ,4-dihidropiridin (DHP) származékai - amelyek antiaritrniás és vérnyomáscsökkentő gyógyszerek is - a csatornát gátolj ák. Az N csatornák (neither T nor L, sem T sem L ) a tengeri c igából (Conus geographus) tisztíto tt ro-conotox innal, míg a P csatornák, amelyeket lege l ő zör a Purkinje-sejtekben találta k meg, egy pókból (Agelenopsis a perta) elöállított tox innal, az ro-agatoxin-IVA-val gátolhatók.

A legtöbbet az L csatornákró l tudunk, amelyek nagy mennyiségben találhatók a szívizomban és a harántcsíkolt izmokban, ahonnan el őszö r sikerült tisztán Jányemi. A fehérje négy al egységből áll (a~, a 2/8, ~ és y). Az a 1-alegység (2 10 kDa) amely nagyfokú bomológiát mutat a feszültségfüggö Na+-csatornával - alkotja a csatornát és szolgál a DHP kötőhel yéüL A fehérje szerkezete és elhelyezkedése a membránban nagyon ha onló a Na+-csatornához: négy, közel homológ ismétlődés van a molekulában, amelyek mindegyikc 6 transz-

EXTRACELLULÁRIS r\

r\

r\

+ '· + + l 23456

l

'

·i ',

+ + +

l 23456

+.

( +

';i

+ l 23456

INTRACELLULÁRIS

2 4-24. áb ra. Az L típusú Ca +-csatoma a 1-alegység ének m odellje. DHP, dihidropiridin

+ +. • i

+ l 23 456

MEMBRÁNTRAN ZPORT-FOLYA~1ATOK

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))» ))))))))))))))))))))))))

membrán-szakasszal rendelkezik (4-24. ábra). A feszültségérzékel ő részt va l ószínűl eg a 4. transzmembránrégiók adják, ahol sok a pozitív töltésű aminosav oldallánc. A többi alegység szerkezete és funkciója kevésbé ismert, ezek va l ószínűl eg a csatorna regu lációjában és membránon belüli helyzetének rögzítésében játszanak szerepet. A szív2 izomban az L csatornákon belépő Ca + az elindítója az izomkontrakcióho z vezető folyamatoknak. A harántesikolt izomban ez bonyolultabb; in a kontrakció kiváltája a szarkoplazmás retikulumból felszabaduló Ca2 , azonban a Ca2+-felszabadulást kiváltó depolarizáció "érzékelője" val ószínű leg a transzverzális tubulusokban levő L csatorna. Ez a csatorna, amit DHP-receptomak hívnak szoros morfológiai kapcsolatban van a szarkoplazmás retikulum terminális ciszterná ival, amelyek membránjában egy növényi a lkaloidra, a rianodima érzékeny fehérje talá lható, amely Ca2....-csatorna. A két truktúra nagyon közel van egymáshoz (-12 nm), s a depolarizáció hatására, a DHP-receptor közreműködéséve l jön létre a szarkoplazmás retikulumból a Ca~ ' -felszabadulás a rianodinreceptoron keresztül (4-25. ábra, lásd még 5. 1 fejezetben). A két struktúra közötti kapcsolat létrejöttében fontos szercpet játszik a DHP-receptor Il. és Ill. homológ dornénje közötti c itoplazmában található hurok (lásd 4-24. ábra), amelynek szerkezete a szívizom L csatornákban eltérő. Ez a különbség részben magyarázza a szívizom és harántcsíkolt izom eltérő aktivációs mechanizmusát. 4-25. ábra. Ca2•-felszabadulás a szarkoplazmás retikulumból a harántcsíkolt izomban. A szarkoptazmás retikulum (SR) membránban található rianadinreceptor négy monomerból álló fehérje, amelyek hidrofób része alkotja a membránon belüli struktúrát, hidrofil része pedig a citoplazmában, az ún. "feet" struktúrát. Ez utóbbi kerül kapcsolatba a dihidropiridinre érzékeny L csatomával (DHP-receptor)

T~tubulus

443

Az N csatornák, amelyek a neuronokban és számos endokrin szövetben (pl. pancreas, mellékvesevel ő, hypophysis elül ső lebeny), valamint a P csatornák, amelyek a központi idegrendszeri neuronokban találhatók, a depolarizációra l étrejövő neurotranszmitter fe lszabadulás és hormonszekréciók kiváltásában j átszanak szerepet. Egyes szövetekben a feszültség fúggő Ca2 t -csatornák az a 1- és ~-al egységcn foszforil álódnak, ami a reguláció egyik l eh etősége. Szívizomban az L csatornákat a cAM P fúggő protein-kináz foszforilálj a, s ez a csatornák aktiválásának valószinüségét fokozza. A szimpati kus izgalom ~-recep­ 21 torokon keresztül ily módon fokozza a Ca -belépést, s ezáltal pozitív inotrop hatású. A ~-receptor-stimul ác ió pozitív kronotrop hatást is jelent, amely egy 27 kDa mol ekulatömegű fehérje, a foszfolambán közreműködéséve ljön létre. Ezt a fehérjét protcin-kinázok (cA MP-dependens, 2 24 Ca -kalmodulin-depe ndens és Ca •-fo zfolipiddependens) foszforilálják. A foszforilá lt faszfoIambán aktiválja a szarkoplazmás retikulum Ca2+ -ATPázt, és stimulálja a Ca2+ -felvételt a citoplazmából a szarkoplazmás retikulumba (lásd még 5. l fejezetben). A feszültségfiiggő Ca2+ ~csatornákat meg kell kü~ 21 lönböztetni a plazmamembrán egyéb Ca -csatornái tó l, amelyek vagy receptor ioncsatornák (glutamát-NMDA receptor, P 2 purinerg receptor lásd 6.1 . fejezet) vagy receptorok aktíválását követően másodiagos messengerek hatására nyí lna k. Ezek a feszü ltségre nem vagy csak nagyon kevéssé

eszültsé~~{zékelő

~

1aktin

ll filament

r-Ca2•-csatorna ,

SR KONTRAKCIÓ

444

mmm>>>>»»>>>>»>>>>>>»>>>>»>m>»>»>>»>>>»>>>>»>»»>»»»»>>»>>>»>»»

érzéken yek és - szemben a feszültségfiiggő csatornákkal - nem j ellemző rájuk a nagyfok ú Ca2+-szelektiv itás. Ca2+-fe lszabad ulás az endopla zmás (szarko plazmá s) retikulu mbóL A Ca2 ' mobiliz áló receptorok szignáJ transzdu kc iój áva l külön fej ezet foglalko zik, itt csak a folyama t vázlatos ismertet ésére és az endopla zmás retikulu mból történő Ca2 ' -mobilizálás ismertetésére szorítkozunk. A Ca2 • -homeo sztázis szempo ntjábó.l az endopla zmás retikulu m (ER) a legfonto sabb Ca2+-raktáro zó intracelluláris organc llum, amelybő l a Ca2 + fel szabadítható és ahova a citopJazmából ismét fel vehető. Az ER-ból Ca 2+-ot mobiliz ál nagyszá mú hormon , neurotranszmitte r és modulát or, amelyek receptora i a plazmamembránb an vannak. A receptor és az agonista kötése G-fehérj ék (guanin nukleotido t kö tő fehérjék ; lásd 5.1 fej ezet) közremü ködésév cl aktiválja a fosz folipáz C-t, amely a membrá nban a foszfatid ilinoz ito l-4,5-bis zfoszfátot hasítja és inoz itol-l ,4,5-tris zfoszfát (IP3) keletkezik. Az IP3 az az intracelluláris messeng er, amely nagy affinitás ú kötőh ellye l rendelke zik a ER membrá nján, s a kötés eredmén ye Ca 2+ kiáraml ása az ER-ból a citoplazmába. A folyama t a részletei a 475. oldalon olvasható k. Az izomban az intracelluláris Ca2+-raktár szerepét a szarkoplazmá retikulu m (SR) tölti be, s itt a Ca 2+- mobilizá lásnak más a mechanizmusa és a fizio lógiai szerepe. Harántc síkolt izomban a T tubulusok (a sarcolem ma betürem kedései) depolarizációj a váltj a ki a SR-bó l a Ca2+-fe lszabadu lást s a Ca 2+ a troponin C-hez kötődve elindítja a ke ntrakciót (4-25. ábra). Nem tisztázott az a mechan izmus, ami a T tubuluso kró l a depolari záció hatását közvetíti, de lehetség es, hogy valamily en DHPérzékeny Ca2+-csatornáról van szó. A harántcs íkolt izomban az SR-ból történő Ca 2+-felszab adulásh oz nincs szükség extracelluláris Ca2 +-be lépésre, szemben a szív izomma l, ahol a feszültségfüggő Ca2+-csatorn ákon be l épő Ca2+ indukálj a az SR-bó l a Ca2 +-fe lszabadu lást (Ca2+-fiiggő Ca 2-t -fel szabadulás) és ez a kontrakc ió triggere. Simaizm okban a de polarizáció okozta Ca2+-mobiliz álás me llett, a SR-bó l IP3 is rnobiliz ál CaH -ot plazmamembrán receptoraktiválá s következtében, hará ntcsíkolt izomban ennek a működése kétséges (lásd még 4 78. oldal).

M EMBRÁN OK - M EMBRÁN TRANSZ PORT-FO LYAMATOK

Az intrace lluláris Ca 2• -konce ntráció t csökkentő mecha nizmus ok A fi ziológiá s stimulus ok hatására létrej övő 2 Ca ' -koncen tráció-e melkedé s a citoplazmában átmeneti , miveJ a plazmam embrá nban és az endoplazmás retikulu m membrá njában hatékony tran szportrendszere k működn ek a Ca2+ c itoplazmábó l történő eltávolít ására. Ca2+-A TPáz a plazma membr ánban. A Ca2+ transzpo rtj a a c itoplazmából az extracelluláris térbe az elektrokémia i grádiens ellenébe n aktív transzpo rttal történik (4-26. ábra). A Ca2+-ATPá z minden sejt plazmamembránj ában megtalá lható enzim, amely a P típusú ATPázo k közé sorolható. Ennek m egfe lel ően számos tulajdonsága hasonló a Na' K+-ATPáz -éhoz; átmenetileg egy aszparag insav oldallán con foszforilálódik, két konformációs á llapotba n fordul elő és vanadát taJ gátolható. A pumpa sztöchio metriáj a (Ca2+/ATP) a plazmamembrá nban l. Az enzim fontos tulajdonsága, hogy kalmodu linnal stimulálható (4-26. ábra). A kalmodu lin ta lán a legálta lánosab b, a legtöbb sejtben megta lálható Ca 2 ' -kötő fehérje, amely számos, a Ca2+ által kiváltott sejtvála sz közvetítője. A kalmodulin azonban a Ca 2+-homeo sztázist is befolyásolja azáltal, hogy a Ca 2 ~ -ATPázt, így a Ca2+-kipumpá lást stimulá lja. Az enz im, a C-terrninálishoz közeli szakasz on megköti a kalmodu lint, ez a V maxértéket növeli, a Ca 21 -mal szemben i KM-értéket pedig 20 ~-tM -ról 0,5 11M-ra csökkenti . Ez utóbbi azt j elenti, hogy az enzim már v iszony lag kis [Ca2+]i emelked és rne llett aktiváló dik. Az enzimet aktiválj ák a savanyú foszfolipidek, a protein- kináz A és protein-kináz C-vel történ ő foszforiláció is. A Ca 2+-ATPázna k több izoenzimje ismert, a melyek kül önböző gének és alternatív splicing termékei. Az izoenzim ek alapvető pumpafu nkc iója azonos, azonban regulációjuk - különös en a kalmodu lin iránti érzéken ységük - eltérő lehet. (A hepatoc itákban ta lálható Ca2+-ATPá z izoenzim például ka lmoduli nnal ne m aktiválh ató.) A Ca2+ATPáz egy 138 kDa m o l ekul atömegű fehérje, ame ly l O tran zmembrán a -heli x-szaka szt tartalmaz és mind a foszforiláció, mind a reguláció helyei intracellulári an található k (4-27. ábra). Na+-Ca2+ cseretra nszport . A Ca 2+-ATPá zhoz képest kis affinitású , de nagy kapacitá sú transz-

MEMBRÁNTRAN ZPORT-FOLYA MATOK

>m >»>>> >>»>> >>»>>»m»mHm>>m» >»>>>>>>> >>m»m>»m>»m>>m»>m»m>m>m » >>m>>>m »m>m

445

Na~

--------------~ ~r-------2

./ l Na ' -ca ...--

...

CSERETRANSZPORT I

ca2i

4-26. ábra. Aktív Ca 2•-t ra nszportok a plazm amembránban

portnak tekinthető (4-26. ábra). Optimális aktivírá2 sát pM-os intracelluláris Ca -koncentráció nál éri el, míg a Ca2+-ATPáz már kis [Ca 2...] , változásra reagál. A Ca 2- -ki pumpálás a Na+ elektrokémiai grádiensének terhére történik, amelynek sztöchiometriája az egyes szervekben eltérő, de 2 a+/Ca2+ -nál nagyobb, vagyis a pumpa e lektrogén. Működé e reverzibilis, az extra- és intra2 celluláris Na' - és Ca ' -koncentráció któl ftlggően 21 ellenkező irányban is működhet, amikor Ca belé21 pésreadhatalternatív lehetőséget. A Na...-Ca cseretranszport nincs jelen minden sejtben (hiányzik

2 4-27. ábra. A Ca ··ATPáz modellje a plazmamembrá nban. PKC: protein-kináz C; PKA: protein-kináz A

például a májsejtek membránjábó l), legnagyobb aktivitással a neuronokban és a szívizomban mű­ ködik.

Ca2+-pumpa az endoplazmás retikulumban. A 2 Ca +-ot a citoplazmábó l az ER (és SR) raktáraiba Ca2-+ -ATPáz pumpálja. Az enzim működése sok 2 szempontból hasonlít a plazmamemb rán Ca +A TPázéra, de attól eltérő fehérje, amelyet több különböző gén kódol és számos izofennában fordul el ő. P típusú ATPáz, amely a citoplazmatik us oldalon köti az ATP-t és foszforilálódi k. Sztöchio2 metriája 2Ca .../ATP. Az enzim nagy affinitással

INTRACELLULÁRIS

kalmodulinkötöhely

EXTRACELLU LÁRIS

foszforiláció helye

ATP-kötőhely

PKA

446

)))))) ))))))))>))))))) )) )))))) )) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )) )) ))))))))))))))

köti a Ca 2 ~ -ot, a kül önböző izoenzim ek Kw je O, 1- 1 !JM, ezért nagyon érzékenyen reagál az intracelluláris Ca2 +-koncentráció-változásra. Az enzim jelentőségél nemcsak az adja, hogy a c itoplazma nyuga lmi Ca2+-koncen trációjána k fenntartásába n vesz részt, hanem az is, hogy fe ltölti az ER Ca 2+-raktára it, ahonnan hormono k és neurotranszmit terek mobilizálnak Ca2 +-ot. Ca2+-tran szportok a mitokon drium belső membrá noo keresztül . A sejtmemb ránok Cal+ tra nszportja inak tárgyalás ánál meg kell említeni azokat a rendszere ket, ame lyek a mitokond riumok belső membrán jában találhatók , noha szerepük a sejtek Ca2+-homeosztázisában vitatott. A mitokondrium ok egy uniportere n keresztül veszik fel a citoplazmából a Ca2 ~--t, amelyhez az energiát a protongrádiens szolgáltatja. Intenzív Ca 2 ' -felvéte l a mitokond rium belső membrán ján keresztül csökke nti a protongrádienst és értelem szerűen minden

MEl\-mRÁ NOK - ME IBRÁNTRA NSZPORT- FOLYAMA TOK

olyan körülmény, ami a protongrádienst csökkenti , gátolja a mitokond rium Ca 2 1--felvételét. Az uniporter kis affini tású (K. - l O !JM Ca2+), ezért valószínűleg működés e olyan [Ca2+]i-nél számottevő, ami már a sejt életét veszélyezteti. A mitokond rium bel ső membrán on keresztül Ca2 ' transzportálódhat a c itoplazmá ba Na+-Ca2+ cseretranszporton keresztül , ennek fiziológia i j elentősége nem tisztázott . Bár a mitokond rium Ca 2 ' -transzpo rtjainak szerepe a citoplazm a Ca2+-koncentrációj ának reguláció j ában vitatott, az valószínűnek látszik, hogy a mitokond rium szabad-C a2+-tartalmá t befolyáso lva , szerepet j átszanak néhány Ca2+-szenz itív intrarnitokondriá lis enzim (piruvát-dehidrogen áz-foszfatáz, NAD+-dal működő izocitrát- dehidrogenáz, a-ketoglu tarát-deh idrogenáz ) aktivá lásában, s ezáltal az A TP-terme lés szabályoz ásában.

f A fejezet megírásáv al kapcsolatb an tett javaslatok ért és kritikai észrevétele kért a szerLő köszönetet mond Dr. Csermely Péternek, Dr. König Tamásnak , Dr. Sarkadi Balázsnak és Dr. Tretter Lászlónak .

'

5.

Extracelluláris jelek receptorai és a jelátviteli mech anizm usok

FEJEZET

5.1. Plazmame mbrán-rec eptorok és jelátviteli mechanizm usaik (Adám Veronika és Faragó Anna) A receptor- ligand kölcsönhatás jellemző í A plazmamembrán-receptorok felosztása és tulajdonságai A receptor ioncsatornák Heteratrimer GTP-kötő fehérjék (G-fehérjék) részvétele a receptorhatások közvetítésé ben Prote in-kinázok és foszfoprotein-foszfatázok A cAMP-mediátorrendszer lnozitol-foszfolipid jelátviteli rendszer. A Ca2+ mint intracelluláris mediátor és az inozitol-J ,4,5-triszfoszfát szerepe A guanilát-cikláz és a ciklikus GMP jelentősége a jelátvitelben. A nürogén-m onoxid biológiai szerepe A nitrogén-monoxid keletkezése és jelentősége Tirozin-kináz receptorokkal mí.íködő jelpályák és a protoonkog ének 5.2. Sejtmagre ceptorok (Fésiis László) A zteroid- tiroid- D-vitamin " magrcceptor" család Hormonfüggő magrecepto r család komplexitá sa Az "árva" magreceptorok és a reverz endokrinol ógia kibontakoz ó világa A magreceptorok tágabb értelemzés e Orvosbiológiai jelentőség 5.3. A sejtprolife ráció és a természete s sejthalál biokémiáj a (Fésüs László) A sejtosztódási ciklus biokémiai sajátságai és szabályozá sa Proliferációs szignál útvonalak, a mitogén kaszkád A restrikciós pont szabályozá sa Az M fázis kináz (cdc2, CDK l ) A ciklindependens kinázok szabályozásának főbb elvei A proteolízis jelentősége a sejtciklusban A sejtosztódási ciklus szabályozá sának kapcsolata a tumoros sejtproliferációval Protoonkogének és onkogének Tumorszup presszor gének A természetes sejthalál molekuláris háttere A tennészete s sejthalál formái A sejthalál (apoptózis) elindítása Effektor mechanizm usok Az elhalt sejtek fagocitózis a Az apoptózis gátlása Orvosbioló giai jelentőség

Plazmamembrán-receptorok és jel~tviteli mechanizmusaik

5.1 •

Ádám Veronika és Faragó Anna

A sejt és környezete közötti kölcsönhatásnak feltétele, hogy a sejtek érzékeljék a környezetükbe érkező extracellulári jeleket - kémiai anyagokat - , s továbbítsák a sejthez érkező jelzést azokhoz az intracellu láris mechanizmusokhoz, amelyek a sejt válaszreakcióját kiváltják. A sejtek bonyolult kölcsönhatásban vannak a velük közvetlenül érintkező sejtekkel, de utasítást kapnak neurotranszmitterek formájában a beidegző neuronoktól é hormonok formájában a vérpályán keresztül távolabbi szervektől is. Ezeket, a sejt számára külső jeleket, összefoglalóan extracelluláris jeleknek (szignáloknak), azt a több lépéses folyamatot pedig, amelyben a jelzés a sejt válaszát kiváltja, jelátvitelnek, szignál transzdukciónak nevezzük. Az extracelluláris jelek érzékelő i a receptorok. A receptorok fehéijék, amelyek egy-egy jelként szolgáló anyag felismerésére és megkötésére specializálódtak. A receptorok specificitása azt jelenti, hogy minden egyes extracelluláris jel receptora egyedi, csak az adott jelre jellemző struktúra, amely kisebb, nagyobb vagy igen nagy mértékben különbözik minden más szignál receptorátóL Egy adott hormon vagy neurotranszmitter megkötésére több fajta receptor is rendelkezésre á llhat, azaz valójában több fajta receptor ismert, mint ahány extracelluláris jel létezik. Ennek megfelelően vannak adrenerg, kolinerg, dopaminerg, szteroid, inzulin stb. receptorok, amely elnevezés a receptorról nem árul el mást, csak azt, hogy milyen extracelluláris molekula megkötésérc képes. Amint azt látni fogjuk, a nagyszámú, el térő mole-

kulák felismerésére specializálódott, egyedi szerkezcti sajátcsságú receptorok néhány jól definiálható csoportba sorolhatók.

A receptor-ligand kölcsönhatás jellemzői

Függetlenül a receptorok egyedi ajátos ágától, minden receptor nagy zelektivitással és affinitá sal köti azt az extracelluláris molekulát, amelyre specia lizálódott. Mindazokat az endogén, valamint természetes anyagokat és szintetikus származékokat, amelyek a receptorhoz kötődnek, ligandoknak nevezzük. Azok az anyagok, amelyek a receptort aktiválják az agonisták, azok pedig, amelyek a receptort gátolják az antagonisták. A receptor és a ligand közötti kötés (asszociáció) a receptor- ligand komplex (RL) létrejöttét eredményezi és ez leírható az alábbi összefüggésscl:

ahol R a szabad receptor, L a zabad ligand, k, az asszociáció és k2 a disszociáció sebes égi konstansa. A receptor- ligand komplex koncentrációjának időegység alatti változását az RL komplex keletkezésének és disszociációjának eredője adja:

d[RL] dt

- - = k 1 • [R] · [L] -

k, · [R L] -

450

EXTRACELL ULÁRIS JELEK RECEPTORAl ÉS A JELÁTVlTELl MECHANIZMUSOK

>»»>m»m>m>m>>>m>»>>>»>>>>>>>>

Egyensúlyi helyzetben (equilibrium); amikor d[RL] dt

=o

a keletkezés és a visszaalakulás sebessége azonos: k 1 • [R] · [L]

= k2

•

[RL]

azaz: kl

-

k2

·[R] · [L]

= [RL]

Az asszociációs egyensúlyi konstans (Ka) az asszociáció és a disszociáció sebességi konstansának a hányadosa: [RL]

(l)

[R] · [L]

A receptor- l igand kötés disszociációs konstansa (~) az asszociációs konstans reciprokával azonos, azaz: [R] .

[L] [RL]

(2)

0,40

Kisérleti körülmények között radioaktív jelzett liganddal megmérhető, hogy különböző ligandkoncentrációknál mennyi a keletkezőRL komplex mennyisége. Az 5-J. ábra mutatja, hogy az összefüggést telitési görbe írja le. A receptor- ligand kötéshez olyan membránpreparátumokat használnak, amelyek nagyszámú receptorfehérjét tartalmaznak. A ligand azonban nemcsak a receptorhoz kötődbet, hanem aspecifikusan más fehérjékhez vagy membránlipidekhez is. Ezt oly módon veszik figyelembe, hogy megmérik a radioaktív ligand kötődését akkor is, amikor nem jelzett ligand nagy feleslegben ( l 00- 1000-szer nagyobb koncentrációban) van jelen, ami a speciftkus kötőhelyekről leszorítja a jelzett ligandot, de az aspecifikus kötő­ helyről nem (mert az aspecifikus kötőhelyek száma igen nagy). A kötött radioaktív ligand teljes mennyiségéből az aspecifikusan kötött ligand mennyiségének levonásával kiszámítható a speciftkus, receptor- ligand kölcsönhatást jelző ligandkötés. A specifikus kötés görbéjéből bizonyos feltételek mellett hozzávetőlegesen megbecsü lhető a Kd értéke: az a szabadligand-koncentráció, amelynél a specifikus kötőhelyek 50%-a ligandot köt (5-l. ábra). A Kd pontosabb meghatározása Seatchardanalízissel történhet. Ehhez számításba kell venni, hogy egyensúlyi helyzetben az összes receptor kötőhelyek száma (R1) egyenlő a liganddal kötésben levő (RL) és a szabadon lévő (R) kötőhelyek szárnával: R1= RL + R R = R 1 - RL

á)

~x o 30 l

e.-o

specifikus

ffi 0,20

Ha figye lembe vesszük a kötésben lévő és a szabadon maradt receptor kötőhelyek számát az (l) egyenlet felírásáboz:

.!2'

K

l:

:O

:Ö ~

o' 10

a

-

o'00 .....p
0,10

0,20

0,30

0,40

szabad ligand (M x 1o-8 )

[RL] [L]

[~~] =K . ([RJ -

0,50

[RL])

(3)

=

:d

([R 1 ]

-

[RL])

átrendezve: [RL]

5-1 . ábra. A receptor- ligand kötés telítésí görbéje

=

[L]

=

(4)

L

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOR O K ÉS J ELÁTVITELJ MEC HANIZM SOK

ábrázolják a kötöttligand-k oncent([RL]) [L]

ráció fiiggvényében. (A kötött ligand koncentrációja azonos a kötésben lévő receptor koncentráA Kl értéke az egyenes meredekséciójával géböl számítható. A görbe metszéspontja az abszcisszán az összes kötőhelyek számát (R1) jelöli Ki (5-2a ábra). A Seatchard-gö rbe egy komponen-

[RL]).

a 0,60 "O lll J:l lll

0,50

Kd =2,6x1o-9 M

~ =2,2x1o-10 M

C'! 0,40

'il :Q

~

0,20 0,01

0,05

0,25

0,20 O, 15 kötött (M x 1o-9 )

0,1O

45 1

sü, ha a ligand egyfajta kötőhelyhez kapcsolódik (5-2a ábra). Több fajta kötőhely esetén a Sebatchard-g örbe több komponensü, amikor a számítás egy kicsit bonyolultabb. A görbe meredek szára megtörik és egy másik szakasz különíthetö e l, amely a kis affinitású (nagyobb d isszociációs konstansú) kötőhelyeket jelzi. A meredek szakasz meghosszabb ítása kijelöl az abszcisszán egy R,-értéket, amely azonban pontatlan, mert ez a görbe a nagy affínitású kötőhelyek mellett a kis affinitású kötőhelyeket is reprezentálja. A nagy affinitású kötőhelyek Kl-értékének pontos meghatározása a kis affinitású kötés értékeinek levonása után lehetséges, mert ez jelöli ki a specifikus, nagy aftinitású kötés görbéjét (5-2b ábra). A Seatchard-ábrázolás a Kd és a nagy affinitású kötőhelyek számának meghatározás a mellett ily módon lehetőséget ad annak eldöntésére is, hogy az adott ligand a receptcron hányféle kötőhe lyhez kapcsolódhat A receptorok endogén (a saját szervezetben termelődő) ligandjuk iránti nagy affinitását jelzi, 11 9 hogy a Kl a legtöbb receptor esetében 10' - 10M. A receptor endogén ligandjával kialakuló komplexe a receptor aktíválását okozza. Az a molekulán belüli zerkezetválto zás, amely a receptor aktiválás mechanizmus át jelenti, még nem tisztázott, sokkal inkább ismertek az aktíválást követő molekuláris következmények.

A Seatchard-görbe meghatározás ához a kötött ligand és szabad ligand koncentrációj ának hányadosát

))))))))))))}))>))))))))))))) })1)))))))))))>1)))))))))))) )))

b

0,06 Kd =1•7x1o-9 M

0,05

11

R =9x1ot

A plazmamembrán-receptorok felosztása és tulajdonságai

M

"O

2lll

0,04

N lll

'il '9 0,02 :o ,:,(. 0,01 0,00-+--..l..-.---~_:.,_-~--.---,--~

0,01

0,10

0,20 0,30 0,40 kötött (M x 1o-9 )

0,50 0,60

l

5-2. ábra. Egy (a) és két (b) komponens ü Scatchard görbe.

10 9 Szaggatott vonal: Kd=2, 6·10· M; R 1=2, 2· 1G. M - kis affinitású kötőhelyek korrekciója nélkül

A receptorok lokalizációja alapján elkü lönítjük a plazmamemb ránban és az intracelluláris an található receptorok két csoportját, amelyeket külön alfejezetekben tárgyalunk. A plazma membrá n-receptorok közös jellemzője, hogy integráns membránfehé rjék, általában glikoproteine k, amelyek egy vagy több transzmembránszak asszal rendelkeznek. A receptort egy (monomer) vagy több (polimer) - azonos vagy különböző - alegység a lkothatja. A plazmamembrán-receptoro k a receptor fehérjeszerkezete és a szigná l transzdukciós mechanizmus ok alapján néhány csoportba sorolhatók. A legjobban ismert receptorcsopo rtokat az 5-3. ábra mutatja.

452

>>»»>>~>•>>Hn>»»»»l»>»»»>>>»>••

EXTRACELLULÁ RIS J ELE K RECEPTORAl ÉS A JELÁTV ITELJ M ECHANIZMUSOK

RECEPTOROK

INTRACELLULÁRIS

PLAZMAMEMBRÁN

l IONCSATORNÁK

HÉTTRANSZMEMBRÁN DOMÉNNEL RENDELKEZŐ G-FEHÉRJÉKHEZ KAPCSOLÓDÓK

EGY TRANSZMEMBRÁN DOMÉNNEL RENDELKEZÖK

TIROZIN-KINÁZ AKTIVITÁSSAL RENDELKEZÖK VAGYAHHOZ CSATLAKOZÓK

acetilkolin-nikotin glutaminsav-NM DA GABA A glicin

adrenerg a, p acetilkolinmuszkarin neuropeptidek glukagon ACTH angiotenzin (AT1) biogén aminok trombin

inzulin EGF PDGF

GUANIL-CIKLÁZ AKTIVITÁSSAL RENDELKEZÖK

pítvari nátriumüritő faktor

szteroidhormonok pajzsmirigyhormon

5-3. ábra. Az extracelluláris szignál receptorok felosztása. A vonal alatt néhány példa látható az egyes csoportba tartozó receptorokról

O Receptor ioncsatornák. A receptort alkotó al-

egységek több transzmembránszakasszal rendelkeznek és a membránban egy pórus vagy csatoma körül rendeződnek, amely a receptor- ligand kötés hatására átjárhatóvá válik. A csatornák anionok vagy kationok számára permeábilisak, az extracelluláris jeleket ezen receptorokon keresztül ionok közvetítik a sejt belsö környezetéhez. Ilyen pl. az aceti lkolin nikotinreceptora, a glutaminsav NMDA-receptora, a GABAA-receptor és a glici n receptora, ame lyekről részletesebben i szólunk. 6 A receptorok egy csoportja hét transzmembrándoménnel rendel kező, egymásra nagymértékben hasonló fe hérjékbő l áll. Ezek rő l a receptorokról a jelzést beterotrimer GT P-kötő fehérj ék közvetítik a sejt számára. A receptorokat aktiváló Iigandok eltérö szerkezetű moleku-

lák, köztük kis mo l eku l atömegű biogén aminok (adrenali n, noradrenalin, dopam in, szerotonin) és peptidek (glukagon, P-anyag, bradikinin, luteinizáló hormon) egyaránt vannak. A receptor-agonista kötés eredménye a receptorszerkezet változása, amelynek hatására a receptor kölcsönhatásba lép az ún . heteretrimer guaninnukleotid-kötő fehérjékkel (részleteket lásd alább), amelyek aktiválódnak. Az aktivált heterotrimer G-fehérje disszociál és bizonyos alegysége kapcsolódik egy effektor molekulához, általában egy enzimhez, amelynek az a funkciója, hogy egy vagy többféle ún. másodiagos messenger (intracelluláris mediátor) molekulát szintetizál. A G-fehérjékkel történő kölcsönhatás következtében az enzimek általában aktiválódnak, de elő fordu l, hogy gátlás jön létre. A legáltalánosabban ismert effektor enzimek az

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOROK ÉS JELÁTVITELJ MECHANIZMU OK

adenilát-cikláz és a foszfolipáz C, illetve a retinapálcikákban egy ciklikus GMP-foszfodiészteráz. Kapcsolódhat a G-fehérje ioncsatornákhoz is, mint pl. bizonyos Ca2+-csatornák vagy a K+-csatorna, amelynek következtében a csatornák aktiválódnak vagy gátlódnak (5-4. ábra). Ezeknek a folyamatoknak a részleteiről és funkcionális jelentőségükről a későbbiekben részletesen is szó lesz. Molekuláris biológiai módszerekkel nagyobb számú receptort azonosítottak, amelyek G-febérjékhez kapcsolódnak, mint ahányhoz - jelen ismereteink szerint - biológiai funkció rendelhető. Közös jellemzője a receptoroknak, hogy hét hidrofób, 20- 25 am inosavból álló, tran zmembránszakasszal rendelkeznek, amelyeket extracelluláris és intracelluláris hurkok kötnek össze. Az egyes receptorok között mind a hidrofób, mind a hidrofil régiókban nagyfokú szekvenciahomológia áll fenn. A z 5-5. ábra az adrenerg P-receptor szerkezetét mutatja, amelynek megismerése nagyban járult hozzá a G- fehérjéhez kapcsolódó receptorok általános sajátosságainak tisztázásához. Az agenisták és a receptorok közötti kötés létrejöttében fontos szerepet játszik a 3. transzmembrándomén. A biogén aminok esetében az aminocsoport, az e régióban található aszparaginsavval lép kölcsönhatásra. Az agonista kötő-

5-4. ábra. A G-fehérjéhez kapcsolódó receptorok hatásának általános sémája

))))))))))))))))))))))))))))))))).))))))))))))))))))))))))))

453

hely kialakításában részt vesz az 5. és 6. transzmembránrégió is. A G-fehérjékkel a receptor a citoplazmatikus oldalon létesít kapcsolatot, a kölcsönhatás kialakításában a transz-membránszakaszok citoplazmatikus o ldala és az intracelluláris hurkok transzmembránrégióhoz közeli része vesz részt. Az agonista kötődése a receptoron olyan konformációváltozást idéz elő , ami az intracelluláris G-fehérje kötőhelyet amely a receptor ún. nyugalmi állapotában rejtve van - hozzáférhetővé teszi, és létrejöhet a kölcsönhatás a G-fehérjével. A G-fehérje a receptort is befolyásolja, ami a kölcsönhatást követően egy ideig ún. kis affinitású állapotban marad. Mutációs vizsgálatok igazolták, hogy a receptor affinitásának á llapotát a ham1adik intracelluláris hurok határozza meg. A hét transzmembrán szakasszal rendelkező receptorok ligand hatására bekövetkező aktívációja ettő l eltérő mechanizmussal is történhet. A változatos receptoraktiváción belül is külön említést érdemelnek sajátos működésük miatt a proteázok, pl. a trombin receptora (PAR; proteázaktivált r eceptoroknak nevezik őket). A proteázaktivitással rendelkező Iigandok a receptor extracelluláris N-terminális végéről egy rövid (néhány tíz aminosavból álló) peptidszakaszt lehasítanak. Az új N-terminális "rejtett"

Ca2+-csatorna

vagy K+-csatorna

[ca2+]t hiperpolarizáció

fehérjefoszforiláció

454

))))ll))))))>))))))))))))))))))))))))) ))))))

EXTRACELLULÁRIS JELEK RECEPTORAl ÉS A JELÁTVITELIMECH ANIZMUSOK

glikozilálás helyei

EXTRACELLULÁRIS

membrán

' COOH INTRACELLULÁRIS

5·5. ábra. A P-adrenerg receptor szerkezetének vázlata. A ligandkötésben részt nem vevő aminosavakat négyszögekkeljelöltük

ligandként aktiválja a receptor többi részét az extracelluláris hurkokhoz kapcsolódva, míg a felszabadu ló eredeti N-terminális önálló aktivitás a l rendelkezik, pl. trombocitaaggreg ációt tud okozni. A fentiekben ismertetett alapséma rendkívül nagyszámú és változékony sejtfunkció-változásnak lehet a hátterében. A válto7ékonyságot az bi7tosítja, hogy a jelátviteli rendszer

minden eleme, a receptorok, a G-fehéljék és az effektorok egyaránt nagyfokú heterogenitá t mutatnak. Egy adott extracelluláris szignál érzékelésérc a szervezetben többféle receptor létezhet és u&ryanazon receptor, esetleg egy adott ejten belül is, egyszerre többféle szignál transzdukciós mechanizmust müködtethet. További heterogenitás! okozhat az, hogy ugyanazon G-fehérje többféle effektorhoz kapcsolódhat Jó példa a heterogenitásra, hogy a szervezetben a szimpatikus hormon (adrenalin) é neurotranszmitter (noradrenalin) megkötésére eltérő struktúrájú és farmakológiai sajá-

PLAZMAME MBRÁN-RECEPTOROK É JELÁT I TELI MECHANIZMUSOK

tosságú receptorok talál hatók (o." o.2 , ~ 1 -~ 4), amelyek különbözö G-fehétjékhez kapcsolódnak, az o.2-reccptorok adott sejten belül esetleg többféle G-fehérjéhez is. A ~-rccepto­ rokho7 kapcsolódó G.-fehérje pedig a membránban többféle etTektorral is köl csönhatásra léphet. Ez a heterogenitás sokféle, az egyes szervckre, sejtekre speciftkus válaszreakciók kialakulását eredményezi. (Előfordul, hogy az irodalomban egyesG-fehérjével müködő receptorokat metabotrop receptornak hívnak, megkülönböztetendő az ionotrop - ioncsatorna - receptoroktól.) t)

A receptorok harmadik csoportjának szerkezetére je ll emző, hogy a receptorfehérje minimálisan érintkezik a lipidmembránnal. A receptorokat egy vagy több a legység alkotja, de a legységenként legfeljebb egy transzmembránrégióval rendelkeznek. (Ismert olyan receptor is ebben a csoportban, amelyet g likoz il-foszfatidilinozitol horgonyoz a membránhoz.) A re ceptor aktiválása nyomán - az eltérő azonnali hatások mellett - hosszú távú, a sej tmagból kiinduló sejtvá laszok is létrejönnek. Az ide tartozó receptorok között sok olyan van, amelynek ligandkötö alegysége protein-tiroz in-kináz aktivitással rendelkezik. Ide tartoznak pl. az inzu lin, a növekedési faktorok és neurotrof hormonok receptorai. A receptorszerkezet szempontjából ide tartoz ik a guani lát-c ikláz aktivitású pitvari nátriumürítő peptidreceptor is.

A legtöbb receptor működésekor a stimulációt követően olyan fázis következik, amikor egy ideig a stimulus folyamatos megléte ellenére a biológiai válasz hatékonysága csökken, a receptorok ún. deszenzitizációja alakul ki . Az "érzéketlenség" akut komponense, ami perceken (esetleg másodperceken) belü l kialakul reverzíbilis és megszűn i k a deszenzitizáló stimulus megszűn téve l. Lassabban, órákon belül alakul ki az ún. down-reguláció, amikor a receptorok száma csökken. Ezek a jelenségek nagymértékben befolyásolják a terápiásan alkalmazott receptor Iigandok (pl. !3-adrenerg agonisták) hatékonyságát és az alkalmazhatóság időtartamát.

A folyamatok pontos molckuláris mechanizmusa még nem i mert, de az biztosnak látszik, hogy mind a deszenzitizáció, mind a down-reguláció kialakulásában fellétjék foszforilációja fontos szercpet játszik. A ~radrenerg receptor amelynek aktiválása cAM P szint eme lkedést és proteinkináz A ak tíválást okoz - szubsztrátja is a protcin-kináz A-nak. A receptor foszforilációja a receptor és a G-fehérje

>»>>> » >•>H>»>>>u>n >H>>>>>»>>>>>>>>>>n >U>>>>>>>>> >>

455

szétkapcsolását, s így a receptorstimuláció hatásának csökkenését okozza, ami egy akut, negatív feedback regulációnak tekinthető . Természetesen, a cAMP-szint emelkedése és a !3-receptor foszforilációja létrejöhet minden olyan stimulus hatására, amely az adott sejtben a cAMP-szintet emeli. A deszcnzitizációnak azt a fonnáját, amely egy receptoron más receptorok aktiválásának hatására alakul ki heterológ deszenzitizációnak hívjuk, szemben a saját receptor i7galom következtében kialakuló homo lóg dcszenzitizációval. A receptorok foszforilációjában a protein-kináz A me ll ett a protein kináz C és egy kü lö n kináz család, a G-fchérjéhez kapcsolódó receptor-kinázok (GRK) is részt vesznek. Ezek is szerin- vagy treonincsoportokat foszforilálnak az aktivált receptor karboxí-terminális régiójában (5-6. ábra).

5-6. ábra. A fh-receptor foszforilációja (deszenzit izációja). Gs, adenilát-ciklázt stimuláló G fehérje; AC, adenilát-cikláz; GRK, G-fehérjéhez kapcsolt receptor-kinázok

A receptorszám-csökkenés lassúbb fo lyamat, amiben szerepe lehet a receptorok meg növekedett proteolitikus lebornlá ának és csökkent receptorszintézisnek egyaránt. A cAMP-függö protein-kináz - legalábbis bizonyos receptorok esetében ebben is fontos szerepet j átszik, mivel a receptor foszforilációja elősegíti a receptor internalizációj át (melynek során a receptor a c itoplazmába kerül).

A receptor ioncsatornák A receptor ioncsatornák néhány a legységből álló integráns membránfehérjék, amelyben az alegységek ionpermeábilis csatornát hoz nak létre. Ezek a

456

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

EXTRACELL ULÁRI S J ELEK RECEPTORAI ÉS A J ELÁTVIT EU MECHANIZM SOK

5-1. ábra. A receptor ioncsatornák lokalizációja és a kiváltott sejtválasz

epolarizáció

l fehérjék neurotranszmitterek receptorai és fontos szerepet játszanak számos neurotranszmitter hatásának közvetítésében. Megta lálhatók neuronok mcmbránjában, s így az ideg-idegi kommunikációban vesznek részt, de jelen vannak a szervckbcn is, ahol a beidegzö neuronokból felszabaduló transzmitterek hatását közvetítik Attól függően , hogy a receptor aktiválása milyen ion áthaladását teszi lehetövé, depo larizációt, azaz stimulációt, vagy ell enkező l eg, gátlást okozhatnak. Azok a csatorná k, amelyek átmenetileg Na+-t engednek át az elektrokémiai grádiens irányába, a sejteket depolarizálják, amelyek Cl -ra permeábi lisak, a depolarizáció gáttását hozzák létre (5-7. ábra). Mind a sti-

mu láció, mind a gátlás gyors; szemben a G-fehérj ével. működő receptorokkal, amelyek hatása másodperceket vesz igénybe, a receptor ioncsatornák hatására a membránpotenciál-változás rnsokon belül létrej ön. A nyitott csatornákon keresztül az ionáthaladás I 07 ionfs sebességet is elérhet, ami magyarázza a gyors és hatékony receptorm űködést. Ide tartozik az acetilkolin nikotinreceptora, a y-aminovajsav (GABA) A tipusú receptora, a glicin, a g lutam insav NMDA (N-metil-D-aszpartát), a szerotonin 5-HT3 receptora és a P2 purinerg receptoro k egy csoportja. Az 5-1. táblázat a receptor ioncsatornák néhány fontos tulajdonságát foglalja össze.

5-1. táblázat. A legfontosabb receptor ioncsatornák tulajdonságai

-

Receptor

.,.-

-

Ionszelektivitás

-

.

--

l

--

Agonista

Antagonista

---

nikotin

Na·>~>Ca2...

acetilkolin, nikotin

d-tubokurarin

GABAA

cr. Hco3·

GABA

bicucullin

glicin

cr. Hco3·

NMDA

... Na, K+ , Ca2+

-

nem NMDA

--

l glicin . . glutaminsav.ghcm, N. metll. D. aszpartát

-D-(-)2-ammo-5.fosztono-valerát

AMPA, kainál

6-eiano-7-nitro- kvinoxalin-2,3-dione

-

- - - - - - --·

szerotonin

p2X

!

sztrichnin

ATP

szuramin

i

-------l

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOROK ÉS J EL ÁTVITELl MECHANIZMUSOK

Előfordul , hogy az egyes receptorokon belül az alcsoportok megkülönböztetése valamjlyen szintetikus vagy természetes (de nem endogén) agonista iránti szelektivitás alapján történik. Ilyen pl. a g lutaminsav NMDA, az acetilkolin muszkarin- vagy nikotinreceptora, amelyekről később még szó lesz.

Jelen felosztásban az extracelluláris Iigandok receptorait tárgyalj uk, de meg ke ll említeni, hogy receptor ioncsatornának tekinthetők azok a csatornák is, amelyeken intracelluláris mediátorok kötődnek és okoznak ionpermeabilitás növekedést. Uyen pl. az inozitol- l ,4,5-triszfoszfát (IP3) receptora az endoplazmás retikulumban vagy a szarkoplazmás retikulumban a Ca2+ által indukált Ca2+-felszabadulást közvetítő receptor. Ezekről más helyen szólunk (475. oldal). Az ioncsatornák közül legtöbbet az acetilkolin nikotinreceptoráról tudunk, amelyet elsőként sikerült megtisztítani, a molekuláris biológia mé dszereivel vizsgálni és működéséről modellt felállítani. Későbbi vizsgálatok igazolták, hogy a többi receptor ioncsatorna szerkezete a nikotinreceptoréhoz nagyon hasonló. A nikotinreceptornak lokalizációja és szerkezete alapján két altípusa különíthető el, az izom és a neuron típusú receptor. A harántcsíkolt izomban a receptor egy 280 kDa molekulatömegű, öt a l egységből á lló fehérje (pentamer), amelyben az egyik a legység két példányban található (a2 pyo). (A neuronális nikotinreceptor ettől eltérő szerkezetű, a- és P-alegységekből áll.) Az alegységek egy csatorna köré rendeződnek, amely a receptor nyugalmi helyzetében nem átjárható. Az alegységek mindegyike 4 transzmembránszakasszal rendelkezik (5-8. ábra). Ez a membránon belüli orientáció jellemző a többi receptor ioncsatorna alegységeire is. Az acetilkolin kötőhelyek, minden receproron kettő, az a - y és az a.-<> alegységek egymással érintkező felszínén találhatók. Ide kötődnek a többi agenisták és a kompetitív antagonisták egyaránt. A szignál transzdukciókban részt vevő receptorok (és G-fehérjék) kü lönleges tulajdonsága, hogy gyakran nagy affinitással kötnek tennészctben előforduló toxinokat A nikotinreceptor a kígyó egyik toxinját az a-bungarotoxint köti, s ezt jól ki lehetett használni a receptor tisztításában.

Minden, a nikotinreceptorhoz specifikusan kötő­ dö ligand pozitív töltésű kvatemer ammóniumcsoportot ta1talmaz. A receptor- ligand kötés kialakí-

457

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

l

a alegységek

b alegységek transzmembrán-régiói +

NH3

cooextracelluláris

intracelluláris

c

acetilkolin-kötőhelyek

felülnézeti képe acetilkolin-kötőhely

l 1----1

0,65 nm

5-8. ábra. Acetilkolin nikotinreceptor-szerkezetének vázlata. (a) A/egységek, (b) az a/egységek transzmembránrégiói, (c) az acetilkolin kötőhelyek felülnézeti képe

tásában tirozin és triptofán, valam int aszparaginsav és glutaminsav oldalláncokjátszanak szerepet. A z acetilkolin kötődése megváltoztatja a kötőhely szerkezetét és ez az a legységek elmozdulását okozva kinyitja a csatoma "kapuját", ami a receptor citoplazmatikus részén található. A csatorna alkotásában az alegységek M 2 transzrnembránszakasza vesz részt. Nyitott állapotban a kationckra permeábilis csatoma átmérője 0,65 nm, s ez meghatározza, hogy melyek azok a kationok, amelyek a csatornán áthaladhatnak A nikotinreceptort nem szelektív kationcsatornának lehet tekinteni,

458

» ....))))))»» »>))) ))))))))))))))))))))))

EXTRACELLULÁ RI J ELEK RECEPTORA l ÉS A JELÁTV ITELl MECHANIZMUSOK

amelyen keresztül Na+, K+ és Ca2 + áthaladása történik az elektrokémiai grádiens irányába. Az izom és a neuronális nikotinreceptor permeabi litása nem teljesen azonos; a neuronális receptor Ca 2+-permeab ilitása lényegesen nagyobb. A receptor legfon tosabb gátlója az izomrelaxáns hatású d-tubokurarin. A központi idegrendszer legfőbb gátló transzmittere a GABA, míg az agytörzsben és a gerincvel őben a glicin. Mind a GABAA-, mind a glicinreceptor anioncsatoma, amely nyitott állapotban cr és HC03- áthaladásátteszi lehetövé. Bár az ionpermeabilitás más, a csatornák szerkezete sok hason lóságot mutat a nikotinreceptorraL Mindkét receptort öt alegység alkotja (GABAA- receptor alegységek számos izoformája létezik). Az alegységek között nagyfokú a szekvenciahomológia, itt is minden alegység négy transzmembránszakaszt tartalmaz, és sok a hasonlóság az extracelluláris transzmitter kötőhelyek harmadlagos szerkezetében. Szemben azonban a nikotinrecepton·al, amely az M 2 régióban és intracellulárisan inkább negatív töltéseket tartalmaz, a gátló neurotranszmitter receptorok ezen régióiban nagymértékű pozitív töltés túlsúly található (5-9. ábra) .

Külön említést érdemelnek az L-glutaminsav neurotranszmitter receptorai, mivel a glutaminsav a legfontosabb excitátoros neurotranszmitter a központi idegrendszerben. Több fajta receptora ismert, melyek közül néhány a receptor ioncsatornák családjába tartozik. Szelektív agen isták és antagon isták alapján az ún. ionotrop glutaminsav receptorokon belül elkü l öníthető az NMDA (N-metil-0-aszpartát), az AMPA- (a-amino-3-bidroxi-5-metil-4-izoxazol-propionsav) és a kainát(hatékony neurotoxi n) receptor. Legtöbbet vizsgált és legjobban ismert az NMDA-receptor, amelynek szerepet tulajdonítanak a neuronális plaszticitás - a tanulás és emlékezés - fo lyamataiban és a glutaminsav neurotoxikus hatásának közvetítésében. Az NMDA-receptor, ha onlóan a többi receptor ioncsatomához, al egységekből épül fel, amelyek négy transzmembránrégiót tartalmaznak, azonban a receptor számos tulajdonsága egyedülálló az ioncsatornákon belül. A receptorműködés fontos eleme a csatorna Ca2+-permeabilitása, mert a Ca2 ~ -beáram lás tehető felelőssé az említett receptorhatásokért Az eddig ismert receptor ioncsatornák közül az NMDA-receptor relatív (a többi ionhoz viszonyított) Ca2+-permeabilitása a legna-

glutaminsav NMDA

p 5-9. ábra. A glicinreceptor transzmembránrégióinak modellje 5-10. ábra. Az NMDA-receptor modellje

A glicinreceptor gátlója a sztrichnin, amely nagy mennyiségben a központi idegrendszeri gátló folyamatok felfüggesztése révén a mctoros rendszer izgaimát váltja ki, ami izomgörcsök kialakulásához vezet.

gyobb. A receptor alegységek a glutaminsav mellett glicint is kötnek, a kettő együttes jelenléte szükséges a receptor aktiválásához. Sajátos tulajdonsága a receptornak, hogy működését nemcsak

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOROK ÉS JELÁTVlTELl MECHANIZMU OK

ligandok, hanem a mernbrán- potenciál is befolyásolja. A nyugalmi, negatív membránpotenciálnál a Mg2+ blokkoljaa csatornát és gátolja a transzmitter okozta ionpermeabilitás-növekedést A preszinaptikusan felszabadu ló glutaminsav csak akkor okoz jelentős ion- áramlást a csatornán keresztül, ha a posztszinaptikus sejt megfelelő mértékben depo2 larizált ahhoz, hogy a Mg + gátló hatása megszűn­ jön. Az is jellemző tulajdonsága az NMDAreceptornak, hogy a 3. és 4. transzmembránrégió közötti intracelluláris szakaszon olyan konszenzus helyek vannak, ahol a Ca2+-kalmodulin dependens protein-kináz és a protein-kináz C a csatornát foszforilálhatja és ezáltal a működését szabályozhatja. Az NMDA-receptor modelljét a 5-10. ábra mutatja.

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))>)))))>

459

lődik,

sakkor kapcsol ki, amikor a GTP hidrolizáL A GTP hidrolízisét maga a G-fehérje végzi, amely GTPáz aktivitással rendelkezik (5-ll. ábra). Jelen alfejezetben a heteretrimer G-fehérjékröl lesz szó, a jelátvitelben szerepet játszó egyéb, ki molekulatömegü GTP-kötő fehérjékről késöbb szálunk.

GDP

GTP

GDP

~~ \ ~· inaktív

~ l

GTP

l

aktiv

5-11. ábra. A GTP-kötő fehérjék aktiválásának-inaktiválásának általános sémája

Heteratrimer GTP-kötő fehérjék (G-fehérjék) részvétele a receptorhatások közvetítésében A GTP-kötő fehérjéknek nagy szerepe van az extracellulári zignálok továbbításában. A GTPkötő fehérjék családjába számos fehérje tartozik a transzlációs faktorok, a ras protoonkogén tennéke (p21 ras fehérje), az egyéb kis molekulatömegű GTP-kötő fehérjék (rab, rap, rho, rac, ARF stb. gének termékei), a tubulinek és a heteretrimer GTPkötő fehérjék - , amelyek közül ez utóbbiak játszanak fontos szcrepet a hét transzmembrándoménnc l rendelkező plaz mamembrán-receptorok hatásának közvetítésében. A heteratrimer GTP-kötő fehérjék (ezeket röviden G-fehérjéknek hívják) három különböző alegységből á llnak. A G-fehérjék jelátalakítóként (transducer) is felfoghatók, amelyek közvetítik a receptoraktiváció hatását egy effektor molekulához. Nagyszámú kémia ingerület - hormonok, neurotranszmitterek - ily módon befolyásolja a ejtrnűködést, dc ide tartoznak a látás és a szaglás folyamatában meghatározó receptorok is. A heteretrimer G-fehérjék közös jellemzője, hogy GTP-t kötnek, ami aktiválja a G-fehérjét, beindítja a jel közvetítést, majd a GTP GDP-vé történő hidrolízise leá llítja a működést. Egy olyan molekuláris " kapcsolóról" van tehát szó, ami akkor kapcsol be, amikor a GDP ismét GTP-re cseré-

A heteretrimer G-fehérjék három alegysége az o:- (39- 5 1 kDa), a P- (35- 36 kDa) és a y- (7- l O kDa) a legység. A P- és y-alegység szorosan kapcsolódik egymáshoz, az a-alegység kötődése lazább, s képes a py-ról disszociálni. Az a-alegység nagy affinitással köti a guanin nukleotidokat, a GDP-t vagy a GTP-t, a jelátvitel szempontjából aktív állapotban akkor van, amikor GTP-t köt. A G-fehérjék aktiválódását a receptor indítja el, akkor amikor az extracelluláris agonista kötődik a receptorhoz. A receptor- ligand komplex szerkezetváltozása a G-fehérje o:-alegységhez kötődött GDP disszociációját és GTP-re történő kicserélődését okozza. A GTP-t kötő a-alegység (o:-GTP) diszszociál a py-alegységröl és kölcsönhatásba lép az effektorral (adenilát-cikláz, foszfolipáz C stb.), amelynek működését módosítja, s ez intracelluláris mediátorok szintjének változását eredményezi a sejten belül. Az a-alegység, amely egyszersmind enzim is, GTPáz aktivitása révén a GTP-t hidrolizálja, ezzel aktív állapota megszűnik. A keletkező o:-GDP disszociál az effektorról, ismét kötődik a py-alegységhez, létrejön az inaktív GDP- o:py komplex, amely ismét kölcsönhatásba léphet a receptorral és újra kész a jelátvitel közvetítésére (5-12. ábra).

460

))))))})))))))))>))))))))))))))))))))) )>))))

EXTRACELLULÁRIS JELEK RECEPTORA l ÉS A JELÁTVlTELJ MEC HANIZ 1 SOK

A

~P

\

ÁLLAPOT

INAKTIVÁLÁS

/ GTP

___....____,..~ ~ intracelluláris mediátor

5-12. ábra. A G-fehérjék müködése a jelátvitel során. R, receptor; A, agonista; E, effektor

A G-fehérjék csoportosítása az a-alegységek szekvencia hasonlósága alapján történik. Eszerint a ma ismert, mintegy 20 a-alegység (amelyek legalább kilenc gén és alternatív splicing termékei) 4 nagyobb csoportba sorolható, a Gs-, Gi-, Gq- és a G 12-fehérjék családjába. Ezekről ad áttekintést az

5-2. táblázat. Legjobban ismert a G 5 -fehérje-család, amely nagyszámú hormon- és neurotranszmitter, valamint a szaglás receptorához kapcsolódik, és nevét onnan kapta, hogy az adenilát-ciklázt stimulálja (s), s így a cAMP-szintézist fokozza. Az adenilátcikláznak öt izoformája ismert, amelyek mindegyikét aktiválja a Gs-fehérje. A Gsa aktiválja még

a dibidrapiridin-érz ékeny (L típusú) feszültségfüggo" c a 2+-csato rna' kat 1s. Ettől eltérő szerkezetük és funkciójuk van a Gqfehérje-családba tartozó febérj éknek, melyek csaknem minden szövetben megtalálhatók. A Gq·fehérjék a sejtmembránban a foszfolipáz C enzimet aktiválják, ami a foszfatidilinozitol -4,5-biszfoszfátot inozitol-l ,4,5-triszfoszfátra (IP3) és digliceridre hidrolizálja (lásd 475. oldal). A receptor és a foszfolipáz C között a Gq-családba tartozó G-fehérjék létesítenek kapcsolatot. Eltérő tulajdonságú fehérjék tartoznak a Gi-fehérje-családba, amelyek közös jellcmzője, hogy pertussistoxin iránt érzékenyek. Legjobban azok a o

PLAZMAMEMBRÁN-RECE PTOROK É J ELÁTVITE LI ~lEC HAN I ZM U OK

5·2. táblázat. A legfontosabb G-fehérjék a-alegységelnek csoportositása és tulajdonságai

--

Előfordulása

-

ADP-riboziláció

Effektor

a (4)

choleratoxin

adenilát-cikláz (+) Ca2•-csatorna (+)

Uolf.

szaglóideg

choleratoxin

adenilát-cikláz (+)

Gq

a

csaknem mindenütt

G1

Cll (3)

csaknem mindenütt

G12


(2)

agy

Ut

(2)

retina

foszfolipáz

~ pertussistoxin

-·

---r:

minden szövet

G,

46 1

>>»>>>>>>>>n»>>n»>>>>>>»>>>>>>»»>>>>>>»>>»>>>>>>»

c~

Fontosabb receptorok

--·-

-

l

~-ad renerg ,

glukagon, dopamin (0 1). TSH, ACTH, LH szag a 1-adrenerg, kolinerg-muszkarin, · kolecisztokinin, TRH, vazopresszin

-i

adenilát-dkláz ri l i •drenerg, kotinerg-muszkarin, K·-csatoma (+) foszfolipáz C (+)

dopamin (0 2), opioidok, szomatosztatin

pertussistoxin

Ca2•-csatorna (-)

a:radrenerg, met-enkefalin, GABAa

=T~hoteratoxin pertussistoxin

cGMP-specifikus · tosztodiészteráz

mindenütt

l

r=

Zárójelben az izoformák számát tüntettük fel.(+) az aktiválást, (-)az inaktiválást jelzi.

a i-fehérjék ismertek, amelyek az adenilát-cikláz gáttását okozzák (i = inhibition), de tartoznak ide olyan G-fehérjék is, pl. a G 0 , amelyek ioncsatornákkal létesítenek kapcsolatot. Fontos ezek közül az a Gi-fehérje, amely a kolinerg muszkarinreceptorhoz kapcsolódik és a szívizomsej tekben közvetlen ül aktiválja a K+-csatornákat és h iperpolarizációt hoz létre. Úgyszintén ebbe a csoportba tartoznak az a.1-alegységet tartalmazó G 1-fehérjék (G1; t= transzducin), amelyek a retinapálc ikákban találhatók. Ezeket a rodopszin aktiválja, s a cGMP-re specifikus foszfodiészterázt stimulá lják, aminek következtében meghatározó szerepet játszanak a látás fo lyamatában. Az a.-alegységeknek számos dornénje van, külön doménhez kötött a specifikus receptor fe lismerése, a guanin nukleotid kötés, a GTP-hidrolízis, a py-alegységek kötése és az effektorral törté nő interakció. A J3y-a legységek funkciója kevésbé tisztázott, az biztosnak látszik, hogy szerepük van az a-alegység membránhoz történő rögzítésében, de egyes esetekben közvetlenül effektorral is kapcsolatba léphetnek. Így egyes szövetekben a 2 py-alegység aktiválja K+-, Ca +- és Na f-csatornákat, aktiválhatja a foszfatidilinozitol-3-kinázt

(lásd 490. oldal) és a citoplazmás tirozin-kinázokat is (lásd 470. oldal). Sajátos tulajdonsága egyes bakteriális toxinoknak, hogy a heteratrimer G-fehé1jék a-alegységét adott helyen A DPribazilálják s ezáltal rn líködésüket rnegváltoztatj ák. Az ADP-riboziláció lényege az, hogy NAD+-ról a toxin hatására ADP-ribóz kerül az a-alegységre, rniközben a nikotinsavamid felszabadul (5- 13. ábra). A cholera kórokozójának (Vibrio cbolerae) toxinj a az adenilát-ciklázt stimuláló C su-alegységet ADP ribozilálja a GTPáz aklivilá ért fel el ő dornénen (20 1-arginin), arninek következtében a7 a-alegység GTPáz aktivitása megszünik (5-14. ábra). Ennek funkcionálisan az a következménye, hogy a G-fehérje nem tud " kikapcsolni" , az adenilát-cikláz folyamatosan aktív marad, é kontrollálatlanul felerő ödnek azok a sej t folyamatok , amelyeket a cAMP stimulál. Minthogy a cholera vibrio a gyomor-bél csatorna sejtjeivel kerül kapcsolatba, az adenilátcikláz permanens aktiválása ezeket a sejteket érinti és magyarázza a cholerában kialakul ó súlyos elektrolit- és folyadék felszívódási zavarokat. A szamárköhögés kórokozójának (Bordetella pertussi s) a toxinja, a pertussi stoxin más a -alegységeket (G,a) ADP ribazilál közel a7 a-alegység karboxi-tenninálishoz (egy ci szteinen), amel y a receptorral történő kapcsalódá helye. Az ADP-riboziláció következtében nem jön létre a receptor és a G-fehérje közölti asszociáció, vagyis mindazon receptorok, amelyek pertussi toxinérzékeny G-fehérje közreműködéséve l mlíködnek, a toxinjelenlétében nem képesek a sej tmüködést befolyásolni (5-J 5.

ábra).

462

>>>m>m>>>>>m>>>m»>>>>>>»>>>m>m

EXTRA CELLULÁRJS J ELEK RECEPTORAI ÉS A J ELÁTVITELJ M ECHANIZMUSOK

N H ,-C u ~o

nikotinsavamid N

~o

l

CH2 -

OH

0 - P-

l o


~o

o,

O - P-

l o-

N

'

OH OH

OH ADP-ribóz

NAD+

NH,-C ú ~o

CHOLERATOXIN PERTUSSISTOXIN

nikotinsavamid N

~o CH2 -O -

OH

P-

l o


~o

0 - P-

l o-

O,

N

'

OH

OH

OH

5-13. ábra. A G-feh érje a -alegységek ADP-ribozilációja bakteriális toxi nak hatására

Mint az 5-2. táblázatban látható, a G-fehérjé k nagy többsége a sejtmembránban enzimekkel lép kölcsönhatásba, amelyek intracelluláris med iátorok képződését kata lizálják, mint pl. az adenilátcikláz és a foszfo lipáz C, amelyek ha tására cAMP, illetve IP3 és diacil-g licero l keletkezik. Ezek a mediátorok viszik tovább a sej t számára az utasítást. Ez a fo lyamat a j el felerősödését (arnplifikációj át) okozza, mert az effektor enzim aktiválása több katalitikus ciklusban fokozza az intracelluláris mediátorok képződ ését. A jelamp-

lifikációban tényező az is, hogy egy receptor többféle G-fehétj ével is kölcsönhatásba léphet. Külön kell említést tenni azokról a fo lyamatokró l, amelyekben a G- fehérjék nem enzimekhez, hanem közvetlen ül ioncsatornákhoz kapcsolódnak és azok működését modulálják. Közvetlen G-fehérje kölcsönhatás révén aktiválódik a K ' -csatorna a muszkarinreceptorok stimulációj a következtében a szimpatikus és a paraszimpatikus ganglionban, központi idegrendszeri neuronokban, valamint a pitvari szívizom ejtekben. Ennek K+-kiáramlás és

PLAZMAM EMBRÁN-RECEPTOROK ÉS JELÁTVITELJ MECHANIZMUSOK

)))))) )) ))))>))) )))))) )))>)\)))))))))))) ))))))))))))H))))))

463

GTPáz-aktivitás

/\

cAMP

l Gsa ADP-ribazilálása

CHOLERATOXIN

5-14. ábra. A G1 ,, GTPáz aktivitásának gátlása choleratoxin által okozott ADP-riboziláció következtében

~ON IST~

~

receptor-G-fehérje asszociációja

l

r

G, és Go a.-alegységek ADP-ribozilációja

PERTUSSISTOXIN

5-15. ábra. A receptor-G-fehérje asszociáció gátlása pertussistoxin által okozott ADP-riboziláció következtében

hiperpolarizáció a következménye, ami neuronokban az idegi vezetés és ingerületátvitel gátlását, a szívben pedig negatív laonotrop hatást eredményez {5- 16. ábra). Úgyszintén közvetlen kölcsön-

hatás jöhet létre a G-fehérjék és a feszültségfüggö Ca2' -csatornák között (5- 17. ábra) . Az aradrenerg receptorok, a GABA 8 , valam int a szomatosztatinreceptorok aktiválják a G 0 -fehérjét, ami a

464

)))))))))))))))))))))»)))))) )))))))))))))))

EXTRACELLUL ÁRIS J ELEK RECEPTORAI ÉS A JELÁT ITELl MECHAN IZM

OK

5-16. ábra. A K•-csatoma aktívációja acetilkolin hatására a G1-fehérje közreműködésével

GTP

5-17. ábra. G-fehérjék közvetlen kölcsönhatása a feszültségfüggö Ca2• -csatornákkal

_j

2 feszültségfügg ö Ca _._-csatomákka l kölcsönhatásb a lépve annak komformáció ját úgy változtatja meg, hogy a csatorna érzéketlenné válik a depolarizáció iránt. Mind az L, mind az N típusú csatornák gátolhatök ily módon. Ezzel e llentétesen hatnak a G 5 -fehérjék, amelyek a.-alegysége a feszültségfüg 2 gö Ca2 ' -csatornákat aktiválja és Ca +-belépést okoz. Ez a hatás hormonok és neurotranszm itterek hatására számos szövetben (pl. neuronokban , sz ívben, endokrin sej tekben) megfigyelhetö .

Protein-kinázok és foszfoprotein-foszfatázok Az extrace lluláris jelre adott sejtválasz kialakulásának molekuláris mechanizmus ában alapvető szerepet játsz ik a reverzibilis fehérjefoszfo riláció, amelyet protein-kináz ok hoznak létre és

foszfoprotein -foszfatázok züntetnek meg. A plazmamembránb an e lhelyezkedő receptorokkal rendel kező kémiai jelek közül igen soknak a jelpálya-rend szerét egy (vagy több) intracelluláris m ediátor (másodlagos m essenger) képző­ dése j ellemzi. Az eddig ismert intracelluláris mediátorok befolyá olják bizonyos protein-kinázo k és foszfoprotein-foszfatázok aktivitását. E mediátorok között van olyan, amelynek minden további hatásáért a mediátor á ltal aktivált protein-kináz a felelős (ilyen pl. a cAMP-mediá tor-rendszer) és van olyan is, amelynek molekulári s hatásmechanizmusában a fehérjefoszfor iláció nem kizáróla2 gos, de nagyon fontos tényező (i lyen pl. a Ca mediátor-rend szcr). A plazmamembr ánban elhel yezkedő receptorokkal rendelkező kémiai jelek egy másik csoportjánál a kémiai jel-receptor komplex kialakulása intracel luláris mediátor közbeiktatása nélkül, közvetlenül feh érjefoszforilá-

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOROK ÉSJELÁTVl TEU MECHANIZMUSOK

)) )))) )))) )))))))))))))))) )))) )))) ))>))))))))))))))))) ))))))

465

plazmamembrán

l

l l

l l

cAMP

cGMP

Ca2·

PKA

PKG

;

/

+ + +~

•

+ + 2

Ca ./kalmodulin dependens PK-ok

•

MAP-kináz kaszkád citoplazma PKC

5-18. ábra. Protein-kínázok szerepe a különbözö jelpályák müködésében. A cAMP, cGMP, Ca2 • és DG (diglicerid, diacil-glicerol) a legjobban ismert intracelluláris mediátorok, amelyek a sejtspecifikus választ kiváltják. A MAP-kináz (mitogén aktivált protein-kináz) kaszkád egy sor egymást aktíváló protein-kinázból áll (PKA, protein-kináz A; PKG, protein-kináz G; PKC, protein-kináz C)

ció segítségével aktiválja a j elpályát (Ilyen jelpályájuk van például a növekedési faktoroknak; 5-18. ábra). A különbözö extracelluláris kémiaijelek által aktivált, egymástól teljesen különböző jelpályarendszerek között szoros kölcsönhatás van (ezt az irodalomban cross-talk-nak nevezik). E kölcsönhatás vagyis az egyes jelpályák közötti információcsere molekuláris alapját az esetek túlnyomó többségében ugyancsak a fehérjefoszforiláció teremti meg. A fehérjék foszforilációja az ATP y-helyzetű foszfátcsoportjának a terhére megy végbe, míg a defoszforiláció hidralitikus hasítás útján történik (lásd 1.2. fejezet). A fo lyamat lényegéhez tartozik, hogy a febérjéken található OH-csoportok közül csupán bizonyos, az arninosavsorrend alapján meghatározott oldalláncot vagy oldalláncokat érinti, míg a többi OH-csoport nem foszforilálódik. A folyamat jelentőségét mutatja, hogy az eukarióta sejtek génállományának 2- 3%-a protein-kinázokat és foszfoprotein-foszfatázokat kódol, ezernél több különböző protein-kinázt, illetve faszfoprotein-foszfatázt ismertek fel eddig, és az ismereteink ezen a téren még meglehetősen hiányosak.

A protein-kinázokat aszerint szakták csoportosítani, hogy a fehérjék valamely szerin, illetve treonin oldalláncának OH-csoportján hoznak létre foszfát-észter kötést (protein-szerinltreonio-kinázok), vagy valamelyik tirozin oldal1ánc OHcsoportját foszforilálj ák (protein-tirozin-kinázok). Az enzimek általában vagy az egyik, vagy a m ásik csoportba tartoznak, azonban ismert olyan kivételes enzim is, amely szubsztrátjának bizonyos treonin és tirozin oldalláncait is képes foszforilálni. Egy sej ten belül a fehérjék mintegy 30%-a képes foszforilálódni valamelyik proteinkináz segitségével, a szerinltreonin-csoportok foszforilációja nagyságrendekkel gyakoribb, mint a tirozinfoszforiláció. A protein-tirozin-kinázok általában a sejtek szaporodásának, illetve differenciálódásának a szabályozásában vesznek részt, míg a szerin/treonin-kinázok a metabolikus utak szabályozásától a növekedés és differenciálódás szabályozásáig, minden folyamatban megtalálhatóak. A protein-kinázok katalitikus aktivitása a legtöbb ismert esetben szigorúan szabályozott. Az aktiválás vagy egy ligand által kiváltott allosztérikus szabályozás (ilyenek többek közt az intracelluláris

466

)))))))))))) )))) )))))))) )))))))))))))))) ))))

EXTRACELLULÁRIS JELEK R ECEPTORAl ÉS A JELÁTVITE Ll 1EC HANIZM USOK

mcdiátorok által aktivált protein-kinázok, pl. a cAMP-dependens protein-kináz), vagy a proteinkinázok maguk is foszfori láció- defoszforiláció segítségével szabályozódnak (ebbe a csoportba tartozik a sejtproliferáció szabályozásában részt vevő protcin-kinázok jelentős része.) Gyakran mindkét mechanizmus szerepet játszik. A proteinkinázok foszfori lációját többnyire egy másik protein-kináz végzi, ilyen módon több lépésből álló, bonyolult foszforilációs kaszkádok jönnek létre. A foszforilációs kaszkádok általában a jel erősítéséhez vezetnek, ennél azonban nagyobb jelentősége lehet annak, hogy a többlépcsős, kaszkádszcrü foszforiláció a jelpályarendszer műkö­ désének többirányú szabályozhatóságát, a jelpályák közti kölcsönhatásokat is lehetövé teszi. A protcin-kinázok néhány képviselőjét az 5-3. táblázat rnutatja be. A protein-kinázok szerkezetét - funkciójuk, regulációjuk, zubsztrátjaik minden különbözősége ellenére - bizonyos fokú hasonlóság jellemzi. Az

enzimek katalízisért felelős részében (katalitikus domén, a homológia erre a szakaszra jellemző), mindig megtalálható egy jellegzete , rövid, glicinben gazdag aminosavszekvencia, amelyet egy lizin követ a megfelelő pozícióban, ez az A TP kötődé­ sének helye. A katalízisért fele l ős aktív centrum körüli szerkezet is nagyfokú homológiát mutat. A fehérjéket foszforiláló enzimek közölt találunk olyanokat, amelyek csupán egyetlen bizonyos fehérje foszforilációját végzik (vagy legalábbis csupán egy-két szubsztrátjuk van) és ismerünk széles szubsztrátspecifitású protein-kinázokat, amelyek igen sok különböző fehérje foszforilációját képesek katalizálni. Ez utóbbiak ún. specifitásd eterminánsok alapján ismerik fel szubsztrátjaikat. A specifitásdeterrninánsok bizonyos aminosavak, amelyek a foszforilá landó oldallánc szomszédságában, meghatározott pozícióban helyezkednek el. (Specifitásdeterminánsok között több enzim esetében szerepeinek bázikus aminosavak, egyes enzimeknél ilyen feladatot savanyú oldalláncok látnak

5-3. táblázat. Néhány jól ismert szerin/treonin protein-kináz szabályozásának legfontosabb mechanizmusai

cAMP (allosztérikus aktiválás)

protein-kináz A

l protein-kináz G

cGMP (allosztérikus aktiválás)

protein-kináz C "klasszikus" izoenzimek

Ca2•, foszfatidil-szerin , diacil-glicerol (allosztérikus aktiválás)

kettős szálú RNS-dependens protein-kináz

kettős

l

protein-kináz B

1

foszforiláz-kináz

2•-kalmodulin-dependens

szálú RNS (allosztérikus aktiválás)

más lipidek, pl. arachidonsav (aktiválás)

l

a2• -kalmodulin (allosztérikus aktiválás)

m;oz;n-könnyülánc-k;náz

l Ca

Egyéb szabályozás

Regulátor

Protein-kináz neve

kináz ll

raf-kináz (MAP-kináz-kináz-kináz)

foszforiláció protein-kináz A (gátlás)

foszfatidilinozitol-3-4-biszfoszfát (transzlokáció)

a foszforilációt egy másik kináz végzi, amelyet a Pl-3-4-biszfoszfát aktivál

Ca2•-kalmodulin (allosztérikus aktiválás)

foszforiláció protein-kináz A (aktiválás)

Ca2 •-kalmodulin (allosztérikus aktiválás)

autofoszforiláció (aktiválás)

ras GTP-kötő fehérje (aktiválás)

foszforiláció protein-kináz C (aktiválás) protein-kináz A (gátlás)

l

G

PLAZMAM EMBRÁN-RECE PTOROK É J ELÁTVITELJ MECHANIZMU SOK

el, más enzimeknél a proJin oldalláncnak van irányító szerepe.) Az intracelluláris mediátorrends zerek hatásmechanizmusában központi szerepet játszó, széles szubsztrátspeci fi tás ú szerin/treon in-protein-kiná zok közül néhányat részletesebbe n is jellemzünk. Ezek közül a legrégebben i mert enz im a cAMPdependens protein-kináz, más néven p roteinkináz A. Aktiválatlan állapotában a protein-kináz A két-két azonos katalitikus, illetve regulátor a legységből álló tetrarner szerkezetű fehérj e (ez a holocnzim). A kata litikus alegység felel ős a fehérjék foszforilációjáért, a tetramerben azonban a regulátor alegység gátolja a katalitikus alegység működését, ezért inaktív a tetrarner holoenz im. A regulátor alegységen helyezkednek cl a cAMP kötöhelyek (két-két kötőhel y egy-egy regulátor monoméren). Ha a cAMP koncentrációja növekszik, a cAMP a regulátor a legységekhez kötődik és az allosztérikus szerkezetváltozás következtében a boioenzim regulátor alegység dirnérre és katalitikus alegység monomérekre disszociál. A katalitikus alegység ezáltal felszabadul a gátlás aló l és aktivvá válik. A katalitikus alegység a szubsztrát specifitásának meg felelő (specifitásdet errninánsait

regulátor

•• cAMP

aktív

••

regulátor

regulátor

••

aktiv

5·19. ábra. A cAMP-depende ns protein-kináz aktiválódásának mechanizmusa (kat. katalitikus alegység)

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

467

tartalmazó) és más szempontból (pl. intracelluláris lokai izáció) is elérhető fehérjék foszforilációját addig folytatja, míg a cAMP-kencen tráció a sejtben magas. Ha a cAMP-szint csökken, a cAMP a regulátor a legységekről disszociál és a regulátor alegység dirnér ismét asszociál két katalitikus alegység monomérrel, az enz im ismét az inaktív holoenz im-szerkezete t veszi fel (5-19. ábra). A protein-kináz A regulátor alegységeibő l kétféle 1 izotípus (R és R"l ismert, ezek funkcionálisa n va11 lamelyest különböznek egymástól. Az R a legységnek ún. tar gettáló szerepe is van. Ez aztjelenti, 11 hogy az R -alegység fehérje- feh érje kölcsönhatások révén a szubsztrátjai közelében horgonyazza ki a holoenzimet, így a katalitikus alegység disszocJaCIOJa után gyorsan elérheti ezeket a szubsztrátoka t. A cGMP-depen dens protein-kiná z {proteinkin áz G) szerkezete hasonlít a protein-kináz A szerkezetére, dc a G kináz két azono polipeptidláncból ál l. Ebben az enzimben a katalitiku é regulátor rész nem alkot két külön polipeptidláncot, hanern ugyanazon polipeptidlánc két különböző doménjén helyezkedik el. A cGM P kötődése a regulátor doménhez nem vezet az a legységek disszociációjá hoz, dc az allosztérikus szerkezetvált ozás felszabadítja a katalitikus domént a regulátor domén által okozott gátlás alól. A protein-kináz C -nek nevezett enzim valój ában nem egyetlen fehérje, hanem egymásra nagymértékben hasonlító, azonban egymástól mégis valamelyest különböző fehérjékből álló enz imcsalád (jelenleg 12 családtag ismert). A család tipikus, 11 1 ,.klasszikusna k" nevezett tagjai (a, ~ , ~ és yprotein-kináz C) a Ca2+/foszfolip id-dependens p rotein-kinázo k, a család többi, atípusos tagja Ca 2 -independen . Az izoenz imek különbözőkép­ pen expresszálódn ak különbözö szövctekben (a y-izoforma pl. csak a központi idegrendszerb en fordul e lő) és valamelyest eltérő módon történő aktiválódásuk miatt az is val ószínüsíth ető, hogy a család minden tagjának saját, spcciá lis szerepe van. A protein-kináz C család tagjai egyetlen, több doménből á lló polipeptidlánc ból á llnak, az alapállapotban az N-terminális oldalon l evő regulátor domén (amely maga is több részből áll), gátolja a C-terminális félen elhelyezkedő katalitikus dornén működését. A regulátor doménhez kötődö allosztérikus Iigandok együttes hatására szabadul fel a

468

)))))))))))H)))))))))))))))>)))))))))))))))

EXTRACELLULÁRIS JELEK RECEPTORAl ÉS A JELÁTVITELl MECHANIZMUSOK

katalitikus domén a gátlás alól. A klasszikus protein-kináz C izoenzimek aktiválódásához in vitro Ca2 + és foszfatidilszerin szükséges, az enzim 21 Ca iránti affinitását azonban igen nagy mértékben növeli egy másik intracelluláris mediátor, a

diglicerid (diacil-glicerol, DG). Sejten belül első­ sorban a DG megjelenése, illetve felhalmozódása a plazmamembránban (vagy valamely más membránban) indítja el a protein-kináz C aktiválódását, ez nyugalmi Ca2~ -koncentráció me llett is megtör-

COOH

b

lipidek

5-20. ábra. A protein-kináz C izoenzi mek szerkezete és aktiválódásának mec hanizmusa. (a) A protein-kináz C család klasszikus tagjait a, ~1. pll, y-izoenzimek) alkotó polipeptidláncon négy konstans (C ,, C2. C3 és C4) szakasz és öt variábilis szakasz (V1, V2, V3, V4 és V5) helyezkedik el. A polipeptidlánc N-terminális fele a regulátor domén, C-terminális fele a katalitikus domén. A C, szakaszon két ún. ncinkujj"-szerkezet található (lásd transzkripciós faktorok szerkezeténél), azonban ezzel a protein-kináz C nem a DNS-hez kötődik, hanem a C1 szakasz a lipid természetű aktivátorok (foszfatidilszerin, diacil-glicerol) kötő­ helye. A C2 szakasz tartalmazza a kötőhelyet a Ca2• számára. Ez a szakasz hiányzik a család atípusos, illetve Ca2•-independens tagjaiból. A regulátor domént a katalitikus doménnel összekötő V3 szakasz az enzim aktivált konformációjában különösen érzékeny a proleolitikus enzimekre. A C3 szakaszon helyezkedik el az A TP-kötőhely. A C4 szakasz a szubsztrátkötőhelyet és a katalitikus centrum többi részét tartalmazza. A regulátor domén en a C 1 szakasztól N-terminális irányban található a pszeudoszubsztrát (P) hely. A pszeudoszubsztrát hely az enzim specifitásdeterminánsainak megfelelő aminosavsorrendet tartalmazó szakasz, de a foszforilálható szerin vagy treonin oldallánc helyett alanint tartalmaz. (b) Az enzim inaktiv konformációja úgy alakul ki, hogy a pszeudoszubsztrát hely (P) kapcsolatba lép a katalitikus részen található szubsztrátkötőhellyel (S), mintegy letedi azt. Az aktivátor molekulák kötődésekor (DG, diacil-glicerol) az enzim konformációja megváltozik, a pszeudoszubsztrát hely eltávolodik a szubsztrátkötőhelytöl és így az hozzáférhetővé válik a szubsztrátok számára

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOROK ÉS J ELÁTVlTELl MECHANlZMUSOK

ténhet. A DG gyorsan metabolizálódik, a DG-koncentráció csökkenése az enz im inaktiválódásához vezet. Az inaktív enzim jelentős része a c itoszolban található (legfeljebb Ca2+ segítségével alakul ki egy laza kapcsolat a membránnal), DG hatására azonban az aktivált enzim szarosan a membránhoz kötődik. A protein-kináz C család szerkezetét és aktiválódásának mechanizmusát az 5-20. ábra mutatja. A protein-kináz C segítségével működö jelpálya-rendszerek megismerésében fontos szerepe van a forbol-észtereknek, amelyekben található egy DG-ra em l ékeztető szerkezet, ezért aktiválják a protein-kináz C izoenzimeket. A forboi-észterek azonban a DG-del ellentétben a sejtekben nem metabolizálódnak és így a protein-kináz C izoenzimek permanens aktiválódását idézik elő. Az aktivált protein-kináz C nyitott konfom1áeiója érzékennyé teszi az enzimet a sejtekben található proleolitikus enzimek iránt és ezért a forboi-észterekkel tartósan aktivált protein-kináz C-t a proleolitikus enzimek lebontják. Ezt a folyamatot nevezik a protein-kináz C down-regulációjának Sejten belül a különbözö izoenzimek aktivitását még különféle más lipidek is befolyásolhatják, ezek között elsősorban az arachidonsavai tartják számon.

A protein-kináz A és C ún. széles szubsztrátspecifitású protein-kjnázok, igen sok kü lönfé le fehérjét tudnak foszforilálni. Specifitásuk alapja (specifitásdeterrninánsuk) bázikus aminosavak jelenléte a foszforilálandó szerin/treonin csoportok környezetében, a foszforilálandó OH-tól N-terminálisan (protein-kináz A) vagy mindkét irányban (protein-kináz C). A citoszolban megemelkedő Ca2+-szint (Ca2+mediátor) hatása nemcsak protein-kinázok aktiválódásán keresztül érvényesül , a protein-kinázoknak azonban a Ca2 ; -mediátorral működő jelpálya molekuláris eseményeiben is nagy szerepe van. A 1 citoszol Ca2 -konccntrációjának növekedését el ső­ sorban (de nem kizárólag) egy kalmodulinnak nevezett kb. 17 kDa nagyságú fehérje érzékeli, amely molekulánként négy Ca 2+-t tud megkötni. A Ca2+-kalmodulin komplex különböző enzimekhez kötődve aktiválja azokat (lásd inozitol-lipid jelpályarendszemél). A c itoszol Ca2+-koncentrációjának csökkenésekor a Ca2+ disszociá l a kalmodulinról és ezzel együtt a kalmodulin disszociál az aktivált enzimről , amely (egy speciális enzim kivételével, lásd később) ismét inaktív állapotba kerül. A Ca2+-kalmodulin komplex segítségével aktivá-

»>»>»»>»m>>»m»>m>>»»»>»»>»>»>>>»»»m

469

lódó enzimek között több, kül önböző proteinkináz is található. Ezek között vannak szűk szubsztrátspecifitású protein-kinázok, amelyek egy-egy bizonyos fehérje foszforilációjára specializálódtak. Ilyen enzim a foszforiláz-kináz és a miozin-könnyűlánc-kináz. Több széles szubszCa2+-kalmodulin dependens trátspecifitású protein-kináz is ismert, ezeket számokkal különböztetik meg egymástól, Ca2+-kalmodulin dependens prote in-kináz l, Ca2+-kalmodulin dependens protein-kináz ll stb. Ez utóbbi enzimek több fehérje foszforilációját képesek katalizálni . A Ca2+- kalmodulin d ependens protein-kináz ll-nek fontos szerepe van a Ca2+-mediátorral mű­ ködő j elpályá k működésében, leülönösen a központi idegrendszerben. Ennek az enzimnek lényeges tulajdonsága, hogy a Ca2 t-kalmodulin komplex segítségével történő aktiválódása után önmagát is képes foszforilálnj és az autofoszforilált enz im még a Ca2+-kalmodulin komplex disszociációja után is aktív marad. Az elsődleges aktiválás utáni, hosszan tartó, már Ca2+-independens aktivitásnak nagy szerepet tulajdonítanak a szinaptikus plaszticitásban. A felsoroltakon kívül még igen sok proteinszerin/treonin-kináz ismert. Ezek közül némelyek említésre kerültek korábbi fejezetekben (pl. a c iklindependens protein-kinázok az eukarióta sejtek sejtciklusának szabályozásakor, a kettős szálú RNS-dependens protein-kináz az eukarióta sejtek vírusokkal szembeni védekezésével kapcsolatban), mások ismertetésére később , a növekedési faktorokjelpályarendszerének leírásakor kerül sor. A protein-tirozin-kinázok egyik csapOltjába a plazmamembrán integráns komponensét képező, egyetlen transzmembrándomént tattalmazó, a növekedési faktorok receptorainak feladatát ellátó fehérjék tartoznak. Ezekben a fehérjékben a polipeptidlánc extracel luláris részén (a fehérje N-terminális részén) he lyezkedik el az extracelluláris jelre (növekedési faktorra) specifikus receptor domén, és intracellulárisan (a C term inális részen) helyezkedik el a kináz domén, il.letve azok a tirozi n oldalláncok, amelyeket az enzim saj át magán foszforilá lni képes. Az extracelluláris oldalon kötődö növekedési faktor hatására intracellulárisan foszforilá lódó tirozin oldalláncok indítják el a jelpálya működését (lásd a növekedési faktorok jelpályarendszerét leíró fejezetben).

470

))1»)))))))1)))) )))))1)))1)))))) )))))))))))

EXTRAC ELLU LÁRIS JELEK RECEPTO RAl ÉS A JELÁTVI T ELl MECHAN IZM

A protcin-tirozin-kinázok egy másik csoportj ába tartozó enzimek (nem recepto r protein tirozin kinázok ) nem a plazmam embrán integráns alkotórészei, önmagukban nem látnak el receptorfunkciót, hanem a citoszolban található k (esetleg zsírsava kkal vannak a mernbránhoz kihorgo nyozva). Azonban valami lyen extracelluláris jelre (növekedési faktor, citokine knek nevezet t reguláto r molekulák, limfocit ákat aktiváló jelek stb.) a jelet felfogó, gyakran nem tirozin-kináz természetű receptor intracelluláris részéhe z képesek kötödni és így indítják el a jel átvitelét. Ebben a csoportban a legrégebben ismert enzim, a daganatkeltö retrovíru sokban elsöként le írt onkogén, illetve celluláris protoonkogén, az src gén által kódolt src-kin áz (illetve a homoló g gének által kódolt src-kiná z család). Az src-kiná z szerkeze tét az 5-21. ábra mutatja. A katalitikus doméne n (src homoló gia domén l ) kívül még két másik olyan domént is tartalmaz, amelyek hez hasonló doméne k más fehérjékben is megtalá lhatók. Az SH2 domén (src homo lógia domén 2) jellegze tessége, hogy foszforilált tirozin o ldallánc okhoz tud kötödni és így az SH2 domént tartalmazó fehétjék egy kiválasztott, tirozin oldallán cán foszforilált fehérjéh ez tudnak kapcsolódni. Az SH3 domén (src homoló gia domén 3) pedig bizonyos proJinban gazdag aminosa vszekve nciákat képes felismerni és azokhoz kötödik. Az SH2/SH 3 doméne kkel rendelke zö fehér- jék bonyolult fehérje- fehérje kapcsol atokat tudnak kialakítani, amelyeknek nagy szerepü k van a növeked ési faktorok jelpálya rendsze rének kialaku lásában (lásd késöbb). Az src-kiná z moleku lákjelen tös ré zéta fe-

hérjéhez kovalensen kapcsolódó zsírsav-oldallánc kihorgo nyozza a membrá nhoz. Említésre méltóak a JAK (Janus arcú) protcintirozin-k inázok is, amelyek a citokinek tirozinkináz aktivitással nem rendelkezö receptorairól közvetítik a jeleket a sejt számára. A nem receptor tirozin-kinázok csoportj ába tartoznak a sejtmagban elhelyez kedö tirozin-kinázok is. A foszfopr otein-fo szfatázo k csoportosítása ugyancs ak azon az alapon történik, hogy szeríni treonin vagy tirozin OH-t észteresítö foszfátcsoport hidrolitikus hasításá t katalizálják-e. Ezek a csoporto k itt i eJhatárolódnak egymástól, annak ellenére , hogy a legutóbb i idöben ismertté vált néhány speciális szubsztrátra szakoso dé enzim, amelyek szubsztrátjuknak mind treonin-foszfát, mind pedig tirozin-foszfát oldallán cát képesek defoszforilálni. A szerin/t reonin foszfop rotein-f oszfatáz ok között korábba n négy enzimcs aládot különítettek el, a PPl, PP2A, PP2B és PP2C enzimeket, de a klónozási eljárásokka l újabb enzimek felismerése és karakterizáJása történt meg. Nem tisztázott még teljesen az sem, milyen módon regulálódnak ezek az enzimek. Kivétel a PP2B enzim, amely Ca2+-kalmodulin depende ns foszfoproteinfoszfatáz, kalcine urinnak is nevezik. A PP2C aktivitásáh oz Mg2 szükséges. A PP l és PP2 katalitikus alegységböJ és különbö zö regu látor, illetve targettátó alegység ekböl összeálló boioenz imeket hoznak létre. A PP l aktivitá sát közvetv e (regulátor-targettáló alegység ei, vagy specifikus, fehérjetermészetű, nem minden szövetb en megtalá lható inhibito ra foszforilációjának segítségéve!) a

autofoszforilációs hely Tir

~~~~~~-~~~~~~

mirisztil oldallánc

OK

regulációs hely

5-21 . ábra Az src protein-t irozinkináz család szerkeze te. A család tagjai három homológ domént tartalmaznak (katalitikus, SH2 és SH3 domének}, a negyedik minden izoenzimben egyedi. Az SH2 domén foszforilá/t tirozin oldallánchoz tud kötódni, az SH3 profinban gazdag szekvenciát ismer fel. Az enzimek maguk is tartalmaznak foszforilálható tirozin olda/láncot. A polipeptid N-terminális szakaszán levő tirozin foszforilációja inaktiválja az enzimet

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOR OK ÉS JELÁTVITELl MECHANIZM

cAMP-dependens protein-kináz szabályozhatja (csökkenti az aktivitását). A foszfoprotein-foszfatázok kutatásában is segítséget jelent a különbözö (nem endogén) inhibitor vegyületek alkalmazása. A PP2 enzim aktivitását már kis koncentrációban a PPI-et csak nagyobb koncentrációban gátolja az okadáns~v. a többi fo zfoprotein-foszfatáz nem érzékeny erre a vegyületre. A kalcincurin aktivitását a ciklosporin gátolja.

A tirozin-foszfoprotein-fosz fatázok között ugyancsak ismertek receptor természetű molekulák, pl. a limfociták aktiválódásának folyamatában játszik szerepetegy ilyen enzim (CD45-nek nevezik), azonban oldható tirozin-foszfoprotein-foszfatázok is vannak. A fehérjék foszfori láltsági á llapota mindig (legalább) két komponensű fo lyamat eredménye, az illetékes protein-kináz(ok) és a folyamatot visszafordító foszfoprotein-foszfatáz(ok) pillanatnyi aktivitásától fúgg.

A cAMP-mediátorrend szer Igen sok hormon, neurotranszmitter, illetve lokáli kémiai mediátor rendelkezik olyan plazmamembrán-receptorra l, amely egy beteretrimer GTP-kötő fehérje segítségével az ciklik us adenozin-3' ,5'- mo no foszfát (cAMP) képződését katalizáló adenilát-cikláz enzim mőködését szabályozza. Ezeknek a receptoroknak a szerkezete hasonlít egymásra abban, hogy mindegyik hét transzmembrándoménnel rendelkezik, egyébként azonban mindegyik receptor nagyon specifikusan köti a saját ligandját. Az adenilát-cikláz működését szabályozó ligandok, pontosabban receptoraik két csoportba tartoznak, az egyik csoport a heterotrimer Gs- (stimuláló) fehérjével á ll kapcsolatban, ezek a ligand- receptor komplexek aktiválják az adenilát-ciklázt. A másik csoportba tartoznak azok a ligand- receptor komplexek amelyekaGi (inhibitor) heteretrimer GTP-kötö fehérj e segítségével gátolni képesek az adenilát-cikláz működését (5-4. táblázat). Adenilát-cikláz enzimből is többféle izotípus létezik. a központi idegrendszer egyes sejtjeiben található olyan adenilát-cikláz is. amelyet Ca2 ' kalmodulin is aktivál.

OK

)))))) )))) )))) )))))))))))))))) )) )) )))) )))))) )))) )) ))))))))))

471

5-4. táblázat. Néhány extracelluláris kémiai j el, amely az adenilát-cikláz müködésének módositásával fejti ki hatását Extracelluláris kémia jel

Glukagon ACTH

Hetero trimer G-fehérje Gs

Hatás

1aktiválás ""' aktiválás

p-adrenerg aganisták Parathyreoideahormon

Gs Gs Gs

l aktiválás

tireotrop hormon luteinizáló hormon

Gs Gs

aktiválás aktiválás

vazopresszin (VPrreceptoron) dopamin (0 1-receptoron) hisztamin (H2-receptoron)

Gs Gs

aktiválás aktiválás

Gs

aktiválás

G;

gátlás gátlás

a2-adrenerg agenisták dopamin (02-receptoron)

l acetilkolin (M -receptoron) 2

opiát receptor agenisták

G; G, G,

aktiválás

gátlás gátlás

Az aden ilát-cikláz az A TP~- és y-helyzetű foszfátját pirofoszfátként hasítja le a cAMP képzödé ekor, a folyamatot sejten belül a pirofosz fát anorganikus foszfátra történő hidrolíz ise tesz i irreverzíbilissé. Az intracelluláris cAMP-szint az adenilát-cikláz aktivitásának, illetve a cAMP-t adenozin-5' -foszfáttá (AMP) hidrolizáló ciklikus nukleotid foszfodiészterázok aktivitásának függvénye (5-22. ábra). Az adeni lát-cikláz átmeneti aktiválódása után (az aktiváló extracelluláris jel koncentrációjának csökkenésekor) a nyugalmi cAMP-szintet a ciklikus nukleotid-foszfod iészterázok he lyreáll ítják. Többféle típusú ciklikus nukleotid-foszfodiészteráz ismert, nem minden sejtben található meg mindegyik típus. A legáltalánosabban elterjedt az alacsony KM-értékű ( l O 6 M nagyságrendű) c iklikus nukleotid-foszfodieszteráz és a magas KMértékű ( l O"" M nagyságrendű) ciklikus nukleotidfoszfodiészteráz. Ez utóbbi nemcsak a cAMP, hanem az analóg szerkczetű cGMP hidrolízisét is katalizálja és aktivüását a Ca2+- kalmodu lin kompl~x fokozza. Bizonyos sejtekben található olyan cAMP-t bontó foszfodiészteráz, amelynek aktivitását cGM P fokozza, míg zs írsejtekben például ismert egy olyan enzimtípus, amelyet az inzulin egy

472

>m»•»>~>»•>m»H»»»»»»»»»n>

o ll

o-- P l o-

o

EXTRACELLULÁRIS JELEK RECEPTORAl ÉS A JELÁTVlTELl MECHANIZMUSOK

5-22. ábra. cAMP bontása

ll

ll

l

l

O- P- O- P o~

képződése

és el-

O-CH2

o· H

~

adenilát-cikléz

adenin

o

H

O=P--0

l

i

cAMP

OH

o~

Hp

ciklikus nukleotid faszfediészteráz

adenin

AMP

OH

hosszú, bonyolult foszforilációs kaszkád segítségével aktivál. A fentiek is jól mutatják, hogy a cAMP-rendszer működését más jelpályák is befolyásolhatják. A cAMP mediátorrendszer a l egegyszerűbb ismert jelpálya, mert eukarióta sejtekben a cAMP szinte minden hatásáért a cAMP-dependens protein-kináz (protein-kináz A) felelős (5-23. ábra). A protein-kináz A (már ismertetett módon történő) aktiválódásakor felszabaduló katalitikus

OH

alegysége a legkülönbözőbb fehérjék foszforilációját katalizálja. Ezáltal egyes metabol ik us utakat gyorsít, más metabolikus utakat gátol, a metabolikus utakban részt vevő enzimek aktivitásának a módosítása segítségével (5-5. táblázat). Nemcsak metabolikus enzimeket foszf01·ilál a protein-kináz A, hanem például bizonyos ioncsatomák febérjekomponenseit, a szívizom szarkaplazmás retikulumában levő kalciumpumpa egy regulátor fehérjéjét (foszfolambán), a simaizom

EXTRACELLULÁRJS J ELEK RECEPTORA l É A JELÁTVITELJ MEC HANIZ M USOK

5-23. ábra. A cAMP-jelpálya komponensei (G., stimuláló G-fehérje; G;, gátló G-fehérje; PKA, proteinkináz A; Kat, katalitikus alegység; R z, regulátor alegység dimér)

jel 2

l l

receptor 1

receptor 2

*

5'-AMP

l

f PKAl

R Kat 2

cAMP dimer

2

diészterázok

H20 tetrarner

,A~t

l monomer proteinszubsztrátok

foszforilált fehérjék

sejtválasz

kontrakcióját szabályozó Ca2 +-kalmodulin dependens miozin-könnyű lá n c-kinázt stb., és így befolyásolni képes a Ca2 +-je lpálya müködését is, illetve egy később i smertetendő p rote in-kináz foszforilációja segítségével még a növekedési faktorokjelpályájának működését is modulálhatja.

Noha kü lönböző extracelluláris j elek, kül önböző sejtekben ugyanazonjelpályarendszert használják, az extracelluláris jelre adott válasz mindig sejtspecifikus, vagyis az adott sejtre j ell emző. Ennek pedig az a magyarázata, hogy a cAMP-dependens prote in-kináz egy adott sejtben a sej t differenciált-

474

)) )))) )) )))) )) )) )))))))) )))))))) )))))))))) ))

EXTRACELLUL ÁRJS J ELEK RECEPTORAl ÉS A JELÁTV lTELl MECI-IANIZM USOK

r--- ---

5-5. táblázat. A cAMP-dependens protein-kináz néhány szubsztrátja Szubsztrát fehérje

f-foszforiláz-kináz

J

aktiválás (glikogénbontás fokozódása)

l gátlás (glikogénszintézis csökkenése)

f glikogén-szinteláz

l

foszfofruktokináz ll (májban)

fruktóz-2,6-biszfoszfát bontása (glikolizis sebességének csökkenése, gl ukoneogenezis sebessénövelése)

~nek

piruvát-kináz (májban)

hormonszenzitív lipáz

r acetil-GoA- karboxiláz

l GREB-fehérje

Foszforiláció hatása

l

gátlás~olízis sebesség:nek csökkenése) - - - - - - - - - aktiválás (lipolízis sebességének fokozódása) gátlás (zsírsavszintézis sebességének csökkenése)

--

-1

j cAMP reszponzív elemmel (GRE) szabályozott génekről transzkripció se bességének fokozódása

ságának megfe lelő fehérjéket képes foszforilálni a sejt differenciáltsá ga határozza meg, hogy egy adott sejtben milyen folyamatot szabályoz a cAMP. Például a trigliceridek raktározására és szabad zsírsavak felszabadítására speciálódott zsírsejtekben dominánsan cxpresszálódó enzim a hormonszenzitiv lipáz, a zsírsejtekben ez az enzi m az el sődlege célpontja a protcin-kináz A akti vitásának. A mellékvesc kromaftin sej tj eiben és a szimpatikus neuronokban a tiro7in-hidroxilá z enzim expresszálódik scjtspecifi kusan, ezért ez az enzim lehet a protein-kináz A egyik szubsztrátja. A sejtek d ifferenciáltsági állapotának meg fel elő fehérjék ex pressziój ának fontosságát a szabályozásban jó l mutatj a a foszfofruktokináz II és a piruvát-kináz példája. A májsejtckben ta lálható foszfofruktokiná z ll é piruvát-kináz enzimeket a cAMP-dependens protein-kináz foszforilálja, ez a már ismett módon a cAMP-szint növekedésekor a májsejtekben a g likolízis ebességének a c ökkcnéséhez vezet és megkönnyíti, hogy a glikogén bontásábó l szárma7Ó glukóz a vércukorszint növelésérc fordítódj ék. (A foszfofruktokiná z ll foszforilációj a egyben a g lukoncogcnezist is gyorsítj a.) A vázizomsejtekbe n exprcsszálódó foszfo fruktokináz ll és piruvát-kináz izoenzimek sze rkeze tébő l hiányzik az az ami no avszekvenc ia, amelyet a protc in-kináz A foszfo ril á Ini képes, így vázizomban a cAMP-szint emelkedése nem vezet a g likolí7is gátlásához, sőt, a g li kogén bontásának célja éppen a g likolizis sebességének a fo kozása. További példa a cAMP sejtspecifi kus hatá aira, hogy a cAMP egyes sejttípusokban erősíti , más sejtekben éppen gáto lja a Ca2+-j elpálya működését. Ezt szépcn mutatja a S7ÍVizomsejtekrc, illetve a simaizomsejtekre gyakorolt hatása. Szívizomsejtekben a s7arkoplazmás retikulum Ca 2~-pum­ páj ának regulációj áért felel ős foszfolambán foszforilációj a

segitségével, relaxációkor cl őse~ít i a citoszolból a szarkoplazmás retikulumba törté nő ca· zekvesztrálódást, és így gyorsítja a rclaxációt {pozitív Jeronotrap hatás). Másrészt mind ezzel, mind egy lassú plazmamembrán Ca2 -csatoma foszforiláció segítségével történő aktiválásán keresztül elő­ segíti, hogy a következő kon trakciókor a citoszol Ca2 koncentrációjának emelkedése és ezért az összehúzódás erej e még nagyobb legyen (pozitív inatrop hatás). Ezzel szemben s imaizomsejtekbe n a protein-kináz A fő szubsztrátja a kontrakció! clinditó miozin-könnyülánc-ki ná7. amelynek Ca~ -szenzitívitását a fos7fo riláció gátolja, ezért itt cAMP/Ca2 antagoniLtnus áll fenn.

A cAMP-depen dens pro tein-kináz azonban nemcsak meglévő feh érjék aktivitásának a szabályozására képes, hanem a transzkripció sebességének a szabályozása révén befolyásolja az egyes enzimek (fehérj ék) mennyiségét is. A cAMP-dependens transzkripciós szintű szabályozás jelentős részéért a DNS-en található C RE-nek nevezett ci z-regulációs elem {cAMP-reszp onzív elem) és az ezt az elemet feli s merő, ehhez spccitikusan kötődni képe és a cAMP-dependens pro tcin-kináz által foszforilált, CREB-ne k nevezett fehérje (transzkripciós faktor) felel ős. A CRE egy rövid, palindrom nukleotidszekvencia (TGACGTCA ), amely a cAMP-vel szabályozott gének promoterén helyezkedik el. Az eukarióta gének transzkripciój ához mindig több transzkripciós faktorra van szükség, mert a DN S-dependens RNS-polimeráz ll nem képes a transzkripciót egyedül elkezdeni (5-24. ábra).

PLAZMAM EMBRÁN-R ECEPTOR OK É J EL ÁTVITELl M ECHANIZM USOK

5-24. ábra. A cAMP reszponziv elem (CRE) és a CREB-fehérje foszforilác ió· jának szerepe a cAMP-vel szabályozott gének transzkripciójának iniciációjá ban. (a) A GRE és TATA elemek elhelyezkedése egy cAMP-vel reguláit gén promoterén. A CREB-dimér a GRE-helyh ez, a TF obligát transzkripciós faktor a TATA-boxhoz kötödik. (b) A foszforilációja CREB-dimér s::ükséges ahhoz, hogy egy CBP-nek nevezett közvetítő fehérje kötödjön a GREB-hez. A CBP segí!ségével alakul ki egy olyan komplex a GREB és a TF transzkripciós faktorok között, amelyik erősen segíti az RNS-polimeráz ll bekötödéséf a promoter megfele/ö helyére. A CBP koaktiváto r fehérje, amelynek hisztonokat acetilá/6 aktivitása is van

TATA · -~-- - - -- -- --- ------ · - -

5' -

3' - CRE

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

--'---

~-- - -;r~~~~~ri~~~~.

--

475

3' 5

,

iránya

transzkripció startpontja

b

-- --- --- ---------

3'

- _-_-_-- --.--------- ---------.t,-_

5'

~~____::~~-.::=:~-- -

Inozitol-fosztolipid jelátvit eli 2 rendszer. A Ca + mint intrace lluláris mediátor és az inozitol-1 ,4,5-tri szfosz fát szerep e

nak: az egyik a hét transzmc mbránsze gmenttel rendelkező és G-febérj éken keresztül ható receptorok, a más ik a tirozin-ki náz aktivitású (vagy azzal kapcsola tban levő) receptoro k (lásd késöbb), s e k ét receptorc salád eltérő PLC izoenz imeket akti-

A receptoro k egy jel entős részének aktiválá a a sejtekben foszfatidi linozitol- származékok hidrotízi ét fokozza. Ebben a j e látviteli rendszerb en a intracellul áris mediátoro k a foszfatidilinozito lokra pecifikus foszfo lipáz C-enzim hatására ke letkeznek. Jelen fejezetbe n az egyszerű ség kedvéért, foszfolipá z C enzimrő l (PLC) szólunk, de ezalatt a foszfatidi linozitolo kra speciftkus enzim értendő. Az enzim legfontos abb szubsztrá tja a plazmamembrán lipid kettős rétegében he lyet fogla ló foszfatidilinozitol- 4,5-biszfo szfát (PIP2). A PLC eredmény e hidrolízi hatására végbeme nő foszfát ,4,5-trisz l inozitoldiacil-glic erol (DG) és (IP3) keletkezé se, amelyek e jelpálya intracelluláris mediátora i és a sejten belül a jelátvitelt két különböz ö irányban viszik tovább (5-25. ábra). Azok a receptoro k, amelyek hatására a foszfolipá z C aktiválód ik két e ltérő receptorc saládhoz tartoz-

vál. A foszfolip áz C enz imnek , amely müködés éhcz Ca 2+ -ot igényel, több izoformáj a ismert, (p, 8 és y) ame lyek között minimá lis a szekvenc iahomo lógia. A z egyes izoformá kon belül további alcsoportok különíthe tök el (PLC-p,, -p:!, -y 1, -y2 stb). A j elátv iteli fo lyamatok ban a P- és a y-PLC szcrepét igazolták, a PLC-8 funkciója egyelőre nem ismert. PLC- p, a legtöbb szövetbe n megtalálh ató é G-fehérjék hatására aktiválódik. A foszfolipáz C- p, enzimet a Gq-fehérj ék akti válják, az a-alegység kö lcsönhatá sba lép az enzimme l és a V ma~·o t növeli. A másik két PLC izoformá t (y és o) a Gqu nem befolyáso lja. Mindazo k a neurotran szmitterek, hormono k és mediátorok, amelyek receptora a membrán ban a Gq- (esetleg a G / Go) fehérjékh ez kapcsolt PLC- P-aktiválást okoznak, és ily módon indítják el a sejtválaszt (5-26. ábra).

ac

·,

>»»>»>..»>>»»»•>»•>»>»>~>mmm

476

EXTRACELLULÁ RIS JELEK RECE PTORAl ÉS A J ELÁTVITELJ MECHAN IZMUSOK

5-25. ábra. Diacil-glicerol és inozitol-1 ,4,5-triszfoszfát keletkezése foszfatidilinozil-4,5-b iszfoszfátból a foszfolipáz C hatására

~o

o

~

H C-O-C- R

21

R -C-O-CH

l

2

HC-O 2

t

1

o

~

P-O

!

o· #o v

J-.,----t's

-

O -P-O

l

o· ~o 0-P-O

l o·

foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát (Pl P2 )

~o

o

~

H C-O-C-R

21

1

R -C-O-CH 2

l

H2C-OH

diacil-glicerol (DG)

inozitol-1,4,5-triszfo szfát (IP3 )

A másik PLC izoformát, a PLC-y-t a tirozinkináz receptorok aktiválják. A PLC-y tartalmaz egy SH2-nek nevezett domént, amely sok más fehérjébcn is megtalálható, amelyek szintén a tirozin-kinázhoz kötődnek (lásd tirozin-kinázok). A receptor és a PLC-y közötti kölcsönhatás az enzim foszforilációját és azt eredményezi, hogy az egyébként citoplazmában lokalizálódó enzim a membránhoz kerül, ahol szubsztrátja is található. Így nemcsak a Gq-fehérjén keresztül ható hormonok, ha nem a tirozin-kináz receptorral működö növekedé i faktorok is (pl. a PDGF és az EGF) IP3 és DG kcletkezést stimulálnak (5-26. ábra).

E ltérő receptorok e lté rő PLC izoenzimek közremüködésével, de végül is IP3 és vele párhuzamosan DG keletkezést okoznak. E két mediátor fe l el ős a sejten belüli további eseményekért, amelyek közül elsőként az IP3 irányában követjük tovább a jelátvitel folyamatát.

Az lP3 hatásának az a lényege, hogy emeli a citoszol szabad Ca 2+ koncentrációját, mert vizoldékony molek:ula lévén eljut az intracelluláris Ca2+ raktárakhoz és onnan Ca2 1 -ot mobilizál. E helyütt szót kell ej teni azokról az intracelluláris Ca2+raktárakról, amelyekből 1P3 és egyéb stimulusok hatására Ca2+ mobi lizálható. A sejtek könnyen mo-

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPT OROK ÉS JELÁTVITELl MECHAN I Z M U OK

5·26. ábra. A foszfatidilinozitolra specifikus foszfolipáz C (PLC) izoenzimek aktiválása két eltérő receptormechanizmussal. Piros keretben felsorolva néhány példa látható azokból az agonistákból és receptortipusokból, amelyek PLCaktiválást okoznak (PDGF, trombocita eredetű növekedési faktor; EGF, epidermális növekedési faktor)

)) •>,, )))) )))))))) "))))))))))))))))))))))))))) )))))))))}))

477

acetilkolin- m,, m2 noradrenalin - a 1 hisztamin - H1 szerotonin - 5-HT2 glutaminsav-metabotrop angiotenzin ll vazopresszin- V, P-anyag kolecisztokinin ATP

!

!

RECEPTOROK (tirozin-kináz aktivitás)

RECEPTOROK (hét transzmembránszegmenttel)

! !

G-fehérjék FOSZFATIDILINOZITOL SPECIFIKUS FOSZFOLIPÁZ C

PLC-~

-

-

PLC-y

diacil-glicerol (DG)

inozitol-1,4,5-triszfoszfát (IP3)

!

Ca +-mobilizálás

protein-kináz C aktiválás

bilizálható Ca2+-raktára az endoplazmás, illetve az izomban a szarkoplazmás retiku lumban van. A Ca2+ itt nem szabadon, hanem fehérjékhez kötve 2 található, ami biztosítja azt, hogy a Ca t a j e lentékeny magas ke ncentráció (nlM-os ta11omány) e lle2 nére nem csapód ik ki. A számos Ca ~ -kötő fehérje közül, amelyek az endoplazmás és sza rkoplazmás retikulumban jelen vannak, a kalszekvesztrin (63 kDa) és a kalretiku lin (46 kDa) szerepe látszik egyértelműnek . A kalszekvesztrin a harántcsíkolt, a szív- és a sima izomban talá lható, a ka lretikulin a legtöbb sejtféleségben j elen van. Nagy ka pacitás-

2

1

2 sal kötik a Ca2 +-ot (-50 Ca ~ kötőhe l y mo lekulán2 ként), de kicsi a Ca + iránti affinitásuk (l
478

)) )))))) ))))) ) )) )))) )) )) )))))))) )) ))))) ) ))))

EXTRACELLUL ÁRI S JELEK RECEPTORA l ÉS A JELÁTVITELJ JECHANIZMU OK

tor-család tagjai (>3) több kü lönbözö gén és a lternatív splicing produktumai, négy nagy a legységböJ állnak (300 kDa), melyek egy csatorna körül rendezödnek. A fehérjét a C terminális intramembrán domén rögzíti az endoplazmás retikulum membránhoz, az IP3 kötöhelyct az N-termináli citoplazmába nyúló domén tartalmazza. Az IP3 kötödé e egymás után a négy alegységhez konformációváltozást indukál, aminek következtében a Ca2 ' -ra permeábilis csatorna aktiválódik és Ca 2+ szabadul ki az endoplazmás retikulum Ca 2+-raktáraiból a citoszciba (5-27. ábra). A másik csatorna, amelyen keresztül intracelluláris Ca2+-mobilizálás történ het az endoplazmás, va lamint a szívizom és a harántcsíkolt izom szarkoplazmás retikulumban található, az l P3 receptorhoz szerkczet és funkció szempontjából egyaránt nagyon hasonl ó rianodinrece ptor (család-3). Nevüket onnan kapták, hogy egy ríanodin nevü növényi alkaloida is aktiválja őket. A rianodinrcceptor sokféle sejtben (harántcsíkolt izom, szívizom, neuronok, simaizom stb.) hozzájárul Ca2+-szignálok kialakulásához. Meg kell említeni, hogy bár az [P3 és a rianodinrcceptor ok között

sok a hasonlóság, nagyon lényegesen különbözhet a müködésük és a funkciójuk. Ez különösen igaz a harántc ikoh izomban és a szívizomba n található rianodinreceptorokra. A harántcsíkolt izomban a szarkoplazmá retikulum rianodinreceptorai a depolarizáció hatására aktiválódnak. A feszültségváltozás t a T-tubulusok dihidropiridin-ér zékeny csatornái (lásd 441. oldal) érzékelik, amelyek stmkturálisan és funkcionálisan egyaránt kapcsolódnak a rianodinreceptorokhoz, s a l étrejövő konformációvált ozás a rianodinreceptor Ca2 -csatorna aktívá lását eredményezi. A szarkoplazmás retikulumból ily módon felszabaduló Ca2+ indítja cl az izomkontrakció folyamatát. A szívizomban ezzel szemben a plazmamembrán -depolarizáció következtében, a feszültségfüggő Ca2--esatornákon kere ztül az extracelluláris térből a sejtbc lépő Ca 2 váltja ki az intracelluláris Ca2 raktárakból történő Ci -rnobilizálást. A szívizornban minden egyes kontrakció kiváltája a kismértékű extracelluláris Cah -belépés hatására létrejövő hirtelen Ca~ -kiáramlá a szarkoplazmás retikulum ból. Ez az ún. Ca 2 +-fliggő Ca2• felszabadulás a rianodinrcceptor okon kere, ztül történik, s nemcsak a zívizomban. hanem más sejtekben, pl. a neuronokban is hasonlóan müködik. Az agonisták hatására létrejövő intracelluláris Ca2 -felszabadulást, az iméntiektől eltéröe n, a már ismertetett módon keletkező l P3 váltja ki, közvctlenül aktiválva az l P1-receptor-csatorn át (5-28. ábra) .

l p 3::::::::::::::::::::::::::::::::::::::=:::

-: :?.. T

ca''

Ca2+

Ca 2+-kötö fehérjék (kalmodulin és mások)

FEHÉRJEFOSZFORILÁCIÓ

FEHÉRJEFOSZFORILÁC IÓ

EGYÉB HATÁSOK

5-27. ábra. A foszfatidilinozit ol jelátviteli rendszer vázlata. Rövidítések: DG, diacilglicerol; PIP , foszfatidilínozitol2 4,5-biszfoszfát; PLC, foszfolipáz C; R, receptor; /P3 , inozitol-1,4,5-triszfoszfát; RTK, receptor-tirozin-kináz

PLAZMAM EMBRÁN-RECEPTOROK É JELÁTVITELl MECHANI ZM

DHP-érzékeny feszültségfüggő Ca2+ -csatorna T-tubulus--membrán

OK

)))))))))))))>))>)))))))))))))))))))))))))))))))»»»»> »>

Ca

2

-J

479

DH P-érzékeny

+

feszültségfüggő

-=

Ca2+-csatorna

~ ~~ ) ca2+

.. l -i. recepto~2·

. d'mnano

ca2+ Ca2 +-raktár szarkoplazmás retikulum

Ca2+ Ca 2+-raktár

c Receptoraktiválás okozta Ca2+-felszabadulás IP3 hatására agonista

~

ca2+ Ca2+ -raktár

5-28. ábra. Ca2• -felszabadulás az intracelluláris Ca2•-raktárakból. Az ábrához a magyarázalot lásd a szövegben (DHP, dihidro-piridin; IP3, inozito/-1,4, 5-triszfoszfát)

Az intracelluláris Ca2 • -sz ign á) ([Ca 2 1]i-emelkedés) számos sejtben nem kizárólag az endoplazmás retikulumból a citoszciba történő Ca2+felszabadulás eredménye, hanem hozzáj árul ehhez a plazmamembránon keresztül létrej övő extracelluláris Ca2+-beára mlás is (5-27. ábra). A Ca2+raktárak feltöltöttsége eddig ne m tisztázott mechanizmussal befo lyásolja a plazmamembránon keresztüli Ca2....-beáramlást: amikor a C aH -raktárak fe ltöltöttek, nincs Ca2' -beáramlás a sejtbe, amikor a plazmamembrán közelében elhelyezkedő Ca2+raktárakból az IP3 mobilizá lja a Ca 2 -ot a "raktárkészlet" csökken, aktiválódik az extracelluláris 21 Ca -belépés ("store-operated" Ca21-be lépés). Ez

egyszersm ind az intracellu láris Ca2+-raktára k fe ltöltését is lehetövé teszi. Kísérleti körűlmények között, számos sejtféleségben az aganisták által okozott intracell uláris 21 Ca -szignál nem folyamatos [Ca 2+]i-emelkedést jelent, hanem fluktuá lva ún. kalciumoszcilláció lép fel, amely egy pontról ki indulva terjed a sejten belül. Ennek pontos magyarázata és jelentősége még nem ismert. Természetesen az lP3 metabolizálódik is, amelynek során intracelluláris foszfa tázok hatá. ára három lépésben dcfoszforilálódik és inozitol keletkezik, ami felhasználódi k a foszfa tid il inozitol új ras7i ntéziséhez. Az IP3-ból egy kináz hatására a ci toplazmába n inozitol- l ,3,4,5-tetrak is?foszfát

480

)))))))))))).)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOROK ÉS JELÁTVlTELI MECHANIZMUSOK

([P4 ) is keletkezik, amelynek közvetlen szerepe lehet az intracellulári [Ca2+] növelésében. (Az IP3-at foszforiláló kináz enzim Kt.de alacsonyabb, mint az 1Pr 5-foszfatáz enzimé, azaz az 1P4 keletkezés elsődleges az IPr ról történő foszfát hidrolízishez képest.) Az IP4 metabolizmusa is egymást követő defoszfori lációs lépések eredményeképpen inozitol keletkezéséhez vezet. Az JP3-mctabolizmus vázlatát a 5-29. ábra mutatja. Az inozitol-foszfátok metabolizmusát a Li+ befolyásolja, amely gátolja az l ,4-IP 2 ~ JP átalakulást, ezáltal a foszfatidjlinozitolok újraszintézisét. A Lt hatékony gyógyszer a psychosis maniacodepressiva kezelésében, lehetséges, hogy terápiás hatékonysága összefügg az inozitolfoszfolipid j elátviteli rendszetTel ható receptorhatások csökkentésével.

Az IP 3 hatására tehát a citoszolban egy másik mediátor, a Ca2+ mobilizálódik, s azoknak a sejtválaszoknak egy részéért, amelyeket PLC-t aktiváJó receptorok indítanak el, végül is a Ca2+ tehető felelőssé . Az 5-6. táblázatban néhány olyan hatás látható, amelyeket a foszfatidilinozitol jelátviteli úton, a Ca2+ vált ki. A kérdés, hogy melyek azok a fehérjék, amelyek működését a Ca2 ' regulálja és

5-6. tábrázat. Az ino%itol-lipid jelpálya által közvetített néhány sejtválasz

Sejt

Hatás

simaizom bronchus érfal

kontrakció

máj

glikogénlebomlás

nyálmirigyek

emésztőenzimek

pancreas

ója

neuronok

neurotranszmitter-felszaba dul ás

szekréci-

melyek azok a sejtfunkciók, amelyek ennek következtében megváltoznak.

'Va"tacil-glt!erol inozitol-1,4,5-triszfoszfát

foszfatidillnozitol-4,5-biszfoszfát

IP3- - - - - - ' - C ATP \-..-ADP IP35-foszfatáz

inozitol-1,3,4,5-tetrakiszfoszfát (IP4 )

~P,

inozitoi-1,F:o~.

ADP ATP

inozitol-1 ,3,4-triszfoszfát

~P, inozitol-3,4-biszfoszfát

~ P,

inozitol-4-fasz~ P,

inozitol-3-foszfát

ADP ATP

inozitol------===-- -- - - - - --+ foszfatidilinozitol COP-diacil-glicerol

5-29. ábra. Az inozitol-foszfát-metabolizmus vázlata

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOROK ÉS JELÁTVITELl MECHANIZMUSOK

))))>)>))))))))))))))))))))) )) )))))))))))) )) )) )))) )))) ))))))

48 l

A legáltalánosabb és minden sejtben megtalálható Ca2+-kötő fehé1je a már említett kalmodulin (469. oldal). A Ca2+-kalmodulin komplex különböző enzimekhez kapcsolód ik, amelyeket aktivál. Az 5-7. táblázatban néhány ilyen enzim látható, közülük a Ca1+- kalmodulin függő protein-kinázokról, amelyek számos fehérjét foszforilálnak és ezáltal regulálnak, már szó volt. A táblázatban fel21 sorolttöbbi enzimhez a Ca - kalmodulin közvetlenül kapcsolódik. Nagyon jel entős sejtfunkció változások magyarázhatók a Ca2+-kalmodulin komplex közvetlen aktiváló hatásávaL

5-7. táblázat. Néhány fehérje, amelyek a

[Ca-t~,-növekedés hatására létrejövő sejtvála-

szokban játszanak szerepet

,......__ _......_::•:e__-.--_..,__._,.......~-

Ca2 •-kalmodulin által aktivált enzimek

Ca2•-kalmodulin függő protein-kinázok [ plazmamembrán Ca2• -pumpa mlozin-könnyGiánc-kináz

miozin-könnyülánc-kináz aktívitás

~

miozln-könnyülánc-foszforilálás protein-kináz C troponin C kalpainok annexinek

l

ciklikus nukleotid-tosztodiészteráz (magas KM-G)

~

aktin-miozin kapcsolódás

~ KONTRAKCIÓ

glikogén-foszforiláz-kináz

kalcineurin (protein foszfatázok) . nitrogén-monoxid-szintáz

l

Ilyen pl. a simaizmok kontrakciója (5-6. táblázat), amely a miozin-könnyűlánc-kináz (lásd 6.2. fejezet) aktiválásának a következménye. A szimpatikus izgalom hatására az érfalban létrejövő simaizom~kontrakció (vérnyomás emelkedés) mechanizmusa tehát lépé-sről lépésre nyomon követhető és molekuláris szinten értelmezhető (5-30. ábra). Hasonlóképpen, minden elemében ismert a glikogémnobilizálás mechanizmusa a májban pl. az adrenerg a 11 -receptol' aktiválás következt6ben. Erről a 2.2. fejezetben már szó esett.

Ma még nem minden sejtfunkció pontos molekuláris mechanizmusa ismert vagy azért, mert nem tudjuk, hogy az ismert sejtfunkció, pl. szekréciók, neurotranszmitter-felszabadulás mögött milyen

5-30. ábra. Az érfal simaizom-kontrakció mechanizmusa a1-receptor-aktiválás következtében

molekuláris történés van, vagy azért, mert ismert Ca 2 +-kötő és Ca2 1 hatására regulálódó fehérjékhez egyelőre nem tudunk funkciót rendelni. Részben ilyenek az 5-7. táblázatban bemutatott Ca 2 +-kötő fehérjék. Ezekközül a harántcsíkolt izom kontrakciójának regulációjában szerepet játszó troponin C szerkezetileg nagyon hasonló a kalmodulinhoz. Ismert Ca2+-kötő fehérjék a kalpainok, amelyek intracelluláris neutrális proteázok és Ca 2+ hatására aktiválódva számos fehérje részleges vagy teljes proteolízisét katalizálják. Fiziológiás szerepük kevéssé ismert csakúgy, mint az annexinek családjáé, amelyek Ca2+ segítségével a membránban jórészt a savanyú foszfolipidekhez kötődnek (aminek következtében megakadályozzák, hogy ezek a foszfolipáz A 1 szubsztrátjai legyenek). A család egyes tagjai az exocitózisban játszanak szerepet. Mint az eddig iekben láttuk az IP3 és a Ca21 az inozitol-lipid jelpálya egyik irányát jelenti. A má-

482

~>»>>»>>»>»»»»m>»»»>>»>>>>»m

EXTRACELL LÁR I JELEK RECEPTORA l ÉS A JELÁTVITELJ MECI-IAN IZ.M SOK

ik irányban a jelátvitelért a diacil-glicerol a felelős, amely a PLC hatására a PIPrből keletkezik (5-25. és 5-27. ábra). A diacil-glicerol a sejtmembránban marad és aktiválja a membrán környezetében, de a citoszolban található protein-kináz C-t, ami ennek hatására a membránhoz asszociálódik. Az aktiválás, amelynek mechanizmusát már tárgyaltuk (lásd 468. oldal) átmeneti, mivel a DG metabolizmusa gyors, a membránban foszfatidsavvá alakul és újra felhasználódik a foszfatidilinozitolok (és egyéb foszfolipidek) szintézisére. Meg kell említeni, hogy számos receptoraktiválá , amely először a foszfatidilinozitolok hidrolízisét váltja ki, később egy tartósabb OG-keletkezést (és protein-kináz C aktiválást) is okoz. Ennek forrása már nem közvetlenül az inozitollipidek hasítása, hanem a foszfatidilkolin. Foszfatidilkolinból DG képződik vagy egy foszfatidilkolint hidrolizáló foszfolipáz C hatására közvctlenül, vagy foszfolipáz D hatására, foszfatidsav intermedieren keresztül (5-31. ábra). Nem tisztázott, hogy milyen módon történik a receptoraktiválást követően a foszfatidilkolin hidrolízisének aktiválása. A két fázisú - egy átmeneti gyors és egy tartóabb - DG keletkezésnek megfelelően aktiválódnak a protein-kináz C különböző izoenzimei. Jelen pillanatban még nagyon hiányosak az ismereteink arról, hogy milyen PKC szubsztrátok milyen sejtfunkciók regulálásábanjátszanak szerepet. A rendszer komplexitásához hozzájárul az izoenzimek

nagy száma (-12), és a szövcti specificitás, mind az egyes izoenzimek, mind a lehetséges szubsztrátok tekintetében. Néhány szubsztrát és a foszforiláció hatására bekövetkező funkcióváltozás azonban jól definiá lható. A PKC egyik fontos szubsztrátja pl. az EGF-receptor, amiről a 487. oldalon lesz szó. PKC hatásra foszforilá lódik számos ioncsatorna (K +-csatorna, Ca 2+-csatorna) az idegrendszerben, receptor (pl. nikotinreceptor) és membrántranszport fehérje (Na .._H + cseretranszport).

A guanilát-cikláz és a ciklikus GMP jelentősége a jelátvitelben. A nitrogén-monoxid biológiai szerepe A ciklikus GMP (cGMP) a sejtekben GTP-ből keletkezik (a cAMP analógiájára) a guanilát-cikláz hatására. Bár a cGMP-nek egyértelműen intracelluláris mediátor szerepet tulajdonítanak, az egész rendszer működéséről sokkal kevesebbet tudunk, mint a cAMP-vel működő receptor- jelátviteli rendszerrőL Lokalizációját, alapvető szerkezetét és működé­ sét illetően kétféle guanilát-cikláz ismert, amelyek ugyanazt a folyamatot, a cGMP keletkezését katalizálják: az egyik a plazmamembránban lokalizáló-

5·31. ábra. Diacil -glicerol keletkezése a j elátvitel során. (PLC, foszfolipáz C; IP3 , inozitol-1,4,5-tríszfoszfát; DG, diacilglicerol; PLD, foszfolipáz D)

r~

--FOSZFATIDILINOZITOL-- FOSZFATIDILKOLIN - - -

foszfatidlilinozitol·

PLD

PLC

specifikus PLC kolinfoszfát

!

kolin

foszfatidsav

DG

NIZM SOK PLAZM AMEMB RÁN-R ECEPT OROK É JELÁT ITELI 1ECHA

dó ún. partik uláris enzim , a másik a citopla zmában taiálha tó szolub ilis enzim (5-32. ábra). A partikuláris enzim egysze rsmind recept or is, bár még kevés extrac ellulár is szigná l ismert , amely guanilát-cikláz aktivit ású recept orhoz kötödi k. Az első és minde zideig a legfon tosabb ezek közül a pitvari nátriumürítő faktor (ANF - atrial natriu retic factor), amely vazod i latáció t, diures ist, natriur esist és aldosz terons zintézi s-gátlá st okoz. Először a pitvarban azonos ították , késöbb kiderü lt, hogy sok más helyen i5 szintet izálód ik. A plazm amem bránban található kétfajt a recept ora közül az egyik a G-fehérjékhez kapcso lódik, a foszfo lipáz C stimulációját és az adenilát-cikl áz gátlás át okozza . A má ik ANF-r eccpto r egy !30 kDa molek ulatöm egű monomcr, amely nek aktivá lása cGMP képző­ déséhez vezet. Szinté n a memb ránban lokal izálódik az a recept or, amely nek endog én ligandja ismeretlen, de amely az E. col i és egyéb bélbak tériumok hő tabi! toxinj ának a recept ora a vékon y- és va tagbélben. A toxino k hatásá ra guan ilát-cikláz

ANF

') szelubilis

cGMP

~

cGMP-függö protein-kináz

~L fehérjefoszforiláció -

_J

5·32. ábra. cGMP keletke zése a partiku láris és a szalub ilis guanil- cikláz hatásá ra. ANF, pitvarin átrium ürftő faktor; GC, guanilát-cikláz (Lehet a cGMP-nek közvetlen, a cGMPdependens protein-kináztól független hatása is pl. cGMPdependens cAMP foszfodiészteráz)

akti válás jön létre, cGMP keletk ezik és a követk ezménye s klorid - és egyéb iontran szport -zavar ok miatt dian·h oea (hasm enés) lép fel. Eltérő szcrke zetü az ún. szolub ilis guanil átcikláz , amely a citopla zmába n lokaliz álódik. A fehérje két alegységből (77 és 70 kDa) álló hctero dimer. Mindk ét alegys ég karbox i-tenn inális régiója nagyfo kú szckve nciaho mológ iát mutat a memb ránban lokaliz álódó guanil át-cikl áz karbox í-term inális régióval. A szalub ilis guanil át-cikláz fonto tulajdo nsága, hogy hem proszt etikus csopo rttal müköd ik. A nitrog én-mo noxid (NO) és minde n olyan anyag , amelyből a sejtbe n NO keletk ezik, a szalubilis guanil át-cikl ázt aktivá lja és fokozott cGMP keletk ezéshe z vezet. A NO az enzim hem proszt etikus csopor tjával (a hem va sal) lép kapcsolat ba, nitroza bern jön létre, s - bár nem tudjuk pontos an miért - ez az enzim aktivit ás fokozó dásával jár. A NO nagysz ámú fizioló giás és patoló giás hatása inak hátteré ben ez a molek ulári kölcsö nhatás áll (lásd alább) . A cGMP - a cAMP -hez hasonl óan - protein kinázt aktivá l, amit cOM P-függ ö protei n-kiná znak (prote in-kin áz G) hívunk (lásd még 467. oldalt) . Szubs ztrátja i között több olyan ioncsa torna (pl. fe21 szü ltségfüggő Ca -csato rna) és transz portfe hérje 1 2 (pl. Na -Ca + cseretr anszpo rter) van, amellyel mal párhuz agyaráz ható a cGMP -szint emelk edésse 2 mosan , simaiz mokba n észlelt [Ca +] 1-csökk enés. Ez lehet a molek uláris mecha nizmu sa az érfal simaizo m-rela xációj ának, ami minde n olyan esetbe n létrejö n, amiko r a guanil át-cikl áz (akár a partiku láris, akár a szolub i lis) aktivá lódik (pl. ANF vagy NO hatásá ra). Létezi k olyan speciá lis jeltov ábbító rendsz er is, amely nek működése során az extrac ellulár is jel nem a citoszo l cGMP szintjé nek a növek edését , hanem éppen ellenkezőleg a cGMP szint csökk enését idézi elő. Ez a rendsz er a fényt érzékelő retinapálc ikákba n találha tó. Ezekb en a sejtekb en (sötétb en) a cGMP nyuga lmi konce ntráció ja nagyságren dekke l magas abb mint a többi sejtekb en általában és a cGMP közve tlenül (nem a protein kináz G segítsé géve!) egy kation csator nát tart nyitva, annak egyik fehérj ekomp onensé hcz kötődve. A sejtme mbrán nyuga lmi polari zációj át (a memb ránpot enciál aszok ásos - 70 mV helyet t - 30 mV) az ezen ioncsa tornán beáram ló é a pumpa enzim ek segítsé gével a sejtből eltávo lított ionok által terem-

484

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

EXTRACE LLUL ÁRI J ELEK RECEPT ORAl ÉS A J ELÁTVlTELI 1ECHAN IZMU OK

tett egyensúly határozza meg. Fény (fotonok) hatására (itt nem részletezett mechanizmus segitségével) a pálcikák külső korongjában el helyezkedő rodopszin aktiválódik. A rodopszin a heteratrime r G- fehérjék családjába tartozó G, (transzducin) segítségéve! aktivál egy specifikus cGMP-foszfo diészter ázt, amely a cGMP-t 5' GMP-vé hidrolizá lja. A cGMP- zint csökkenéseko r az ioncsatorna záródik, de mert az ionpumpa tovább műkö­ d ik, az ionkoncentráció esőkkenése a plazmamembrán hiperpo larizációj át hozza létre. A retinapálcikák plazmamemb ránjában történő vá ltozás az alapja a fény érzékelésének .

A nitrogén-m anoxid keletkezése és jelentősége A nitrogén-manoxid (NO) a legkisebb és az e l ső gáz halmazállapotú mo lekula, amelyről az utóbbi években igazolták, hogy fontos mediátor és neurotranszmitter funkciót tölt be és jelentőséggel bír a cardiovascularis rendszerben, az immunfolyam atokban és az idegrendszerben. A terápiában régóta értágítóként használt nitrovegyületekről beigazolódott, hogy hatékonyságu kért a szervezetben be-

NH2

l ő Jü k keletkező

NO a felelő . In vivo a NO a sejtekben argininből keletkezik a nitrogén-oxi d-szintáz (NOS) hatására. A reakció az 5-33. ábrán bemutatott módon, két lépésben megy végbe, melynek során Nco-01-l-L-arginin köztitermék keletkezik. A reakcióban az arg inin guanidincsoportján oxidáció történik, a reakció végeredmény e a NO mellett citrullin keletkezése. Az oxidációban öt kofaktor vesz részt: a hem, NA DPH, FA O, FMN és a tetrahidro-bio pterin. A NOS klónozá a és a szerkezetvizsgálat alapján azonosították azokat a szekvenciáka t, amelyekhez a kofaktorok k ö tődnek. (Jelentős szekvenciaho mológia van a NOS és a eitekrom P450-reduktáz között.) A nitrogén-oxid -szintáz konstitutív és indukálható formában fordul e lő. Konstitutív enzimet, vagyis amely pennanen en része egy sejt enzimkészletének az endothelsej tekben és az idegrendszerben találtak. Indukálható enzim van a makrofágokban, aho l nom1álisan nincs detektálható mennyiségbe n jelen, csak stimulusra - citokinek vagy bakteriális lipopo liszacharid endotoxinok hatására - a stimulust követő 2-4 órán belül keletkezik. Bár kezdetben azt hitték, hogy indukálható NOS csak a makrofágokban található, kiderült,

NH2

l

l

C = NH

C = N - OH

NH

NH

l

l

l

NADPH

(CH2b

l

l

(CH2h

ov. 1/2 NADPH

NH2

l

C= O

l

NH NO

+

l

l

(CH2h

l

HC - NH2

HC - NH2

HC - NH2

COOH

COOH

COOH

l

l

L-arginin

l

Nv-OH- L-arginin

citrullin

b HEMKÖTÖ DOMÉN

FAD

l NADPH l

l

p

5-33. ábra. A nitrogén-mono xid-szintáz által katalizáll reakció (a) és az enzim en a kofaktor cAMP -függ ő foszfo riláció helyének a sematikus ábrázolása (b). Rövidítés: CAM, kalmodulin

kötő h e lyek ,

valamint a

PLAZ~IAMEM BRÁ - RECEPTOROK ÉS J ELÁTVITELl M ECHAN IZM USOK

hogy ok más szövetben, pl. a májban és az endothelsejtekben is jelen van. Jelentösen különbözik a konstitutív és az indukálható enzimek rcgulációja. Az agyban és az endothelsejtek ben az enzim Jegfonto abb sti mulá2 Jója a kalcium; a Ca +- ka lmodulin a NOS-hoz kötödik és aktiválja az enzimet O lyan stimu lusok 2 tehát, amelyek a citoszol Ca ' -szintjét eme lik, az endothelsejtekben és a neuronokban (azokban, amelyek rendelkeznek NOS enzimrnel) NO- zintézist indítanak cl. Ezekben a sejtekben a kalmodulinantagonis ták (pL tri fl uoperazin) a NO szintézisét gátolják. Az indukálható NOS aktivitása nem függ az 2 intracelluláris Ca +-tól, annak ellené re, hogy az enzim szorosan köti a ka lmodulint. (Szemben a kons2 titutív enzimrnel, amely csak a Ca ~-ka l modul in kornplexet köti.) Ha egyszer a NOS megszintetizá lódott, a sejtekben permanens NO-szintézis történik.

lumen

a€etilkolin bradikinin trombin adenin nukleotidek

• endothelsejt

A nitrogén-oxid számos enzimme l kölcsönhatásba lép, amelyek vasat tartalmaznak. Jól ismert a guan ilát-cikláz aktív centrumában lévő

.. ..

l

Arg : (i;. • [ca2+]-+ Ca2+_kalmodulin -+ NOS

N

cGMP-függő

21

A NOS-t prote in-kinázok (A, C, G és Ca - kalmodulin függö) foszforilá lják, ami a katal itikus aktiv itást csökkenti . A NO-szintézis kom petitív gátlói az argininanalóg ok (amelyekben a guanidincsoportban különbözö szubsztitúciók vannak), amelyekhez nagy terápiás reményeket fűznek. A NO gáz halmazállapo tú molekula és a keletkezés hel yéről diffúzióva l j ut e l a körn yező sejtekhez. Hatásának erőssége és tartama attól függ, hogy milyen távolságra diffu ndál. A NO fé lélctideje általában l 0-30 s, mert a sejtekben és a keringésben gyorsan átalakul. A keringésben többek között az oxihemoglobi nnal, a sejtekben az ox igénnel és oxigén szabad gyökökkel reagál és nitritté, illetve nitrá ttá alakul.

...__ _ ( Arg ) NOS ..... J indukció NO

~ .

se]tm

1

protein-kináz

ff \

RELAXÁCIÓ

5-34. ábra. Simaizom-relax áció az érfalban NO hatására. Az endothelsejtekben a konstitutív NOS-t (nitrogén-monoxidszintázt) receptorstimuláció aktiválja. A NOS makrofágokban és endothelsejtekben indukálható. (Arg, arginin; NO, nitrogén-monoxid; sGC, szolubilis guanilát-cikláz)

486

)))))))))))))))))))))))}))))))))))))))) ))))>

EXTRACELL ULÁRIS JELEK REC EPTORAl ÉS A JELÁT VITELl MEC HANIZM USOK

hem prosztetikus csoporttal történő kölcsönhatása és a következményes enzimaktiválás. Ez azért érdemel külön kiemelést, mert megmagyarázza a NO vaszkuláris hatását. Az érfal endothelsejtjeiben a NOS akti válódik, amikor az intracelluláris (Ca 2 t] emelkedik és a létrejövő Ca 2 - kalmodulin komplex a NOS-hoz kötő­ dik. Az argininbő l keletkező NO a környező simaizomsejtekbe diffundál, ahol aktiválja a szolubil is guanilát-cikláz enz imet A létrejövő simaizom-relaxác iónak jelen ismereteink szerint az a legvalószínűbb oka, hogy a cGMPfüggö protein-kináz hatására csökken a [Ca2 ]i. Az endothelsejtekben számos stimulus 1P3kelctkczésen (vagy közvetlen Ca2+-beáramláson) keresztül Ca2'* -szignált okoz, közülük elsőként az acetilkolin hatása volt ismert. Hosszú időn keresztül csak EDRF (endothel-dcrived relaxing factor)-nak nevezték azt a feltételezett anyagot, ami az acetilkolin hatására az endothel ejtekből felszabadul és érfal-relaxációt okoz. Erről az anyagról bebizonyosodott, hogy azonos a NO-dal. NO felelős a terápiában régóta használt értágító nitrovegyületek (nitroglicerin, nitromint tb.) hatékonyságáért is, amelyekbő l NO keletkezik és a fenti mechanizmussal az érfalban simaizom-relaxác iót okoznak. Az endothelsejtekben bakteriális endotoxinok hatására a NOS indukálható is, amelynek aktivitása nem függ a Ca2+-tól, hatása hosszan tartó, s szerepe van az endotoxin shockban kialakuló súlyos vémyomásc ökkenés kialakulásában (5-34. ábra) .

Tirozin-kináz-receptorokkal működő jelpályák és a protoonkogének A soksej tű, differenc iált sej teket tartalmazó szervezetek számára a l apvető fo ntosságú, hogy sejtj eik a meg felel ő időben és módon szaporodjanak, és funkc iójuknak megfc le löen specializálódjanak. Az e célnak meg fe lel ő szabályozás, túlnyomórészt, ugyancsak extracelluláris kémia i je lek segítségével történik. A sej tpro liferáció és differenc iá lódás szabá lyozásában részt vevő kémia i j elek közé tar-

toznak a növekedési faktorok (growth factor) pl. az epidcrmáli s növekedési faktor (EGF), a trombocitákból származó növekedési faktor (PDGF), a tibroblaszt növekedési faktor (FGF), a neurotrofinok (pl. az NG F), vagy a metabol ikus hatásai mcllctt növekedési fak torként is i met1 inz ulin stb. A sej tproliferáció és -differenciá lódás mc llett ezen anyagok a sejt mozgását, illetve alakját i befolyásolhatják. A növekedési faktorokat a mesterségcsen fenntartou sejikultúrák viselkedésének a vizsgálatakor fedették fel. Annak ellenére, hogy mindcn s7ükséges tápanyag rende lkezésre állt, a kü lönbözö típusú állati ejtek csak akkor sokasodtak, ha a tá ptalaj hoz szérumot is adtak. A szérumból elkülöníthetök voltak azok a sejtproliferációt (differenciálódási, túlélést, migrációt stb.) stimuláló extracelluláris kémiai jelként szolgáló, polipeptid természetű anyagok, amelyeket összefoglaló néven növekedési faktoroknak nevezünk. Ezek az anyagok a keringésben é így a szérumban is jelen vannak, azonban az csetek többségében az érintett sejtekkel szoms.~:édos sejtek által termelt lokális kémiai mediátorokként viselkednek. A felsorolt növekedési faktorok (EGF, PDGF, NGF, FGF, inzulin stb.) egy-egy szerkczctilcg többé-kevésbbé ha onló tagokból álló családba tartoznak.

Jelen fej ezetben növekedési faktorokként említjük azokat a kémiai jeleket, ame lyeknek plazmamembrán-rec eptora saját tirozin-kináz-aktivitással rendelkezik. A növekedési fa ktorokéhoz hasonló jellegű hatást gyakorolha tnak a sejtekre a citokineknek nevezett anyagok (pl. az interleukinok, interferonok stb.) is. A citokinek plazmamembrán-receptora általában nem rende lkezik saját tirozin-kináz-aktivitással és a citokint spcc itikusan kötő polipeptiden kívül álta lában még (legalább) egy másik po lipeptidlánc is szükséges annak a komplexnek a kia lakulásához, amely a c itokin kötődése után a sej t be lseje fe lé a j elátvite lt elind ítja. Tirozinkinázok a citokinek j e lpá lyáiban is szerepelnek, azonban ezek a tirozin-kinázok nem tartoznak az integráns membránfehérj ék közé. A Janus arcú protcin-kinázok (JAK) ismertek an·ól, hogy citokinek j e lpályarendszeré ben vesznek részt. A növekedési faktorok je lpá lyarendszerében még sok az ismeretlen tén yező, ezért csupán annak a mechanizmusnak az ismertetésére szorítkozunk, amelynek elve ma már általánosnak látszik. Ez a mechanizmus a legjobban tisztázott az EGFrecepto r segítségével induló jelátvitel esetében. Az EGF receptora tipikus pé ldája az egy transz-

K

z

a

PLAZ~1AMEMBRÁN-RECEPTOROK ÉS JELÁTVITELJ MECHANI ZMUSOK

membránrégióval rendelkező tirozin-kináz-receptoroknak (5-35. ábra), amelyekbő l e könyv irásakor már több mint ötvenet ismerünk. A2 extracelluláris doménen kötődö EGF két receptormolekula dimerizációját hozza létre, a dimerizáció elengedhetetlen feltétele a jelpálya aktiválódásának. A dimerizált receptor intracellu láris doménjén autofoszfori láció segítségével bizonyos tirozin oldalláncok foszforilá lódnak (a két receptormolekula egymást foszforilá lja), a foszforilált tirozin oldalláncokhoz különbözö fehérjék kötődnek, amelyek a jelet továbbítják. Azok a fehérjék, amelyek a foszfotirozinokhoz tudnak kötödni SH2 doménnel rendelkeznek (lásd protein-kinázoknál). A tirozin oldalláncok körü li am inosavszekvencia határozza meg, hogy melyik foszfotirozin oldallánchoz milyen SH2 dornénnel rendel kező fehérje kötődhet. Az EGF-receptoron legalább öt helyen foszforilálódik tirozin oldallánc, ha mindegyikhez másik fehérje kötödik, legalább ötféle irányban indulhat el a jel továbbítás. Ez is jellemzöen hozzatartozik a növekedési faktorok jelátviteli mechanizrnusához, a hatásuk többféle irány ban induló változások összességébő l jön létre (5-35. ábra). A növekedési faktorokra jellemző ajátságos jelátvitel egy jelentős részéért a ras GTP-kötő fehérje aktiválódása felelős. A r as gének (H-r as, K-ras és N-ras) 21 kDa nagyságú proteineket kódolnak, ez a p21ras, amely (hason lóan a heteratrimer GTP-kötő fehérjékhez) GTP-t és GDP-t is képes kötésben tartani, de csak a GTP-t kötő formája aktív. A ras fehérje zsírsav oldallánccal a plazmamembrán belső oldalához van kihorgonyozva és müködését más fehérjék segítik e lő. Nem rendelkezikjelentős saját GTPáz (GTP-t GDP-re és anorganikus foszfátra hidrol izáló) aktivitással (a heterotrimer G- fehérjéktől eltérően), GTP-t hidrolizáló aktivitását speciáLls fehérjék idézik elő. Ilyen típusú fehérjeként ismert eddig egy GAP (GTPázt aktiváló protein) nevű fehérje, ill etve bizonyos sejttípusokban egy neurofíbromin nevű febé tje. Ezek a fehérjék a p21 ras inaktiválódásában játszanak szerepet A p2fas aktiválásához olyan fehérje szükséges, amelynek hatására a GDP disszociál a ras fehérje felszínéről, ilyenkor a disszociált GDP helyére a sejtben nagyobb koncentrációban jelen levő GTP kötődik. Ezt a folyamatot cserélő (exchange) fehérjék irányítják, ilyen fehérje pl. az SOS-nek

)))))))))))))))}))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

487

a

l

COOH

l

HOOC

l

COOH

inzulin-R

EG F-R

l l

COOH PDGF-R

b

membrán

992 1068 1086 1148

ll 73

5-35. ábra. Az EGF receptor szerkezete. (a) Az EGF (epidermális növekedési faktor), az inzulin és a trombocitából származó növekedési faktor (PDGF) szerkezetének hason/6 elemei. A tirozin-kináz domének piros, a transzmembrán domének fekete négyszögekkel vannak jelölve. A csíkos négyszögek ciszteinben gazdag doméneket, az oválisok immunglobulinokra emlékeztető doméneket je/ölnek. (b) Az EGF-receptor (a receptornak csak az intracelluláris részét ábrázoltuk részletesebben) foszforilá/t tirozinjaihoz kötő­ dö SH2 doménnel rendelkező fehérjék (PLC, foszfolipáz C; Grb2, kapcso/6 fehérje; PI-3K, foszfatidilinozitol 3-kináz) . A számok a tirozinok helyét mutatják a polipeptidláncban

488

)))))) ))))))>) ))))) ))) )) ))))»)))))) )) )) ))))

GTP

EXTRAC ELLULÁRJS JELEK RECEPTORAl ÉS A J ELÁTV lTELl MECHANIZMUSOK

GDP

membrán

inaktiv

aktivált

GDP

5-36. ábra. A p 21 ras GTP-kötő fehérje mű ködését közveti enül irányító fehérjék. A GDP-nek GTP-re történő cseréjét az SOS-fehérje, a GTPhidrolíziséta GAP (G TP-ázt aktiváló protein) seglti elő. A GAP-hoz hasonló aktivitása van a neurofibrominnak is

nevezett fehérje (5-3 6. ábra). Az SOS-fehérjén egy speciális, prolioban gazdag régió is található, amelynek a jelpálya aktiválódásában fontos szerepe van. (Emlékeztetőül : a heteratrimer G-fehérjék esetében a GDP-nek GTP-re történő cseréjét maga a hét transzmembrándoménnal rendelkező receptor segíti elő, amely közvetlen kapcsolatban áll a G-fehérjével.) Az aktiválatlan sejtben az SOS cserélő fehérje a c itaplazmában helyezkedik el és így nem jut a ras fehérje közelébe. A rendszer aktiválásának az a feltétele, hogy a cserélő fehérje a citoplazmából a ras közelébe helyezödjön át. Ezt egy kapcsoJó (adapter) fehérje, pl. egy Grb2-nek nevezett fehérje biztosítja (más kapcsaló fehérjéket is ismernek, amelyek analóg módon működnek) . A Grb2 fehérjén egy SH2 domén és két SH3 domén található (lásd protein-ki názok fejezetben). Az SH3 doménekkel a kapcsoló fehérje a cseré l ő fehérje (SOS-fehérje) speciális, prolioban gazdag régiójához tud kötődn i. Ez a kapcsolat már a citoplazmában is megtörténik hiszen az aktiválatlan sejtben mindkét fehérj e a citoplazmában található. A növekedési faktor receptorához történő kötő­ désekor bekövetkező változásoknak a lényege a transzlokáció, azaz a kapcsaló fehérjével összeköttetésben levő (Grb2 fehérje SH3 doménje- SOS-fehérje proliogazdag régiója közti. kölcsönhatás miatt) cseré lő fehérje a plazmamembránhoz kerül

citoplazma

EGF-receptor

proliogazdag része a SOS fehérjének

GTP

e

- - + GDP

_j 5-37. ábra. A Grb2 kapcsaló (adapter) fehérje szerepe a p21ras GTP-kötő fehérje aktiválásában. Az EGF-receptoron a pirossal jelzett rész a tirozin-kinázt tartalmazó domént mutatja, a fekete körökkel ellátottnyúlványoka foszforilá/t tirozin oldalláncokat szimbolizálják. A p21ms fehérje zsírsav oldallánccal van kihorgonyozva a plazmamembránhoz. Az EGF receptor aktiválódása dimerizációval j ár

»))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOROK ÉS JELÁ TVlTELl MECHANIZMUSOK

a p21 ras közelébe, és így aktiváini tudja a ras fehérjét. Ebben a transzlokációban van alapvető szerepe a receptor autofoszforilációja során kialakuló foszfotirozin oldalláncoknak és az ezek közül eg~'et (esetleg többet) felismerő kapcsoló fehérjének (Grb2 fehérje), amely SH2 doménjével kötő­ rlik a foszfotirozinhoz. A receptorhoz kötődö kapcsoló fehérje segítségével a cserélő fehérje is a plazmamembránhoz transzlokálódik, a ras fehérje aktiválásához szükséges helyre. ltt segít kicserélni a ras fehérjéhez kötött GDP-t GTP-re (5-37. ábra). A p21 ras GTP-t kötött formája aktivál egy különböző protein-kinázokból á lló foszfori lációs kaszkádrendszert (MAP-kináz kaszkádnak nevezik), amely végül egy sor különféle fehérje, közöttük transzkripciós faktorok foszforilációjának segítségével indítja el a növekedési faktorok által szabályozott folyamatokat (5-38. ábra). A kaszkád első enzime egy raf-nak nevezett gén által kódolt

szerin/treonin-protein-kináz. A raf protein-kináz aktiválódásához szükséges a p21 ras- GTP kötött formájával kialakul.ó komplex. A raf protein-kináz (nevezhetjük MAP-kináz-kináz-IGnáznak is) foszforíJál és ezzel aktivál egy sajátságos enzimet, ez a MAP-Icináz-kináz. A MAP-kináz-kináz kivételes enzim, amely specifikus szubsztrátján, a MAPkinázon (müogén aktivált protein-kináz), mind egy treonin, mind egy tirozin oldalláncot képes foszforilálni. E kettős foszforilációval aktiválódik a MAP-kináz. A MAP-kináz tulajdonképpen nem egyetlen enzim, hanem enzimcsalád, tagjait ERKnek (extracelluláris jelre reguláiádá protein-kinázoknak) is szokták nevezni. A MAP-kinázok vagy ERK-ek szerin/treonin-protein-kinázok, specifitás determinánsaik prolint tartalmaznak és szubsztrátjaik között további protein-kinázok, transzkripciós faktorok és más fehétjék találhatók (5-38. ábra). A MAP-kináz kaszkád aktiválódásának fontos szerepe van többek között az AP-l cisz-regulá-

plazmamembrán ..---. ~ protein-kináz C ..

MAP-kináz-kináz

'"!\

-

GTP

t

------til-•

l

l MAP-kináz

transzkripciós faktorok

más fehérjék

l

l

l

Ser/Thr

Ser/Thr

Ser/Thr

5-38. ábra. A MAP-kináz kaszkád aktiválódásának mechanizmusa

protein-kináz A

MAP-kináz-kináz

TyrP

proteinkinázok

489

MAP-kináz

490

))))))))))))»))))>)))»))))))))))))))))»))

EXTRACELLULÁRIS JELEK RECEPTORAI ÉS A JELÁTVITELJ MECHANIZMUSOK

ciós elemhez kötődö transzkripciós faktorok (fos és j un gének által által kódolt fehé1jék, lásd transzkripció szabályozása fejezetben) mííködésének szabályozásában. A MAP-kináz kaszkád elsősor­ ban a génexpresszió szabályozásában vesz részt. (A raf gén által kódolt protein-kinázzal induló MAP-kináz kaszkád az Erkl és Erk2 kinázok aktiválódásához vezet. Hasonlóan működő, de reguláció szempontjából ma még kevésbé ismert protein-kináz kaszkádból, amely más Erk-kinázokat aktivál, több is létezik). A növekedési faktorok receptorának autofoszfori lációja a receptororr több tirozin oldallánc foszforilációjához vezet, ezek mindegy ike dokkoló helyet létesít SH2-doménnel rendelkező, különböző feh érjék számára. Ezáltal az autofoszforilált receptorról egyszerre több jelpálya is elindulhat (Egyes receptorok esetében, a dokkoló helyek számának növelése céljából a receptor foszforilál egy másik fehérjét is. llyen például az ugyancsak tirozin-kináz aktivitással rendelkező inzulinreceptor, amelyről a jelpályák indulását az inzulinreceptor-szubsztrát foszforilációja segíti elő.) A p21ras GTP-kötő fehérje segítségével történő MAP-kináz kaszkád aktiválásorr túl, más utak is aktiválódnak. Ezek egyike az ugyancsak SH2doménnel rendelkező foszfolipáz C-y enzim által indított inozitol-lipid jelpálya, amely a már koráb21 ban ismertetett módon a citoszol Ca -szintjének átmeneti növekedéséhez és a protein-kináz C aktiválódásához vezet. A protein-kináz C (kül ön böző izoenz imei nek) aktiválódása több ponton is részt vehet a teljes j elpálya müködésében. Egyrészt a protcin-kináz C a ras fehérje kikerülésével is képes aktiváini a raf gén által kódolt protein-kinázt ésennek következményeképpen a MAP-kináz kaszkádot (5-38. ábra). Másrészt a protcin-ki náz C-nek saját magának is szerepe van a fos és j un (A P- l ) transzkripciós faktorok akti válódásának bonyolult, többszörös foszforiláció! és defoszforilác iót igénylő mechanizmusában. Mindczck a momentumok a protein-kináz C-nek az EGF jelpályarendszer aktiválódásának irányában ható (ú n. forward) fu nkció i. Ennek az enzimcsaládnak azonban jellegzetessége a duális szerep, szinte minden o lyan rendszerben, amelyben akti válódik, visszafelé ható (feedback) regu lációt is végez. Ennek tipikus példája az EGF-rcceptor protein-kináz C által katali záll foszforilációja és dcszcnzitizációja ligandjával szemben. Mindez arra mutat, hogy a növekedési faktorokjelpályarendszere i dőben nagyon finomao összerendezett, egymással párhuzamos, sőt egymással ellentétes fo lyamatokat is magába n foglaló láncolata a kiilönböző molekuláris eseményeknek.

A különböző jelpályák közötti kölcsönhatás (cross-talk) szép példája a raf fehérje cAMPdependens protein-kináz által katalizált foszforilációja. Ez a foszforiláció gátolja a MAP-kináz kaszkád aktiválódását, és magyarázatul szolgál arra a jelenségre, hogy miért van a cAMP-nek igen sok sejttípusban antiproliferatív hatása. A tirozin-kináz receptorral indított jelpályákorr kívül ismertek más olyan jelpályák is, amelyek a Grb2 adapter fehérje segítségével a Ras GTP-kötő fehérje aktiválásához és így az Erk l/Erk2 MAPkipáz kaszkád aktiválásához vezetnek. Néhány, 7 transzmembrán-régióval rendelkező receptor (pl. bombezin vagy a trombin receptora) szintén képes a Ras aktiválására és így prol iferációs jel képzésére. Ezekben a jelpályákban a G fehérje py alegysége egy citoplazrnás tirozinkinázt (az src-kináz családjába tartozó enzimet) aktivál, és így indul el a foszforilált tirozinról az SH2 doménnel rendelkező adapter fehérje segítségével a Ras aktiválása. Itt emlitjük meg, hogy a sejt- extracelluláris matrix kapcsolatot biztosító integrinek is képesek citoplazmás tirozin-kinázok segítségével a Ras aktiválására. Ugyancsak fontos komponense a tirozin-kináz receptorról induló jelátvitelnek a foszfatidilinozitol-3-kináz (Pl 3-kináz) segítségével aktiválódó jelpálya. (Ezt az enzimet a regulátor alegységén levő SH2-domén irányítja a receptorhoz). A Pl 3-kináz foszfatidilinozito l-4-foszfátból nem az inozitol-lipid jelpálya ismert foszfatidilinozitol4,5-biszfoszfátját, hanem foszfatidilinozitol-3,4biszfoszfátot hoz létre, illetve foszfatidilinozitol4,5-biszfoszfátból foszfatidilinozitol- 3,4,5-triszfoszfát képződését katalizálja (5-39. ábra) . A PI 3-kináz membránban megjelenő produkturnai olyan fehérjék membránhoz való kötődését és aktiválódását idézik elő, amelyek ún. PH dornénnel rendelkeznek. Az ilyen módon aktiválódó jeltovábbító utak egy része a citoszkeleton, illetve bizonyos sejtkompartmentek változásait idézik elő (pl. az inzulinreceptor esetében a Pr 3-kináz aktivitása szükséges a GLUT-4 glukóztranszporter plazmamembránba történő transzlokációjához). Ezeknek a változásoknak a pontos molekuláris mechanizmusa még nem ismert. Ismert azonban az a folyamat, amellyel a PI 3-kináz aktiválódása létrehozza az úgynevezett "túlélési jel"-et.

PLAZMA 1EMBRÁ -RECEPTOROK É JELÁTVITELJ MECHANIZM SOK

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

5·39. ábra. A foszfatidilinozotol-3- kináz termékei

491

~o CH2 -O - C-R1

o

~

l

R2 - C- O-CH

~

l

CH -O - P 2

l

0 O

o-

,lj

~

o

O- P - O

-

l o~o CH2 - O - C-R 1

o

~

R2 - C - O -

l l

0 ~ CH - O-P - O

CH

2

l

o·

A "túlélési jel" fogalma részletesebb magyarázatot igényel. Megértéséhez tudni kell, hogy a magasabbrendű . soksejtű eukarióta szervezet sejtjei erősen szocializálódtak. Ezek között a sejtek között fiziológiás körülmények között nincs kompetieié n alapuló szelekció, az egyes sej tek élete, szaporodása vagy halála a teljes organizmus érdekeinek van alárendelve. Nagyon pontos szabályozórendszer határozza meg azt hogy az egyes sejteknek mikor kell szaporadniuk (erre szolgáló jelzés a növekedési faktorok megjelenése), de

ugyanakkor arra is van saj át, szabályozott molckuláris programjuk, hogy "öngyilkosságot" kövessenek el, ha a teljes organizmus érdeke ezt így kívánja. A sejthalálprogramo t beindíthatja egy kül ső jel (ligand) vagy a DNS súlyos, nem kij avítható sérülése, sej tkultúrákban meg lehet figyelni a növekedési faktorokat tartalmazó szérum megvonásakor stb. A különböző kiindulási mechanizmusok kül önböző utakon caspase-nak (ciszteinaszpartát-proteáz) nevezett speci ál is proteáz enz imek aktiválódásához vezetnek, amelyek felel ősek

S3S

·,

492

))))))))))))))))))))))))))))»>»>»»)))H)

EXTRACELL LÁRJS J ELEK RECEPTORAl É A JELÁTVITELJ M ECHANIZM USOK

mitokondrium

2

citokróm c ....___---..

caspase aktiválás

protei

kináz B mitokondrium

l

foszfoprotein-foszfatáz

5-40. á bra. A .túlélési jel". A: a protein-kináz B aktiválódása a foszfatidilinozitol3-kináz termékeinek megjelenésekor. b: A Bad fehérje foszforilációja megakadályozza a citokróm c kiáramlását a mitokondriumból

a sejhalált okozó végső lépésekért (A programmozott sejthalá l jel entőségéve l és mole kuláris mechanizmu aival az 5.3 fejezer foglalkozik részlete en.) A sejthalálprogram egyik fontos lépése a citokróm c kiáramlása a mitokondriumból. A citoleróm c a citoszolban caspasc enzimek aktiválódását idézi elő. Minthogy a sejtben létezik o lyan molekuláris program, amelyik a citokróm c halált okozó kiáramlásához vezethet, léteznie kell egy

olyan mechanizmus nak is, amelyik ezt a programot csak speciális esetben engedi müködésbe lépni, a fiziológiás sejtpro liferáció közben megakadályozza, hogy ez megtörténjen. Ez a mechanizmus a " túlélési j el". A fi zio lógiás sejtproliferáció egyes fázisaiban a sej t időröl-időre megkapja ezt a jelet, mintegy biztosítékául annak, hogy szaporodása a szervczet egésze szempontjábó l is hasznos. A " túlélési jel" lényegét tekintve egy fehérje

PLAZ 1AMEM BR . N-RECEPTO ROK ÉS JELÁTVIT ELl MECHANI ZMUSOK

foszforilációja, amelyet a protein kináz B katalizál. A protcin-kináz B PH-domén nel _rendelkező enzim, amelyet egy másik, ugyancsak PH-domén nel rende lkező protein-kin áz fo zfori lá l és ezáltal aktivál. Amikor a foszfatidili noz itol-3-kináz aktiválódik és a membránba n megjelenne k termékei (a foszfátidilinozitol-3,4-b iszfosztát, illetve foszfatidilinozitol-3,4,5-tri z foszfát), a protein-kin áz B a membránhoz kőtőd ik , aho l találkoz ik az ő t aktiváló, ugyane ak Pl 3-kináz függő kinázzaL Az aktivált protein kináz B foszforilá l egy Bad nevű fehérjét és ezzel gátolja annak citokróm c kiáramlást előidéző hatá át. A Bad fehérje foszfori lá latlan fom1ája a Bel fehérjéhez kötődve e l ő idézi a cirokróm c kiáramlását. A Bad fehérje i dőről - időre (foszfoprote in fosz fatázok hatására) defoszforiláJódik. ezért a sejtproliferáció során ismételten foszforilátni kel l. A " túlélés i jel" a Bad fehérje foszforilációja (5-40. ábra).

A növekedési faktorok jelpályaren dszerének megismerés e tette v ilágossá a protoon kogének, illetve onkogének szerepét a rosszindula tú daganatok kialakulásá ban. A rosszindula tú daganatsejtré történő átalakulást bizonyos gének (együttes) szomatikus mutációja hozza létre, az egye szomatikus mutációk némelykor öröklött, prediszpon áló mutációkho z társulnak. A növekedési faktorok jelátvivő mechanizm usában szerepl ő fehétjéket kódoló gének a protoonkog ének, amelyek mutációja, meghibásadása onkogénné történő átalakulásh oz vezethet. Az onkogének által kódolt fehérjék aktivitása kontrollála tlanná válik, és olyanko r is növekedési jelet közvetítene k a sejt felé, amikor nem volna szabad. A növekedési faktorok jelpályája sz inte minden tagjának megfelelő génnek ismert az onkogén változata is (retrovírusokban is megtalálható onkogének ), kezdve magától az extracellulá ris jelet képviselő, polipeptid termésLetű növeked ési faktortól, a növekedési faktor receptor á n (v-er bB) , a ras GT P-kötő fehérjén, a raf által kódolt proteinkinázon és más protein-kin ázokon keresztül a folyamatba n részt vevő fos és j un transzkripciós faktorokig (5-8. táblázat). A ras protoonkogén mutációja következté ben kialakuló

)) )) )))))) )) )) )))) )))) )))) >))))))))) )) )) )) )))) )))) )) )) ))))))

493

állandóan aktivált ras fehérje pl. a humán tumorok kb. 30%-ában az egyik összetevője a daganatsej tek kifej lődését előidéző változásoknak. A rosszindulatú daganat ejtté történő átalakulás azonban nem egyetlen gén mutáeiójának az eredménye, hanem majdnem mindcn e etben többszörös mutáció következménye. A mutáció nem csupán a protoonkogének aktiválódásá t jelenti, igen nagy szerepetjátszik a tumorszupp resszor gének inaktiválódá sa is. A tumor szuppresszor gének olyan fehér:jéket kódo Inak, amelyek a sejtproliferáció fiziológiás kereteinek biztosításában vesznek részt, pl. a sejtciklus G l/S határon levö kontrollpontjain késleltetik vagy gátolják az S fázisba történő átmenetet (lásd DNS-ről szóló fejezetben). Ezeknek a tumorszuppresszor géneknek (pl. a p53 fehérjét kódoló génnek, illetve a p 16 fehérjét kódoló gén nek) a deléc iója, az általuk kódolt fehérje hiá nya vagy rossz funkciója nagy gyakorisággal szerepel a tumorsejt k.ialakulá ának egyik összetevőjeként (Irodalmi adatok 50, illetve 70%-os gyakoriságúra becsülik a p53, illetve p 16 gén hibás változatának jelentétét a különbözö humán tumorokban.)

A növekedés i faktorok jelpályaren dszerét képező fehérjék közőtt is van olyan, amelyet tumorszupp resszor gén kódol, pl. a ras GTPáz

r 5-8. táblázat. A növekedési faktorok jelátv~ rendszeréből ismert néhány fehérje és az azt 'kódoló protoonkog én daganatkeltő retrovíru. sokból is ismert onkogén változata

. l --

~----~

A fehérje funkciója

r t~o~bocitából származó

~

=

növekedési faktor (PDGF) EGF receptortehé1e

[ p21 '85

v-sis

-

__ ,

---j v-erbB

GTP-kötő fehérje

fos transzkripciós faktor jun f transzkripciós faktor src-kináz (nem receptor protein-tirozin-kináz) --

v-ras (többféle vál~zata is ismert) v-raf

raf-protein-kináz (MAP-kináz-kináz-kináz)

l

t-- - l

l

__j

-

l

Vírus-onkog én elnevezése

j

-t

____

l

v-fos v-jun

j v-src ..__-

l

494

)))) )) )))))))))) )))) )))))))))) ))))))))))))))

EXTRACELLULÁRIS JELEK RECE PTORAI ÉS A JELÁTVITELI M ECHANIZM USOK

aktivitását fokozó (a GAP-fehérjéhez hasonló aktivitással rendelkező) és így az iTiaktiválódását előidéző neurofibromin nevű fehérjét kódoló NF 1 gén. Ennek a génnek a ki esése okozza a neurofibromatosis nevu, torzító (elefántember) daganatos megbetegedést. Itt kell megemlítenünk, hogy bizonyos protein-

kinázokra vagy foszfatázokra ható vegyületekkel is elő lehet segíteni tumorok kialakulását, ilyen tumorpromoter hatása lehet a protein kináz C-t petmanensen aktiváló forbotésztereknek vagy a PP2A és PP 1 faszfoprotein-foszfatázokat gátló okadánsavnak.

A fejezet megírásával kapcsolatban tett javaslatokért és kritikai észrevételekért a Dr. Buday Lászlónak.

szerzők

köszönetet mondana k

Ajánlott irodalom Cell S ignaling in Bruce Alberts, Dennis Broy. Jul ian Lewis, Martin Ra ff, Kei th Roberts, James D. Wartson: Molccular Biology of the Cell. Garla nd Publishi ng Inc., New York and London, 1994 Signa ll ing by Receptor Tyrosi nc Kinases by Fantl W. J., Johnson D. E .. Willia ms L. T. in A nnua l Rev. of Biochem. 1993, 62,

453-48 1. Be rridge M. J.: l nosi tol Trisphosphate and Calcium SignaJii ng. Nature, 361, 3 15- 325. 1993 Strader C. D., Fong T. M., Tota M. R., Underwood D.: Structure and Function ofG-protein-Coupled Receptors. Ann Rev. Biochem. 63, 101 - 132, 1994 Hepler J. R. and Gi lma n A. G.: G-proteins Tre nds in Biochem. Sci. 17.383- 387, 1992

l

Sejtmagreceptorok

.2.

Fésüs László

Azélőszervezet

minden megnyilvánulási formáját gének kifejeződése, gének által kódolt fehérjék funkciói irányítják és teszik lehetövé. A génkifejeződésegyik meghatározó molekuláris történése az arról készült mRNS szi ntézise, transzkripciója RNS-polimeráz segítségéveL A transzkripció szabályozása specifikus kölcsönhatások eredménye cisz-módon ható DNS-szekvenciák (promoter és enhancer elemek) és az azokhoz kötődö, transzható szabályozó fehérjék között. A transzkripciót szabályozó transzkripciós faktorok általában a sejtmagban, a szabályozandó gének fehé1jét kódoló részein kívül eső speciá li s DNS-szakaszokhoz kötődve indítják el, illetve gyorsítják vagy lassítják az RNS-szintézist. A transzkripciós faktorok hatását hozzájuk tapadó fehé1jék, poszt-transzlációs módosítás (pl. foszforiláció) és Iigandok kötődése befolyásolja (aktiválja vagy gátolja). Azokat a transzkripciós faktorokat, amelyeket kis molekulatömegű, a sejtmembránokon áthatoló, így a sejtmagba könnyen bcjutó lipofil természetű anyagok szabályoznak, magreceptoroknak nevezzük.

A szteroid-tiroid0-vitamin-retinoid "magreceptor" család A génkifejeződés szövet- és funkc ióspecifikus szabályozásának meghatározó formája kisméretű lipofil hormonok segítségével történik. A szteroidok, tiroidok, retinoidszánnazékok és a D-vitamin

potens szabályozói az egyedfej lődésnek, a differenciálódásnak és sok más szöveti funkciónak. E hormonokat már a század korai évtizedeiben izolál ták, radioaktív formáik segítségével a 60-as évek végére az is kiderült, hogy a sejtmagban fehérjékhez kötődve hatnak, feltehetően transzkripciót szabá lyozva. Az e l ső ilyen két magfehérjét, a glukokortikoid- és ösztrogénreceptorokat 1985ben klónozták és határozták meg elsőd l eges szerkezetüket Ezt követően orra írták le valamennyi zsíroldékony hormon (beleértve a hormonhatású vitaminszá rmazékok) magrecept01·át és kiderült, hogy közös szerkezeti sajátságaik alapján egy molekulacsaládba sorolhatók. Valamennyi családtag rendelkezik DNS-kötő doménnel (5-41. ábra), amely a receptort specifikus DNS-szekvenciákhoz, a hormon válaszadó e lemhez irányítja; ezek az elemek vagy fordítottan ismétlődő (palindróm), vagy közvetlenül ismétlődő szekvenciák (5-42. ábra). A DNS-kötő domén e magreceptorcsalád mit1den tagja esetében két, szekvenciájában az evolúció során nagymértékben konzerválódott Z n-ujjat tartalmaz (5-43. ábra); ezek egyike az ismétlődő szekvenciák valamelyik feléhez való DNS-kötésért felelős régiét tartalmazza, a másik a mo leku la dimerizációj áért felelős. A receptor C-temünális végén található a ligandkötő domén, amely a hormon felismerést és ebbő l következöen a fiziológiás válasz specificitását és szelektivitását biztosítja. Leegyszerűsítve azt mondhaljuk, hogy a l igandkötö domén megkötve a hormont, a receptor molekulát transzkipciót aktiváini képes állapotba hozza. A hormonhatás specificitásának másik leté-

496

EXTRACELLULÁRJS JELEK RECEPTORAl ÉS A JELÁTVITELl MECHA IZM USOK

))))))»))~>))))))))))))))))))))))))))))))))

RECEPTOR NEVE

RECEPTOR SZERK&ZE1J1E domének DNS-kötő

variábilis domén

ligandkötö domén

domén

Glukokortikoid

Je

Nl

<15%

~'IMI~

<15%

<15%

&~ <15%

r'ki'1

l <15%

~ll~

57%

Mineralokortikoid

55%

Progeszteron

30o/o

Ösztrogének

<15%

r

'l

D-vit amin

17%

Tiroidhormon

15%

Ret insavreceptor a

5-41 . ábra. A klasszikus hormonreceptorok szerkezet ének összehasonlítása

8? 6 5~32'12

3 4 5678

GRE ÖRE TRE

DRE

5-42. ábra. Példák specifikus hormon (G, glukokortikoid; Ö, ösztrogén; T, tiroid; D, D-vitamin) válaszadó elemek (RE) DNS-szekvenciájára

teményese a receptor DNS-kötő Zn-ujjában található szekvencia, amely biztosítja, hogy csak az ennek megfel e l ő DNS-válaszadó elemmel lépjen az adott receptor kapcsolatba. A szerkezeti sajátságok megismerése és sok kísérletes munka alapján ma már pontosan tudjuk a magreceptorok részvételével létrejövő honnonális hatás molekuláris részleteit. Ez a szteroid hatás példáján bemutatva a következőképpen foglalható össze. A sejtek citoplazrnájában található glukokortilwid-receptor Zn-ujjait lefedik, és ezzel inaktív állapotban tartják (5-44a ábra) a hozzájuk kötődö hősokk-febérjéket (bsp 90). A sejtbe diffundáló kortizai kötődik a ligandkötő hely hez, aminek következtében a receptor leválik a hősokk­ fehérjéről és a sejtmagba kerül. Ott az egyik Zn-ujjával kapcsolódik a szabályozandó gének glukokorükoid-receptor specifikus válaszadó elemének egyikfeléh ez, mig a másik félhez egy másik

ujjszerü egység

ujjszerü egység

dimerizációs régió

DNS-kötő

aminosavak

kapcsaló régió

5-43. ábra. Az ösztrogénreceptor DNS-kötö régiója két Zn-ujjának elsődleges szerkezete

EXTR ACELL ULÁ RIS .JEL EK RECEPTO RAl ÉS A J ELÁTV ITELl MECHAN IZMUSOK

498

a

szteroidreceptor

kerti7o1

COOH

szteroidreceptor

)

COOH

b

RNS-polimeráz

J/

J PROMOTER TBF: TATA-hoz kötödö fehérje (obligát transzkripciós faktor-komplex) K: kortizai

_j S-44. ábra A kortizol hatásmechaniz musának molekuláris szintű magyarázata. (a) A kortizol kötődik a citoszó/ban található receptorhoz és a sejtmagba tereli azt. (b) A kortizo/t kötött receptor dimerizálódik, hozzákapcsolódik a válaszadó e/emhez, majd transzaktiválja a szteroid specifikus gén promóter régióját és annak részeként az RNS polimerázt

EJTMAGRECEPTO ROK

)).)))))))))))))) )))))) ))))))))))))))))) ))))))))))))})))) )))))))))))))))))

kortízolt kötött glukokortikoid-r eceptor kapcsolódik Zn-ujja igénybevétel ével. A két receptor molekuJa második Zn-ujjai k segitség ével dimerizálódik. Ezt követően a DNS-hez kapcsol ódó, kortízolt kötő, dimeriz álódott receptor molekul ák konfom1ációja olyan módon változik meg, hogy felszínükön negatív töltésű aminosa v-oldall áncok jelennek meg, amelyek kapcsolatba kerülnek a gén promoter régióján ak fehérjek omplexe ivel (5-44b ábra). Ennek eredmén yeként lranszak tiváció történik, vagyis az RNS-po limeráz a promote r komplex aktiválásának eredmén yeként elindítja a t-anszkripciót, a kortizol által szabály ozott gének (ilyen egy adott sejtben akár több tucat is lehet) mRNS-ének átírását. A legfrissebb eredmén yek szerint a szteroid hormonok nemcsak DNS-hez kötődve szabályozhatják a génkifejeződést. Hatásuk másik bizonyított módja a transzkripciós interferencia. Ennek lényege, hogy a ligand bekötödé e után az aktív konformációs állapotban lévő receptor más transzkripciós faktorok hatását befolyás olja. Bizonyí tottnak tekinthető, hogy az igen sokrétű kortizai hatás (pl. szénhidrát-anyag csere befolyás olása, fehérjeés DNS-sz intézis fokozás a a májban, egy sor egyedfej lődési lépés gyorsítása, kalc iumfelszívódás befolyá olása, az immun- és gyullad ásos válasz gátlása, citokine k termel ődésének gátlása, extracelluláris matrix képződé s gátlása) egy része, elsősorban a gátJási folyama tok, nem igénylik a receptor DNS-kötődését. Valószínűsíthető , hogy a kortízolt kötött receptor interferál más transzkr ipciós faktorok (így AP-l vagy NF-tc.B válaszad ó elemhez kötődők) funkciójával, és igy éri el é lettani hatását.

A hormonfüggő magreceptorcsalád komplexitása A szteroid- tiroid- 0 -vitamin- retinoid hormon magreceptorcsalád 15 tagját azonosí tották 1990re. Köztük találhatók külön gének által kódolt izotípuso k is, így pl. a retinoid receptor ok a, p és y típusa. A 90-es évek közepér e a család tagjaina k száma több mint 150-re bővült, beleértve a különböző speciese kből izolált formáka t és azokat, amelyeknek még nem talá lták meg a ligandjá t és ezért ,,árva" receptor oknak nevezik őket (lásd később).

))))))))))))))))) ))))))))))))))))) ))))))))))))))))) )))))))))))))))))

),)))))))>))

499

Az is egyértelművé vált, hogy ezen magrece ptorcsalád tagjai nagyjáb ól négy osztályb a soroU1at ók (5-45. ábra). Az J. osztályb a a j ól ismert sztcroidrcce ptorok tartozna k, amelyek hormont nem kötött formába n a citaszói ban hősokk-fehérj ékhez kapcsolódva található k; a hormon "betereli" a magba a receptor t, ahol a hormon t kötött receptorforma fordított an i smétlőd ő DNS válaszad ó szekvenciák at ismer fel és , homodi mer formában transzaktiváL A IT. osztály tagjai alaphelyzetben (hormon nélkül) is a sejtmag ban talá lhatók és ott ligand nélkül gátló hatást fejtenek ki az általuk szabályozo tt gének transzkripciójára, közvetle nül ismétlődő válaszad ó ONS-sz ekvenci ákat ismerne k fel , valamen nyien RXR-ra l (RXR a 9-cisz-retinsav receptor a) heterodimerizáló dnak. Az A-vitamin-szá rmazék retinsav képlete:

COOH

A ll L osztály tagjai az "árva" homodi mer receptorok, amelyek közvetle nül ismétlődő válaszad ó DNS-ele mekhez kötődnek. ("Árva" receptor oknak nevezzü k azokat a fehérjék et, amelyek szerkezetük alapján receptor nak tekinthetők , dc ligandju k még ismeretlen). A IV. osztályb a tartozó monom er "árva" receptor ok nem i smétlődő , á ltalában hosszab b DNS válaszad ó elemhez kötődnek. Újabb eredmények szerint további, a magreceptor okhoz kötődö fehérjék i szcrepe t játszanak e receptorok működésében . A koaktivá torok a receptor hoz bekötőrlő ligand hatására kapc a lódnak a receptorokhoz, azok transzaktiváló régióihoz. Önmagu k is bírnak transzak tiváló doménn al, jelenlétü kben a transzkr ipciós hatás fokozódik. Egyrészt hídképző molekul ák a receptor dimerck és a TATA-b oxhoz kötőd ö obligát transzkripciós faktor komplex között, másrész t különböző aktív funkciók at jeleníte nek meg a transzkr ipció szabályozásában. így pl. a koaktivátor komplex ek hiszton-acetiláztran szferáz aktivitással bírva fellazítják az átírandó gén nukleos zómáit, génspec ifikus

500

EXTRACELL ULÁRiS JELEK RECEPTORA l ÉS A J ELÁTVITEL l MECHAN IZMUSO K

»»»>»>>»>»>»»nmm>>))»>»»»»

SZii'ElROIDRECEPTOROK RECEPTOR LIGAND

RECEPTOR LIGAND

GR glukokortikoid MR mineralokortrkord

RAR o., ~. y retmsav tiroxin TR o., ~

AR androgén

VDR

ÖR osztrogén

1,25(0H)-vit D3

PPAR o., ~. y eikozanoid ,,ÁRVA" receptorok

HOMODIMER "ÁRVA" RECEPTOROK

?

MONOMER "ÁRVA" RECEPTOROK

RECEPTOR LIGAND

RECEPTOR LIGAND

? RXR

9-cisz retinsav

COUP/ARP ? HNF-4

NGFl-B NGFl-B

?

ELP/SF-1 ?

L

?

_ _ _ _ _j 5-45. ábra. A magrecepto rok osztályai

módon lehetövé téve az aktív kromatin kialakulását, az RNS- polimeráz hatékony müködését (5-46. ábra). A korepresszorok gátolják a ligand nélküli magrecepto rok aktivitását; a gátló komplex adaptereket és hiszton deacetiláz aktivitássa l bíró fehérjét tartalmaz, amelyek ligand hiányában inaktív állapotba viszik az adott génszakasz t (5-46. ábra). A ligand megjelenés ekor leválnak a magreceptorról, lehetövé téve a koaktivátor komplexek bekötődését.

Az "árva" magreceptorok és a reverz endokrinológia kibontakozó világa A magreceptorok jelentős száma nyilvánvaló vá tette, hogy a hagyományos zsíroldékony hormonok mellett létezniük kell más ligandokna k is. Általában elmondható , hogy magreceptorra hatni tudó l igand háromféle módon jelenhet meg. Kép-

zödhet más szervekben (pl. a tiroid hormon) klasszikus endokrin hormon módjára, keletkezhet a célsejtben apchormon előa l akbó l (ilyen pl. a mind-tansz retinsavból létrejövő 9-cisz-retinsav, amely az RXR-recep tor ligandja), végül a ligand (pl. prosztaglandinszármaz ék) abban a sejtben is képződhet, amelyben a hatását kiváltja (5-47. ábra) . Különleges érdeklődés kiséri az "árva" receptorok ismeretlen ligandjaina k felkutatását. Sokan ezt a munkát fordított endokrinológiának is hívják, hiszen szemben a klasszikus endokrinológiával, itt el őbb lettek meg a receptorok 6s ezt követően keressük a hozzájuk tartozó hormont, ligandot, majd annak segítségével deritjük fel az élettani funkciót. Csak az emberi szervezetben 40 körüli az ilyen "árva" receptorok száma. A fordított endokrinológia el ső sikere éppen a 9-cisz-retinsavnak a fe lfedezése volt, specifikus receptorának, az RXR-receptornak (amelynek 3 izotípusa van) az ismeretében. A közelmúltban 5 további "árva" receptor találta meg ligandját

501

)) »>>)))))))))))) ) >)))))))))) )))) )) ))))))H)) U))))))))))> )

HANI ZMU OK PLAZM AMEMB RÁN-R ECEPT OROK É JELÁT VITELI MEC

h iszton -deace ti láz

DNS -- ___]' - -

r-....__ _

g átolt

ko-aktiváló komple x

hiszton-acetiltranszferáz

--

_/

gátló kompl ex

l

j

aktivált

retinsav

mRNS-polime ráz

echani zmusa. A CBP/p300, aktiváló komplexekben talált fehérje. 5-46. ábra. Koakt iváló és ko repress záJá komple xek hatásm A CBP (CREB binding protein) a cAMP által szabályozott van. a aktivitás áz anszfer Az aktiváló komplexnek hiszton-acetiltr us transzkripciós faktorok közös koaktivá tor fehérjéje GREB-hez és az AP-1 fehérjékhez is kötődik; különböző specifik

SEJTM A G

mRNS-polimeráz

APO-LlGAN D

' INTRA CELLU LÁRIS LIGAN D l

"'----------

enésén ek 5-47. ábra. A m agrece ptoroka t ak tiváini képes Iigando k megjel

lehetős égei

Y

\~ v'

nukleo :.óma

))

502

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))

EXTRACELLULÁRIS JELEK RECEPTORAl ÉS A JELÁTVITELl MECHANIZMUSOK

Az energiaháztartás szabályozásában fontos szerepet játszó PPAR-receptorokról (a, pés y típusokot ismerünk, nevüket peroxiszóma pro liferációt kiváltó hatásukról kapták) először az derült ki, hogy ismert gyógyszerek aktiválják; pl. azok, amelyek a triacilglicerol-szintet és a coronariasclerosist csökkentik a PP ARa-t aktiválják és lipoproteinek génjének szabályozásával fejtik ki hatásukat; a PPARy-hoz pedig antidiabetikumok köt ődnek. A legújabb eredmények szerint a PPAR-ok természetes ligandjait különböző ho szúságú és telíteltségi fokú zsí rsavak ciklooxigenáz (a 15d-PGh a PPARy specifikus ligandja) és lipoxigenáz (a SS-HETE specifikusana PPARa-hoz kötödik) termékei közölt kell keresnünk.

koleszterin. Az oxiszterol hatására aktiválódott LXR transzaktiválja a CYP7 enzim (amely a koleszterinből tötténő epesav képződéshez szükséges) génjét Ha nincs LXR-hatás, akkor extrém mértékben felszaporodik a májban a koleszterin. A pregnánreceptor (PXR) szintén az RXR-ral alkot heterodirnert, természetes ligandján (pregnánszármazék) kívül aktiváini képes az összes humán terápiában használatos gyógyszer közel fele. Transzaktiváló hatásának célgénje (CYP3A4 gén) citoleróm P450 enzimet kódol, amely egyike a legszélesebb hatás ú, xenobiotikumokat átalakítani képes monooxigenázoknak. (A CYP géncsaládról, a citolerom P450 kapcsán a 2.6 fejezetben további részletek találhatók). A konstitutív andraszteronreceptor (CAR) ligand nélkül is aktív a sejtekben; természetes ligandja, a tesztoszteronszármazék androsztanol bekötődésének hatására inaktivá-

Nemrég derült ki, hogy az "árva" receptorok közül négynek szteroidszánnazék a ligandja (5-48. ábra). Az LXR (máj X receptor) RXR-ral alkot heterodimert. Ligandja olyan oxiszterol (a koleszterolszármazék 24S,25-epoxikoleszterol), amely akkor keletkezik, ha a májban feleslegben van a

5-48. ábra. Néhány szteroidszárm azék, amely "árva" receptorok ligandja

co2H

szkvak!n ~

1

H

/kolT~~

OH

kenodezoxi-kolsav

~XR /

pregnenolon

l

24(8),25-epoxi-koleszterol

LXR D-vitamin

DR

progeszteron~O

kortikoszteroidok GR

H

sp-pregnán-3,20-dion PXR gyógyszerek

q9=>

HO ••

androsztanol CAR

+ - - szex szteroidok

PLAZMAMEMBRÁN-RECEPTOROK ÉS JELÁTVJTELI M ECHANIZ M USOK

)) )))))))) )) )) ))))))))))))))l)))))))))))))))))))))))))))))))

503

ct~ o~,

ct~oMc, TCCO

SEJTMAG

receptor

DNS endoplazmatik us retikulum

en hancer

promoter

CITOPLAZMA

~ ~

mRNS

~-5-49. ábra. A dioxinszármazék TCDD (tetraklórdibenzo-p-dioxin) hatására aktiválódó AH-receptor (AHR). Az ábra megértéséhez lásd még a 2.6 fejezetben leírtakat

504

>m»>m>m»»»>»»»>>»>»»>»»m

EXTRA CELLULÁRIS J ELEK RECE PTORAI ÉS A Jl:LÁTVITELII\I EC HANIZM USOK

lódik, az á ltala szabályozott gének kifej eződése fe l fliggcsztődik (egyikük a CYP2 B enzim génje). V a l ószínűsíthető, hogy a receptor a szteroid-homeosztázis egyik szabályozój a. A famezil X receptorról eredetileg azt téte lezték fel, hogy farnczol lesz a természetes ligandja. Ezt később nem s ikerült bizonyítani . Kiderült, hogy a temlészetes Iigandok epesavak (így pl. a kcnodezoxikó lsav), vagyis az FXR (amely azokban a szövetekben fej eződik ki leginkább, ahol az epesavak megjelennek), ezek magreceptora eddig nem teljesen ismert géne k kifejezödé ének szabályozására. E ligandc oport hatá a i ö sze égükben azt mutatj ák, hogy egymássa l összefliggő anyagcsereutak (ebben az esetben a komplex szteroid-anyagcsere) termé kei adott sejtben közvctleni.il szabályozhatj ák kulcsenz ime ik génjeit (metabolikus génszabályozás).

A magreceptorok tágabb értelmezése A fentiekben bemutatott magreceptor család kifejlődése azt mutatja, hogy az evolúció során kifej ezetten e l őnyös volt a cinkujjat tartalmazó DN Skötő és a ligandkö tő domének fúziójával létrejött szerkezet, ame ly biztosítani tudta diverz élettani funkc iók speci fíku s szabá lyozásának megje lenését. Ez azonban nemjelenti azt, hogy csak cinkujjat tartalmazó magreceptorok j elentek meg az evolúc ió során. Jó példa az ettő l e ltérő megoldásra a sztero l szabályozó elemhez kötődö fehérje (amely az LDL-receptor, továbbá a ko lesztero lszintézis kulcsenzime, a HGM-CoA reduktáz génj eihez közeli és azokat szabályozó válaszadó DNS-szakaszhoz kötődik) : ez akkor válik az e ndoplazmatikus retikulum membránban ta lá lható inaktív e lőa lakbó l proteázok hatására aktívvá, ha a

sejtekben a koleszterolszint csökken. Jó l ismert az aromás hydrocarbon-rec eptor (AHR) példája is; ebben az esetben xenobiotikus (tehát nem természetes) anyag a ligand (pl. a dioxin), ame ly a receptort aktivá lva a biotranszformáció első fázisának enzime i (pl. a CYP l A l ) génj ét transzaktiválja és vezet ezen detoxifi káló enzimek intracellulárisa szintjének növekedéséhez (5-49. ábra).

Orvosbiológiai jelentőség

A magreceptorok orvosbiológiai je l entőségéL nem lehet eléggé túlbecsülni. G lukokortikoidvagy tiroidreceptorok nélkül nem lehet élni éppúgy, ahogy ligandjaik nélkül sem. Az utóbbi években egyre több olyan kórképet is leírnak, amelyben a magreceptorok mutációja, részleges deléciója mian a betegség az adott honnonnal kezelhetetlen; pl. a D-vitaminnal kezelhetetlen angolkór, tiroxinrezisztens tiroidhiányos szindróma, androgénnel nem korrigálható szexuális fejletlenség. A szteroidok és a retinaidok igen jelentős szerepet töltenek be a különböző terápiás protokollokban. újabb és újabb gyógyszerek kifejlesztése várható az ,,árva" receptorok már felderített és a közeli jövőben felderítendő ligandjainak ismeretében. A legújabb eredmények alapján közeli kapcsolat mutatható ki a PPARy hatásai és a diabetes, valamint az arteriosclerosis kifejlődée között. Az RAR receptor kromoszómális transzlokáció m iatt bekövetkezőfúziójaa PML génnel a mieloid sejtek olyan malignus transzfOJmációját eredményezi, amelynek kezelése magreceptor ligandokkal lehets éges.

A sejtproliferáció és a ·természetes sejthalál biokémiája Fésüs László

Az emberi szervezet fiziológiás működése során a sejtproliferáció és a sejthalál egymást kiegészítő egyensúlyi folyamatok. Szervezetünk legtöbb sejtje meghatározott élettartammal rendelkezik, naponta sejtjeink milliárdjai balnak el, helyettük ugyanilyen számban kell új sejteknek keletkezni. A sejtproliferáció leülönösen jelentős az embriogenezis során, a növekvő szervezetben, a csontvelőben, a bőr bazális rétegében, a bélhámsejtek napi pótlásában, de elengedhetetlen feltétele a sebgyógyulásnak vagy más megnövekedett igény kielégítésének. Ma már részletesen ismerjük azokat a biokémiai folyamatokat, amelyek a sejtproliferáció és a tennészetes sejthalál folyamatokat meghatározzák.

A sejtosztódási ciklus biokémiai sajátságai és szabályozása A korai fénymikroszkópos vizsgálatok során ismerték fel, hogy amitózis (M fázis) vagyis a sejtek kettéosztódásának periódusa több, a kettéosztódást előkészítő szakaszból álL Mitózis alatt a sejtek összetömörítile kromoszómáikat (profázis), felsorakoztatják azokat a mikrotubuláris orsóra (metafázis) és a testvérkromatidokat a sejt ellentétes pólusára csoportosítják (anafázis). Keveset lehetett látni a mitózisok közötti időszak (interfázis) történéseiből, kivéve, hogy a sejtek térfogata nő. Az interfázis fekete doboz maradt addig, amíg fel nem fedezték, hogy a DNS hordozza a kromoszómákban tárolt infmmációt. Ezt követően kimutat-

=

ták a kromoszómaállomány megduplázódását, és hogy ez az interfázis idején, annak rövid időszaká­ ban zaj lik. Ez a felismerés az interfázist három szakaszra osztotta: G ~, amitózis és a DNS replikáció kezdete közötti időszak; S fázis, a DNS szintézis ideje; és G 2, az S és az M fázis közötti időszak (5-50. ábra). A G l , S, G 2, és M fázisok mint meghatározó sejtciklus-szakaszok jelentősége fokozatosan vált egyértelművé és a sejtosztódási ciklus kutatás legfontosabb célja olyan biokémiai események azonositása lett, amelyek kiváltják az egyik fázisból a másikba való átmenetet Az egyes fázisokon belül is kiemelkedő jelentősége van az ún. stabil pontoknak, nevezetesen a start (S fázis kezdete) előtti (s), a G2/M átmenet (gm) és a metafázis (m) pontoknak, amelyek a sejtosztódási ciklus ellenőrző pontjai; csak akkor halad tovább a ciklus, ha megfelelő infonnációk érkeznek a következő lépéshez szükséges összes biokémiai esemény bekövetkeztéről. A három ellenőrző pont közül kettő esetében (s, gm) az áthaladás biokémiai meghatározói döntően a ciklus adott pontján újonnan szintetizálódott ciklinek és az azok által aktivált ciklindependens kinázok (CDK-k), amelyeket konstitutív és indukálható inhibitorok (CKT-k) kontollálnak. A metafázis stabi t pontból történő kilépés elsősorba n az anafázist elősegítő komplex (APC) proteolitikus hatásának az eredménye (lásd később).

A szomatikus sej tek, például hepatociták és neuronok in vivo hosszú ideig funkcióképesek tudnak maradni akkor is. ha nem proliferálnak; ezt, a sejtproliferáció szempontjából nyugalmi állapotot

506

)~)))))))))))))))))))))))),.)))))))))));)))>)

EXT RACELLULÁRJ S J ELEK REC EPT ORAl ÉS A J ELÁTVlTELJ MECHANIZM

····....

gm

·... \

~ APC CDK1ciklin B

\

.. .

CDK2- \ ······ CKI ! ciklin A \"..

.

\ G l G1 o l l~

··...

!

•.J..

0
~

.••

''y"

bt

~f)..·Q

1~

0()_~~ v

~ /

~-

+- -_, R

k ·· k d · · t kt noveees1 a oro

/

s

•

OK

/

l

' G1

J

5-50. ábra. A sej tosztódási ciklus sémás ábrázolása. A G, fázis eseményei közül azok, amelyek az S fázis előkészítői már az már az S előző ciklus alatt a G 2 és a mitózis eseményei idején indulhatnak. Ugyanígy, a mitózisra való, döntően G2 előkészületek fázisban m egkezdőd nek . A G0 -ból a G 1-be való belépés növekedési faktorok hatására lehetséges (folyamatosan proliferáló sejtek nem lépnek ki a G0-ba). A kritikus szabályozási pontok az R (restrikciós pont, a progresszió vége), az sa start e lőtt, a gm az M fázisba lépés el őtt és az m, a metafázisban. A belső nyilak a ciklindependens kinázok (CDK) és a meg felelő ciklinek komplexeinek kialakulását jelzik. A ciklindependens kináz-ciklin komplexekhez átmenetileg inhibitorok (CK l) kötőd hetnek .

gyakran nevezzük Go helyzetnek. Az ilyen G0 állapotban tartott sejtek nem rendelkeznek megkettő­ zött DNS-tartalom mal. A Go és G 1 sej tek azon tú lmenően hogy részt vesznek vagy sem a sej tciklusban, nagyon sok minden másban is különböznek egymástól. A Go és 0 1 sej tek megkülönböz tetése központi kérdés, m ert hogy egy adott sejtpopuláción belül milyen ütemben nő a sejtszám, az e lsősorban attól ftigg, hogy a sejtek mekkora hányada proliferál a G0 fázisban lévő sej tek számához viszonyítva. A Go állapotban lévő sejtek viszszatérhetnek a sejtciklusba, amennyiben á tesnek az ún . mitogén kaszkád biokémiai eseményein.

Proliferációs szignál útvonalak, a mitogén kaszkád A G0-ban lévő sejtek proliferációs szignálok hatására j utnak el a sej tosztódási cikJus G 1 szakaszá-

ba, és onnan a restrikciós ponton át az S fázisba. A proliferációs szignálútvona lat, más nevén a mitogén biokémiai kaszkád útvonalat növekedési fa ktorok indítják cl, amelyeket három fő csoportba lehet osztani:

O Tirozin-kináz -receptorokra hatók, így a PDGF,

EGF, fibroblaszt növekedési faktor (FGF), hepatocitanöv ekedési faktor (HGF) és mások. 6 Egy transzmembrá n domént tartalmazó, de saját tirozin-kináz- aktivitással nem ren delkező receptorokra hatók, így az eritropoetin (Epo), a kolóniastimul áló faktor (CSF), az interleukin-l , interleukin-2 és mások. t) Hét transzmembrán doménnal rendel kező receptorokra ható bizo nyos sejtekben mitogén kaszkádot is indítani tudó bombezin, noradrenalin, szerotonin és mások.

A SEJTPRO LIF ERÁC IÓ É A T ERM ÉSZETE SEJTHA LÁL BIOK ÉMJÁJA

A receptorokhoz kötődő növekedési fa ktoro k másodiagos hírv ivők képződ éséhez vezetne k; sejtIrultúrákban végzett kísérle tek során intenzí v fehérjef oszforilációt, diacilg licerol- és inozito i-Pképződést, nátrium -, kalc ium- és protonb eáramlást figyeltek meg. Már néhány órán belül megfigyehetők a korai, azonna li válasza dó gének Uun, fos, myc transzk ripciós faktoro k) transzk ripciójá nak fokozód ása, majd ezen, fő leg transzk ripciós fehérjék szintéz isét követi a sejtma gszerk ezeténe k átrendeződése, új abb gének indukc iój a, újabb és új?.bb fehérjé k megjelenése (ciki inek, proteáz ok), beleértve DNS szintéz iséhez, poliaminok e l őá llítá­ sához szüksé ges enzime ket Az enzime k egy része a sejtmag ba vándorol, ott multienzim-ko mplexek alakulnak ki (prerep likáció s komple xek), elkezdő ­ dik a DNS és a hiszton e k szintézise, vagyis az S fáZIS.

Az utóbbi évek ku tatása inakj elentős eredmé nye, hogy sikerül t a prolife rációs szignál útvona lak

>>>>>>>>n»l>>>>>>>»>>>>>•>•>>>•>>>>>>>>»>>>>»>>»>>))>>>>n

507

egyiké nek, a ras mitogé n kaszkád útvona lnak minden lépését fe lderíteni. A tirozin-kináz-receptorokka l müköd ő j elpályá k le írásako r ez az ú tvonal má r részlete s isrnerte tésre került, itt röviden ismét összefo glalj uk (5-51 . ábra). A 2 1 k O méretü ras fehé rje a hozzá kovale nsen kötődö palmitát- és famezilcsopor tok segítsé gével sejtme mbránh oz van kihorgo nyozva és GDP-t kötött formáb an inaktív. Aktív, GTP-t kötő állapot ba annak hatására kerül, hogy a növekedési faktor (pl. EGF) a tirozin-kináz aktivitá sú recepto rához kötődik (EGFR), a receptor ennek hatá ára dimerizá lódik és autofos zforilá lja specifi kus tirozin oldallá ncait Ezekhe z SH2 domén jével dokkol ó fehérje (GRB2) ka pcsolód ik, annak SH3 doménjei pedig a citoplazmáb ól kihorgo nyozzá k azt az enzime t (SOS), amely a ras-GD P-t GTP-re cseréli. Ugyanez beköve tkezhet bizony os hét transzm embrándomén t tartalmazó recepto rok esetébe n is, illetve olyan saját tirozin- kináz-a ktivitás sal nem rendel kező recepto r

lásd a szöveges leírást és az 5.1. fejezetben leirtakat 5-51 . ábra. A ras proliferá ciós szignál útvonal. Az ábra megérté séhez

508

)))))))) )))) )) )) )))))))) )))) )))) )) ))))))))))

EXTRACELL ULÁRfS J ELEK RECEPTORA I ÉS A .JELÁTVITE LI MECHAN IZMUSOK

esetében, mint pl. az eritropoetin (Epo) receptora. Ilyenkor a receptoraktiválás az src tiroz in-kinázcsaládba tartozó enzimet aktiválja, ez az Shc fehérjét foszfori lá lja, amihez a GRB2 és azon keresztül az SOS kötődn i képes. Az igen rövid ideig aktív ras aktív állapotba hozza a raf fehérjét (és más ras effektor célfebérjéket), majd endogén GTPáz aktivitása révén a kötött GTP-t GDP-vé alakítva inaktív állapotba kerül. A raf fehérje kináz, foszforilációval aktivál más kinázoka t, így a

sejtek egy részében a MEK fehérj ét is, amely az ERK fehérjét foszforilálj a. Az ERK fehérj éket foszforilál a citoszólban , majd bevándorol a sejtmagba, ahol szintén foszforilác ióval aktivál transzkripciós faktorokat, amelyek újabb, ugyancsak foszforilálódó transzkripc iós faktorok szintézisét teszik lehetövé. Az utóbbiak hatására egy sor kritikus szabályozó feh érje, így pl. a ciklin D, E és A génjei indukálódn ak.

ras szignál

+

p

J DHFR ~TK POL

TS és más fehérjék

ciklinek transzkripció s faktorok

l

p

foszforiláció ciklindependens kináz

5-52. ábra. A restrikciós pont szabályozás ának sémája. Az E2F-k elindítják többek közölt a dihidrofolát-reduktáz (DHFR), a timidin-kináz (TK), a timidilát-szint áz (TS), a DNS-polimeráz-a (POL), a ciklin E és más fehérjék szintézisét. Mindez pozitív visszacsatolást eredményez, elősegítve a RB (retinoblasztoma fehérje) fenntartó foszforilálását ciklin E-CDK2-vel, hozzájárulva a restrikciós pont irreverzibilis átlépéséhez, az S fázis elindításához. A p53-mal indukálható p21 fehérje is képes G 1-blokkot csinálni azzal, hogy gátolja a CDK2-t; a p27 a ciklin E(A)-CDK2 komplex alapállapotú gátló fehérjéje. (Az ábra megértéséhe z lásd még a szövegben található leírást.) Az inhibitor fehérjék családokat alkotnak. A p16 családba tartozik a p 15, p18, p19. A p21 családnak ugyancsak több tagja van

A SEJTPROLIFER ÁC IÓ É A T ERM ÉSZETE SEJTHALÁL BIOKÉMIÁJA

A restrikciós pont szabályozása A restrikciós pont a G 1 fázis azon pontja, ahonnan a sejtek további mitogén stimulus nélkül is tová"bhaladnak a sejtciklus lépésein. Feltehetően egybeesik a cikl in E szintézis megtörténtéveL A restrikciós ponton való áthaladást és az S fázisba való belépést CDK-ok szabályozzák, amelyeket a ciklin D és E egymást követően kapcsol be. A D típusú ciklinek mintcgy növekedési faktor érzékelöként hatnak, mi vel expressziójuk inkább függ az extracelluláris környezetből érkező információktó l (növekedési faktorok, ras mitogén kaszkád), mint az adott sejt sejtciklusban fennálló pozíciójátóL Amint a sejt belép a sejtciklusba (a G 0-ból vagy újabb sejtcikJus indul a G 1-böl), D típusú ciklinek indukálódnak a növekedési faktorok hatására bekövetkező elnyújtott korai válasz részeként; mind a D ciklinek szintézise, mind katalitikus partnereikkel (döntően CDK4) való összeállásuk a mitogén stimuláció függvénye (5-52. ábra). Egyidej űl eg a CDK-ciklin D komplexet gátló CKI (ciklin-dependens kináz inhibitor p 16 fehérje) proteolízissei degradálódik. A ciklin D-fiiggö kinázok hiperfoszforilálják a retinoblasztoma (RB) fehérjét. A RB é más RB-hez hasonló fehérjék közvetve génexpressziót szabályoznak, me11 inaktív komplexben tartják az E2F transzkripciós faktorcsalád tagjait. Ez utóbbiak aktiválják azon géneket, amelyek termékei fontosak az S fázisba történő belépéshez. Alulfo zforilált állapotban az RB az E2F komplexekhez kötödik és ezzel gátolja a E2F célgének átírását. Az RB foszforilálása az E2F transzkripciós faktort szabaddá teszi, lehetövé téve az E2F célgének aktiválását, vagyis az S fázist bevezető folyamatot, amelyet eredendően a ciklin D és a ciklin D-függö kinázok megjelenése indított el. A restrikciós pont szabályozásának igen fontos eleme a p53 fehérje funkciója. DNS károsodás esetén a p53 fehérje mennyisége megnövekszik és a p53 transzkripciós faktorként többek között indukálja a p21 CKI génjét A p2 1 ciklin-dependens kináz fehérje inhibitor megakadályozza azt, hogy a CDK2 elindíthassa az S fázi t. A p53 aktiválja a DNS hibajavító enzimrendszert is. Amennyiben a DNS károsodás túl nagy, vagy a hibajavítás nem elégséges, a p53 indukálja a sej thalált (apoptózist) kiváltó géneket és elindítja a kárcsodott sejt eliminálását.

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

o

5 9

A fenti folyamatok egyes lépéseinek részletcsebb leírása a 3.1. fejezetben található, itt elsősor­ ban az egymást követő lépések összefüggéseire hívjuk fel a fi gyelmet.

Az M fázis kináz (cdc2, CDK1)

Az S fázis maghatározó biokémiai történései után (többek között a DNS állomány megkettözödése, hisztonek szintézise) a sejt a G2 állapotba kerül, amelynek során felkészül a mitózisra és ellenőrzi, hogy az S fázis eseményei rendben lezajlottak. Ez az ellenőrzö funkció adja a gm stabit állapot elsődleges jelentöségét; addig nem megy tovább a sejtciklus, amíg minden fontos biokémiai eseményről be nem fut a "megnyugtató " információ. Az ellenörzések visszajelzései az ún. M fáz is kináz, a cdc2, más néven ciklindependens kináz l (CDKL) zabályozá ábanjelentkeznek (lá d még a 3. 1 fej ezetben). A CDK l a ciklin B-vel kempiexet alkot. A komplex azonban inaktív a G 2 fázisban, mert az az ATP kötőhel yén foszforilált. A folyamat émáját az 5-53. ábra mutatja. A cdc25 foszfatáz (amelyet a vi sszaj el zőszignál o k aktiválnak) az aktív centrum közelében foszforilált treonin é tirozin oldalláncokat defoszforilálja. Az aktívvá vált M fázis kinázkatalizá lja a mitózis eseményeit, egészen a metafázis bekövetkeztéi g. Eddig megismert kulcsszubsztrátjai között megemlítendő a H l hiszton, a !aminok (amelyek fo zforilációja teszi lehetövé proteolitikus degradációjukat és ezzel a magmembrán szétesését), citoszkeletáli s fehérjék, centroszáma és más fehérjék, amelyeknek ki kell kerüljeni a kromatinból ahhoz, hogy a kromoszómakondenzáció bekövetkczhessen. A G 1 fázis idejérc ezek a zubsztrátok defoszforilálódnak, a cikJin B-t proteázok elbontják, az M fázis kináz a metafázis után már nem aktív.

A ciklindependens kinázok szabályozá sának főbb elvei

A sejtciklus kulcsenzimeit, a ciklindependens kinázokat extra- és intracelluláris jelek rendkívül precízen szabályozzák. A CDK-ok aktivitá át több, az evolúció során megőrzött biokémiai me-

SIO

EXTRACELLULÁRJS J ELEK RECEPTORAI ÉS A J ELÁTVITE LJ MECHANIZM SOK

G2

M

gátló foszforiláció /\ stabilizáló ~ ~ foszforiláció

• /

inaktrv PK akttv PK kulcsszubsztrátokat foszforil ál

..

. ..

-~----_-_-_-_- _-_- _-("":::oo--11'-t!--+11' 0 [ioszfatá~

:

5-53. ábra. Az M fázis kináz szabályozó mechanizmusai és működése. Az aktivitást a cdc 25 foszfatáz kapcsolja be

a

sis hst ros met neu trk

MEMBRÁN

CITOPLAZMA

d

e r myc els myb jun fos ski

fl

ciklinO

c

[;B raf

src fgr fes lek sea yes

5-54. ábra. Sémás ábrázolás sejtkompartmentek bemutatására, ahol onkogén vagy protoonkogén termékek lokalizálódnak. (a) Növekedési faktorok; (b) transzmembrán tirozinkináz növekedési faktor receptorok; (c) az src és ras géncsalád membránhoz kapcsolódó tagjai; (d) citoplazma jelátvivő molekulák; (e) a magban található transzkripciós faktorok; (f) sejtciklus regutátorok

A EJTPROLIFERÁCIÓ ÉS A T ERMÉSZETES SEJTHALÁL BIOKÉMIÁJA

chanizmus szabályozza, amelyek összességében a szabályozó útvonalak szinte utolérbetetlen eleganciájú és bonyolultságú hálóját alkotják.

O CDK-aktiválás ciklinkötődéssel. Mindegyik CDK a ciklinek specifikus alcsoportjával tud komplexet alkotni . Emellett egy adott ciklin több CDK-zal is képes kölcsönhatásba lépni . A szabályozás transzkripciós szinten a megfelelő ciklinek adott időpontban indukált szintéz isévcl történik. 8 CDK-gát/ás foszforilációval. A C DK-ciklin komplexek aktivitását gátolja két, az N- terminális vég közelében elhelyezkedő oldallánc foszforilációja (Tr 14 és Tyr 15 mind a cdc2, mind a C DK2 e etében). A defoszforilációt a cdc25 foszfatáz katalizálja. O CDK-aktivá/ásfoszforilációva/ (komplex stabilizáló foszforiláció). A teljes CDK aktiválás foszforilációt igényel konzervatív treonin oldalláncokon (Tr 161 a cdc2, Tr 160 a CDK2 esetében). O CDK-gátlás inhibitor a/egységekkel. A négy fontosabb emlős CKI két csoportba tartozik: a p21 és p27 egymáshoz hasonló fehérjék, amelyek a CDK2- és a CDK4-ciklin komplexeket preferálják. A p 16 és p 15 egymáshoz szintén hasonló Cl
A proteolízis jelentősége

a sejtciklusban A proteolízis a CDK aktivitást a C DK aktivátorok (ciklinek) vagy inhibitorok lebontásával szabályozza, illetve közvetlenül elindíthatja a metafázisból az anafázisba történő átmenetet A proteolízis kémiai irreverz ibilitását kihasználva a sejtek a sejtciklus kritikus pontjain adnak döntő irányultságot a biokémiai folyamatoknak Az APC (anafázist elősegítő fehérjekornplex) proteolitikus aktivitása a kromoszómaszegregációt és a mitózisból törté n ő kilépést segíti el ő az anafázis inh ibitorok és mitótikus ciklinek lebontásávaL Amíg a G1-S és a 0 2- M átmeneteket (s és gm) döntően

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

511

C DK-ok határozzák meg, addig a metafázisból a G 1-be jutást az APC proteolitikus hatása katalizálJa.

A sejtosztódási ciklus szabályozásának kapcsolata a tumoros sejtproliferációval Protoonkogének és onkogének Az onkogének fogalma a tumorvirológiábó l származik: olyan virális (el ső orban retrovirális) génekrő l van szó, amelyek az adott vírus tumorkeltő hatásáért felelősek (lásd 3.3. fejezet illetve 5.1. fejezet). A 70-es években derült ki, hogy ezeket a géneket a virusok gazdaszervezeteikből vették át; azok ott normál körülmények között a sejtproliferáció szabályozásában vesznek részt, de megváltozásuk tumorok kialakulásához vezethet (lásd 5.1. fejezet). Kiderült, hogy a mitótikus kaszkád szignáltranszdukciós biokémiai útvonala ilyen protoonkogénekkel van " kikövezve" (5-54. ábra). A protoonkogének onkogénné aktiválódásának lehetséges biokémiai mechanizmusai a következők : promoter beilleszkedés, enhancer beilleszkedés, kromoszomális transzlokáció, génamplifikáció, pontmutáció vagy deléció. Az öt mechanizmus közül az első négy onkogének termékének a megnövekedését j e lenti transzkripció fokozódása miatt, a fehérje szerkezetében nincs semmifé le változás. Ez azt j elenti, hogy egy onkogén termékének menny iségi fokozódása elégséges lehet egy sejt malignussá tételéhez. Az ötödik mechaniz mus, a pontmutáció vagy deléció, a fehérje szerkezetének megváltozását jelenti, miközben annak mennyisége nem nő . Ebből az következik, hogy a malignitás felé billentheti a sejtproliferáció kényes szabályozási folyamatait a kulcshe lyzetben müköd ő regulác1ós fehérje szerkezeti abnonnalitása. Az onkogén hatás kialakulását az alábbi példák ill usztrá lj ák. • Növekedési faktorok túltermelése, amelyek magára a növekedési faktort terme lő sejtre hatnak (autokrin mechanizmus). Az onkogén közvetve stimulálhatja a növekedés i faktor génjét, vagy az onkogén maga kódol növekedési faktort (pl. a

512

•

•

•

•

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

EXTRACELLULÁRIS JELEK RECEPTORAI ÉS A JELÁTVITELI MECHANIZMUSOK

sis onkogén megfelel a trombocita eredetű növekedési faktor, a PDGF egyik polipeptidlá ncának). Az onkogén hibás receptort kódol, amely stimulációs jeleket továbbít a sejteknek akkor is, amikor nincs jelen az extracelluláris térben növekedési faktor. Klasszikus példa erre a transzmembrán tirozin-kináz aktivitású receptorok, amelyek onkogénné válva növekedési faktor nélkül is autofoszforilálják tirozin oldalláncaikat és ezzel folyamatosan aktiválják pl. a ras útvonalat. Ilyenek a PDGF receptorból kialakuló kit, az epidermális növekedési receptorból kialakuló erb, a hepatocitanövekedési receptorból kialakuló met és több más onkogén. A növekedési receptortól eredetileg nonnál stimulációs szignált vivő útvonal kóros megváltozása. A normál gén terméke j elet továbbít receptorstimuláció után a sejt belsejébe; onkqgén fom1ája olyan fehérjét eredményez, amely a receptor felől érkező jel hiányában is stimulációs szignált küld a sejtmagba. A malignus tumorok 30-40%-ában megtalálható kóros ras fehérje endogén GTPáz aktivitása adott pontmutációk következtében akár ezredrészére csökkenhet, ezzel a ras aktív jeltovábbító GTP-t kötő formája túl gyakran küld sejtosztódásra vezető szignált. A citoszól szignáltovábbító fehérjéinek onkogénné alakulása elsősorban fokozott vagy tartós fehérjefoszforilációs képességükben nyilvánulhat meg, pl.akóros raf esetében. Elváltozások azokban a fehérjékben, amelyek a sej tmagban fogadják a mitogén stimulációsjeteket. A humán myc gén a sej tekben heterodimer formában található a max fehérjével kapcsolódva; ez a kölcsönhatás elősegíti szekvenciaspecifikus kötődését DNS-hez és ezzel olyan célgének indukcióját, amelyek meghatározóak a restrikciós ponton való áthaladásban, az S fázis elindításában. A myc gén expressziója több, a transzkripciótól a poszt-transzlációig terjedő szinteken szabályozódik. Genetikai változások (génarnplifikáció, kromoszómatranszlokáció, inzerciós mutagenezis, pontmutáció következtében megváltozott transzkripciós elongációs sebesség, a mRNS szerkezetének olyan megváltozása, amely megnyújtja annak felezési idejét) képesek a c-myc fehérje emelkedett intra-

celluláris koncentrációját kiváltani, ami tumorképzéshez vezethet. • A sejtciklus ell enőrzö pontok deregulációja a ciklin-CDK komplexekben létrejött elváltozások miatt. Az onkogenezis során több e llenőrzé­ si pont szabályozása borulhat fel és ez gyakran annak a következménye, hogy a ciklin-CDK komplexekben szerkezeti változások lépnek fel. A start deregulációja ahhoz vezethet, hogy a sejtszaporodás érzéketlenné válik az extracelluláris jelekre. Mindez kialakulhat a pozitív regulátorok túlzott expressziójának következtében. Gyakran figyelték meg malignus tumorokban a ciklin D (ritkábban a ciklin A és E) kórosan magas szintjét, vagyis a ciklin D protoonkogén, potenciális onkogén.

Tumorszuppresszor gének Már az onkogén kutatások kezdetén felmerült, hogy létezniük kell olyan biokémiai mechanizmusoknak, amelyek ellensúlyozzák a protoonkogének/onkogének sejtekre kifejlett hatását; pl. megfigyelték, hogy malignusan proliferáló és normál sejt fúziója után általában megszünt a kontroll nélküli proliferáció. Az első tumorgátló gén felfedezésére a retinoblasztóma tumoros kórkép tanulmányozása során keri.ilt sor. A retinablastorna tumornak örökletes és sporadikus fonnái ismertek; ezt csak annak feltételezésével lehetett magyarázni, hogy két genetikai esemény szükséges a kialakulásához, a gén mindkét aliéljében kell valaminek történni. A retinablastorna sejtekben megfigyelhető kromoszómaelváltozások tanulmányozásával (törések, deléciók) sikerült a genetikai eseményeket a 13. kromoszómához kapcsolni, majd a molekuláris biológia módszereivel a gént klónozni, és a retinoblasztóma fehérjét azonosítani. Kiderült, hogy retinablastorna-sejtekben ez a fehérje vagy funkcionális fonnája mindig hiányzik a gén mindkét aliéljének károsodása miatt, valamint, hogy az ép gén visszajuttatása a sejtekbe megállítja a malignus proliferációt. Több éves munkával sikerült tisztázni a retinoblasztóma fehérje funkcióját is; foszfori lálatlan formája gátolja az S fázishoz szükséges fehérjékJenzimek génjeinek indukcióját (5-52. ábra). Ha a fehé1je hiányzik, ezen gének indukciója szabályozatlanul állandóan bekövetkezik.

A EJTPROLIFERÁCIÓ ÉS A T ERM ÉSZ ETES EJTHALÁL BIOKÉM IÁJA

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

5 13

5-9. táblázat. Néhány tumorszuppresszor gén és termékei biokémiai funkciója A hiányzó feh érje biokémlal funkciója

Kromoszómális lokalizáció

Név

-

Rb retinoblasztóma

13

sejtciklus restrikciós pont szabályozása

p5J

17

a CDK inhibitor p21 indukciója, Gadd45 segítségével DNS hibajavítás, apoptózist indukál

NF-1 neurotibroma tosis 1. tipus

17

neurofibromin (ras GTPáz aktiválás)

NF-2 neurotibromatosis 2. tipus

22

a sejtmembrán citoszkeletonhoz kapcsolása ( schwannomin)

WT-1 transzkripciós Wilms tumor

11

négy Zn-unat tartalmazó gátló hatású faktor

DCC .daleted in colon cancer"

18

netnn-1 receptor a receptor szabaddá válása apoptózist vált ki

von Hippel-lindau

3

a CKI p2 7 fehérje stabilizálása

P1 6

9

a cdk4 inhibitora

PTCH basal sejtes karcinóma

9

transzkripció represszálása specifikus sejtekben (TGF- ~ család tagjainak génjét); a TGF-~ több fajta sejt proliferációját befolyásolja

DPC4 deletáll pancreas tumorokban, locus 4t

18

TGF-~

BRCA1 emlőkarcinóma

17

DNS hibajavítás

13

DNS hibajavítás

10

Pl3 foszfatáz

-

-

-

----1

melanoma

-

-

- - - - - - - - t --

BRCA2 emlökarcinóma PTEN deletáll prostatarákban

_ _ _ _ _. L . _ _

A retinoblastoma gén felfedezése után az 1990-es években újabb és újabb tumorszuppresszor gének fe lfedezésére került sor. Kiderült, hogy a proli ferációs szignál útvonal negatív szabályozóit kódoló gének (beleértve a sej tciklus start szakaszát ellenőrzőket) potenc iális antionkogének (tumorszuppresszor gén) abban az értelemben, hogy mindkét allé! károsodása tumor kialakulásához vezethet. Az 5-9. táblázat a 90-es évek végérc megismert néhány antionkogént mutatja be. Megfigye lhető, hogy a gének/fehérjék neve a klinikai kórképhez kapcsolódik, vagyis legtöbbször a klinikum adta a kiindulópontot az adott tumorban hiányzó gén felfedezéséhez. A fehérje funkciój ának megismerése általában ezután következett és sok esetben ma sem tisztázott egyértelműen. Kiemelkedő jelentősége

van a p53 fehérjének , amelynek hiányát a malignus tumorok közel 50%-ában megfigyelték. Ez m utatja, hogy mcnnyire fontos az a normál esetben fennálló kontroll mechanizmus, amely megakadályozza, h ogy a

szignálútvonalon hat

károsadott DNS-t tartalmazó sejtek belépjenek az S fáz isba, hogy bekövetkezzen a ki nem javított mutációkat tartalmazó DNS replikációj a. Amint azt e fejezet korábbi részében láttuk, a ejtproliferációs útvona l aránj elentős szerepe van a fehérje foszforilációs fo lyamatoknak. Gyanítható volt, hogy léteznie ke ll olyan tumorgátló génnek, a me ly foszfatázt kódol. Csak a közelmúltban fedezték fel az első ilyen foszfatáz gént. Erről azonban kiderült, hogy nem fehérje foszfatáz. Olyan inozitol-P származék a szubsztrátja, amely az intracelluláris kalciumszint szabályozása révén biztosítja a proliferációs szignálútvonal hatékonyságát (5-9. táblázat). Nem kétséges, hogy a modem , molekuláris célpontú, hatékony tumorte rápia az onkogén hatások biokémiai mechanizmusainak befolyásolásával (elsősorban gátlásával), illetve a kieső tumorgátl ó molekulák hatásának pótlásával (többek között majd génterápiával) lehetséges. Az onkogének és a tumorgátló gének közötti legfontosabb ki.ilönbségeket az 5-l O. táblázat mutatja.

514

EXTRACELLULÁRIS JELEK RECEPTORAI ÉS A JELÁTVlTELl MECHANIZMUSOK

)))))) )) )))))) )) )) )))))) )))))))) )))) )))) )) ))

:ll

.,

•

5-10. táblázat. Néhány jellegzetes különbség az onkogénej( és a tumorgátló gének között a malignus ·· ' sejtproliferáció kialakulása s~em~ontjából -~----. . --~ .....................,._,............._._---.;......_..............._ _~..............__._.._........._..._....~------'l Onkogének 1------~- --

Tumorszuppresszor gének

- - - ----------+----- - - -·- -------------

Mutáció a két allél egyikében elégséges a hatáshoz

Mutáció mindkét alléiben vagy a mutációt az egyik alléiben követi a másik által kódolt fehérje inaktiválódása

A fehérjetermék megnövekedett funkciója

Fehérjefunkció elvesztése

Mutáció szomatikus szövetekben keletkezik, nem öröklődik

A mutáció jelen lehet a germinális sejtekben és/vagy a szomatikus sejtekben

Kismértékű

Sok esetben

szöveti preferencia

A géntermék pozitfv jelet továbbít

A természetes sejthalál molekuláris háttere A természetes sejthalál azé lőszövetekben állandóan előforduló fizio lógiás folyamat az olyan sejtek zökkenőmentes eltávolítására, amelyeknek nincs funkciója (pl. morfogenezis, du plikálódó struktúrák, szexuális dimorfizmus), amelyek fiziológiás körűlmények közőrt felesJeges számban képződnek (pl. csontvelőben), amelyek nem megfelclően fej lődnek (p l. limfociták egy része), amelyek már teljesítették funkciójukat (pl. endometrium, szöveti "turnover"), vagy amelyek potenciálisan kárt okozó sejtek (pl. autoreaktív T sejtek, neutrofi l granulociták).

A természetes sejthalál formái O Programozott sejthalál. Az embriogenezis so-

rán gyakori jelenség; funkcionáli s, fejlődéstani definíció olyan sejthalálra, amely időben és térben megjósolható, valam int aktív fehérjeszintézist és új gének expresszióját igényli. 8 Specializált sejthalál. Szövetspecifikus terminális differenciálódás; a sejthalál programja egy adott ponton felfüggesztődik, a részleges sejthalál specifikus szöveti funke iét szolgál (pl. elszarusodás, kornifikáció). Aktív fehérjeszintézist, új gének expresszióját igényli. A komitikáció az élő kcratinociták clbalása, miközben l hónapnyi idő alatt a stratum basaléból a stratum comeumba jutnak (5-55. áhra). Astratum spinotosumban elveszítik sza-

nagymértékű

(örökölhető)

szöveti preferencia

l A géntermék negatív vagy differenciálódási jelet továbbít

porodási készségüket, a méretük növekszik, ellapulnak és vizet vesztenek. Specifikus keratinok (Kl , KIO) expresszálódnak és filamenteket alkotnak; ezek a filamentumok a stratum granulosumban filagrin segítségével tovább pakolódnak (makrofibrillumok). Más fehérjék, li pidek és szénhidrátok szintetizálódnak, a DNS, a sejtmag, a mitokondrium eliminálódik. Új organellumszerü struktúrák, lamelláris testek jelennek meg, sta b il fehétjeburok képződik. Az utóbbi a szétesö plazmamembrán alatt keletkezik specifikus szubsztrátfehérjék (lorikrin, involukrin, komifin) glutaminjai és lizinjei között, kovalens keresztkötéseket létrehozó transzg lutamináz (Tg l) segítségéve!. A komcoeita nem más, mint keratinkötegekkel kitöltött keresztkötött fehérjeburok A fehérjeburokra kí vülről a lamelláris testekből származó ceramidok és zsírsavak kovalensen kötődnek. C)

Apoptózis. Elsősorban rnorfológiai, az 1970-es évek elején született definíció: típusos esetben a sejtmag állománya kondenzálódik, majd fragmentálódik, a citoplazma zsugorodik, az elhaló sejt legtöbbször fragmentálódik, az organellumok többsége épen marad, az apoptótikus testek fagocitózissal gyorsan eliminálódik. A sejtekből nincs makromolekula kiáramlás, nem követi gyulladás és hegképződés . Nem fiziológiás ágensek is kiválthatják, nem mindig igényel aktív fehérje szintézist, új gének expreszszióját.

A három sejthalálforma közőrt a nyilvánvaló különbségek mellett sok a hasonlóság, a közös biokémiai elem. A következőkben a leggyakrabban megfigyelhető apoptózis molekuláris mechanizmusának részleteit tekin~ük át, hangsúlyozva, hogy annak számos biokémiai eleme a másik két sejthalál formában is szerepet játszik.

ÉM IÁJ A A EJTPROLIFERÁCIÓ ÉS A TERMÉ ZETES SEJTHA LÁL BIOK

))))))))))))))) ))))))))}))))) ))))))))))))))) )))))))))))))))

))))>

515

Fra1

I

lorikrin filagrin

spinózus réteg

bazális réteg fosB

----~-

Fra2

junB

------ - ------------------

5·55. ábra. Az epiderm isben

megfigyelhető

génexp ressziós mintáza t sémája. T: tranzíció s réteg. Fra, jun, fos: transzkr

ipciós

faktorok

A sejthalál (apoptózis) elindít ása Az apoptózist elindító, ún. apoptó tikus faktoro k, tényezök lehetnek sejtfelszíni recepto rok ligandjai (pl. a tumornekrózis faktor - TNF, Fas ligand, antigén a T sej t negatív szelekciója esetén) vagy olyanok, amelyek magrec eptorok on át hatnak (glukokortikoidok, retinsav, p53). Az apoptózis kiváltásának másik módja a túlélési faktorok hiánya, kancentrációjuk csökkenése. A túlélési faktorok is lehetnek sejtfelszíni recepto rokon át hatók (pl. eritropoetin a normob lasztek esetébe n, antigén a pozitív szelekció során, ILJ a monoc iták számár a, idegi növekedési faktor - NGF a fej l ődő idegrendszerben , CSF a rnieloid prekurzorok számár a), vagy magreceptorokra hatók (pl. tesztoszteron a prostataepitheliumban), illetve sejt- sejt kölcsönhatáson alapulé k (pl. idegren dszer fejlődése, sejtérés a tímuszban). Ismerü nk nem fizológiás hatásokat (UV vagy röntgensugárzás, toxikus

anyago k, hypoxia, gyógys zerek), amelye k szintén apoptó zishoz vezetne k (5-56. ábra). Többfé le jelátviteli útvonal vezethe t apoptó zisra jellemző moleku láris mechan izmuso k beindít ásához, akár egy adott sejt esetébe n is. Ezek közü l a kaszpá z nevezetű proteáz ok részvételével zaj ló biokém iai folyamatok részletei a legismertebbek. A kaszpá zok aktív centrum ukban cisztein -hisztidin-diádot tartalmazó, aszpart át mellett hasító proteázok. Aktivá ládásuk során (amely auto vagy transzkatalízissei történh et) a proform ából kihasitott kis és nagy a l egységekből épül fel az aktív enzim, amely homo-h eterodi mer. A prokaszpáz aggreg ációt adapter moleku lák kaszpá z prodom énekhez való kötődése indítja el, kialakítva a kaszpázak aktívác iéhoz szüksé ges "apopt oszóma" szerkez etet, amelye k két egymás tól eltérő folyamat eredmé nyeként alakulh atnak ki (5-57. ábra). A Fas, TNF és az e családb a tartozó más halálrecepto rok ligandjaik bekötődése után adapter fc-

5 16

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

EXTRACELL ULÁRIS JELEK RECE PTORAl ÉS A JELÁTVITE Ll MEC HANIZMUSO K

t(J]étésl ~aktorQk megvanása

- - - - - - • másodiagas hirvivők

~

/

géntranszkripció

/ Ca 2+-dependens PROTEÁZ

l

- -

a citoszkeleton és magmembrán felbomlása, a sejt ~sugorodésa

enzimek aktiválása

ENDONUKL EÁZ

l DNSfragmentáció és kromatinkondenzáció

TRANSZGLUTAMINÁZ

l

cítoplazmatikus és sejtmagfehé rjék ketesztkötése

felismerés fagaciták által

l

fagocitózis gyulladás nélkül

_j 5-56. Az apoptózis domináns molekuláris eseményein ek egyszerűsitett sémája (Nem minden proteáz és DNáz Ca2• -függő, pl. kaszpázok, CAD)

hérjét (FADD, Fas associated death domain) és prokaszpáz okat (a Fas receptor esetében prokaszpáz 8-at) kötnek, oligomerizá lnak és a prokaszpáz autokata lízissel aktiválódik. Az aktív kaszpáz további kaszpázoka t aktivál, e l indítva egy aktivációs kaszkád folyamatot. A másik adapter molekula az Apafl (apoptosis aerivating factor-l), amely a prokaszpáz 9-et köti és egyben két Apafl-prokaszpáz 9 dimerizálódik. Ez a komplex önmagában még nem aktív, ahhoz (és ezzel a kaszpáz aktivációs kaszkád elindításáh oz) az Apafl-hez dATP vagy A TP és ci tokróm c szükséges. A citokróm c a mitokondri umbó l kerül ki olyan apoptózist kiváltó stimulusok következté ben, amelyek nem sej tfelszíni receptorok on keresztül, hanem a

mitokondri umra hatnak, ott átmeneti permeábil itási pórusokat nyitva. A mitokondri umból bizonyos sejthalál stirnulusok hatására tlavoprotein szabadul ki (AIF, apoptosis inducing factor) , amely a ejtmagba jutva kaszpázok nélkül is elindítja az apoptózis molekuláris eseményei t. Ez is jelzi az apoptózis je látviteli útvonalak sokféleségé t; va lószí nű síthetö, hogy további mechanizm usokra derül majd fény, hiszen nem ismerjük pl. a túlélési faktorok megvonása vagy a p53 á lta l kiváltott apoptózis ki alakulásának molekulári s részleteit, illetve a sejtek sok esetben akkor is elhalnak, ha a kaszpázok gátoltak (kaszpáz-ftiggetlen apoptózis)

A [JTPROL IFERÁCIÓ É A TE R 1É ZET E S EJ T HA LÁL BIOKÉM IÁJA

51 7

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

. 1gnad

-.

pl. Fasl

halál receptor pl. Fas

~~~~ ~~~~

_.

_

AIF

f

adapter

~ -- tffi 1

pl. FADD prokaszpáz-8 aktív kaszpáz-8

aktív prokaszp áz-9 kaszpáz 3,6,7

l

prokaszp áz-9

w aktív kaszpáz-3,6 ,7

l

kulcs szubsztrátok

l

APOPTÓ ZIS

ai, illetve a mitokond rium eredetű, 5-57. Az apoptózi s sejtfelszí ni jellel és mitokond riumból inditható kaszpáz kaszkádj inducing factor apoptosis AIF; factor-1; kaszpáz hatástól független sejthalál. Apaf 1; apoptosis activaling

Effektor mecha nizmus ok Az apoptóz is e ffektor mechaniz musai fele lősek a sejt elhalásá t eredmén yező irreverz ibilis történés ekért, a rnorfo lógia i kép kia lakulásá ért Az ezekben a biokémi a i lépésekb en ré zt vevő enzimek ÍJTcverzibilis reakciókat katalizá lnak (5-56. ábra).

O Proteázok. A kétfé le módon elinduló kaszpáz kaszkád végeredm ényekén t az ölő kaszpáz nak is elneveze tt kaszpáz 3 aktiváló dik; ennek gátlószerei sokféle rnódon kiváltott apoptóz is esetében megak adályoz zák a sejt e lhalását. Igen nagy szárnú kaszpáz szubsztrátot írtak le (pl.

citoszke letális fehérjék , nukleári s larnina, sejtrnag enzimek , apoptóz ist gátló fehérjék ), dc nem ismert, hogy ezek közül me lyik (melyek ) proteali tikus hasítása a sejthalál meghatá rozó, v isszafordíthatatl an lépése. Bizonyo s sejtha lál rendszerekben a kaszpáz ok m e llettj el entős szerepet tulajdon ítanak a granzirn eknek (a c itotoxikus T sej tekből kiszabad uló szerin-p rotcázok, amelyek a célsejte kben e lindítják az apoptózis folyama tát és kaszpáz okat is aktiváln ak), illetve a kalpaino knak is. 6 DNá:::ok. Bár a nukleos zómák közötti D N S-hasítás az apoptózis egyik legjelleg zetesebb jele, a ma i napig nem ismerj ük pontosan azokat az en-

5 18

l»>mm»»m»»l>>>>m>m>>>>>>>m>>

EXTRACELLUL ÁRIS JELEK RECEPTORAI ÉS A J ELÁT VITELJ MECHAN IZMUSOK

zimeket, amelyek ezt a biokémiai esemény t végrehaj tják. A gyanúba került enzimek között szerepeinek specifikus endonukleázo k, a pancreas DNáz I (amelynek nem szekretálódó formája nagyon sok sejtben és szövetben jelen van) és a lizoszomális DNáz II. A kaszpázoka t aktiváló j e látv iteli rendszerhez kapcsolódik a kaszpáz aktivált DNáz (CAD), amely inhibitorával (ICAD) heterodimert alkotva inaktív, aktiválását a kaszpáz 3 katalizá lja azzal, hogy két helyen hasítja, és ezzel hatásta lanná teszi az inhibitor TCAD-ot. Az is va l ószínű , hogy az apoptótikus DNS degradáció e lső lépése nagy, 50 kb nagyságú darabokra történő hasítás. t) Transzglutarninázok. A legtöbb apoptózissal elhaló sejtben a szöveti típusú transzglutami náz indukálódik, maj d aktiválódik és nagy tömegben ke resztköti az intrace lluláris fehérjéket, azok specifikus glutamin és lizin oldallánca ik igénybevételé veL Vannak olyan sejtek, ame lyekben maga a keresztkötés lehet a sejthalál kiváltója . M ás sejtekben a keresztkötés hozzájárul a stabil apo ptótikus testek kialakulásához, ezzel is megakadá lyozva a sej ten belüli makromo lekulák kül ső környezetbe történő ki áramlá át.

Az elhalt sejtek fagocitózisa Az apoptózissal elha lt sej tek hatékony, gyors fagocitózisa majd teljes lizoszómális degradációj a makrofágokba n és nem fagoc ita sejtekben a sejthalá l e formájátszinte észrevétlenné teszi az é lő szervezet számára. Az e lha ló sejtek felszínén foszfatidil-szerin molekulák je lennek meg, fehérje glikoziláció következik be. A bekebelező sejtek tö bbfaj ta, kooperatív mechan izmus segítségével ismerik fel az elha ló scjteket; adhéziós mo lekulák, több receptor és dokkoló fehé1jék vesznek részt a folyamatban . Molekulák aktív transzportja egy A BC transzporter segítségével bizonyítottan szerepet j átszik. A sejtek bekebelezése együtt jár a c itoszkeleton átrendeződésével adapter/szign álközvetítő molekulák segítségéveL A bekebe lezett sejt valam enny i biokémia i komponensét, makromolckuláját a lizoszómák enzime i a lapösszetevő ikre bontják.

Az apoptózis gátlása Az élő sej tekben a sejtha lál gépezete igen szoros kontroll a latt áll. Nagyon valószínű, hogy a sejtproliferáció negatív szabá lyozó elemeihez hasonlóan az apo ptózis inhibitorok az apoptotikus szignálútvona l tö bb szintjén is hatnak. Az apoptózis kontroll legismertebb példáj a a bel-2 fehérje hatása. A bel-2 gént e lőször mint a follicularis lymphomákba n leggyakrabba n transzlokálód ó gént ismerték meg. Azzal, a tumornöveked és szempontjábó l szekatlan tulajdonságga l rendelkez ik, hogy nem a sejtproliferác iót fokozza, hanem a sejtek túlé lését segíti , megnyújtja azok élettartamát. Úgy j árul hozzá az onl
A EJTP ROLI FERÁCIÓ É.

TERMÉSZETE

EJTHALÁL BIOKÉMIÁJ A

rül fény - többek között olyanokra, amelyeket vírusok is használnak arra, hogy az általuk fertőzött sejtek elhalását megakadályozzák. Ezen fehérjék hwnán megfelel őire jó példa a FLIP (amely a Fas intracelluláris szakaszának és a prokaszpáz-8-nak véletlenszerű aggregációját akadályozza meg) vagy az apoptózis inhibitor IAP-k, amelyek közvetlenül gátolják a kaszpázokat, vagy azok aktiválódását. A sejthalál biokémiai folyamatait tehát a sejtproliferációhoz hasonlóan igen hatékony ellenőrzö/gátló mechanizmusok szabályozzák.

Orvosbiológiai jelentőség A tennészetes sejthalál folyamata alapvető fontosságú az élő szervezet működésében. Enélkül nem lehetséges embriogenezis, nem alakul ki az ideg- és az immunrendszer optimá-

>>>»H>>>>mmHm>»>>»»m>n>»>m»m»m>>»»>m

5 19

l is funkciója, nem biztosítható a szövetekben a sejtpopulációk folyamatos megújulása. Molekuláris mechanizmusainak defektusa, a szükséges apoptózis elmaradása autoimmun kórképekhez, tumorokhoz vezethet. Bizonyított, hogy az apoptózist gátló fehérjék potenciális onkogének, az apoptózist k iváltó szignál útvonalak tagjai (beleértve a p53 transzkripciós faktort vagy a bax-ot) tumorgátló hatásúak. A nem megfelelő időben, helyen és mennyiségbcn jelentkező apoptózis funkcióvesztést, degenerációt eredményez, az ischaemiás szövetpusztulások progressziójának lényeges komponense az apoptózis típusú sejthalál. A neurodegeneratív Alzheimer-kór vagy a Parkinsonbetegség egyaránt kapcsolatba hozható fokozott apopózissal. A megismert molekuláris elemek új, hatékony terápiás stratégiák célpontjai lehetnek egyre több betegségben.

Az egyes szervek és szarvrendszerek működésének biokémiai alapjai

•

6.1. A kémiai idegingerület átvitel (neurotranszmisszió) molekuláris alapjai (Adám Veronika) Az akciós potenciál és a feszü ltségfüggő Na+-csatorna A kémiai ingerületátvitel jellemzői Am inosav neurotranszmitterek Glutamát A glutamát neurotranszmisszió szerepe a fiziológiás és patológiás folyamatokban GABA és glicin Acetilkolin Az acetilkolin szintézise, raktározása és felszabadulása a kolinerg neuronokban Kolinerg receptorok Az acetilkolin inaktiválása Katecholamin neurotranszmitterek. Noradrenalin, dopamin és adrenalin A katecholaminok bioszintézise és raktározása A katecholaminok metabolizmusa és inaktiválása A noradrenalin és az adrenalin receptorai Dopaminreceptorok Szerotonin Szerotani nreceptorok Neuropeptidek Opioid peptidek

6.2. Kontraktilis rendszer (Dux László) Az izomszövet kontraktilis rendszere A vastag filamentum rendszer, a miozin fehérje szerkezete A vékony filamentum rendszer A kontrakció mechanizmusa Az érett harántcsíkolt izom felépítés. Szupramolekuláris struktúra A vázizom hossz- feszülés összefüggése, a csúszó filamentum (sliding filament) modell A kalcium szignál keletkezése és eliminációja izomban A kalciumszignál és az izom szarkatubuláris rendszere A kalciumfelszabadulás mechanizmusa A kalciumvisszavétel mechanizmusa Az izomkontrakció energiaszükségletének biztosítása Az izomszövet alkalmazkodási reakciói Az izomfáradás, izomláz Az izom adaptációja, plaszticitása Az izomszövet citoszkeletális vázrendszere

Egyes fontosabb izombetegségek biokémiai alapjai Az izomszövet fontosabb anyagcsere-betegségei A citoszkeleton, membrán-citoszkeleton rendszer betegségei izomban Ioncsatorna-betegségek az izomszövetben

6.3. A kötőszövet és a hám struktúrfebérj éi (Machovich Raymund) Kollagének A kollagén bioszintézise és degradációja Elasztin Egyéb fehérjék Keratinok Fibronektin és laminin Proteoglikánok

6.4. Lokális hormonok egyes szervek működését befolyásoló hatása. Az eikozanoidok (Mandl József) Prosztanoidok Az arachidonsav metabolizmusa. Arachidonsavellátás. Foszfolipáz A 2 A "ciklooxigenáz" -út. Prosztanoid- és tromboxánszintézis A prosztanaid és a tromboxán katabolizmusa Leukotriének A lipoxigenáz-út. Leukotriének szintézise és Lebontása Eikozanoidok biológiai hatásai Eikozanoidreceptorok. Eikozanoidok és szignál transzdukciós rendszetek

6.5. Hemosztázis (Machovich Raymund) A véralvadék képződése és feloldódása A véralvadás molekuláris és celluláris mechanizmusai A fibrinogén és a fibrin A trombin szabályozása A protrombin aktiválása Az aktivált X-faktor keletkezése A véralvadás beindítása és a véralvadási kaszkád A trombinképződés szabályozása; a protein C A véralvadás inhibitorrendszere A szöveti faktor reakcióút inhibitora A vérlemezkék (trombociták) A fibrinolízis A fibrin feloldódása A plazmin keletkezése A plazminogén konformációváltozásai A plazminogénaktívátorok A plazminogénaktívátorok inhibitorrendszere A plazmin inhibitorrendszere A fibrinolízis szabályozása A máj szerepe a hemosztázisban Az endothelium szerepe a hemosztázisban

E

6.6. Mitokondriális betegségek (Sümeghy Balázs) A mitokondriális genom károsodása A mitokondriális genom mutációi és az ehhez kapcsolódó betegségek A mitokondrium oxidatív károsodása, öregedés Terápiás l ehetőségek

6.7. A klinikai laboratóriumi diagnosztika biokémiai háttere (Dux László) A klinikai laboratóriumi diagnosztika célja, feladata A laboratóriumi diagnosztika, rnint azélőszervez etek áramlási egyensúlyána k nyomon követése Normál-, referenciatart omány fogalma meghatározás a Kóros laboratóriumi eredmények típusai Laboratórium i diagnosztikai eredmények hibái, értékelése Az eredmények valódisága, pontossága, véletlen és szisztémás hibák Laboratórium i diagnosztikai mérések kalibrálása, standardok tipusai Külső minőségellenőrzés a laboratóriumi diagnosztikáb an A laboratóriumi diagnosztikai vizsgálatok fő fázisai A preanalitikai fázis Az ana litikai fázis A posztanal itika i fázis Szűrővi zsgálatok

A kémiai idegingerület átvitel {neurotranszmisszió) molekuláris alapjai

1•

Adám Veronika

Az idegrendszer al apvető jellegzetessége, hogy során elektromos jelek képzése és vezetése történik. Egyetlen neuronon belül az információt elektromos jelek továbbítják, amelyek egy másik neuroma vagy a beidegzett sejtre kémiai anyagok, neurotranszmitterek segítségével kerülnek át. A neuron tehát azzal a képességgel is rendelkezik, hogy az elektromos jeleket kémiai jellé, majd azt ismét e lektromos jellé alakítja át. Jelen fejezetben vázlatosan e két sajátosság molekuláris alapjait tekintjük át. működése

Az akciós potenciál és a feszültségfüggő Na+-csatorna Minden sejt, így a neuron működésének is egyik meghatározó feltétele, hogy intracellulárisan, a sejt citoplazmájában az ionok koncentrációja eltérő legyen - esetleg több nagyságrenddel is - az extracelluláris ionkoncentrációktóL A K+ a sejten belül koncentrálódik, a Na t, cr és a Ca2"~ koncentrációja viszont alacsonyabb, mint az extracelluláris térben. Az egyen lőtlen ioneloszlás e lektromos potenciál különbséget eredményez a plazmamembrán mentén, amely nyugalmi állapotban a neuronokban - 60 és - 80 m V közötti érték (belül negatív). A nyugalmi potenciált, amely hez penneabil itásukkal arányosan aK.. , a Na+ és a cr járul hozzá, a Goldman- Hodgkin- Katz-egyenlet írja Je:

ahol R az egyetemes gázállandó, T az abszolút hő­ mérséklet, F a Faraday-állandó, P a permeabilitási együttható, [ J az ionok extracelluláris (e) és intracelluláris (i) koncentrációi. ([K+] e = 4 mM; [K+]i = 145 mM; [Nalc = 140 mM; [Nali = 15 mM; [Cl ]e = 125 mM; [eni 9 mM) A sejtekben mérhető nyugalmi potenciálhoz néhány 1 mV-tal hozzájárul a Na' K -ATPáz 3Na'/2K' sztöichiometriájából adódó extra pozitív töltés kipumpálása (lásd még 432. oldal).

Mivel nyugalomban a plazmamembrán K+ iránti permeabilitása nagyobb, a nyugalmi potenciál nagyon közel van aK+ egyensúlyi potenciálhoz, azaz aK+ elektrokémiai gradiense közel O. Ezzel szembenjelentős Na+ elektrokémiai grádiens van a plazmamembrán mentén, ami szabad Na+-árarnlás esetén +60 mV-ra vinné el a membránpotenciált (a Na+ egyensúlyi potenciálja +60 m V). Külön említést érdemel a cr, amelynek nyugalmi eloszlása közel van az elektrokémiai egyensúlyhoz, nem lévén olyan cr-pumpa a membránban, ami grádienst tartana fenn. A gátló neurotranszmitter glicin és GABA receptorai (GABA-A) Cr-ioncsatornák, aktiválásuk a cr szabad áramtását teszi lehetövé, ami megakadályozza, hogy a Na+permeabilitás-növekedés ellenére depolarizáció jöjjön létre. A GABA és a glicin gátló hatásának ez a mechanizmusa.

526

))l>)))))))))>))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

SZERVEK, SZERVR ENDSZEREK M " KÖDÉSÉNEK BIOKÉMIAI ALAPJAJ

A neuron elemi működése az ingerület vezetése az akciós potenciál segitségével, amelynek során a nyugalm i potenciál hirtelen, nagy mértékben és átmeneti leg csökken. Kialakulását és terjedését az teszi lehetövé, hogy a plazmamembránban feszült, n·uggo" N a +- es ' K+ eg . -csa toma' k vanna k . A N a +csatornák már kis mértékű depolarizáció hatására aktiválódnak, 1- 2 ms időtartamig Na+-beáramlást engednek meg az elektrokémiai grádiens irányában, aminek következtében a membránpotenciál lecsökken és megközelíti a poz itív Na+egyensúly i potenciá lt. 1- 2 ms után a Na+-csatornák spontán inaktiválódnak, megszűnik a Na+-beáramlás. A nyugalmi potenciá lt a K+-kiáramlás állítja vissza, amely a késve aktiválódó feszültségfüggő K ~ -csa­ tornákon keresztül jön létre. Az akciós potenciál je llegzetes görbéje tehát két ion áramlásából adódik {6-1. ábra), s létrejöttét feszültségfüggő ioncsatornákjelenléte és működése teszi lehetövé.

>+60

.s

N

:ro .ü c

Q)

ö

E

::1.

~

·ro c -~ ....

o

'-.O 40 EE roQl

a. c

~

~E

.o E Q) -60 E

o

-~ ~ ro

1----i

1 ms 6-1. ábra. Az akciós potenciál görbéje (bal oldali skála) és a Na·-. illetve K· -csatornák aktiválása űobb oldali skála)

A feszü ltségfüggő csatornák közül legjobban a Na+-csatorna ismert, amelynek szerkezete alapvetően jell emző a többi csatomára is. A csatornát eml ős agyban egy 260 kDa molekulatömegű glikoprotein alkotja (a-alegység), amelyhez két kisebb alegység (!3~, 132 ) kapcsolódik, amelyek úgyszintén g likoproteinek és a csatorna megfelelő orientációját biztosítják a plazmamembránban (6-2. ábra). Az a-alegység négy azonos doménből áll , amelyek mindegyike hat transzrnembránszegmentet tartalmaz. Ezek a membránban úgy helyezkednek e l,

hogy - el sősorban az S 4 -szegmenttel - egy csatornát alkotnak. A feszültség érzékelését az S4 -szakaszban elhelyezkedő pozitív töltésű aminosavo ldalláncok teszik lehetövé, amelyek a nyugalmi membránpotenciálnál a szomszédos transzmembránszegmentekben található negatív töltésű oldalláncokkal kölcsönhatásba lépve rögzítik a fehérje szerkezetét, s ilyenkor a csatorna nem átjárható. Kismértékű töltéseloszlás-változás (depolarizáció) a pozitív töltésű o lda lláncok e lmozdulását teszi lehetövé, s ez olyan konformác ióváltozást jelent, amelyben a csatorna átjárhatóvá válik (0,3-0,5 nm átmérő). A permeabilitáshoz hozzájárulnak az S,-S6 szakaszokat összekötő szegmentek, amelyekben sok a glutamát és az aszpartát A csatornán való áthaladás esetén a Na... részlegesen elveszti a hidráthurkát A csatorna Na+ iránti szelektivitása nem kizárólagos, egyéb ionok (pl. Li 1) számára is átjárható. A csatorna megismerésében fontos szerepe t játszottak toxinok, amelyek az állat- és növényvilágban, valarnint az cmlös szervezetekben a a+-csatornához szelektíven kötődve s azt gátolva méregként müködnek. Legismertebb közülük a tetrodatoxin és a saxitoxin (halakban található toxinok) . amelyeket kísérleti körűlmények között a csatornákjelölésére használtak, s ez a tisztitá során lehetövé tette a csatornát alkotó fehérje nyomonkövetését Jelzett toxinek segítségével LUdták meghatározni az egyes zövctekben a Na--csatornák sürüségét is.

A Na+-csatornát intracellulárisan a cAMP-függő protein-kináz foszforil álja, ami feltehetően az inaktiválást segíti el ő. A csatornát foszforilálja a protein-kináz C is.

A feszültségfüggő Na+-csatornákat gátolják a klinikumban használatos helyi érzéstelenítők (lidokain, prokain), amelyek lipidoldékony molekulák, és a csatorna intramembrán hidrofób részéhez kötődnek. Klinikai hatásukat - az axonális vezetés átmeneti felfüggesztését - tö- ' kéletesen megmagyarázza a Na+-csatornák gátlása.

Az axonmembránban jelen lévő Na ' -csatornák az axon hillockban keletkező akciós potenciál tovavezetését teszik lehetövé. Ennek megfelelően a Ranvier-befüződések területén a Na ' -csatornák sű-

EUROTRANSZMl S Z IÓ MOLE K LÁRJS ALAPJA J 6·2. ábra. A feszültségfüggö Na• -csa· torna modellje (a) és az a -alegység transzmem bránszak aszai (b). P, a cAMP-függö protein kináz, ill. P, a protein-kin áz C által történö foszforiláció helyei. +, az s4 szegmentben található lizin és arginin; - , az Ss-S6 szakaszon levö glutamát és aszpartát aminosav oldallánco kat jelzi

527

a

helyi

érzéstele n ítők

b lll.

IV.

extracelluláris

intracelluláris

p

rüsége tízszeres e annak, mint ami a Ranvier -befií-

ződések közötti axonsza kaszon található. A Na+-

csatornák itt egységesek és funkciój uk az, hogy a rövid ideig tartó akciós potenciálokat továbbítsák. Ezzel szemben a kü l önböző izmokba n és szekréciós sejtekbe n többféle csatorna talá lható, am elyek inkább a kontra kciók, illetve a szekréciós' válaszok intenzitá sának és időtarta mának szabályo zásában játszanak szerepet, ezért változat osabbak és álta lában hosszabb an tartó depolari zációt tesznek lehetövé. A feszültségfüggö K • -csatomá król molelo.'Uláris szi nten lényegesen kevesebb et tudunk, m int a Na+·csato m ákról. Elcktroftziológiai paraméte rek, endogén regulá torok {pl. a citoplazmá ban jelen lévő Ca2 vagy AT P) és fa rmakológ ia i érzékenység a lapján számos K' -csatorna különít hető el, de molekuláris biológiai módszerr el e7idáig csak két csatornát azonosítottak. Ezek 7erkezete hasonló, de ne m azonos a a' -c atomáva L A K -csatorná t hat tran zmembrá nszakas zal rendel kező fehé rjék a lkotják, va l ószínű telrarner struktúrában (az össze en 24 transzmem bránszaka szt, tehát nem egy nagy polipe ptid tartalmaz za. mint a Na+·csato rnánál). Immuncit okémiai módszerrc l az egyik faj ta K csatornát inkább preszi naptikusan, a másikat inkább a dentriteken azono ították.

-------

A kémiai ingerületátvitel jellemzöi A neurotra nszmiss zió - azaz az ingerüle t terjedése egyik neuronról a másikra vagy egy neuronról a be idegzett sejtrc - kémiai anyagok, a neurotranszmitterek segítség ével történik. Definíc ió szerint a neurotra nszmitte rek olyan anyagok , amelyek az idegsejt ben terme l ődnek, az axonterminálisból depolari záció hatására szabadu lnak fel és receptor aikon hatva a p osztszin aptikus sejt aktiválását, illetve gátlását okozzák . A neurotra nszmisszió a legtöbb esetben morfoló giailag és funkcio nálisan egyarán t jól definjá Jható helyen, az ún. szinapsz isban történik . A szinapsz isban az " üzenete t" kü l dő neuron axonter minálisa alkotja a preszina ptikus terminá list, amit a szinapti kus rés vá laszt el a posztszinaptikus neuron (vagy be idegzett sej t) membrá njától. A preszina ptikus neuronbó l az akc iós potenciá l hatására fe lszabadu ló neurotranszmitte r a szinapti kus résen átdiffundálva éri el receptm·át a posztszi naptikus membrá nban. A neurotran szmissz ió á lta lában nagyon gyors és röv id ideig tartó fo lyamat (0,5- 3,5 ms a preszinapti kus akciós potenciá ltól a posztszinaptikus

SZERVEK, SZERVRENDSZEREK M Ű KÖDÉSÉNEK BIOKÉMIAJ ALAPJAJ

528

6-1. táblázat. A legfontosabb neurotransz~ mitterek "', Klasszikus neurotranszmitterek: acetilkolin noradrenalin dopamin szerotonln adrenalin hisztamin adenozin ATP ----------~----~--~------~~

Aminosavak : glutamát y-aminovajsav (GABA) glicin Peptidek: Met-encefalin P-anyag kolecísztokinin szomatosztatin vazoaktfv intestinalis peptid (VlP) vazopresszin

receptor aktiválásig), kivételt a lényegesen lassúbb hatású neuropeptidek jelentenek Az utóbbi évtizedekben nagyszámú kémiai anyagot azonosítottak, amelyek a központi és a perifériás idegrendszerben neurotranszmitter funkeiét töltenek be (6-l. táblázat). Ezek közül az ún. klasszikus neurotranszmitterek és az aminosavak viszonylag kis molekulák, és általában gyors szinaptikus hatásokért fel el ősek. Lassúbb és tartósabb hatásokat hoznak létre a peptid transzrnitterek, amelyek gyakran a klasszikus transzmitterekkel azonos terminálisban, kotranszmitterként fo rdulnak elő. A neurotranszmitterek nagy száma és a változatos mechanizmusok rnjatt a szinaptikus működé­ sek áttekintése nem egyszerű . Vannak azonban a neurotranszmissziónak o lyan jellegzetességei, amelyek hasonlóak tekintet nélkül arra, hogy meIyik neurotranszmitterről és milyen szinapszisról van szó. Mielőtt néhány fontosabb neurotranszmitterről részletesen szólnánk, azokat az általános sajátosságokat tekintjük át, amelyek a szinapszisban mennek végbe. Ezek vázlata a 6-3. ábrán látható.

Gáz-halmazállapotú: NO

depolarizáció

10

AXONTERMINÁLIS

Ca2+

transzmitterszihtézis

~

! @

TR

TR

preszinaptikus membrán SZINAPTIKUS RÉS

5 enzimatikus elbontás R

posztszinaptikus membrán

6-3. ábra. A neurotranszmisszió egyes elemei aszinapszisban. A depolarizáció (1) hatására megnyílnak a feszültségfüggő Ca 2·-csatornák (2), a Ca2• -beáramlás kiváltja a végkészülékben szintetizálódott és a vezikulákban raktározott transzmitter (TR) felszabadulását (3), a TR kötödik a posztszinaptikus membránban található receptorokhoz (4), amelyek vagy ioncsatornák, vagy G-fehérjéhez kapcsolódó receptorok (preszinaptikusan is találhatók), végezetül a transzmitter inakti-' válódik (5) (vagy enzimatikusan elbomlik, vagy a preszinaptikus membránon keresztül visszakerül a végkészülékbe)

NEUROTRANSZM I

ZIÓ MOLEKULÁRJ ALAPJA l

)))))))))))}))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))H))))))))))))))))))))))))))I))))))))

O A preszinaptikus terminálisban történik a leg-

több neurotranszmitter szintézise. A bioszintézishez szükséges enzimek j órészt a citoszolban találhatók, de egy-egy neurotranszmitter szintézisében vaJamely partikulumban található enzim is részt vesz. Ez aló l kivételt a peptid transzm itterek jelentik, amelyek a sejttestben zintetizálódnak, vezikulákba épülnek be és axonális transzporttal jutnak el a végkészülékhez. 8 A neurotranszmitterek raktározása a szinaptikus vezikulákban történik, amelyek 20-60 nm átmérőjűek és az axon terminális c itoplazmáj ában helyezkednek el. A vezikulák membránjában V típusú ATPáz található, amely proto ntranszlokáló enz im, és pH grádienst hoz létre a vezikulamembrán mentén, az intravezikuláris közeg relatív savanyodását okozva. A létrejövő proton elektrokémiai potenciál (belül pozitív) neurotranszmitterek felvételét teszi lehetövé. Az egyes neurotranszmitterekre specifikus transzporterek vagy a pH-grádiens (pl. acetilko lin, katecholaminok) vagy a membránpotenciál-kompon ens (pl. glutamát) vagy mindkettő (pl. GABA) terhére transzportálják a citoplazmában szintetizálódott transzmittereket a vezikulába (6-4. ábra).

NT

6-4. ábra. V tipusú ATPáz a szinaptikus vezikulák membránjában. A neurotranszmitter transzportja vagy a pH-grádiens (1 ), vagy az elektrokémiai potenciálkülönbség (2), vagy mindkettö (nem jelezzük) terhére történik. NT, neurotranszmitter

@)

529

A preszinaptikus neuron depolarizációja a vezikulák és a plazmamembrán fúz ióját váltják ki és megtörténik a neurotranszmitterek felszabadulása. E téren i lényeges a kü lönbség a klassz ikus neurotranszm ittereket tarta lmazó kis méretü, elektronmikroszkóp alatt áttetszőnek látszó vezikulák (a továbbiakban csak kis vezikulák) és a peptideket tartalmazó nagy, a középen sű rűbbnek imponáló (dense core) vezikulák között. A kis vezikulák a citoplazmában nem random módon helyezkednek el, hanern az axon terminális szinaptikus rés felőli membránja közelében, az ún . aktív zónában találhatók, aho l a plazmamembránban nagy a feszültségfüggö Ca2 1-csatornák sűrűsége. Innen történik a dcpolarizációt kisérő Ca2+-belépés közvetlen hatására a vezikulák kiürülése a szinaptikus résbe. Maga a fúzió olyan rövid ideig tartó folyamat, hogy nem jöhet létre a vezikulák és a plazmamembrán teljes egybeolvadása, hanem a vezikulák újra azonnal v i sszafűzödnek, megőrizve integritásukat A plazmamembrán és a vezikulamembrán lipid- és különösen fehérje-összetétele teljesen eltérő (pl. a a•K -ATPáz, amely esszenciális fehérje a plazmamembránban, nincs jelen a vczikulákban, de a V tipusú ATPáz, amely fontos fehérje a vezikulamembránban, nincs a plazmamembránban). l Ta a szinaptikus vezikulák egyszerűen endoci tózissal füzödnének Ic a plazmamembránból a két membrán összetételének többékevésbé azonosnak kellene lenni.

A neurotranszmitter-felszaba dulás molekuláris mechanizmusáról ma má r sok információ áll rende lkezésre, sok részlet azonban még feltáratlan. A folyamatban a neurotranszmittert tartalmazó vezikulák a plazmamembrán közelébe kerülnek, annak egy kitüntetett részén, az ún, aktív zónában létrejön a kapcsolat a vezikula és a plazmamembrán között ("docking"). A két membrán fehérjéi között kialakuló kezdeti kötés, ame ly alkalmassá teszi a vezikulákat az exocitózisra az ún. priming, amely feltétele a membránok fúziójának Az ily m ódon el ő­ kész ített membránok Ca 2 ~ hatására fúzionálnak (exoc itózis), amelynek során a vezikulákban található neurotranszmitter a szinaptikus résbe kerül. A vezikulák ezután l efűzödnek a plazmamembránról (endocitózis) és endoszómák-

530

)})))))))>))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

SZ E RVEK, SZER R ENDSZERE K M ~ KÖDÉSÉN EK BIOK ÉMIAI ALAPJAl

ka l fuzionálnak, ahonnan újra l e ffiződ ve ismét szinaptikus vezikulák keletkeznek. A proton elektrokémia i grádiens terhére tö rténő neurotranszmitter-fe lvétel után a veziku lák visszakerülnek az aktív zónába (transzlokáció) és alkalmassá válnak az exocitózisra. Az egész fo lyamat körülbelül 1 perc a latt lezajlik, amibő l az exocitózis maga kevesebb mint l ms-ot vesz igénybe. A szinaptikus vezikuláknak ez a ciklusa ok szempontbó l hasonló más vezikuláris transzporthoz, azonban egyedülálló a szigorú reguláció és a rendkívül gyors lefo lyás szempontjábóL A vczikula membránjában és a plazmame mbránban számos olyan fehérje található, amelyek részt vesznek az exocitózis előkészítésében, inic iá lásában és az azt követő folyamatokba n. Ezek közül a teljesség igénye nélkül csak a fontosabbakat és azokat említjük, amelyek funkc iój át ismerjük. E lnevezésük, ame ly nem követ semmil yentörvényszerűséget egy saj átos nómenklatúrát mutat, és sok esetben az ado tt fehérje oldékonysági vagy kötési viszonyaira utaló rövidítéseket takar (6-2. táblázat). Az egész fo lyamatot is csak vázlatosan ismerte tjük (6-5. ábra). A vezikula és a plazmamembrán közölti az exocitózishoz elengedhetetlen kap-

6-2. táblázat. Néhány, a neurotranszmitterek felszabadulásában szerepet játszó fehérje Szi naptikus vezikulák membránjában rab-fehérjék

Ras-hoz hasonló GTPáz aktivitással rendel kező fehérjék

synaptobrevin

V-SNARE; vezikuláris SNAP-receptor

synaptophysin

több fehérjét jelöl, amelyek pórus alkotására képesek, kötik a synaptobrevint

1---s~-~-~_P_t~_ta_g_:_i_n_........_ Ca

2 ..·ot

és

foszfolipidek~

Plazmamembránban

l

SNAP-25

(szolubilis NSF-attachment faktor)

NSF

(N-ethylmaleimid sensitíve factor) ATPáz aktivitással rendelkezik

syntaxin

Kötni tudja a SNAP-25-öt, synaptota~mint, synaptobrevint, N tipusú Ca ..-csatornákat és a SNAP fehérjéket

neurexln

a -latrotoxin receptora

feszültség-függő

Ca2• -csatornák

6-5. ábra. A vezikulák exocitózisában részt vevő fontosabb fehérjék. A neurotranszmisszió( befolyásoló toxinak hatáshelyei

vezikulamembrán

plazmamembrán

syntaxi/

botulinum toxinak

a -latrotoxin

NEUROTRA NSZM IS Z IÓ \10LE K LÁRI A LA PJAJ

>>>>>m>> >>»>»>»>>>>>>>>>>»>> >>»mmm>>»>>m » » » >»>m>''» m >>»>>>>»»>>»>»>»>>»>

csolat (synaptic core cornplex ) kialakítá sában három fehérje vesz részt; a plazmamembránb an található syntaxi n és SNAP-2 5 (amelyek a t-SNAR E-t alkotják ; t = target) és a vezikula membrá njában elhelyezked ő synapto brevin vagy v-SNAR E (v = vezikulá ris). A v-SNARE és t-SNARE fehérjék a c itoplazm atikus részen található a -helixek en keresztü l kapcsolódnak össsze hidro fób és ionos kölcsön hatások révén. Ez a komplex nem j ön létre az aktív zónától távol eső membrá nrészen, a hol a syntaxin a plazmam embránban nem a SNAP-2 5-hez, hanem egyéb fehérjékhez, a vezikul amembránban pedig a synapto brevin a synapto physinhe z kötődi k, megaka dályozv a a core komplex létrejöttét. A három fehérje által alkotott komplex (synapto brevin- syntaxinSNAP-2 5) receptor ként szolgál a SNAP és az NSF számára (innen ered a SNARE elnevez és). Több fehérj e tartozik a SNA P családba (a, j3, y), de az elnevez és e llenére, a SNAP-25 nem. Az NSF ATPáz aktivitás sal rendelkező fehérje, amelyne k meghatá rozó szerepe van a membránfúzió val járó fo lyamato kban. ATP hidrolíz is közben az NS F hatására a komplex szétesik , de eközben va l ószínű l eg megtörténik a két membrán részlege s fúziója. A komplex ke letkezés e és szétesés e alkotja az ún. pr iming folyama tát, 2 ami után a Ca + hatására megtörténhet a két membrá n te ljes fúziója A szinapti kus vezikulá k és a plazmam embrán összeka pcsolód ása az aktív zónában jön létre, ahol leülönösen nagy a plazmamembrán ban a 2 feszültségfüggő Ca +-csatorn ák sűrűsége (első­ 21 sorban N típusú csatorná k). A Ca -csatom á2 kon át bel épő Ca + a membrá n közvetle n 2 környe- zetében (mikrodomén) je l entős Ca "' ka ncentrác ió-eme lkedést okoz, ami az exoci2 tózis közvetle n ki váltój a. A Ca ' -koncen trá2 ció a Ca +-csatornák intracellulári oldaláná l átmenetileg akár l 0- 100 )..lM is lehet, ahonnan 2 a csatorná k inaktiválódása után a Ca ' eidi ffundál az axon tenniná lis távolabb i részébe. A Ca2 +érzékel őj e va l ószínűleg a synapto tagmin, amely a vezikulá k membrá njában található 2 Ca2+-kötő fehérje és Ca + hatására foszfolipidekh ez, illetve a syntaxinhoz kapcsolódik. Maga a fúzió valószíníHeg egy nagyon komplex folyamat, amelybe n szerepe van a synap-

53 l

totagmin- syntaxin kölcsönhatásnak , a foszfolipidekh ez való kap csolódá snak (ami a membrá nokat átstrukn trálhatja ) és egyéb feh érj ékkel, így pé ldául a plazmam embránban c lhel yezkedő neurexinne l létrej övő kölcsön hatásnak. Meg kell említeni , hogy a rab fehérje család számos tagjának fontos szerepe van abban , hogy vezikulák álljanak a transzm itter-felszabadu lás rendelke zésére. Ezek viszony lag ki mol ekulatömegű GT P-kötő és hidroliz áló fehérjék , amelyek GTP-kö tött forrnába n a vezikulá k membrá njához kapcsoló dnak A membrá nfúzióba n közvetle nül nem vesznek részt, de hiányuk ban a szina ptikus transzmiszszió csökken. Szintén nem a mernbrá nfúziót befolyás olják, de a neurotra nszmiss zióban mégis fontos szerepet j átszanak a szinaps ziook, azok a vezikula membrá nban he lyet foglaló fehérjék , amelyek nek több tagját ismerj ük, s amelyek foszfori lációval reguláló dnak. A szinapsz inokat foszforilálja a cAMP-függő protein- kináz és a Ca2 '-kalmodulin függő protein-kináz I, és c ak a szinapszin l-et a CaMK JI is. A szinapsz in l citoszke letális fehérjékhez, így aktinhoz is kapcsolódik, aminek követke ztében a vezikulákat rögzíti az idegvégződésen be lül. Ami kor 2 ismételt stimulác iók követke ztében a Ca · ka ncentrác ió a végkész ülékben megeme lkedik; a CaM K n aktiválódik és foszforil álja a szinapsz in l-et. E nnek követke ztében megszű nik az aktinhoz történő kötődés , ezáltal a vezikulá k kirögzítettsége, és így a vezikulák az aktív zóna közeléb e kerülhet nek. A szinapsz in l-nek tehát az a szerepe, hogy segítség ével a tartós stimulác ió során a végkészülékben vezikulák á lljanak a neurotran szmitter -fe lszabadulás rendelke zésére. Ennek je l entőséget tulajdonítanak a memóri a rögzülés e szempontjábóL Az exocitózi s egyes kompone nseivel történő kölcsönhatás m iatt ·zámos tox in gátolja vagy éppen kontrollálatlan ul sti mulálja a neurotranszmi tterek felszabadu lását. A p roteáz aktivitással rendel kező tetanus toxin é botulinum toxinek a v-S ARE t-S ARE kom plex kialak ulását gátolják, mert hasítják a synaptobrevint (tetanus), a S A P25-t vagy a yntaxint (botulinu m tox inok), ezáltal a transzm itter-fel zabadu lást tartósan gátolják. Az a-latrotox in (a Fekete Özvegy pók

·,

532

))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))) )))))))

ZERVEK, SZERVRENDSZ EREK 1 .. KÖDÉ ÉNEK 810KÉMIA I A LAPJA l

toxinja) a neurexint köti és trans7mittcr-felszabad ulást okoz Ca2 ' -stimulus né lkül is. Más a helyzet a nagy (>70 nm). peptidtarta lmú, ún. den se core vc7ikulák ese tében. Ezek az aktív zónáktól távol helyezkednek cl, mobilizálás uk nem a hirtelen és lokál is [Ci' ]-cmelkedés hatására törté nik, hanem a végkészülékben diffú zan megemel kedő [Ca 2 ]-koncentrációra reagál nak. A pepti de rg axonterrni ná lisokban L- és Ncsa tornákat talá ltak. A plazmamem bránnal történő fúzió álta lában a szinapti kus réstöl távolabb j ön létre, s a felszabadul t peptid di ffúzióval éri el a környező ne uronokon található receptorait A vezikula és a plazmamembrán közölt az exocitózis! követően a fúzió tökéle tes, hiszen hiába i fúződ ne le ismét a veLikula, a végkés7Üié kbcn, ahol ni ncs fehérjeszintézis, nem tudna új ratöltöd ni.

O A fel szabadult transzmitter diffúzióv al éri el a

posztszinaptikus membránt, aho l receptor ához kötődik, s ez kiváltja a posztszin aptikus neuron vagy ejt (simaizom , harántcsí kolt izom, mirigy) válaszát. A receptoro król már részletesen széltunk (lásd 5. 1 fejezet). Jelen fejezetbe n az egyes neurotran szmittere k specifiku s receptorairó llesz szó. A gyors neurotranszmitterek legtöbbje receptor ioncsatornához kötődi k, s attó l függően , hogy a receptor milyen ionra permeábilis, posztszin aptikus aktiválás vagy gátlás j ön létre. A posztszinaptikus me mbrán metabotro p, G-fehéijé vel működő receptoro kat is tartalmaz, a mel yekrő l szintén szóltunk már. Meg kell jegyezni, hogy a legtöbb végkészülékben a preszinaptikus membrán is tartalmaz receptoro kat, amelyek vagy autorecep torok, vagy más transzmit terek receptora i, és aktiválásuk a transzmit terfelszabadulás gáttását vagy serkentését eredmény ezi. 0 Nagyon fontos feladata a szinapszisnak a felszabadult transzmi tter inaktivál ása, azaz a receptor környeze téből történ ő eltávolítá sa, amely két módon mehet végbe. A transzmit ter vagy enzim hatására elbomlik és inakti válódik, vagy a preszinaptik us membrán ban található, specifiku s transzporterén keresztül visszaker ül a preszinaptikus citoplazm ába. A transzport a Na+ elektroké miai grádiens terhére történik ún. másod Iagos, Na+- függő kotranszp orttal (lásd 436. o ldal). A továbbiak ba n a teljesség igénye nélkül áttekintjük néhány neurotranszmitter speciális sajátosságait, funkciójá t és jel entő égét.

Amino sav neurotranszmitterek Az aminosavak közül a g lutamát, a glutamátszármazék GABA és a glicin az általános metabolikus szerepen kívül transzmitter funkciót is ellátnak a központi idegrends zerben. A két eltérő funkciót eltérő intracelluláris kompartmentekben található aminosav készlet látja el.

Glutamá t Részleteit illetően leginkább a g lutamát neurotranszmisszió ismert. A glutamát a legfontosabb excitátoro s transzmitter a központi idegrends zerben. Immunhisztokémi ai vizsgálat tal, különö- sen a cortex, a hippocam pus, a striatum és a cerebeliu m területén lehet glutamat erg neuronokat kimutatni . A neurotran szmisszió ról szóló általános részben összefoglalt sajátossá gok a g lutamát transzmisszió esetében az alábbiak (a váz latos összefoglalás az 6-6. ábrán látható): A glutamát a vér-agy gáton (agyi kapillárisok endothelsejtrétege) nem tud áthatolni, szintézise az agyban történik. A glutamát keletkezé sének legfő bb útjai a transzam inálás, az a-ketoglu tarátból történő g lutamát-d ehidrogen áz reakció és a glutamin dezamidá lása. Ezek a reakciók részleteib en a 2.4. fejezetbe n olvashatók. A glutam in az a tracitá kban szintetizá lódik a g lutamin-szintetáz hatására. A glutamin ~ glutamát átalakulás a neuronokban a mitokond rium be l ső membrán bel ső felszínén lokalizáló dó g lutam ináz hatására megy végbe. A neurotranszmisszió ban szerepet játszó glutam át nem a citoplazm ában loka lizálódik, hanem a metabolikus folyamatokban részt vevő glutamáttól elkülönítve, a szinaptik us vezikulák ban raktározódik. SpecifLku s gluta mát transzporter található a vezikulák membránjában, amely a citoplazm ából ahol a glutamát koncentrációj a mM-os nagyságrendben van - g lutamátot transzportál a vezikula belsejébe, a kb. 50- l 00 mM ke ncentráció ellenében. A transzpottcr K1-értéke (analóg az enzimolégiában használatos KM-értékkel) 1- 5 mM . A glutamát mint anion transz portálódik az elektrokémiai potenciál terhére, amit a vezik:ula membránjában található protonpu mpáló ATPáz tart fenn. A glutamát transzpor ter specifikus, aszpartát ot nem

E ROTRANSZMIS Z IÓ MOLEKULÁRIS ALAPJAJ

)))))))))))))) ~))))))))))) )) )))))))))) >) )))))))))) )))) ))>>)))) )) )))) )) }) )) )) )> )) >) >)>) )) )) )) )) )))) >~))H

533

glia glutam i n - + - - - - - - - - - - + transzaminálás

l K+

Gl~~~v~ ' ---i~

2 Na+

Glu NMDA AMPA/kainát

j

6-6. ábra. A glutamáttal müködö szinapszis vázlata. G/u, glutamát; Gin, glutamin; G/u-T, glutamát transzporter; R, receptor; NMDA, N-meti/-o-aszpartát; AMPA, o.-amino-3-hidroxi-5-metil--4-izoxazo/-propionsav

transzportál, szelektív gátlója ezidáig nem ismert. A fiziológiás stimulusra, a Ca2+ közvetlen hatására a vezikulák exocitózisa következik be és a glutamát a szinaptikus résbe ürül. Glutamátreceptorok. Két receptor típus ismert, amelyhez a glutamát szelektíven kötödhet: az ún. ionotrop receptorok, amelyek ioncsatornák és a glutamátreceptorok nagy többségét alkotják, valamint az ún. metabotrop, G-fehérjébez kapcsolódó receptorok. Az ionotrop receptorokon belül az eltérő farmakológiai érzékenység a lapján NMDA(N-metii-D-aszpartát), AMPA- (a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxazol-propionsav) és kainátreceptor különíthetö el, az utóbbi kettőt gyakran egynek tekintik és AMP Nkainát vagy egyszerűen nem NMDA-receptornak nevezik. Az NMDAreceptorokról, amelyek Na+-ra, K+-ra és Ca2+-ra permeábilis csatornák, már részletesen száltunk (458. oldal), jelen fejezetben csak spec iá lis jelentöségüket tárgyaljuk.

Az AMPA-receptorok a központi idegrendszer legkülönbözőbb részén megtalálhatók. A receptor ioncsatorna aktív állapotban elsősorban monovalens kationokra (Na ~. K+) permeábilis, tehát posztszinaptikus depolarizációt okoz, de bizonyos helyeken Ca2+-ra permeábilis AMPA-receptort is leírtak. A receptor klónozásával több AMPAszelektív csatornát azonosítottak, amelyekben az alegységek - az acetilkolin nikotinreceptorhoz hasonlóan - pentarner komplexet képeznek. A metabotrop glutamátreceptorok (mGluR) a hét transzmembránszegmentte l rendelkező, G-fehérjékhez kapcsolódó receptorok családjába tartoznak. Ezen belüllega lább hét receptort klónoztak és azonosítottak, amelyek között vannak olyanok, amelyek az inozitol-foszfolipidek hidrolízisét aktiválják és olyanok, amelyek az adenilát-cikláz, illetve a Ca2+-csatornák gátlását okozzák. Pre- és posztszinaptikusan egyaránt megtalálhatók, és hatásuk az egyes agyterületeken más és más lehet. A preszinaptikus receptorok egy része gátló auto-

534

l

,,".,,,",,.,»"»>>>>>»»>»>m»»>»>>~»»»>>n>»»>>»

SZE RV E K, SZER RENDSZEREK MŰKÖDÉSÉNEK BIOKÉMIAI ALAPJAl

receptor, tehát a g lutamaterg axon terminál i on találhatók és aktivá lásuk a glutamátfelszabad ulást gátolja. Ez általában a preszinaptikus K+-csatornák aktiválásának vagy a Ca2"'"-csatornák gátlásának a következménye. A glutamaterg neuronokon olyan preszinaptikus receptorok is vannak, amelyek pozitív feedback szabályozást gyakorolnak. Ebben a zabályozásban a protein-kináz C és a K +-csatornák gátlásának szerepét igazolták. Inaktiválás. A szinap6kus résben a glutamátkoncentráció az exocitózist követően rns-on belül lecsökken, részben a g lutamát d i ffúziója, részben a glutamát transzporter működése következtében. A g liasejtek és a preszinaptikus glutamaterg neuronok membránjában Na+-glutamát ko transzporter található, amely a Na+-grad iens terhére glutamát felvételét teszi lehetövé. A transzporter sztöchiometriája 2Na' + glutamát/ IK+, azaz a Na+- és gluta má tfe lvétellel párhuzamosan a transzporteren keresztül a K+ ellenkező irányú transzportja történik. Ez utóbbi sajátosság nem jellemző a többi aminosav (GABA, gl icin) transzporterre. A g lutamát transzporteren keresztül aszpartát is felvételre kerül. Minthogy azonban a vezikulák aszpartátot nem vesznek fe l, a fiziológiás stimulus asztpartátot nem, csak g lutamátot szabadít fel a végkészülékbőL

A glutamát lleurotranszmisszió szerepe ~peciális fiziológi ás és patológiás folyamatokban A glutamát fiziológiás körülmények között a központi idegrendszer legfontosabb excitátoros neurotranszmitter e. Jelenlegi ismereteink szerint a hippocampus glutamaterg neurotranszmissziójána k kitüntetett szerepe lehet a tanulás és az emlékezés folyamatában. Az információk kezdeti rögzítésében - mielőtt az még a cortexben tárolódna - a hippocampusnak tulajdonítanak szerepet. Az egyik lehetséges modell ennek vizsgálatára az ún. long term potentiation (LTP), amelynek az a lényege, hogy a hippocampus adott szinapszisaiban a preszinaptikus glutamaterg neuronok rövid ideig ta1tó nagy frekvenciájú ("tetanikus") ingerlése után hosszú ideig, akár hetekig megnő az adott, egységnyi preszinaptikus ingerléssei

kiváltható posztszinaptikus válasz (epsp; excitátoros posztszinaptikus potenciál) erőssé­ ge, azaz a szinapszis "emlékszik" az előző tetanikus ingerlésre. Ennek kialakulásában az NMDA-receptoro k szerepe egyértelműnek látszik: NMDA-receptor-a ntagonisták az LTP kialakulását gátolják. Az NMDA-receptoro k az AMPA-receptorok kal együtt fordulnak elő, az utóbbiak aktiválása a tetanikus ingerlés következtében olyan mértékű posztszinaptikus depolarizációt hoz létre, ami az NMDA-receptorokon a Mg2 t -gátló hatását felfüggeszti (458. oldal), az NMDA-receptoro k aktiválódnak és Ca2+-belépés jön létre. A Ca2+ számos fehé1jét, enzimet aktiválhat, de nem világos, hogy ezek közül melyik és mi módon vesz részt az LTP kialakulásában. Az LTP kialakulásában szerepet játszhat egy retrográd messenger is (esetleg a nitrogén-monoxid), amely az NMDA-receptorok aktiválásának következtében posztszinaptikusan keletkezik és preszinaptikusan fokozott glutamátfelszabad ulást vált ki. A glutamát neurotranszmisszió és az NMDA-receptoro k a hypoxiás agyi károsodás kialakulásában is döntő szerepetjátszanak . Elhúzódó anoxia (pl. szívmegállás vagy trombotikus érelzáródás következtében) sejtkárosító és neurotoxikus hatású. Az energiatermelés károsodása miatt a sejtek tartósan depolarizálódnak, a glutamaterg neuronokból glutamátfelszabadulás történik, ami az NMDA-receptorok tartós aktiválása következtében a posztszinaptikus neuronban nagymértékű [Ca2+]i-emelkedést okoz, ami pl. az intracelluláris Ca 2+-függő proteázok aktiválása következtében sejtkárosító tényező. A helyzetet rontja, hogy a pozitív feedback szabályozás további glutamát felszabadításával erősíti fel a folyamatot. NMDA-receptor-g átlókkal, egyelőre csak kísérteti körűlmények között, az ischaemiás sejtkárosodás lényegesen csökkenthető a hippocampusban és a striatumban, amelyek egyébként a bypoxiára a legérzékenyebb területek. A hypoxia során bekövetkező egyes események lehetséges összefüggését az 6-7. ábra mutatja. Döntő szerepet tulajdonítanak a glutamát neurotranszmisszi ónak az epilepsia és néhány

NEU ROTRANSZM ISSZIÓ MOLEKULÁ RI ALAPJAl

>>n»>>>>>>»>->>>>>>>>>>>>>>)>>>>>>>>>>n»>>>>>>>>>>nn>>>>H>>••n>>>I'>>>>H>>>>•>n>>>>>>>>H>>l>>>

535

neurodegen eratív betegség kialakulásában. Kisérleti körülmények között epilepsia váltható ki a g lutamát neurotranszmisszió túlzott stimulálásával, s ebben mind az AMPA-, mind az NMDA-rec eptorok aktiválása szerepet j átszik.

ATP-szintézis J..

Na~K'-ATPáz-gátlás

~ depolarizáció

~

GABA és glicin

glutamátfelszabadulás

~

posztszinaptikus NM DA-receptor-aktiválás

2

~

[Ca +],-emelkedés

~? sejtkárosodás

6-7. ábra. Az ischaemiás neuronális károsodás kialaku lásának lehetséges tényezői

A központi idegrendsz er legfőbb gátló neurotranszmitte re a y-aminovajsav, (y-aminobu tirát) a GABA, amely a legtöbb agyi régióban megtalálható és a glicin, amely az agytörzsben és a gerincvelőben játszik szerepet. A GABA-val működő szinapszis vázlatát az 6-8. ábra mutatja. A GABA-szi ntézis és -lebontás az ún. GABA-shu nt útján történ ik (6-9. ábra) , amelyhez a legfontosab b prekurzor a glukóz, amelynek metabolizmus a a Krebs-ciklust működteti. A GABA keletkezése közvetlenül g lutamátból történik a glutamát-d ekarboxiláz (GAD) hatására, amely piridoxál-f oszfát kofaktorral működik. Az enzim

6-8. ábra. A GABAerg axon termi nális sémája. Az ábrához a részletes ismertetés a szövegben olvasható. GABA-T, GABA-transzporter

glutamát Ir GLUTAMÁT-. ] DEKARBOX ILAZ

GABA

GABA/

~

~

Cl- ioncsatorna

-.

536

>>>l>»>>>>>>m»>>>>>m»>»>>m>>~»>>>~»>>»>m»m>>>>

SZ ERVE K, SZERVRENDSZEREK MÜKÖDÉSÉNEK BIOKÉMI AI ALAPJAl

a.-ketogtutarát

glutamátdekarboxiláz

Krebsciklus szukcinát-szemialdehid

GABA (y-aminobutirát)

szukcinát

6-9. ábra. A GABA-shunt

specifikusan, csak a GABA transzmitterrel műkö­ dö neuronokban expresszálódik. Így a központi idegrend- szerben a GAD kimutatása (antitesttel, mRNS-hibridizációval) a GA BAerg neuronok azonosítására alkalmas. A glicinnek az agyban nincs speciális metabolikus útja, szintézise a 2.4. fejezetben leírtak szeri nt történik. A GABA- és a glicinfelvétel a szinaptikus vezikulákba, bár bizonyitott, de részleteiben kevésbé ismert, mint a glutamát felvétel. Úgy tűnik, hogy a két gátló neurotranszmitter aminosav közös vezikuláris transzporteren jut be a citoplazmából és a transzportpH-grádiens terhére történik. A depolarizáció hatására felszabaduló GA BA a GABAA-receptorokat aktiválja és a megnövekedett c r -permeabilitás következtében a posztszinaptikus neuron rnűködése gátlódik. A GABAA- és a glicinreceptor c r-ioncsatoma, amelynek tulajdonságairól már részletesebben száltunk (458. oldal). A GABA metabotrop, G-fehérjékhez kapcsolódó receptorokat, ún. GABABreceptorokat is aktivál, amelyek pre- és posztszinaptikusan egyaránt megtalálbatók.

A GABAA-receptor farmakológiailag szelektíven aktiválható és gátolható, de ennek egyelő­ re terápiás jelentősége nincs. A receptcron

alloszterikus kötőhelyek vannak, ahol endogén anyagok, iiJetve az orvosi gyakorlatban használt gyógyszerek kötődnek. A szorongás tüneteinek oldására használt benzodiazepinek kötődése például a csatornák nyílásának valószínűségét növeli, rnfg a barbiturátok és egyes szteroidok jelenlétében a csatornák GABA hatására trutósan nyitva maradnak. A barbiturátok aktiválják a csatornát GABA részvétele nélkül is, s valószínű ez magyarázza nagyobb koncentrációban megnyilvánuló általános anaestheticus hatásukat.

A GABAA-csatornán intracellulárisan (a 3. és 4. transzmembránszakaszt összekötő burkon) olyan konszenzushelyek vannak, ahol a protein-kináz A, C és protein-tirozin-kinázok foszforilálnak. A protein-kináz A-val történő foszforiláció a csator- , nát gátolja. A GABAA-receptort az etanol stimulálja, ami magyarázhatja az alkohol általános szedatív hatását. A glicinreceptornak ezidáig specifikus aganistája és antagonistája nem ismert. A sztrichnin, egy növény i alkaloid azonban a receptort gátolja, bár nagy affinitású kötőhelye nem azonos a glicin kötő hellyeL A gátló glicinreceptorok blokkolása következtében a strichnin generalizált görcsöket okoz.

NEUROTRANSZMISSZIÓ MOLEKULÁR IS ALAPJAJ

Acetilkolin Az acetilkolin volt az el ső kémiai anyag, amelynek neurotranszrnitter szerepét igazolták. Megtalálható mind a központi, mind a perifériás idegrendszerben. Acetilkolin a transzmitter a neuromuszkuláris szinapszisban, ahol a harántcsíkolt izom tónusát és kontrakcióját szabályozza. Jelen van a vegetatív ganglionokban és acetilkolin a transzmitter a paraszimpatikus posztganglionáris rostokban, ahol a szív, a gyomor- bél traktus, az emésztőrendszer mirigyeinek, a pupillának stb. a paraszimpatikus beidegzését közvetíti. A központi idegrendszerben elszórtan a cortexben, hippocampusban és az alacsonyabb agyrégiókban egyaránt megtalálható.

Az acetilkolin szintézise, raktározása és felszabadulása a kolinerg neuronokban Az acetilkolin szintézise a kolinerg neuronok axon terminálisában történik kolinból és acetilCoA-ból a kolin-acetil-transzferáz (CAT) hatására (6-10. ábra). Mivel az enzim csak az acetilkolint szintetizáló neuronokban van jelen, immunhisztokémiai kimutatása a központi idegrendszeri kolinerg pályák feltérképezését tette lehetövé. Az axon terminálisban az enzim a citoszolban lokalizálódik. A szintézishez az acetilCoA a mitokondriumban piruvátból keletkezik, citrátként transzportálódik a citoplazmába és ott az ATP:citrát-liáz hatására keletkezik. Az acetilkolin

kolin

acetil-GoA

»>>))

))))))))))))) ) )))))))) )) )))) ))))))))))))))))))))))))))))))))))))>))))))))))))))))))))) )))) )))) ))))

szintézisben nem a CAT működése a sebességmeghatározó (KM kolin iránt ~ l mM), hanem az, hogy kolin a szükséges mennyiségben rendelkezésre áll-e. A neuronokban de novo kolinszintézis nem történik, a vérplazmában a kolin koncentrációja - l OmM. A kolin egy speciális, csak a kolinerg neuronok plazmamembránjában megtalálható, ún. nagy affinitású kolin-transzportrendszeren keresztül kerül a citoplazmába (K1 = 1- 5 j.!M), amely a Na+-kotranszporterek családjába tartozik. (A többi sejt a foszfolipidek szintéziséhez szükséges kolint kis affinitású, Na+-tól nem fúggő transzporterrel veszi fel, amelynek K1-értéke 10- 100 j.!M). A kolin transzporteren keresztül a neuronba kerülő kolin legalább fele a neuronból felszabadult acetilkolin hidrolízisébő l származik és újra felhasználódik az acetilkolin szintézisére. Alternatív kolinforrást jelenthet a foszfatidilkolin Lebomlása, ami a központi idegrendszerben kiilönösen jelentős, ahol a vérplazmából kolin - a vér-agy gát barrier következtében - csak korlátozottan áll rendelkezésre. A végkészülékben található acetilkolin 80%-a vezikulákban lokalizálódik, ahova a citoplaz mából a vezikula aceti lkolin/H+ cseretranszportere szá llítja. A kolinerg vezikulákban A TP is j elen van, de ezidáig nem ismert az a mechanizmus, ahogy az A TP a vezikulákba kerül. Egy vezikula az emlős központi idegrendszerben kb. 2000 acetil kolinmolekulát tartalmaz, s bár metodikai nehézségek miatt a neuromuszkuláris junkcióban ez az adat ne m á ll rendelkezésre, az elektrofiziológiai analízis alapján itt is hasonló nagyságrend tételezhető fel. Az izom nyugalmi működését jellemző miniatür véglemez-potenciá lok a veziku lákból felszaba-

t

KOLIN-ACETIL-TRANSZFERÁZ

6-10. ábra. Az acetilkoli n szintézise

537

acetilkolin

538

»>>»>»»»>>>>>>m»>»>»>»>»>m»»»>»»>>>»>»»»>

SZERV EK, SZERVRENDSZERE K MŰ KÖDÉSÉNE K BlüKÉMIAI ALAPJA l

glukóz

+

J

piruvát

NAGY AFFIN ITÁSÚ KOLINTRANSZPORT

ATP: citrát-liáz acetil-CeA citrát

T

oxálacetát

v ACETÁT

lMUSZKARIN j j RECEPTOROK

6-11 . ábra. Az acetilkolin (ACh) szintézise, receptorai és inaktiválása a kolinerg axon terminálisban

duló acetilko lin-"kvantumokna k" felelnek meg. A kolinerg szinapszisban zaj ló fo lyamatok vázlata a 6- JI . ábrán látható.

Kolinerg receptorok A kolinerg receptorok megkülönböztetés e és e lnevezése két alka loid iránti eltérő érzékenység alapján történt, jóval azelőtt, hogy a receptorok természetéről és a kapcsolódó szignáltranszdukciós rendszerekről bármi ismert lett volna. Ennek alapján a receptorok két csoportba sorolhatók, a nikotin- és a muszkarinrecepto rok családjába. Mint később kiderült, két eltérő szerk ezetű, funkciójú és lokalizációjú receptorcsaládró l van szó, s mindkettőn belül további altípusok különí thetők e l. Néhány a ltípus fontosabb tulajdonságaina k összefoglalása az 6-3. táblázatban látható.

A nikotinreceptor a receptor ioncsatornákhoz tartozik, amel yrő l részletesen száltunk a 457. o ldalon, itt csak funkcionális j e l entőségüket foglalj uk össze. A receptor a harántcsíkolt izomban található és e l sősorban Na+ és K+-ra permeábilis. A kolinerg neuronból a spontán, kvantális acetilkolin-felszabadulás a nikotinreceptorok on keresztül hozza létre a harántcsíkolt izomban a miniatűr véglemezpotenciá lokat, ami funkcioná l is értelemben azt jelenti, hogy felel ős a nyuga lmi izomtónus fenntartásáért A mctoros neuron stimulációja több száz' acetilkolin-kvantu mot szabadit fel, s ez a njkotinreceptorok Na+-permeabilitása következtében a miniatűr véglemez-potenc iá lok sokszorosát, a posztszinaptikus potenc iá lokat hozza létre. A depolarizáció aktiválja a feszültségfliggő Na+2 csatomákat, akciós potenc iál jön létre, ami Ca +-t mobilizál a szarkoplazmás retikulumból és kiváltja az izomkontrakciót. A nikotinrecepteron kompeti-

NEUROT RAN Z MISSZIÓ MOLEK ULÁRIS ALAPJA l

)))))))) )))))) )))) )))) )) )))) )))))) )))) )))))))) )))))) )) )) )))))))) )) )) )))) )))))))))))))) )))))))) )))))) ))))

539

M r receptorok vannak a kolinerg axonterrninál is membránjában is, ahol az aceti lkolin-felszabadulás negatív feedback gáttását közvetítik. Az M 3-receptorok a gyomor-bél rendszerben a simaizmo kon és a nyálmirigyekben talá lhatók, a Gq-fehérjét és a foszfatidilinozitol jelpá lyát akti2 válják, intracelluláris [Ca j -e me lkedést okoznak, s ez fe lelős a paraszimpatikus izgalom simaizom-kontrakciót és szekréciót okozó hatásáért A muszkarinreceptorok specifiku s, de nem szelektív - mert mindhárom receptaran hatékony - gátlój a a terápiában is használatos atropin. A muszkarinreceptor-aktiválás fontosabb fi zio lógiás hatásainak és a j elátviteli mechanizmusoknak az öszszefoglalását az 6-3. táblázat mutatja.

tiv gátló, a kl inikumban izomrelaxánsként haszná lt 2 d-tubokurarin. El térő a legység-szerkezetű és Ca + iránt permeábilisabb nikotinreceptor ta lálható a központi idegrendszerben, ahol szerepe egyel őre nem ismert. A nikotinreceptort érintő súlyos autoimmun betegség a myasth enia gravi s, amelyben ellenanyagok termelödnek a harántcsíkolt izom ni kotinreceptora ellen. A z állapotot, a nikotinreceptorok számának nagymért ékű csök kenése következtében, egyre súlyosbodó izomgy engeség, fáradékonyság, végül az izomtónus elvesztése jellemzi. A betegség a légzésbénulás következtében halálos k i menetelű .

A muszkarinreceptorok a hét tran szmembránszegmenttel rendel kező és G-febérjékhez kapcsolódó receptorok családjába tartoznak, és megtalálhatók a központi idegrendszerben és a paraszimpatikus beidegzésű belső szervekben. M oleku láris biológiai módszerekkel öt a ltípusa különböztethető meg (M 1- M 5) , amelyek közül három funkcionálisan és farmakológia ilag, valamint lokalizáció szempontjából is j ó l e lkülöníthető. Az M 1-receptorok neuronális Górészt preszinaptikus) lokalizációjúak, a Gq-fehérjén keresztül a foszfa tidilinozitol jelpályát aktiválják és a transzmitterfelszabadulás pozitív regulációj ában j átszanak szerepet. Az M2-receptorok a szívben találhatók és a kapcsolódó G-fehérjéken keresztűl közvetlenül aktiválják aK ' -csatornát, hipe rpolarizációt és bradycardiát okoznak. Az M 2-receptorok a Gi-fehérjén keresztű l adeni lát-cikláz-gátlást is okoznak.

Az acetilkolin inaktiválása A receptorokról disszociá ló aceti lkolint a szinapszisban az acetilkolin-észteráz bontja kolinra és acetátra. Az enzim a ko linerg szinapszisban talá lható és specifikus az acetilkolinra. A z acetilkolin-észteráz megkülönböztctcndö az ún. pszeudo-kolinészterázoktól (más néven butiril-kol in-észteráz), ami a máj ban keletkezik, a plazmában található, s val ósz ínű leg az a funkciója, hogy a szervezetbe került , potenciálisan toxikus, idegen észtereket hidrolizálja.

A z acetilkolin-észteráz több izoforrnában és változatos alegység-összetételben fordul el ő , azonban

6·3. táblázat A kolinerg receptorok néhány jellemző tulajdonsága Re· ceptor

r -

lokalizáció

T . . . -~elátvitel

l l

!:T-ron ·~

~

M2

Gq

PLC-aktiv_á-lá_s _ ____.__tr_anszmitterfelszabad ftás (preszinaptikusan)

----

szfvizom

K· -csatorna aktiválás

kolinerg végkészülék

Adenilát-cikláz-gátlás ~-csatorna aktiválás

1

Hatás

negatív inatrop és kronotrop transzmitterfelszabadulásgátlás

:J ~

M3

l gyomor-bél simaizom mirigyek (nyál-, gyomor-, hasnyál) pupillasphincter izom

Niko±

arántcsikolt izom

Gq Gq Gq

l PLC-aktiválás

kontrakció szekréció pupillaszükület

PLC-aktiválás PLC-aktiválás 2

- - - ' - Na•-. K•-, Ca · -ioncsatorna

l atropin

j

kont_ra_k_ci_ó _ _ _

t .tubokurarin

540

)))))))))))) )))))))))) )) )))) )))))))) )))))))) )))))))) )))))))) ))))

SZERV EK, SZER RENDSZEREK M ÜKÖDÉSÉNE K BIOKÉMIAI ALAPJAl

minden formában extracelluláris an , a plazmamembránhoz kötődik. A katalitikus alegységeket a C-terminá lison egy lipidhorgony vagy a katalitikus a legységekhez disszu lfidkötésse l kapcsolódó fil amentózus, kollagéntartalmú struktúr a legység köti a plazmamemb ránhoz. Az enzim a szerinproteázokná l leírtak szerint működik (lásd J.2 fejezet), de érdekes módon nem mutat szekvenc iahomalógiát a szerin-proteázokkal. Működése közben az aktív centrumban lévő szeri n acetilálódik , de az effektív kata litikus aktiv itásnak megfelel ően az acetil-enzim rövid él etű.

Az acetilkolin-és zteráz reverzibilis gátlói neosztigmin, fizosztigmin - az aktiv helyen l évő szerinnel reagálnak és karbamaii enzim j ön Létre, amely az acetil-enzimnéJ stabilabb és gátolja az acetilko lin bidrolízisét. A reverzibilis gátlók szemcseppkén t pupi llaszűkitést okoznak. Az enzim irreverzibilis gátlói, az aJkiL-foszfátok súlyos mérgek, ame lyek a szerin OH-csoporttal rendkívül stabil kötést hoznak létre, ame ly gyakorlatilag nem bidrolizál.

A katecholamin neurotranszmitterek. Noradrenalin, dopamin és adrenalin Az idegrendszerb en neurotranszm itter szerepet katccholamin ok a noradrena lin és a dopamin. A hasonló struktúrájú adrenalin elenyészően kevés neuronban található, viszont a mellékvesevel ő legfontosabb szimpatikus hatású hormonJa. betö l tő

A katecho/aminok bioszintézise és raktározása A dopamin, a noradrenalin és az adrenalin szintézise egyaránt tirozinbó l történik (6-12. ábra). A tirozin-hidro xiláz, egy kevert funkc iójú oxigenáz, ame ly molekuláris oxigén fe lhasználásáva l, bi opterio kofaktor közreműködéséve l , meta-pozícióban egy hidroxilcsoportot épít a tirozinba és 3,4-dihidroxi-L-fen ila lanin (L-DOPA) keletkezik.

A tirozin-hídrox iláz a fenila lani n ~ tirozin átalakulást is katalizálni tudja, aminek phenylketonuriás egyénekben van j elentősége. Mivel a tirozin-hídrox iláz csak a katecho laminokat szintetizáló sejtekben található, ez a reakció a katecholaminok szintézise szempontjábó l fontos, de nem j e lent érdemleges a lternatívát a fenilalanin metabolizmusában . A tirozin-hídrox iláz a katecholamin szintézis sebességmegh atározó enzimje, ahol a katecholam in-bioszintézis szabá lyozása történik. Fokozott idegi ingerlés során az intracelluláris Ca2+-szin t emelkedik, ami aktiválja a Ca2t-kalmodu lin függő prote in-kinázt (CAMK II), ez foszforilálja és aktiválja a tirozin-hidrox ilázt, ami a katecholamin szintézis fokozásával lehetövé teszi a neuron alkalmazkodását a megnövekede tt igénybevételh ez. Az L-OOPA-t a DOPA-dekarboxiláz a lakítja tovább, és dopamin ke letkezik. A DOPA-dekarboxiláz nagyon hatékony (alacsony KM, nagy vmax) és széles szubsztrátspc cificitású enzim, ame ly más aromás aminosavakat is dekarboxilál (így az 5-hidrox.i-trip tofánt a szerotoninbio szintézis során), ezért aromás-amino sav-dekarboxi láznak is nevezik. Nemcsak neuronokban, ha nem más sejtekben (pl. vese, endothe l) is megtalálható. A tirozin-hídrox iláz és a DOPA-dekarboxiláz egyaránt a citoszolban található szalubilis enzim, s itt keletkezik a dopaminerg neuronokban a szintézis végtermékét j elentő dopamin . A további események a vezikulában dő lnek e l, ahova a dopamin transzportá lódik. A dopaminerg neuronok nem, dc a noradrenerg neuronok és a mellékvesébe n a kromaffin sejtek vezikulá i tarta lmaznak egy enzimet, a dopamin-13-h idroxilázt, ami a dopamint noradrenalinná alakítja. Az enzim Cu-t tartalmazó, szintén kevert funkciójú oxigenáz. A reakcióhoz az elektronokat az aszkorhát zolgáltatja, ami a veziku lákban dehidro-aszko rbáttá alakul. A noradrena lin tehát mind a neuronokban, mind a mellékveseve l őben a vezikulákban keletkezik. A mellékvesevel ő és néhány agytörzsi neuron tarta lmazza a feniletanolam in-N-metiltra nszferáz enzimet, ami az S-adenozil-metioninról metilcsoporto t transzferál a noradrenalinra és kia lakul az adrena lin. Az enzim a citoszolban ta lálható, azaz az intermedierek ismét a citoszalba kerülnek. A szintézis során tehát a citoplazmába n keletkezett dopamin a veziku lába transzport álódik,

NE ROT RANSZMISSZIÓ MOLE K LÁ RI A LA PJA l

6-12. ábra. A katecholaminok bioszintézise. A bekeretezett rész a vezikulát jelzi, a többi reakció a citoszolban történik

541

)U))) ))))>))H))))))))))))))))))))))U))))))))))))H) )UHU>)))))))))))) HU))>>)>>>>)>> .H)))))))))n

~H

HO ~··· CH -b~ coo-~

l

2

1

H

L-TIROZlN tirozin-hidroxiláz

HO

~H

l

3

coocH2 - cl

HO

1

o

c:

e

:J

H

Q)

c:

~

Q)

L-DOPA

co2

~

c:

DOPA-dekarboxiláz

.E

~

o

c:

e :J Q)

('O

c:

o

e>

a.

"' HO

Q)

c: ~

"'o~ c:

HO

-

~

Q)

'Q)

cn

c:

:E ('O E o ....

DOPAMIN

~

Q) f/) Q)

DOPAMIN ~ dopamin-P-hidroxiláz

HO

+

CH -CH2 - NH3

HO

l OH NORADRENALIN

NORADRENALIN

l

feniletanolamin--N-metiltranszferáz

HO

+

CH l - CH2 - NH2 - CH3 OH ADRENALIN

>

~

~

Q)

E

542

»>m>>»>»•>»>>>m»»»>»>»»>m»»»»>»>m»>»»•

SZERVEK , SZERVRENDSZEREK MŰKÖDÉSÉNEK BIOKÉM IAI ALAPJ AJ

az ott ke l etkező noradrenalin a citoplazmába kerül vi sza, sitt keletkezik az adrenal in, ami aztán ismét a vezikulába transzportálódik és raktározódik. A szintézis lépései a 6-12. ábrán Láthatók. A feniletanolamin-N-meti l-transzferázt a kortikoszteroidok regulálják, amelyek a mellékvesekéregböl nagy mennyiségben felszabadulva az enzi m fokozott szintézisét váltják ki. A katecholaminbioszintézis a tirozin-hídroxilázon történő akut reguláció mellett a tartós neuronális aktivitáshoz is alkalmazkodik, amikor megnő a tirozin-hídroxiláz és a dopamin-P-hidroxjJáz mennyisége.

A katecholaminok felvétele a vezikulába, jelen ismereteink szerint azonos transzporteren, a proton grádiens terhére történik, azaz ATP-függö folyamat. A neuronokban a noradrenalin vagy a kis szinaptikus vezikulákban, vagy a nagy dense core vezikulákban raktározódik, mindkét helyen ATP-vel, az utóbbi vezikulákban még valamilyen neuropeptiddel együtt. A kromaffin vezikulák mindkettönéllényegesen nagyobbak (~280 nm átmérő) és a katecholamin, A TP és dopamin-P-hídroxi láz mellett további fehérjéket és ionokat tartalmaznak, amelyek a vezikulák

HO HO

CH -

l

+

CH2 -NH3

OH noradrenalin

HO

! ~o

HO

~

o

CH-C

l

"- H

OH aldehid-red

u~

~ehid-dehidrogenáz HO

HO HO

CH - CH2 - 0 H

l

l

OH

HO

CH- COOH

l

l

OH

COMT

COMT

CH-CH2 - 0H

CH-COOH

OH

OH

l

3-metoxi-4-hidroxi-fenilglikol MHPG

l

3-metoxi-4-hidroximandulasav

6-13. ábra. MHPG keletkezése a noradrenalin metabolizmusa során. Az ábrán nem jeleztük, de a reakciók más sorrendben (COMT-MAO-aldehid-reduktáz vagy -dehidrogenáz) is ezeket a metabolitokat eredményezik

2

NEUROTRANSZMISSZIÓ MOLEKULÁRJS ALAPJAI

)))))))))))))))))}))))))))))))})}))))))))))))))))))))))))))))))))>))))))>)))))))))>))))>))>)))))))))))))

exocitózisa során a katecholaminokkal együtt felszabadulnak. A katecbolaminok transzportját a vezikulákba a rezerpin gátolja, amely tartós alkalmazásakor a vezikulákat depletálja. (A rezerpint régen vérnyomáscsökkentőként használ ták.) A neuronokból és a mellékveséből a katecholaminokkal együtt ATP is felszabadul. Az A TP és belőle az extracelluláris ún. ekto-ATPázok hatására keletkező adenozin modulátor anyagok, amelyek felismerésére specifLkus receptorok alakultak ki az idegrendszerben és számos más sejtben. Receptoraik részben ioncsatornák, részben G-fehérjéhez kapcsolódnak. Az ATP tehát nemcsak mint a metabolizmus központi anyaga jelentős, hanem mint extracelluláris szignál is egyre fontosabbnak látszik.

543

legfontosabb metabolit a 3-metoxi-4-hidroxifenilglikol (MHPG), amelynek mennyisége jelentösen csökken a likverban és a vizeletben depressziók egyes formáiban. A dopaminból a MAO, az aldehid-dehidrogenáz és a COMT hatására keletkező metabolit a homovanillinsav (HVA; 6-14. ábra), amelynek mennyisége szintén meghatározható. A dopaminerg pályák károsodása esetén, pl. Parkinson-kórban a HVA mennyisége lecsökken.

A katecho/aminok metabolizmusa és inaktiválása A katecholaminok katabolizmusában két enzim játszik szerepet: a monoamino-oxidáz (MAO) és a katechol-0-metiltranszferáz (COMT). A MAO a mitokondriumok külső membránjában található fiavintartalmú enzim, ami általában az aromás aminokat oxidálja. A citoplazmába kikerülö - a vezikula által nem védett - katecholaminokat oxidatív dezarninálással a megfelelő aldehiddé alakítja. Két MAO izoenzim létezik, a MAO-A és a MAO-B, amelyek cDNS-ét klónozták és aminosavszekvenciáját ismerik. Megkülönböztetésük funkcionális alapja az, hogy eltérő a szubsztrátspecificitásuk: a MAO-A szubsztrátja elsősorban a noradrenalin és a szerotonin, a MAO-B sokféle feniletil-amint átalakít, beleértve a táplálékban jelenlévöket. Mindkét izoenzimnek szelektív gátlói vannak, amelyek terápiás jelentőségüek. A COMT, ami nemcsak az idegrendszerben található, S-adenozil-metioninról metilcsoportot transzferál a katecholgyűrü 3-0H-csoportjára. Széles a szubsztrátspecificitása, az oldallánctól függetlenül gyakorlatilag minden katechol gyüriín metilál.

6-14. ábra. A homovanillinsav képlete

A katecholamint tartalmazó neuronokból felszabadult neurotranszrnittert az axon terminális membránjában található transzportrendszer veszi fel a preszinaptikus terminálisba, s ezáltal inaktiválja. Szelektív transzporter található a megfelelő neuronokban a noradrenalinra, a dopaminra és a szerotoninra. Ezek, felépítésüket és általános mechanizrnusukat illetően a Na+-kotranszporterek családjába tartoznak.

A transzportereknek specifikus gátlói vannak, amelyeket a depressziók kezelésében alkalmaznak (lásd még alább). A katechetamin transzportert gátolja a coca cserjében található, élvezeti szerként fogyasztott kokain is.

A noradrenalin és az adrenalin receptorai A két enzim plusz az aldehid-dehidrogenáz és az aldehid-reduktázhatására többféle metabolit keletkezhet (6-13. ábra) . Az agyban keletkező

A noradrenerg pályák a központi idegrendszerben, a locus coeruleusból indulnak, és adrenerg receptorok vannak számos agyrégióban. Az axonból

544

>) ~H))) >HU)))>))))))))))))))H))))>)))))))))) )) >> ))

» )>>>))))

SZERVEK, SZERVRENDSZER EK MÜKÖDÉSÉNE K BIOKÉMIAI ALAPJAl

felszabaduló noradrenalin, a többi biogén aminnal együtt nem kizárólag szinaptikus kapcsolatban, hanem esetleg nagyobb távolságon diffundálva éri el a receptorait A periférián a szimpatikus innervációnak megfelelően noradrenalinrece ptorok vannak a szimpatikus ganglionban és a szimpatikus beidegzésű be lső szervekben (pl. érfal, bronchus, gyomor-bél simaizom). Olyan szervek is tartalmaznak adrenerg receptort, amelyeknek nincs szimpatikus beidegzése (pl. uterus, harántcsíkolt izom), ahol endogén agon istájuk a hormon adrenalin. A noradrenalin és adrenalin receptorai funkcionális és farmakológiai szempontból p, a 1- , a 2csoportba sorolhatók. A P-receptorokon belül (Pt- P4) p, és P2-receptorokról tudunk legtöbbet. Ezek funkcionális szempontból azonosak, mindkettő G-fehérjén keresztül az adenilát-ciklázt stimulálja és a sej tekben cAMP-szint emelkedést okoz. A P-receptor szerkezetéről , ami je llemző példája a hét transzmembránsze gmenttel rendelkező, G-fehérjéhez kapcsolódó receptoroknak már részletesen szóltunk (453-454. oldal). A p, és P2elkülönítés farmakológiai szempontból jelentős. Noha a két receptor általában együtt fordul elő, az egyes szervekben a fiziológiai hatás valamelyik receptor dominanciájának az eredménye, és a megfe l e lő agonistákkal viszonylag szelektíven lehet egyes hatásokat befolyásolni. P 1- és P2-re-

ceptorok jelen vannak a központi idegrendszerben és a perifériás szervekben. A szimpatikus hatásokat és azok molekuláris mechanizmusát az 6-4. táblázat foglalja össze. Az a 1- (a,A, a ,s, a,c) ésazarreceptorok (a2A, a 28, a 2c) eltérő celluláris hatásúak. Az a 1-receptorok a Gq-fehérjén keresztül a foszfatidilinozitol jelpályát aktiválják és [Ca2+]-emelkedést okoznak. a 1-receptorok vannak az érfal-simaizmok membránjában, s aktiválásuk simaizom-kontrakciót okoz, mert a Ca2+-kalmodulin komplex aktiválja a miozin-könnyűlánc-kinázt (lásd még 6.2 fejezet). Ezen receptorok gátlói hatékony szerek a hypertonia (magas vérnyomás) egyes fonnáiban. Az a r receptorok aGi-fehérje közvetítésével az aderulát-ciklázt gátolják. Az a-receptorok a központi idegrendszerben és a periférián egyaránt megtalálhatók A noradrenerg neuronon a preszinaptikus gátló autoreceptor az a 2, de a 2-receptor más transzmitterrel működő axon terminálison (pl. kolinerg) is jelen van, s ezen keresztül érvényesül a noradrenalin transzmitter felszabadulást gátló hatása.

Dopaminreceptorok A dopaminreceptoro k (D 1- D5) G-fehérjéken keresztül az adenilát-ciklázt aktiválják (D ~, 0 5) vagy gátolják (D 2, 0 3, D 4) . A központi idegrendszerben

8-4. téblázat. Adrenerg receptorok 6s h~salk az egyes szarvekben Re·

~· p

~

1

Lokalizáció

szfvizom

___ J haráotcslkotUzo~

~2

a1

a2

G·

Másodlagos measenger

Cellulárls effektor

fehérje Gs

cAMP(+)

Ca2•-csatorna (+) glikogén-foszforiláz-kináz (+)

l érfal-simaizom

kontrakció

glikogéomobili~

i--

bronchus gyomor-bél simaizom uterus zsfrszövet érfal-simaizom lép máj

Fizlológlás válasz

miozin-könnyűlánc-kináz

H

relaxáció

l

hormonszenzitív lipáz(+) Gq

Ca2•

~

~

?

Ca2• (L-csatorna)

miozin-könnyű

lánc-kináz(+)

.

l zsirsavmobilizálá~ kontrakció

glikogén-foszforiláz-kináz (+)

vércukorszint-emelkedés

miozin-könnyű

kontrakció

lánc-kináz(+)

\

...

' EUROTRANSZM I

Z IÓ MOLEKULÁRJ S ALAPJ A l

)))))>)))>)))))))})))))))))))))))))))) )))))))>))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))>))))))))))))))))))

a legtöbb dopaminerg pálya a substantria nigrából indul és a striatumba fut. Jelentős dopaminerg innervációj a van a limbikus rendszemek és szerepet játszanak dopaminerg neuronok a hypophysisbormonok, elsősorban a prolaktin szekréciójának szabályozásában. Psychasisok kezelésében használnak olyan gyógyszereket (neuroleptikutnok), amelyek 0 2 -receptor-antagon isták, s hatékony~águk alapján feltétel ezhető, hogy a psychosisok kialakulásában a dopaminerg neurotranszmisszió ká ros működése szerepet j átszik. A nigrostriatalis dopaminerg pályák károsodásának a következm énye a Parkinson-kór, amelyben drasztikusan csökken a striatum dopamintartalma. A betegség 50 év felett gyakori és egyre súlyosbodó végtagremegéssel, beszéd- és mozgászavarokka l, valamint a kognitív funkciók romlásával jár. A kezelés egyik lehetősége L-DOPA adása, a mely a szintézisben a dopamin prekurzora (6-12. ábra).

Szerotonin A szerotonin (5-hidroxi-triptamin, 5-HT) mint neurotranszmitter azért érdemel külön említést, mert jelentősnek látszik szerepe a normális magatartási folyamatok, az alvás-ébrenlét vagy az étvágy szabályozásában. A szemtonin fontosságát jelzi, hogy számos pszichoterápiás gyógyszer a szerotonin-neurotranszmissziót befolyásolja. A szerotonin nemcsak az idegrendszerben keletkezik. Szintézise triptofánból a megfele l ő neuronokban az Aminosavak anyagcseréje cí mű fejezetben leírtak szerint történik. A szintézisben ugyanaz az aromás-aminosav- dekarboxiláz vesz részt, amely a dopa ~ dopamin átalaku lást is katalizálja. A szintézis sebességmeghatár ozó enzime a triptofán-hidroxiláz, amely a tirozin-hidroxilázh oz 2 hasonlóan, Ca +- függő módon foszforilálódik és aktivitása alkalmazkodik a fokozott neuronális aktivitás igényeihez. A szerotoninerg axon terminális membránjában szerotoninra specifikus, Na+-függő transzportrendszer található, ami a felszabadult és a receptorról disszociált szemtonint az axon terminálisba

545

N

l

H 5-hidroxi-triptamin SZEROTONIN

l

MAO

~ldehid-dehidrogenáz

HO

N

l

H

5-hidroxi-indolacetát 5-HIAA

6-15. ábra. 5-hldroxi-indolacetá t keletkezése szerotonlnból

tra nszportá tja és így inaktiválja. A transzport szelektív, kompetitív gátlói hatékony antidepresszív gyógyszerek. A szerotonin metabolizmusa során 5-hidroxiindolecetsav keletkezik (6-15. ábra), amelynek szintje a szerotoninerg neuronok aktivitását jelzi. A metabolizmusban a monoamino-oxidáz A izoenzim és a NAD-dal rnűködő aldehid-dehidrogenáz vesz részt.

Szerotoninrece ptorok A szerotoninerg neuronok az agytörzs körülhatárolt terü leteiről (raphe nuclei) indulnak és a központi idegrendszer csaknem minden részéhez elj utnak, de különösenj elentős a limbikus rendszer szerotoninerg beidegzése. Szemtonint tartalmazó neuronok találhatók a periférián is, amelyek szerepet j átszanak pl. a gyomor- bél rootilitás szabályozásában.

546

)))))))))))))))})))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))))))))))

ZERVEK, SZERVRENDSZERE K MÜKÖOÉSÉNEK BIOKÉMIAI ALAPJA J

A receptorok klónozása és farmakológiai tulajdonságai alapján többféle szerotoninreceptor , ezen belül is több altípus különíthető el. A főbb receptortípusokat és a kapcsolódó szignál transzdukciós mechanizmusokat az 6-5. táblázat mutatja. Az 5-HT 1-receptorok a központi idegrendszerben találhatók és heterogén receptorok, amelyek aktiválása egyes területeken az adenilátcikláz gátlását, máshol aktiválását, illetve a K+-csatornák aktivátását okozza. Különösen sok receptor található a limbikus rendszerhez tartozó területeken, amelynek az érzelmi folyamatokban tulajdonítanak kitüntetett szerepet. Ezeken a receptorokon ható farmakonek az érzelmi állapotot befolyáso lják. (A hallucinogén hatású lizergsavdietilamid, LSD, 5-HT 1- és 5-HT2-receptor agonista). Egyes területeken a 5-HT 1-csoportba tartozó receptorok preszinaptikus lokalizációjúak és transzmitterek felszabadulását modulálják. A 5-HT2-receptorok, amelyek a foszfatidilinozitol jelpályáját aktiválják és intracelluláris [Ca2+] emelkedést okoznak részben a központi idegrendszerben (kü lönösen a cortexben), részben a bél simaizmokon találhatók, ahol hatásukra sima izomkontrakció jön létre. A 5-HT3 (és 5-HT4 ) receptorok a perifériás (gyomor-bél traktust beidegző) és a központi idegrendszeri neuronokban egyaránt megtalálhatók. Az 5-HTrreceptorok mint kation-ioncsatornák membrándepolariz ációt, s igy gyors excitátoros válaszokat okoznak. A receptor

antagonistái hatékonyak a kemoterápiás kezelés mellékhatásaként jelentkező hányinger és hányás csökkentésében. A szerotonin számos központi idegrendszeri funkcióban szerepet játszik. Résztvesz a hypophysis hormonszekréciój ának hypothatamicus szabályozásában (prolaktin, ACTH, növekedési hom1on szekréciót okoz), az alvás-ébrenlét és az étvágy szabályozásában.

A depressziók és a szorongás modem terápiájában egyre nagyobb szerepet kapnak azok a vegyületek, amelyek a szerotoninerg neurotranszmissziót befolyásolják. A szerotonin metabolizmusának, inaktiválásának és receptorainak ismeretében ilyen hatás várható a monoamino-oxidá z gátlás, a szerotonin preszinaptikus transzporterének gátlása és a szerotcoinreceptorok aktiválásának eredményeképpen. Ma már számos ilyen hatásokkal rendelkező szer áll a terápia rendelkezésére.

Neuropeptidek Az opioid peptidek kivételével a peptid neuro- terjedelmi okokból - csak az általános sajátosságok vázlatos ismertetésére szorítkozunk. A neuropeptidek széleskörű funkciókkal rendelkeznek a központi idegrendszerben és azon kivül egyaránt. Vagy a neuronokból felszabadulva diffúz ióval érik el a közelben talá lható receptoraikat, vagy a hypophysisből a neuroszekretoros neuronokból a vérpályába szekretálódnak. A neuronokban a peptid transzmitterck szintézise az összes eddig tárgyalt tra nszmittertő l eltérően ' a sejttestben történik a 3.4. fejezetben tárgyaJt törvényszerűségeknek rnegfelelően. A megszintetizált neuropeptidek, a nagy "dense core" vezikulákba kerülnek, és az axonban transzportálódva érik el a szinaptikus végződést. Gyakran a sejttestben a propeptidek kerülnek a vezikulákba és proteázok hatására itt alakulnak ki a transzmitter peptidek. transzmitterekről

6-5. táblázat. Fontosabb szerotoninreceptor tipusok

l-- ~ me~hanizmus Receptor

5-HT1

Effektor

l

adenilát-cikláz (+,-) K+-csatoma (+)

t l r S-HT2

(+)

Lokalizáció

központi idegrendszer (különösen a limbikus rendszer) vékonybél-simaizom központi idegrendszer

csatorna(+)

5-HTl

kattoncsatorna

5-HT,

aden;lál-cikláz (+)

perifériás és központi idegrendszeri neuronok

__j

per;tériás és közponl; idegrendszeri neuronok

l

NEUROTRANSZM ISSZIÓ MOLEKULÁ RI S ALAPJA l

547

)))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))))))))))))>) )>)))))>>>HH>>>>>>)))) ))))))))n>>n»»H

Opioid peptidek

A neuropeptidek legtöbbször az aminosav vagy a klasszikus neurotranszm itterekkel azonos terminálisban, kotranszm itterként fordulnak elö. A kolinerg terminálisban gyakran Vl P (vazoaktív intestinalis peptid), a noradrenalinn al az apia id peptidek vagy a neuropeptid Y a szerotoninnal a P-anyag fordul elö azonos terminálisban. A peptidek felszabadulása a klasszikus neurotranszm itterektől eltérő mechanizmus sal történik. A neuropeptidek felszabadulását az axonok nagyobb frekvenciával történő stimu lációja váltja ki, s a vezikulák, a depolarizáció hatására létrejövő Ca2+szignálra reagálnak, de ez nem az aktív zónák területén, hanem diffúzan, a végkészülék egész területén érvényesül. A peptiderg veziku lákból a transzmitterfelszabadulás exocitózissal megy végbe és a peptidek pótlása a sejttestből történik.

Az opioid peptidek azoknak a receptoroknak az endogén agonistái, amelyeken keresztül a növényi eredetű martin fejti ki régóta ismert fájdalomcsillapító és egyéb hatásait. Az opioid peptideket endogén fájda lomcsi llapítóknak is nevezik. Az eddig azonosított peptidek közül a legismertebbe k az endorfi nok és két peptapeptid, a metionin-enc efalin (Tyr-Giy-Gly -Phe-Met) és a leucin-encefa lin (Tyr-Gly-Gly -Phe-Leu). Az opi oid peptidek három kü l önböző prekurzor fehérjéből keletkeznek proteolitikus hasítás eredményeképpen . A proopiomelan okortinból keletkeznek az endorfinok (a J3-endorfin 31 aminosavból áll), de emellett az adrenokortiko trop (ACTH) és a melanocitasti muláló hormonok

a pre-proopiomelanokortin pro-opiomelanokortin (/)

3' e>' <{ ll

l

szignál peptid

e> e>' <{

El

<{

<{

'

(/)

3'

...

Ol

r/)

3' ' 3'

<{

'

r/)

r/)

>.

._J

1: l l

l'

r/)

r/)

3' ' 3'

3' ' 3'

l

>.

._J

l

~- MSH

a.-MSH

y-MSH

r/)

r/)

ll

O) ....

~ r/)

~-LPH

ACTH

~-endorfin

b

pre-proencefalin A

lj 1'-1 szignál peptid

1:- 1

(.)

(.)

(.)

Q)

Q)

Q)

c:

c:

c:

..!. Q)

Q)'

::2 ::2

::2

..!. Q)

1

11r ;lll -

ll

ll

(.)

(.)

(.)

Q)

c:

c:

c:

Q)

Q)

Q)'

' Q)

:l

::2

::2

._J

' Q)

Illl (.)

c:

Q)

' Q) ::2

-6-16. ábra. (a) A pre-proopiomel anokortinból keletkezik az adrenokorikotr op hormon (ACTH), a melanocitast imuláló hormonok (MSH), a f3-lipotropin (f3-LPH) és a p-endorfin. A bázikus aminosavpárok a proleolitikus hasTtás helyei. (b) A pre-proeneefal in A , a me lyből a Met-encefalin és a Leu-encefalín keletkezik. A keHős vonalak a bázikus aminosavpároka t jelzik

548

mm»»»>»>>mmnmm»>>»>>»>m>>>>>>>m>»>>m>

SZERVEK, SZERVRENDSZERE K MŰKÖDÉSÉNEK BIOKÉMIAI ALAPJAI

(MSH) is. A protealitikus hasítás bázikus aminosavpároknál történik, amelyek mintegy keretbe foglalják a kihasítandó peptideket. Ugyanígy keletkeznek a proencefalinból az encefalinok (6-16. ábra). A harmadik prekurzor a prodinorfm, amely további opioid peptidszekvenciákat tartalmaz. Az opioid peptidek a központi idegrendszer sok régiójában megtalálhatók. Hogy melyik agyrégióban milyen peptid található, az attól függ, hogy az adott neuronokban milyen prekurzor expresszálóctik és milyen protealitikus enzimek vannak jelen. Az opioid peptidek nagy affinitású, specifikus opioid receptorokhoz kötődnek, amelyek a központi idegrendszerben és a perifériás szervekben találhatók. Szintetikus Iigandok iránti eltérő szelektivitás alapján többféle opioid receptor különíthető el (J.l, o, K). A különböző receptorok eltérő affinitást mutatnak az endogén Iigandok iránt is és általában különbözik lokalizációjuk a központi idegrendszerben. Valószínűsíthető, hogy a o-receptor elsősorban az encefalinok, a J.l-receptor a P-endorfin, a K-receptor pedig a prodinorfin peptidek hatását közvetíti. A receptorok G-fehérjék-

hez kapcsolódnak és hatásukban szerepetjátszik az adenilát-cikláz gátlása, aK+-csatorna aktiválása és a Ca2+-csatomák gátlása. Orvosi szempontból a legfontosabb kérdés az, hogy az opiátok sokféle, eltérő hatásai közül (fájdalomérzés csökkentése, vazopresszinszekréció-csökkentés, hypotensio, gyomorszekréció gátlása, légzésdepresszió, hányinger, kedélyállapot változása stb.) melyik receptorhoz melyik hatás rendelhető, mert ez ad lehetőséget az egyes funkciók szelektív befolyásolására és a nem kivánt hatások csökkentésére. Bár e téren távolról sem letisztultak az ismeretek, úgy tű­ nik, hogy a fájdalomcsökkentő hatás létrejöttében rnindhárom receptor szerepet játszik, a cardiovascularis hatások inkább a o, míg a só- és vízháztartás szabályozásaaK-r eceptor feladata. Az exogén fájdalomcsillapító rnorfin a legnagyobb affinitást a J.l-receptor iránt mutatja. Az opioid receptorok általában posztszinaptikus receptorok, de preszinaptikusan is előfordulnak és aktiválásuk más transzmitterek (pl. dopamin, aceti lkolin, P-anyag) felszabadulását gátolják.

Ajánlott irodalom Basic Neurochemistry (Fifth Ed.) eds. G . J. Siegel, B. W. Agranoff, R. W. Albers, P. B. Molinoff, 1994, Raven Press, New York

~~--------------------~~----------------~~~~~~~~~~----~-------------- ,

.2.

Kontraktilis rendszer

DuxLászló

A kontraktilis szövetek három fő típusa a vázizom, a szívizom és a simaizom. Szívizomban és vázizomban jól felismerhető a kontraktilis rendszerrendezettségéből eredő harántcsikolat, simaizmokban az ultrastrukturális kép sokkal kevésbé rendezett. Jelentős eltérést okoz az izomszövetek felépítésében az, hogy a vázizmok többmagvú rostokból, a szívizom és a simaizmok önálló sejtekből állnak. A simaizomszövet önmagában is rendkívül heterogén, elsősorban a kontrakció-relaxáció szabályozásáért felelős szabályozó mechanizmusok, jelátviteli rendszerek tekintetében. A vázizomrendszer is heterogén, többféle izomtípus különböztethető meg. Az osztályozás legelfogadottabb alapja figyelembe veszi az izomkontrakció sebességét és az anyagcsere jellegét. Így elkülöníthető a lassú oxidatív, a gyors glikolitikus és a gyors oxidatív-glikolitikus típus. (Ezeken kívül számos altípus, átmeneti típus, egyes fajokban erősen specializálódott izomtípusok írbatók le, de ezek részletes taglalása inkább az áttekinthetőséget veszélyezteti.) A lassú oxidatív rostok elsősorban a folyamatosan kis intenzitású munkát végző izmokban dominálnak, így például az antigravitációs izmokban. Kitartó, fáradástűrő rostok, színük a magas mioglobin és mitokondrium tartalom miatt vörös, jól kapillarizáltak. Energiaigényüket elsősorban zsírsavak és ketontestek oxidációjával fedezik, glikogént nem tartalmaznak. A szívizomsejtek számos biokémiai tulajdonságukban erősen hasonlitanak a lassú oxidatív vázizomrostok sajátságaira.

A gyors glikolitikus rostok rövid ideig tartó igen intenzív erőkifejtésre képesek, hamar elfáradnak. Energiaigényüket elsősorban glikogénraktáraik anaerob glikolitikus lebontásával fedezik. Színük világos, kevés mitokondriumot, mioglobint tartalmaznak. Bel ső szarkatubuláris membránrendszerük igen fej lett. A gyors oxidatív glikolitikus rostok kontrakciós sebessége gyors, vegyes anyagcserejellegük miatt fáradságtűrésük jobb, mint a tisztán glikolitikus anyagcserével működő rosttípusnak A rosttípusok polimorfizmusa számos alkotó fehérje gén polimorfizmusában, esetleg alternatív splicing jelenségekben megmutatkozik, pl miozin könnyű és nehézláncok, troponin komplex, kalciumpumpa (SERCA fehérjék), rianodinreceptor, DHP-receptor polimorfizmusa ismert. Az egyes rosttípusok kialakulását genetikai tényezők, neuronálls, hormonális hatások, mechanikai tényezők pl. feszülés, terhelés, edzés határozzák meg és bizonyos határok között egymás között átalakulásra képesek (lásd alább).

Az izomszövet kontraktilis rendszere A vastag filamentum rendszer, a miozin fehérje szerkezete A m iozinmolekulák tömege 540 kD és 6 polipeptidláncból állnak (6-17. ábra). Ezek közül 2 ún. nehéz lánc 230 kD tömegű, részben

550

»»>mm>»>>»>>>»>m>>m»m»»»m•»>>mm>m»>

SZERVEK, SZERVREND SZEREK MŰKÖDÉSÉNEK BIOKÉMIAI ALAPJAJ

Az aktln- és ATP-kötő helyek elhelyezkedése a mlozin nehéz lénc molekulén

N-terminális

t globuláris fej

2 nm!

150 nm Egy miozinmolekula

160 nm A vastag filamentum

L _ _ _ _ _ _ __ ____ - 6-17. ábra. A miozinmolek ula szerkezete

alfa-heliká lis elrendeződésben egymásra tekerectve (szuperhelix) a miozin farki részét alkotják, részben a globuláris szerkezetű feji részekbe is belenyúlnak. A farki rész átmérője 2 nm, hossza 150 nm. A globuláris fej i részek egyenként 2, összesen 4 könnyü láncot is tartalmaznak, amelyek molekulatömege kb. 20 kD. A fej i rész mérete 4 x ll nm, itt lokalizálód ik a rniozinrnol ekula ATP-bontó aktív centruma. Mind a nehéz, mind a könnyü láncok polimorf fehérjék. Izoforma összetételük döntő az izomkontra kció-sebes ség sajátságainak meghatározásában. A harántcsíkolt izomban az ún. vastag filamentumok a miozin fehérj e polirnérjein ek tekinthető­ ek. A polimerizálódott molekuláka t elektroszta-

tikus kölcsönhatások tartják együtt. (Emiatt a miozinmol ekulák kioldása, tisztítása magas ionerősségű pufferekke l volt sikeres.) A miozinmol ekulák összekapcsolódása, a vastag filamentum képzés, a feji részek ellentétes irányú polarizációját eredményezi. Középen a két oldalról beépülő farki részek találkozása egy kb. 300 nm bosszúságú csupasz szakaszt eredményez. A vastag filamentum két vége irányába az ún. tüskés zónák mutatnak, ahol az előemelked ő nyaki és feji részek a vastag filamentum közepe irányába csuklószerű elmozdulás ra képesek, két hajlékony ún. kapocs (binge) régió segítségéve!. A feji részek elrendeződése a vastag fi lamentum keresztmetszete felő l nézve, a körfogaton hat sávot alkot. Ezek a sá-

KONTRAKTILIS RENSZER

)))) )) )))))) )))))))) ))))}) )) )))) )) )) )))))))) )))) )))))))))))) >))) )))) )))) )) ))))))))))>))) ))}) )))) )) )) )}})}))))} )) )))})) >»>)))} )) )) )) )))) )})) )))) ))))))

vok a vastag filamentumot körülvevő hat vékony filamentum fe lé tekintenek. Az azonos sávoken belül a feji részek ismétlődésének távolsága kb. 58 nm.

A vékony filamentum rendszer A vékony fi lamentumok alapvázát az aktin fehérje két gyöngysorszerűen összekapcsolódó polimerje, az ún. F (fibrilláris) aktin alkotja. Az aktin monomer, a G (globuláris) aktin molekulatömege 42 kD. Az élővilágban egyik legáltalánosabban előforduló fehérje. Alfa típusú aktin alko~a a szív, a váz és a simaizmok kontraktilis rendszerének vékony filamentumrendszerét, a béta és gamma típusú aktin a citoszkeletális rendszer része és gyakorlatilag minden sejtben megtalálható. Az aktin polimerizáció, a miozin vastag filamentum képzéséhez hasonlóan, alacsony ionerős­ ségen végbemenő spontán, exergonikus folyamat. Eredménye a több millió dalton molekula- tömegű F aktin, amelynek vége a Z vonal (lásd alább) struktúrájába ágyazódva a kontraktilis rendszer mechanikai erőátv itelének legfontosabb lehorgonyzási pon~át alkotja (6-18. ábra). Az aktin polimer kettős gyöngysorszem elrendeződésekét tekeredő árkot hagy szabadon, melyben egy másik fibrilláris fehérje, a troporniozin kábelszerű kettős helixei fekszenek bele. A tropomiozin monomer molekulatömege 70 kD. A tropomiozin kapcsolódása elfedi az aktin monornérek felszinén

tropomiozin

\

azt a régiót, mely alkalmas lehet a ~iozin fejjel kereszthidak kialakítására. 38 nm távolságra ismétlődve a tropomiozin-rnolekulához kapcsolódva helyezkedik el a troponinkomplex, mely három alegységből épül fel. Ezek a tropomiozinhoz kapcsolódó troponin T, a kalcium kötő doméneket tartalmazó troponin C, valamint az aktin kereszthídkötésével interakcióba lépni képestroponinI (inhibitoros) alegység. Ezek molekulatömege 37 kD (TnT), 18 kD (TnC), illetve 24 kD (Tni).

A kontrakció mechanizmusa A kereszthídciklus. Az izomrostok erőkifejtése a vastag és vékony filamentumok közötti kereszthidak kialakulásának és szinkronizált elmozdulásának következtében jön létre. Ezt a fo lyamatot kereszthídciklusnak (cross bridge cycle) nevezik

(6-19. ábra). A kontrakció befejeztével, a mioz inmolekula fej i részéhez ATP kapcsolódik, az aktomiozin kapcsolat, azaz a kereszthíd szétválik, az izom elernyed. Az új abb kontrakció kezdetén a miozin fej ATPáz aktivitásának hatására a kötött A TP ADP-re és anorganikus foszfátra bomlik. Az ADP kötve marad a miozinfejen és kialakul a kereszthídkapcsolat a vékony filamentum egyik aktin monomér kötő­ helyével. Ezt követi a miozin fej i és nyaki részének csuklószerü elrnozdulása, ami a kapcsolt vékony filarnentumot a szarkorner közepe (H zóna, lásd alább) felé mozdítja el. Ezalatt az ADP leválik az

TnT Tnl TnC

ll

551

l

6·18. ábra. A vékony filamentumok felépitése (Tn T, Tn/ és TnC; troponin T, l és C)

552

m>mm>» »»»>»»> m»>»m» >m»>»m >m»»»>H >

SZE RVEK , SZERV REND SZERE K MŰKÖDÉSÉNEK BIOKÉ MJAJ ALAPJ Al

rigor komplex

hidrollzis

6-19. ábra. A keresz thídcik lus (cross bridge cycle) folyam ata

aktom iozin komplcx.ről , mely a következő A TP kapcsolódásáig stabil an fennmarad. Az új ATP kapcsolódása közvetlen feltétele az izom elerny edésén ek. (ATP hiányban kialakuló rigor állapo t megfigyelhető a hullam erevs ég kialak ulása során is. Erös izonu nunka, menekülés, gyalogsági roham során az izomz at alacso ny A TP-sz intje révén a huiJamerevsé g pillanatszerűen beállh at és ponto san megőrizheti a halál pillan atána k testhelyzeté t A hullam erevs ég későbbi oldód ása már fehérjebontó folyamatok, a kontraktilis fehérjék proteolíz isének követ kezm énye, a normális izomrelaxációhoz nincsen köze). A miozi nmole kula önma gában minimális ATPbontó aktivitással rende lkezik. Az aktinn ak nincsen ATPá z aktivitása. A két fehérje együttesen,

magn ézium ion jelenl étébe n a miozin saját ATPáz aktivitásánál kb. l 00-sz or intenzívebben bontja az A TP-t. Amen nyibe n a rends zerhe z a vékony filamentu m többi fehérjekomponensét, a tropomiozint és a troponin komp lex tagjai t is hozzá adjuk az ATPáz aktivi tás husza d részér e csökken. Ezt a jeJ entősen csökk ent aktivi tást ismét a maxim ális szintr e lehet emeln i, ha a rends zerhe z mikrornoláris konce ntráci óban kalciu miono kat adunk. Mind ez arra utal, hogy a tropomiozin, troponin komp lex kalciu mérzé kenny é teszi az izom kontraktilis rendszerét, ezá ltal megh atároz ó jelentősé­ ge van a kontrakció/relaxáció szabályozásában. A tropo ninko mplex ek, a vékon y filamentum hossz ában kb. 38 nm távolságra követ ik egym ást, kijelö lve a kereszthidak kialakulásának lehetséges

z

KONTRAKTILIS REN ZER

>>)))))))) )))))))))))))))))) >>>>>>>>)))))))HH>H)))>>) )) )) >>))n ) ) U >>)))>))>U>>)>H)))>>))>H> ))

)))) )))) >>)))U)))) U))>))>>))))))))))))))>> )))) ))

helyeit. Kalciummentes közegben, kisebb mint 10·6 M Ca2+ jelenlétében, amikor a troponin C nem köt kalciumot, a tropomiozin és a troponin T a legység közelében elhel yezkedő, és ezáltal inhibitoros

+Ca'i

553

troponin I alegység ráfekszik az aktin-miozin kötésre alkalmas régiójára, az izom relaxált állapotban van (6-20. ábra). Ha az ionizált kalciumszintje e léri a J 6 M értéket, a troponin C

o·

l~·

miozinfej

~-Ca''

keresztmetszet

J

6-20. ábra. Az aktin-miozin kapcsolódás kalcium szabályozása. Tm, tropomiozin; a többi rövidftéshez lásd a 6-18. ábrát

554

>>>>>»>»»>>>>>>>>>>>>»>>»>>>>>>>>>»))H))))))H))>>>>>>)))

SZERVEK, SZERVRENDSZER EK MŰKÖDÉSÉNEK BIOKÉMIAI ALAPJAJ

kalciumionokat köt, eltávolodik a vékony filamentumtól és elhúzza magával az inhibi.toros toponin l alegységet is. Az aktin-miozin kölcsönhatás, a kereszthíd kialakul. Izotóniás kontrakcióban a kereszthídciklus erő­ csapás lépése során a vékony fil amentumok olyan mértékben rnozdulnak el a vastag fi lame ntumokhoz képest, hogy a következő troponinkomplex által megjelölt kereszth íd kötőhelyek a miozinfejek

számára e lérhető távolságra kerülnek és a következő kereszthídciklus ott fog lezajlani, az izom rövidül. Amennyiben az izornra háruló terhelés nagyobb a miozin fej i, nyaki részek erőcsapása során kifejthető erőnél, a filamentumok egymáshoz képest nem rnozdulnak el, az újabb kereszthidak ugyanott alakulnak ki ahol az előző kontrakcióban voltak. Ez az izometriás kontrakcióra jellemző állapot.

adenilát-cikláz

PKA (inaktív)

cAMP

l

ATP

CR,-cAM P, PKA

(aktív) ATP

l

2 Ca2• + kalmodulin E ) Ca ·-kalmodulin komplex

l

ADP

~L

l

MLC-kináz ~(===;:==~====Z) ~ 7MLC-foszfatáz

1

MLC-kináz - P (inaktfv, nagyon gyengén köt ca•·-karmodufin kompfexet)

pl

Ca2· -kalmodulinMLC-kináz (aktiv)

miozin (elernyedt)

miozin- P (összehúzódott)

6-21 . ábra. A simaizom-kontrakció szabályozási mechanizmusa. PKA, protein-kináz A; MLC, miozin könnyú lánc (myosine light chain)

KONTRAKTILIS RENSZER

)))) )))))) )))))) )))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) )) )) )) )))))))) )))))))))) ))>) >))))) >)>) )))))))) )))))) ))))))))))))))))))))))))))))))))

A troponin- tropomiozin komplex szerepe a kalcium érzékenység közvetítésében csak a váz és szívizomzatban érvényesül. Simaizmokban ezt a szabályozószerepeta rniozinfej egyik könnyü lánca, a foszforilálható ún. P könnyü lánc veszi át. A simaizomban a miozin P könnyü láncok foszforilációjáért, defoszforilációjáért felelős kinázok, • foszfatázok számos jelátviteli rendszer hatását közvetíteni képesek (6-21. ábra). Végső soron ezek határozzák meg a simaizmok szervrendszerenként rendkívül heterogén és nagy alkalmazkodási képességet mutató kontrakciós relaxációs állapotát. Az izomfehéljék és az izomműködés megismerésében korszakosjelentőségű volt Szent-Györgyi Albert és munkatársai,

Banga Ilona és Straub F. Brúnó a harmincas évek végén, Szegeden fo lytatott munkássága.

Az érett harántcsíkolt izom felépítés. Szupramolekuláris struktúra. A harántcsíkolt izmok kifejlett állapotukban köteges képződményeket alkotnak. Felépítő egységük az izomrostok, melyek lefutása, elrendeződése nagyrészt az anatómiai helyzettel, erőkifejtéssel, rövidülési képességgel függ össze. A rostok tömegét nagyrészt a kontraktilis apparátust tartalmazó miofibrillumok képezik. Ezen kivül felismerhetők a szarkolemma alá szorult sejtmagok, a szarkatubuláris rendszer elemei, a rnitokondriumok, glikogénszemcsék. Ezek menynyisége, eloszlása jól tükrözi az izomrost kontrakció sebességét, anyagcserejellegét és az aktuális tápláltsági állapotot is. A miofíbrillumok képezik a szinkronizált kontrakció megvalósulásának szupramolekuláris rendszerét. Világosan mutatják a harántcsíkolatot, amely a két keskeny elektrondenz Z vonal között, szarkornerenként az alábbi részleteket mutatja: csekély elektrondenzitású 1/2 izotrop I sáv, az erő­ sebben elektrondenz anizotrop A sáv, melynek közepén a világosabban festődő H sáv található (6-22. ábra) . Nagy felbontású elektronmikroszkópos képeken felismerhető, hogy az A sávban az ún. vastag filamentumok helyezkednek el. Az I sáv két fele, a Z membránhoz kapcsolódó, két szomszédos szarkomerbe nyúló vékony filamentumrendszert tartalmazza. A vékony filamentumok benyúlnak a vastag filmentumok közé, és a H zóna határán ér-

555

nek véget. Keresztmetszeti elektronmikroszkópos ké pen az I sávban a vékony filamentumok hexagonális szabályos rendszere, a H zónában a vastag fi lamenturnok trigonális rendszere látszik. Az A sáv legsötétebb festődésű szakaszán a hexagonális és a trigonális rácspontok szabályos szuperpozíciója látható. Az ultrastruktúra tökéletes megőrzése mellett ebben a sávban felismerhetőek a vastag és vékony filamentumok között húzódó kereszthidak IS.

A vázizom hossz-feszülés összefüggése, a csúszó filamentum (sliding fi/ament) mode/1 A vázizomrostok feszülési, erőkifejtési képessége nagymértékben függ a szarkomerek hosszátóL Maximális feszülés észlelhető ha a szarkomerek hossza 2,0- 2,25 f.!m (6-22. ábra). Ezt meghaladó szarkornerhossz mellett a feszülés képessége fokozatosan csökken, 3,5 f.!In felett aktív feszü lésre már nem képes az izom (a kötőszöveti , támasztó struktúrák passzív feszülése természetesen ilyenkor jobban érvényesül). A szarkornerhosszat rövidítve, a feszülés képesség előbb enyhébb ütemben, majd kb. l ,6 f.!ID alatt rohamosan csökken. l ,2 f.!m szarkornerhossz alatt az izom erőkifejtésre ugyancsak képtelenné válik. A fenti megfigyelések arra utalnak, hogy az izom erőkifejtési , aktív feszütési képessége a vastag és vékony filamentumok között kialakuló kereszthidak számával arányos. A kereszthidalkotás képessége legnagyobb a vastag filamentum két vége felé elhelyezkedő ún. tüskés szakasz és a vékony filamentum maximális átfedése esetén. Nyújtás során ezen átfedő szakasz hossza csökken, majd 3,65 f.!ID szarkornerhossz mellett a kétféle filamentumrendszer szétcsúszása következik, kereszthid képzésre nem marad l ehetőség. Ilyenkor elektronmikroszkóppal a H zóna kiterjedése látszik, az A sáv teljes hosszára. Rövidített izomban a feszülésképességet fokozatosan csökkenti a két vékony filamentum összeütközése a szarkorner közepén (a H sáv eltünése az elektronrnikroszkópos képen). Tovább rövidítve az izmot a vékony filamentumok torlódása és a vastag filamentumok ütközése a Z struktúrákhoz rneredekebben tovább rontja az erőkifej tés lehető-

556

ZERV EK, SZ ER RENDSZE REK M " KÖDÉSÉN EK BIOKÉMJA l ALAPJAJ

)))))))))))HU))))) ))>))))))))J))))U)))))U~>>>U))>>>>>n))))

c-100 ro .D ·ro

2

o~80 (/)

:ro

E 60 ro

·x E

~40

:o ...

(l)

- 20 Q)

-

§

~

o ~~==~----------.---------.-------------------~~~~ 1,5

2 2,5 a Z csíkok távolsága

3

3,5

4

Z vonal

T --

~ ~~~ ~ ~~~ ------ - rr~·~

3,65

1/2 l sáv

~tm

A sáv

2~~ 2,25~-tm

4

6-22. ábra. Az izomhossz és feszü lés összefügg ése

ségeit llyenkor az l sávok eltűnése lesz j el l emző az elektronm ikroszkópos képen. Végül a vékony fi lamentum végek ell enkező oldali Z vonalba ütközése az aktív feszülés l e hetőségét végleg megszün teti . Mindezen összefügg ések gondos tanulmányozása alapján született meg az izomkontrakció máig legelfogadottabb és kísérletesen legjobban alátámasztott modellje, az ún csúszó filamentum

(sliding fil ament) modell. Ennek lényege, hogy az izom rövidülés e a vastag és a vékony filamentum rendszer egymásh oz viszonyított elcsúszás ának következménye. A Z lemez, mint a citoszkele tális hálózat része lehorgony ozza a vékony fil amentumokat. Kontrakc iókor a vastag fila mentumokkal kialakítot t kereszthidak, illetve ezek elmozdul ása behúzza a vékony filamentu m rendszert a vastag filamentumok közötti térbe, am i a citoszkeletális,

'

..

L

KONTRAKTILIS RENSZER

rostok révén makroszkó posan is észlelhető elmozdulás t és/vagy erőkifejtést eredményez. Relaxációb an a kereszthida k felszakadnak és a passzívan megfeszíte tt váz struktúrák rugalmassága következtéb en a vastag és vékony filamentumok szétcsúszna k, az izom makroszkó posan is észlelhető mértékben megnyúlik. • A vázizmok maximális rövidülési képessége a sliding filament modellnek megfelelően kb. a nyugalmi hossz J/3-a. A párhuzamos, hosszanti rostlefutású izmokban ez megegyezik az izom anatómiai hosszának 113-val. Olyan iz mokban, ahol a rostok lefutása valamilyen szögben eltér az izom tengelyétől, a rövidülés mértéke a rostlefutáss al párhuzamos síkban 1/3, a teljes izomra nézve ez kisebb (a lefutási szög koszinusáv al megszorzott érték lehet). Ezen izmokban viszont az erőkifejtés mértéke nagyobb, mivel a ferde rostlefutás miatt, azonos izomtérfogatban sokkal több kereszthíd kialakulására nyílik le he tőség. A maximá lis erőkifejtés mértéke az izom funkcionáli s keresztmetszetével arányos amely a rostiefutásra merőleges síkban mérhető keresztmets zetnek felel meg. ín,

kötőszöveti

A kalciumszignál keletkez ése és eliminációja izomban A kalciumszignál és az izom szarkatubuláris rendszere Az izomkontra kció és - re laxáció szabá lyozó szignálja a citoplazma tikus szabad kalcium kencentráció változása. Ha a küszöbinge rt meghaladó stimulus ér egy izmot, a tovahaladó akciós potenciál kialakulásá t l 0- 15 ms késéssel követi az intracelluláris kalci um szint emelkedése . A kalciumszigná l időbeli dinamikája nagyban függ az izom kontrakciós sajátságaitóL Gyors kontrakció jú izomrostban rövid ide ig tartó, nagyobb ampl itúdójú szignál, lassú izomban kisebb ampl itúdójú, lassúbb lefutású ka lciumjel ész le lhető. A kalciumszignál leszálló szárának kezdetén, a stimulus idejétől számítva kb. 50 ms elteltével kezdődik meg az izom feszülése. A feszülés növekedés e folyamatosan tart a kalciumszi gnál leszálló szára ideje alatt (6-23. ábra) . Fenti megfigyelések arra utalnak hogy az akciós potenciált követően megemelke dett szabad kalci-

akciós otenciál Ca 2 +-jel elektromos stimulus idő

6-23. ábra. Az akciós potenciál, a kalciumszig nál és a kontrakció időbeli lefutása a vázizomban

um szint, a kötőhelyek affinitási konstans szintjét elérve kapcsolódi k a troponin C kötőhelyeihez. Ez vezet a kontrakció elindításáh oz, egyúttal a szabad kalc ium szint csökkenésé hez. Re laxálódó izomban a troponin C-ről leváló kalciumion ok vagy azonnal más kompartme ntekbe kerülnek, vagy átmenetileg kalcium pufferoló fehérj ékhez kötődnek, így relaxációban újabb átmeneti szabad kalcium szint emelkedés nem lesz megftgyelbető. A vázizomros tok és a szívizomsejtek igen fejlett és rendezett bel ső membrán hálózattal az ún. szarkatubu láris rendszerre l rendelkezn ek. Ennek részei a felszíni membrán, a szarkolemma betüremkedésé vel kialakult transzverzá lis, T tubulus rendszer. Ennek Iumene folyamatos teret képez az extracelluláris térrel bár a diffúzió korlátozott volta miatt a T tubulusok lumenében átmenetileg az extracellul árisétól e ltérő ionkoncent rációk is kia lakulnak (6-24. ábra). Az izormostok endoplazm atikus retikulum hálózata szinte teljes egészében a kalc iumraktározásra és -felszabadí tásra specializálódott szaroplazm atikus retikulumm á (SR) alakult. Ennek morfológia i részei, a kontraktilis apparátussal párhuzamo s csatornáka t képező longitudiná lis tubulus rendszer, és a szarkomere k két szélén tágulatot alkotó terminális ciszternák. Müködésbeli különbség a terminális cisztem ák T tubulus fel őli ún. junkcionál is felszíne, valamint a szarkoplazma-

558

»»>)))))))))))>>>>H)))))))))))))))))))>)>>>>>>>>>>>>>»>>»>>

SZERVEK, SZERVRENDSZEREK M Ű KÖDÉSÉNEK BIOKÉMJAl ALAPJAl

miofibrillum - --

terminális ciszterna longitudinális tubulus

~--+---

a szarkolemma invaginácíója, melyből a T tubulus ered

SR membrán Uunctionalis SR)

6-24. ábra. A szarkatubuláris rendszer felépítése vázizomban. SR; szarkoplazmatikus retikulum; RyR, rianodinreceptor; DHPR, dihidropiridin-receptor

tikus retikulum rendszer többi membrán területe között mutatható ki . Az előbbi a kalcium felszabadításért, az utóbbi a kalcium visszvételért felelős.

A kalciumfelszabadulás mechanizmusa A kalciumfelszabadítás, a felszíni mernbránról a T tubuluson beterj edő akciós potenciál hatására indul. A T tubulus rnembránban tetrádokat alkotó L típusú kalciumcsatomák, más néven dihidropiri-

din- (OHP) receptorok szinkronizált elmozdulása, konformáció változása az SR membrán junkcicnális felszínéből előemelkedő kalciumfelszabadító ' csatorna fehérjék, a rianadinreceptorok zárszerkezetét megnyitja és az SR lumenből a kalcium elektrokémiai gradiensének irányába a szarkoplazmatikus térbe, a kontraktilis fehérjékkel azonos kompartmentbe áramlik (6-25. ábra). A riana dinreceptor négy azonos, 450 kO rnolekulatömegü al egységbő l fe lépülő tetramer. Az SR lumen irányába a négy alegység egy közös csator-

KONTRA KTILIS RENSZER

)) )) >>))>>>H>>>)> )))HH> ) ) )) )) )) >)>))) >))))))))))))) )))) )))))))) )})))))) )) )) )))) ))))))) ) )) )) >))>)) )) ))H )) )) )) )) )))) ))))})

>>))))))>») )H)))))>>))))

•

szarkoplazmatikus retikulum Iumene

2. extracelluláris tér

o

OG

o

o

o

szarkoplazmatikus retikulum Iumene

o0

o

o

0 e e Ca20+-ionok

0

o o

o

o

00 Ca2+-ionok

3.

l P3-szenzitív Ca2' -csatorna

endoplazmat ikus retikulum Iumene

o

oo o

Ca2+-ionok

6-25. ábra. Az excitációs-k ontrakciós kapcsolás mechanizmu sa a váz- (1), a szív- (2) és a simaizomba n (3)

559

560

"'""m•»>•>>•~>>»>>»>»h»>>»>»»m•»m»»»>»»>

SZERVEK, SZERVR EN DSZEREK MŰKÖDÉSÉNEK BIOKÉMJAI ALAPJAJ

nát alkot, majd ez a csatorna, ajunkcionális rés közepének magasságában négyfelé válik, derékszögben megtörik és a szarkoplazmatikus tér felé szájadzik. A rianadinreceptor-csatorna zárszerkezete a DHP-receptor szomszédságában helyezkedik el. Vázizomban ez közvetlen mechanikai kapcsolatot jelent, aDHP-receptorok szinkronizált konformációváltozása önmagában el egendő a zár nyitásához. A vázizomrostok így kalciummentes extracelluláris folyadékban is képesek aktiválódni. A szívizom típusú DHP-receptor közvetlen mechanikai kapcsolatot nem alkot a rianodinreceptor zárszerkezetével. Az akciós potenciál hullám hatására megnyíló L típusú kalciumcsatorna DHP receptor kis mennyiségű, ún. trigger kalciumot ereszt át, ami elegendő a rianodinreceptor zárszerkezetének nyitásához, és ezt követően az SR lumenből a nagy mennyiségü kalcium kiáramlásához. Ez az ún. kalciumindukált kalcium release jelensége, ami megmagyarázza, hogy szívizomsejtek extracelluláris kalcium hiányában nem képesek aktiválódni. Simaizomsejtek kalciumaktiválódása nagyobb részt a felszíni membránon keresztül történik. Az intracelluláris kalciumraktárak elérése kémiai szigná~ az inozitol-triszfoszfát felszabadulása és intracelluláris diffúziója segítségével valósul meg. Ez lassúbb folyamat, mint a közvetlen mechanikus kapcsolat vázizomban, vagy a kalcium indukált kalcium release jelenség szívizomban. Tekintettel a simaizom típusok jelentős heterogenitására, az inozitol-triszfoszfát jelátviteli rendszer mellett más szignál utak is szerepet játszhatnak a símaizmok excitációs kontrakciós kapcsolásának létrejöttében (lásd még az 5. 1 fejezetben).

A kalciumvisszavétel mechanizmusa Az izom relaxációját az ionizált kalcium szint csökkenése váltja ki a szakoplazmatikus térben. Ennek következtében a kalcium ionok leválnak a troponin C kötőhelyeiről, és a troponin I meggátolja az újabb kereszthidak kialakulását. A troponin C-ről levált kalcium eliminációja elsősorban a szarkoplazmatikus retikulum rendszer lumenébe történik. Ez a gradiens ellenében zaj ló iontranszport az SR kalciumATPáz (SERCA) enzim működésének eredménye. A SERCA enzim,

113 kD molekulatömegű integráns membránfehérje, amely l ATP energiájának felhasználásával 2 kalciurniont pumpál az SR lumenébe. Ennek során maga átmenetileg foszforilálódik, egy aszparaginsav oldalláncon, emiatt soroljuk a P-tipusú transzport ATPáz enzimek családjába. A fixált transzport sztöchiometria (2 kalcium- L ATP) érdekes ellentmondásban áll a relaxáció elején és végén fennálló eltérő kalciumgradiens miatt a transzport eltérő energiaigényéveL Relaxáció kezdetén kevesebb kalcium van a lumenben és több a szarkoplazmatikus térben, bár a grádiens ilyenkor is belülről kifelé mutat. A pumpaműködés következtében egyre alacsonyabb kalciumtartalmú térből kell a kalciumionoknak az egyre magasabb kalciurnkoncentrációjú SR lumen be kerülnie. Ezen termodinamikai ellentmondás lehetséges magyarázatai a pumpa funkcionális szétkapcsolásának az ún. csúszásnak (slippage) jelensége a relaxáció elején, amikor az ATP-hidrolízis energiája nagyobb részben hővé alakul. További lehetőség a felvett kalcium megkötése az SR lumenben jelenlévő kalciumkötő fehérjék, calsequestrin és calreticulin által. Az izomrelaxáció sebessége legtöbb izomban közvetlenül a SERCA pumpa aktivitásának változásaival együtt változik, így az sebesség meghatározó, limitáló lépésnek tekinthető. Az SR rendszer fejlettsége, a SERCA enzim izoforma expressziója eltérő az egyes rosttípusokban. Gyors kontrakciójú izmokban igen fej lett szarkatubuláris hálózat és a SERCA enzim gyors izoformája található. Lassú izmokban és szívizomban az egész szarkotubuláris rendszer kevésbé kiterjedt, és az alacsonyabb ak:tivitású lassú/szív típusú SERCA enzim expresszálódik. Szívizomban az SR membrán lipidrétegében elhelyezkedő erősen apoláris jellegű preteolipid a foszfolarnban fejt ki szabályozó szerepet. Ezen foszforilálható fehérje defoszforilált állapotában a SERCA enzimhez kapcsolódik és csökkenti annak ' pumpaaktivitását. Béta-adrenerg stimulációra bekövetkező foszforilációja leválasztja a faszfolarnbánt a SERCA enzirnről, és annak specifikus aktivitását kb. 50%-kal emelni képes. Egyes fajokban (pl. halak, kétéltűek) az SR pumparendszer-kapacitása nem elegendő a relaxáció sebessége által megkövetelt kalciumelimináció végrehajátáshoz. Ezen fajok izmában egy nagyobb

KONTRA KTILIS RENSZER

mennyiségben jelen lévő kalciumkötő fehérje, a parvalbumin köti meg az átmenetileg a troponin C-ről leváló kalciumionokat, lehetövé téve ezzel az izom relaxációját, majd a kalciumionok a SERCA enzim kapacitásának megfelelő sebességgel kerülnek tovább az SR lumenébe.

•

Az izomkontrakció energiaszükségletének biztosítása Az izomműködés energiaszükségletét döntő mértékben a kereszthíd ciklus során az aktorniozin által elbontott ATP jelenti. A TP-t igénylő endergonikus fo lyamatok az ionpumpák, e l sősorban a SERCA enzim működése . Kisebb m értékben energiafelhasználást jelentenek az izom intermedier anyagcsereútjainak aktivációs lépései, valamint az anabolikus fo lyamatok endoterm szakaszai is. Az ATP-szükséglet biztosításának mechanizmusa nagyban függ az izom anyagcseretípusátóL Szív és oxidatív típusú vázizomban a zsírsav- és ketontest-oxidáció, valarnint kisebb mértékben az aerob glikolízis játszik szerepet. Ez utóbbi a vérpályábó l fe lvett glukózt hasznosítja, rnivel az oxidatív anyagcseréjű izmok glikogénraktárral nem rendelkeznek. Az oxidatív anyagcsereutak fontosságára utal ezen izmokban a rnitokondriumok nagy száma és térfogata. Az oxidatív energiatermelés oxigénszükségletéta gazdag kapillarizáció mellett a magas mioglobintartalom biztosítja, ami egyúttal az izom vörös színéért is felelős. Kiemelkedően magas a merül ő életmódot folytató emlősök izmainak mioglobin tartalma. A glikolitikus anyagcseréjű izmok energiaforrása az anaerob g likolizis. Ezt nagyrészt a rostok saját glikogénraktára látja el szubsztráttal. Ennek kimerülése után a glukózfelvétel sebessége közvetlenül a vérből nem elegendő a gyors kontrakciótípus energia szükségletének maradéktalan biztosítására. Ez magyarázza ezen izomrostok fáradékonyságát. A g lukózfelvételt az inzulindependens GLUT 4 transzporter katalizálja. Az anaerob glikolízis végterméke a tejsav, ami felhalmozódás esetén lokálisan illetve az izomból kikerülve generalizáltan metabolikus acidos ist okoz, és hozzájárul az izomfáradás kialakulásához. Az izomból kikerülö tejsav a májban piruvátorr keresztül be-

kapcsolódik a glukoneogenezis folyamatába (Cori-kör). Az izom energiaraktározó kapacitását jelentősen növe ini képes a kreatin-foszfát képzése. A kreatin-kináz enzim hatására a felesleges ATP foszfátcsoportját kreatinmolekulára transzferálja, így ADP és foszfok:reatin keletkezik, ami szintén makroerg kötést tartalmaz. Izommunka végzésekor, amint az ATP-szint lecsökken, a kreatinfoszfát leadja a foszfátcsoportot az ADP-nek, és visszaalakul kreatinná. A folyamatot katalizáló enzim, szív és vázizomra specifikus izoformái értékes diagnosztikus param éterek izomkárosodások detektálásában (miokardiális infarktus, izombetegségek). Hasonló energiaraktározó, újrahasznosító folyamat a miokináz vagy adenilát-kináz enzim álta l katalizát 2 ADP = A TP + AMP reakc ió, ami. a kontrakció során nem hasznosítható ADP-molekulák felét ismét felhasználható á llapotba hozza. Ezen folyamatok részletei a 2. fejezetben olvashatók. Az izomszövet anyagcsere-folyamatainak intenz itása munkavégzés során eltérő mértékben változ ik. 12 másodpercig tartó, maximál is izommunka nyomán az oxigénfogyasztás 4 2-szeres emelkedést ro utat. A zsírsavfelhasználás aránya a munkavégzés előtti 69%-ról 18 %-ra csökken, míg a szénhidrát-felbasználás arán ya 31 %-ról 82%-ra emelkedik. A glikogenolízis és glikolizis intenzítása 35-szörös, a citrát-ciklus intenzitása 3,2-szeres emelkedést mutat. Ezzel összhangban a tejsavképzés intenzitása a nyugalmi állapotban megfigyelhető szint 14-szeresére emelkedik.

Az izomszövet alkalmazkodási reakciói Az izomfáradás, izomláz Az izomfáradás komplex folyamat eredménye. Fáradásnak nevezzük azt az állapotot amikor az izomkontrakció ereje és/vagy sebessége nem tud megfele lni a vele szemben támasztott elvárásoknak. Elméletileg a fáradás létrejöhet az excitációs kontrakciós kapcsolat, a kontraktilis rendszer, a metabolikus energiabiztosítás, illetve a kalciumv isszavétel szintjén. A fáradó izomban megfigyelhető a glikogénraktárak kiürülése, a lokális pro-

562

>>»»»»>»»>>>>m>m»>>>m»»»»>»>»»>>>m>»>»>>

SZERVEK, SZERVRENDSZEREK MŰKÖDÉSÉNEK BIOKÉMJAl ALAPJAl

ton-, tejsav- és anorganikus foszfát kencentráció emelkedése, káliumionok kiáramlása, a metabolikus bomlástermékek felhalmozódása okozta hiperozmózis miatti vízbeáramlás. A kreatin-foszfát szintje lecsökken, gyakorlatilag eltünik a fáradt izomból, ugyanakkor fontos megjegyezni, hogy az ATP-szint jel entős fáradásban sem számottevően alacsonyabb. Egészséges izomban a rootoros véglemezben a transzmitter- (acetilkolin) felszabadulás csökkenése nemjátszik szerepeta fáradá s kialakulásában. A metabolikus duzzadás az excitációs kontrakciós kapcsolat elemeinek összerendezett müködését zavarja meg. A káliumvesztés, acidosis, anorganikus foszfát felhalmozódás együttesen eredményezik a kereszthídműködés, illetve a SERCA enzim müködésének csökkenését. Szívelégtelenségben el ő­ ször a relaxáció sebessége csökken, jelezve a kalcium-visszavételi folyamatok nagyobb érzékenységét és korai érintettségét a fáradási folyamatban. Az izomláz nem azonos az izom fáradásávaL Hátterében durva morfológiai károsodások, filamentumok, membránelemek disztorziója, szétesése, esetleg teljes rostok pusztulása áll. Izomláz kialakulását elsősorban ún. excentrikus izommunkában figyelhetjük meg, amikor túlnyújtott izom végez erőkifejtést. Hegyről lefelé jövet a quadriceps izomban sokkal erősebb izomláz alakul ki, mint fe lfelé mászás során. Egyik lábunkkal ismételten fe l, másikkallefelé lépve egy emelvényről, a pozitív munkát (felfelé lépést) végző láb izmaiban a fáradás biokémiai paraméterei sokkal kifejezettebben mérhetőek, míg a negatív munkát (lefelé lépést) végző láb izmaiban sokkal súlyosabb izomlázat kapunk, amely a fáradás biokémiai változásainak megszünte után is, akár napokig fennmarad.

edzése az oxidatív anyagcsere kapacitás, mioglobin-tartalom növekedését eredményezi, ezáltal az oxigénadósság tűrőképesség is javul. A kontrakciós jelleg megváltozása normál, természetes edzési protokollok hatására nemigen következik be. Az izom beidegzési típusától eltérő frekvenciával az izmokat tartósan ingerelve, kereszt innerváció vagy elektromos impulzusok segitségével, a lassú fehérje izofonnák (miozin, troponin komplex, SERCA stb.) gyors típusúra cserélbetők, illetve fordítva a gyors izoformák lassú típusra válthatók. Ezek az átalakulások, hosszú, akár több hetes ingerlést igényelnek. Génexpresszió-változások, miogenikus faktorok, idegi és mechanikus tényezők együttesen játszanak szerepet létrejöttében. Pajzsmirigyhonnek hatására szintén a gyors izoformák expressziója válik erő­ teljesebbé.

Az izom adaptációja, plaszticitása

Az izomszövet citoszkeletális vázrendszere

Az izom sajátságai számos tényező hatására módosulhatnak, átalakulhatnak. Fokozott terhelés, rendszeres edzés hatására elsősorban az anyagcserejelleg megváltozása figyelhető meg. A gyors glikolitikus rostok nagyobb fáradástűréssel rendelkező gyors oxidatív-glikolitikus rostokká alakulnak. Lassú oxidatív rostok megfelelő stratégiájú

Az izomplaszticitás, illetve -transzformáció gyakorlati orvosi felhasználása a kardiomioplasztika műtét, amikor a szívizom elégtelenségének korrigálására a mellüregbe behúzott m. latissimus dorsiból készítenek egy második izomburkot a sziv körül. Ez megfelelő frekvenciával ingerelve a pumpafunkeiét javítja. A latissimus dorsi rostjainak folyamatos szívfrekvenciáj ú működtetése a fáradságtűrés fokozása nélkül nem lehetséges. Ezért a kardiomioplasztika műtéte előtt hetekig tartó krónikus alacsony frekvenciájú ingerléssei az izmot lassú oxidatív típusúvá kell transzformálni. Hasonló előkezelés után am. gracilis incontinens betegek állapotának javítására a sphincter ani megerősítésére használható.

Az aktív kontrakció erőátvitelét, valamint a jemechanikai terheléssei szembeni ellenálló képességet, a rendezett miofibrilláris és szarkotubuláris struktúrák integritásának megőr­ zését fejlett citoszkeletális rendszer biztosítja az izomrostokban. Ennek részei a Z vonal és a lentős mérték:ű

KONTRAKTILI RENSZER

\)•)))))))))))))))n>))))))U)))))))))))))))))))))))))))) )),))))))))))))))))))))))n)U)))))))))))))H)>)HU))))) ))))))))))))}))))))))>)H))>))))))))

miofilamentumok vázrendszere, illetve a membrán citoszkeletális rendszer elemei. A Z vonal alapvázát a l 00 kD tömegű monomerekből felépülö alfa-aktinin-há lózat alkotja. Ebben az alapvázban rögzülnek a vékony filamentumok, részben az F aktin részben az ehhez kapcsolódó citoszkeletális fehérje, a nebulin reven. A • filamentum rendszer másik fontos c itoszkeletális eleme a titin. A jelenleg ismert legnagyobb molekulatömegű fehérje (2,5 megaD) a Z vonal és a vastag filemtumok között helyezkedik el. Merev része hozzáilleszkedik a vastag filamenturnokhoz, és a szarkorner közepéig kíséri azokat. A molekula másikrésze szabadon húzódik a vastag filamentum folytatásaként a vékony filamentumok közötti térben, és a Z vonal állományában rögzül. Periodikusan ismétlődő, rugószerüen megnyúlásra, illetve összetekeredésre képes domének követik ebben a szakaszban egymást. A titin funkciója az izom túlnyújtása után a vastag és vékony filamentumok eredeti pozíciójának helyreállítása, illetve végső állapotban a nyújtás korlátozása.

563

Az intermedier filamentumok közül a dezmin szív- és vázizmokban, a vimentin simaizmokban fordul elő. Simaizmok a v imentin mellett dezmint is tartalmaznak. A dezmin filamentumok annyira specifikusak a váz- és szívizomsejtekre, hogy expressz iójuk megjelenése a mezenchimális össejtek izom irányú elkötelezetté válásának korai markerének tekinthető. A titin, nebulin, illetve az intermedier filamentumok hálózata fontos irányító, szabályozó szerepet játszik az izom morfogenezise, a szarkomerek, filementumok, fibrillumok strukturális rendezödése során. A membrán citoszkeletális rendszer feladata az egyes integráns membránfehérjék, -receptorok, -csatornák laterál is diffúziójának szabályozása, a belső citoszkeletonnal, illetve az extracelluláris mátrix komponenseivel va ló mechanikai kapcsolattartás, a jelátviteli rendszerek működésének támogatása. A szarkolemma citoszkeletáli kapcsolatai biztosítják, hogy kontrakció, rövidülés során az izomrostok felszínéről nem válik le a membrán. Kiemelten fontos terület a rootoros véglcmez,

dystroglycan

6-26. ábra. A disztrofin és a hozzá kapcsolódó glikaprotein-komplex elhelyezkedése az izomban

564

>»»•>»»»»»»>»>»>»»»>»»»>»•»m»>H>>»>»•»>

SZERVEK, SZERVRENOSZEREK M ŰKÖOÉSÉNEK BIOKÉMIAI ALAPJAl

junkcicnál is SR struktúrák védelme az aktív izommunka, illetve passzív terhelések során bekövetkező extrém mértékű mechanikai behatásoktól. Ezen rendszer kiemelkedően fontos tagja a szarkolemma alatt hálózatot alkotó disztrofin, amely a citoszkeletális aktin hálózat és egy a felszini mernbránba épülő glikoprotein-komplex között létesít kapcsolatot (6-26. ábra). Hasonló szerkezetü és funkciójú fehérje az utrophin, amely elsősorban a T tubulus SR junkció, valamint a mioneurális junkció területére lokalizálódik. Szerkezetük erő­ sen hasonlít a más sejttípusokban előforduló membrán citoszkeletális fehérj e, a spektrin szerkezetéhez.

Egyes fontosabb izombetegségek biokémiai alapjai

A miozin, aktin, tropomiozin, troponin komplex febérjéinek defektusa ritkán fordul elő. Ennek magyarázata elsősorban ezen fehérjék igen elterjedt előfordulása és nélkülözhetetlen funkcionális jelentősége lehet. Egyes cardiomyopathiák, a szívizomzat pumpaelégtelensége hátterében a szívtípusú miozin izoformák kárcsodott expressziója áll. Az izomszövet metabolikus anyagcserezavarai, a mitokondriális genom károsodásai, a membrán citoszkeletális rendszer öröklött betegségei, valamint egyes csatornafehérjék defektusai nagyobb jelentőséggel bírnak az izombetegségek kialakulásában.

Az izomszövet fontosabb anyagcsere-betegsége i

A glikogén raktározási betegségek közül számos érintheti az izom szénhidrát-anyagcseréjét. Közös vonásuk a glikogenolizis, glikolizis valamelyik lépésének defektusa, az ezzel járó fáradékonyság, terhelésre bekövetkező görcsök és a glikogén raktárak feltöltött

állapota. Egyes típusokban a szívizom is érintett. Tekintve, hogy a miokardium energiaszükségletének biztosítása döntően lipidekből és ketontestekből történik a szívizom károsodása másodiagos metabolikus vagy jelátviteli hatások következménye lehet glycogenosisokban. A mitokondriális genom károsodásából eredő betegségek jelentős és gyakori manifesztációs helye az izomszövet. Ezeket mitokondriális myopathiáknak is nevezik. A mitokondriális genom sérülékenységét a jelentős oxidáló szabadgyök-képzés magyarázza, a kialakuló defektusok fennmaradását a repair mechanizmusok hiánya okozza. Minden formában általában az izom energetikai egyensúlyának különböző mértékű zavara jellemző, amit morfológiai károsodások kisérnek. A súlyosság mértékét befolyásolja, hogy a nukJeáris genom érintettsége azonos vagy hasonló fehérjék, enzimek kompenzáló expreszszióját megengedi-e.

A citoszkeleton, membrán-citoszkeleto n rendszer betegségei izomban

Legfontosabb ismert betegség ezen csoportban az X kromoszómához kötötten öröklődő, legkésőbb az élet harmadik évtizedében halálhoz vezető Dochenne-betegség vagy dystrophia musculorum progressiva. A dystrophin hiányában a membrán-citoszkeleton rendszer sérül, ami a mechanikai ellenálló képesség zavarán, valamint a dystrophinhoz kapcsolódó integráns membránfehérje- glikoprotein komplex szerveződésének, müködésének zavarán alapszik. Az ismétlődő restelhalások kimerítik a satellitasejtek regenerációs kapacitását, és az érintett fiúk kb. 6-8 éves korukra járásképtelenekké válnak, majd további tíz-tizenkét év után, elsősorban a szívizom és a l égzőizmok károsodása miatt halnak meg. Enyhébb formája a dystrophinopathiáknak a Becker-dystrophia, ahol a leolvasási keret megőrzöttsége

KONTRAKT I L IS RENSZER

•H> ~) )))) )))) )) )) )))H)))))))))))))))))>) )>>))))))))) H )U)))))>) )))) )U))))))))))))))))U)>>))))))

miatt rövidebb, de még bizonyos méctékben funkcióképes distrophinm olekulák szintetizálódnak az izomban. Egyes dystrophiák hátterében nem a dystrophin , hanem a dystrophin asszociált glikoprotein komplex defektusa áll.

Ioncsator na-betegs égek az izomszöv etben

Ezen betegségcsoport legfontosab b, gyakori elöfordulású képviselőj e a malignus hyperthermia, ami az SR kalciumrel ease csatorna, a rianadinreceptor fehérje pontmutációjára vezethető vissza. Emberben és sertésekben is megfi gyelték. E l őbbiben inhalációs anesztetikumok hatására, utóbbiakba n a szállítás, vágás elötti stresszhatásokra váltódik ki a roham. Ennek lényege hogy a mutáns rianodinreceptor-csatorna nyitott állapotának esélye jelentösen nagyobb, mint a normál fehérje esetében. Emiatt malignus hyperthermiás robamban az izom kalciumma l árasztódik el, ami hiperkontrakcióhoz, a metaboliku s folyamatok felgyorsulá sához, a tartalék tápanyagok gyors

Az ábrák elkészítésébe n nyújtott segítségért a

szerző

•> >>>l>)>)-. J• )) •) )U>>>)) H)) H~~>>>>)))))))) H)H)

565

felégetéséh ez, a hőmérséklet általános emelkedéséhez vezet. Ez súlyos életveszélyes komplikációként jelentkezhe t mütéti altatás során, illetve sertésekben a hús minőségét károsítva, jelentős gazdasági vesztesége ket okoz. Az izommemb ránok érdekes tárházát képezik más ioncsatorná k genetikai defektusain ak is. Ezek gyakran a nyugalmi potenciál csökkenését fokozott ingerlékenységet, más esetekben a relaxáció elhúzódását eredménye zik. A myotoniával járó állapotok elhúzódó izornrelaxációt okoznak. Hátterükbe n a kloridvagy a nátriumcsa tornák defektusa áll. A hyper-, illetve hypokalaemiás periodikus paralysises állapotok oka a nátriumcsa tornák defektusa. Ezen betegségek feltün ően gyakran figyethetőek meg teljesítmén ysportokra tenyésztett állatokon (versenylovak, harci kutyák stb). Ennek oka az, hogy a megbomlo tt ionegyensúly miatt az izom folyamatos kismértékű ingerlésnek van kitéve nyugalomban is, és erre munka hipertrofiáv al válaszol. A dihidropiridin-recepto r veleszülete tt hiánya a muscularis disgenesis. Ilyenkor az izomdifferenciá lódás az embrionáli s fej l ődés során a korai miotubulus állapotban elakad. Az élettel összeegyeztethetetlen állapotot eredményez.

köszönetet mond Dr. Rácz Gá bornak.

A kötőszövet és a hám struktúrfehérjéi

.3.

Machovich Raymund

A

kö tőszövet

olyan molekuláris és celluláris e leszerkezet, amely biztosítja a kül ö nböző sejtféleségek szöveti struktúrákhoz törté nő kapcsolódását, illetve a sejtek migrác iój át és azok egymássa l történő kö lcsönhatásainak kialakítását. A sejte k között makromolekulákb ól felépü l ő há lózatos szerkezet ta lá lható, amelyet extracellulá ris m átrixna k nevezünk. Az utóbbi legfőbb alkotói a különböző típusú kollagének, amelyek kollagénrostokat hozn ak létre, az elasztin, amely rugalmas rostokat képez és a proteoglikánok, illetve a glukózaminogliká nok (GAG), melyek a mátrix "alapanyagát" a lkotják. Az extracelluláris rnátrix illusztrá lására két pé ldát mutatunk be (6-2 7. ábra). mekbő l fe l épülő

Em l ősökben a kötőszövet eleme it alkotó fehérjék a szervezet összfehérje-tartalmána k több mint 25%-át teszik ki. Ezek e l sőso rba n 1ibrózus fehérjék, vizes közegben nem vagy c a k rosszul oldódnak. Feladatuk különbözö, többek között a mechanikai funkc iókat ellátó szerkezetek kiala kítása. Leg főbb elő fordul ási helyük a bőr, csont, fogak, izü leti porcok és szalagok, érfalak és álta lában a sej tek közötti szövetek. A koll agének, az elasztin és a proteoglikánok me llett az extrace llu láris mátrix legjellemzöbb képv i sel ő i még a ker a tinok és kisebb menny iségben a fibronek tin és a la minin.

Ezeken kívü l még számos kötőszöveti fehétjeféleség fordul el ő kü l önböző s pecia lizálódott funkc ióval, de ezek tárgyalása megha ladja keretcinket Ugyancsak nem kerülnek megbeszélésre egyéb, bár biokém iai szempontbó l érdekes, de az em beri

szervezet ki a lak ítás á ba n szerepe t nem j á tszó mo lekulák (pl. a selymet alkotó fibrózus fehérje, a ftbroin).

Kollagének A ko llagének tropokollagén a l egységekbő l épülnek fel, amelyekben három, egyenként kb. l OOO aminosavat tartalmazó lánc található. A három, egyenként balmenetcs he likáli s po lipeptidlánc együttesen egy j obbmenetes szuperhélixet alkot (6-28. ábra). A helikális szerkezet nem cx.-hé lix. A tropokollagén rúd alakú zerkezetének hossza kb. 300 nm átmérőj e pedig J ,5 nm . A hélix egy menete 3 aminosavat tartalmaz. A három lánc hidrogénhidakka l kapcsolódik egymáshoz: a H-donor a peptidkötést a lkotó G ly - N H csoportja, az akceptor pedig egy másik p eptidkötés, gyakran a Pro -C=O csoportja. A láncokat alkotó aminosavak összetétel étő l ftiggöen közel 14 féle kollagént lehet megkülönböztetni. Á lta lánosságban jellemző a nagy G ly- (39% ) és Pro- (25%) tartalmuk. A fehérjeszintézishez felhaszná lt aminosavakon kívül 4-hidroxiprolin és 5-hidr oxilizin fordul e l ő bennük. Jell emző még, hogy a tropokollagénlánc okon be lüi és a lá ncok között is kovalens ker eszt kötések jöhetnek létre, bár a kollagének ciszte int nem tartalmaznak. Szénl1idráttartalmuk (glukóz- galaktóz diszacharidegység ek) változatos; a fi brilláris szerkezetekben (pl. izületi szalagok) á lta lában kevés, m íg a lapszerű kollagénszerkezetekben (pl. comea) bőséges.

=

A KÖTŐ ZÖ ET ÉS A HÁM TR KT . RFEH ÉRJÉI

6·27. ábra. Az epi· thelsejtek (a) és az endothelsejtek (b) környezetét képező kötöszövet sematikus képe. Az nalap-

>>>»H))>>>»>>>>>>>>>>>»>>>>>>u>n>>>>n>>>>>>»>uHu>>• >> >>>> >>>>>n>,,,,,,>>>>>> >H>>>., >n>>H>>>

567

epithelsejtek

anyagot• a GAG (g/ukózaminoglikánok és proteoglikánok), a kollagének és az • elasztikus rostok képezik

bazális Iamina

hízósejt

b

.. [l 1nt1ma

l

.-:>

..-:.

l

...,

l endothelsejtek

- - - - - - - - - - - - - - - - bazális membrán ~ ~ elasztikus r~stok

c~~ ·lm•l,om•ejtok kollagénrostok

média-

GAG ~ 1 [

l adventieia

.c:

~~

~111~ 111 ~

c;7 fibroblasztok

kollagénrostok

GAG

l-

A kollagének nagyfokú szakítószilár dságot mutatnak: az l mm átmérőjű kollagénszál e lszakításához több, mint l O kg-os terhelés szükséges. A kollagének fehérjeszerkezete több szempontból is szokatlan. O A kollagénben szabá lyosan ismétl ődő struktúrák jönnek létre, mert majdnem minden harmadik pozícióban Gly található (a globuláris fehérjékben ilyen jellegű szabá lyosság nincs). Mivel a glic in oldallánca kis helyet foglal e l a térben, így elfér a szuperhé lixen belül, ezáltal nagyobb lehetőséget teremt a különböző polipeptidlánc ok egymáshoz közeledéséhe z (6-28c ábra).

A Gly jelentőségére utal , hogy pl. egy glicin hiánya (pontmutáció során a DNS-ben egy G 988 ~ T csere történik és így a Gly helyett Cys keletkezik) már e légséges a hélix részleges felbomlásához, ami súlyos kórképben (esteegcnesis imperfecta) ny ilvánul meg.

6 A kollagénben kétféle módosult aminosav is talá lható: a hidroxilizin (Hy l) és a hidroxiprolin (Hyp). Míg a hidroxi liz in el sősorban szénhidrát oldalláncok kialakításában , a hidroxiprolin a molekula stabilitásában , illetve a hármas hélix kialakításában játszik szerepet (ez utóbbi hiá-

568

)))))))))))))).)))))))) ))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))

SZERVEK, SZERVR ENDSZER EK M Ű KÖDÉSÉNEK BIOKÉMIA I ALAPJAl

t

1,5 nm

tropakollagén

b

6-28. ábra. A tropokollagén sematikus szerkezete. A három polipeptidláncból kialakított szuperhélix (a). Több szuperhélix között keresztkötések jöhetnek létre (b). A tropokol/agénmolekulák összekapcsolódása mikrofibrillumokat hoz létre. A szuperhélix egy menete alulnézetből (c): a vonalak peptidláncot, a pontozott vonalak hidrogénhidakat, az üres karikák Ala-t és Pro-t, a kitöltött karikák pedig Gly-t jelképeznek

keresztkötö tt tropakollagének

c

a szuperhélix egy menete

~

a szuperhélix ,.alu lnézetből"

nya gyengébbé és "törékenyebbé" teszi a kollagén szerkezetét; lásd később). A hidroxilizin és a hidroxiprolin nem módosított aminosava kként épülnek be a polipeptidláncba, hanem a kész fehé1.jeláncban lévő Lys és Pro hidroxilálásával jönnek létre (6-29. ábra). A hídroxi láz enzimek rendkívül specifikusak: csaklizinn elés a-ketoglut aráttal, illetve prolinnal és a -ketoglutaráttal reagálnak. A molekuláris oxigén egyik atomja az aminosavra, a másik a ketosavra kerül, ami jelzi, hogy ezen enzimek dioxigenázok. Az enzim aktív centrumáb an vasion (Fe2+) fog lal helyet, amelynek visszaredukálásáho z aszkorhát (C-vitamin ) szükséges. C-vitamin hiányában nem történik hidroxilálás. A kollagénmoleku lán belül lizinek között keresztkötés ek találhatók, amelyek a kollagének további stabilizációját eredménye zik.

Az ilyen jellegű stabilizáció bizonyos ponton túl azonban már el őnyte lenné is válhat: az öregedés során a keresztköté sek száma növekszik, ami a kollagén rugalmassá gának csökkenésé t eredménye zi. Ezek szembetűn ő jelei a bőr rugalmasságának elvesztése, továbbá a csontok és izületek fokozott sérülékenysége.

A proJin hídroxilátása jelentösen hozzájárul a kollagének stabilitásáh oz: egy tropokollagénben a hélix stabi litása annál nagyobb, minél több benne a Hyp. A stabilitás egyikjelle mzöje az olvadáspont. A kollagének olvadáspontja (Tm) az a hőmérséklet, amelynél a molekula hélix szerkezetén ek az 50%-a megszünik és rendezetlen struktúrává (random coi llá) alakul át. A hidroxi-pro lin szerepének illusztrálására egy jellemző példa, hogy a tőkeha l -

z

A J<ÖTÖ ZÖVET É A HÁ M STRUK TÚRFEH ÉRJÉl

))))))>>))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))l>>>H>U>))))))))))l)))))H)))))))))))))>))

l

569

o ll

- N- c- cl

lizin-hidroxiláz

H

f?r;~~

l

CH2

l

CH2

l

H - C- OH

l a-ketoglutarát

CH2

szukcinát

l

coo-

NH'3"

l

Lys

5-Hyl

CH 2

l

CH2

l C=O

l

coo prolin-hidroxiláz

~

CO,

O.

a-ketoglutarát

Pro

szukcinát

H

O

l

ll

- N - C- C-

l

l

CH2 H2C '\../

c /"OH H 4-Hyp

6·29. ábra. A hidroxi-lizin és hidroxi-prolin keletkezése. A prolinon a hidroxilcsoport más pozícióba is kerülhet; itt csak a leggyakoribb szarkezetet mutatjuk be

bőr-koll agénben

l OOO aminosavban ! 55 Pro és Hyp fordul elő, amelyhez Tm= 16 °C érték társul (a tőkeh al testhőmérsék lete 1o°C- 14 °C), míg a marhabőr-ko ll agénben 232 Pro és Hyp, amelyhez Tm=39 oc társul (a testh őmérsékl et 37 °C). Ha a molekula teljesen elveszti helikális szerkezetét, vagyis ha a hőmérséklet emelésével a hélixet kialakító összes kölcsönhatás megszünik, a kollagén viszkozitása lecsökken, ún. zselatin kele tkezik.

A Pro hidroxilálás hiánya emberben a kollagénstabilitás csökkenését eredményezi, amely bőrlézi ókban és vérzésekben nyilvánul

meg, mert azérfalak károsodása azok fokozott "törékenységét" eredményezi. Ez történik scorbutban, C-vitamin-hiányos állapotokban (az ember, bizonyos emberszabású majmok és a tengerimalac nem tud aszkorbátot szintetizálni).

A kollagének további stabilitását eredményezi kovalens keresztkötések kia laku lása egy tropokollagén rnolekulán belül, illetve 2 vagy több tropokollagén molekula között. A kötések létrejöhetnek két Lys között, de két hidroxi-lizin és egy Lys között is. Két Lys között is két kü l ö n böző mó-

SZERVEK, SZERVR EN DSZERE K MŰKÖD ÉSÉNEK BIOKÉM IA I A LA PJAJ

a

6-30. ábra. Keresztkötések kialakulási lehetőségel különböző kollagénmolekulák lizinjel között. Az els6 esetben az egyik lizinb61 allizin (lizin-aldehid) keletkezik el6bb és az reagál egy másik lizinnel (a), a másik esetben két lizinb61 el6bb két lizin-aldehid keletkezik, majd azok kondenzálódnak kovalens keresztkötést alkotva (b)

""J"'v Lys ""J"'v

l

l

H-N

N-H

~)

l

l

H2N - (CH2l4 - C- H l

H - C - (CH ) -C

l O= C

23

"

H

C= O

l

l

~H,O

lizin-aldehid

Lys

Schiff-bázis !redukció

l

H- N

l

H

N-

H

l l l H - C - (CH ) - C - N;- (CH) -C- H l 23 l l 24 l O=C

H

l

H

C= O l

redukált Schiff-bázis {lizi nonorleucin )

b

!

H- N

~o

r

o~

H - C - (CH l -C r 2s "

O= C

/

H

l

·

N- H

l

C -(CH J - C - H

l C=O

23

H

l

l

lizin-aldehid

~ H,~izin-aldehid

l

H -N

l

~

N-H l

H

l

H - ? - (CH2)s-C

O =C l

?-CH2 -CH2 ~C"

c,

H

aldol keresztkötés

- f-

H

C=O l

don alakulhat ki keresztkötés. Egyik esetben az egyik lizinből először lizinaldehid (allizin) keletkezik lizin-oxidáz és 0 2 jelenlétében, majd a lizin-aldehid Schi ff-bázist képez egy másik lizinnel, amely redukció után kovalens kötést eredményez (6-30a ábra). A reakció azonban úgy is lejátszódhat, hogy elő­ ször mindkét lizinmolekula aldehidszánnazéka keletkezik, majd ezek aldol keresztkötéseket alkotnak (6-30b ábra). Két hidroxi-lizin és egy lizin oldallánca között hármas keresztkötés is létrejöhet, amely ún. "hidroxi-piridin- (piridinolin-)" szerkezetet alakít ki {6-31. ábra). Több tropakollagén egység egymás mellett kb. 1/4-rész eltolódással nagyobb szerkezeti egységeket, ún. mikrofibrillumoka t képez (6-28. ábra). A tropakollagének egymás mellett, illetve egymás után kapcsolódnak, de egy sorban elhelyezkedő trapokollagének között kb. 40 nm méretű hiány ("üreg" ) található. Az "üreg" jelentő szerepet játszhat bizonyos funkciók betöltésében; pl. a csontszövet esetében az üreget kalcium-foszfát- (hidroxi l- ' apatit-) (Ca 10(P04 ) 6(0H)2) kristályok töltik ki. A tropakollagének egymással képzett aggregátumai, a mikrofibri llumok, különben nagyon emlékeztetnek a fibrin monomerek polimerizációjára (lásd a 6.5 fejezetet). Mint ott, itt is további módosulások történnek; keresztkötések jöhetnek létre egy

B

A KÖTŐ ZÖVET ÉS A HÁM STRUKTÚRFEHÉJUti

)))))))))))) )))))))) )) )))))))))))))> )) )))))))))))))))))))))l)))))))>))))))\))))))))))))))) l)))))))))))))))

tropokollagénen belül mind a 3 hélix között, mind pedig különböző tropokollagén molekulák között is. A mikrofibrillumokban előforduló szabályos ismétlődések elektromikroszkópos képen jól láthatók; pl. harántcsíkozás formájában. Mint korábban említettük, pusztán egyetlen G ly~ Cys csere igen jelentős változást eredményezhet egy kollagén• rnolekula felépítésében és funkciójában, így nem csoda, hogy egy-egy aminosaveltérés a tropokollagén elsőd leges szerkezetében a legkülönbözőbb funkc iók ellátását szolgáló keilagénszerkezeteket hozhat létre, amelyek a szemlencse, az inak, az érfalak, a bőr, az erek stb. feladatait szolgálják. A teljesség igénye nélkül , csak példaként említjük meg, hogy az I-es típusú kollagén a bőrben, az inakban, csontban, comeában fordul elő, a II-es típusú az ízületekben, az üvegtestben, a Ili-as típusú azérfalban, bőrben , a limfoid mirigyekben, a IV-es típusú a bazális membránokban, placentában, az V-ös tipusú ugyancsak bőrben, inakban, comeában, a VI-os típus az aortában, izomszövetben, bőrben, illetve majdnem az összes kötőszö­ vetben megtalálható.

571

NH,

l l .

CH~

H

C

OH

l CH2

l

CH2

l

- cl

H

A kollagén bioszintézise és degradációja A kollagének a fibroblasztokban szintetizálódnak, de prekurzor fom1ában , mint prokollagének A prokollagének abban különböznek a tropokollagéntől , hogy nagyobbak; mind a három lánc N-terminális és C-terminális végén is ún. extenziós peptidek találhatók. A C-terminális peptidek között S-S hidak alakulnak ki (6-32. ábra). Ezek az extenziós peptidek nagymértékben eltérnek a tropokollagéntől; egyrészt kevés bennük a Gly, Pro, másrészt ciszteinek találhatók bennük. Ez teszi lehetövé azt, hogy a tropokollagénmolekulák nem képeznek a sejten belül rosszul oldódó aggregátumokat, és azt is, hogy szintézisük helyéről, a fibroblaszt sejtekből kikerülhetnek az extracelluláris környezetbe. Az extracelluláris mátrixban ezután prokollagén-peptidázok lehasítják az N-terminális (kb. 15 kDa) és C-terminális (kb. 30 kDa) peptideket. Az extenziós peptidek eltávolítása után a tropokollagének o ldékonysága lecsökken, a már korábban elmondottak szerint mikro-

CH~

CH2

l

- cl

H

6-31 . ábra. A hidroxi-piridin keresztkötés kialakulása két Hyl és egy Lys között

572

>»>>>>>>>»>>>»>>>>>>>>>>>>)»>>>>»>>»n>»>»>>>n»»>>>»

SZERVE K, SZERVR ENDSZEREK M Ű KÖDÉSÉNEK BIOKÉMIAI ALAPJ Al

prokollagén peptidázok

N-terminális

prokollagén peptidázok

6-32. ábra. A prokollagén átalakulása tropokollagénné. Az itt feltüntetett átalakulás az extracelluláris mátrixban játszódik le

prokollagén C-terminális

tropakollagén --

fibrillumok at képeznek, és keresztkötések alakulnak ki .

Ha az extenziós peptidek eltávolításában defektus .lép fel (pl. csökkent prokollagénpeptidáz aktivitás miatt), az klinikai tünetekben is megnyilvánul; az ilyen betegek bőrében és ízületeiben megnöveke dett mennyiségben található prokollagén, aminek eredménye ként az ízületek rendkívül flexibilisek és a bőr nagymértékben nyújtható (Ehlers- Danlos-szindróma). A kollagének rendkívül stabil fehérjék nemcsak mechanikai értelemben, hanem protealitiku s emésztésse i szemben is. Neutrális pH-tartomá nyban gyakorlatil ag csak a koBagenáz ok képesek degradációjukra. A kaliagenáz ok a szöveti proteázok csoportjába tartoznak, müködésük szaros kapcsolatot alkot az elasztázzal és a fibrinolitikus rendszerrel (lásd később). A kollagén degradáci ójának azonban fiziológai és patológiai jelentősége is van. Fiziológiás lebontás történik általában olyan fo lyamatokba n, amelyekben a kötőszövetek újraépítésé re van szükség, mint pl. sebgyógyu lás során vagy az uterus ciklusaiban. A kollagén degradációja fontos szerepet játszik olyan általános biológiai jelenségekben is, mint pl. az állatok metamorfózisa.

--------

Más oldalról viszont a kollagének emésztése kulcsszere petjátszik olyan patológiás folyamatokban, mint pl. a Clostridium histolyticum által !Gváltott gázgangrae na (amelyben a baktérium egy rendkívül hatékony kollagenáz enzim szekréciójá val teszi lehetövé invázióját; a gazdaszerv ezet kötőszöveti barrierjében a kollagén minden egyes polipeptidláncát több, mint 200 részre "darabolja" ). Szöveti kollagenázok müködnek közre a legtöbb gyulladásos folyamatban is, mint pl. a rheumatoid arthritis vagy a rosszindulatú tumorok növekedése és metasztázisképzése. A szöveti koUagenáz neutrális metalloproteáz, aktív centruma integráns részét Zn 2+ képezi, és aktivitásához Ca2+ jelenléte is szükséges. A legújabb nómenklat úra szerint mátrix metatlo-proteáz- 1nek (MMP-1) nevezik. Az MMP-1 inaktív prekurzor formában , mint prokollagenáz szintetizálódik fibro- blasztokban, makrofágokban, endothelsejtekben és granulocitákban, de amíg az utóbbi sejtféleségb en granulumban tárolódik és csak a megfelel ő ingerre szekretálód ik, a többi sej tféleségben szin- tézise után azonnal kiválasztásra kerül. A prokollage náz aktiválódása, a zimagén enzimmé történő átalakulása specifikus proteolízis eredménye, amelyért elsősorban a plazmin a felelős, bár a kallikrein, a tripszin vagy

A KÖTŐ ZÖVET ÉS A HÁM TRUKTÚRFEHÉRJÉI

573

a sztromelizin is képes a ktiválására. (A plazmin és kallikrein funkcióit lásd még a 6.5. fej ezetben, a tripszinét pedig a 2.4. fejezetben.) A sztromelizin szintén fém-proteáz (MMP-3), de amellett, hogy a prokollagenázt aktiválja, a kollagenázzal "szinkronban" müködik az extracelluláris mátrix degradálásában; emészteni képes a TV-es típusú • kollagént és degradálja a proteoglikánokat, a Iaminint és a fibronektint. A prokol lagenáz szintézise komplikált szabá lyozás a latt áll, amelyben a környező mononukleáris sejtek citokintermelése fontos szerepet játszik. A c itokinek a megfelel ő re-

ceptorhoz kötődésük után a sejtmagban onkoproteineken keresztül aktiválják a prokollagenáz gén transzkripcióját A kollagének szintézisét és degradációját a 6-33. ábra foglalja össze.

Elasztin Az e lasztinra jellemző, hogy hasonlóan a kollagénhez rendkívül gazdag glicinben és pro linban (-30 %). Ezenkívül a fehérjében nagy mennyi ségű

tibroblaszt

KELETKEZÉS degradációs termékek

4. prokollagén - - -+ tropakollagén

szekréció 5. peptidáz

kollagén 'k f'b . k mt ro 1 n11umo

6. kölcsönhatások

7.

k ll jé k o ag ne

keresztkötése~

( 10.

proteolízis

kollagenáz

DEGRADÁCIÓ

9.

a~

prokollrená\ sztromelizin plazmin

6·33. ábra. A kollagének kelet kezésének és lebontásának semat ikus vázlata. A kollagén képződése intra- és extracelluláris folyamatok összehangolt müködésén alapszik. A folyamatok sorrendj ét számozással jelöljük. A PMN polimorfonukleáris sejtetjelent

574

SZERVEK, SZERVRENDSZEREK M .. KÖDÉSÉNEK BIOKÉM IAI ALAPJAl

alanin fordul el ő, de a kollagénhez képest kevés a hidroxiprolin és nincs benne hidroxilizin. Az elasztinrostok tropoelasztin pol ipeptidböl épülnek fel. A tropaelasztinban helikális struktúra található, amely azonban sem az a.-helixre, sem a kollagén hélixre nem hasonlít. A fehérje szerkezetében Val-Pro-Gly-Val szekvenciák gyakran fordulnak elő amelyek ~-fordul atok kialakitását teszik lehetövé. A helikális szakaszokat Lys-ben és Ala-ban gazdag rövidebb, nem helikális szekvenciák kapcsolják össze. Az elasztinban is találhatók keresztkötések, amelyek más jellegűek ugyan,

o

H H

~- (CH,J,-CH,-~- y

CH, - (CH,)

mint a kollagénben l évők, de ezekben is a lizinek játszanak fontos szerepet (6-34. ábra). A keresztkötések jellege és a tropaelasztin helikális szerkezete együttesen hozza létre az elasztin legfontosabb mechanikai tulajdonságát, nevezetesen, hogy az elasztin rendkívüli mértékben ny újtható, tágítható, de az erő m egszűnése után gyorsan visszatér eredeti állapotába. Ez a flexibilitás teszi lehetövé az érfalak, e l sősorban az aorta és artériák tágulékonyságát és a ligamentumok nyújthatóságát Aránylag kevés elasztin található a bőrben és a laza kötöszövetekben. Az elasztin legtöbbször kolla-

-~

H lizinonorleucin

b

lizin-aldehid

lizin-aldehid lizin-aldehid

dezmozin

6-34. ábra. Az elasztinban előfor­ duló keresztkötések. A módosulások a már elkészült fehérjékben lévő aminosavakon történnek. A lizinonorleucin keresztkötés kialakitása úgy történik, mint a kollagén esetében (a). A dezmozin kialakulása során először 3 Lys-ből 3 lizin-aldehid keletkezik, majd 3 lizin-aldehid és egy negyedik nem módosult Lys között kialakul a dezmozin keresztkötés (b)

Zi

A KÖTŐSZÖV ET É A HÁ M TR KTÚRFEHÉRJÉI

)))) )) )) )))))))))))))))))))) )))))))) )) )))))))))) )))) )))) )))))) )))))))) )) )))) )))) )))) )) )) )))) )))) >)"))))))

génnel és poliszacharidokka l kapcsolatban fordul elő a kül ön böző kötőszövetekben . A kollagénhez hawnlóan, az elasztin is oldhatatlan a szervezet vizes közegében, de prekurzora, a proelasztin, amely nem tartalmaz még keresztkötéseket, oldható. A proelasztin molekulatömege kb. 70 kDa, és szintézise után réztarta lmú lizin-oxid ázok hozzák létre • azokat a lizin-aldehid-szárm azékokat, a melyek végül a lizinonorleucin és a d ezmozin keresztkötésekt:t kialakítják (6-34. ábra). Az elasztin degradációj áért az elasztázok a felelősek. Az elasztázok nem specifiku szerin-proteázok; nemcsak az elasztint, hanem szárnos más fehérjét is hatásosan emésztenek (pl. a véralvadási-fibrinolitikus rendszer majdnem összes faktorát, enzimét é inhibítorai nagy részét). Két fajta

nem helikélis szarkezet

protofibrillum

575

elasztáz ismert; az egyik a pancreasban szintctizálódik, sa táplálék fehérjeemésztésében játszik szere pet, a másik a granulocitákban. A pancreas-elasztáz a hasnyálmirigyen és a bélen kívü l csak patológiás körülmények között fordul el ő (pl. akut pancreatitisben kerül a vérkeringésbe vagy a környező szövetekbe). Al apvető feladata a táplá lék emésztése (lásd még a 2.4. fejezetet). A kötőszöveti anyagcsere, a gyulladásos folyamatok és a hemosztázis szempontjából a pancreas-elasztáznál sokkal jelentő ebb a leukocitákban szintetizálódó elasztáz (25 kDa), amelyet a granuloc iták a granulumjaikban tárolnak és "szi.ikség esetén" vagy patológiás körülmények között kivá lasztanak. Ilyenkor a sejtek mieloper oxidázt is szekretálnak, ami az elasztáz legfőbb inhibitorának, az a 1-proteáz inhibitornak hatékony gátlój a (lásd a 2.4 fejezetet is). Az inhibitor magas vérp lazma-koncentrác iója miatt az clasztáz csak o lyan körü lmények között funkc ioná lhat, ahol a granulociták lokális koncentrációj a maga . Az e lasztáz inhibitorának deftcienciáj a esetén az e lasztáz szabályozás né lkül emésztheti a kötőszöveti elemeket, s az egyik jellemző elváltozást, a tüdő fi atalkorban ki fej l ődő emphysernáját eredményezi.

Egyéb fehérjék Keratinok

mikrofibrillum

6-35. ábra. A kerat in m ikro fi brillum e l rend eződése . A protofibrillumok többféle módon is elrendeződhetnek, amelyeket S-S hidak tartanak össze. Az így kialakult mikrofibril/umok tovább ren deződhetnek makrofibrillumokat alkotva (nem látszik az ábrán) és ezek sejtekkel történő társulás után létrehozhatnak pl. egy szál hajat

A keratinok a lapszerkezetét a-hé lixek alkotják, amelyek egym ás köré tekeredve ún . szuperhélix egységet hoznak létre. Az a-hélixet alkotó aminosavak oldalláncai között van der Waals-kölcsönhatások és diszulfidh idak stabilizálj ák a szuperh élixet. A helikális szerkezetet ne m helikális szakaszok szakítják meg. A keratin további rendcző­ dését és stabilitását eredményezi, hogy rostjában két szuperhélix tekeredik egymás köré, amelyet S-S hidak rögzítenek, ún. protofibrillumot a lkotva. Majd 8 protofibri llum ugyancsak S-S keresztkötések révén egy mikroftbri llumot hoz létre (6-35. ábra). A kialakult szerkezet a bőr, haj, szőr, prém, gyapjú és a köröm, illetve a madarak csőrén ek fő

576

'""""""""'""'""""""'"""""">>»>»»>>»»>

SZ ERV EK, SZER \'R EN OSZEREK l ÜKÖDÉSÉN EK BIOKtMIAI ALAPJ A l

alkotóeleme. Ha az S-S hidak mennyisége relatíve kevés, akkor a keratint nagyfokú nyújtható ág, illetve tlexibilitás j ellemzi (pl. haj, gyapjú), ha bősé­ ges, akkor merev, kemény szerkezet jön létre (pL karom, csőr).

Fibronektin és laminin A fibronektin molekula 2 polipeptidláncból épül fel, amelyek egyenként 250 kDa nagyságúak és C-tetminális végüknél S-S hidda l kapcsolódnak össze (6-36. ábra). A molckula nagymértékben e lnyújtott (60 nm hosszú és 2,5 nm széles) és számos olyan eltérő szerkezeti e lemet tartalmaz, amely különböző funkciókért fel e l ős. A hét szerkczeti egységből az N-terminális végén található első és a C-tcrm inálison lévő utol só fe lel ős a fibrinhez kötődésért, míg a másodi k és hatodik a kollagénnel, illetve

Kötőszöveti mátrix: a se}tfelszfni fibronektin

fibrin kollagén

sejt heparin fibrin Vér: plazmafibronektin

heparinnal kialakított kölcsönhatásért, és az ötödik a sejtekkel, illetve a kötőszöveti mátrixszal való kapcsolódásáért (6-36. ábra). Érdekes, hogy az oldható kollagén é fibronektin heparin jelenlétében vizes fázisban oldhatatlan hármas komplcxet hoz létre, amelyben a ko llagén és a heparin komponens a tibronektincn keresztül kapcsolódik, az extracelluláris mátrix jellegzetes szerkezetét illusztrálva. A fibronektinnek két fő formája ismert, az egyik a sejtfelszíni fibronektin (az előbbiekben tárgyalt szerkezet) és a vérplazmában található plazmaflbronektin, amelyben az ötödik szerkezeti egység, a sejthez nagy affi nitást mutató rész hiányzik. A plazmafibronektinben hiányzó részre jell emző egy Arg-Giy-Asp-Ser szekvencia, amely valószí nűl eg felelős a sejtekkel történő kölcsönhatásért (6-36. ábra). A fibronektinek a l egkü l önbözőbb biológiai folyamatokban játszanak szerepet, mint például a sejtek kapcsolatai a kötőszöveli mátrixszal (sejtfelszíni fibronektin) vagy a véralvadási rendszerrel (plazmafibronektin). A sejtfelszíni fibronektin kapcsalódásai elsősorban aszövetek újra modellezésében, a sebgyógyulásban, az embriogenezisben, a sejtmigrációban és a tumormetasztázi képződésében játszanak szerepet. A laminin is, hasonlóan a fibronektinhez az extracelluláris mátrix adhezív g likoproteinje. Nagy molekulatömegű (- l OOO kOa), három láncból felépülő fehérje, amely kereszt alakú formát alkot. Szintén több és különböző funkciót ellátó domén található benne. Egyik fontos szerepe az epithelialis sejtek kötőszövettel történő kapcsolatának biztosítása. Ktilönösen nagy affínitást mutat a bazál is membránokban található TV-típusú kollagénhez.

Proteoglikánok

fibrin kollagén

heparin fibrin

6-36. ábra. A fibronektin sematikus szerkezete. A különböző funkciókért felelős doméneket számokjelzik (1-7). Amíg a a sejtfelsz/ni fibronektin hét doménből épül fel, plazmafibronektin csak hatból (az 5-ös domén hiányzik). (A doméneknél jelöltük, hogy me/y fehérjékkel vagy struktúrákkal történő kölcsönhatásért felelősek)

A kötőszövetek egy másik jellegzetes szerkezeti egységét a proteoglikánok alkotják. Lényegében polianionok (95% a poliszacharid- és 5% a fehérjetattalmuk), amelyek nagy mennyiségü vizet és kationt képesek megkötni. A po liszacharidláncot, fő l eg glukózamin, galaktózamin, vaJamint ezek N-aceti l és szulfát származékai, il letve iduronsav és glukuronsav al-

z

A KÖTŐSZÖVET ÉS A HÁM STR J
>»»»»»>>»>>>>>>»>>»»>>»>>»»>m>>m >>>>m>>>>» >>»m» >»>>>» »>»> >>"»>> >>>»>» » »,>

0 - "'

(p 1-4) H

(Pl -3)

CHPH ,+------0

O- · ..

H

(Pl-4)

H

... - o (~l-4)

OH

H

N-acetíl~galaktózamín-szulfát

glukuronát

kondroítin-szulfál

(-20- 60 diszacharidegység) CHpH

CH2 0so; ,+------0 H

H

... o !Pl-3)

H

o

o

(Pl-4)

!Pl-3)

OH

H

NH l C=O l CH3

galaktóz

N-acetíl-glukózamín-szulfát keratán-szulfát

""' ...

577

6-37. ábra. A glukózaminoglikánokban e l őforduló néhány jellegzetes diszacharidegység, amelyek is métlődve építik fel a lineáris polimert. Az anion karakterű csoportokat piros szinnel tüntettük fel

578

SZ ERVE K , Z E RVR ENDSZER EK l\1. KÖDÉSÉ NEK BIOKÉM JA J ALAPJA l

kotják. A glukóza minogli kánok szerkeze tére jellemző, hogy szabályo san ismétl ődő diszacha ridegysé geket tartalma znak (6-37. ábra). A karboxi icsoport ok mellett az N- és 0-szulf át-csoportok negatív töltéssc eredményezi a proteogli kánok polianio n karakter éL A legisme rtebb glukóza minoglikánok: heparin, heparán -szulfát, kondroi tin-6- zu lfát, kondroitin-4-szulfá t, keratán-szu lfát, dermatá n-szulfá t és hia luronsav. A glukóza minoglikánok közül csak a hialuron át nem tartalmaz sz u l fátcsopo rtoka t. A proteogl ikánokb an a poli zacharidláncok kovalcnscn kapcsoló dnak a fchérjékhez. Rendkív üli mértékb en h idratált gél szerű struktúrát a lakítana k ki. Ez az "alapan yag" teremt l ehetőséget kis és nagy moleku lák diffúzió jára és a kü l ö nböző scjtféleségek vándorl á ára. A kollagén és az elasztik us rostok a mátrix organizá ciój át, illetve stabilitá sát é flexibil itásár biztosítj ák. A kül önböző g lukózaminoglikánok és fehérjék nagyon színcs, változato kombin ációkat bozhatn ak létre, így amellett , hogy az extracelluláris mátrix "alapanyagát" képelik, a l egkü l önbözőbb szerkeze tek, rnint pl. a csigolyák közölti discusok , ízü letek, érfa lak kia lakulásáho z is hozzájár u lnak. A kötőszöveti szerkezet kia lakítása mellett funkc ionál is szerepet is játszhat nak. Pl. a heparin rendkív ül hatásos véralvadásgá tló molekula (lásd 6.5. fejezet), míg a hialuron átról ismert, hogy sebek mellett halmozódik fel és ott nagy vízkötő kapacitá sa miatt ccdemá t okoz. A külö nböző szövetek ben található

proteog likánok pontos szerkeze te és funk ciója azonban még nem ismert. Az eddig bemutat ott kötőszöveti elemeke n kívü l szárnos egyéb fehérjét is ismerünk, azonban szerepük a különböző biológia i folyama tokban és a pato lógiás elváltoz ásokban j elenleg még nem tisztázot t, ezért részlete sebben nem tárgyalj uk ezeket.

A mindenn api életben nagyon gyakran találkozik az orvos a kötőszöveti rendszer t ért károsodás okkaL Az előzőekben ismertet ett defektusokon kívül számos jellegze tes kórképe t ismerünk. Ilyenek pl. a myos itis interstit ialis (izomrostok közötti kötőszöveti károsod ások), a vasculit isek (az erek kötőszöveti struktúráj ában bekövet kezett változás ok), és a különböző szet-vek kötőszöveti elemein ek kóros felszapo rodása (pl. májciiThos is). Ízületi kötőszöveti károsod ások jönnek létre rheumat oid arthritisben, osteoart hrosisba n, Bechter ew-kórb an. ischias- szindróm ában, köszvényben vagy hacmop hiliában is. A kötőszövet patológiás folyamata i legtöbb esetben másodla gosak, a háttérben gyakran immuno lógiai és/vagy gyulladásos reakciók húzódna k meg. Nagy álta lánosság ban elmondh ató, hogy a kötőszöveti betegség ek biokémi ai mechan izmusa ma még nem ismert.

A fej ezet megír ásával kapcsola tban tett javaslato kért és kritikai észrevéte lekért a sze rző köszönetet mond Dr. Csermely Péternek , Dr. Kolev Kraszim irnak, Dr. Krajcsi Péternek , Dr. Lér á nt Istvánna k és Dr. Vodnyán szky Lajosnak .

Aj á nlott iroda lom Molecula r Cell Biology, Eds., J. Dame!l. H. Lod ish, D. Balt imora, W. H. Frecman and Company , New York, 1990 Molccula r Biology of the Cell, Eds., B. A lberts, D. Bray, J. Lewis. M. RafC K. Roberts. J. D. Watson, Garland Publishin g, Inc .. Ne\\ York London, 1994 -

'

Lokális hormonok egyes szervek működését befolyásoló hatása. Az eikozanoidok

.4.

Mandl József

Az egye szervek működésének kialakításában, szabályozásában a sejt közötti kapcsolatokban rendkívül fontos a lokális mediátorok szcrcpe. Számos, kü lönböző molekula, biogén amin (pl. hisztamin, szcrotonin), peptid (pl. bradikinin), fehérjék (pl. citokinek) rendelkezik ilyen hatássa l. Közülük ebben a fejezetben csak az eikozanoidokkal foglalkozunk. Az eikozanoidok 20 szénatomot tartalmazó többszörösen telítetlen zsírsavak oxidált származékai; magukban foglalják a prosztano idokat és azok származéka it (prosztaglandinok, tromboxánok, prosztaciklin) és a leukotriéneknek nevezett vegyület családot. A három leggyakoribb prckurzoruk az cikozatriénsav, eikozatetraénsav (triviális nevén arachidonsav) és az eikozapentaénsav. Közülük a legfontosabb az arachidonsav- ebben a fejezetben csak az arachidonsav származékaiva l foglalkozunk. Az eikozanoidok - mint különböző hatásokra tennelődö biológiailag igen aktív molekulák szintézise univerzális mechanizmus. Szintc az összes emlős ejt tartalmazza azokat az enzimcket, amelyek szüksége ek az eikozanoidok képződésé­ hez. Egyetlen ejttípu azonban általában nem képes valamennyi eikozanoidszármazék szintézisére: különböző típusú ejtek különböző eikozanoidszármazékokat termelnek, eltérő mcnnyiségben. Minden sej ttípus eikozanoid-"protilja" je llem ző a sejt biológiai funkciójára. Prosztanoidszintézisrc szinte valamennyi emlős sejt képes, a leukotriének szintézisére képes ejtek száma jóval

kevesebb. Számos sejt tud azonban mind prosztanoidokat, mind leukotriéneket termelni. A prosztaglandinokat 1930-ban fedc;ték fel ondóváladékban. Simaizom-preparátumok összchú7ódását okozták és csökkentették az artériás vémyomást. Az 1950-es évek végén és az 1960-as években különböző prosztaglandinszárma7ékokat azonosítottak, illetve kimutatták, hogy többszörösen telítetlen zsírsavakból szárma;nak. A rendkí-

vül intenziv kutatások a7 1970-es években vezettek el a tromboxánok, majd a prosztaciklin fclfedc;éséhez. A kutatáok nyomán a pro ztanoidok hatásaival kapcsolatos ismerctanyag annyira kibővül!, hogy nehé7 olyan szcnet, illetve funkciót találni, amelyet pro ztanoidszánna7ékok közvetlenül vagy közvetve ne befolyá ol nának. 1977-bcn ismerték fel, hogy az arachidonsa' szcrepct játszhat az SRS (slow rcacting substancc) bioszintézi ében is. SRS-nck egy simaizom-preparátumok jellegzetcsen lassú kontrakcióját okozó anyagot neveztek el még 1938-ban. llasonló hatá!>ú anyag termelődését antigén stimulussal is ki lehetett váltani s ezt a nem immunológiai ingerre keletkező SRS-töl mcgkülönböztetcndő SRS-A-nak (slow rcacting substanec ofanaphylaxis) nevezték. Intenzív kutatások után 1979-bcn egy új, oxidált arachidon avszám1azékot sikerült azono ítani. Az új vegyületcsaládot leukotriéneknek nevezték cl; zcrkezete különbözött a korábban megismertektőL Az SRS-A leukotriének keverékének bizonyult.

Prosztanoidok Az arachidonsav metabolizmusa. Arachidonsavellátás. Foszfolipáz A2

Az ar-achidonsav a szcrvezctbcn linolsavból és l ino l énsavből szintetizálódik. Emlő ejtekben az

580

))))))o))))

n H >~ H n ~HHU> >> >>))>>>)>)l))))))))) •> ))))))))H))

SZER\ "RK, SZER\'RE".:OSZERFK \1 CKÖOÉSÉ:"'IEK BIOKÉJ\IIAI ALAPJA l

arachidonsav a többi, több zörösen te lítetlen zsírsavhoz ha onlóan - szinte kizárólag a glicerofosz folipidek 2-acil pozíciójában észterifikálva fordul elő. A spontán fel szabaduló a rachidonsav szinte azonna l reé zterifikálódik. Az arachidonsav szabaddá válását az e ikozanoidszintéz is sebességmeghatározó lépésének tekintik. A szabad-arachidonsav-kancentrác ió a citoszolban rendkívül a lacsony. Stimulá lt sejtekben az arachidon av két úton válik a fosz fo li pidekből szabaddá (6-38. ábra). A legfonto abb út az, amikor a foszfolipáz A 2 (PLA2} izoenzimek hatására hidrolíz issci szabadul fel foszfolipidekbő L A nagy mol ckulatömegű PLA2 izoenzim specifikus, csak a7 arachidonsavat tartalmazó foszfolipidek hidrolízisét katalizálja . Emelkedett intracelluláris Ca2 -konccntráció esetén arachidon avat szabadít fel a 2-acil pozíc ióbóL A Ca 2--konccntráció-emelkedé a PLA2 plazmamembránhoz történő transzlokációj ához szükséges, hasonlóan a protein-kináz C tran. z lokác iójához.

Az újabb ismeretek stcrint a speci lik us P LA2 izoenzim akuválása G- fehérjén kcresztiiltörténik. Ezt a PLA: izoenzimet a MAP-kináz (lásd 407. o ldal) foszforilálja. Ennek révén ez aL ak ti\'álási út összefügg több más jelátviteli fo lyamattal.

rcccptorfuggő

Az arachidonsav szabaddá válá át más kis molekulatömegü PLA2 izoenzimek is katalizálják, amelyek azonban nem pccifikusak az arachidonsavra. A gyu lladásokban szercpet játszó mediátorok például ezeknek az izoenzimeknek az expresszióját erkcntik, il letve a gyulladásgátló gl ukokortikoidok ezt gátolják. Az arachidon av felszabadulás másik útjához két enzim, a foszfolipáz C (PLC) és a diacil-glicerol( DAG-) lipáz aktivitása szükséges. A PLC hatására keletkezett diacil-glicerol lehet a DAG-lipáz szub ztrátja é belőle szabadul fel arachidonsav. Ez az út kevésbé általános mechaniz mu , cl ősor­ ban tromboc itákba n fontos. A keletkezett arachidonsav (i) kikerülhet a sejtbő l , (ii) észtcrifikálódhat CoA-val é a keletkezett arachidono ii-CoA beépül a fo z folipidekbe, (iii)

o

~

o CH 2 - O - C - R1 ~ l AA - C - 0 - CH l

CH 2 - o -®-{alkohol) -

~

PLC

A -lipáz

lizofoszfolipid AA

monoacilglicerol

6-38. ábra. Az arachidonsav felszabadulása foszfolipidekbőL Rövidítések: R, zsírsav szénhirogénlánca; G,, G2. G-fehérjék;

PLC, foszfolipáz C; PLA2 , foszfolipáz A 2; DAG, diacil-glicerol;

o

AA

c-~' , arachidonsav

LOKÁLIS flO R 10 OK - F.l KOZANOIOOK

arachidonsav

lipoxigenáz-út

citokróm P450 epoxigenáz- út

• prosztanoidok (PG) tromboxánok (TX)

hidroperoxieikozatetraénsavak (HPETE) hidroxieikozatetraénsavak (HETE) leukotriének (LT)

epoxieikozatetraénsavak (EET) lipoxinok

6·39. ábra. Az arachidonsav oxi dációja a sejtekben

oxidálódhat. Az arachidonsav háromféle úton oxidálódik a sejtekben (6-39. ábra).

0 A ciklooxigenáz álta l katalizált reakciót

követő

folyamatokban prosztaglandinok és tromboxánok képzödnek 6 A lipoxigenázok katalizálják a leukotriének, hidroperox i- és hidroxieikozatetraénsavak (HETE) képzödését. C> Citokróm- P450 izoenzimek az epoxic ikozatetraénsavak (EET) képzödését segítik el ő (epoxigenáz-út). Ezzel az úttal részletesen nem fog lalkozunk. A fentiekben felsoroltako n kívül az arachidonsav nem enz imatikus úton is oxidálódhat; külö nbözö llidroperoxiszánnazékok ke letkezhetnek autoox idációvaL

A " cik/ooxigenáz"-út. Prosztanoid- és tromboxánszintézis A prosztano id-és tromboxán z in tézisben membránkötött enzime k vesznek részt. A szintézis első­ sorban az endo plazmás retikulumban fo ly ik, de a plazma membrán és a magmembrán is tartalmazza a szük éges enz imeket A sz intézis el ső lépésében diox igená lással az arachidonsavba két molekula oxigén épül be (6-40. ábra). A reakc iói a ciklooxigenáz enzi m katalizálja : kialakul a c iklopentán

gyuru és prosztaglandin endo peroxid, PGG 2 ke letkezik. A PGG 2 J 5-hidroperoxi-csopo lija redukálódik 15-hidrox il -csopo rttá a prosztaglandinhidro- peroxidáz hatására és egy másik prosztaglandin-endoperoxid, a PGH2 keletkezik. A két egymáshoz szarosan asszoc iált enzimet együttesen prosztaglandin-endoperoxid-szintetáznak nevezik. A cik loox igenáz aktivitását számos nem sztero id típusú gyulladáscsökkentő gyógyszer (indometac in, sza licilá tok stb.) gátolja. Az acetil-szalici lsav (aszp irin) pé ldául az enzim kovalens modifikációját (Ser-acetiláció) okozza. Ezért a gyulladáscsökkentő gyógyszerek á ltalába n gátolják a prosztagla ndin- és tromboxánszintézist. PGH 2 -ből különbözö reakció utakon prosztaglandinok, prosztaciklin és tromboxán keletkezik. PG H 2-böl a 9- 11-endoperoxi-híd hidralitikus hasítása illetve oxidoredukc ió eredményeképpen a következő három, tenn é zetben előfo rdul ó pr·osztaglandinszármazék keletkezhet (6-40. ábra): PG D2, PGE2, PGF2u A PGD2 szintézisét a PGH- PGD-izomeráz katalizálja. A PG E2 szintézise z intén izomerizáció, az enz im működéséh ez g lutation szükséges. PGF 2u szintézise több úton : PGE 2-böl, PGD2 -ből , illetve PG Hrből történhet redukcióva L A prosztaciklin (PGJ 2) és a h·omboxán A 2 (TXA2) biciklusos m olekula; intram olekulári ox idoredukció útján képződ11ck. A P G l r zintézist a prosztacildin-szintetáz, a T XA2 szintézisét a tromboxán-szintetáz katalizálja, mindkettö ci to-

VI

QO

N

::: ~ ~

~

1.COOH

~

~

::: ~

20

PGI2 (prosztaciklin)

17

l

~ ~ ~

19

~ ~

arachidonsav

202~

~ ~

l ~

ciklooxigenáz

~ ~

~ :::

TXA2

a_,-"

-

(tromboxin ~)

l

COOH

OH

14

~ 15

-'' /

-

~

N

t'l'l ~

< t'l'l ?'

COOH

~

13

t'l'l

OOH

PGE2

PGG2

'

OH

l

~

OH

prosztaglandinhidroperoxidáz

Q~ -"/

-

z o

Vl

N

t'l'l

COOH

•

3: ;:-::

OH

..<:>G~t­

~o~ ',(:>Go,

OH PG H2

_-· "

&r~<

~

;:-:: C•

._...

/?

~

< ~

y

o o

7

bH

_

~

PGF2a COOH

~

t"l-

z

l"l ~

:: o

@ .

o

3:

l

o

OH

PGD2

s::

> r >

." c...

6-40. ábra. Prosztaglandinok és tromboxán A 2 szintézise

,.

>

ll

583

LOKÁLIS HORMONOK - EIKOZANOIDOK

Katabolizmusuk a vérben, illetve szövctekben történhet, a lebontás kitüntetetten fo ntos helyei a tüdő, vese és a máj. A különbözö típu ú sejtek a szecemált prosztaglandinoka t felveszik és két lépésben inaktiválják. Először a valamennyi PGszármazék aktivitásához nélkülözhetetlen 15Catomon elhelyezkedő OH-csoport oxidálódik ketocsoporttá a 15-hidroxi-prosz taglandin-dehidrogenáz (PGDH) hatására. A PGDH a citoszolban található, mind NAD~ , mind NADP' koenzimmel működ ö formái isme rete ek. A második lépésben a 13 és l4C-atom közötti kettős köté redukálódik, s ezzel a biológiai aktivitás e lvész. A prosztaciklin hidrolízissei 6-keto-PGF 1u-vá alakul, a TXA2 szintén spontán TXBrvé (6-4 1.

króm P450 típusú enzim; heteroatomot tartalmazó gyűrüs szerkezet alakul ki. Prosztaglandi nok (PG) és tromboxánok nómenkJatúrája azon alapul, hogy valamennyi szánnazék prosztánsav ciklopentángyürüt tartalmazó 20 C-atomos monokarbonsav szánnazéknak (prosztanoid) tekinthető. A PG rövidítés utáni betü (PGE, PGF stb.) azt jelzi, hogy a cik lopentá ngyűrű 9, • illetve l l C-atomján milyen oxigéntartalmú funkciós csoport helyezkedik cl. A kü lönböző tromboxánokat (TX) szintén különi>özö betűkkel jelzik (TXA, TXB). A prosztanoidok az oxigén tartalmú funkciós csoportokon kívül kettős köté ·eket is tartalmaznak. A kettős kötések száma a prekurzor többszörösen telítetlen zsírsavtól függ. Az arachidonsav-származékok két kettős kötést tartalmaznak - amit alsó indexbe tett számmal jelölnek (PGE2, POh, TXA 2} - a 13 és az 5Catomnál. Az eikozatriénsavból szánnazó pros7tanoidok egy kettő kötést tartalmaznak (PGE 1) a 13, az eikozapentaénavból szánna7ók három kettős kötést tartalmaznak a 13,5,17C-atomnál. A 13C-atomnál a kettős kötés jelenléte, valamint egy hidrexile oport a 15C-atomon karakterisztikus valamennyi prosztanoidra függetlenül attól, hogy melyik zsírsavból szánnazik. A 9C-atomon hidroxilcsoportot tartalmazó szánnazékok esetében a c oportnak a karboxil oldallánchoz viszonyított helyzetét a7 indexben feltüntetett görög betűvel jelzik (PGF2a).

ábra).

leukotriének A leukotriéneket e l őször leukocitá kba n mutatták ki : e lnevezésük is innen származik, valamint o nnan, hogy minden leukotriénben van konjugált tri én struktúra, ami karakterisztikus UV -abszorpciós spektrumot ad. Szemben a prosztanoidokka l és tromboxánokkal, a leukotriének nem ciklusos 20 szénatomos monokarbonsavak ; a három konj ugált kettős kötésen kívül egy vagy két oxigént tartalmazó szubsztituenst is tartalmaznak. Különbözö típusú sejtek, különösen az immunrendszer sej tjei,

A prosztanaid és a tromboxán katabo/izmusa A különbözö oxidált arachidonsavszárm azékok általában igen rövid időn belül inaktiválódnak. Termelödé ük után rendszerint szecernáló dnak .

641. ábra. A 6-keto-PGF1,, és a TXB2 képlete

Ol-l ''

HO

OH

6-keto-PGF,u

584

))))n))))))))))))))t)H))))))))))))))))H)))))))))))))))U)))))

"ZEIH'EK,. ZF.RVREND ZEREK 'l .. KÖD~:. É EK BIOKÉMIAI ALAPJAl

különbözö mcnnyi égben képe ek kü lönbözö leukotriének termelé ére. Elsősorban makrofágokban, monocitákban, neutrofil és eozinoíil sejtekben, valamint hízósejtekben szintetizálódnak, de termelésükre képesek más sejtek is. A ki.ilönbötő leukotriénszánna7ékokat u L T rövidítés utáni betŰ\ eljeLlik (pl. L TA), a molekulában található kett ös kötések s7ámát az alsó indexbe tett szám mutatja (pl. LT 84).

A lipoxigenáz-út. Leukotriének szintézise és lebontása A leukotriének szintézi éhez is a fo zfol ipáz A2 aktiválása szükséges. Ez a lépés megegyez ik a prosztanoidok szintézisénck e l ső lépésével. Különbség a prosztanoidszintézissel szemben, hogy a leukotriénszintézist kivá ltó stimul us mindjárt a reakciósorozat második lépését katalizáló lipo xigenáz aktivátását is jelenti. A tipoxigenázok vastartalmú fehérjék, amelyek azonban nem tartalmaznak hemet. Egy oxigénmolekula beépü lését kata lizá lják az arachidonsav meghatározott zénatomján (5, 12 vagy 15C-atomon). A leukotriének szintézise szempontjából az 5-lipoxigenálás az a lapvetően jelentős út (6-42. ábra). Az 5-lipoxigen áz kalciumdepcnden enzim. Az 5-lipoxigenáz hatására 5-h idroperoxi6,8, ll , 14-cikozatetraén av (5-HPETE) keletkezik. A !2-lipoxigenáz é a 15-lipoxigená7 hatására keletkező 12-IIPETE, illetve 15-IIPETE további metabolizmusa és a képződő hidroxilálltermékek biológiai hatásainak vi.~.:sgálat a a7 eikozanoidkutatás egyik legdinamikusabban fejlődő ága.

A keletkezett 5-HPETE megfele lő hidroxisavvá redukálódhat, 5-HETE keletkezhet az alifá lánc további pontJam oxigenálódhat é égí.il dihidroxi-cikozatetTaénsavak keletkezhetnek (diH ETE). A leukotrién zi n tézis szempontjából a legfontosabb reakció azonban az, amikor instabi l epoxi-zsír av, 5-ox ido-7 ,9, l 1,14-eikozatetraénsav keletkezik. Ezt a vegyületet nevez ik leukotrién A 1nak (LTA 4 ) , mert már tartalmazza a leukotriénekre je ll emző konj ugált kettős kötéses szcrkezetet. Az L T A 4 mi nd a leukotrién B4- (LTB4 ) , mind a leukotrién c-~(LTC4) szmteZJS közös intenncdierjc. Az LT~ ~ LT 8 4 , illetve az LTA4

~

L TC4 átalakulá sebe sége meghatározó a leukotriének bios7intézi ében, S7emben a prosztanoidszintézissel. ahol az arachidonsavat oxidáló ciklooxigenáz a sebességmeghatározó lépés. L T A 4-böl (i) víz belépésével egy epoxid-hidroláz segítségével LTl34 kcletkc7ik, ami kalciumdependens folyamat. A g!utationnal történő kapcsolódás (i i) - amelyet a biotranszformációban is jelentős szercpet játszó glutation-S-transzferáz katalizál - útján peptidillipid konjugátum az L TC4 jön létre. LTC4 -böl a glutaminsav (y-glutamil-transzpeptidáz), illetve a glicin (dipcptidáz) leha adásával, a glutaminsav visszalépésével további leukotrién zármazékok (LTD4 • L TE4 , LTF4 ) képzödhetnck. A peptidleukotrién-származék biológiai aktivitása szempontjából alapvető, hogy a peptid az arachidonavszá rmazék 6C-atomján helyezkedjen el, illetve, hogy a konjugált trién szerke7ct megmaradjon. A leukotrién-bioszintéz is fontos sajátossága, hogy enzimei a pro ztanoidszintézis enzi me itől cltéröen csak részben mcmbn1nhoz kötött, vagy az aktiváládá során mcmbránho7 transzlokálódó fehérjék. Az 5-lipoxigenáz az aktiválódás orán transzlokálódik a mcmbránhoz, a glutation-Stranszferáz, a y-glutamil-trans7peptidáz é a dipeptidáz membránkötött enzimek. A sejtek a különböző leukotriénszárma?ékokat 7eccmálják. A leukotriének katabolizmu a igen gyors folyamat. Lebontásuk intracellulárisan történik. Az LT84 sejttípusonként vá ltozó módon oxidálódik. A peptidolipid- zármazékok gyor an eliminálódnak a vérből , speciescnként vá lto7ó mértékbcn a máj vagy a vese veszi fel ő ket. A májból az epén keresztül ürülnek. Az cpébe el ösorban N-acetilLTE4 fonnájában. dc átalakulás nélkül is szecemálódhatnak. Az N-acetilálódás jelentős inaktiválódás! credményc7. A vesébe kerülö leukotriének főleg LTE4 formájában kerülnek kiválasztásra a vizelette L A katabolizmusban má konjugáció utak is lehet. ége ek.

Eikozanoidok biológiai hatásai A z eikozanoidokkal kapcsolato. kutatások a7 elmúlt évtizedekben óriá. i lépésekkel haladtak e l őre, az ezzel ös ze függö ismeretanyag rohamosan gyarapodott, számo fi 7iológiai és patológiai folya-

LOKÁLl l-lOR IO~OK - EIKOZA OIDOK

COOH

ro,

arachidonsav

H

OOH ,.- COOH

~ diHETE· származékok

5-HETE

5-HPETE

l COOH

H OH

l

H

glutation

OH COOH

Gly

Glu H OH

cooHL

l

-

COOH

l

NHCO(CH2b - CH -

l

6-42. ábra. Leukotriének szintézise

_l_.

LTE,

r G lu

H S - CH2 CHCONHCH2

LTD,

COOH

LTF,

586

)))))>)) )))))) )) )) )) )))))) )))) )))))) )))))) )) )))))))) >)))))))))))

ZERVEK, SZERVR ENDSZERE K ;\l " KÖDÉ ÉNEK BIOKÉMIA I ALAPJAl

matban (pl. hemosztá zis, hypothala mo-hypo physealis rendszer funkciói, szülés, gyulladás ) ismeJt a szcrepük és jelentőségük. A számos eikozano idszárrnazé k biológiai hatása szervrő l szervre változhat és rendkivül eltérő lehet a kü l önböző é lő­ lényekbe n. Ezért, illetve mindezek ellenérc átfogó szemtélet az eikozano idok bio lógiai jelentőségérő l még nem alaku lt ki. Rendkívü l széles a köre azoknak a stimulusoknak, melyek arachidon savfelsza badu lást, prosztano id- és/vagy tromboxá nszintézi st provokálhatnak. Számos hormon, neurotran szmitter, nö-

r

vekedési faktor, citokin, enzim, immunko mplexek váltanak ki meghatár ozott sejteken receptord ependens arachidon savfelsza badulá t foszfolipi dekből (pl. angiotenz in TI , adrenalin, szerotoni n, glutamát, interferon ok, trombin), illetve több neurotran szmitter az intracellu láris Ca2 ' -szint emelésév el közvetve timutál arachidon savfelszabadulá st (pl. dopamin, adenozin , noradrena lin). Más eikozano idok szintén kiválthatj ák termelésü ket Peptid-le ukotriéne k például a bronchus okban TXA 2 szintézist indukálna k patológiá s körülmények között (pl. asthma bronchial e). Számos

6-6. táblázat. Az eikozano idok jelentöse bb biológiai hatása Szi gnál transz· d ukclós rendszer

r PG~ l Gs---. cAMP i

~~2! ~MP J.

l

l Gq ---. Pl t

[ PGF2u

-~- T~omboc~ta -

l

l

pro aggr:. gáns

l+

L

·

antiaggregáns

l--

Érfal -.

vazokonstrlkció

l L +

l

l

l

Simaizom

-

l

vazo· dllatá· cló

~-+l

---+l

kontrakc ió

t--

uterus corpus

~

uterus cervix

l TXA, LTB,

~~.f"d

l

l

_j

G, 4 Pl t

G, 4 Pl t-

l

l

l

l

l

- idegrendszeri hatások: láz, katecholamin-felszabadulás szabályozása, .ébrenlét"

+-- idegrendszen

-l

l

-~- L -L-~-l j l l ~ ~- ~~

. bronchus

-gyulladás I _G-1

l

l

- luteolitikus hatás - központi idegrendszeri hatások - veseműködés

l

l

relaxáció

- Gl Cirkuláris

1

l Gs---. cAMP i

Egyéb

- ut:-us cervi:-1 - gyomorsav-szekréciógátlás

Gl longitudinális

l

l

Gs~cAMP i r l

t

~

Gl bronchus

l

r PGD2

-

- veseműködés - tumornövekedés - gyomorsavszekréció-gátlás - .citoprotektlv" hatások - központi idegrendszeri hatások

l

b
+-

- bronchus

l

hatások: höcsökkentés, alvás, neurondifferenciálódás, szinaptogenezís

l

- vesemüködés - májregeneráció -gyulladás - immunválasz - negalfv inotrop hatás, pitvari K•-csatorna-nyitás -gyulladás

Rövidítések: Gl, gastrointes tinalis traktus; Gs. G ,. Gq, G-fehérjék ; Pl, foszfatidilin ozitol-meta bolizmus

LOIÜLI HOR:vtO~OK - EIKOZA!'IOIDOK

>>>m>>mm»»>>>»>m> >>>>»>»>>>»»»>>» mm>»>>>»>»>» >m»>»»>>>>>» >m>>>>>>>m>>m>>>>m>>>~>>

membránkárosító hatá · vagy ischaemia több szervben és szövetben eikozanoidszintézist indukál. Így a vérkeringé i zavarokkal járó állapotokban közvetve az e ikozano idok képződése fontos tényezője lehet kóros folyamatoknak. Leukotriénszintézist leggyakrabban az alábbi anyagok indukálhatnak: kemotaktiku peptidek, .így az f-Met-Leu-Phc, PAF, IgE választ kiváltó antigének, az egyik komplement komponens (C5a), bakteriáJi endotox inok, fagocitozist kiváltó anyagok, más eikozanoidszánnazékok (pl. 12 H PETE). Az eikozanoidok stimulus nélkül igen kis mennyiségben termelődnek. Stimulus hatására 10-30 s belül hirtelen, akár a nyugalmi szint 50szeresére is fokozódik a szintézisük. Képződésük után nem raktározódnak, ha nem intracelluláris mediátorként, illetve szecernálódva a sej tekből receptorokon keresztül lokális mediátorokként hatnak. Van autokrin funkciójuk, de hatásukat más sejteken is kifejthetik. Lebontásuk, illetve inaktiválódásuk azonban igen gyors folyamat (a tromboxán A 2 féléletideje például vizes oldatban 37 °C-on mindössze 30 s), tehát az eikozanoidoknak inkább lokáJi , mintsem általános, az egész s7ervezetrc kiterjedő hatá aik vannak. Hatá aik rendkívül különbözőek és sokszor egymással ellentéte ek (6-6. táblá=al}, a különböző e ikozanoidszármazékok gyakran egymás antagonistái.

Eikozanoidreceptorok. Eikozanoidok és szigná/ transzdukciós rendszerek Az eikozanoidok plazmafelületi receptorokhoz kötődve fej tik ki hatása ikat. A különböző tennészetc prosztanoidszármazékokna k igen specifikus receptoraik (sőt receptor altípusaik) vannak. A receptorok különböző G-fehérjékkel, illetve szignál transzdukciós rendszerekkel kapcsolódnak (6-6. táblázat). Gs-, Gi-. Gq-n keresztül a receptor- PG kapcsolatok cA MP-szint-eme lkedést vagy -csök21 kenés!, intraceilu tári Ca -szint emelkedést idéznek elő a receptorok (illetve ligandjaik) típusától függöen. Mind az arachidonsav, mind az oxigenált szánnazékok ioncsatornák és enzimek aktivitását befolyá olhatják. A különböző receptoro kon, illetvc az ezekhez csatlakozó szig nál tran szdukciós utakon keresztül kiváltott bio lógia i hatások igen

587

lehetnek az élővilágban. A POD2receptorok trombocitákon és simaizomban, idegszövetben, a méh, a légutak, valamim a gastrointestinalis traktus izomzatában találhatók. A PG E2 igen okféle biológ iai hatást válthat ki ; s imaizom-kontrakciót vagy relaxációt (gastrointe tinalis, urogenitalis traktus, érfal), neurotranszmitter-felszabadulás gáttását vagy serkentését, lipolízis gátlását, gyomorsavszekréció-gátlás t, gyulladás gátlását, immunglobul in-expreszió gáttását, a vízreabszorpció gátlását, a trombocitaaggregáció serkentését okozhatja. Ennek megfelelően igen sok szervben, szövetben találhatók PGEr receptorok. A PGF2u-receptorok is több ejttípusban előfordulnak. A sejtproliferáció szabályozásában pél.dául az EG F hatás ra termel ődő PGE2, PG F2(1 hatását ismerték fel. A PGI2 elsősorban az érendotheliumban tem1e lő­ dik és receptorai a trombocitákban és az érfal simaizomsejtjeiben expresszálódnak (lá d 6.5. fejezet). POl 2-receptorok azonban más szövetekbcn is előfordulnak, így például idegszövetben, thymusban. A TXAr receptorok részben a PO l2receptorokkal ellentétes hatásokat közvetítenek, így trombocitákban és az érfa l simaizomsejtjeiben. Fontos a szerepük a légutak simaizmaiban i . LT-receptorok több szcrvben, illetve sej tben találhatók, így lépben, a gastrointestinalis traktu ban, tüdőben, agyban, neutrotil granulocitában. Az LTB4 -reccptorok a leukociták és a limfociták fe lszínén találhatók, G-proteincken keresztül számos sejtfunkciót befolyásoló hatá uk van: kemotaxis, kemokinézis, aggregáció serkentése. Mindez az LTB4 gyulladásokban betöltött szerepévcl függ össze. Lipoxigenáz mctabelitok például (szerotoninszenz itív) K+-csatornák működését szabá lyozzák neuronokban, valamint protein-kinázok aktivitására hatnak, pl. a neuroszekrécióban jelentős Ca2+- kalmodulin dependens prote in-kináz Il-t lipoxigenáz metabolitok gátolják. A z cpoxigenáz-út egyes terméke inek a Na '" ,K+-ATPáz gátló hatását ismerik vesében és a corncában. Az e ikozanoidok hatásaik j e l entős részét sejtek, illetve sejtorganellumok kontrakciójának befolyásolásán keresztül fejtik ki. A különböző cikozanoidszánnazékok fliggően a származéktól , illetve a "cé lsejttő l ", egyaránt előidéznek kontrakciót és relaxációt. PGE2 például a gastrointestinalis eltérőek

588

SZERVE K, SZE RVREN DSZERE K 1 Ű KÖD ÉSÉNEK BJOK ÉM IAI ALA PJAl

traktus longitu dináli sima izmain ak kontrak cióját, dc a cirkulá ri simaizm ok relaxác ióját váltja ki Ugyan az a szám1a zék kiválth at sejt- és ejtorgane llum-ko ntrakci ót (pl. TXA 2 bronch us simaizom kontrak cióját, illetve a trombo cita tubuláris rend zeréne k kontrak cióját okozza ). Peptidleukotr iének (LTC4 , LT D4 , LTE4 ) példáu l, szemben az LTB 4 -el e l sősorban - G-fehé rjékhcz kötött recepto raikon kereszt ül - simaizo m-kont rakc iót kiváltv a hatnak (pl. a thma bronch ialéban légutak ös zchúzó dását okozzá k). A vc cmükö dés, a reprodu kciós ciklus zabályo zásában az eikoza noidok hatása inak kutatás a vizonyla g ho zú múltra tekinth et v is za. Az elmúlt évtized ben az eikozano idok szerepe az idegrendszer müköd é ében került az érdek lődés egyik középpontjába. A PGD2, PG E 2, LTC4 , L TB4, va lamint az epoxig enáz mctaho lit EET-k szercpé t és hatásait a már e l őbb is említet t hypothalamohypoph ysealis rendsz er működésében , a PGE , 2 12-HPE TE, LTC4 funkció it a szinaptik:us transzmisszió ban i merték fel. Az eikozan oidok intercel luláris mcdiátor funkciÓl töltene k be. A hídroxi -leukot rién LTB4 különböző proszta glandin szánna zékokk al együn a gyullad ásos folyam atok fontos mediát ora. A kül önböző szervek fizioló giai müköd ésében (és az egyedfej lődésben) o ly jelentős sej t-sejt közötti

kölcsön hatások ban az cikozan oid mediát or funkció igen lényegc . Ez például a májmü ködé zabályozásá ban (Kupff er-scjte k, sinus endoth elsejtek és hepatoc iták közti kapcso latok) az érfalmü ködés, -tónus fcnntat1ásában (endoth el- simaizo msejt kapcso lat), a korább an említet t idegren dszeri hatáokban je lentős. A ej t-sejt kölcsön hatások igen ajá tos módja, amit PG H 2, illetve LT A 1 ,mint szintézi interme dierek esetébe n figyelte k meg. A timulált neutrof il granulo c iták által tem1elt LT ~-t példáu l különböző ejtek felvehe tik és különböző médok on alakíth atják tovább . Tromb ocitákb an, cndothel ejtekbe n LTC4 , vörösv értestek ben L TB 4 képződik belőle, amelye k különböző hatásúa k és a funkció juk is e ltérő a változó patológ iás állapot okban. Az eikozan oidrece ptorokk al, illetve az egye szárma zékok hatásai nak szignál transzd ukciós mechanizm usaival kapc olato kutatás ok jelenle g rendkív ül intenzí vek. A moleku láris biológi ai módsze rekkel nyert újabb ismere tanyag (recept or cONS- ek klónoz ása) - ö szhang ban a korább an kapott eredmé nyekke l - igen fontos terápiá lehető égel jelent a kőzeljővőben. Számo s betegsé g patoge neziséb en ismerté k fel az eikoza noidok szcrepé t, ezért képződésük és lebontásu k, valami nt hatásm echaniz musuk ismeret e vá ltozatla nul az érdekl ődés középp ontjába n áll.

A fejezet megírás ával kapcsol atban tett javaslat okért és kritikai észrevét elekért a szerző köszönetet mond Garzó Tamásn ak és Dr. Kardon Tamásn ak.

.5.

Hemosztázis

Machovich Ray1nund

Hemosztázis fogalma alatt az érpályának azt a képességél értj ük, amely lehetövé teszi, hogy a vér az érpályán belül megtartsa fo lyékony á llapotát és abból kikerülve elveszítse azt, ún . véralvadéka t hozva létre. A vér ezen tulajdonsága biokém ia i reakciók egyensúly i állapotának függvénye. Ezen egyensúlyi á llapotnak bármilyen irányú e ltolódása patológiás elváltozáshoz vezethet:

O a véralvadás hiányossága vagy az a lvadék fokozott oldódása vérzékenységgel j áró betegségeket (haemon·hagiás kórképeket), @ míg a fokozott alvadékképződés vagy gátolt althrombosisos betegségeket vadékoldódás (thromboemboliás kórképeket) eredményezhet.

A hemosztázis zavara képezi a cardiovascularis kórképek egyik alapját. amely napjainkban, a ,jóléti társadalmakban" a haláloki statisztikák e lső helyén áll, de szarosan kapcsolódik olyan egyéb és úlyos betegségekhez, mint például az atherosclerosis. általában a gyulladással járó kórképek, a tumormetasztázisok kialakulása. A ros~zindulatú daganatos megbetegedések több minl 90°fo-ában mutatható ki a hemosztázis zavara.

A hemosztázis fenntartásához mind molekuláris, mind pedig celluláris kompo nensek szükségesek; ezek leg főbb képv i sel ő i a véralvadási-fibrinolitikus rendszer, a vérlem ezkék (trombociták), a bepatociták, a granulocita- monocita- makro fág rendszer, valamint az endothelium.

A véralvadék képződése és feloldódása Molekuláris szinten a véralvadék létrejöttének és mcgszünésének lényege, hogy a vérplazma egy bizonyos fehérjem oleku lája, a fib rinogén oldékonysága vizes fázisban proteolíz is következtében megszünik és ún . fibrinaggregátum j ön létre. További degradációk eredményeképpen v iszont ezen gél állapot szűnik meg, mert a keletkezett fehérjerészek víza idékonyak (6-43. ábra). A folyamat e l ső fáz isához, amelyet véralvadásnak nevez ünk, egy cellulá ris esemény társul, a vérlemezkék aggregációja. Ez a komplex fo lyamat teszi lehetövé, hogy a sérülés következményeként ne vérezzen cl az ember, il l. ez az oka annak, hogy ha az érpá lyán be lül tött énik a károsodás, thrombosis j öhet létre. A fo lyamat második fázisához is, amelyet fib rino lízisnek nevezünk, társulhatnak celluláris esemé nyek; ezekben e lsősorban a granuloc ita- makrofág rendszer sej tjei vesznek részt. Normális körülmények között a fo lyam atok egymással egyensúlyban vannak (mindig keletkezik és m indig fel is oldódik va lamennyi fibrin). Mindkét folyamat molekuláris kompo nenseinek szintéziséért és lebontásáért el sősorba n a máj fe lelős, rníg a folyamatok be indításában az endothelium j átssza a döntő szerepet. A fibrinogén m eglehe tősen nagy koncentrác ióban fordul el ő a vét·keringésben. A hemosztázis kulcsenz imei (a trombin, a plazmin) zimogén (proenzim, inaktív prekurzor) formában szintetizálódnak a májban, aho nnan a vérkeringésbe kerülnek.

590

,,>>>>~.,>>n>>>>n>>n»>>>>>>n>H>>>>>>>>>>>>>>>>>»>>>>>>>>>>

ZE RVEK. SZER\'R EN DSZEREK M ~ KÖDÉSÉNEK BIOKÉMIAI ALAPJAI

fibrinogén

fibrin

fibrindegradációs termékek (FDP)

i

T

6-43. ábra. A véralvadási-fibrinolitikus rendszer legalapvetőbb reakciói. A fibrinogén~ fibrin átalakulást a trombin (7) katalizálja; a lehasadt fibrinopeptid (FP) oldatban marad, míg a fibrin egy másik, majd további fibrinmolekulákhoz kötődve vizes fázisban nem oldódó aggregátumot hoz létre. A fibrin degradációját a plazmin (P) katalizálja; a proteolitikus reakciók olyan termékeket (FDP) eredményeznek, amelyek vizes fázisban oldódnak. Mind a trombin, mind a plazmin keletkezése rendkfvül komplikált és több szinten szabályozott reakciók eredménye, amelyeket általános konvenciók szerint véralvadásnak, illetve fibrinolizisnek neveznek, amit ezen az ábrán két háromszög jelképez. A két enzim keletkezése a véralvadás és a fibrinofízis szabályozását jelenti

A véralvadás molekuláris és celluláris mechanizmusai A fibrinogén és a fibrin A fibrin keletkezése. Ha valahol trombin ke letkezik, akkor lehetőség nyílik arra, hogy a fibrinogénből 4 peptid lehasadjon; 2 fibrinopeptid A és 2 fibrinopeptid B (6-44. ábra). A fibrinogén proteolízise során már az első fibrinopcptid A hidro lízise olyan fibrinmolekulát eredményez, amelynek megváltoznak fizikokémiai tulajdonsága i, és így alka lmassá vál ik a rra, hogy egy másik hasonló molekulával aggregáturnot hozzon létre. Bizonyos kígyómérgek halására csak egyfajta fibrinopeptid eltávolítására kerül sor. A trombin, bár különböző reakciósebes égekkel, mindkét fajta fibrinopeptidet lehasítja. Azokat a fíbrinogénmolekulákat, amelyek elvesztenék öszszes fibrinopeptid A és B részüket, fibrin monomereknek is nevezzük. Az ilyen monomerek szabályos szerkezetet alkotva kötődnek egymáshoz úgy, hogy mind oldalaik, mind végük között kölcsönhatások alakulnak ki; magát a folyamatol fibrinpolimeri zációnak is szekták nevezni (ez a reakciósor nem igényel enzimes katalízist). A vízben oldhatatlan fibrin lényegében ilyen monomerek halmazát jelenti (6-45. ábra).

A fibrin további módosulásokon mehet át, ha aktivált XIIT-faktor (F-XIIJa) van j elen. Az F-XJIJa szulfhiclril-ligáz e nzim (aktív centrumát -SH csoport képezi) és az ún. transzglutaminázok enzimcsaládjába tartozik, amelyek egyik funkc iója az, hogy a fibrin szerkezetében kovalens keresztkötéseket hoz létre a gamma-láncok, illetve kisebb reakciósebességgel az a-láncok között (6-46. ábra); ezt a fázit fibrinstabilizációnak szekták nevezni.

Az F-XlJJa kli nikai jelentőségél elsősorban az adja. hogy a thrombosis késői fázisában, amikor már a fibrinben a keresztkötések kialakultak. a terápiás beavatkozások sokszor eredménytelenek (lásd a Fibrinolízis c. Fejezetet is). Az F-XHia hiánya viszont vérzékenységi problémákat okozhat, mert a sérülés helyén a fibrinháló ,.laza" marad.

A vérplazmában a X IIl-faktor elsősorban a fibrinogénhez kötött formában található. Aktiválásáért a trombin felelős; vagyis ahol trombin keletkez ik, a fibrinogén átalaku lhat fibrinné és a XJJI-faktor is aktiválódhat. Mint az edd igi ekből kitűnik, a trombin felel ős a fibrin keletkezéséért és indirekt módon annak további módosulásáért. A trombin, hasonlóan a tripszinhez, a szerin-proleázok csoportjába tartozó enzim, a peptidkötések hidrolíz isét tekintve azon-

HD-10 ZTÁZJ

6-44. ábra. A fibrinogén szerkezete. A fibrinogén elnyújtott alakú glikoprotein, amely 3 láncból épül fel (Aa-lánc B~-lánc, y-lánc). A fibrinogén szimmetrikus szerkezetű, mert két ilyen három láncú szarkezet kapcsolódik össze és végső fokon úgy írható le, mint: (An, Bp, y} 2. A · láncokat S-S hidak tartják együtt. A trombinra és néhány kfgyóméregre specifikus peptidkötés (Arg-Giy) az Aa- és Bp-láncok N-terminális végén található. A fibrinogénmaleku/át egyszerűsített ábrázolási formában is bemutatjuk az ábra jobb alsó sarkában

59 1

N

y

y

s 'Y ---,-------1---- N sl sl

s

N--~-----~---

8

c

8

T

FPA FPB

- y'h

- Slu -

- y (a )-lánc

1

CH2

CH2

CH2

CH2

l

0

l + NH3

l

CH2

l

CH2

l

l

o

'JH

F-XIIIa

\

l

l NH l

CH2 ..J

l

CH 2

l

CH2

CH2

CH 2

CH2

l

l

y (a.)-lánc - Lys -

l

l

- Lys -

_j

6-45. ábra. Fibrinpolimerizáció. Rövidítések: fibrinogén (Fg), trombin (T) és fibrinopeptid A és B (FPA és FPB)

6-46. ábra. Keresztkötések kialakulása a fibrin láncok között. Az aktivált Xl/l-faktor (F-XIIIa) egy glutamin és egy lizin oldallánc közölti savamid (,,izopeptid'J kötés kialakulását katafizá/ja

592

)))}))

..

SZE RVE K, SZERVR EN DSZE REK M " KÖDÉSÉNEK BIO KÉM IA I ALAPJA l

)))~))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

F-Xa

1

(_

protrombin N - - - -- - - - - - Arg274Gla terminális

/

Thrz7s---·,- Arg323- 1~324--.,---- c terminális

s

s

fragment 1-2 N - - - -- - - - -- - - Arg Gla terminális

Arg

Th r

s l s Ile

l

s

"-J

trombin

Ac

6-47. ábra. A trombin keletkezése protrombin ból. Rövidítések: aktiváll X-faktor (F-Xa), aktiv centrum (AC), y-karboxiglutamát (G/a)

ban nagyfokú pecifi citá sal rende lkezik; egy fehérjében egy vagy két köté né l nem hidrolizál többet. A trombin (36 kDa) két láncból épül fe l, ame lyeket S-S híd tart össze (6-47. ábra).

A trombin szabályozása A trombin menny iségének és aktivitásának szabályozá ára két leh etőség van: az egyik az enzimkeletkezés sebességének, vagyis a protrombin aktiválá ának zabá lyozása, a más ik a keletkezett trombinmolckulák inaktiválása.

A protromhiu aktiválása A protrombin szintézise során po zttranszlációs módosulás történik; több glutamátból gammakarbox ig lutaminát (Gia) keletkezik (lásd később), majd a módosul t zimogén szckretálódik a májból a vérkeringésbe. A protrombin enzimatikusan ina ktív glikoprotein , ha azonban a mo lekulában két meghatározolt peptidkötés h id ro liti kusan bomlik, trombin ke letkezik (6-47. ábra) . A két kötés h idrolízisét az aktivá lt X-faktor mellett egyes exogén enzime k (pl. kígyómérgek) is katalizá lj ák. Az egyik protealitikus lépé során a protrombin két részre ha ad; az N-terminális rész tartalmazza a

Gla-amino av olda lláncokat (fragment 1-2). A protrombinban ez a szekvencia fel el ős a különböző lipid- fehérje-Ca2+ kölcsönhatásokért (lásd később). A C-terminá lis részben (pretrombin) az aktivált X-faktor hatására bekövetkező proteolízis során olyan konformációváltozás j ön létre, amelynek eredményeként kialakul a trombin aktív centruma. A protrombin proteolízisének sebessége azonban nagyon kics i. A max imáli s reakciósebesség akkor következik be, amikor a protrombin és az aktivált X-faktor mellett aktivált V-faktor, ka lc ium és vérlemezke membránfoszfol ipidek is jelen vannak. Ezekbő l az elemekbő l épül fel a protrombináz komplex (6-48. ábra). A komplexben a fehérjekomponensek nem kovalens kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz az aktivá lt vérlemezke foszfo lipidmembrán-fe lszínén. Nemcsak a protrombin. hanem az aktivált X-faktor is G la-t tartal21 maz. A Ca a Gla-hoz kötőd ve a fehérjékben olyan konformációváltozást induká l, amely lehető­ vé teszi a foszfo lipidhez történő kötődést. Az akt ivált V-fa ktor olyan proteo- litikusan módosult vérplazmafehérje (ne m proteáz), a me ly kofaktor szerepet tölt be a reakcióban. A komplexben a molekulák konf01mációvá ltozása és orientációja következtében a protrombinaktiváció sebessége 300 000-szeresére fokozódhat.

II EMOSZT ZIS

>»>>>>m»»»>m>>>>»»>»»>>»>>»>>>m>>»>>»»»>>»m»>>>>>»»H»»m>>n»»>>»>h»>m»m»»»»»»>»»»»>»»>m»»»»>>m»m> >>H>)))>>>

593

6·48. ábra. A protrombin áz komplex. Rövidítések: aktivált X-faktor (F-Xa), aktivált V-faktor (F-Va)

,//

:

. . . ............................. .. ..... '

~tiváltJérleme~ Az aktivált X-faktor keletkezése A X-faktor két láncból fel épü lő, G la-t tartalmazó glikoprotcin, amelynek akti válása limitált proteolízissei történik. Az aktivá lás orán egyéb kofaktorok, foszfo lipidfelsz ínek és Ca 2 1 jelenlétében aktiválódási komplex ek alakul nak ki. Ezek a komplexek felfoghatók úgy is, mint az érpályában ideiglene. en képződött kompartmentek, amelyekben a proenzimek aktiválásának a sebessége több nagyságrenddel növekszik. A X-faktor aktiválódá a során keletkező komplexe ket az egyszerűbb áttekinthető ég céljából nem ábrázoljuk, de hangsúlyozzuk, hogy nélkülük a véralvadási folyamat (a trombin k épződése) nem hatékony. A komplexek rendkívül hasonlóak a protrombináz komplexhez (funkcióikat azonos mechanizmusok szerint fejtik ki), c ak a protrombint a X-faktor helyettesíti, az V-faktot1 a VJII-faktor vagy szöveti faktor (tissue-faktor), az enzimet (aktivá lt X-faktor) pedig az aktivált lX-faktor vagy az aktivált Vll-faktor. A X-faktor aktiválódását több enzim i képe katalizá lni; az endogén szcrin-proteázokat képviselö aktivált VII-fakt or és az aktivált IX-fakto r mellett kígyómérgek {pl. Russel vipera mérge, amely szintén szerin-proteáz) és egy cisztein-proteáz is, amelyet kizárólag tumorsejt ek termelnek (ezért cancer procoagu lansnak is nevezik). A X-faktor endogén aktiválásá nak két útja lehet (6-49. ábra}, aF-Vlla nemcsak a X-faktort aktivál-

Pro

t

F-Xa

~

/

F-X

F-IXa

~ F-IX

~ F-VIIa

~

___.!

@

~ F-VII

i

F-XIa

"

F-XI

F-XIIa

t

6-49. ábra. A véralvadás i zimogének aktiválódá sa. A faktor nomenklatúra a szerin-proteázokat, illetve az azoknak megfelelő zimagéneket jelenti. A vastag nyíl az átalakulást, a vékony nyíl az enzimhatás célpontját jelzi. Röviditések: T, trombin; Pro T, protrombin; F-Xa, aktivált X-faktor; F-X, X-faktor; F-VIIa, aktivált V/l-faktor; F-V/1, VII-faktor; TF, szöveti faktor; F-IXa, aktivált IX-faktor; F-IX, IX-faktor; F-XIa, aktivált Xl-faktor; F-XI, Xl-faktor; F-XIIa, aktivált X/l-faktor; F-X/1, Xli-faktor (a szöveti faktor és ,,idegen felszín" szerepét lásd később)

594

m~>»»>>»»•»>»»llm>»»»>»>llm»>IIHH>»>>>II»>

SZERVEK. SZERVREND ZEREK M " KÖD ÉSÉNE K BIOKÉMIA I ALAPJAl

ja közvetlenül, hanem a IX-faktort is, és ezután a ké pződött F-IXa hatékonyarr aktiválja a X-faktort. A keletkezett F-Xa nemcsak a protrombint képes aktiválni , hanem pozitív visszacsatolás útján a VJI-faktort is. Bármilyen úton történik is a X-faktor aktiválódása, a kérdés az, hogy miért, mikor és hol keletkezik az az e l ö enzim, amely elindítja a reakciósorozatot

A véralvadás bei11dítása és a véralvadási kaszkád A véralvadási folyamatok (6-49. ábra) l egfőbb beindítója az aktivált VII-faktor. Normál körűl­ mények között az enzim rendkívül kis menny iségaz is gyor an inaktiválódik ben képződik, endogén inh ibitora j e lenlétében (lásd késöbb). Ezenkívül az aktivált VII-faktor nem hatékony enzim, ha egy kofaktora, a szöveti faktor (tissuefactor, TF) nincs jelen. A szöveti faktor a vérrel nem érintkező sejtek felszínén állandóan jelen van és szöveti sérülés során a vén·el érintkezésbe kerülhet. Különbözö fertöző betegségekben (pl. Gram-negatív baktériumok által előidézett seps isben) bakteriális lipopoliszacharid (LPS, endotoxin), interleukin-l (J L-l) és tumornecrosis faktor (TNF) hatására a szöveti faktor megjelenhet az endothelsejt, illetve monocita fe l zínén is. A szöveti faktor megje lenése extrém módon fokozza az aktivált VII-faktor aktivitását. Tradicionálisarr ezt a folyamatot a véral vadás "extrins ic útjának" szekták nevezni . A véralvadá i fol yamatok beindításának egy más ik lehe tséges útja a X l-faktor aktiválása, aminek eredményeképpen a keletkezett aktivált XI-faktor a IX-faktort aktiválja. Ezen reakciósorozat, amelyet tradicioná lisarr a véralvadás " intrinsic útjának" neveznek (6-49. ábra), kapcsolódhat a XII fa ktor funkcióihoz. Az a tény azonban, hogy a X l faktor aktivációjának leghatékonyabb katalizátora a trombin, azt jelz i, hogy az intrinsic út inkább a véralvadási kaszkád fel erő­ sítését, mint az iniciálását szolgálja (6-49. ábra). Bárhogyan történik is a véralvadás beindítása, a következm ények egy bizonyos szempontból haon lóak; nevezetesen az e l ső enztimeakció egy másik enzimféleség képződéséhez vezet, amely ezután egy hannadik enzim keletkezését eredmé-

nyezi, és így tovább, addig amíg nagy mennyiségü trombin nem keletkez ik. A rendszer erösítő berendezésként müködik, amelyet véralvadási " kaszkádnak" neveznek. Minthogy a véralvadási enzimek (szerin-proteázok) protealitikus reakciókat katalizálnak (amelyek irreverzibilisck), szigorúan meghatározott a reakc ió iránya. A rendszer hatékonyságát fokozza , hogy: (i) poz itív vi szacsatoJások tovább növelhetik egyes enzimek keletkezésének sebes égét, és (ii) a rea kc iók komplexekben (elsősorban vérlemezke foszfolipid membránja álta l kialakított kompartmentekbe n) 5 játszódnak le, ahol a reakciók J 0 -szcres ebességnövekedést is e lérhetnek az oldatban mérhetö értékekhez képest. Így nem meglepö, hogy rendkívül rövid idő alatt nagyságrendekkel megn ő az enzimmolekulák száma, aminek eredményeként a trombin e lérheti azt a helyi koncentrációt, amely e légséges a fibrinogén megalvasztásához és a vérlemezkék aggregációjának kiváltásához (lásd később).

A XH-faktor nagy affinitással kötödik a vér számára " idegen", elsőso rban negatív töltésekkel rende lkező fel sz ínekhez~ ahol azután egy peptidkötés hidrolízise révén akti válódik. Az aktiváJási fo lyamat azonban sokkal bonyolultabb, mert egyéb komponen. ek is hozzájárulhatnak és reguláihatják a rcakciót (6-50. ábra). A Xll- faktor aktiválódhat aktivált XI-faktor vagy kallikre in hatására. Ha keletkezett aktivált XII-faktor, az képes a véralvadás beindítására; a XT-faktort és a Vll-faktort is aktivá lhatja. Mindezek mellett az aktivált XII -faktor fibrino líz ist is indukálhat, a komplement rendszeren keresztül interferálhat az immunrendszerrel, illetve a prekallikrein aktiválásával kaliikreint produkál, ami aztán szubsztráttól függően vazokonstrikciót vagy vazodi latációt válthat ki . Jelen legi ismereteink szerint úgy tünik, hogy a X II faktor aktiválódása a kallikreinrendszer rel indul be. A prekallikrein - nagy mo l eku l atömegű kinincgén komplex- az endothel felszínén lévő receptorhoz kötődve aktivál egy membránkötött proteázt, amely a prekallikre int kallikreinné alakítj a. A kallikre in ezután direkt aktiválja a Xll faktort, a kininogénből bradikinint szabadít fel (amely az endotheiből plazminogén aktivátor szekréciót vált ki) és aktiválja a prourokinázt is. Az utóbbi két reakció fibrinolízi t induká l (lásd később).

HEMOSZTÁZrS

>>H~))))>))))))l))))))))))))))))l)H>)))))))UU)>))))))>>>H»>>>H>>>>UU)>)))>l))))))))))))))))))l))Hl>>>Hll)J))))))))))l))n>)>>>>))l))l>)>)))))))ln>>H>)l)) )))));.

6-50. ábra. A Xli-faktor multifunkcionális szerepe. Rövidítések: X/l-faktor (F-X/1), aktivált X/l-faktor (F-XIIa}, Xl-faktor (F-XI), aktivált Xl-faktor (F-XIa}, IX-faktor (F-IX), preka/likrein (PK), kallikrein (K), nagy molekulatömegü kininogén (HMWK), VII-faktor (F- VII)

595

r /véralvadás~ F-IX

F-VII

\

F-XIa

F-XI

) F-XII

.,idegen felszín"

komplement rendszer

+ + immunreakciók

F-XIIa /

~ proren in . _ K

CE0

PK

+ ~ + ang1otenzin

- - - --+

(vazokonstrikció) kininogének

+ + brad1k1mn

plazminogén és plazminogénaktívátorok

\

fibrinolízis

(vazodilatáció)

A Xl i-faktor úgy látszik közponli szerepet játszik a véralvadási-fibrinoli tikus rendszer egyéb biológiai folyamatokkal történő összekapcsolásában. Pontos funkciójáról azonban keveset tudni. A többi véralvadási faktorral ellentétben. hiánya nem kapcso lódi k vérzéses rendellenességekhez.

A véralvadási faktorok hiánya vagy defektusa súlyos vérzékenységi zavarokhoz vezethet. A Vlll -faktor hiányán alapszik a haemophilia A, a IX-faktor deficiencia okozza a haemophilia B-t; mindkét betegség intraarticularis, intramuscularis és intracerebralis vérzésekre, illetve azok súlyos szövődményeire hajlamosít.

A XI-faktor hiánya hozza létre a haemophilia C klinikai tüneteit. A többi faktor hiányossága, mint pl. a fi brinogéné, a protrombiné, az V-faktoré (parahaemophilia) és a X-faktoré, bár életveszélyes vérzéseket okozhat, különösen trauma vagy mütét során, aránylag ritka.

A

trom binképződés

szabályozása; a protein C

A véralvadási kaszkád kofaktorai, az V-faktor és a VIIl-faktor fontos szerepet játszanak a véralvadás sebességének meghatározásában. Mindkét

596

SZERVEK, SZE H RENDSZERE K 1 " KÖDÉSÉNEK BIOK ÉMIAI ALAPJAl

kofaktor inaktív formában található a vérkeringé sben. Ha azonban kis mennyi égü trombin keletkezik, az képes egy-egy peptidkötés t hidrolizálni a kofakto rokban, azok kétláncúak lesznek és aktív konformác iót vesznek fe l; ez a komplexekben a reakciósebes égek extrém növekedés éhez vezet. A kofaktorok , egy következő specifikus kötés hidrolízise során, elveszíthetik aktivitásukat. Az inaktiválást egy szerin-prot eáz, az aktivált protein C katalizá lja. Az aktivált protein C az inaktív prekurzor prote in C-ből ke letkezik, és a reakció érdekessége, hogy ezt is a trombin katalizálja (6-5 J. ábra). Vagyi a trombin mind pozitív-, mind negatív visszacsatolási reakciók révén szabályozni tudja saját szintézisén ek sebességét. A protein C Ola-t tartalmazó, két láncból felépülő glikaprotei n és normál köri.il mények között állandóan jelen van a vérplazmáb an. Hatékony aktivá lá dá ához azonban a trombinon kívül egy endothel eredetű kofaktorra (trombomo dulinra) is szükség van. A trombomoduli nhoz kötődö tt trombinna k megvá ltozik szubsztráts pecificitá a; így csökken a fibrinogénne l, a Xlll-, az V-, a VIIl-faktor okkal és vérlemezké kkel szembeni hatékonysá ga, dc ezerszeresére nő a protcin C-t aktiváló potenciálja. A rend zcr érdekesség e, hogy egy enzim (a trombin), a konfonnáci ójától ftiggően , egymással ellenté tes biológiai funkciókat katalizál: lehet trombotiku s vagy antitrombo tikus is.

@ T

PC

/

\

F-Vl

F-V ..........._....

~

aPC

~ F-Va:JPS

F-VIll

~F-VIII

PS

~ F-VII ,

6-51 . ábra. Az V-faktor és a VIli-faktor aktiválódása és inaktiválódá sa. Rövidítések: trombin (T), V-faktor (F-V), VI/l-faktor (F-V/11), protein C (PC), aktivált protein C (aPC) , aktivált V-faktor (F-Va), aktivált V/ll-faktor (F-VI/Ia), inaktív kofaktorok (F-Vi és F-V/1/i), trombomodulin (TM), protein S (PS)

Amíg a protein C aktivá lása az endothe lsej tek fel zínén játszódik Ic, addig az aktivált VI IJ -faktor és V-faktor inaktivá lása az aktivá lt vérlemezke foszfolipid fel szú1én kia lakult komplexek ben történik. Az aktivált protcin C működéséhez egy kofaktor fehétje, a protein S szükséges.

A véralvadás inhibitorrendszere Azon a he lyen, ahol nagy mennyiség ü trombin keletkezik, a vér mcgalvad, ami " hasznos" a vérveszté elkerülése, a vérkeringé s fenntartása zempontjábóL Kérdés azonban, hogy mi vet véget a véralvadék növekedésének és az ér lumen e lzáródásának? Ezt a szercpet a véralvadás inhibitorrendszere tö lti be. Különböző proteáz inhibitorok találhatók a vérkeringésbe n (a vérplazmaf ehétjék több mint l 0%-át teszik ki). Ezek á ltalában nem specifikusa k egy-egy enzimre, bár szerepük egyes reakciókba n kitüntetett lehet. Hatásmechanizmusuk zcrint két csoportra oszthatók. O Az egyik mechanizm us során kovalens kötés j ön létre az enz im aktív centruma és az inhibitor között. Így müködik az antitromb in (a trombin legfőbb inhibitora), az a 1-proteáz inhibitor (a 1-antitripszi n néven is ismert; lásd 2.4. fejezetet) és a heparin kofaktor lJ (szintén e l ső orban a trombin inhibito ra). Mindhárom inhibitor a véra lvadási szcrin-prot eázok z ubsztrátjak ént fogható fel. Az enz im "szuicid", ekvimolári s komplcxct hoz létre az inhibiton al és elveszti aktiv i tását. 6 A más ik mechanizm us orán az enzim kötődik az inhibitorhoz de az enzim aktív centruma mű ­ ködőképe marad. A tér zerkezct-vá ltozás miatt azonban a nagy mo lekul atömegű szubztrátok (pl. fibrinogén) nem férnek hozzá. Így müködik az armakrog lobulin. A proteáz inhibitorok közül az antitrombin és a heparin kofaktor ll nem hatéko ny inhib itorok. Heparin (6-52. ábra) vagy heparinszerű molekulák (pl. heparán-szulfát) jelenlétébe n azonban a trombin inaktiválás sebessége nagyságren dekkel fokozódhat. A reakció érdekesség e, hogy a heparin '

B

HE)10 ZTÁZI

')t)))})UH>•>n>)H)))))))t)U)))lU))Jo)))))Jo)))))))))))U)))))))o))))))))))))))))))))))))))))))))))))>))))U)))))))))))))H))>>HH))))U)U~))))U')))))))))))))))))) )>UJ>

... .:r~~-

l:leparin

00

.:

o

.·

·~··.·o

so l 3 o

so l 3 o

CH2

CH2

.

o~--~

_-

o

597

~l

l

l

o

o NH l

o NH l

OH

so3-

O = C-CH3

a

H

lfL.fVl..n.JLr

! ~ 100 ~

50 H

l idő

heparin jelenlétében

(percek) heparin nélkül

H

b

Hi f

6·52. ábra. A heparin képlete, valamint a: hatásmechanizmusa a trombin- antitrombin reakcióban. Rövidítések: trombin (T). antitrombin (A), heparin {H), trombin-antitrombin komplex (T-A) . A reakciókinetikai ábrán a trombin antitrombin által történő inaktiválását tüntettük fel az idő függvényében . A heparin o-glukuronsav, L-iduronsav és 0-szu/fatált, illetve N-szulfatált o-glukózamin egységekből épül fel. Egy molekula átlagosan 11 kDa molekulatömeget ér el b: A hirudin reakciója trombinnaL A hirudin (Hi) fejirésze a trombin aktív centrumához (C), mfg farki része (negativ töltésű) a trombin fibrinogén! kötő oldalához (f) illeszkedik; az így kialakult komplexben (T-Hi) a trombin aktivitása megszűnik

598

SZERYE K, ZERVRE NDSZER EK M '" KöOÉSÉ NEK BIOKÉM IAI ALAPJAl

katalitik us szerepe t játszik a trombin- antitrom bin reakciób an (6-52. ábra). Az antitrom bin és a trombin is nagy affinitás sal kötödik a heparinh oz, majd azon az enzim aktív centrum a és az inhibito r között kovalen s kötés jön létre (a trombin inaktiválódik ), hasonló an, mint heparin nélkül, de heparin jelenlét ében sokkal nagyobb reakciósebes éggel. Minthogy a trombin- antitrom bin komplex affin itása a heparin hoz kicsiny, a heparin szabadd á vál ik és újra fellia ználódh at egy következő reakciób an.

és azza l komplex et képzett (6-53. ábra). Az inhibitor biológiai jelentősége va lószínűleg abban rej lik, hogy a szerveze t ezzel tud védekez ni az ellen, hogy a "szüksé gtelenül " ke letkező aktivált VII-fakt or a véralvad ás i kaszkád ot beindít a.

A trombin inaktivá lását gyorsító tulajdon ságam iatt a heparin már több évtizede az egyik leggyak rabban használt gyógysz er a thrombo emboliá s betegsé gek megelőzésében, ill etve kezelésé ben.

Aza2 -makrog lobulin a szervez et egyik legá ltalánosabb inhibito ra, szinte minden szerin-p roteáz aktivitá át gátolja, így a trombin t és a plazmin t is. J e l entősége a véralvad ási-fibri nolitiku s rendszerben még nem pontosa n ismert. A proteáz inhibito rokra, mint á ltalános elv igaz, hogy el sősorba n "szabad enzimek et" (szubsz trátjukhoz nem kötöttek et) képe ek inaktivá lni. Mit is jelent ez a véra lvadási kaszkád szempon tjából ? A trombin kivételé vel a véralvad á i proteázo k foszfolipid-Ca2 +-kofak tor komplex ekben vagy " idegen fel szín"- kofakto r komplex ekben fordulnak elő ahol hozzáfé rhetetlenek az inhibito rok számára . Mindebből az következik, hogy az eddig ismertet ett plazma proteáz inhibito rok e l sősorban a trombin inaktivá lásá n keresztül szabályozzák a véralvad ási rendszert.

A szövetif aktor reakció út inhibifora (tissue-factor patluva y inhibito r,· TFPI) Ezt az inhibito r fehérjét endothe lsejtek és tumorsejtek szintetiz álják, majd szekréci ó útján kerü l a vérkerin gésbe, ahol lipoprot einekhe z kötődve rendkívü l a lacsony koncent rációban található. A TFPI az aktivá lt VII-fakt or legfonto sabb inhibitora. Érdekes sége, hogy csak akkor képes azt inaktivá lni, ha már találkoz ott aktivált X-fakto rral

6-53. ábra. A szöveti faktor reakcióú t inhibitorá nak (TFPI) Rövidítések: aktivált X-faktor (F-Xa), aktivált V/l-faktor (F-V/Ia), inaktivált F-Xa (F-Xi), inaktivált F-V/Ia (F-V/Ii) működése.

Mint az e lőzőekből kitűnik, a trombin inaktiválása kulcssze repetjátszik a véralvad ás szabályozásáb an. Nem csoda, hogy az orvostár sadalom nagy érdeklődést tanúsít exogén eredetü egyéb termész etes és mesters éges trombin inhibitorok iránt. Több vérszívó rovar és egyéb állat tennel trombin inhibito rokat Ezek fehérjetennész etü molekulák, amelyek az emlős szervezetek ben keletkező trombin t inaktivá lni ké-

E

HEMOSZTÁZI S

pesek. Ezek közi.il orvosi szempontból a piócák által termelt hirudin látszik a legjel entősebb­ nek. A bimdin viszony lag kis molekulatömegű fehérje (-7 kDa), amely "feji" és "farki " részbő l épül fel. Az utóbbi nagy mennyiségü Glu-t és Asp-ot tartalmaz (6-52b ábra). A hirudin • nagy affinitással (Kd=7x 1o-11 M) és extrém nagy reakciósebességgel kötődik a trombinhoz és azt inaktiválja. Rendkívül nagy a hirudin specificitása is; a trombinon kívül még egyetlen egy enzimet sem találtak, amelyet a hirudin gátolna. A tetmészetes inhibitorok mellett nagyszámú (eddig több, mint százféle) szintetikus trombin inhibitort is előállítottak.

lemezkékben bekövetkező morfológiai változások pedig nagymértékben hozzájárulnak ahhoz, hogy a vérlemezkék aggregáturna maga is mechanikusan megakadályozza vagy csillapítsa a vérzé t a sérülés helyén. A vérlemezke funkciói szempontjából fontos kérdés, hogy miJyen faktorok válthatják ki aktiválódásukat A l egjel entősebbek a következők : O a kollagén , 8 a trombin (amely a vérlemezke-aggregáció egyik legerősebb ingere; már l o-8 M koncentrá-

cióban hatékony) (6-54. ábra), €l a vérlemezke-aktiváló faktor (platelet activa-

ting factor, PAF; lásd 2.3. fejezetet), amelyet a fehérvérsej tek és endothel sejtek szintetizá lnak és szekretálnak elsősorban gyulladásos fo lyamatok során, és már Jo-10 M koncentrációban vérlemezke-aggregációt vált ki.

A vérlemezkék (trombociták)

A vérlemezkék az eml ősök legkisebb rnéretű sej tes elemei, amelyek DNS-szintézisre nem képesek. Féléletidejük az emberi vérkeringésben 9- 12 nap. A vérlemezkék leglényegesebb tulajdonságai, hogy: (i) aktiválási felszínt formálnak a vét-alvadási kaszkád számára, (ii) mint kontraktilis rendszer, különbözö alakváltozásaik (adhéziós és aggregációs képességük) révén direkt hozzájárulnak a vérrög kialakitásához, (iii) mint szekréciós rendszer, nemcsak a véralvadási, hanem egyéb biológiai fo lyamatokban is szerepet játszan ak. A vérlemezkék nélkül a véralvadási folyamatok nem müködnek hatékonyan; ha a vérlemezkék funkciójában zavar áll elő, vagy számuk a normális 300 OOO tromboc ita!)..tl-rő l 50 OOO alá csökken, vérzések következhetnek be. Ha az érfal érülése helyén, a vér számára "idegen" felszín keletkezik (pl. kollagén válik szabaddá), a vérlemezkék von Willebrand-faktor (lásd később) jelenlétében hozzákötődne k (adbézió). Nagyobb sérülésesetén vagy egyéb, aktíválást beindító komponensek megjelenésekor a vérl emezkék egymáshoz is kapcsolódhatnak (aggregáció); az utóbbi Ca2 ' -t és fibrinogént igényel. M indkét folyamat során a vérlemezkék aktiválódhatnak, ami a már említett véralvadási kaszkádot fe lgyorsító foszfo lipidfelszín kialakításához vezet, illetve szekréciós folyamatok beindulását eredményezi. A vér-

a

b

T

~~l foszfolipáz-C ~ aktiválódás J

6-54. ábra. A vérlemezke trombinreceptora. a: A trombinreceptor (R 1) natív állapotban. b: Konformációváltozás, ha a trombin (T) egy peptidkötést hidrolizál

A vérlemezke-aktiválás beindításának a foszfolipáz C ak tiválódása a kulcslépése. Az inozitolfoszfát rendszer közvetítéséval a citoplazmában megemelkedik a szabad Ca2 +-szint, amely ezután aktiválhatja a kontraktilis rendszert, illetve a foszfolipáz Art (6-55. ábra). Az utóbbi reakció tromboxán A2 (TXA2)szintéziséhez vezet (lásd a 6.4. fejezetet), amely a vérl emezkébő l kikerülve a saját vagy egy másik trombocita receptarán keresztül fe l erős íth eti , illetve kiválthatja a szignált. A kontrakció eredményeként a vérlemezke membránja foszfolipidstruktúrát sza lgáltat a véralvadási kaszkád számára (régebben vérlemezke 3-faktornak nevezték), illetve ADP-szekréció következik

600

ZERVE K, SZE RVRENOSZEREK M " KÖOÉSÉNEK BIOKÉM IA I ALAPJA l

trombtn

acetilszalicilát (aszpirin)

Ca' granulum-........-~--­ szekréció

~ protein.

AMP

kináz

kontraktilis~

rendszer (MLCK)

~

koffein teofil! in papaverin dipiridamol

6-55. ábra. A v érlemezke aktiválása. Az aktiválási folyamatokat és az összes lehetséges eseményt egy vérlemezkén mutaljuk be (a valóságban természetesen több frombocita múködik közre, amelyekben nem egy időben játszódik le az összes reakció). Röviditések: foszfolipáz C (PLC), inozito/1 ,4,5-triszfoszfát (IPJ), vérlemezke membránfoszfolipid (PF-3), foszfolipáz A 2 (PLA2), arachidonál (PL-AA), fosztolipid (PL), ciklooxigenáz (CyO), tromboxán-szinteláz (TSy), adenilát-cikláz (AC), tosztodiészteráz (POE). vérlemezke aktiválásához szükséges receptorok (R 1 és R 2). Az átalakulásokat vaslag nyilak, a hatásokat vékony nyilak, a gátlásokat (-)jelek szimbolizálják. A véralvadás fokozódásának irányába ható komponenseket piros szinnel jelezzük

be. Az ADP az aktiválódott vérlemezke denz granu lumából kikerülve a tromboxán A 2 receptorától eltérő receptorhoz kötődve G,-proteincn keresztü l gátolja az adcnilát-cikláz működését, ami csökkent cAMP-szintet eredményez. Ezál ta l fokozódik a TXA 2 szintézise é a vérlemezkék aggrcgációja, mert a cAMP gátolja a TXA 2 szintézisét, aktiválja a cAMP-függő protein-kinázt,

amely gátolja a mioz infoszforilációt [a miozinkönnyűlánc-kináz (MLCK) foszforilálódik é inaktiválódik], ezáltal c ökkentve a kontraktilis rendszer működését. Az e lmondottakkal ellentétes fo lyamatokjátszódn ak le, ha az endothelsejtekben prosztaciklin (PGI 2 ) szintetizálódik é szekretálódik. Amíg az ADP (és az adrenalin is) a Gi-proteint aktiválja, a PG12 (hasonlóan az

HEl\IOSZTÁZIS

)))))) )))) )))))))) )))) )))) )))) )))) )))) )) )))) )) )))))))) )))))))) )) )))) )))))))))))) )))))) )))) )))) )) )) )))> ))) ) ))>))) )) )) )) )) )) )))) )) )))))) )) )) )) )) )))))) )l )))))))) )))))))) ))))))

adenozinhoz) a G, -protein t aktiválja, amely nek eredményekép pen a fokozott adenilát-ci kláz aktivitás cAMP- zint-emelkedé t eredményez (6-55.

ábra).

Említést érdemelnek azok a vegyületek is, amelyek valamilyen módon a fent említett folyamatokkal interferálnak és ezért a medicinában alkalmazást nyertek. Ilyenek az aszpirin (acetil-szalicil av), amely a cikJooxigená zt gátolja, ezálta l a TXA 2-szintézist csökkenti· a ' dipiridamol, illetve a koffein, teofillin és papaverin, amelyek a vérlemezke foszfodiészter áz aktivitását gátolják, gátolva a cAMP hidro líziét, vagyis növelik a cAMP-szintet , aminek eredménye csökkent aggregációs készség. A vérlemezke-a dhézió és vérlemezke-a ggregáció - a véra lvadás moleku láris reakcióihoz hasonlóan - kofaktorokat igényel. Amig az aggregáció Ca 2 - és fibrinogénfüggő, az adhézió nem jön létre von Willebrand-f aktor nélkül. A von Willebrand-fa ktor 2050 aminosavból épü l fe l, amely multimer komplexet képez azálta l, hogy egy ilyen lánc N- é C-terminál i végével is kapcsolódhat egy másikhoz. A szerkezeten kötő helyek találhatók a vérlemezke membránja, a Y lll faktor, a heparin és a kollagének számára. A von Willebrand-faktort az endothelsejte k szintetizálják és szecernálják; a vérlemezke adhéziójában játszott szerepén túl további feladata, hogy a Vrri-faktort szá llítja a vérkeringésben. Sérülések orán kollagén, heparin, vérlemezkem embránglikoprotein (GPib vagy G Pllb/Illa) kötőrlhet a 'on Wi llebrand-fakto r megfelelő fu nkcioná lis dornénje ihez.

A von Willebrand- faktor hiánya vagy defektusa (von Willebrand-k ór) esetén nem jön létre adhézió és, a betegek vérzékenység ben szenvcdhetnek . Altalában a vérlemezke-re ndellenességek haemorrhagiás tünetekkel járnak; a betegségek örökletes és szerzett fom1ái is elő­ fordulnak.

6ol

Orvosi szempontból figyelemremé ltó, hogy a véralvadási rendszerbe több szinten is be lehet avatkozni:

O A különböző véralvadási faktorokat elő lehet állítani (ma már géntechnológ iai módszerekkel) és terápiá an alkalmazható k. & A kompartment ek ( alvadási komplexek) kialakulása gátolható (a májban a Gla-képződés megakadályoz ása pl. Syncuman·al vagy a vérlemezkék aktiválódásán ak gátlása pl. aszpirinnel). O A véralvadási proteázokat, el ső orban a trombint in vivo inaktiválni lehet (pl. heparin adásával fokozható az endogén inhibitorok hatékonysága . vagy hirudin alkalmazásával a trombin közvetlenül és specifik:usan inaktiválható).

Fibrinolízis Bár tö bb proteáz képe a fibrint emé zteni (pl. tripszin, elasztáz, katepszin G), nagy általáno ságban e lfogadott, hogy a fibrinolíz is a plazmin aktivitását j elenti . A plazmin azonban csak proenzim plazminogén formában található a vérkcrinué ben· b ' így működésén ek előfe ltéte l e a plazminogén aktiválódása.

A fibrin feloldása A plazmin (83 kDa) a szerin-protcáz ok c aportjába tartozik; két láncbó l épül fel, ame lyeket S-S hidak tartanak össze (6-57. ábra). Bár különböző fehérjéket bonthat (főleg a lizin melletti kötéseket), a plazm in egyik l egje l entősebb funkciója a fibrin emésztése. A proteolíz is sebes ége megvá ltozik, ha a fibrin vagy a fibrinogén szerkezetében módosulások következnek be; így pl. az aktivált X lil-faktorral keresztbe kötött fibrin szolubilizálása lassúbb reakció, mint a natív fibriné. A keresztkötött fibrinben emésztés után ún. D-dimérek jelennek meg, amelyek a vérben kimutathatók (6-56. ábra).

602

, . ~) t))))))) l)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

6-56. ábra. A polimerizált fibrin és a keresztkötött fibrin monomer egységeinek degradációj a. A plazmin (P) a fibrin emésztésekor egy fibrin monomerből két D degradációs terméket és egy E degradácós terméket hoz létre. A keresztkötött fibrin monomerekből o-dimérek keletkeznek. A keresztkötéseket a xxx jelzések szimbolizá/ják. A reakciókinelikai ábrán a polimerizált fibrin, a keresztkötött fibrin és a plazmin inhibitorral is keresztkötött fibrin degradációjának relatív sebességél mutatja. A fibrin degradáciős terméket az FOP rövidítés jelzi

Z ERVEK, SZ ERVR EN DSZ EREK l n KÖD É ÉNE K BIOKÉMI AI ALAPJA l

polimerizált FDP mennyiség inhibitorral is keresztkötött

idö (óra)

E változásoknak orvos i szempontból kettős van: (i) ha az orvos késő n ta lálkoz ik a thrombosisos betegge l, k isebb a remény a vérrög gyors feloldására, (i i) a diroerek kimutathatók a vérplazmában, így diagnosztikaiprognosztikai j e lként használhatók.

jelentősége

válódhat, (ii) a plazminogénaktívátorok nincsenek á llandóan j e len a vérplazmában, (ii i) hatásos inhibitorrendszer zabá lyozza a plazminogénaktívátorok aktivitását, (iv) egy másik inhibitorrendszer rendkívül gyorsan ina kti válhatja a kész plazminmoleku lá kat.

A plazminogén konformáció változásai A plazmin keletkezése A p l az minogén ~ plazmin áta lakulás folyamatát plazminogéna kt iválásnak nevezik. Funkcioná lis zempontból a plazminogénnek három régiój át lehet megkülönböztetni : az N-tenninális, ún. aktivác iós peptidszakaszt, az öt ún. kring le-struktúrát tarta lmazó régié t és a C-terminális oldalon az aktív centrum (ser741 ) kialakításához szükséges szekvenc iát (6-57. ábra). A plazmin keletkezése re ndkívü l kifinomu lt módon több szinten szabá lyozott rendszer: (i) a plazminogén , mint szubsztrát, a körülmén yektő l ftiggőe n nehezen vagy könnyen akti-

Nonnális körülmények között a vérplazma ionmili őjében a plazminogén a lig h ozzáférhető a plazminogénaktívátorok számára ; ugyani az N-terminá lis aktivációs peptid ré z " lefedi" az Args6 t-Yals62 (lá d a 6-57. ábrát) peptidkötést az aktivátorok elől. Ha azonban az aktivációs peptid "eltávolodik" akár konformációvá ltozás következtében, akár proteolízissei (pl. plazmin vagy elasztáz hatására), a módosult zimcgén az aktivátorok szám ára j ó szubsztráttá válik. A plazmin á ltal végrehajtott plazminogén módosulás azt jelzi, hogy a plazmin pozitív v isszacsatolási mechanizmussal szabá lyozhatja saját keletkezését.

HEMO ZTÁZIS

))))))))))))))))))))))))))))))o)))))))))))))))))>))))))))n))lU>))))H))))))))))

)

h)))))).)))))))))))))U))))))))))}))))))))>)))))})))))))))))))~h)))))))))))))))))))))))))

603

plazmin

Í

lysn

( p

L~~

Cys..., j C-terminélis Asn.,., \

rv\1... Ar?,.,

PA

\

s l s Val _ _ _ j _ _ _ _ _ Asn / AC

~er,.,

Glu1

N-terminélis

elasztáz (El). 6-57. ábra. A plazminogén és plazmin szerkezete. Rövidítések: plazminogénaktívátorok (PA), plazmin (P), (norvég felemlékeztet pereere ábrázolásban részletes és kringle-szerkezetek (K). A kringle-szerkezetet S-S hidak tartják össze létre és jön szerkezet kétláncú során aktiválódása plazminogén egyláncú Az =perec). kringle elnevezés; fedezőktől származó annak rövidebb láncán alakul ki az aktív centrum (AC).

A p/azminogé naktivátor ok Endogén (emlő ök által termelt) és exogén (baktériumok által termelt) plazminogé naktívátoro k ismertek. A két legjellegzete ebb endogén aktivátor az urokináz (helyesen: urokináz típusú plazminogénakti vátor; uPA) és a szöveti típusú plazminogénaktivátor (tissue-typ c pia minogen activator; tP A). Mindkét aktivátor fő forrása az endothelsej t, bár tumorsejtek is nagy mennyiség ben szintctizálják. A tP A-szekréci ó egyik legfőbb ingere a bradikinin, amely kallikrein hatására a kininegénekből szabadul fel. Plazminogé naktivátork ént működhet még az aktivált XII-faktor, hatékonysá ga az uP A-nál és a tP A-nál sokkal cseké lyebb. Ennek biológiai vagy fiziológiai jelentősége nem ismert; az a tény azonban, hogy Xll-faktor- deficiens betegek nem szenvednek vérzékenys égben, sőt hiánya gyakran társul thmmboem boliás kórképekke l , amellett szól, hogy a fibrinolíz is beindításáb an fontos szerepet játszhat az aktivált XII-faktor. Az urokináz típusú plazminogé naktivátor inaktív formában szintctizáló dik és szekréciója után az urokináz legspecifik usabb aktívátora a kallikrein és a plazmin. Az egyláncú z imcgénből (scuPA)

kétláncú aktív enzim keletkezik (tcuPA). A kallikrein szerepe azt jelzi, hogy a XII-faktor és a kinin- kallikrein rendszer zoros kapcsolatb an Ichet fibrinolitik us folyamatok kal, míg a plazmin szerepe azt mutatja, hogy a plazminogé naktiválá t a plazmin pozitív visszacsato lás útján, mind a zimogén, mind az aktivátorok módosítá án kere ztül felerösítheti. Regulációs szempontb ól még egy fontos effektust kell tekintetbe venni, nevezetesen azl, hogy a tP A , amely aktív fennában szekretálód ik, csak akkor válik hatékony enzimmé, ha ún. kofaktorok is jelen vannak. Ilyen tP A-kofakto r szerepe t játszhat az endothelse jt felszíne, bizonyos denaturált fehérjék, a miozin és a fibrinolitik us rendszer végső szubsztrátj a, a fibrin . Az utóbbi azért érdekes, mert jelzi, hogy a fibrin egyidőben lehet a plazmin szubsztrátj a és a szöveti típu ú plazminogé naktivátor kofaktora. Ha elfogy a szubsztrát, elfogy akofaktor is, " ninc szük ség" enzimre, nem is aktiválódik a plazminogé n. Az exogén plazminogé naktívátoro k legjellemzőbb, s orvosi szempontb ól legfontosab b képvi elője a sztreptoki náz, amely nem proleolitiku s enzim, hanem a P-hemolitik us Streptococ cus által

604

n>>>>Jo>>>U))))))>>>>>>H>>>>>>>)n>>>)>)))))»>>>>>>»>>>>»>)

Pg

SZERV E K, ZER \'REf';D SZERE K :\1 .. KÖDÉSÉNEK BIOK ÉMIAI ALAPJA J

A plazm in inhibi torren dszere

p

s l

s

_ t AC

AC

H-Pg

6-58. ábra. A humán plazmin og én sztrept okinázz al alkotott komplexe plazmi nogéna ktiváto rként mükö dik. Rövidftések : sztreptokináz (SK). humán plazminogén (H-Pg), aktív centrum (AC), sztreptokináz-humán plazminogén komplex (SK-H-Pg), plazmin (P)

termel t fehé rje. Humá n szervc zetbe kerül ve nagy a ffinitás a l kötődik a plazm inogén hez és abban olyan konformáció változ ást induká l, hogy a zimag énben kifej l ődik egy aktív centru m anélkül , hogy kétlán cú plazm in(ogé n) keletkezne. A sztrep tokiná z- plazm inogén komp lex mint plazm inogén aktivá tor müköd ik, hasonlóan az uP A-hoz vagy a tPA-h oz (6-58. ábra). A sztrep tokináz- plazminogén kompl ex féléletidej e igen rövid ; zubsztrát (plazm inogén) hiányá ban néhán y percen be lü l degrad álódik . A ztrepto kinázt már régóta haszná lják throm boem boliás betegs égek kezelé ére. Bár újabban az orvos i gyako rlatban el ő nyben része ítik az urokin ázt és a géntec hno lógiáv al gyárto tt tPA-t.

A p/azm inogén aktivátorok inhibi torren dszere A plazm inogénaktivá tor inhibítora i közül (eddig négy fé le ismert) a leg fontos abb a plaz minog énaktivá tor inhibi tor-l ( PA l- l ), amely ekvim oláris komplexet képez a plazm inogénakti vátoro kka l é's mind a tP A-t, mind az uP A-t gyorsa n ina ktiválj a.

A plazm in leghatékony abb inhibit ora a plazm in inhibi tor (régeb bi nevén a 2 -antipl azmin), amely rendkí vül gyorsa n képez ekvimo láris komplexet az enzim meL A plazm in és a plazm in inhibitor közötti reakci ó a körülm ények szerin t változhat. Ha pl. a plazm in már k ötődött szubsztrátjához, a fibrinh ez, az inaktiválás sebess ége nagysá grende kkel kisebb , mint a "szaba d" enz imé. Ha viszon t sok tromb in keletk ezett és az aktivá ita már a X ITl -fakto rt, akkor ennek eredmények ént nemcs ak a fibrinben j önnek létre keresztkötés ek, hanem az aktivá lt XIIl -fakto r minteg y " ráköti" a plazm in inhibitort is a fibrinh álóra, úgy hogy az megta rtja inhibit or aktivit ását; te hát a vérrög hozzáférhete tlen lesz a plazm in számára (lásd még a 6-56. ábrát i )

M indkét mecha nizmu s jelzi a kliniku s számára, hogy milycn fontos a throm boemb oliás kórkép ek gyor diagnó zisa é az azonn ali terápiás eljárás megke zdése a hatéko ny kezelé s céljáb ól.

A fibrin olízis szabá lyozá sa A fibrin olízisb en részt vevő molekulák szintéziének (6-59. ábra) é szekré ciójának sebess égétől függően vagy az enzimek, vagy az inhibitorok koncen trác iója lehet magas abb, am i alapve tően megha tározz a a fibrino líz ist. A szabályozás mikéntje még nem ismert, bár több információ is talá lható az irodalo mba n.

A klinik us szemp ontjáb ól hasznos, hogy az inh ibitoro k és az inhibitor-enz im komplexek menny isége a vérben m eghatározható, am i táj ékozta tást j elenth et terápiá s szem pontbó l.

M olekulá ri szinten j át zódna k le a pozitív és a negatív vi ssz~lcsatol ásos rea kciók, illetve az inhibito r okka l történő gátlási reakc iók nagy része (6-60. áhra). A plazm inogén bő l plazm in keletk ez-

HEMO ZTÁZIS

605

6-59. ábra. A plazmin keletkezés celluláris szintű regulációja. Rövidítések: plazminogén (Pg), fibrinogén (Fg), plazmin inhibitorok {Pl), plazminogénaktívátorok (PA), plazminogénaktivátor inhibitorok (PAl). plazmin (P). fibrin (F). A szekréciót és átalakulást vastag nyilak, a hatást vékony nyilak, a gátlást (-). a fokozást (+) szimbólumok jelzik

~ Fg

f )~ ~Pg F~

PAI~ PA

Pl

endothefsejt (tumorsejtek)

het, ha plazrnjnogénakti vátor szabadul fel a sejtekA plazmin pozitív feedback szabályozás útján fokozza további plazminmolekulák keletkezését. A szöveti típusLI plazminogénaktí vátorok hatékonyabban müködnek, ha ko faktorok vannak jelen. ből.

6-60. ábra. A plazminogénaktiválás molekuláris szintű szabályozása. Rövidítések: plazminogén (Pg), plazmin (P), fibrinogén (Fg), fibrin (F). egyláncú és kétláncú szöveti tlpusú plazminogénaktívátorok (sctPA, tctPA), aktivátorok kofaktorai (Cof), egy- és kétláncú urokináz tlpusú plazminogénaktívátorok (scuPA, tcuPA), protrombin (ProT), trombin (T), inhibitorok (1). A vastag nyilak átalakulásokat vagy kötődés!, a vékony nyílak hatásokat, a (+) jelek pozitív, a (-) jel negatív visszacsatolást jeleznek. Mint mindkét tPa, az egyláncú uPA (scuPA) csak bizonyos körülmények között rendelkezik csekély aktívitással. Mindez azt jelzi, hogy a tPA a plazminogénaktiváció beindítását, az uPA pedig a felerősítését szolgálják. A fibrinolízis hatékonyságához a plazmin hozzájárul azzal is, hogy gátofni képes a véralvadás egyes kofaktoraít, így gátolja további fibrin keletkezését.

Amíg a plazmin a fi brint meg nem emésztette, az megta1tja kofaktor aktivitását. Mind acelluláris, mind a molekuláris komponensek olyan kompartmenteket hozhatnak létre, a melyek elkülönülnek a környezetüktő l é azok-

606

SZE RVEK, SZERVRENDSZER EK M KÖDÉ ÉNEK BIOKÉMIAI ALAPJAI

ban lokálisan nagy koncentrációcltéré sek alakulhatnak ki. Ilyen kompa1tmcnt maga a trombus vagy egy gyulladásos terület is.

A fibrinolízis patológiás változásaival kapcsolatban általánosságként elmondhatjuk, hogy fokozott működése (pl. az aktiválódási folyamatok felgyorsulása vagy az inhibitorok defektusa) vérzékenységet eredményez, míg a fibrinolízis csökkent működése (pl. plazminogén hiánya vagy e légtelen aktiváládá a) thromboemboliás kórképekhez vezet. A fibrinolízis és véralvadás társult, rendkívül súlyos kórképe jöhet létre, amikor nagy mennyiségü szöveti faktor (TF) jelenik meg a vérkeringésben (pl. terhesség során elhalt magzatból vagy sepsises állapotban az endothe l ejtek é monociták felszínén). Ilyenkor general izáltan fokozódik a véralvadási kaszkád, e lfogynak a zimogének, a sok proteáz "elfogyasztja" az inhibitor rendszert, miközben a fibrinolízis is beindul. Parallel a lakulnak ki thrombosisok és vérzések. A kórképet disszeminált intravascularis coagulopathiának (DIC), illetve újabban intravascularis coagulatiós fibrinolízisnek (lCF) nevezik. Az intravascu laris folyamatok mellett a fibrinolízis szerepet játszhat extravaszkuláris eseményekben is, mint pl. az extracelluláris szövetek degradációjában (lásd 6.3. fejezet), a sebgyógyulásban, az ovulációban és terhességben, a legkülönbözőbb gyulladásos fo lyamatokban, angiogenezisben, a tumorok növekedésében és metasztázi sképződésében .

A máj szerepe a hemosztázisb an A máj kettős szer epet játszik a hemosztázi ban; egyrészt a hepatocitákban történik a véralvadási- fibrinolitikus rendszer legtöbb fehérjéjének szintézise és poszttranszlác iós módosítása, másrészt a májmakrofágok (Kupffer-sejtek) és részben a hepatociták veszik fel a vérkeringésbő l az inaktív proteázokat, illetve a proteázok inhibitorokkal a lkotott komplexeit és degradálják azokat. A máj gyakorlati jelentőségéL az jelzi a legjobban, hogy parenchymá károsodásakor (pl. cir-

N

rhosis) zavart lesz a véralvadá i zimcgén rendszer szintézise, ami sú lyos vérzékenységi problémákat okozhat. A máj kitüntetett zerepe a Gla szintézise. A Gla számos alvadási faktorban (protrombin, X-faktor, IX-faktor, Vll faktor, protc in C és protein S) már meg lévő g lutaminsav módosulásán kere ztül képződik: a glutamát gamma-C-atomjáh oz zéndioxid felhasználásával egy további karboxiicsoport kapcsolódik. A rcakciót egy karboxiláz enzim katalizálja (6-6 1. ábra). A reakció nem történik meg K-vitam in hiányában. A K-vitamin a karboxiláz műköködé e közben oxidálódik. illetve két további e nzim hatására redukálódik (6-62. ábra).

Glu

l 13CH y

l

G la

2

H-C - H

l

r :c

l 13cH l

2

H -1c- r()()

coo-

l

coo

6-61 . ábra. A gamma-karboxil-glu taminsav (Gia) szintézi-

se. A karboxiláz által katalizáll reakció kofaktora a K-vitamin redukált formája (lásd még a 6-62. ábrát is)

K-vitamin-hiány vagy a K-vitamin-ciklus gátlása vérzékenységi zavarokat eredményez. Az utóbbit használják fel az orvosi gyakorlatban thrombosisos betegségek kezelésére. Egy lóhere féleségben talált vegyület, a dikumarol az epoxid-rcduktázt gáto Ua (6-62. ábra), ezáltal a K-vitamin-ciklus nem müködik: és nem történik Gla-szintézis. (A dikumarol felfedezéséhez az vezetett, hogy helytelen tárolás következtében a rothadó szénában keletkezett ez a vegyület és a tehenek elvéreztek. Később a vegyületet patkányirtásra használták Ma gyógyszer.) A dikumarinszármaz ékok alkalmazásának veszélye, hogy hatásuk a fehé1je zintézis sebességéhez kapcsolt. Ha a poszttranszlációs Gla-hiány kialakult és vérzés következik be, meg kell várni, amíg a GJa-tartalmú fehérjék újra szintetizá-

HE\10SZTÁZIS

)))) )) )))))))))))))) )))))))) )))))))))) )))))))) )) )) )))) )) )))))) )))))))) )))))))))) )) )))))) )))))))))))))))))))))) )))))))))) )))))) )))) )) )) )))) )))) )) )))))))))) )) ) ))))))) )))))) ))

607

OH

o

o

hidrokinon (a karboxiláz kofaktora)

o

o

K-vitamin-ciklus

epoxid

kin on

epoxid-red u ktáz

~

dikumarin

6-62. ábra. A K-vitamín-ciklus. A K-vitaminban (kinon) az R-gyök változó lehet, és szintetikusan is változtatható, ami a hatékonyságot befolyásolja. Leggyakrabban:

egységeket tarlalmaz (ha pl. n = 6, K 2-vitaminról beszélünk). Az oxidált forma (epoxid) redukcióját az epoxid-redukláz katalizálja. A reduktáz enzim gátolható dikumarinszármazékokkal (Dicumarol, Warfarin, Syncumar)

lódnak. Ez azt jelenti, hogy a gyógyszerhatás csak a hiányzó fehérjék pótlásával függeszthető fel. Ezért az ilyen jellegű kezelés - bár könnyű, mert orálisan alkalmazható - szeros laboratóriumi ellenőrzést igényel.

Az endothelium szerepe a hemosztázisban Az eukarióta sej tek elvesztették közvetlen kapcsolatukat környezetükkel; zámukra az anyagcsere-folyamatok végbemeneteléhez és fe ladataik ellátásához a vérkeringés biztosítja a feltételeket.

608

))).))))))))))))))))))))))))))))})))))))))))))))))))))))))))))))

SZ ERVEK, SZER REN DSZE R EK 1 .. KÖDÉ É:"~ EK BIOKÉM IA I ALAPJAJ

Az ere k (artériák, vénák) te ljes be l ső felszínét endothelsejtek hálózzák be; a kapillárisokon keresztül szaros ka pcsolatot teremtenek a keri ngő vér és a környező sejtek között. Az ér és a vér külön szervnek is tekinthető. Funkció i e llátásának a lapvető fe ltéte le, hogy az érpályán belül a vér ne m veszítheti c l folyékony halmazá llapotát Az endothe lsej tek " védettek" a véralvadási rcndszen·el szemben; felszínük és bizonyos komponenseik a ntitrombotikus tul ajdonságúak. Az endothelsejtek Ileparint és h epa rinszerű molekulá kat (pl. heparán-szulfát) termelnek, amelyek egyrészt szekretálódhatnak, másrészt a sejtek

vérrel érintkező felszínére kerülhetnek. Így lehetöség nyíl ik arra, hogy bizonyos érszakaszokban, ha trombin keletkezik, az gyorsan inaktiválódjon antitrombin j elenlétében (lásd a 6-52. ábrát is). Az endothelsejtek integráns membránkornponense a trombomodulin különleges szerepet tölt be a véralvadási folyamatok gátlásában (lásd protein C aktiválás). Amíg a "szabad" trombin véralvadást eredményez (megalva ztja a fibrinogént, aktiválja a vérlemezkét, a Xlll, az V és a Ylll fa ktorokat; 6-44., 6-5 1. és 6-55. ábrák), addig a trombomodulinhoz " kötött" trombin prote in C-t aktivál (6-51. ábra), "kvázi" haemophiliát hoz létre.

ae

Fg F-V F-VIII F-XIII

vérlemezke

r károsodás

6-63. áb ra . Az endo thelium antitrombotikus tulajdonságá nak fő bb elemei. Rövidítések: endothe/sejt (EC) , szövetí faktor (TF) , trombin (T), protrombin (ProT), aktivált V- és VI/l-faktor (F-Va és F-V/1/a), vérlem ezke és tromboxán A 2 (TXA2), fibrinogén (Fg), fibrin (F), X l/l-faktor (F-X/11), protein C (PC), aktivált protein C (aPC), trombomodulin (TM), antitrombin (A T), heparán-szu/fát (H S), adenozin (A), proszfacik/in (PG/2), plazminogén (Pg) , plazminogénaktivátor (PA), plazmin (P). A vastag nyilak átalakulást vagy kötődést, a vékony nyilak hatást jelentenek. A nyflhegy előtt levő függőleges vonal azt jelzi, hogy az enzim kötött formájában nem hatékony a felsorolt szubsztrátjain. A szaggatott vonal a véralvadási komplexeket jelzi. A piros szín a trombus képződésnek kedvező tendenciákat szimbo/izálja

» ))>>>~>Hn»n>>> >~ >>» >>>> >>>~)))))H> ))>>>>>>>>>>>H>>>>>>>»>>n>>>>>>>>>»>>»~>>>>>>>>>>>»>» >n>>>>> >U>>>>>>>>>>>>>>>>»H>>>))nn >H>>H>n>H>>HH>>> >>n)) •>

Ennek a negatív feedback szabályozásnak gyakorlati jelentőségét az bizonyítja, hogy a protcin C-hiányos betegek, valamint azok, akiknél az V-faktor mutációja miatt az nem inaktiválliató aktivált protein C-vel (APC-rezisztencia), thrombosisban szenvednek. Figyelemre méltó az is, hogy a trombomodulin in vivo funkciójának gátlása trombin jelenlétében (olyan koncentTációban, amely különben nem jár emmiféle károsodással) pár percen belüli úlyos thrombosis kifejlődéséhez és halálhoz vezet. A trombomodulin egy másik biológiai hatása a fibrinolízis gátlása. A trombomodulinhoz kötött trombin aktiválja a vérben található prokarboxipeptidáz B-t, majd a karboxipeptidáz B eltávolítja a fibrin C-terminális Lys-jeit. amelyek a pla1minogén- ftbrin kölcsönhatásáért felelő ck. Így c ökken a plazminogénaktiváció sebessége, a fibrinolízis "gátolt" lesz. Az időközben fokozódott protein C aktiválódás miatt viszont c ökken a trombin mennyisége, és ezáltal a prokarboxipeptidáL B aktiválódása. A fibrinolízi fe l zabadul a gátolt állapotából. A rend zcr müködésének in vivo jelentősége még nem ismert. Az endothelsejtek nemcsak plazmamembránjuk útján képesek a véralvadási folyamatokat gátolni, hanem egyéb sejtbiológiai folyamatok révén is. Amíg a vérlemezkék az arachidon avból TXA 2-t

6O9

szintetizálnak, az endothelsejtek PG1 2-t termelnek. A prosztaciklin pedig, mint láttuk, gátolja a vérlemezkék aggregációját (6-55. ábra). A PG ir hez hason ló mechanizmussal működ ik az adenozin is, mely az endothelsejt felszinén elhelyezkedő adenozin-difoszfatáz révén a vérlemezkék aggregációját fokozó ADP-ből keletkezhet A plazminogénaktivátorok elsősorban az endothelsejtekben szintetizálódnak. Szintézi üket és szekréciójukat különböző faktorok vagy behatáok (bradikinin, aktivált protein C, trombin, fizikai megerőltetés stb.) fokozhatják. Ez alapvető jelentőségű, mert amíg a vérah adási folyamatok egyik legfőbb beindítója az endothelium károsodása, a fibrinolízis iniciálásához ép endothelsejt-funkcióra van szükség. A folyamat azonban sokka l bonyolultabb, mert az endothelsejtek felelősek a plazminogénaktivátor inhibitorok (pl. PAT- l) egy részének zintézi éért és zekréciójáért is. A két rendszer egyensúlyi állapota nagymértékben befolyá olja, hogy a ftbrinolitiku folyamatok beindulhatnak-e vagy sem (6-59. ábra). Mindczekhez társul, hogy az endothelsejtek felszíne a fibrinolí zis szempontjából is kitüntetett zerepct játszhat nevezetesen az ép endothel ejt külső mcmbránján a plazmi nogén aktiváláshoz szükséges komponensek találkoznak é az aktiválás reakciósebessége nagymértékben megnő. Azokat a legfontosabb mechanizmusokat, amelyek hozzájárulnak az endothelium tromborezisztens tulajdon ágaihoz a 6-63. áhra foglalja össze.

A fejc:ret megírás
AjánloU irodalom

Blood Vessei Wall and Thrombosis, cd. R. Machovich, CRC Press. Florida USA. Vol. l-Il., 1988 Hemoslasts and Thrombosis, Ftb. R. W. Colman, J. llirsh, V. J. Mardcr, E. W. Salzman, J. B. Lippincott Company, Philadelphia. 1994

Mitokondriális betegségek

.6.

Süntegi Balázs

A mitokondrium a sejtek legfontosabb oxidatív energiatermelő objektuma, amely felhasználja a citoplazmában glukózból képződő piruvátot, a zsírsavakat és aminosavakat. Ezen anyagok mitokondriális átalakulásai során termelődött reduká lt koenzimeket (NADH és FADH2) a re pirációs komplexek ox idálják és az oxidác ió során felszabadult energia egy jelentős részét A TP szintézisre fordítják. Az itt képződő ATP-t egy transzport rendszer juttatja a citoplazmába, ahol e ljut a sej t A TP-t használó enz imjeihez (fehérjé ihez). A fenti folyamatok sérülése legtöbb szövetben nagyfokú A TP-hiányt okozhat, amely a sejt pusztulásához, illetve súlyos betegségekhez vezethet. A mitokondriális betegségek két nagy csoportba oszthatók: O az egyik csoportba azon betegségek tartoznak, melyek oka a nukleárisan kódolt és a mitokondriumba transzportútján bejutó enzimek-fehétjék génjeinek a károsodása, 6 a má ik csoportba tartozók esetében a mitokondriális ge nom károsodása következtében a mitokondriális genomban kódolt fehétjék defektu a hozza létre a betegséget. A mitokondriáli genom károsodásának okai lehetnek örökletes tényezők, stressz hatások, illetve a kor e l őrehaladtával bekövetkezett DNS károsodások akkumulációja.

A nukleá risan kódolt mitokondriá lis enzimek génjeinek mutációja á ltal előidézett mitokondriá lis betegségek e léggé ritkák, így ezekkel részleteiben nem foglalkozunk.

A mitokondriális genom károsodása Az emberi sejtekben l évő gének több mint 99,9 %-a a nukleáris genomban található, de egy kis zámú gén a nukleáris genomtól fúggetlenül elő­ forduló mitokondriális genomban van. A mitokondriális genom 16 569 nukleotidpárból álló c irkulális DNS-molekula, amelynek komplementer láncai összetételükben jelentősen különböznek (6-64. ábra). Az ún. nehéz lánc igen sok guanint tarta lmaz, míg a komplementer könnyű lánc c itczinban dúsult. A nehéz lánc a templátja a két rRNS-nek, 12 mitokondriálisan kódolt fehérjének és 14 tRNS-nek. A könnyű lánc egy fehérjeláncot kódol és 8 tRNS-t. A mitokondriáli s DNS nem tartalmaz intronokat E llentétben a nukleáris genommal, a mitokondriális DNS (mtDN S) molekulák száma egy sejtben több száz is lehet, sőt a petesejtekben a mtDN S-molekulák száma a I O OOO-t is elérheti . A mtDNS replikációja két he lyrő l indul. Az RNS szintéze mindkét láncról megtörtén ik és tartalmazza az egész genomot. Az e l sődleges transzkriptumból egy mitokondriális ribanukleáz enzim vágja ki a tRNS-eket. Mivel a mtDNS rendkívül kompakt és a riboszomális RNS-ek, valamint a mRNS-eknek 5' és 3' végeinél nincsenek nem kódoló szekvenc iák, ezért poli-A végek poszttranszkripciós hozzáadásával fejeződik be a mitokondriális mRNS képződése. Hasonlóan a baktériumokhoz, a fehérjeszintézis itt is formil-metioninna l kezdődik és a mitokondriális fehérjeszintézis i gátolható a bakteriá-

MJTOKONDRI ÁLI BETEG ÉGEK

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

6l l

DNS 16 569 bázispárból áll. NO, NADH 6-64. ábra. A humán mitokond riális DNS szerkeze te. A humán mitokondriális cai. Az ND6 alegységet és 8 tRNS-t a fehérjelán táz ATP-szin ATPáz, dehidrogenáz alegységei; CO, citrokróm-oxidáz alegységei; LHON, Leber örökletes látóideg jelzik. régiókat kódoló t tRNS-eke a k szakaszo piros A külsö. belső lánc kódol, a többit rostokkaL neuropathia; MEERRF , myoclonusos epilepsia töredezett egyes

lis riboszóm a inh ibitor klóramf enikolla l. Tovább i érdekess ége a mitokon driáli fehérjes zintézis nek, hogy a genetika i kód különbö zik a mcgszok ottól (6-6. táblázat), így a normál stop kodon (UGA) triptofánt kódol a mitokon driumba n. Az (AUA) izoicucin kód metioni nt kódol a mitokon driumba n, és az (AGA, valamin t AGG) arginin kódok stop kodonké nt szolgáln ak az emberi mitokon driumban . Ezek a genetika i kód változá ok biztosítják, hogy mtDNS- bcn kódolt gének c ak a mitokon driumba n tudjanak cxpressz álódni.

Az összes mitokon driumba n kódolt polipept id a mitokon driális belső membrá nban el helyezkedő respirác iós komplex ek a lkotórés ze (6-7. táblázat). A re pirációs komplex ek a mitokon driális oxidáció és ATP-szi ntézis következő reakciói t katalizá lják. A komplex T, NADH dehidro genáz vagy NADH: ubikino n oxidore duktáz katalizá lja a hidrogéntra nszfett a NA DH-ról az ubikinon ra. Az enzim aktív centrum ában tlavin mononu kleotid (FMN) és számos vas-kén centrum található . A mitokon driálisan kódolt fehérjék részt vesznek a

612

>)))))))))))))))) ))))>))))))))))) H))))>)))))>))) )))))))))))))))

SZERVE K, SZERVR ENDSZF:REK :\1 KÖOÉSÉNF:K BIOKÉl\I IAI ALAP.IAI

1 6-6. táblázat . Különbs égek az univerzá lis kód

t és a mitokon driális genetikai kód között 1 különböző fajokban_ _ _ _ _ Kodon

l

-1 UGA AUA CUA

l

~

ll

6-7. táblázat. Az emberi mitokon driális genomb an kódolt polipeptidek és a légzési lánc komplex einek a kapcsol ata ,~

L

UniverMitokond riális kód zális · ~ kód ___j Emlősök Drozofila j Élesztő

Komplex ek

j

Stop

Trp

Ile

Met

Leu

Le u

Met

l- Leu

Met

j 1.-

Thr 1

ll.

AGA j

AGG

l Arg

Stop

l Ser

A mitokondriálls DNS által kódolt alegységek száma

~rp

_,_-

+-Trp _

~,-

Az alegységek teljes száma

Arg

lll.

l V.

O Az mtDNS autonóm módon viselked ik, pl.

egyik humán sej tvona lból átvi hető egy másik humán sejtvona lba citoplaz mafúzió va l vagy

l Szukcinát-dehidrogenáz l Ubikinon-citokróm c oxidoreduktáz

IV.

reakció ban és a komplex ct spccitik usan gátló rotenon egy mitokon driálisan kódolt polipept idhez kötödik . A komplex Il - szukcin át:ubiki non oxidorc duktáz, valójában a zukc inát-deh idrogenáz é egy hidrogén -transzf eráz együttes e, amely komp lex nem rendelke zik mitokon driálisan kódolt kompon enssel. A komplex lll (citokró m bc 1 komplex ) vagy ubikino n:citokr óm C oxidorc duktáz a redukált ubikinon oxidáció ját katalizá lja, miközben redukálj a a c itokróm C-t. A komplex lll citokróm b kompon c e mitokon driál isan kódolt Az oxi dáció befejező lépése a citokróm -ox idázon (komple x IV) történik , ahol az e lektrono k átkerülnek az oxigénr c, amely proton felvételé vel vízzé alakul. A komplex három legnagy obb polipept idjc mitokon driá lisan kódolt Az F 1F0-A TPáz vagy (komple x V) a protong rád iens energiáj át felhasználva ATP-t szintetiz ál ADP-ből és foszfátbóL Az Fo-részn ek két kompon ense mitokon driá lisan kódolt. Ezért bármely mitokon driá lisan kódolt gén károsod ása maga után vonja valame ly ik respirác iós komplex károsad ását és így defektív mitokon driális ox idatív foszfori láció! eredmén yez. A mtDNS genetiká ja jelentös en különbö zik a nukleári s genomé tól , a legjelleg zetesebb kölönbségekct az a lábbi öt pontban foglaljuk ös ze:

NADH-dehidrogenáz -

l Citokróm-oxidáz 1

ATP-szintáz

r\

l l

>25-

7

4

9

t

o

L 13

12

..

3

2

mitoko ndrium mikroin jektálás ával. Ez a jelcnség szépen demons trá lható klóramf enikol rezisztens mtDNS- sel rendelke ző sejteken , ame lyekből a reziszte ncia mitokon drium mikroinjekc iójával átvihető má ik ejtvonal ba. Ezekben a sejtekbe n a mtDNS- ek kevered nek, dc rekombi náció nincs, vagy elenyészően c cké ly. @ A mtDNS anyai ágon öröklődik. C) A mtDNS repiikatí ven szegrcg álódik mitózi és meJOZJS során. Ez azt jelenti, hogy egy hcteroplazmiku (amelyb en van mután és normál mtDNS) sejt többszö ri mitotiku s és meiotikus lépések után olyan sejtekké alakul, amelyekben vagy a mutáns mtDNS vagy a nom1ál mtDNS kerül többség bc. Azaz a ejtek egy réze megszab adul a genetikai károsad á tól, míg más részükb en a genetikai káro odás dominán san felszapo rodik. O Különbö zö zöveti érzéken y ég a mutáció kra. Erre példa, hogy az idegsejt ek jóval kisebb DNS-vá ltozást jelentő mutáció knál sérülnek , mint mondju k a hcpatoc iták. 0 A mitokon driális genom evolúció jának sebessége kb. l 0- 20-szor nagyobb . mint a nukleári genom evolúció s sebe , ége.

MITOKONOR I Á LIS BETEGSÉGE K

)) )))) )) )))) )))))) )))) )))) )))) )) )) )))))))) )))) )) )) )))) )) )))))) )))) )))) )))))))) )))))))))))))))))))))))

Mitokond riális genom mutációi és az ehhez kapcsoló dó betegség ek A mitokondri umban történ ő tem1inális ox idáció enzimjein képződhetn ek részlege en redukált oxigén intermedier ek (6-65. ábra), ame lyek rendkívül reaktívak, és képesek a sej talkotórész ek oxidatív károsítá ára. -~.

e1to~róm1C-ox~dá'Z

NADPHoxidáz

~

L

02

t

e-

e-

0 2-. _l_.H20 2

t

jl

szuperoxid-d izmutáz

e-

l.. OH• _l_. H20

t

glutation-peroxidáz

kataláz, peroxidáz

6-65. ábra. Reaktív oxigén intermediere k átalakitásai

képződ és e

és

A fent j elzett reaktív ox1gen intermedi erek és egyéb anyagok DNS-káros odást idézhetnek el ő, amelyek következményeké nt mutáció történhet a mitokondri ális DNS-ben. A mitokondri á lis DNS mutációi négy kategóriába sorolhatók : O Misszensz mutáció (a kodonok változása miatt egy fe hérje szerkezete vá ltozik). Misszensz mutáció a latt azt é1jük, amikor a mutáció miatt a képződő polipeptidb en egy adott aminosav helyett egy új aminosav j e lenik meg. Ez a típusú mutáció gyakori a Leber örök letes optikai-látóidegi neuropathiá ban (LHON). A mtDNS mutációj a következté ben (6-64. ábra) sérül a látóideg és a központi idegrend zer egy része, és korai vakságjön létre. A betegség anyai ágon örök l őd ik . Például a Komplex l 4. komponcn-

) )))) )) )))))) ))))))))>)))))l) )))))l

6 13

sében egy arginin- hisztidi n c ere történ ik (6-64. ábra), aminek következtében részlegesen inaktiválód ik a Komplex l. Ennek következté ben csökken a NA DH-bó l történő AT P-termelés és a sej tben energ iaellátási zavarok lépnek fel. Hasonló mutációk történhetne k a Komplex I e l ső komponens ében és a c itokróm b-ben (6-64. ábra), amely szintén energ iatermelési problémák at okoz a mitokondriumban. 6 Proteinszi ntézis mutáció (a mutáció több mitokondri álisan szintetizáló dó fehérje szintézisét károsítja, mert a szintézis mechanizmusa károsodik). Amenny iben a mutáció valamely tRNS-cn történik, akkor gyakorlatil ag az egész mito kondriális protcin z intézis sérül. Általában ezek a mutációk csak az mtDNS egy ré zét érintik, azaz a mitokondri ál is fehérje zintézis csak ré z legesen károsodik. Ilyen mutációkat vettek észre a MERRF szindrómáb an (myoclonus epi lepsy w ith ragged red ftbcrs; myoclonu epi lep ia töredezett egyes rostokkal) szindrómában, M EL AS, amely nevét a j ellegzetes tünetekrő l kapta; m iopatia, encephalop athia, tejsavas (lactic) ac idosis és stroke- zerű tünetek. Ezek a betegségek a myopathián kívül súlyos központi idegrendsz eri zavarokat okoznak. C) Inzerciós-d eléciós mutá ciók. A mitokondriális DNS delécióját vették észre a szemmozg ató izom károsodásá val járó Keams- Sayre-szind rómában. A de léciók esetenként csak az ös zmtDNS mennyiség néhány százalékában vannak j elen és régiótól függően változnak. Álta lában a deléció menny isége növekszik az é letkor e l őreha l adtáva l. Az is előfordulh at. hogy valamely, a mitokondri ális genom stabilitásáb an fonto nukleárisan kódo lt gén károsodása destabilizálja a mitokondri ális gcnomot, a mibő l zámos deléció alakulhat ki . Ugyanakko r a betegség a nukleáris genomra jellemző módon örökl ődik.

O A mtDNS m enny iségén ek változását okozó mutációk. A mtDNS kópia számának változása i okozhat súlyos károsodást. Ezt fi gyelték meg halálos újszü lötti respirációs szindrómáb an. Előfordult olyan eset i , amikor a betegben az mtDNS menny isége a normálérté k 2%-át éri c ak el. Ilyen j ell egű mtDNS-csö kkenést figyeltek meg o lyan AZT-kezelt betegekben i , akiknél myopathia a lakult ki.

614

>H»>»>>>>>»»»>»»>»>I>»»>))m>m>>»>m>l>m»»»

SZ ERVEK, SZERVR ENDSZE REK M ÜKÖDÉS ÉN EK BIOKÉM IAI ALAPJA l

A mitokondrium oxidatív károsodása , öregedés A sejtekbe n nom1áli s müködés közepette is megje lenne k reaktív oxigéns zármazé kok (ROS) (6-65. ábra) és nitrogén intermedierek (NO é peroxinitrit, amely a NO é a szupero xid kölcsön hatása során alakul ki), ame lyek nagyobb mcnnyiségben (oxidatív stressz) oxidálják a sej talkotórészeket, be leértve a DNS molekul ákat is. A nukleáris genom igen j ó DNS kijavító rend zere nagymértékben képes csökken teni a DNS-ká rosodás t, de a lényege sen kevésbé aktív mitokondriá lis DNS kij avító rendsze r nem képes teljesen korrigá lru az mtDNS- ben bekövetkezett oxidatív károsod ásokat. Ezért az mtDNS-ben sokka l nagyobb a mutációk el ő fordulása, mint a nukleári s genomban. Azonba n a mitokondriális mutáció k számána k megnöv ekedése maga után vonja a genomban történ ő deléciók kia lakulásá t. Ennek megfelelően ismert, hogy 35 éves kor után gyakran mérhető mennyis égben megjele nnek az ún. közönsé ge 3,6-kb és 5-kb deléciók, mclyek mennyis ége az életkor el őreha ladtával növeksz ik. Ebbő l követke zően a kor előrehaladtáva l a mtDNS által érintett respirác iós komplex ek aktivitás a csökken . Ugyanilyen logika szerint azon személyekné l, akiknek már örökölt mtDNS -károsod ása van (tehát alacsonyabb, de még nem kórosan alacsony a respirációs komplex ek aktivitás a), a koruk e lőrehal adtával súlyosbod ik a helyzet, és a nagy energi aigényű szövetekbc n a kóros folyama tok indulnak el (6-66. ábra). Hasonló képpen különbö ző okok álta l kiváltott oxidatív tressze lindíthat - különös en a nagy energ ia igényű szövete kben (idegsej te k, szívizom ) - mtDNS-károsod ást, amely kóros funkció kat eredményezhet A neurono kban az oxidatív stressz me llett a nagyfokú g lutamát fel zabadul ás által okozott tartósan magas ka lc iumkoncentráció is a mtDNS károsodá ához vezethe t, és így a rnitokondriá l is energiatermelés részlege s károsad ását okozhatja. Ezen részlege s energ iadefi cit vezethe t bizonyo s neurono k kipusztulásához, különös en olyan esetekben, ami kor egyes sej tek egyéb károsad á nak is ki vannak téve. Az ilyen jellegű j árulékos mtDNS károsod ás j ell emző a Pakinso n-kórra, amyotro picus lateralsclerosisra (ALS), a Hunting ton-kórra és Alzheimc r-kórra. Ezen betegség ekre jell emző,

hogy az e l sődleges problém a nem mitokondriális, ugyanakkor mindegy ik esetben fokozott ROStermelés történik kül önböző típusú neurono kban és a fokozott ROS tennelé az érintett idegsej tekben a mtDNA károsadását induká lja, amely később energ iadefekt ust és sejtpu ztulást okoz. Így végül is a kiindulási októl ftiggetle nül az érintett sejtcsoportok pusztulá sát a mitokondriáli genom nagyfokú károsodása okozza. Ehhez tartozik még az a megfigy elés is, hogy a mtDNS részlege s károodása megnöv eli a mitoko ndriális ROS-ter melé t, amely további mtDNS -károsodást eredményez.

o

50

100

életkor (év)

egészséges

(/) 100 :E .ü ro a.

J!1 ~ro 50

r---- --beteg lá!Qpll:@ - - - -

-o

·x o

o

50

100

életkor (év) ~

-

sérült mtDNS oxidatív kapacitás

l

6-66. ábra. Az öregedés hatása a mitokond riális genom állapotár a és a mitokond riális energiate rmelésre

'IITOKONORIÁLIS BETEGSÉGEK

Ezé1t egy kezdeti károsodás, egy fokozort ROS-termelés ~ mtDNS károsodás ~ további ROS- termelés ~ további károsodás pusztító ciklusába hajthatja a mitokondriumot, amely fo lyamat végülis sejthalálhoz vezet. Az, hogy a fenti elképzelés tényleg igaz, szépen igazolható egy Komplex T inhibitorral ( 1-metil-4-fenil-1 ,2,3,6tetrahidropiridinnel), amely megnöveli a mitokondriális ROS termelést, és á llatmodel lekbcn clpusztítja a sub tantia nigra neuronjait és Parkinson-kór jellegű tüneteket okoz. Az életkor előrehaladtával megjelenő növekvő mennyiségű mitokondriális mutációk és az ezeket követő mtD S-deléciók csökkentik a mitokondrium oxidatív cnergiatermelését. de ugyanakkor a romló minö égü mitokondriális genomban képző­ dő polipeptidek - melyek a respirációs komplexek komponensei - megnövelik a ROS-termelést. A ROS-t az antioxidáns enzimek és anyagok nem képesek a normális sz inten tartani, így ezek mennyisége megnő, és káros lipidperoxidációt, valamint fehérjék oxidációját okozhatja, ami az apalipoprotein B oxidációján keresztül hozzájárulhat az időskori arteriosclerosis kialakulásához is. Ha ontóképpen az mtDNS fokozort oxidatív káro adá a cardiomyopathia kialaku lá ához vezethet é szerepet játszhat a nem inzulinfüggö diabetes mellitus tüneteinek úlyosbodásában és a velejáró vaszkulári komplikációk kialakulásában.

Terápiás

lehetőségek

Az egyik felmerül t terápiá lehető ég a re pirációs lánc aktivitásának a növclé c, így az A TPprodukció növelése. Számos anyag került kipróbá lásra, így pl. ubikinon, fi lokinon, menadion, szukcinát, aszkorhát és riboflavin, melyek részt vehetnek az e lektronszállításban vagy stabi lizá lhatják a respirációs komplexeket, estleg antioxidáns hatásúak. Voltak ugyan kedvező e redmények, de igazi áttörést a fen ti anyagokkal kapcsolatos vizsgálatok nem igazán eredményeztek. További próbálkozás volt aceti l-kam itin adá a, mely állatkísérletekben mér ékelte a korfuggö kardiolipin zintcsökkené t és javította a mitokondriáli energiatermelést Hasonlóképpen egyéb antioxidánok (E-vitamin, C-vitamin stb.) adásával i voltak probálkozások, melyekben több kísérleti rend zcrben bizonyultak előnyösnek, de igazán meggyőzö humán terápiára még várni kell. Ugyanakkor az eddigi vizsgá latok messzemenően jelzik a mitokondriális genom károsodásának jelentöségét nagyszámú betegség kialakulásában és a nem mitokondriális betegségek korfüggő súlyo bodá ában. Jelzik továbbá azt is, hogy a mitokondriális respirációs rend zerből felszabaduló reaktív oxigén specicszek átalakítása - scmlege ítésc, a reaktív oxigén pecieszek - antioxidáns anyagok egyen úlyának fenntartása a különbözö zövctek ho zú távú fenntartásához elengedhetetlenül zükséges.

Ajánlott irodalom

Principles of Biochemistry, Lcninger, A.L.. Nelson, D.L. and Cox, M.M. Worth Publisher, Inc. ew York. 1993. Wallace, D.C. Discasesof the mitochondrial DNA. Annu. Rev. Biochem. 61, l 175- 1212 ( 1992) Lufi. R. The development of mitochondrial medicine. Biochcm. Biphys. Acta 127 1, 1-6 ( 1995).

A klinikai laboratóriumi diagnosztika biokémiai háttere

.7.

Dux László

A klinikai laboratóriumi diagnosztika célja, feladata A klinika i laboratóriumi diagnosztika az in vitro diagnosztika ága it fogla lja magába. Ezek a klinika i kémia/klinikai biokémia, hematológia/hemo sztazeológia, mikrobio lógia. Ezen tcrületeken a viz gálatok elvégzé e nem igény li a vizsgált személy fiz ika i jclenlété t, c a k valamilyen testfolyadék vagy excretum minta biztosítá át. A klinikai laboratóriumi vizsgálatok célja betegég gyanúja csetén a diagnózis felállítása, pontosítása, már diagnosztizá lt betegen a folyamat progre z iój ának, prognózisának követése, az alkalmazott terápia hatékony ágának é /vagy me llékh atása inak e ll e nőrzése. Külön csoportot képeznek az egészséges egyéneken elvégzett vizsgálatok, melyck célja normá l- (re ferenc ia-) érték megállapítáa vagy szűré lehet.

A laboratóriumi diagnosztika, mint az szervezetek áramlási egyensúlyának nyomon követése

élő

Az é l ő szervezct áramlási egyensúlyban l évő, ny itott tern1odi namikai rendszer, melynek rendezettsége nagyobb a környezet rendezettségéné l, így annak fenntartása á llandó energiabefektetést igényel. Kémiai összetételét és fe lépítését viszonylag szűk koncentrációtartom ányon belül képes állandó z inten tartani, szabályozó rend zere inek m ű ködé e következtében. Ez a szabályozás az áramlási egyensúly állapotát a környezeti paramé-

terek változá ai ellenében is biztosítani tudja, amennyiben a szabályozó mechanizmu ok nem sérültek vagy a (k ü l ső, be l ső) környezet változáa inak mértéke nem halad meg egy kritikus szintet. A szabá lyozás lényege, hogy az adott kémiai paraméter szintjének változása kapcsolja ki vagy be az adott korrekc iós mechanizmust, így a kémiai ö szetevő k koncentrációjának ingadozá a elkerül hetetlen e le me a szabályozott rendszereknek. Erniatt egészséges egyénekben, a kémiai összetevők menny iségét nem egyetlen értékkel, hanem egy koncentrác iótartománnyal adhatjuk meg, amelyen belü l az ingadozások normáJi nak teki nth etők. Ezt a ávot nevezzük referencia- vagy normáltartománynak, zélcssége nagyban függ a vizsgálati minta eredetétől (pl. vizeletben általában sokkal zélesebb, mint vérplazmában), illetve a kémiai paraméter életm űködé ek szempontjából tekintett fontosságától. Egy kémiai paraméter normá ltarto mányon belül e ·ő vizsgála ti értéke arra nem ad info nnációt, hogy a zabá lyozási rendszer ka pacitá ának, tartalékainak milyen mértékü felha ználásával tudta a szervezet a normá lis sávba eső értéket biztositani. Ennek eldöntésére alka lmasak az ún. terheléses vagy provakációs próbák, tesztek, mclynek során az egyensú lyából ki mozdított rend zer homeosztázisának v is zaállását vizsgá lj uk. Fontos tudni, hogy a terhc léses próbák c ökkent szabályozóképesség esetén egészségkárosodá st, akár életveszélyt okozhatnak, így azok végzése csak arra teljesen fe lkészült helyen és ke llő körültek intés el megengedhető.

KLI'\I KA I LAllO RATÓRil \11 OIACNO SZTIKA BIOKf.:\11 l HÁ T TERF:

A kémiai paraméterek áram lási egyensúlyának elvesztése, a referenciatartományon kívül eső értékek biokémiai értelemben betegségnek vagy annak tünetének tek i n thetők. Egyes paraméterek jelentő. mértékű referenciatartományon kívül kerülése pl. kálium, oxigén, ion izált ka lcium, g lukÓ7 perceken belül az egé z é l ő szcrvczet áram lási egyensúlyának végleges felbom lásához, halálho7 vezetnek. Más paraméterek esetében e7 az időta rta m órákban mérhető. Vannak olyan paraméterek, pl. plazmafehérjék, lipidek melyek re ferenciatartomány on kivüli értékei közvetlenül nem fenyegetik a szervczet áramlás i egyensúlyát, de fo lyamatos mű kö­ dé i, strukturá lis zavarokat okozva rontják az egyén élctmin őségét és várható élettartamát is (vö. króniku beteg égek). A referenciatartomán yon kívül eső kémia i paraméterek mcsterségcs korrekc iój a az orvos lás célj a és fe ladata. Ezen mcstcrsége beavatkozások többsége ma nem 7abályozá , hanem vezérlés alapján lehetsége ek {pl. inzulin idő közönkénti adagolása diabetes me ll itusban). Ennek s ikeréhez az ingadozások időbeli üteme, iránya és mértéke előre tervezh ető ke ll , hogy legyen. Ennek bizonytalansága vc zélyezteti a terápia s ikerét. Haté konyágát javíthatja az adott paraméter (d iabetes mellitusban szérumglukóz) vagy va lame ly patobiokémiai jell egzetesség (d iabetes me llitusban a fchérjegli koziláció) mértékének folyamatos laboratóriumi kontrollja. Bioszenzorok fej lesztése és alka lmazása nagy segítséget jelenthet a terápiá beavatkozások vezérlés helyett va lódi szabályo7ái alapokra hc lyczésében. Ez jelen leg a biotechnológiai kutatások egyik izgalmas és ígéretes területe.

Normál-, referenciatartomány fogalma meghatározása A normá l- vagy referenciatartomány egy paraméter egész éges egyénekben megengedhető ingadozá a it fog la lja magában. Az ingadozá ok háttcrében az egyén biológia i ingadozásai. valamint a méréshez használt technikából e redő pontatlanságok egyaránt mcgta lál hatóak. Normá lis elo zlás esetén az egyes méré i eredmények az átlag körül i haranggörbét adnak. Konvcnc ioná lisan az átlaggal azonosnak. normálértéknek tekintjük a

±2SD közötti sávba eső eredményeket. Fontos tudni, hogy a Gauss-eloszlás függvénye alapján ez az összes mért érték 95%-a, így teljesen egé zséges egyéneken is az csetek 2,5%-ában ennél magasabb, 2,5%-ban enné l alacsonyabb értéket kapunk. Ez minden egyes vizsgá lt paraméterre külön-külön igaz, így az alábbi képlet alapján: (0, 95)"

Egy paraméter esetében 5%, két paraméter csetébe n l O%, négy paraméter esetében 19%, tíz paraméter esetében 40%, húsz paraméter esetébe n 64% az esélye annak, hogy legalább egy, a referenc iatartományon kívül eső eredményt kapunk te lje cn egészséges egyénen is. Ha ke ll ő körültekinté nélkül ezt a " kóros" laboreredményt kezelni kezdik, a referenciatartományon kívül eső paraméterek száma várhatóan em elkedni fog. Re ferenciaérték meghatározásánál fo ntos fi gyelembe venni, hogy a biokémia i paraméterek áramlási egyensúly szintje életkor, nem, genetika i háttér, táplálkozási, é letmódbe li szokások, környezeti tényező k á lta l i befolyá olt. A re fcrencia(normá l-) tartományok gyakran nagy számban e lérhető, ko rlátozott önálló ágú egyéneken kerültek meghatározásra, pl. katonák, rabok, orvosta nhall gatók, így kiterjeszté ük a teljes populációra óvatosságat igényel.

Káros laboratóriumi eredmények típusai A referenc iatartományon kívül e ő értékek megítélése kül önböző. A ±2SD tartományon kismértékbcn kív ül eső értékeket fi gye l em fe lkeltő vagy korai, enyhe tüneteknek tekinthetjük. Ilyenek észle lése esclén célszeri.í a mérés megi mé tlé e a mintavételi, preanalitika i e l őí ráso k pontos betartására fo kozott figye lmet fordítva. A j e l entősebb mértékben eltérő mérési eredményeket az adott paraméter áraml á i egyen úly i helyzetének zavaraként értéke lhetjük. Az analitikai szempontból kimutatható menny i égi különbségek orvo i megítélése eltérő lehet, így célszerű a mérőrendszer, mű zer megválasztá a orán az orvosi dönté hozata l szempontjából értékelh ető eltérések kimuta thatósági szintjét megcélozni. ( Pl. ésszerű tl en és gazdaságtalan század vagy ezred

l 618

»>>»>»>>»>»»»>H»>•>>»»mmm»»»>»»m»>»m

SZER EK, SZERVRENDSZEREK M . KÖOÉ ÉNE K BIOKÉM IAI ALAPJAI

millimólo e ltérések kimutatását végezni o lyan paraméterek esetén, ame lyeknél a klinika i döntésbeli különbség egész millimólokban megmutatkozó e ltérések esetén áll csak fenn). Külön kategóriaként kezelendöek az azonnali riasztást i gény lő, é letveszélyes állapotot j el ent ő eltérések. Ilyen e ltérések észle lése esetén, az esctleges mintavételi , ana litikai stb. hiba lehetőségé­ nek kizárása előtt, soron kívül értes íte ndő a beteget kezelő orvos vagy a mintaküldő szemé ly. Azonnali riasztá t i gényl ő értékeket mutat a 6-8. táb/á::al.

6-8. táblázat. Azonnali riasztást igénylő paraméterek

r

lámho sz stb. következtében, az össze e lvégzett mérést egyfo rmán érintő eltéréseket. Ennek mértéke lehet állandó vagy függhet a méJt paraméter koncentrációjától A random deviáció a véletlenszerűen bekövetkező hibá kat j e lenti, amely nem minden mérést é nem azonos méltékben érintenek. A mé rési eredményeket va lódiságuk (accuracy) és pontosságuk (precis ion) a lapján j e llemezzük. A valódiság az elmé leti, kon venc ionális valódi értékkel va ló megegyezés mértéke, a pontosság az egyes mérések eredményének reprodukálhatósága, valójában a Gau s-görbe szélességének megfelelő fogalom. Az ideáli mérési eredmény valódi és pontos. A valód iság eitéré ét szisztémás hibaforrások, a pontosság roml á át véletlen hibaforrások adj ák . A pontatlanságra, annak mértékére azonos m inta ismételt mérésével, a kapotl eredmények szórásának összehasonlításával kaphatunk információt. Jellemzésére alka lmas a variációs koefficiens (CV) mértéke, ami a tandard deviác ió és a mérési átlag há nyado a, zázalékban kifejezve.

Na•

<115 mmol/1

>160 mmol/1

K+

<2,5 mmol/1

>6,5 mmol/1

Ca2•

<1,5 mmol/1

>3,5 mmol/1

p

<0,3 mmol/1

Mg2•

<0,4 mmol/1

>1,5 mmol/1

cr

<80 mmol/1

>120 mmol/1

ev= s_o · IOO%

HC03.

<1 0 mmol/1

>40 mmol/1

x

Glukóz

<2,5 mmol/1

>35 mmol/1

Az ún . abszurd é1t ékek az élette l semmiképpen nem összeegyezteth ető, akár nagyságrendekkel eltérő eredmény észlelése súlyos preana litikai vagy posztanalitikai hiba bekövetkeztére utal, a telj es mintavételi mérési és adatköztési rend zer alapos e ll enőrzését igény li.

Laboratóriumi diagnosztikai eredmények hibái, értékelése Az eredmények valódisága, pontossága, véletlen és szisztémás hibák A klinikai laboratóriumi diagnosztikai mérések többsége kvantita tív vagy legalábbis szemikvantitatív alfa-numerikus eredményt szolgáltat. A mérési eredmény összetevői a konvencioná li valód i érték, amire rárakódnak a szisztérnás és a véletlen hibák. Szisztémá hibák közé soroljuk a rossz kalibráció, pontatlan adagoló, rosszu l beállított hul-

A variációs koeffic iens e lfogadható értéke laboratóriumi diagnoszti kában ionmérések esetében 1- 2%, kis molekulatömegü metabolitok meghatározásánál max imum 5%, enzimek, fehérjék mérésénél 10- 15% lehet. A mérés valódiságának e itéré e it a mérés megismétlésével nem lehet felismerni . A mérési eredmények valódiságának problémái (inaccuracy) súlyosan veszélyeztetik a laboratóriumi eredmények transzferábil itását, egye mérőrendszerek , metodikák, laboratóriumok között egy-egy országon belül és nemzetközi ös zeha onlításban egyaránt. Ez jel en tős többletkö ltségeket, a viz gálatok ismétclgetését, korábbi leletek értelmezési problémá it, multicenter tanu lmányok értékelh etőségének zavara it okozza.

Laboratóriumi diagnosztikai mérések kalibrálása, standardok típusai A mérési eredmények valódisági kérdésének megoldása megegyezik a re latív ská lán kapott mérési j e lek, eredmények, abszolút ská lára való

KLINIKAI LABORAT ÓRI UMI DIAGNO ZTIKA BIOK ÉMl l HÁTTERE

transzferá lásának megoldás ávaL Köznapi nyelven, ezt a folyamato t kalibrá lásnak nevezzük. A kalibrálás lényege, hogy kémiailag egyérte lműen defi niált, ismert koncentrá ciójú, nagy ti ztaságú oldatokon e lvégezve a mérést, a mérési j el változásait detektálju k. A mérendö mintán kapott j elet ezen ka librációs egycnesről/görbér ő lleo l vasva abszolút skálán kapjuk meg a mémi kívánt paraméter mennyisé gét. A kalibrálá ra ha ználható elsöfokú, primer randard anyagoka t köznapi gyakorla tban nem használják, azokat nem zeti, nemzetkö zi standardi zálási központo k á llítják e lő és tárolják. Ezek segítségével transzferá lják a mért érték valódiság át az ún. másodfok ú, szekunde r standardo kra, amit reagens-, m érőm űszergyá rtók, fejlesztö k haszná lnak munkáj uk során. A desztillá lt vizes alapanya gú primer és szekunder standard oldatok a mért érték valódiság ának beállítása szempon tjából kiválóak, ugyanakkor a klinikai laboratór iumi diagnosztikai m inták egy alapvető sajátságá t nem tudják reproduká lni . Ez az ún. mátrixhatás. A bio lógia i minták, testfolyad ékok, nem tisztán vizes olda to k, hanem nagyszám ú fehé1je, li pid, kismolekulájú metabolit, ion ko mplex rendszere . Ezen mátrix hatás jelenlétében számos mérési mód zer, kémiai detektá lási reakció a vizes oldatban megfigyelhetőtő l jel entős mértékben eltérően v iselkedik . Kóros minták esetében ezen m átrixhatás jellege, mértéke önmagáb an is sokféleké ppen változhat , pl. dia lizált beteg piazmájában egészen más mátrixha tást kapunk d ialíziskezelé s előtt, alatt és után. Fényelny elésen, fényszórá son a lapuló méréseke t a minta lipid-, lipoprote in-tartalmának változása i, színreakc ió n alapuló méréseke t icterus, hemo líz is okozta színváltozások zavarhatj ák. A mátrixha tás kiiktatásá nak egyszerű , ugyanakkor nem teljesen bizto nságos módja a mérési rendszer érzékeny ségi szintjéne k változtatá sa, köznapi nyelven lenullázá sa, a reakció terméket nem, c ak a mátrixhat ásokat hordozó, ún . vak pró ba segítségé vel. Ennek auto matikus elvégzése a jellzaj arány megengedhetetlen szintre való cltolódás át elfedheti. Az ún. tercier, harmadla gos standardo k vagy kalibráto rok a mátfixhatást is tartalmaz zák, valódi biológiai mintákbó l vagy ahhoz hasonló összetételben mesterség e cn állítják e l ő. A kémiai para-

))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))) )))))))))))

619

méterek va lódi értékét elsőd l eges standardo kból eredeztet ett, másodiag os standardo k segítségé vel határozza meg és garantá lja gyártójuk, forgalmazój uk. Ezen kalibráto rok egítségév cl történi k a labo rdiagnosztika i módszerek ka librálása. Fonto , hogy a legszéles ebb méréstarto mányú metodi kák esetében is a mért j el és a mérend ő anyag kencentráció közötti összefügg és csak egy adott tarto mányon belül lineáris. Efölö tt vagy ezalatt deviác ióval szám olhatunk. Emiatt nem szabad a kalibrác iós görbe/egy enes m ért po ntjain kivü li szakaszró l extrapolá cióval értéket leolvasni . Cél szerű a kalibrációt kórosan magas é kórosan alacsony konccntrációjú, ún. patológiá s kalibráto rra l is e lvégezni. Ennek hiányába n a túl magas konccntrá ciój ú analitet tartalmaz ó mintát kell hígítani , a kalibrációs görbérő l leolvasha tó értéket adó koncentrá ciótartomán yba, és a végső eredmény közlésko r a hígítás fokával megszorozni . A primer, kémia ilag tökéletcs en defi niá lt standard an yagok e l őá llítá a anorganik us ionok, kis m o l ekula tömegű mctaholitok esetében megoldo tt. Nehezebb a helyzet a makro molekulá k, fchétjék, lipoprote inek, nukle insavak tandardiz ációj ával és így laborató riumi diagnosz tika i m eghatároz ásaival kapcsolat ban, aho l a molekulá k genetikai polimo rfiz musa, a térszerke zetbeli, ko nfo rmációs izomérek e lőfordulása egészség es egyénekben is megnehezítik az eredmény ek valódiság ának megíté lését. T ovább nehezíti a helyzetet patológiá s minták esetében a betegségg el oki összefiigg ésbcn vagy másodlag osan kialaku ló poszttran szlációs jelenségek nagy szám a és vél etlen szerűen bekövetk ező eloszlása. Pl. oxidáló szabad gyökö k, nitrogén-mon oxid hatására beköve tkező módosulá sok, fehérjeglikáció s tb. Patológiá san módosíto tt primer makromo lekula standardo k elöállítá a és e lterjesztés e a patobioké mia, laborató riumi diagnosztika igen kun-ens kutatá / fejle ztési területe.

Külső minőségellenőrzés

a laboratóriumi diagnosztikában A laboratóriumi diagnoszti kai eredmény ek valódiságána k, az eredmény ek tran zferábilitásának biztosítás ára kiterjedt külsö minősége ll enőrzés i rendszere k alakultak , többnyire no n profit alapú, nemzeti vagy nem zetközi szakmai szcrvezetek ke-

620

)) ))))-)) ))) ))))) )) )) )))) )) )))) 1))) ) ) )))) )))) )) )) ) )l)))))))))))))

SZERVEK, SZERVRENDSZEK EK M Ű KÖI>ÉSI!:J EK BIOKÉMIAI AL PJAI

retében. A külső minösége llenőrzés során a laboratóriumok meghatároz ott időközökben ismeretlen mintákat kapnak, az analitikai mérések elvégzésére. A kapott eredménye ket kétféle elven étiékelik. Konszenzu s éttéken alapuló ellenőrzés esetében a v izsgálatban résztvevők eredménye it átlagolják és ehhez viszonyítjá k az egye résztvevők teljesítményét. Hátránya hogy kevés résztvevő és a rosszul mérők magas aránya esetén gyakran a legjobb laboratóriu mok érik el a legros zabb minős í­ tést. Emiatt, ahol erre mód van, ezt felvá ltotta a célétiéken a lapuló értékelési rendszer. Ennek lényege, hogy a minta összetételé t a rutin diagno ztikában használatos mód zerekné l és eszközökn él nagyságrendekkel érzékenyeb b, pomosabb é valódibb eredt11ényt szolgá ltató, ún. referens laboratóriumban meghatároz zák, ez lesz az ún. célét1é k. A körv iz gá lati telje ítménycket az egye laboratóriumokba n ehhez hasonlítják . A referens módszerek , technikák köre a technikai fejlődéssei fol yamatosan fejlődik, jelenleg referens médszeme k számít a laboratóriu mi diagnosztikában az atomabszo rpciós spektrometria, a HPLC, a gázkromato grá fiával összekötöt t tömegspektromet ria, a kapilláris e lektroforéz is.

A laboratóriumi diagnosztikai vizsgálatok fö fázisai A preanalít ikai fázis A laboratóriu mi diagno z tika i vizsgálatok at három fáz isra osztjuk. Ezek a preanalitika i, az analitikai és a posztanalit ikai fázis. Nem laboratóriumban dolgozó orvos, egészségügyi szakember számára legfonto abb a preana litikai fázis szempontjainak, követelmén yeinek ismerete és maradékta lan bctartá a vagy betartatása , tekintve hogy az ebben a fázisban e lkövetett hiba a laboratóriu mi , zemélyzet által csak nehezen vagy utólag feli sm erhető, és a mintát még a laboratóriu m ba érkezés e lőtt a" izsgálat e lvégzésére teljcsen a lkalmatlanná teheti. A minta, leggyakrab ban a vérpl azma vagy szérum nyerése megkövete li a vizsgá lt személy pontos e l őkész íté ét (éhgyomor ra, é lvezeti szerek, gyógyszere k fogyasztá át me llőzve). A vérvételi

hely nyomkuJ ása, préselésc, a vér erőte ljes szívása hcmo lízist okozhat, és/vagy a mintát szővetned­ vekke l keveri. A testhelyzet standardizá lása a mintavételek során fonto . Álló testhelyzetb en az alsó testfélben a hidrosztatik ai nyomá emelkedett volta miatt több folyadék lép ki a vérpályábó l és emiatt a legtöbb a nal it plazma/ szérum koncentrác iója 5 l 0%-kal maga abb é11ékct adhat, mint a fekvő egyénben levett mintában. Gyakori preanalitik a i hiba, hogy laboratóriumi vizsgálatra a vért olyan érszakaszró l nyerik, mclynck közelébe infúziót folyatnak be és annak e ikeveredése el őtt a kémia i paramétere ket akár ab zurd tartományb a tolhatja cl. Még súlyosabb hibaforrás magából az infúziós kanliiből nycm i laborviz gálathoz vérmintát. Az alakos e lemek és a p lazma vagy szérum gyors szakszerű zétválasLtá sa elengedhetetlen a pontos labordiagno sztikai eredménye k érdekében. Az alakos e lemek és a plazma együttes állása során kálium áramlik ki a scj tckből , így annak értéke téve cn magasabb lehet. Fontos figye lembe venni, hogy a vörösvértes tek g lukózt fogyasztana k, é ez a glukózfelvétel óránként l 0%-os zérumgluk óz zintcsökkenést eredménye z. Egészséges egyénben preanalitik ai hibából eredő látszólagos hypoglykacm ia könnyen azonosítha tó, viszont enyhén emelkedett vércukorsz intct a vörösvértes tek g lukóz fogyasLtása ismételten a normáltarto mányba csökkenthe ti, ami a kezdődő diabetes felismerését é időbe li kezclését veszélyezte ti . A g lukózszi nt-csökken é kivédésére nemjavallt a vénninta h üté c, még kevé bé annak fagyasztása. Hüté során c ökkenő anyagcsere -folyamato k, csökken ő A TP- z int a a K -pumpa c ökkent müködése miatt tévesen magas K -szintet kapunk. A. vvt-ck gondatla n megfagyas ztá a generalizált hemolízis révén jelentős K '-kiáram lás mellctt, az anaero b anyage ere miatt nagy meanyiség ben jelen l évő LDl l enzim kiáramlásá t is eredményezi. Egyérte lmű en javasolható a glikolíz ist gátló szert, á ltalában fluoridot tartalmazó vérvételi csövek haszná lata vércukorszint- meghatároz áshoz. [gen jól alka lmazhatók a szeparáló gélt tartalmazó primer vérvételi csövek. mclyekben centrifugá lás orán egy gélszerü anyag az a lakos elemek és a plazma/ zérum határfelüle tei köLé flotál és az analitek diffúz iójának gátlására órákig képes dugót a lkotni. T

KLI ' IKA I LA BORATÓ RI U ~I DI AGNOSZTIKA BIOK ÉM IAI HÁT T ER E

Fontos figyelem be venni egyes analitck , e l sősor­ ban a b ilirub in fényérzé kenység ét, így a kém iai vizsgála tra levett m intá kat fé n ytő l védve ke ll szállítani, tárolni .

Az analitik ai fázis lonmcg határoz ások. Az ana li tika i fázis biokémiai héttere eltérő az egyes viz gá lati tipusok, c oportok kőzőtt. Ionméré sek esetében fontosab b a preanalí tika i fázisban már említett hibafo rrások kizárása . Az e lérhető elektrokém ia i, lángfoto mctriás, enz imatikus, illetve atomabs zorpciós ion meghatá rozások elfogadh ató valódisá gú é ponto ságú eredmén yeket szolgáltatnak. Kis moleku latömeg íí metabolitok megh atározása. A kis molcku latőmegű metabolitok, g lukóz-, karbami d-, kreatinin -, bilirubin meghatá rozások klasszikus kémiai zínreakc iókon a lapuló mód zereit egyre több területen kezdik felvá ltani a drágább, de specifi kusabb enzimatikus módszerek. Ezek alkalma zása a rán a lapköve telmény, hogy az enzimatikus reakc ió cl őren dü kinetiká t kövessen, vagyis a reakció sebessé ge arányos legyen a szub ztrát (a meghatá rozandó analit) koncent rációjának el ső hatvány ával, azaz magáva l a koncent rációval, így megfel e l ő kalibrálás me llett az ana lit koncen trációj a az enzimre akció ebesség e alapján megadható. Diagnos ztikai enzimm ér ések. A diagnos ztikus célú enzimak tivitás-m érések során csekély kivételtől eltekintv e (pl. szérum- kolinészteráz) valójában nem a v izsgált enz im funkciój ára vagyunk kíváncsiak. Az enzimek et csak egyes szervck re. szövetek re többé vagy kevé bé specifi kus makromoleku láris indikáto roknak tekintjük. Megjele nésük, illetve megnöv ekedett aktivitás uk a testfo lyadéko kban az enz imet eredetile g tmt a lmazó szerv szövetk árosodá sára hívja fel a figyelm et. A károsadott sej tek ből kiáramló számos anyag közül az enzimek d iagnoszt ikus e l őnyét az adta, hogy j elenlétük, mennyis égük vá ltozása a testfolya déko kban viszony lag olcsó, cgyszeri í aktivitás mérésse l detektálh ató. A diagnos ztiku célú enzimak tivitá -mérése k e etében a m intában mérhető maximá lis ebesség re vagyunk kíváncsi ak, így a reakció nullad re nd ű

>>))))))))>»>>>>>>Ht>>>> nnnn >HJo>>)> >> >> >t>>>n>•• H,, ~HHH>

621

kinetikáj a fe ltétlen követelmény. Az ehhez szükséges szubsztrátfeles l egről nemcsak a méré · elején, ha nem annak végén is gondoskodni ke ll. Ez utóbbi gyakran gondot okozjel entő en emelkedett aktivitásó minták esetében , p l. akut pancrea titi ben az a lfa-am iláz-aktivitás méré ekor. Nagy mcnnyis égű szubsztrát hozzáad ása egyrészt j el entősen emeli a mérés költsége it, másrész t gyakran méré techn ikai zavarokat is okozhat fő l eg opti kai rendsze rekben. Cél szerűbb a mérés időtartam á t rövidíteni, ami e lsőso rban gyorsabb, érzékenyebb detektálási rendszert igényel, vagy az általáno san haszná lt módsze r a bio lógiai minta hígítá a révén a relatív szubsztrátfclesle g biztosítá a. Az egyes enz imek diagnos ztikus in formációértéke függ szerv-, szövetsp ecifitásuk mértékétő l. Ezen pecifitást je lentősen javítja, ha nem az enz im összakti vitását, hanem egyes izoform áinak e lkülöníte tt aktivitás át határozz uk meg. Ennek módsze rei kihaszná lják az e ltérő szubsztrátaffi nitás, specifitá , gátló zer, hőmérsé kl et vagy antitest-érzékenység et az egye izoform ák között. Az enz immolekula mére te, a lakja, ej ten belüli kompartmenta lizációja , struktúrához kötöttsé ge szintén be folyásolhatja a kiáramlá orrendjé t és mértéké t. A mennyis égi változás ok interprc tá lása, a kárcsod á súlyossá gáva l, kiterjedé sével összef üggésbe n azonban jelentős óvatoss ágat igényel. Figyelem be kell venni , hogy a károsodás körüli, ún. zéli izgalmi zónában kom penzá ló fokozott e nz imfehérj e-expres szió indul meg, ami a k iáramlá ra képe enzimmennyisé get megnöv el i. Igen súlyos kiterjed t k árosodá sban ez a fokozott szintézis e lmaradh at, ami enyhébb enzimak tivitá -emelke dést okoz. Egye szervek megbete gedéseiben, pl. vázizmo k, máj a korábba n emel kedett enzimak tivitás visszaté rése a normáltartomán yba nem szükégszerü en a gyógyul á jele. Okozha tja az ún. kiégett végstád ium elérése, amikor a káro odott zervben már nem szintetiz álódik elegend ő enzim a kiáraml ás fenntartá ára. Szív izomban ezen stád ium e lérése el őtt, a funkció csökkenés ered ménycként bekövetkezik a halál. A testnedv ekben mérhető enzimak tivitást a kiáramlás mértéke mellett az enzim aktív kon formác iós á llapotának e lvesztés e, fragmen tálódása , lebomlá sa, k iürülé e is befolyás olja. Emiatt egyre j o bban elterjed az enz immo lckulák katalitik us aktivitásának meghatá rozá a helyett, azok immunké-

622

ZERVEK, SZERVRE~DSZE REK M - KÖDÉ ÉN E K BIOKÉMIAI ALAPJAJ

m1a1 menny i égi meghatározása, ami az inaktív, limitált proteolízisen átesett, akti vitással már nem rende lkező molekulákat is detektálni tudja. Ezen immunkémiai e ljárások költségesebbek, technikailag nehezebbek, de megb ízhatóbb eredm ényt adnak é enzimaktiv itással nem rendelk ező mo lekulákat is diagno ztikus célra felhasználható vá tesznek (pl. Trop onin l, Troponin C, myoglobin). Toxikológiai, gyógyszerszint-ellenőrzés céljából végzett vizsgálatok. A tox iko lógia i, gyógyszerszint-monitoro zás céljait szolgá ló laboratóriumi v iz gálatok nagyré zt kis, közepes ma lekulatömegű molekulák minöségi és menny iségi k imutatására irányulnak. Klinikai diagnosztikai szempontból két e ltérő felhasználási területüket különböztetj ük meg. Az egyik a beteg, mérgezett szemé ly ellátá át, é letmentését egítő, gyor , egysze rűcn , kis technikai és e lméleti fe lkészültséggel, a nap 24 óráj ába n bármikor e l végezhető táj okozódó mérések. Ezek többny ire csak hatóanyag szerinti nagyobb c a portokat tudnak megkülö nböztetni vagy j elenlétüket kizárni a mintában. Elsőso rban betegellátási célzatúak, j ogi proced ú rákban az ilyen módszcrekke l, ilyen körülmények között nyert eredmények bizonyítékként nem haszná lhatóak fe l. Többny ire a gyógyszer-, méregmolekulák immunkémiai kimutatásán alapulnak. Más zempontok a lapján történnek az igazságügyi orvostani célzatú toxiko lógiai laboratórium i vizsgálatok. llyenkor az eredmény ana litika i pontos ága, megbízhatósága fontosabb a sürgős lele tközlésnél, illetve a 24 órás hozzáférhetőségné L Ilyen vizsgá latokat arra felkészült speciá li laboratóriumok végeznck. Az. a lka lmazott technikák e lsősorba n HPLC és gázkromatográfi ával kapcsolt tömegspektrometria. Az igazságügyi orvosta ni célú laboratóriumi vizsgá latok esetén fokozott fi gyelmet ke ll fordítani a mintavéte lre, a szemé ly és minta azonosítá ára, az esetlege szándé kos vagy véletlen kontaminációk kiküszöbölésére, az ún. ,,cha in o f custody" fe lügyeleti láncolat maradéktala n biztosítására. Enélkül j ogi szempontból érvényte len eredmények születhetnek mérgezés-, dopping-, kábítószer- stb. viz gálatok során, a mi a fe leslege költségek mell ett még kártérítés i elj árásoknak is kiteheti a labora tóriumot. Nukleinsav-diagn osztika. A nukle insav alapú laboratóriumi diagnosztika sokak véleménye sze-

rint a j övő diagnosztikáj a, ami fo kozatosan kiszorítja a hagyományos biokémiai diagnosztikai e ljárásoka t. A fej l ődés üteme ezen a tcrületen valóban figyelemre méltó. Az emberi genom project befejezése, valamint a DNS chip technológia ki fejle ztése l ehető éget ad egy egy mikrokártyán 30-40 OOO kí.il önböző c DNS primer rögzítésére és a vizsgált szem é lybő l nyert mRNS-mi ntávaJ való hibridizáltatásra. Az alkalmazott fi uore zcens detektálási rendszer percek a latt azonosítani tudj a a keresett mutáns vagy betegség kialakulására haj lamosító geneti kai konstellációt. Így a nukleinsav a lapú diagnosztika mára technika ilag csaknem korlátlannak tekinthető. Minden más diagnosztikus e ljárást kiszorító képességének megítélése mégis óvatosságat igényel. Tekintette l arra. hogy a genetikailag kódolt, betegségre haj lamosító konstellációk manifesztációja, különösen poligénes örö klődés esetén számos e~yéb tényez?, életmód, környezeti hatások fúggvcnye. Az 1smert betegségek háttcrében álló pathobiokém iai történések gyakran po zttranszlációs módo ítá ok eredményei, lásd fchérjeglikáció, nitroxiláció, oxidá ló szabad gyökök hatása, folding. unfo ld ing megváltozása, melyek genetikailag nem vagy csak közvetve kódolt fo lyamatoknak teki nthetőek. Ezért a nukleinsav a lapú diagnosztika aligha szorítja ki teljesen a funkciók végrehajtásáért é a struktúra fenntartásáért felel ő egyéb makromolekulák, fehérjék, g likoproteinek, lipoproteinek djagnosztikus célú viz gálatait. A nukleinsav alapú diagnosztika leh etősége in ek robbanás szcrü növekedése ugyanakkor fe lszínre hozta számos jogi, etika i korlát kérdését is. A néhány mikrogramm mRNS-ből , akár az egyén intrauterin életében leolvasott el őre kódolt élettörténet o lyan adathalmazt jelent, me lynek felelős­ ségteljes őrzése, felhasználása, interpretálása jelenleg meghaladja az egyének, a c aládok, a társadalom (betegbiztosítási, oktatá i, munká ltatói stb. rendszerek) fe lkészü ltségét.

A posztanalitikai fázis A klinikai laboratóriumi vizsgála tok harmadik, posztanalitika i fázisa során az analitikai fázisban kapott nyers mérési eredmények technikai, szakmai validálása, majd lc letté szerkesztése és ahol

KLINIKAI LABORATÓRIUMI DIAGNOSZTIKA BIOKÉMIAI HÁTTERE

csak mód van rá interpretálása történik. A technikai validálás során a mérőrendszer működőképes­ ségének, megbízhatóságának ellenőrzése, a kontrollm inták eredményeinek, a kalibráció, hígítás stb. helyességének ellenőrzése, megfelelő mértékegységek hozzárendelése történik. Ezt követi a szakmai validálás, az azonos személ ybő l származó különböző vizsgálati eredmények összevetése esetleg a rendelkezésre álló egyéb adatokka l, korábbi vizsgálatok eredményeivel, az alapvető biokémiai, patohiokémiai törvényszerűségekkel. Ezt a fázist plauzibilitási próbának is nevezik. A végleges, ellenőrzött, megfelelő informatikai keretekbe rendezett laboratóriumi eredmény a lelet, melyhez sziikség esetén biokémiai, patohiokémiai interpretáció is kapcsolódik. A lelet célszerű hasznosítása a diagnózis felállítása, pontosítása terápia ellen őr­ zése során, az újabb laboratóriumi vizsgálatok rendelése folyamatos elemző, értékelő munka eredménye kell, hogy legyen. R. Asher által, 1954-ben a Britisb Medical Bulletin-ben megfogalmazott öt kérdés, amelyet egy laboratóriwni vizsgálat kérése előtt fel kell tenni: O Miétt kérern ezt a vizsgálatot?

Milyen eredményre számítok? Ha a várt eredményt kapom, befolyásolja-e a diagnózist? O Hogyan befolyásolja a kétt vizsgálat a beteg kezelését? 0 Előnyére válik-e a vizsgálat elvégzése a betegemnek?

f)

€)

Ha az öt kérdés közüllegalább egyre nem tudunk határozott pozitív választ adn i, a vizsgálat kérésétől nyugodtan eltekinthetünk egyértelmű

Szűrővizsgálatok

Fontos és felelősségteljes terü lete a laboratóriumi diagnosztikának a szűrővizsgálatok kérdése, ahol egészséges vagy annak tartott egyedeken végzünk méréseket, betegségek korai felismerése, hajlam, veszélyeztetettség megállapítására. Ilyenkor

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

623

figyelembe kell venni a hatékony szűrővizsgálat­ ok, Egészségügyi Világszervezet által feláll ított követelményrendszerét 0 A szűrővizsgá lat legyen hatással a beteg é leté8 O

O

0

0

nek minőségére és/vagy időtartamára. A kiszűrt személyek számára álljon rendelkezésre megfelelő kezelés. A szűrés olyan személyekre irányuljon akiken a betegség tünetei még nem figyeibetőek meg (aszimptomás állapot). Az elérhető kezelés legyen hatékonyabb az aszimptornás állapotban, mint a tünetek kialakulása után. A szűrőv izsgálati e ljárás megfelelően standardizált legyen. A szű rés költségei legyenek arányban annak hatékonyságával, a kérdéses betegség gyakoriságávaL

A

fentiekből

kitünik, hogy az elterjedten végzett, közül igen kevés felel , meg ezen elő írásoknak , azok gyakran divat, publicitás, üzleti egyéb szempontokkal kontaminálódnak. A szürőv i zsgál atok értékelés során fontos a szű­ rési határérték (cutoff limit) he lyes megválasztása. Acutoff-érték emelése növeli az álnegatív (valójában pozitív, de negatív eredményt adó) egyének számát. (Feltéve, ha a paraméter emelkedése jelenti a kóros e lváltozást.) Acutoff-érték esőkken tése viszont az álpozitív (valójában egészséges, de a vizsgálaton pozitív eredményt adó) esetek számát emeli. fontos tudni, hogy szűrőv i zsgá l atokban az á lnegatív eredmények nagyobb gondot jelentenek mint az álpozitív eredmények. El őbbi ek valójában a szű rés értelmét kérdőjelezi k meg, az utóbbiak esetében a kiszűrt személyeket ismételt, nagyobb specifitású és érzékenységü vizsgálatnak vetik alá, pl. phenylketonuria gyanúja esetén a Guthrie-féle gyors teszttel kiszűrt újszülötteken aminosavanalizátorral vá lasztják szét a valódi és álpozitív eseteket Az álpozitívitás l ehetőségének figyelembevételével a szűrővizsgá lati eredmények interpretálásakor kellő óvatossággal, körültekintéssel kell e ljárni az érintett személy vagy családtagjai felé. népszerű szűrőp rogramok

Tárgymutató

A ABC fehérjék 437 abetalipoproteinacmia 189 abzim 22 ACAT 173 ACE 214 acetecetsav 165 acetii-CoA hiányos képződése 91 képződése pintvátból 8 1 mint elágazási pont 3 18 szerepe a g likolizisben J 18 transzportja 146 acetii-CoA-karboxiláz 147 acetil-enzim 540 aceti lkolin 537 inaktiválása 539 nikotinreceptora 456, 457 szintézise 537 acetilkol in-észteráz 539 acetil-neuraminsav 141 acetil-transzferáz 148 acidosis, tejsavas l 16 aci! caiTier protein (ACP) 148 acil-CoA:koleszterin-aciltranszferáz (ACA T) !73 acil-CoA-dehidrogenáz 160 elégtelen müködése 162 aci1-CoA-szintetáz l 54 acil-glieeridek 145 aci !transzfer 82 ACP 148 ACTI-f 21 l , 2 16 adaptív enzimrendszerek 3632 adrluktok 299 adcni lát 275 adenilát-cikláz 453, 460, 471 adenilát-kináz 118, 561 adeniloszukcinát-liáz 275 adeniloszukcinát-szintetáz 275 adenin 269

adenin-foszforibozil-transzferáz 276 adenozil-metionin 232, 540 ade nozin 609 adenozin-3'-foszfát-5'-foszfoszul fát 296 adenozin-dezamináz 285 hiánya 288 ade nozin-difoszfát (ADP) 76 adenozin-difoszfatáz 609 adenozin-foszfátok 59 adenozin-kináz 277 adenozin-trifoszfát (ATP) l 06, 11 8 adipociták 325 adipoe ita 146 ADP foszfori lációja 76 ADP/ATP ciklus 59, 60 adrean lin 132 adrená lis androgének 211 adrena lin 13 1, 258, 540 receptorai 543 adre nerg receptor 453, 455 adrenogenitalis szindróma 216 adrenokortikotrop honnon (ACTH) 2 11 , 547 aerob glikolizis l 04 affinitáskromatográfi a a fehé~jék elválasztására 20 agy anyagcseréje 324 szerepe az intermedier anyagcsere integrációjában 324 AIDS vírus 382 akceptor kontroll 77 a kciós potenciál 525, 526 akonitáz 85 aktin 7 aktínamicin D 367 aktiv hely 2 aktív szulfát 248 aktív kromatin 371 aktív transzport 431 má odlagos 431, 436 aktivált metilcikl us 232 akut fázis fehéJjék 225

626

>>>>>>>>>>>>>>»>>>>>>»>>»>>>>>>»>>»>>>>>>»>>>>»>>>>>>>>>>>>>>>>»>>»>>>>U>>>>>>>>>>>>>>n>>>>)>>>>>»>>»>>>>»>>»>>>>»>>»>>>>>>H»»>>>>>>»>>>>>>>>>>>>»

akut imennittens porphyrinuria 262 akut pancreatitis 224 akut transzfonnáció 383 alani n 3, 115, 246 a lanin-ami notranszferáz 43 alaninciklus l 15 ALAT 39 albumi n 6 alcaptonuria 258 aldózok 92 aldóz-reduktáz 124 aldoláz 106 aldoláz B 122 aldoszteron 211 szintézise 214 alfa 1-antitripszin 594 al fa~-antiplazmin 604 alfa 2-makroglobulin 596 alfa-adrene rg receptorok 544 alfa-am inosav 3 alfa-bungarotoxin 457 5- alfa-di hidrotesztoszteron 216 1-alfa-dihidroxi-kolekalci fero l 2 19 alfa-hélix 9 alfa-ketobutirát 239 alfa-ketoglutarát 86, 240 a l fa-ketoglutarát-dehidrogenáz 86 enzimkomplex 86 szabályozása 90 a lfa-krisztall in 136 a lfa-laktalbumin 126 alfa-li mit-dex trin I 00 a lfa-oxidáció 164 alka likus foszfatáz 43 aJkil-foszfátok 540 alkohol hatása a GABA-receptorra 536 mint energiabevitel 327 alkohol-dehidrogenáz l 08 alkoholizmus okozta májkárosodás 327 alkoholos erjedés l 08 allantoi n 285 all izin 570 allopurinol 288 allosztérikus konfonnációváltozás 37 allosztérikus aktivátor 37 allosztérikus enzimek 35, 36 allosztérikus inhibitor 37 a llosztérikus kölcsönhatások 3 l 5 allos7térikus kötőhely 37 alloxantin 288 a lmasav enz im l 5 l alternatív splicing 370 Alzheimer-kór 6 l 4 Ames-próba 352 amiláz 43, l 00 a milóz 98 amilopcktin 99 amilo-transzglikoziláz l 26

TÁRGY 1 TATÓ

aminoacil-tRNS-szinteláz 387. 388 aminocukrok 140 arnincdikarbonsav 6 a mino-hidrolázok 285 ami no-levulinát 261 a mino-levuli nát-szintá7 261 a minopterin 283, 284 aminosav(ak ) 3, 285 apoláros 3 aromás 3 átalakulásai 240 bázisos 6 ess7enciá lis 220 glukoplasztikus 246 katabolizmusa 240 ketoplasztikus 246 metabolizmus zavara 326 nem esszenc iá lis 232 neurotranszmiller 528, 532 oldallánc szcrinti csoportosítása 3 poláros 6 savas karakteru 6 szemiess7enc iá lis 220. 243 s7erkezcti tulajdonságok 3 táplálékból szánnazé 22 l transzportja 226 aminosav-anyagcsere 29 1 aminosav-oxidázok 240 a minosavsorrend 7 aminotranszferázok 23 1 ammónia 240, 326 eliminációja 24 1 AMP 275 AM PA- (a lfa-amino-3-hidroxi-5-meti 1-4-isoxazolpropionsav) recepto r 458, 533 AM PA/ka inát receptot 533 AM PA-receptorok 533 AM PA-s7elektív ioncsatorna 533 AM P-dezamináz 290 ampli fikáció 462 amyotro pieus la teralsclerosis 614 anaplcrotikus reakciók 90 anabolikus folyamatok 32 1 anabolizmus 56 anaerob metabolizmus l 04 anaemia B 1r vitamin-hiány okozta 296 hemolitikus l 40 anaerob g likolizis l 08 anaplerotikus reakció 15 1 Andersen-betegség 133 a ndrogének 2 l t androszténdion 21 l , 2 l 6, 218 A F215 A F-receptor 483 angiotenzin l 2 l 4 angiotenzin l l 132, 2 l 4 angiotenzin lll 2 l 4 angiotenzinkonvertáló enzim (ACE) 214

TÁRGYM TATÓ

)))))))))))})))))))))})))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))))))))))HH))H)))))))»)))))))))))))))))H)))I)))

angiotcnzinogén 2 14 annexinek 481 anomerek 94 anorganikus szul fát 248 antibiotikumok 394 antikodon 387 antimetabolitok 35 antionkogén 513 antiplazmin 604 antiport 431 antiprolifcratív hatás 490 antis7enz nuklein av 413 antitripszin 596 antitrombin 596 antivirális szerek 285 anyage ere integrációja patológiás állapotokban 325 intennedier 56 szabályozása 3 15, 320 anyage erezavar 325 APC-(aktivált protcin C-)rezisztencia 609 AP-endonukleáz 350 apoenzim 27 apoprotcin 184 apoprotein A-I 187 apoprotcin B-1 00 184, 185 apoprotein e-rr 184 apoprotein transzfer reakciók 184 apoproteinek 182 apopto i inducing factor 5 16 apoptótikus faktorok 515 apoptózis 348.374,514 apoptózis inhibitorok 518 apa transzfen-in 264 a rachidonsav 203, 422, 469, 579 felszabadulása 580 ioncsatorna 587 arginá7 243. 251 arginin 6, 243, 244, 25 1 argini noszukcinát-liáz 241 argini noszukcinát-szintctáz 24 1 aromás-aminosav-dekarboxi láz 540 aromás aminosav 3 arteriosclerosis 188 árva receptorok 499 arzenál glikolízis gát lá a l 06 ASAT 39 asziálg1ikoprotein 228 aszkorhát 540 aszkorbinsav (C-vitamin) 68, 3 12 a zparagi n 6, 235, 260 aszparagi náz 260 aszparagi nsav 6 aszpartát 235,260,279 transzporter l 12 a zpartát-transzkarbamiláz 279 a 7partát-aminotranszfcráz 43 asszociáció 449 as zociációs egyensúlyi konsta ns 450

ATP keletkezése l 06 szerepe a glikolízisben l J 8 ATP:citrát-liáz 147, 537 ATPáz F típusú 435 P típusú 435 V típusú 435 ATP-szintetáz 72 ATP-ADP transzloká7 77 A TP-hidrolízis 77 A TP-szintáz 7 1, 76 atrakti lozid 77 atrial natriuretic factor (A F) 483 atropin 539 attenuátor 365 AUG kodon 386 avidin 11 3 azaszerin 274 B B 1-vitamin 91 B 1rvitamin 9 1, 232,254,291 baktérium, lizogén 378 bakte riofágok 376 replikációja litikus úton 377 replikációja lizogé n úton 377 bakteriolízis 377 bakteriosztatikus hatás 394 barbiturátok hatása GABA jelenlétében 536 barna zsír zövet 77 Basedow-kór 260 bázissorrend 33 1 b el-2 518 b en7odiazepinek hatása GABA jelenlétében 536 beriberi kór 91 béta-adrenerg receptor 453, 544 béta-galaktozidáz l 00 béta-hidroxivajsav 165 béta-ketoacil-ACP-szintáz 148 béta-ketoacil-szintáz 148 béta-oxidáció 160 csökkenése 32 1 béta-picated sheet 9, ll béta-redőzött le mez 9, ll béta-tum l l bilirubin 265, 268 g lukuronsavas konjugációja 302 konjugációzava ra 326 konjugált 265 bi lirubin-di glukuronid 265 biliverdin 265 biliverdin-reduktáz 265 bioenergetika 55 biológiai oxidáció 68 biotin 90, 11 3. 147,232 biotranszfonnáció 297 bio lógiai jel e ntősége 307 e l őkészítő szakasza 299

627

628

>>>>>»>>>>>>m >»>>»>»»mm>»>mm»>>>»>mm>>>>>>>>>>» »>»>»»>m >>>m»>>>>>>>>» >>>»»>»>> >>>>>>>m>»»»>>>>»>>>m>»>>»»>H»»>>»>»>>

biotranszformáció (fol yt.) konjugációs szakasza 302 oxidációs folyamatai 299 szabályozása 305 biotranszformációs betegség 308 biotranszformációs enzi mek 307 aktivitása 308 2,3-biszfoszfogliccrát l 09 bronz-diabetes 268 bungarotoxin 457 butiril-kolin-észteráz 539 butirii-S-ACP 149

c. cs

Ca 1 431 , 435,440,441,444,44 5,446,467,469,470. 477, 480,481,540,580,58 7 intracelluláris 476, 477 Ca 2'/foszfolipid dependens protcin-kináz 469 Ca 1 -ioncsatornák 4-+ l Ca 1 -jelpálya 469, 473 Ca~ - kalmodulin dependens protein -kináz 467, 481 CAAT-box 367 CAD279 cAMP 471 hatása simaizomsejtekre 474 hatása szívi:lOmsejtekre 474 cAM P/Ca2 , 474 cAMP- CAP komplex 365 cAMP-akceptor fe hérje 365 cAMP-dependens protein-kináz l 18, 466, 467, 472 cAMP-ftiggö protcin-kináz 158, 526 cAMP-mediátorrcnds zer 471 cAMP-reszponzív elem 474 cancer procoagulans 593 Cap- képződés 367, 368 caspase 491 CAT 537 CBG 215 cD S 410 cD S-könyvtár 4 1O COP-kolin 197 ceramid 207 ccrebrozid 207 CFTR fehérje 438 cGMP482 cGMP-dependens protcin-kináz 467 cGMP-foszfodiésztcr áz 453, 484 cGMP-függö protein-kináz 483 cGMP-szint 484 chaperonok 16 cholelithiasis 180 choleratoxin 207, 437,461 ciklikus adcnozin-3',5'-monofoszfát lásd cAM P ciklikus guanozin-monofoszfá t lásd cGMP ciklikus nukleotid-foszfodiészterázok 471 ciklindependens kináz 509 ciklindependens protein-kinázok 347,469 ciklinek 347 cikloheximid 394

c ik looxigenáz 58 1 ci klooxigenáz-út 581 ciklosporin 471 c ink-proteázok 221, 223 cinkujj fehérjék 372 c irrhosis 326 c isz-elemek 367, 371 c i z-Golgi-kompartment 398 cisz-regulációs e lemek 362 cisztation 239 c isztationi n-liáz 239 cisztationin-szintáz 239 cisztein 6, 239. 248. 3 19 cisztein-a zpartát-proteáz 491 ci ztein-proteáz 593 c isztin 6 c isztronok 359 citidil-transzfcráz 198 citidin lebontása 288 citokinek 486, 573 jelpá lya rendszere 486 citokróm b5 153 , 299 citokróm c 76 c itokróm P450 299, 30 l citokróm P450-indukció 306 citokrómok 73 c itokróm-oxidáz 76 citokró3m-rcduktáz 75 citokróm-oxidáz 68, 69 c itoszkeletális rendszer 562 c itozin-arabinozid 284 c itrát 147 szerepe a g likolizisben 118 citrátcikl us 79, 232 anaplcrotikus reakciói 89 reakciói 85 szabályozása 89 tápanyag-katabolizm usban 88 citrát-szintáz 85, 89 allosztérikus szabályozói 89 allosztérikus szabályozói 89 citrullin 24 1, 245, 484 cr 525,536 COMT 543 congenitalis adrcna lis hyperplasia 2 16 consensus szekvencia 359, 367 corc enzim 358 core-glikolizáció 397 corc-hisztonok 343 Cori-ciklus 115, 323 cosmid 407 cöruloplazmin 6 C RE474 C REB 374,474 Crigler ajjar- zindróma 268, 308 c ro fehérje 3 79 eross-taik 465, 490 CTP 279 CTP keletkezése 282

TÁRGYM TATÓ

TÁ RGYMUTATÓ

)> )))) )))))))) )) )))))) )))))))))) )})))) )) )> )))))))))))))) )))))))))))>)) )))))) )))))))))) )))))))) ))))))))))))))))))))

CTP:foszfokolin-citidilil-transzfe ráz 197 CTP-szintetáz 279 cukoralkohol 96 Cushing-kór 325 cutoff-érték 623 C-vitamin (lá d még aszkorbinsav) 68, 3 12 mint e l ektronátv ivő rendszer 68 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator 438 csatorn ak épző ionofórok 439 csontszövet 570 csoportátvitel 56 csoportátviteli potenciál 56

o

.l

Drvitamin 2 J9 dehalogenáz 260 dehidrogená7ok 69 deléció 35 1, 352 denaturáló vegyületek 15 dense core vezikulák 532 depurini7áció 349, 352 derrnatán-s7ulfát 142, 578 lebontásá t katalizáló hidrolázok hiánya 142 de zaturáció 152, 153 de zaturáz 153 deszenziti7áció 455 heterológ 455 homológ 455 dezaminálódás 349 dezaminá7ok 285 dezmin 563 dezoxikólsav 178 dezoxi-monoszac haridok 97 dezoxi-nukleotidok lebontása 285 dezoxi-nukleozid-difoszfát 284 dczoxi-pirimidin- fotoliá7 349 dezoxi-ribonukle otidok 33 1 bioszintézisének S7abályozása 284 kelctkezé e 28 1 dezoxi-ribonukleozid-5'-trifoszfá t 336 dezoxi-timidilát 282 szintézise 283 DllP-receptor 443 diabetes mellitus 135 bronz 268 inzul inlliggő 325 diabeteses keteaeido is 165, 168 diacil-gliceridek 145 diacil-glicerol 468, 475, 482 diacil-glicerol-lipáz 580 dialízis fehérjék elválasztására 18 diallil-szul fid 30 l diarrhoea 436, 483 DIC 606 didezoxi-módszer 403 diffúzió 428 egyszerű 429 facilitá lt 429 lateráJi 425

)))) )))))))))))) )))))))))) )))) ))

»)>))))))))))))))))))

dig liceridek 145. 146,468 dihidrolipoil-red uktáz 87 di hidrofolát 232 dihidrofolát-reduktáz 232 dihidrolipoil-dch idrogenáz 82 dihidrolipoil-tra nszacetil<íz 8 1 dihidrolipoil-tra nszs7ukciniláz 86 dihidroorotát-de hidrogenáz 279 dihidroorotáz 279 dihidroorotsav 279 dihidropiridin 565 d ihidropirimidináz defektusa 290 dihidropiriminidáz 288 di hidropteridin-red uktáz 237 dihidrouracil 288 dihidroxi-aceton 92 dihidroxi-aceton-fos7fát 155 3,4-dihid roxi-fenilalanin (DOPA) 258 dikumarol 606 dimerizáció 349 dimetil-adenin 269 dimetil-all iipirofoszfát 169 2,4-dinitrofenol 77 d ioxigená7ok 70 d ioxi n 306 d ipalmi toil-lecitin 196 dipeptid 7 d iphtheria exotoxin 394 direkt bilirubin 265 d is7acharidázok l 00 diszacharidok 92, 97 disszeminált intravascularis coagulopathia 606 disszociáció 449 disszociációs konstans 450 disztrofin 564 dnaB-fehérjc 339 dnaC fehérje 339 DNázok 5 17 DNS 17,355, 400, 40 1 A-formája 335 bázisszekvenciájának vizsgálata 402, 403 B-formája 33 1 C-formája 335 eukarióta sejtekben 343 extranukleáris 34 7 károsodásainak javítása 348 kés l ekedő 339 miLOkondriáli 348, 6 13 olvadáspontja 335 rekombináns 405 relaxált 335 replikációja eukariótákban 344 replikációja prokariótákban 336 specifikus kémiai hasítása 403 szerke7ete 33 1 topológiai izomér 336 vektor 405 Z-formája 335

629

630

)) )))))) )))))))))))) )))) )))))))))))) )) )))))) )))))))))))))))) )) )) )))) )) )) )))) )) )))))) )) )))))))) )))))) )))) )))))))))))))))))))))))))))))))))) )))))))))) ))))))))))))))))))))

D S-chip41 5 D S-dependens D S-polimerázok 336 DNS-dependens RNS-po limerázok 358, 366 DNS-genommal rend e l kező virusok 379 DNS-giráz 336, 339 D S-hez kötődö fehérjék 3 72 D $-károsodások 348 D S-I igáz 338, 34 1, 349, 40 l, 350 eukarióta 344 D S-polimeráz 336. 349, 350, 403 e ukarióta 344 DNS-szintézis 27 1 D S-topoizomerázok 336 D S-virusok, transzformáló 379 dokkoló fehérje 396 dolikol-foszfát 397 dolikol-pirofoszfát 397 L-OOPA 258,540 DOPA-dekarboxiláz 540 dopamin 258, 540 dopamin-béta-hídroxiláz 540 dopaminreceptorok 544 down-reguláció 455, 469 dTMP 282 Dubin- Johnson-szindróma 268, 308 Duchenne-betegség 564 durva endoplazmás retikulum 395 dystrophia musculorum progressiva 564 dystrophin 564 dystrophin asszociált glikoprotei n komplex 565

l EF-G elongációs faktor 392 EF-Ts elongációs faktor 392 EG F 486 EGF-receptor 482, 486 egyszerű diffúzió 429 Ehler - Danlos-szi ndróma 572 éhezés 320, 321 éhezé i hypoglykacmia 327 eiF2 393 eikozanoidok 145, 579 biológiai hatásai 584 receptorai 587 eikozapenlaénsav 579 eikozatetraénsav 579 eikozatriénsav 579 ekto-ATPáz 543 elágazási pontok intermedier anyagcserében 3 16 elasztáz 223, 227 pancreas 575 ela ztin 6, 566, 573 degradációja 575 flexibilitása 574 elektrokémiai potenciál 43 l elektrontranszfer 63, 68 kalalizáló enzimei 69 elhízás 325 elongáció 152, 360, 390

TÁRGYM TATÓ

clongációs faktorok 390, 392 eukarióta 393 elsőd leges transzkriptum 366 e mésztés l 00 emlékezés, glutamát szerepe 534 emphysema 225 emzymopathia 42 encefalinok 548 cndergonikus reakció 56 endonukleáz 349, 40 l cndonukleáz-metiláz 400 endoplazmás retikulum 395, 444 endorfinok 547. 548 endothel-derived relaxing factor 486 endothelium szerepe a véralvadási folyamatokban 607 tromborczisztens tulajdonságai 609 endotoxin shock 486 energiaraktárak 320 energiatöltés 6 1 energ iatranszdukció 77 energ iatranszformáció 55 enhanccr 37 1 cnhancer DNS-szakasz 367 cnoil-CoA-hidratáz 164 enoláz 107 enterális proteázok 223 cnteropeptidáz 223 entrópia effektus 26 enzimaktivitás gátlása 34 szabályozása 35 enzi matikus katalízis 6 enzimek 6, 2 1 aktivitása 33 allosztérikus 35, 36 emésztésben részt vevök l Ol fajlagos akti vitása 33 immobilizált 43 karbarnoil 540 konccntációemelkedése a vé rplazmában 43 mcnnyiségének szabályozása 3 15 osztályai 26 speci fíci tása 23 e n7imindukció 306 enzimgátlás, kompetitiv 35 cnzirn- szubsztrát komplex 22, 30 enzymc-linked immunosorbent assay 43 epe 178 epesavak 172, 175, 190 enterohepatikus körforgása 178 másodiagos 178 epe zckréció 32 1 epidermális növekedési fakto r (EGF) 486 epilepsia, glutamát szerepe 535 epimcráz 163 e pimerek 93 epi thelsejtek transzporterei l 02 ep0xigenáz-út 58 1, 587

TÁRGYMUTATÓ

)) )))) )) )) )))))) )))))))))))))))))) )))))))))))))))))))))))) )) )) )))))) )) )))))) )))))) )) )))))))) )))) )))))))))))))))))) )))) )))))))))) )) )) )) )))))) )))))))))) )))))))) ))))))))))

eritróz-4-foszfát 137 eritromicin 394 esszenciális aminosavak 220 esszenciális fructosuria 124 esszenciális zsiravak 145 etanol mctabolizmusa 327 eukarióta gén 366 eukarióta kromoszóma 343 eukarióta mRNS 389 eukarióta riboszóma 389 E-vitamin 3 12 exchange fehérjék 392 excitátoros posztszinaptikus potenciál 534 exergonikus reakció 56 exocitózis 481 exon 366 exonukleáz 336 exotoxin 394 expressziós rendszerek 41 l expressziós vektorok 41 O extenziós peptidek 57 1 extracelluláris jelek 449 exrracelluláris jelre rcgulálódó protein-kináz (ERK) 489 extracelluláris matrix 566, 578 extracelluláris receptor 449 extranukleáris DNS 347 F

F plazmid 341 F típusú ATPáz 435 facilitált diffúzió 429, 436 FAO 64.82 fajlagos aktivitás 33 familiaris hypercholesterinaemiák 187 fázisátalakulási hőmérséklet 425 feedback enzimgátlás 39 fehérjeszintézis mitokondriumokban 399 fehérjék 6, 566 biológiai funkciók 6 Ca2+ 481 cserél ő 489 denaturációja 12, 14 DNS-hez kötődö 372 dokkoló 396 elsődleges szerke7ete 7 emésztése 221 emésztése bélben 223 emésztése gyomorban 223 endogén, lebontása 227 feltekeredése 15 fúziós 411 foszforilálódása 397 G 444 hannadiagos szerkezet 12 heteretrimer GTP-kötő 459 hősh oc k 397 integráns 425 ionos karakter 13 izoelektromos pont 13

fehérjék (folyt.) izolálás 17 kapcsoló 488 ligand affinitás alapjántörténő elválasztás 17 másoellagos szerkczet 9 rnérete szerinti elválasztá 17 molekuláris chaperonok 397 multienzim komplex 14 natí v állapot 14 natív állapot kialakulása 15 negyedleges szerkezet 14 oldékonyság 17 perifériás 425 raktárak 320 rep 340 riboszóma 366 sejtorganellumokba irányítása 394 szerkezete 7 szerkezetét megismerő metodikák 17 szupramolekulásris struktúra 14 töltéstől fiiggő szeparálás 17 zsír avas acil eződése 397 fehérjeemésztő enz imek ak tivitásának szabályozása 223 fchérjefoszfori Jáció közvetlen 464 reverzibilis 464 felszívódás l Ol fém-proteáz 573 feni lalania 235, 254 anyagcserezavarok 258 fenil-alani n 3 feni lalanin-hidroxiláz 235, 258 feniletanolarnin-N-metil-transzferáz 540 fenilketontestek 258 fény érzékelése a retinapálcikákban 484 ferritin 6 ferrokelatá7 26 1 feszültség függő ioncsatornák 526 feszültség fiiggő Ca2·-csatornák 441 fcszültség fiiggő ioncsatornák 439 fesziiltségftiggő Na+-csatornák 525 FFA 321 FGF 486 fíbrilláris aktin 551 fibrin 603 keletkezé c 590 fibrin monomerek 590 fibrinaggregátum 589 fibrinogén 589, 590 fibri nolízis 589 fibrinolitikus rendszer aktiválódása 609 fibrinolízis 60 l fíbrinopeptid 590 fibrinpolimerizáció 590 fibrinstabilizáció 590 tibroblaszt növekedési faktor (FG F) 486 fibroblasztok 57 1 fibroin 566 fibronektin 566, 576

..

631

632

)) )) )))) ))))))»)))))))) )) )) )))))) >))))) )))) )))) )))) )) )) )))) )))) )))))))) )))))))))) )) )))) )))))))) )))))>)))))) )))))))))))) )))))) )) )))) )))) )))))))) )))))))) )))) )))))) )))) ))

titá nsav 164 fiziológiás icte rus 268 fi ziológiás ketos is 168 fizos7tigmin 540 flav in-adenin-dinukleotid (FAO) 64, 82 Oavin-mononukleotid (FM ) 64, 240 fiav in-oxidázok 3 1 l flavoprotein dehidrogenázok 69 Oavoproteinek 73 flexibilitás 574 flip-flop mozgás 425 fluiditás 425 fluid-mosaic me mbránmodc ll 425 5-fluorouracil 282, 285 timidilát-szintáz gátl ása 283 FM 64,240 folátcsapda 29 1 folliculusstimuláló hormon (FSH) 2 11 folsav 232. 284 hiánya 232 forboi-észterek 4 69, 494 fonnilkinurenin 248 fonnil-metionin 396 forward funkció 490 fos 493 fos fché1jc 374 foszfatidil etanolamin 194, 422 szintézise 20 l fo zfatidiletanolamin- -mctil-transzferáz 198 foszfatidilgliccrol 194 foszfatidil inozi tol 194, 422, 426 szintézise 20 l fo. zfatidilinozitol jelpálya 539, 544. 54 6 foszfatidi l inozitol-4,5-biszfoszfát 20 l. 4 75 foszfatidilinozitolokra specifikus e nzim 4 75 foszfatidilkolin 194, 4 22, 482 szintézise 196 foszfatidilszerin 194, 422 szintézise 20 l foszfatid av l 57, 193 foszfatidsav-foszfatáz l 57, 200 3-foszfo-adenozin-5-foszfoszul fát (PAPS) 303 foszfolipidek 423 foszfoeno lpiruvát 11 4 foszfocno lpiru vát-karboxikináz 9 1, 11 3, 114 foszfofruktokináz 324, 474 foszfo fruktokináz I l 06, l 12, 11 7 foszfo fruktokináz ll l 06, 11 9 toszfogiicerát-kináz l 06 foszfog liccrát-mutáz l 06 foszfogliceridck 422 fo zfoglukóz-izomeráz l 06 foszfoglukomutáz 126 6-foszfoglukonát-dehidrogenáz 137 6-foszfoglukono-delta- lakton 136 fosz fohexóz-izomeráz l 06 foszfokrcatin 324 foszfolambá n 472, 474 loszfolamba n 443

TÁRGYM TATÓ

foszfolipáz A2 580 foszfolipáz C 453, 475, 580 foszfolipáz C (PLC ) 475 foszfolipid k ettős réteg 424 foszfolipidek 193, 422 mozgásai a membránokban 424 4 -foszfopantetein 148 foszfopentóz-epirneráz 13 7 foszfopentóz-izomeráz 137 foszfoprotein-foszfatázok 41, 129, 130, 133, 464, 470 csoportosítása 470 szcrin/ trconin 470 tirozin 4 7 1 5-foszforibozil-1-amin 272 5-foszforibozil-1-pirofoszfá t (PRPP) 272 5'-foszforibozil-aminoimidazol-szi ntetáz 275 5'-foszforibozil-amino imidazol- 7uk cinokarboxamidszintetáz 275 foszforiláció 129, 397 sz ubsztrá tszintű 61 , 87, l 06 foszto riláció-defoszforiláció 40 foszforilációs kaszkádok 4 1. 466 foszforilációs potenciál 60 foszforiláz-a- foszfatáz 130 foszforiláz b-kináz 130 foszforiláz-kináz 130 loszforiltranszfer 59, 76. 87 toszforolízis 128 fosLfotran zferázok 27 frameshi fi mutáció 35 l free fatty acid l 58, 189 fructosuria, cs zenciális 124 D-fruktóz93, 122 mctabolizmusa 122 transzportja l Ol fruktó7- l .6-biszfoszfa táz l 14 fruktóz- 1-foszfát-aldo láz 122 fruktóz-2,6-biszfoszfá t l 19 fruktóz-2,6-biszfoszfá t 120 fruktóz-6-foszfát 137 fruktózintole rancia 122 fruktokináz 122 FSH 2 11 fumaráz 87 fura nó7 93 fúziós fe hérjék 41 1

C , GY G fe hérjék 444 gátlás 456 gén. riporte r 41 2 génamplifikáció 374 géne k kiütésc 34 8 génkö nyvtár 406 génsebészet 40 l G2-fázis 34 5, 460 GA BA 250, 525, 535, 536 szinLéLisc 535 GA BA A-receptor 458

TÁRGYMUTAT Ó

)) )))))) )) )) )))) )))))))))))))))) )))))))))) )))) )))) )) )>)) )))))) »)))))) )))) )))l»)))))))))))))))))))))))))}))))))))))))))))))))))))) ))))))) l)))))))))))))))))))))))))))))

GABAerg neuronok 536 GABA-shunt 535 galactosaemia 124 galactosuria 124 galaktózamin 14 1 galaktóz 124 metabolizmusa 124 galaktóz-1-foszfát-uridil-transzfe ráz 124 galaktózamin 142 galaklitol 124 galaktocerebrozid 207 galaktoki náz 124 galaktozidáz l 00 galaktozil-transzferáz 126 gamma-aminobutirát gamma-aminobutirát (GABA) 250, 525, 535, 536 gamma-ami novajsav 535 receptora 456 gamma-glutamil-ciklus 227 gamma-karboxiglutami nát 592 gamma-karboxil-glutaminsav szintézise 606 gangliozidok 207 gap 349 GAP-fehérje 487 gasztrin 223 Gaucher-kór 2 10 GC-box 367 gélelektroforézis 17 gél szűrés 18 gentamicin 394 geranil-pirofoszfát 169 G-fehérjéhez kapcsolódó receptor-kinázok 455 G-fehétjéhez kapcsolódó receptorok 532, 533 G-fehétjék 452, 459, 460, 587 csoportosítása 460 G-fehérjé khez kapcsolódó receptorok 536 Gilbert-kór 308 Gilbert-szindróma 268 glicerin 322 glicerin-3-foszfát 155 glicerinaldehid 92 glicerin-foszfát-deh idrogenáz l 09 glicerin-ki náz 155, 325 glicerofoszfatidok 422 glicerol-foszfát-dehidrogenáz 75 glicin 3, 237, 246, 456, 525, 535, 567 glicinreceptor 458 glicin-szintáz 239, 246 glicin-transzamináz 239 glikán 426 glikoforin 425 glikogén 98, 99, 126 anyagcsere-szabályozása 129 izomban 323 lebontása 128 máj 320 metabolizmusa izomban 129 metabolizmusa májban 13 1 glikogén-foszforiláz 128, 129, 130, 133

glikogén-foszforiláz-kináz 469 g likogénmobilizálás 481 g li kogén-szintáz 126, 129, 133 g li kogénszintézis 126, 317 g likogéntárolási betegségek 133 g likogenezis 92, 32 1 g likogenin 126 glikogcnolízis 92, 322, 323 glikolizis 6 1, 91 , 92, l 03, 157, 232, 3 17, 323 A TP szerepe l 18 ar.:enát, gátlása l 06 energiamérlege l 08 hormonális szabályozá a l 18 reakciói l 04 sebe sége l 09 szabályozása l 16 g likolitikus kapaci tás l 09 g likolizáció, core-397 g likoprotei n 427 g li koprotei nek 397 zénhidrátláncának szintézisc 141 glikoszfingolipidek 207 glikozidázok 141 repair mechanizmusban 350 glikezidok 96 glikozidos O H-csoport 94 g likozilált hemoglobi n 136 g likozil-foszfatid ilinozi tol kötődése fehérjéhez 399 g likozil-foszfatidilinozitol horgony 426 g likozil-transzferázok 14 1 g lobuláris aktin 55 1 g lutamát-dehidrogenáz 532 g lukagon 11 7, 11 8, 120, 132, 133, 201 , 322 szerepe a gli kolizisben 118 szerepe a zsírsavszintézisben 147 g lukocerebrozid 207 g lukokináz l 06, 12 1, 32 1 glukokortikoidok 21 O glukoneogenezis 92, 112, 157, 322 hormonális szabályozása 118 szabályozása l 16 g lukonsav 96 g lukoplasztikus aminosavak 246, 322 g lukóz 93, l 03, 321 agyi szükséglet 324 aktivált 126 d irekt oxidációja 92, 1361 13 7 foszforilációja 6 11 l 06 koncentrációja a plazmában 133 oxidációzavara 9 1 raktárak 320 szintézise de novo 113 szi ntézise lipidekből 115 transzportja l Ol 1 l 021 429 g lukóz-6-fo zfát dehidrogenálása 139 m int elágazási pont 316 g lukóz-6- foszfát-dehidrogenáz 136

633

634

)) )))))) )))))))))))))))) )))))))))))) )) )))) )))) )))))))) )))) )) )))))) )) )))))))) )) )))) )))))))))) )))))))))) )))))))))))))))) )) )))))))))))))))) )))))))) ))))))))))))))))))))))))

glukóz-6-foszfát -dehidrogenáz-hiány 140 glukóz-6-foszfat áz 114, 317, 323 gl ukóz-6-foszfatáz -deficiencia 286 glukózamin 141 , 142 glukózaminoglikánok (GAG) 141, 566 glukózszenzor molekula 133 glukóztranszpon er l 02, 429, 436 glukuronidáció 302 glukuronidképződé 302 L-gl ukuronsav 142 glukuronsavas konjugáció 302 bilimbin 302 GLUT-2 transzporter 135 glutamát 228, 229, 232, 241, 25 1 neurotranszmisszió 532 raktározása 532 receptorok 533 szerepe a tanulás és emlékezés folyamatában 534 szintézise 532 glutamát-dehidr ogenáz 9 1, 240, 241 glutamát-dekarb oxi láz 250, 535 glutamát-dehidr ogenáz 229 glutamaterg neuronok 532, 534 glutamát-oxálacetát-transzaminá z (GOT) 43 glutamát-pimvát -transzamináz (GPT) 43 g lutamil-ciszteini1-glicin (GSH) 227 gl utamin 6, 240, 241 , 250, 324, 532 gl utamináz 240, 244, 25 1, 532 glutaminsav 6 receptorai 458 g lutaminsav NM DA 456 gl utamin- zi ntctá7 235, 241 glutation 68, 304. 312 oxidált 248 redukált 248 szintézis 227 zi ntézise 248 glutationkonjugá ció 304 glutation-peroxidáz 248, 3 19 glutation-reduktáz 248, 3 19 glutation-S-trans zferáz 304 g lutation-szintetáz 248 g lycogenosisok 133 GMP 275 GM P-reduktáz 290 Goldman- H odgkin- Katz-cgyenlet 525 Golgi-komplex 398 kompartmentjei 398 golyva 260 GOT43 GPT43 granuloeita- monocita- makrofág rendszer 589 granzi mek 517 Graves-kór 260 growth factor 486 GSII 227 GTP - kötő fehérjék 392, 459 guanidinoacetát- metil-transzferá z 252 guan ilát 275

TÁRGYMUTATÓ

guani lát-cikláz 482 szalubilis 483 guanin 271 guanin-dezamin áz 286 guanozin lebontása 286 guanozin-3'.5'-tetrafoszfát 366 gyulladáscsökkentő gyógyszer 581

n hélix destabili záló (HD-) fehérjék 340 hős hock 397 bősilockfehérjék 397 húgysav 27 l. 285, 286 heptózok 92 haemochromato si 268 haemoglobinopa thia 48 haemorrhagiás kórkép 589 haemosiderosis 268 harántcsíkolt izmok 555 kontrakció 443 HDL 175, 182, 187 heli x- kanyar-hélix fehérjék 372 hem 26 1 pros?tetikus c oport 483, 486 szintézise 261 hemoglobi n 6, 48, 49 aminosav-összetétele 48 glikozilált 136 szintézi ének öröklődő zavarai 49 hemolitikus anaemia 140, 268 hemosztázis 589 endothelium szerepe 607 máj szerepe 606 zavara 589 hem-oxigenáz rendszer 265 hemszintézis 306 hem-vas 44 heparán-szulfát 142, 578, 608 lebontását katalizáló hidrolázok hiánya 142 heparin 142, 578,598, 608 heparin kofaktor TI 596 Ilepatikus lipáz 184 hepatociták 589 hetero lóg deszenzitizáció 455 heteronukleáris R S 355. 367 heteropoliszacharidok 92 heteratrimer G-fehérjék 484 heteratrimer GTP-kötő fehérjék 452, 459, 47 J heteratrimer guaninnukl eotid-kötő fehérjék 452 heterotrop hatás 37 hexózok 92 hexózaminok 140 hexokináz 62, l 06. l 12 hexok ináz izoenzimek szerepe a glikolizisben 12 1 Hfr baktérium 34 1 hialuronsav 142, 578 hibridizáció 335,407, 408 in situ 408 hidrátburok 13

TÁRGYMUTAT Ó

hidrogénion-kon centráció szerepe a glikolíLisben 118 hidrolázok 27, 41 hidroperoxidázok 70 hidroxi-3-metil-g lutaril-CoA (HMG-CoA) 165 hídroxiláz 568 ll ~ 2 10 l7a 216 21-hidrox iláz-elégtelenség 2 16 hidroxi-li7in 567 hidroxi-metil-citozin 269 hidroxi-meti 1-transzferáz 23 7 hidroxi-piridin-szerkezet 570 hidroxi-prolin 567 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz (PGDH) 583 17~-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz 216 5-hidroxi-triptam in 248 high density lipiprotei n (HDL) 175. 182. 187 hipoxantin 275, 285, 349 hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz 276, 288 hirudin 599 histidinaemia 253 hisztamin 253 hisztidáz 253 hisztidin 6, 240, 253 hisztidin-dekarboxiláz 253 hisztidin-liáz 253 hisztonok 343, 345 core-343 HMG-CoA 165 J!MG-CoA-reduktáz 169, 172, 186 HMG-CoA-reduktáz gátlók !87 HMG-CoA- zintáz 165 homotrop hatás 38 holoenzim 27, 358, 467 homocis7tein szintézise 232 homocis7tein-metil-tran zferá7 254, 29 1 elégtelensége 296 homocis7tin 240 homogentizát-oxidáz 258 homogenti7insav 258 homológ deszenzitizáció 455 homopoliszacharidok 92, 98 hornotrop kooperatív hatás 38 homova nillinsav (IlVA) 543 honnonok. lokális 579 hom1onreceptorok, sejten belül 372 honnonszenzitív lipá7 158, 474 humán choriogonadotro p hom10n 2 1l humán immundefficiencia vírus 382 Huntington-kór 614 IlVA 543 hyperglykaemiás, hyperosmolaris coma 325 hyperammonaemia 326 hyperbilirubinae mia 326 újszülöttkori 308 hyperchylomicronaemia 325 hyperglykaemia 32 1 hyperlipidacmiá k 189

635

hyperlysinacmia 261 hyperoxaluria 239 hyperphenylalaninaemia 258 hyperthyreosis 260 hypoglykaemiá coma 325 hypoglykaemia 32 1 laktózintoleranciában 122 hypothyreosis 260 hypoxiás agyi káro odá:. 534 hypoxia 534

icterus 268, 302 idegrcnds7er működése 525 l DL 182, 184 L-iduronsav 142 ikerion 3 immobili.lált enzimek 43 lmuran 284 in situ hibridizáció 408 inaktiv kromatin 371 indító lánc 339 indirekt bilirubin 265 indol-3-karbinol 30 J indukciós hatás 308 indukció 363 induktív enzimrendszerek 363 ingerület ve7etése 526 inhibitorok, kompetetív, valódi 35 iniciáció 360, 390, 393 iniciációs buborék 339 iniciációs faktorok 390 eukarióta 393 iniciációs komplex 390 iniciátor kodon 389 inozin 285 inozinsav 275 inozitol- l ,4,5-triszfos7fát 475 inozitol-fo zfátok, metabolizmusa 480 inoLitol-fos7folipid jelpálya 4 75 inozitol-lipid jelpálya 481 integráns membránfehérjé k 425 interfázis 345 interferonok 38 1, 486 interkaláció 352 intericukí nok 486 intennediate density lipoprotein 182, 184 intennedier anyagcsere 56 elága7á i pon~ai 3 16 integrációja 3 15 intracell ulári Ca 2+ 476, 477 intracelluláris mediátorok 464 intracell uláris pH 436 intrinsic faktor 29 1 hiánya 29 1 intron 366 inzerció 35 1, 352 inzerciós szekvencia 343 inzcrciós-deléciós mutációk 613

TÁRGY MUTAT Ó

636 inzulin 89, 121 , 133,321 hiánya 135 mint növeked ési faktor 486 szerepe a glikolizi sben 11 8 szerepe a zsírsavs zintézisb en 147 inzulin/gl ukagon arány 325 inzulinfüggő diabetes mellitus 325 inzul inrecept or 455, 490 ioncsata mák 439, 482 Ca~.,. 441 feszültségftiggő 439 receptor 439 ionc crélő kromato gráfia fchérjesz étválaszt ásra 20 ionofórok 439 ionok tran zportja 431 ionotrop receptorok 533 IP3 478 irreverzíbilis enzi mgátlás 35 itom nikotinreceptor 458 izocitrát-dehidrogenáz 86, 3 19 allosztérikus szabályo zói 8S gátlása 147 zabályez ása 90 izoelektr omos fókuszálás 18 izoelektromos pont 18 febérjéké 13 izoenzim ek 27 izoicucin 3, 254 IZOITI

metaboli zmusa 324 szerepe az intermedier anyagcs ere integrác iójában 323 izomeráz ok 27, 164 izomfáradá 561 izomkontrakció 538 izomkon trakcióh oz szükséges energia 323 izomláz 56 1 izomműködés energias zük églcte 56 1 izopcnte nil-pirof oszfát 169 ,J

JAK (Janus arcú) protein-t irozin-ki názok 470, 486 jávorfas zörp betegség 260 jelátv itel449 jelpályák 465 2 Ca ' 469, 473 cAMP mcdiálo rrendszer 4 72 citokinek 486 foszfatidilinozito l 539, 544, 546 inozitol-foszfolipid 4 75 inozitol- lipid 48 1 közötti kölcsönh atá 490 növeked ési faktorok 486 protein-kináz C 469 tirozin-kináz-receptorral működő 486 j elpályar endszere k 465 jód hiánya 260 jun 493 junfehér je 374

h. K. 435,525 ,526,52 7 ka inátrecep tor 458, 533 kalcineurin 470 kalcium 130 kalciumindukált kalcium relcase 560 kalciumszignál 557 kallikrein 572, 594. 603 kalmodulin 130, 444, 469, 481 kalmodulinantagonisták 485 kalorikus homeosztázis 325 kalpainok 48 1 kalretikulin 477 kalszekv esztrin 4 77 kapcsaló fehérje (adapter) 488 kapcsolt reakciók elve 56 karbami d 286 karbamil-foszfát 241. 277 karbam il-foszfát-szintetáz 24 1, 243 . 244. 279 karbamoil enzim 540 karboxil-proteázok 22 1, 223 karboxipeptidáz 223 karcinog ének 348 kardiolipin 194. 422, 423 kamitin 159. 26 1 kamitin-aciltrans zfcráz 159 hiánya 160 kamitinszint-csö kkené sei járó állapotok 321 kamitinv esztés 32 1 kamitin-zsíracil-transzferáz 322 kaszpáz 5 15 katabelitrepresszió 365 katabolizmus 56. 79 katalázo k 286 kataláz 3 12 katalitikus képesség 33 katalízis 23 katechol aminok 254, 540 bioszinté zésc 540 metabol izmusa 543 katechol -0-mctil -transzfe ráz (COMT ) 543 katepszinek 227 kazein 6 kefalin 194 keményítő 98 kémiai ingerületátvitel 527 kemiozm otikus elmélet 77 kemoter ápia 284 kenodezoxikólsa v 178 keratán- szulfát 142, 578 keratinok 6, 566, 575 kereszthíd ciklus 55 1 kereteltolódással járó (frame hi ft) mutáció 351 kés lekedő DNS-lán c 339 ketózok 92 kétdimenziós elektroforézis 18 kctoacidosis 325 ketobutirát 239 kctoglut arát 240

TÁRGYMUTATÓ

>>>>>>>>>J>>»>>)>>>>>>>>,>>>>>>>>>>>>>>»>>»>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>n>>»>>>>>>>>»»•>>>>>>>>>n>>»>>>>>>>>>>»>>»>)>>>>>>H>n>>>>>>>n»>>»»n>>,>»>>>>>>»»n>>

ketoizokaproát 260 ketoizokaproát-dehidrogenáz 260 kctonaemia 168 ketontestek 165, 3 18, 246, 320, 324 koncentrációja 325 túltermelése 325 ketonuria 168 ketoplasztikus aminosavak 246 kílorrukron 182, 193 maradvány 184 kimotripszin 26, 223 k.imotripszinogén 224 kinázok 27, 277 kinurenin 248 kinurenináz 248 kisméretű citoplazmai RNS 355 kisméretű nukleáris RNS 355, 370 klónozás 405 klóramfenikol-acetil-transzferáz 343 klasszikus neurotranszmitterek 528 klasszikus PKU 258 Klenow-fragmentum 336. 403 klinikai laboratóriumi diagnosztika 616 klorid- bikarbonát cseretranszport 430 klorofill 261 knock-out állatok 4 15 kobalamin 254 kodon 386 kodon- antikodon lötyögés 387 kódszótár 386 koenzim Q 74 koenzimek 27 kofaktor defektusos PKU 258 koffein 271 kolecisztokinin 190, 223 kolekalciferol 2 19 ko Ieszteri n 168, 2 1O, 423 szá Ilitása l 84 szintézis regulációja 172 szintézise 168 koleszterin-észteráz 175 koleszterin-észterek 168, 173 koleszterinkövek 178 kolicin 34 1 kolicinogén taktor 341 kolin 196 szintézise 246 ko1in-acetil-transzferáz (CAT) 537 kolinerg receptorok 538 kolinerg szinapszis 538 kolin-transzportrendszer, nagy affinitású 537 kolipáz 192 kollagenáz, szöveti 572 kollagének 6, 566, 599 degradációja 572 fehérjeszerkezete 567 olvadáspontja 568 stabilitása 568 koltagenázok 227. 572

kólsav 175 kompartmentalizáció 36 sejten belüli 3 16 kompetíció 308 kompetetiv enzimgátlás 35 kompetetiv inhibitorok, valódi 35 komplementaritás 335 komplementer bázispárok 333 kondroitin-6-szulfát 142,578 konjugációk 298 g lukurooidáció 302 glutation- 304 metilezés 304 paracetamol- 306 szalicilsav- 302 szulfatá lás 302 konjugált bilirubin 265 konstitutiv mRNS-szintézis 359, 362 kontrakció mechanizmusa 55 1 kontrakti lis szövetek 549 kontrollálatlan sej tszaporodás 348 korcpresszor 365 kortikoszteroidkötő fe hérje (CBG) 215 kortizo l 2 1O szintézise 214 kotranszmítter 528 kotranszport 431 kova lens katalízis 26 köszvény 286 kötőszövet 566 k özvetlen fehérjefoszforiláció 464 kreatin 252 kreatin-foszfát 62, 252, 561 kreatinin 24 1, 252 kreatininclearence 252 kreatinin-kináz 43 kreatin-kináz 252, 56 1 krisztallin 136 kromatin, aktív 371 kromoszóma, eukarióta 343 kromoszómaséta 409 K-vitamin 606 kwashiorkor 22 1

L L (long-lasting) ioncsaromák 442 laboratóriumi géntechnika 400 !ac-operon 363 lagging strand 339 laktalbumin 126 laktát 322, 323 szérumszintje 108 laktát-dehidrogenáz 43, l 08 aktivitásának mérése l 09 laktátacidosis 9 1 !aktáz 100 laktonáz 136 laktonszerkezet 96 laktóz 97

637

638

) ) n )))) H)))))) >>n))))>>

•> '>)) ~> )))>)))) >>» )) >>»>H>)))>>>>>>) l) )l)))>)))))) n>)>> )l>)))>>>))))) )l>))))>)))) h>>)))) n))))))))))))>>l\)) >l )l>>>>))>)

laktÓ7 s:zintézise 126 laktózi ntolerancia l 02 laktóz-szintá:z 126 laminin 566, 576 Ianoszteri n J 72 laterális diffúzió 425 LCAT 175, 187 LDL 182. 184 LDL-receptorok 186 leading strand 339 lecitin 178, 194 lecitin:koles7terin-aciltran :zferá:z 187 lccitin:koleszterin-aciltranszfcrá z (LCAT) 175 légzési (respirációs) kontroll 77 lég:zési lánc gátlós:zerei 76 Le ch yhan- zindróma 288 Icucin 3, 260 leueincippzár 372 lcucin-encefalin 547 leukaemia 286 leukoeita-elasztáz 575 leukotriének 579, 583, 584 szintézise 584 katabolizmusa 584 Lll 211,217 liázok 27 Iigandok 30. 449 limitált proteolízis 41 limit-dextrin l 00 linolénsav 145 linolsav 145. 164, 422 lipázok 157. 190 honnonszenzitív 158 lipid kettős réteg 423 lipid transzfer fehérjék 187 lipidek 143 funkció zerinti felosztá a 143 s:zállítása J 80 lipid-peroxidáció 300 lipidszállítási rendellenességek 180 liponsav 82 lipoproteinek 157, 18 1 lipoprotein-lipáz 157, 184 lipos:zómák 424 lipoxigenáz-út 584 lipoxigenázok 581. 584 litokólsav 178 li:zin 6. 260. 261 lizin-oxidáz 570, 575 li:zogén baktérium 37R lizolecitin: lecitin-aeiltrans:zferáz (LLAT) 203 li/07im 377 LLAT 203 lokális bonnonok 579 long tenn potentiation (LTP) 534 low density lipoprotein 172. 182. 184 LTP 534 luteini:záló hormon (LH) 2 11 , 217

>>>>)))))ll )l»

TÁRGY 1UTATÓ

\1 M fázis kináz 509 májglikogén 320 máj zerepe a hemosztázisban 606 szerepe a:z intem1cdier anyagcsere integrációjában 320 májban folyó glukoneogene:zis 115 májbetegség okozta anyagcserezavar 326 májcoma 320 májelégtelenség 32 1 máj-lipáz 187 malát 87, 91,319 malát transzporter J 12 malát-dehidrogenáz 87, l 09. 151 malignus hyperthennia 565 malonii-CoA 147, 162 malonil-CoA- ACP-transzacilá:z 148 malonil-transzferá7. I 48 maltá7 l 00 maltóz 97. J00 maltotrióz l 00 mannóz-6-foszfát 398 mannó:zamin I 4 I MAO 448,543 MAO-inhibitorok 248 MAP-kináz 489 MAP-kináz kaszkád 489 MAP-kináz-kináz 489 Maple Syrup Uávorfaszörp) betegség 260 marasmus 22 I másodiagos aktív transzport 431. 436 mátrixhatás 619 Maxam G ilbert-mód zer 403 McArdle-szindróma 133 mebrán fehé rjék integráns 425 perifériás 425 mediátorok, intracelluláris -164 megszakított en:zimatikus szinté:zis 403 melanin 258 mclanocitastimuláló honnonok (MS H) 548 mcmbrá nfchérjék 425, 429 membrá nlipidek 421 membránmodcll 425 membránok 421 aszimmetriája 424 barrier tulajdonsága 428 nuiditása 425 kémiai összetétele 421 szénhidrát alkotórésze 427 membrántranszport-folyamatok 428 mentő mechanizmusok 276 timidilátszintézis 283 citidin nukleotidok 280 purin oukleotidok 276 uridin nukleotidek 280 mcntö utak 280, 283 MEOS 327 mércgtclenítés 297

639

T Á RGYMUTAT Ó

6-merkaptopuri n 284 mcssenger RNS 355 eukarióta 389 prokarióta 389 mctabolikus acidosi 168 metabolikus utak éhezéskor 322 tá plálék fe lvé te lkor 321 metabolizmus 56 mctabotrop glutamátreceptorok 533 metabotrop receptor 455, 532, 533, 536 meta lloenzimek 26 metalloflavoprotei n 69 metalloproteázok 227 mcthaemoglobinacmia 49 metil-citozin 269 metil-ma lonát-acidosis 29 J metil-rna lonil-CoA 254 mcri l-malonii-CoA-mutáz 162, 254, 29 1 metilezés 304 metilmalonsavas acidaernia 162 metilma lonsavas acuduria 162 mctionin 6, 254 rnetionin-cnccfa lin 547 mctotrcxat 283 3-metoxi-4-hidroxi-fenilgliko l (M1-IPG) 543 micclla 423 Michae1is- Menten-mode11 30 mi clope roxidáz 575 mikrofibrillum 575 mikroszómá lis etanol oxidá ló rends7er (MEOS) 327 mi kroszómá lis légzési lánc 299 mincralkortiko idok 2 1O minera lokortik oidok 2 14 mi ofibrillumok 555 mioglobi n 6 mioki náz 11 8, 56 1 miozin 7, 549 m iozin-könnyiHá nc-kináz 469, 474, 472 mismatch repa ir 35 1 misszcnsz mutáció 6 13 mitogén aktivá lt protein-kináz 489 mitogén kaszkád 506 mitokondriális bel épő szekvencia 399 mitokondri á lis betegségek szintézisének zavarai 78 mitokondri ális DNS 348, 6 13 mutáció i 6 13 mi tokondriá lis fe hé rjék 78. 399 mitokondri ális geno m károsodása 6 1O mitokondriális genom mutác iói 6 13 rn irokondriá lis légzési lá nc 72 mitokondriumok 70, 399, 6 1O membránja 423 oxidatív károsodása 6 14 mitózis 505 mobil carri erek 439 mo lekuláris chaperonok 397 monoacil-gliccridek 145, 146 monoamino-oxidáz (MAO) 24 8, 543

monoamino-oxidáz-inhibitor 248 monogiccridek 145 monomer 14 mononuklcotidok 27 1 monooxigenázok 70, 298 monoszacharidok 92, 97 szte rcoizomérek 93 morfin 548 mucolipidosisok 142 m ucopolysaccha ridosisok 142 mukopoliszacharidok 142 mukoprotc inek 6 multidrog transzportcr 437 multidrug-rczisztc ncia fehérje 438 m ultienzim kompex 26, 82 muszkarinreceptorok 539 mutác ió 348, 35 1, 6 13 irányított 41 2 mu tagéne k 348 mu tagenezis, in v itro irányított 4 12 myasthcnia gravis 539 myelinmembrán 42 L myositis interstilialis 578

''

..... N (ncither T nor L) ioncsatorn ák 442 N-acetil-gluta mát 244 N-acetil-gluta mát-szintetáz 244 N -aceti l-neuraminsav 97 nádcukor 97 növekedési fa ktorok 345. 383, 486 jelpályarendszere 486 receptorai 455, 469 N a f J Ol , J 02, 43 1, 432, 436, 444, 525. 526 Na+-csa tornához kötődö toxinok 526 Na+-csatornák 525 N ADH 73 N ADI-l-dehidrogenáz 74 NADH-UQ-oxidoreduktáz 74 N AD PH 73,3 18 forrása 15 1 tenne lése 139 NADPH-citokróm P450-reduktáz 299 NADPH-oxidáz 3 1 l nagy nuk leáris ri bonukleoprotein-részecskék 375 nagy T antigén 379 nascens kilomikron 183 natív kenfonnáció 12, 16 nebulin 563 negatív szupcrtekcrcs 336 nem esszenciális aminosavak 220 bioszintézise 232 nem h iszton fehé rjék 343 nem kompetelí v enzimgátlás 35 nem pcnnisszív gazdasej tek 379 nem receptor prote in-tirozin-kinázok 4 70 nemi hormonok 2 10 szintézise 2 16 neomicin 394

TÁRGYMUTATÓ

640 neosztigmin 540 neuropeptidek 546 neurofibromatosis 494 neurofibromin 487, 494 neuronális nikotinreceptor 458 neuropeptidek 528 neurotranszmisszió 527 elemei a zinapszisokban 528 neurotranszmitterek 525, 527 aminosav 532 aminosavak 528 felszabadutá a 529 inaktiválása 532 katecholaminok 540 klasszikus 528 peptidek 528 raktározása 529 receptorhoz kötődése 532 szerotonin 545 szintézise 529 neurotrof hormonok receptorai 455 neurotrofinok (NGF) 486 neutrális zsírok 145 GF486 nick338 Niemann- Pick-betegség 208 nikotinreceptor 457, 538 nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP+) 66 nitrózaminszármazék ok 307 nitrogén-monoxid 252, 483, 484, 534 nitrogén-oxid vaszkuláris hatása 486 nitrogén-oxid-szintáz 484 indukálható 484 konstitutív 484 MDA (N-metii-D-aszpartát) 458, 533 NMDA-receptorok 534 nonsense kodon 386 noradrenalin 258, 540 receptorai 543 orthem -blot eljárás 408, 41 l 0-szintáz 3 1 l növekedési faktorok 6 NSF 53 1 nukleáris lokalizáció jele 399 nukleázok 27 1 nukleotid 269 nukleinsav antiszenz 413 nukleinsavak 33 1 bázissorrendjének meghatározása 408 nukleolu z 374 nukleoszóma 343 nukleotidázok 285 nukleotid-anyagcsere 29 1 nukleotidcukrok 140 nukleotidek 269, 296, 33 1 bioszintézisét befolyásoló vegyü letek 284 egymásba történő átalakul ása i 290 nukleozid 269 nukleozid-difoszfát 282

nukleozid-difoszfát-kináz 87, 283 nyugalmi potenciál 432

o obesitas 157,325 okadánsav 4 7 1, 494 Okazaki-fragmentum 340 oligo-adenilát-depend ens endonukleáz 381 2',5'-oligo-adenilát-szintetáz 38 1 ol igo-glukán-transzferá z 128 oligope ptid 7 oligos7acharidázok l 00 oligoszacharidok 92 olvasási keret 386 omega-oxidáció 165 onkogének 383, 493, 5 11 opioid peptidek 546, 547 omitin 25 1 omitinciklus 24 1, 286 omitin-transzkarbami láz 241 orotát-foszforibozil-transzferáz 279 orotsav 279 osteogenesis írnperfecta 567 o uabain 433 ovalbumin 6 oxálacetát 147 oxidáció alfa 164 omega 165 oxidatív dezaminálás 240 oxidatív foszfori láció 56, 61, 70, 76 oxidatív stressz 75, 3 1O oxidázok 69 oxidoredukció 63 oxidoreduktázok 27. 69. 318 oxigenáció 299 oxigenázok 70 oxigéntoxicitás 309 oxitocin 132 ö l ő kaszpáz 517 öregedés 6 L4 Önemésztődés 223 ösztradiol 2 17 ösztrogének 2 L7 ősztron 2 18 p P típusú ATPázok 435 P:O hányados 76 p 16 fehérje 347 p2 1 fehérje 347,374 p53 fuhérjc347.348,374 ,379,509,5 L3 P450 izoenzim 300 PAF 196 Pakinson-kór 6 14 palindrom 365 zekveneia 36 1, 400 palmitinsav 15 1, 422 szimézise 148

641

TÁRGYMUTATÓ

palmitoil-CoA 147 palmitoil-S-CoA 149 pancreas-claszláz 575 pancreas-lipá7 178, 19 1 pancreas-proteázok 224 pancreas-tripszin inhibitor 224 pancreatitis, akut 224 pankreozimin 223 PAPS 303 Parkinson-kór 543, 545 partikuláris enz im 483 partikuláris guanilát-cikláz 483 parvalbumin 56 1 Pasteur-effektu l 09 passzív transzport 4 29, 43 1 PCR413 PDGF 486 pentóz-foszfát keletkezése glikolízis intcnnedi erc kből 137 pentóz-foszfát-út 136, 3 18 szabályozása 139 pentóz-foszfát-ciklus 139 működésének megváltozásával össze függő kórképek 140 pentózok 92 pep zin 223 pepszinogén 223 peptid extenziós 57 1 neurotranszmitter 528, 546 opioid 547 transzmitterek 546 peptid-leukotriének receptorai 588 peptid-leukotrién-szán nazék 584 peptidil-transzferáz 392 peptidkötés 7, 8 perifériás 425 pennis ziv ga7da ejt 379 peroxid shunt 300 peroxidáz 3 12 pertussistoxin 460 phenylketonuria 237.258 piranóz 93 piridinnukleotid-trans zhidrogenáz 73 piridinolinszerkezet 570 pi ridoxál-fos7fát 229, 535 piridoxamin- foszfát 23 1 pirimidin 269 pirimidin nukleotidok 27 1 bioszintézise 277 lebontása 285 pirimidinantagonisták 284 pirimidinbázisok lebontása 288 pirimidin-dehidrogen áz 288 pirimidinvázat alkotó atomok eredete 276 piruvát mint elágazási pont 3 17 piruvát/laktát redoxrendszer 64 pi ruvát-dehidrogenáz 8 1, 32 1 csökkent müködése 9 1 piruvát-dehidrogcnáz- foszfatá7 89

pinivát-dehidrogenáz komplex 8 1 akti vi tásának szabályozása 88 szabályozása 90 piruvát-dehidrogenáz -kináz 89 piruvát-dckarboxiláz l 08 piruvát-karboxiláz 90, 11 3 piruvát-kináz 107, 11 2, 120.474 pitvari n átriumürítő faktor (AN F) 2 15, 483 PKU258 klasszikus 258 kofaktor defektusos 258 platelet activaling factor (PA F) 196, 599 plazmafibronektin 576 plazmalogén 194 szintézise 203 plazmamembrán 423 plazmamembrán-rece ptorok 45 1 plazmidok 341 , 405 plazmin 572, 589, 60 l, 603 inhibitorrendszere 604 keletkezése 602 plazminogénaktiváto r inhibitor-l 604 plazminogénaktiválás 602 plazminogénaktivátor 603 inhibítorai 604 PLC 475 PLC izofonnák 476 poli-A-farok 368 poli-A-po limeráz 369 poliaminok 252 policisztronos mRNS 359 polimeráz láncreakció 41 3 polipeptid 7 polipeptidlánc szintézise 390 polipeptidláncot kódoló gének transzkripciója 366 poliszóma 392 poliszacharidok 92, 98 pontmutáció 35 1 porfirinek 26 l anyagcsere-változása i 265 anyagcserezavarai 268 lebomlá a 265 szintézise 87, 261 porfobilinogén 261 , 262 porin 7 1 porphyriák 265 porphyria cutanea tarda 262, 268 posztszinaptikus aktiválás 532 posztszina ptikus gátl ás 532 posztszinaptikus neuron 527 poszttranszlációs kovalen módosítá ok 3 15 pozitív hornotrop hatás 38 pozití v inotrop hatás 474 pozití v k.ronotrop hatás 474 pozitív reguláció 365 pozitív szupertekercs 335 prefehérje 395 prcgnenolon 2 l l, 2 16 prekallikrein 594

642

))J)))))))H))))))>))))) )U>))))))>))))))))>>>>> »>>>H>>)))))>)H)>>> >)))>>)) >>))>)))H))U)))))))))))

prekurzor aktivá lás 39 prc-profehétj e 395 preszinaptikus neuron 527 primáz 339. 340 primoszóma 340 prodinc din 548 proelasztáz 224 proelasztin 575 proenzimek 41 , 223. 395 pro fág 378 profehérje 395 progeszteron 2 J8 programozott sejthalál 5 14 proinzulin 134 prokarboxipc ptidáz A 224 prokarióta mRNS 389 prokarióta gén 366 prokarióta riboszóma 389 prokollagéne k 57 1 prokollagén-p eptidázok 57 1 prokollagená z 572, 573 pro liferációs szignál út vonalak 506 prolin 3, 25 1 protnotere k 358, 359 propionii-CoA 162 pro ziaciklin 579, 58 1, 609 prosztac iklin-szimetá.t 58 1 prosztaglandi n-endopcroxid 58 1 prosztaglandi n-endoperoxi d-szintctáz 58 1 prosztagland in-hidropcrox idáz 58 1 prosnaglandi nok 579, 58 1, 587 nómenklatúrá ja 583 receptorai 587 prosztanoidok 579. 583 katabolizmusa 583 prosztetikus csoportok 23, 27 proteáz inhibitorok 598 a lfa 1-proteáz 224, 225 proteázok 41 , 22 l cnterá lis 223 szöveti 227 proteázaktivá lt receptorok 453 proteázok 26, 43, 5 17 protcin C, a ktivált 596 protein fold i ng 15 prote in S 596 protein-diszulfid-izomcráz 397 protein-kináz ok 40, 4 1. 129, 455, 464 A 467, 472 cGMP-depen dens 467 ciklindependens 469 c 467, 526, 534 Ca2 '/foszfo lipid de pendens 469 Ca2 - ka lmodulin dependens 467, 48 1 cAMP-depen dens 11 9, 467 cGMP-függö 483 c oportosítása 465 extracellulá ris j e lre rcgulálódó prote in-kináz 489 G 467, 483

)))>))))))))>)H})>)>)))) >))))>>>>>>U>>U>>> >>Hn>>>H>H))>)U

TÁRGYMUT ATÓ

prote in-kinázok (folyt.) kettős szálú RNS-depe ndens 469 mitogén aktivált 489 széles s.tubsztrátspc cifitá ú 469 szük szubsztrátspcci fitású 469 szerkczcte 466 prote in- zeri n/trconin-kinázok 4 65 proleinszinté zis mutáció 6 J3 protcin-tiro7in-kinázok 465. 469 JAK 470 nem receptor 470 sejtmagban c lhel yczkcdők 470 src 470 proteoglikáno k 576 szénhidrátlán cának szinté.tise 141 proteolízis 324 intracelluláris 227 protofibrillum 575 proton motoros erö 77 protoncsatorna 76, 77 protonofor 77 protoonkogéne k 34 7, 383, 493 protoporftrin lX 26 1 protrombin aktiválása 592 protrombiná7 komplex 592 provírus 379 PRPP 272, 276 PR.PP-amidotranszfc ráz 275, 288 PRPP-g lutamin-amid otranszfcráz 272 PR.PP-szintáz 288 PR.PP-szintctáz 272, 275, 276 psoralen 30 l ps7cudo-koli nésztcrá7 539 purin 269 antagonisták 284 purin nukleotid 27 1 bioszintézise 27 1, 275 c iklu 29 1 lebontása 285 purin-nukleo zid-foszforilá z 285 hiánya 288 purinbázi ok 27 1 anyagcserezavarai 288 lebontá a 285 újra hasznosítása 276 puromicin 394 putreszcin 252

R faktor 342 raf 489, 493 ragadós DNS-végek 40 l random coil ll ras 489 ras gének 385. 487 ras GTP- kötő fehérje 487 Rb-fc hérj e 374, 379 ROS 196 reakc ió ebesség 30

..

TÁRGYMUTATÓ

reaktív oxigén intennedier 3 1O reaktív oxigén species 3 1O receptor 449 adrenalin 543 deszenzitizációja 455 dopamin 544 extracelluláris 449 g lutamát 533 receptor ioncsatornák 439, 452, 455, 532 ionotrop 533 kolinerg 538 rnuszka rin 539 nikotin 538 noradre nalin 54 3 prosztaglandjn 587 rianodi n 478, 558 szcrotonin 545 sztcroid- liroid- 0 -vitamin- rctino id honnon 499 receptor ligand komplex 449 receptor-kinázok 455 reccptonnedíált e ndoci tózis 264 redox homeosztázjs 3 18 reductive power 66 redu káló ekviva le n ek tra nS7portja 109 redukált glutation 3 19 redukciós potenciál 63 re ferenciatartomány 6 17 Refsum-kór 165 reguláció, pozitív 365 regulátor gén 363 rekombináció 353 rekombináns D S-mo le kulák 40 1. 405 rekombináns DNS-technológia 17. 400 relaxá lt DNS 335 relcase fa ktorok 392 euka rióta 393 renin 2 14 rep fehérjék 340 repair mecha nizmu ok 348 replikác ió 336 repl ikációs villa 338 replikáz 376, 380 rcpliszóma 339, 340 reprcsszív szabályozás 365 rcpres 70r fehérje 363 represszor- korcpresszor komplex 365 respíratory di tress syndroma (ROS) 196 restri kció 4 00 restrikciós endonukleáz-mct i láz párok 400 restrikciós endonukleázok 400 restrikciós e nzimek 401 restrikciós térképek 400, 40 1 reszponzív ele m 37 1 rctinális ABC tra nszporte r 438 rct inoblastoma gén 5 13 retrovírus 383 retrovírusok 380, 38 1 reverz tra nszkriptáz 376, 382 reverzíbilis enzimgátl ás 35

643

Reye-szindróma 326 rezerpin 543 rezisztenciafaktor 341 , 342 rezisztenciatranszfer fa kto r 342 RFLP-térkép 402 rho-fehé rjc 360 rianodin 443, 565 receptor 478, 558 D-ribóz 93 D-ribóz-5- foszfát 137, 272 ribóz-foszfát-pirofoszfokináz 272 riboforin 396 r1bonukleá7 26 riba nukleáz P 2 1 ribonukleinsav mint e nzime k 2 1 ribonuklcotidok 33 1, 355 ribonuklcotid-reduktáz 28 1, 284 riboszóma eukarióta 389 prokarióta 389 ri boszómaciklus i smétlődő 389 ribos7Ómafehérjék 366 riboszóma-RNS 355. 36 1, 366 transzkripciój a euka ri ótákban 374 ribozim 2 1, 370, 375 ribozimek 362 D-ribulóz-5-foszfát 137 rifamicin 367 rifampicin 367 riporter gének 41 2 RNS-po limeráz 366 RNS a nalizise 408 hete ronukl eáris 367 kettős szálú 38 1 kismére tű nukleáris 370 ribos7óma 366 típusai 355 transzfe r 387 U-370 RNS-dependens DNS-polimeráz 376, 38 1 RNS-dependens protein-kináz 38 1 RNS-dependens RNS-polimeráz 376, 380 RNS-polimeráz 339 R S-vírusok 376, 380 ro dopszin 46 1, 484 rosszindula rú daganat kialakulása 493 rotáció 425 Rotor-szindrá ma 30 8 Rous-sarcoma vírus 383

s, ~L. S-adenozil-metionin 232, 540 S-adenozil-mctionin (SAM ) 304 S-adcnozil-metionin-ciklus 254 salvage mechanizmus 276 SAM 304 Sanger-módszer 403

644

)))')>>>>>)n>>H»>>>>•> >>,> >))) >> •>>> >>H>>>>>>))>>))))>>))>>>>>>>> >>n>>>>))>>))>> n>>>>>>>>>>>H>»>>>>))))>)))>)>>>>)H>))))>>>>>>))>>>>))H))))))))))>>,,>)>>>>»>>

sarlósejtes anaemia 48 savanyú proteázok 22 1 savanyú foszfatáz 43 sav-bázis katalízis 26 saxitoxin 526 Seatchard-analízis 450 Seatchard-görbe 45 1 scorbut 569 sejtek intennedier anyagcseréje 3 15 sejtek redox homeosztázisa 3 18 sejten belüli kompartmentalizáci.ó 3 16 sejtfelszíni fibronektin 576 sejthalá l 505, 5 14 sejtlégzés 79 sejtmagreceptor 495 sejtosztódási ciklus ellenőrző pontjai 505 sejtproliferáció 505 SGOT 232 SGPT 232 SH2/SH3 doménekkel rendelkező fehérj ék 4 70 SHBG 2 17 sima endoplazmás retiku lum 395 simai zmok kontrakciója 48 1 simaizom 555 simaizom-kontrakció 481 simaizom-relaxáció érfalban 483 slow reacting substanec (SRS) 579 slow reacting substance of anaphylaxis (SRS-A) 579 SNAP-25 53 1 snRNS 370 SOS cserél ő fehérje 488 Southern-blot módszer 408 specializált sejthalál 5 14 specifikus cGMP-foszfodiészteráz 484 specifikus ligandkötés 450 specifikus transzkripciós faktorok 367 specifitásdetenninánsok 466 spektrin 564 spennidin 252 spermin 252 splicing 367, 370 alternatív 370 mechanizmusának károsodása 37 1 src-gén 383 src-kináz 4 70 SSB-fehérjék 340 stacionárius állapot 32 standard anyagok 6 19 standard redoxpotenciál 63 steatorrhoea 193 stimuláció 456 stopkodon 386, 389 struktúr gének 358 strurna 260 surfactant 196 synaptobrevin 53 1 synaptotagmin 53 J syntaxin 53 l széles szubsztrátspeci ft tás ú protein-kinázok 469

TÁRGYMUTATÓ

széndioxid-transzport 430 szénh idrát-anyagcsere 140 szénhidrátok 92 osztályozása 92 szénsavanhidráz 430 szérum-glutaminsav-oxálecetsav-transzam ináz 232 széru m -gl utamin sav-piroszől ősav-tra n szam i náz 232 szívglikozidok 433 szívizom anyagcseréje 324 szívizom-infarctus hypoxia következtében l 09 szívizom-kontrakció 443 szöveti faktor 593, 594 szöveti faktor reakcióút inhi bitora 598 szöveti kollagenáz 572 szöveti proteázok 227 szöveti típusú plazminogénaktivátorok 603 szétkapcsoló szerek 77 szabad gyökök 299 szabad zsírsav 158 szabadenergia-változás 22, 55 szacharóz 97 szal icitsav konjugációja 302 szarkoplazmás retikulum 444 szarka tubuláris rendszer 557 szedoheptulóz-7-foszfá t 137 szekréciós vezikulák 435 szekretin 19 1, 223 szekvenciális modell 38 szekvenciális reakciók 34 szemiesszenciális aminosavak 220, 243 szemikinon 75 szerin 6, 237, 239, 240, 246 szeri n/treonin foszfoprotein-foszfatázok 4 70 szerin-proteázok 26, 4 1, 221. 223, 540 szerotonin 545 receptorok 545 szintézise 248 szexdukció 342 szexfaktor 341 szexuálhonnonokat kötő globulin (SHBG) 2 17 sztingolipidek 193, 203 szintése 207 szfingomielin 196, 207, 422, 423 szfingozin 203 sziálsav 97, !41 , 207 szigma-alegység 358 szignál peptidszekvencia 395 szignál transzdukció 449 szignál transzdukciós rendszerek 345, 587 szigná l fel i sme rő részecske 395 szimmetri a modell 38 szimport 43 l szinapszinok 53 1 szinapszis 527 kolinerg 538 szinaptikus plaszticitás 469 szinaptikus rés 527 szinaptikus vezikulák 435, 529 szisztémás lupus crythematosus 37 1

TÁRGYMUTATÓ

szkvalén 17 1 szkvalen-szintáz J69 szolubilis enzim 483 szolubilis guanil át-cikláz 483 szorbito l 96 sztearii-CoA 153 szterkobilin 265 szteroidhonnonok 2 1O inaktiválása 2 15 szintézisének szabályozása 2 1 l szintézise 2 16 szintézise me l lékvesekéregben 2 1O szteroid- tiroid- D-vitamin- re tino id honnon magreceptorcsalád 499 sztreptokináz 603 ztreptokináz- plazminogén komplex 604 sztreptomicin 394 sztreptomicinrezisztcncia 394 sztrichnin 458, 536 sztringens kontroll 366 sztrofantin G 433 sztromelizin 573 szubsztitució 35 1 szub ztrá tszintű foszfori láció 61, 87, 106 zubsztrátkötö hely 22 szui cid enz im 283, 288 szukcinát 250 SZl.Jkci nát-dehidrogenáz 75, 87 szukcinát-szemialdehid-dehidro genáz 250 szukcinát-UQ-oxidoreduktáz 75 szukcinii-CoA 89, 254 szukcinil-CoA-szintetáz 87 szukráz J00 szulfá t aktív 248 anorganikus 248 szulfa tálás 302 szulfhidril puffer 248 szulfhidril-ligáz 590 szulfonamidok 284 szulfotranszferázok 302 szuperhélix egység 575 szuperoxid-
T (transicnt) ioncsatornák 44 1 tanulás, glutamát szerepe 534 táplálékbevitel 320 targettáló szerep 467 TATA-box 367 Tay- Sachs-kór 208 TBG 259 tejcukor 97 tejsav 116 tejsavas acidosis l 16 tejsav-dehidrogenáz 43 tekeráz 397

645

telítetlen zsírsavak 422 telített zsírsav J 44 te lítetlen zsírsav 144 telitési koncentráció 30 tclomér szekvencia 345 telomé rek 345 telomcráz 345 temperált fágok 377 template 358 tcobromin 271 teo fi llin 27 1 természetes sejthalál 5 14 te nnináció 360, 392 te nninációs faktorok 392 terminális glikoziláció 398 tennináli oxidáció 56, 70, 74, 76 tennogenin 77 testvérkromatid csere 354 tesztoszteron 2 16 tesztoszteron-ösztrogén -kötő g lobulin {TEBG) 2 17 tetrózok 92 tetraciklinek 394 tetra hidrobiopterin 235 tetrahidro-dihidrofolát ciklus 282 tetrahidro folát 232, 275, 282 tetrahidrofolát-a nalógok 283 tetrajód-tironin 258, 259 terrodotoxin 526 thalassaemia 49, 37 1 thalas aemia-szindróma 49 thromboembolia 606 thrombosis 240, 589 thyreoid stimuláló honnon (TSH) 260 thyreotropin releasing honnon (TRl-1) 260 tiamin-pirofoszfát 82, !37 timidilát-kináz 283 timidilát-szintáz 282, 285 timidin-kináz 283, 285 timidin-trifoszfá t 282 liminbázisok UV-fény hatására t örténő dimerizációja 349 tioészteráz 149 tioinozinsav 284 tiokináz 154 tiolízis 160 tireoglobulin 258 tiro id-peroxidáz 258 tirosinaemia 258 tiroxin 79, 258, 259, 260 tiroxinkötö globulin {TBG) 259 tirozin 3, 235, 254, 258, 540 tirozin-hídroxiláz 540 tirozin-foszfoprotein-foszfatázo k 471 tirozin-hídroxil áz 258, 474 tirozin-kináz receptorok 4 76 tirozin-ki náz-aktivitás 486 tirozin-kináz-receptorokkal működö jelpályák 486 tissue-factor 593, 594 tissue-factor pathway inhibitor 598 tissue-type plasminogen act ivators 603

646

)))))))) )) )))))))H))))))))) ))H)))) • .,~)))) Jo) )))) )) H))))»))))))))))'))))))))))))))")))))))))))))))) >H})))))))) )op))))))))>)))))))))))))))")})))))))))),,))))))))))))

titin 563 topoizimerázok 336 topológiai izomér D S-molekulák 336 topológiai izomérek 335 toxinok, Na ' -csatornához kötődö 526 transfer RNS 355 transzaldoláz 137 transzami ná Jás 231, 240 transzaminázok 229 transzducin 484 transz-elem 362 transzfekció 41 l transzfer RNS 387 transzkripciója eukariótákban 3 74 transzferázok 27, 40 transzferrin 6, 264 transzfot111áció 405 akut 383 transzfot111áló DNS-vírusok 3 79 transzfonnált baktériumok 405 transzgénikus állatok 415 transzglutaminázok 397. 590 transz-Golgi-kompanmcnt 398 trans7ketoláz 137 transzketolázhiány 140 transzkortill 2 15 transzkripció 358 polipeptidláncokat kódoló gének 366 szabályozása prokariótákban 362 tran zkripciós faktor 4 74 tran zkripció buborék 360 tran zkripciós egység 358 transzkripciós faktorok 367, 374 eukatióta 37 1 transzkriptum 366 transzláció eukariótákban 393 gátlása 394 gátlása prokariótákban 394 utáni módosulá ok 394, 396 transzlációs apparátus 387 transzlációs faktorok 389 transzlokáció 392 transzport 429 ATPázok 435 aktív 431 másodiagos aktív 43 l passzív 431 transzporterek 7 1, 429 glukóz 436 transzportfolyamatok e nergetikája 43 1 transzpozáz enzim 343 transzpozíció 353 transzpozonok 342, 353 transz-reguláeiós elem 362 transzverzió 351 tranzíció 35 1 tranzíeió analógok 35 tranzíciós állapot 2 1

TÁRCYI\1 TATÓ

treonin 6, 240, 254 treonin-dehidratáz 254 TRI J 260 tri67fos7fiít-izomeráz 106 tri67ok 92 triacil-gliceridek 145 trifluopcrazin 485 trigliceridek 145, 146. 324 hidrolí7ise l 57 raktára 320 raktározása l 57 szállítása 182 szintázise l 54 trijód-tironin 259 tripeptid 7 tripla-hélix génterápia 4 15 tripszin 223. 224, 572 tripszin inhibitor 41. 224 tripszinogén 224 tripiofán 3 katabolizmusa 248 triptofán-dioxigenáz 70 triptofán-hidroxiláz 545 triptofán-pirroláz 248 trombin 589, 590, 599 trombocitákból szát111azó növekedési faktor (PDGF) 486 trombociták 589, 599 trombocitaaktiváló faktor 196 trombomodulin 240, SS/6, 608 tromboxánok 579 , 58 1 katabolizmusa 583 nomenklatúrája 583 tromboxán-szinteláz 58 1 trombus 606 tropoelasztin 574 tropokollagén 566 troponin C 481, 55 l lroponin l 551 lroponin T 55 1 troponin tropomiopzin komplex 555 TSH 260 d-tubokurarin 458, 539 túlélési jel 491 tumorpromoter hatás 494 tumors7uppresszor gének 347, 374, 379. 384, 493, 5 13 tüdőemphysema 575 tyrosinaemia 258 l

ubikinol 75 ubikit10n 74 ubikvitin 228, 344 UDP 279 UDP-glukuronil-tran zfcrá7 (UDPGT) 302 UDP-galaktóz 124, 140 UDP-galaktÓ7-4-epimeráz 126 UDP-glukóz 126, 140 UDP-glukóz-pirofoszforiláz 126 UDP-glukuronil-lrans7fcrá7 :265

TÁRGYMUTATÓ UDP-gluku ronsa\ 140 UDPGT 302 UDP-xil67 140 ugráló gének jelensége 342 ukleotidszá rmazékok 296 UMP 279 UMP szintézise 279 uniport 43 1 unkompetc tiv enzimgátlá s 35 UQH2-cito króm c-reduktáz 75 urát 285 urát 27 1, 285 urátkristályok 286 uracit 288 ureáz 241 urea 24 1, 260, 326 ureaciklus 241 urea zinté.tis snbályozá sa 243 uridin lebontá a 288 urikáz 285 U-RNS 370 urobilin 265 urobilinogén 265 urokináz 253, 603 uronsav 96 uroporfi ri nogén uroporfirin ogénck 261, 268 uroporfirin ogén-koszi ntáz 261 uroporfirin ogén-szintá z 261 UTP 279 utrophin 564

V tipusú ATPázok 435, 529 vakuola 435 valódi kompetitív inhibitorok 35 va lin 3, 254 valinomici n 439 vanadát 435 vasanyagcs ere 262 va anyage ere-zavarok 268 vasculitisek 578 vashiányos anaemia 26R vas-kén komplex prosztetiku s csoport 74 va tag filamentum ok 550 vasveszté 265 vazoaktív inte tinalis peptid (VlP) 547 vazopre szin 132 vékony filamentum rendszer 551 vektor D S 405 eukarióta 41 l expresszió s 41 O verdogtobi n 265 vérlemezke -adhézió 60 l vér 589 véralvadás 589 extrinsic útja 594 inhibitorren dszere 596

647

véralvadás (folyt.) intri nsic útja 594 szabályozá sa 592 véralvadási enzimek 594 véra lvadási faktor V II 593, 594 VIII 593 JX 593 x 593 XI 594 XII 594, 595, 603 XIII 590 hiánya 595 véralvadási fo lyama tok 594 véra lvadék 589 véra lvadsái kaszká d 594 vércukorsz int acctil-CoA -karboxi láz működését befolyásoló 147 ingadozása 325 szabályozá sa 133 vérlemezké k 589, 599 aggregác iója 589, 599, 60 l vérlemezke -aktiváló faktor 599 vérukorszin t 32 1 vérzékenys ég 606 vérzékenys égi zavarok 595 very low density lipoprotein (VLDL) 157, 182, 184 vesekő 286 vezető DNS-lánc 339 vczikulák 435 V-faktor 592 vimentin 563 virionok37 6 vírusgenom 376 virusok 376 DNS-, transzform áló 379 DNS-gcnom mal rendel kező 379 replikációja 379 vitaminok 8 19 1 812 9 1' 232, 254, 291' 296 c 3 12 o, 219,499 E 3 12 K 606 vízben oldódó csoportátvi telben szcrepet játszó 57 VL DL 157, 182, 184 von Gierke-kór 133 von Wi llcbrand-fa ktor 599,601 v-one gén 383 von-Gierke -kór 286 v-SNA RE 53 1 Wcm icke- Korsakoff- szindróma 140 \. xantin 27 1, 275, 285, 349 xantin-oxid áz 69, 285, 288 xeroderma pigmentosum 349 xi lulóz-5-fos zfát !37, !39

648

TÁ RGYM UTATÓ

,

....

zimogének 223 Zovirax 285 zsíracil-CoA 89 zsíracil-CoA-dehidrogenáz 75 zsínnáj 200, 327 zsírok emésztése l 90 keménysége J 46 neutrális 145 olvadáspontja 146 zsírsavak 144, 325 béta-oxidációjának regulációja 162 de novo bioszintézise 146 elágazó szénláncú 153 esszenciális 145 jelölése l 44 koncentrációj a 325 oxidációj a 159

zsírsavak (folyt.) páratlan szénatomszámú, oxidációja 162 páros szénatomszámú, oxidációja 160 rövid szénláncú 153 speciális 153 szabad 158, 189 szintézis elkötel ező lépése 147 szintézis regulációja 14 7 telített 144 telítetlen 144, 422 telítetlen, oxidációja 162 zsírsavlánc elongációja 152 zsírsav-szintáz 148, 153 modellje 149 zsírsavszintézis 32 J zsírszövet fehér 157 szerepe az intermedier anyagcsere integrációjában 324 zselatin 569