OECD 425

OECD/OCDE PEDOMAN OECD UNTUK PENGUJIAN BAHAN KIMIA Toksisitas oral akut - Up-dan-Down-Procedure (UDP) PENGANTAR

1. Pedoman OECD untuk Pengujian Bahan Kimia secara berkala ditinjau berdasarkan kemajuan ilmiah atau perubahan praktik penilaian. Konsep pendekatan pengujian naik-turun  pertama kali dijelaskan dijelaska n oleh Dixon dan Mood (1) (2) (3) (4). Pada tahun 1985, Bruce mengusulkan untuk menggunakan prosedur up-and-down (UDP) untuk penentuan toksisitas akut bahan kimia (5). Ada beberapa variasi dari desain eksperimental naik-dan-turun untuk memperkirakan LD50. Pedoman ini didasarkan pada prosedur Bruce yang diadopsi oleh ASTM pada tahun 1987 (6) dan direvisi pada tahun 1990. Sebuah studi yang membandingkan hasil yang diperoleh dengan UDP, tes LD50 konvensional dan Prosedur Dosis Tetap (FDP, Pedoman Tes OECD 420) diterbitkan pada tahun 1995 (7). Sejak makalah awal Dixon dan Mood, makalah terus muncul dalam literatur biometrik dan terapan, memeriksa kondisi terbaik untuk penggunaan pendekatan ini (8) (9) (10) (11). Berdasarkan rekomendasi dari  beberapa pertemuan ahli pada tahun 1999, revisi tambahan dipertimbangkan tepat waktu karena: i) kesepakatan internasional telah dicapai pada nilai cut-off LD50 yang disesuaikan untuk klasifikasi zat kimia, ii) pengujian pada satu jenis kelamin (biasanya betina) umumnya dianggap cukup, dan iii) agar perkiraan titik menjadi bermakna, ada kebutuhan untuk memperkirakan interval kepercayaan (CI). 2. Prosedur pengujian yang dijelaskan dijelaska n dalam Pedoman ini bernilai dalam meminimalkan  jumlah hewan yang d ibutuhkan untuk unt uk memperkirakan toksisitas t oksisitas ora l akut bahan kimia. Selain  perkiraan interval inter val LD50 dan kepercayaan kepercaya an diri, tes tersebut memungkinkan pengamatan tandat andatanda toksisitas. Revisi Pedoman Uji 425 dilakukan bersamaan dengan revisi Pedoman Uji 420 dan 423. 3. Pedoman pemilihan metode uji yang paling tepat untuk tujuan tertentu dapat ditemukan dalam Dokumen Pedoman Uji Toksisitas Lisan (12). Dokumen Pedoman ini juga  berisi informasi tambahan t ambahan mengenai perilaku dan interpretasi interpretas i Pedoman 425. 4.

Definisi yang digunakan dalam konteks Pedoman ini tercantum tercantu m dalam Lampiran 1.

PERTIMBANGAN AWAL

5. Laboratorium pengujian harus mempertimbangkan semua informasi yang tersedia tersed ia  pada bahan uji sebelum melakukan penelitian. Informasi tersebut akan mencakup identitas dan struktur kimia dari zat uji; sifat kimia fisiknya; hasil uji toksisitas in vitro atau in vivo lainnya pada zat; data toksikologis pada zat-zat yang terkait dengan struktur atau campuran semacam itu; dan penggunaan zat yang diantisipasi. Informasi ini berguna untuk mengetahui relevansi tes untuk perlindungan kesehatan manusia dan lingkungan, dan akan membantu dalam pemilihan dosis awal yang tepat.

6. Metode ini memungkinkan estimasi LD50 dengan interval kepercayaan keperca yaan dan hasilnya memungkinkan zat untuk digolongkan dan diklasifikasikan menurut Sistem Harmonisasi Global untuk klasifikasi bahan kimia yang menyebabkan toksisitas akut (16). 7. Bila tidak ada informasi yang tersedia untuk membuat perkiraan pendahuluan pendahu luan LD50 dan kemiringan kurva dosis-respons, hasil simulasi komputer menyarankan agar dimulai mendekati 175 mg / kg dan menggunakan unit setengah-log (sesuai dengan progresi dosis faktor 3.2) antara dosis akan menghasilkan hasil terbaik. Dosis awal ini harus dimodifikasi  jika zat tersebut cenderung sangat beracun. Jarak setengah log menyediakan penggunaan penggunaa n hewan yang lebih efisien, dan meningkatkan akurasi prediksi nilai LD50. Karena metode ini memiliki bias terhadap dosis awal, sangat penting bahwa dosis awal terjadi di bawah  perkiraan LD50. (Lihat paragraf 32 dan Lampiran Lampira n 2 untuk pembahasan pe mbahasan urutan urut an dosis dan da n nilai awal). Namun, untuk bahan kimia dengan variabilitas yang besar (yaitu, lereng dosis dosis rendah), bias masih dapat diperkenalkan dalam perkiraan mematikan dan LD50 akan memiliki kesalahan statistik yang besar, serupa dengan metode toksisitas akut lainnya. Untuk memperbaiki ini, tes utama mencakup aturan penghentian yang diberikan pada properti  perkiraan dar ipada sejumlah pengamatan uji u ji tetap (lihat paragraf 33). 8. Metode ini paling mudah diterapkan pada bahan yang menghasilkan kematian dalam satu atau dua hari. Metode ini tidak akan praktis untuk digunakan saat kematian tertunda (lima hari atau lebih) dapat diperkirakan. 9. Komputer digunakan untuk memudahkan kalkulasi kalkulas i hewan-hewan yang membentuk urutan pengujian dan memberikan perkiraan akhir. 10. Uji zat, pada dosis yang diketahui menyebabkan nyeri dan tekanan tertekan akibat tindakan korosif atau sangat mengiritasi, tidak perlu diberikan. Hewan atau hewan yang hampir mati jelas sakit atau menunjukkan tanda-tanda kesedihan parah dan abadi akan dibunuh secara manusiawi, dan dianggap dalam interpretasi hasil tes dengan cara yang sama seperti hewan yang meninggal dalam tes. Kriteria untuk membuat keputusan untuk membunuh hewan yang hampir mati atau menderita berat, dan panduan tentang pengenalan kematian yang dapat diprediksi atau yang akan segera terjadi adalah subjek dari Dokumen Panduan OECD yang terpisah (13). 11. Uji batas dapat digunakan secara efisien untuk mengidentifikasi bahan kimia yang cenderung memiliki toksisitas rendah.

PRINSIP UJI BATAS

12. Limit Test adalah tes sekuensial yang menggunakan maksimal 5 hewan. Dosis uji 2000, atau sangat 5000 mg / kg, dapat digunakan. Prosedur untuk pengujian pada tahun 2000 dan 5000 mg / kg sedikit berbeda (lihat paragraf 23-25 untuk uji batas pada 2000 mg / kg dan  paragraf 26-30 untuk uji batas pada 5000 mg / kg). Pemilihan rencana uji sekuensial meningkatkan kekuatan statistik dan juga telah dibuat untuk secara sengaja bias melakukan  prosedur terhadap penolakan uji batas senyawa dengan LD50s mendekati batas dosis; yaitu,  berbuat salah pada sisi keamanan. Seperti halnya protokol uji batas, probabilitas mengklasifikasi dengan benar senyawa akan menurun karena LD50 aktual lebih mendekati  batas dosis. PRINSIP UJI UTAMA

13. Tes utama terdiri dari satu dosis tunggal yang teratur dimana hewan diberi dosis, satu  per satu, minimal interval 48 jam. Hewan pertama menerima dosis satu langkah di bawah tingkat perkiraan terbaik LD50. Jika hewan bertahan, dosis untuk hewan berikutnya meningkat sebesar [3,2 kali dosis asli; Jika meninggal, dosis untuk hewan berikutnya mengalami penurunan dengan progresi dosis yang sama. (Catatan: 3.2 adalah faktor bawaan yang sesuai dengan progresi dosis satu unit log setengah Ayat 32 memberikan panduan lebih lanjut untuk pilihan faktor jarak dosis.) Setiap hewan harus diamati dengan seksama sampai 48 jam sebelum membuat keputusan mengenai apakah dan tidak berapa dosis hewan  berikutnya Keputusan itu didasarkan pada pola bertahan 48 jam dari semua hewan sampai saat itu. (Lihat paragraf 31 dan 35 tentang pilihan interval dosis). Kombinasi kriteria  penghentian d igunakan untuk menjaga jumlah hewan tetap rendah sambil menyesuaikan pola dosis untuk mengurangi efek dari nilai awal yang buruk atau kemiringan rendah (lihat  paragraf 34). Dosis dihentikan saat salah satu dari kriteria ini terpenuhi (lihat paragraf 33 dan 41), pada saat mana perkiraan LD50 dan interval kepercayaan dihitung untuk pengujian  berdasarkan status semua hewan saat penghentian. Untuk sebagian besar aplikasi, pengujian akan diselesaikan hanya dengan 4 hewan setelah pembalikan awal pada hasil hewan. LD50 dihitung dengan menggunakan metode maximum kemungkinan (14) (15). (Lihat paragraf 41 dan 43.) 14. Hasil dari prosedur uji utama berfungsi sebagai titik awal untuk prosedur komputasi untuk memberikan estimasi interval kepercayaan jika memungkinkan. Uraian dasar untuk CI ini diuraikan dalam paragraf 45.

URAIAN METODE Pemilihan Spesies Hewan

15. Spesies hewan pengerat yang lebih disukai adalah tikus meskipun spesies hewan  pengerat lainnya dapat digunakan. Biasanya tikus betina digunakan (12). Hal ini karena survei literatur tentang tes LD50 konvensional menunjukkan bahwa biasanya ada sedikit  perbedaan dalam sensitivitas antara jenis kelamin, namun pada kasus di mana perbedaan diamati, wanita pada umumnya sedikit lebih sensitif (7). Namun, jika pengetahuan tentang sifat toksikologi atau toksinoksin bahan kimia terkait struktur menunjukkan bahwa pria cenderung lebih sensitif maka seks ini harus digunakan. Bila tes dilakukan pada pria,  pembenaran yang memadai harus diberikan. 16. Hewan dewasa muda yang sehat dari strain laboratorium yang umum digunakan harus dipekerjakan. Betina harus nulipara dan tidak hamil. Pada saat dimulainya dosis, setiap hewan harus berusia antara 8 dan 12 minggu dan beratnya harus jatuh dalam interval di antara ± 20% berat awal rata-rata dari setiap hewan yang telah diberi dosis sebelumnya. Kondisi Perumahan dan Pemberian Makan

17. Suhu di ruang hewan percobaan harus 22 ° C (± 3 ° C). Meskipun kelembaban relatif minimal 30% dan sebaiknya tidak melebihi 70% selain selama pembersihan kamar, tujuannya harus 50-60%. Pencahayaan harus buatan, urutannya 12 jam cahaya dan 12 jam gelap. Hewan-hewan tersebut ditempatkan secara terpisah. Untuk memberi makan, diet laboratorium hewan pengerat konvensional dapat digunakan dengan persediaan air minum yang tidak terbatas. Persiapan Hewan

18. Hewan-hewan tersebut dipilih secara acak, ditandai untuk mengizinkan identifikasi individu, dan disimpan di kandang mereka paling sedikit 5 hari sebelum pemberian dosis agar memungkinkan dilakukannya aklimatisasi terhadap kondisi laboratorium. Seperti pada rancangan uji sekuensial lainnya, perhatian harus diberikan untuk memastikan bahwa hewan tersedia dalam ukuran dan rentang usia yang sesuai untuk keseluruhan penelitian. Persiapan Dosis

19. Pada umumnya zat uji harus diberikan dalam volume konstan selama rentang dosis yang akan diuji dengan memvariasikan konsentrasi sediaan dosis. Jika suatu produk akhir atau campuran cair diuji, penggunaan zat uji yang belum diencerkan, yaitu pada konsentrasi konstan, mungkin lebih relevan dengan penilaian risiko berikutnya dari zat tersebut, dan merupakan persyaratan beberapa pihak yang berwenang. . Dalam kedua kasus tersebut, volume dosis maksimum untuk administrasi tidak boleh dilampaui.

Volume cairan maksimal yang bisa diberikan sekaligus bergantung pada ukuran hewan uji. Pada tikus, volume biasanya tidak melebihi 1 ml / 100g berat badan; Namun dalam kasus larutan berair, berat badan 2 ml / 100g dapat dipertimbangkan. Sehubungan dengan perumusan preparat dosis, penggunaan larutan / suspensi / emulsi berair direkomendasikan sedapat mungkin, diikuti dengan urutan pilihan dengan larutan / suspensi / emulsi dalam minyak (misalnya minyak jagung) dan kemudian kemungkinan larutan di tempat lain. kendaraan. Untuk kendaraan selain air, karakteristik toksikologi kendaraan harus diketahui. Dosis harus disiapkan segera sebelum pemberian kecuali jika kestabilan persiapan selama periode dimana obat tersebut akan digunakan diketahui dan terbukti dapat diterima. PROSEDUR Administrasi Dosis

20. Bahan uji diberikan dalam dosis tunggal oleh gavage menggunakan tabung perut atau kanula intubasi yang sesuai. Dalam keadaan yang tidak biasa bahwa dosis tunggal tidak memungkinkan, dosis dapat diberikan dalam fraksi yang lebih kecil selama periode tidak lebih dari 24 jam. 21. Hewan harus berpuasa sebelum pemberian dosis (mis., Dengan tikus, makanan tapi  bukan air harus ditahan dalam semalam; dengan mouse, makanan tapi tidak air harus ditahan selama 3-4 jam). Setelah periode puasa, hewan harus ditimbang dan zat uji diberikan. Bobot tubuh berpuasa setiap hewan ditentukan dan dosisnya dihitung sesuai berat badan. Setelah zat tersebut diberikan, makanan dapat ditahan 3-4 jam lagi pada tikus atau 1-2 jam pada tikus. Bila dosis diberikan dalam pecahan selama periode waktu tertentu, mungkin diperlukan untuk memberi hewan makanan dan air bergantung pada panjang periode. Uji batas dan Uji Utama

22. Uji batas terutama digunakan dalam situasi di mana eksperimen memiliki informasi yang menunjukkan bahwa bahan uji cenderung tidak beracun, yaitu memiliki toksisitas di  bawah dosis batas peraturan. Informasi tentang toksisitas bahan uji dapat diperoleh dari  pengetahuan tentang senyawa percobaan serupa atau campuran atau produk yang diuji serupa, dengan mempertimbangkan identitas dan persentase komponen yang diketahui memiliki toksikologi. Dalam situasi di mana hanya ada sedikit atau tidak ada informasi tentang toksisitasnya, atau dimana bahan uji diharapkan menjadi racun, tes utama harus dilakukan.

Uji Batas Uji Batas pada 2000 mg / kg

23. Dosis satu hewan pada dosis uji. Jika hewan mati, lakukan tes utama untuk mengetahui LD50. Jika hewan bertahan, tentukan empat hewan tambahan secara berurutan sehingga total lima hewan diuji. Namun, jika tiga hewan mati, tes batas dihentikan dan tes utama dilakukan. LD50 lebih besar dari 2000 mg / kg jika tiga atau lebih hewan bertahan. Jika seekor binatang tiba-tiba meninggal dalam akhir penelitian, dan ada korban lain yang selamat, adalah tepat untuk menghentikan pemberian dosis dan mengamati semua hewan untuk melihat apakah hewan lain juga akan meninggal selama periode pengamatan serupa (lihat paragraf 31 untuk periode pengamatan awal). Kematian yang terlambat harus dihitung sama dengan kematian lainnya. Hasilnya dievaluasi sebagai berikut (O = survival, X = death). 24.

LD50 kurang dari dosis uji (2000 mg / kg) saat tiga atau lebih hewan mati. O XO XX O OX XX O XX OX O XX X

Jika hewan ketiga meninggal dunia, lakukan tes utama. 25. Uji lima binatang. LD50 lebih besar dari dosis uji (2000 mg / kg) saat tiga atau lebih hewan bertahan. O OO OO O OO XO O OO OX O OO XX O XO XO O XO OO/X O OX XO O OX OO/X O XX OO Uji Batas 5000 mg / kg

26. Secara khusus, dan hanya bila dibenarkan oleh kebutuhan peraturan yang spesifik,  penggunaan dosis 5000 mg / kg dapat dipertimbangkan (lihat Lampiran 4). Untuk alasan kepedulian terhadap hewan, pengujian hewan di Kategori GHS 5 berkisar (2000-5000mg / kg) tidak disarankan dan hanya boleh dipertimbangkan bila ada kemungkinan kuat bahwa hasil tes semacam itu memiliki relevansi langsung untuk melindungi manusia atau hewan. kesehatan atau lingkungan.

27. Dosis satu hewan pada dosis uji. Jika hewan mati, lakukan tes utama untuk mengetahui LD50. Jika hewan bertahan, tetapkan dua hewan tambahan. Jika kedua hewan  bertahan, LD50 lebih besar dari batas dosis dan tes dihentikan (misal dilakukan observasi 14 hari penuh tanpa dosis hewan lebih lanjut). 28. Jika satu atau kedua hewan mati, maka beri dua binatang tambahan, satu per satu. Jika seekor binatang tiba-tiba meninggal dalam akhir penelitian, dan ada korban lain lainnya, adalah tepat untuk menghentikan pemberian dosis dan mengamati semua hewan untuk melihat apakah hewan lain juga akan meninggal selama periode pengamatan serupa (lihat  paragraf 10 untuk periode pengamatan awal). Kematian yang terlambat harus dihitung sama dengan kematian lainnya. Hasilnya dievaluasi sebagai berikut (O = survival, X = death, dan U = Unnecessary). 29.

LD50 kurang dari dosis uji (5000 mg / kg) saat tiga atau lebih hewan mati. O XO XX O OX XX O XX OX O XX X

30.

LD50 lebih besar dari dosis uji (5000 mg / kg) bila tiga atau lebih hewan bertahan. O OO O XO XO O XO O O OX XO O OX O O XX OO

Uji Utama

31. Hewan tunggal diberi dosis berurutan biasanya pada interval 48 jam. Namun, interval waktu antara dosis ditentukan oleh onset, durasi, dan tingkat keparahan tanda-tanda toksik. Perlakuan terhadap hewan pada dosis berikutnya harus ditunda sampai seseorang yakin akan kelangsungan hidup hewan yang telah diberi dosis sebelumnya. Selang waktu dapat disesuaikan sebagaimana mestinya, misalnya, jika terjadi respons yang tidak meyakinkan. Tes ini lebih mudah diterapkan bila selang waktu satu digunakan untuk membuat keputusan dosis berurutan. Namun demikian, tidak perlu menghitung ulang dosis atau rasio kemungkinan jika interval waktu berubah pada pertengahan hari. Untuk memilih dosis awal, semua informasi yang tersedia, termasuk informasi mengenai zat-zat yang terkait secara struktural dan hasil uji toksisitas lainnya pada bahan uji, harus digunakan untuk memperkirakan LD50 dan juga kemiringan kurva respons-dosis.

32. Hewan pertama diberi dosis di bawah perkiraan pendahuluan terbaik LD50. Jika hewan bertahan, hewan kedua mendapat dosis yang lebih tinggi. Jika hewan pertama meninggal atau tampak hampir mati, hewan kedua mendapat dosis lebih rendah. Faktor  progresi dosis harus dipilih sebagai antilog dari 1 / (perkiraan kemiringan kurva respons dosis) dan harus tetap konstan selama pengujian (perkembangan 3,2 sesuai dengan kemiringan 2). Bila tidak ada informasi tentang kemiringan zat yang akan diuji, faktor  progresi dosis 3.2 digunakan. Dengan menggunakan faktor perkembangan standar, dosis akan dipilih dari urutan 1.75, 5.5, 17.5, 55, 175, 550, 2000 (atau 1.75, 5.5, 17.5, 55, 175, 550, 1750, 5000 untuk kebutuhan peraturan spesifik). Jika tidak ada perkiraan tingkat kematian zat tersebut, dosis harus dimulai pada 175 mg / kg. Dalam kebanyakan kasus, dosis ini adalah sublethal dan oleh karena itu berfungsi untuk mengurangi tingkat rasa sakit dan penderitaan. Jika toleransi hewan terhadap bahan kimia diharapkan sangat bervariasi (yaitu, lereng diperkirakan kurang dari 2,0), pertimbangan harus diberikan untuk meningkatkan faktor  perkembangan dosis di luar standar 0,5 pada skala dosis log (yaitu, 3,2 faktor perkembangan ) sebelum memulai tes. Begitu pula untuk zat uji yang diketahui memiliki lereng sangat curam, faktor progresi dosis lebih kecil dari pada standar harus dipilih. (Lampiran 2 mencakup tabel progresi dosis untuk jumlah keseluruhan lereng berkisar antara 1 sampai 8 dengan dosis awal 175 mg / kg). 33. Dosis berlanjut tergantung pada hasil interval waktu tetap (misalnya 48 jam) dari semua hewan sampai saat itu. Pengujian berhenti saat salah satu kriteria penghentian berikut  pertama kali terpenuhi: a) 3 hewan berturut-turut bertahan di batas atas;  b) 5 pembalikan terjadi pada 6 hewan berturut-turut yang diuji; c) setidaknya 4 hewan telah mengikuti pembalikan pertama dan rasio kemungkinan yang ditentukan melebihi nilai kritis. (Lihat paragraf 44 dan Lampiran 3. Perhitungan dilakukan pada setiap dosis, mengikuti hewan keempat setelah pembalikan pertama). Untuk berbagai kombinasi LD50 dan lereng, aturan berhenti (c) akan terpenuhi dengan 4 sampai 6 hewan setelah pembalikan tes. Dalam beberapa kasus untuk bahan kimia dengan kurva dosis dosis surut dangkal, tambahan hewan (sampai total lima belas yang diuji) mungkin diperlukan. 34. Bila kriteria penghentian telah tercapai, perkiraan LD50 harus dihitung dari hasil hewan pada penghentian uji dengan menggunakan metode yang dijelaskan pada paragraf 40 dan 41.

35. Hewan-hewan raksasa yang dibunuh karena alasan manusiawi dianggap sama seperti hewan yang mati dalam tes. Jika seekor binatang tiba-tiba meninggal dalam akhir penelitian dan ada korban lain yang selamat dengan dosis di atas atau di atas, adalah tepat untuk menghentikan pemberian dosis dan mengamati semua hewan untuk melihat apakah hewan lain juga akan mati selama periode pengamatan serupa. Jika korban selamat berikutnya juga meninggal, dan tampaknya semua tingkat dosis melebihi LD50, paling tepat untuk memulai  penelitian kembali dimulai setidaknya dua langkah di bawah dosis terendah dengan kematian (dan meningkatkan periode pengamatan) karena teknik ini paling akurat. Bila dosis awal di  bawah LD50. Jika hewan berikutnya bertahan pada atau di atas dosis hewan yang mati, tidak  perlu mengubah progresi dosis karena informasi dari hewan yang sekarang telah meninggal akan dimasukkan ke dalam perhitungan sebagai kematian dengan dosis lebih rendah daripada yang selamat berikutnya. , menarik LD50 ke bawah. PENGAMATAN

36. Hewan diamati secara individu setidaknya satu kali selama 30 menit pertama setelah  pemberian dosis, secara berkala selama 24 jam pertama (dengan perhatian khusus diberikan selama 4 jam pertama), dan setiap hari setelahnya, selama 14 hari, kecuali jika mereka memerlukan untuk dihapus dari penelitian dan dibunuh secara manusiawi untuk alasan kesejahteraan hewan atau ditemukan tewas. Namun, durasi pengamatan sebaiknya tidak diperbaiki secara kaku. Ini harus ditentukan oleh reaksi toksik dan waktu onset dan lama masa pemulihan, dan karenanya dapat diperpanjang bila dianggap perlu. Saat tanda toksisitas muncul dan hilang penting, terutama jika ada kecenderungan tanda-tanda toksik tertunda (17). Semua pengamatan dicatat secara sistematis dengan catatan individu yang dipertahankan untuk setiap hewan. 37. Pengamatan tambahan akan diperlukan jika hewan terus menunjukkan tanda-tanda toksisitas. Pengamatan harus mencakup perubahan pada kulit dan bulu, mata dan selaput lendir, dan juga sistem pernapasan, peredaran darah, otonom dan saraf pusat, dan aktivitas somatomotor dan pola perilaku. Perhatian harus diarahkan pada pengamatan tremor, kejang, air liur, diare, kelesuan, tidur dan koma. Prinsip dan kriteria yang dirangkum dalam Human Immune Endpoints Guidance Document (13) harus dipertimbangkan. Hewan yang ditemukan dalam kondisi yang hampir mati dan hewan yang menunjukkan rasa sakit parah atau tandatanda kesedihan yang parah harus dibunuh secara manusiawi. Ketika binatang dibunuh karena alasan manusiawi atau ditemukan tewas, saat kematian harus dicatat sesedikit mungkin. Berat badan

38. Bobot hewan secara individual harus ditentukan sesaat sebelum zat uji diberikan dan  paling tidak setiap minggu setelahnya. Perubahan berat badan harus dihitung dan dicatat. Pada akhir tes, hewan yang masih hidup ditimbang dan kemudian dibunuh secara manusiawi.

Patologi

39. Semua hewan (termasuk yang meninggal selama tes atau dikeluarkan dari studi untuk alasan kesejahteraan hewan) harus mengalami nekropsi bruto. Semua perubahan patologis kasar harus dicatat untuk setiap hewan. Pemeriksaan mikroskopik organ yang menunjukkan  bukti patologi kotor pada hewan yang bertahan 24 jam atau lebih setelah pemberian dosis awal juga dapat dipertimbangkan karena dapat menghasilkan informasi yang berguna. DATA DAN PELAPORAN Data

40. Data hewan individu harus disediakan. Selain itu, semua data harus diringkas dalam  bentuk tabel, ditunjukkan untuk setiap dosis uji jumlah hewan yang digunakan, jumlah hewan yang menunjukkan tanda toksisitas (17), jumlah hewan yang ditemukan tewas selama tes atau dibunuh karena alasan kemanusiaan, waktu kematian hewan individual, deskripsi dan waktu dampak toksik dan reversibilitas, dan temuan nekropsi. Alasan untuk dosis awal dan progresi dosis dan semua data yang digunakan untuk mendukung pilihan ini harus disediakan. Perhitungan LD50 untuk Uji Utama

41. LD50 dihitung dengan menggunakan metode kemungkinan maksimum (14) (15), kecuali dalam kasus luar biasa yang dijelaskan pada paragraf 42. Detail statistik berikut mungkin berguna dalam menerapkan perhitungan kemungkinan maksimum yang disarankan (dengan asumsi σ). Semua kematian, apakah segera atau tertunda atau membunuh manusiawi, digabungkan untuk tujuan analisis kemungkinan maksimum. Setelah Dixon (4), fungsi kemungkinan ditulis sebagai berikut:  L

= L1 L2 .... Ln ,

Dimana, L adalah kemungkinan hasil eksperimen, diberikan μ dan σ, dan n jumlah total hewan yang diuji Li = 1 - F (Zi) jika ith hewan itu selamat, atau Li = F (Zi) jika ith hewan itu mati, F = distribusi normal kumulatif normal, Zi = [log (di) - μ] / σ di = dosis yang diberikan kepada hewan ith, dan σ = standar deviasi pada unit log dosis (yang bukan standar deviasi log). Perkiraan LD50 benar diberikan oleh nilai μ yang memaksimalkan kemungkinan L (lihat  paragraf 43). Perkiraan σ 0,5 digunakan kecuali ada nilai gener ik atau spesifik kasus yang lebih baik.

42. Dalam beberapa keadaan, perhitungan statistik tidak akan mungkin dilakukan atau kemungkinan akan memberikan hasil yang salah. Cara khusus untuk menentukan / melaporkan perkiraan LD50 tersedia untuk keadaan ini sebagai berikut: a) Jika pengujian dihentikan berdasarkan kriteria (a) pada paragraf 33 (yaitu, dosis batas diuji berulang kali), atau jika dosis di atas berakhir, pengujian LD50 dilaporkan  berada di atas batas at as. Klasifikasi selesai atas dasar ini.  b) Jika semua hewan yang mati memiliki dosis yang lebih tinggi daripada semua hewan hidup (atau jika semua hewan hidup memiliki dosis lebih tinggi daripada semua  binatang yang mati, walaupun hal ini hampir tidak mungkin terjadi), maka LD50 adalah antara dosis untuk yang hidup dan binatang mati Pengamatan ini tidak memberikan informasi lebih lanjut mengenai nilai pasti LD50. Meski begitu,  perkiraan LD50 kemungkinan besar bisa dibuat asalkan ada nilai σ. Menghentikan kriteria (b) pada paragraf 33 menjelaskan satu keadaan seperti itu. c) Jika hewan hidup dan mati hanya memiliki satu dosis yang sama dan semua hewan mati lainnya memiliki dosis lebih tinggi dan semua hewan hidup lainnya menurunkan dosisnya, atau sebaliknya, maka LD50 sama dengan dosis umum mereka. Jika zat yang terkait erat diuji, pengujian harus dilanjutkan dengan progresi dosis yang lebih kecil. Jika tidak ada situasi di atas terjadi, maka LD50 dihitung dengan menggunakan metode kemungkinan maksimum. 43. Perhitungan kemungkinan maksimum dapat dilakukan dengan menggunakan paket  program komputer SAS (14) (misalnya, PROC NLIN) atau BMDP (15) (misalnya, program AR) seperti yang dijelaskan pada Lampiran 1D di Referensi 3. Program komputer lain juga bisa digunakan. Petunjuk tipikal untuk paket ini diberikan dalam lampiran pada Standar ASTM E 1163-87 (6). [The σ yang digunakan dalam  program BASIC d i (6) perlu diedit untuk mencerminkan parameter dari Pedo man Tes OECD 425.] Keluaran program adalah perkiraan log (LD50) dan kesalahan standarnya. 44. Aturan penghentian rasio kemungkinan (c) pada paragraf 33 didasarkan pada tiga ukuran kemajuan uji, yang merupakan bentuk kemungkinan pada paragraf 41 dengan nilai yang berbeda untuk μ. Perbandingan dilakukan setelah setiap hewan diuji setelah keenam yang belum memenuhi kriteria (a) atau (b) paragraf 33. Persamaan untuk kriteria rasio kemungkinan disediakan pada Lampiran 3. Perbandingan ini paling mudah dilakukan secara otomatis. cara dan dapat dijalankan berulang kali, misalnya, oleh rutinitas spreadsheet seperti yang juga disediakan di Lampiran 3. Jika kriteria terpenuhi, pengujian berhenti dan LD50 dapat dihitung dengan metode kemungkinan maksimum.

Perhitungan Interval Keyakinan

45. Setelah uji coba utama dan perkiraan perhitungan LD50, dimungkinkan untuk menghitung perkiraan interval untuk LD50. Semua interval kepercayaan ini memberikan informasi berharga tentang keandalan dan kegunaan uji utama yang dilakukan. Interval kepercayaan yang luas menunjukkan bahwa ada lebih banyak ketidakpastian yang terkait dengan perkiraan LD50. Keandalan perkiraan LD50 rendah dan kegunaan perkiraan LD50 mungkin marjinal. Interval yang sempit menunjukkan bahwa ada sedikit ketidakpastian yang terkait dengan perkiraan LD50. Keandalan perkiraan LD50 tinggi dan kegunaan LD50 diperkirakan baik. Ini berarti bahwa jika tes utama diulang, perkiraan LD50 yang baru harus mendekati perkiraan awal LD50 dan kedua perkiraan ini mendekati LD50 yang benar. 46. Bergantung pada hasil tes utama, satu dari dua jenis perkiraan interval dari LD50  benar dihitung. 



Bila setidaknya ada tiga dosis berbeda yang telah diuji dan dosis tengahnya memiliki setidaknya satu hewan yang bertahan dan satu hewan yang mati, prosedur komputasi  berbasis profil digunakan untuk mendapatkan interval kepercayaan yang diharapkan mengandung LD50 yang benar. 95% dari waktu. Namun, karena sejumlah kecil hewan diharapkan bisa digunakan, tingkat kepercayaan diri sebenarnya tidak tepat (18). Aturan penghentian acak meningkatkan kemampuan tes secara keseluruhan untuk merespons berbagai kondisi yang mendasarinya, namun juga menyebabkan tingkat kepercayaan yang dilaporkan dan tingkat kepercayaan diri yang sebenarnya agak berbeda (19). Jika semua hewan bertahan pada atau di bawah tingkat dosis tertentu dan semua hewan mati saat diberi dosis pada tingkat dosis yang lebih tinggi berikutnya, interval dihitung yang memiliki batas bawah dosis tertinggi yang diuji di mana semua hewan  bertahan dan memiliki batas atas tingkat dosis dimana semua hewan mat i. Interval ini diberi label sebagai "perkiraan." Tingkat kepercayaan pasti yang terkait dengan interval ini tidak dapat ditentukan secara khusus. Namun, karena jenis respons ini hanya akan terjadi bila respons dosisnya curam, pada kebanyakan kasus, LD50 sejati diperkirakan terkandung dalam interval yang dihitung atau sangat dekat dengannya. Interval ini akan relatif sempit dan cukup akurat untuk penggunaan yang paling  praktis.

47. Dalam beberapa kasus, interval kepercayaan dilaporkan tidak terbatas, termasuk memasukkan nol sebagai ujung bawah atau tak terhingga sebagai ujung atasnya, atau keduanya. Interval semacam itu, misalnya, dapat terjadi bila semua hewan mati atau semua hewan hidup. Menerapkan serangkaian prosedur ini memerlukan perhitungan khusus yang dapat dilakukan dengan menggunakan program khusus yang tersedia dari USEPA atau OECD atau dikembangkan sesuai rincian teknis yang tersedia dari USEPA atau OECD (20). Pencapaian cakupan interval dan sifat dari program khusus ini dijelaskan dalam laporan (21)  juga tersedia melalui USEPA.

Laporan pengujian

48.

Laporan pengujian harus mencakup informasi berikut: Bahan uji:  

Sifat fisik, kemurnian dan, bila relevan, sifat fisik-kimia (termasuk isomerisasi); data identifikasi, termasuk nomor CAS.

Kendaraan (jika sesuai): 

 pembenaran untuk pilihan kendaraan, jika selain air.

Uji hewan:    

spesies / strain yang digunakan; Status mikrobiologi hewan, bila diketahui;  jumlah, usia dan jenis kelamin hewan (termasuk, jika sesuai, alasan penggunaan lakilaki dan bukan perempuan); sumber, kondisi perumahan, diet, dll.

Kondisi uji:    

Alasan pemilihan tingkat dosis awal, faktor progresi dosis dan tingkat dosis tindak lanjut; rincian formulasi zat uji termasuk rincian bentuk fisik bahan yang diberikan; rincian administrasi zat uji termasuk volume dosis dan waktu pemberian; Rincian kualitas makanan dan air (termasuk jenis makanan / sumber, sumber air).

Hasil:    

  

 berat badan / berat badan berubah; tabulasi data respon dan tingkat dosis untuk setiap hewan (yaitu hewan menunjukkan tanda-tanda toksisitas termasuk sifat, tingkat keparahan, durasi efek, dan mortalitas); Bobot individu hewan pada hari pemberian dosis, dalam interval mingguan sesudahnya, dan pada saat kematian atau pengorbanan; waktu terjadinya onset tanda toksisitas dan apakah ini dapat dibalik untuk setiap hewan; emuan nekropsi dan temuan histopatologis untuk setiap hewan, jika tersedia; data LD50; Perlakuan statistik hasil (deskripsi kalkulasi rutin komputer dan tabulasi spreadsheet  perhitungan).

Diskusi dan interpretasi hasil. Kesimpulan.

LITERATUR

1) Dixon W.J. and A.M. Mood. (1948). A Method for Obtaining and Analyzing Sensitivity Data. J. Amer. Statist. Assoc., 43, 109-126. 2) Dixon W.J. The Up-and-Down Method for Small Samples (1965). J. Amer. Statist. Assoc. 60, 967-978. 3) Dixon W.J. (1991). Staircase Bioassay: The Up-and-Down Method. Neurosci. Biobehav. Rev., 15, 47-50. 4) Dixon W.J. (1991) Design and Analysis of Quantal Dose-Response Experiments (with Emphasis on Staircase Designs). Dixon Statistical Associates, Los Angeles CA, USA. 5) Bruce R.D. (1985). An Up-and-Down Procedure for Acute Toxicity Testing. Fundam. Appl. Tox., 5, 151-157. 6) ASTM (1987). E 1163-87, Standard Test Method for Estimating Acute Oral Toxicity in Rats. American Society for Testing and Materials, Philadelphia Pa, USA. 7) Lipnick R.L., Cotruvo J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I., Goddard M., Segal L., Springer J.A., and Myers R.C. (1995). Comparison of the Upand-Down, Conventional LD50 and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol., 33, 223-231. 8) Choi S.C. (1990). Interval estimation of the LD50 based on an up-and-down experiment. Biometrics 46, 485-492. 9) Vågerö M. and R. Sundberg. (1999). The distribution of the maximum kemungkinan estimator in up-and-down experiments for quantal dose-response data. J. Biopharmaceut. Statist. 9(3), 499-519. 10) Hsi B.P. (1969). The multiple sample up-and-down method in bioassay. J. Amer. Statist. Assoc. 64, 147-162. 11) Noordwijk van A.J. and van Noordwijk J. (1988). An accurate method for estimating an approximate lethal dose with few animals, tested with a Monte Carlo procedure. Arch. Toxicol. 61, 333-343. 12) OECD (2000). Guidance Document on Acute Oral Toxicity . Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 13) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. 14) SAS Institute Inc. (1990). SAS/STAT® User’s Guide. Version 6, Fourth Ed. or later. Cary, NC, USA. 15) BMDP Statistics Software, Inc. (1990). BMDP Statistical Software Manual. W.J. Dixon, Chief Ed. 1990 rev. or later. University of California Press, Berkeley, CA, USA.

16) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmentla Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and Working Party on Chemicals in  November 1998, Part 2, pg 11. [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-52114-no-24-no-0,FF.html]. 17) Chan P.K. and Hayes A.W. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA. 18) Rosenberger W.F., Flournoy N. and Durham S.D. (1997). Asymptotic normality of maximum kemungkinan estimators from multiparameter response-driven designs. Journal of Statistical Planning and Inference 60, 69-76. 19) Jennison C. and Turnbull B.W. 2000. Group Sequential Methods with Application to Clinical Trials. Chapman & Hall/CRC: Boca Raton, FL. USA. 20) Acute Oral Toxicity (OECD Test Guideline 425) Statistical Programme (AOT 425 StatPgm). Version: 1.0, 2001. [http://www.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-document-524nodirectorate-no-24-6775-8,FF.html] 21) Westat. 2001. Simulation Results from the AOT425StatPgm Program. Report  prepared for U.S. E.P.A. under Contract 68-W7-0025, Task Order 5-03.

LAMPIRAN 1 DEFINISI

Toksisitas oral akut mengacu pada efek samping yang terjadi setelah pemberian oral dosis tunggal suatu zat, atau beberapa dosis yang diberikan dalam waktu 24 jam. Kematian yang tertunda berarti bahwa hewan tidak mati atau tampak mati dalam 48  jam namun meninggal kemudian selama periode pengamatan 14 hari. Dosis adalah jumlah zat uji yang diberikan. Dosis dinyatakan sebagai berat (g, mg) atau sebagai berat zat uji per satuan berat hewan uji (misal: mg / kg). Faktor perkembangan dosis, kadang-kadang disebut faktor jarak dosis, mengacu pada kelipatan dimana dosis meningkat (yaitu, progresi dosis) saat hewan bertahan atau pembagi yang mengalami penurunan saat hewan mati. Faktor progresi dosis direkomendasikan untuk menjadi antilog dari 1 / (perkiraan kemiringan kurva respons dosis). Faktor progresi dosis standar direkomendasikan untuk menjadi 3,2 = antilog 0,5 = antilog ½. GHS: Sistem Klasifikasi yang Harmonisasi Secara Global untuk Zat Kimia dan Campuran. Kegiatan bersama OECD (kesehatan manusia dan lingkungan), Komite Ahli Transportasi Barang Berbahaya (sifat kimiawi) dan ILO (komunikasi bahaya) dan dikoordinasikan oleh Program Interorganis untuk Pengelolaan Bahan Kimia yang Komprehensif (IOMC ). Kematian yang akan datang: ketika negara atau kematian maut diperkirakan sebelum waktu pengamatan berikutnya direncanakan. Tanda-tanda yang menunjukkan keadaan ini  pada hewan pengerat bisa meliput i kejang, posisi lateral, ganjalan, dan tremor. (Lihat Human Human Science (BUKU) Endpoint Guidance Document (13) untuk lebih jelasnya). LD50 (median dosis oral mematikan), adalah dosis tunggal yang diturunkan secara statistik dari suatu zat yang dapat diperkirakan menyebabkan kematian pada 50 persen hewan saat diberikan oleh rute oral. Nilai LD50 dinyatakan dalam satuan berat zat uji per satuan  berat uji hewan (mg / kg). Dosis batas mengacu pada dosis pada batasan atas pada pengujian (2000 atau 5000 mg / kg). Moribund status: berada dalam keadaan sekarat atau ketidakmampuan untuk bertahan hidup, bahkan jika diobati. (Lihat Human Human Science (BUKU) Endpoint Guidance Document (13) untuk lebih jelasnya).

Ukuran sampel nominal mengacu pada jumlah total hewan yang diuji, dikurangi satu angka di bawah jumlah tanggapan seperti pada awal rangkaian, atau jumlah hewan yang diuji sampai namun tidak termasuk pasangan yang menciptakan pembalikan pertama. Misalnya, untuk rangkaian di mana X dan O menunjukkan hasil hewan yang berlawanan (misalnya, X dapat berupa: "meninggal dalam 48 jam" dan O: "bertahan") dalam pola sebagai berikut: OOOXXOXO, kita memiliki jumlah total yang diuji hewan (atau ukuran sampel dalam  pengertian konvensional) sebagai 8 dan ukuran sampel nominal seperti 6. Contoh khusus ini menunjukkan 4 hewan setelah pembalikan. Penting untuk dicatat apakah penghitungan di  bagian tertentu dari pedoman mengacu pada ukuran sampel nominal atau jumlah yang diuji. Misalnya, jumlah aktual aktual yang diuji adalah 15. Bila pengujian dihentikan berdasarkan  jumlah maksimum tersebut, ukuran sampel nominalnya akan kurang dari atau sama dengan 15. Anggota sampel nominal dimulai dengan hewan st (r-1) hewan sebelum yang kedua dalam pasangan pembalikan) (lihat pembalikan di bawah). Kematian yang dapat ditebak: adanya tanda klinis yang mengindikasikan kematian  pada waktu yang diketahui di masa depan sebelum akhir percobaan yang direncanakan, misalnya: ketidakmampuan mencapai air atau makanan. (Lihat Human Human Science (BUKU) Endpoint Guidance Document (13) untuk lebih jelasnya). Probit adalah kependekan dari istilah "probability integral transformation" dan model respons dosis probit memungkinkan distribusi normal standar dari respons yang diharapkan (yaitu, yang berpusat pada mean dan diskalakan dengan standar deviasinya, σ) terhadap dosis (biasanya dalam skala logaritmik) untuk dianalisis seolah-olah itu adalah garis lurus dengan kemiringan timbal balik σ. Distribusi normalitas normal adalah simetris; Oleh karena itu, meannya juga merupakan respons LD50 atau median yang sebenarnya. Pembalikan adalah situasi di mana nonresponse diamati pada dosis tertentu, dan respons diamati pada dosis berikutnya yang diuji, atau sebaliknya (yaitu, respons diikuti oleh nonresponse). Dengan demikian, pembalikan diciptakan oleh sepasang tanggapan. Pasangan  pertama terjadi pada hewan bernomor r-1 dan r. σ adalah standar deviasi kurva log normal yang menggambarkan kisaran toleransi subjek uji terhadap bahan kimia (di mana subjek diharapkan mampu merespons jika dosis kimia melebihi toleransi subjek). Perkiraan σ memberikan perkiraan variasi di antara hewan uji dalam menanggapi berbagai dosis. Lihat lereng dan probit. Lereng (kurva dosis-respons) adalah nilai yang terkait dengan sudut di mana kurva respons dosis naik dari sumbu dosis. Dalam kasus analisis probit, ketika respons dianalisis  pada skala probit terhadap dosis pada skala log, kurva ini akan menjadi garis lurus dan kemiringannya adalah timbal balik σ, standar deviasi dari toleransi uji yang mendasarinya, yang diasumsikan untuk didistribusikan secara normal. Lihat pro bit dan σ.

Aturan penghentian digunakan dalam pedoman ini secara sinonim dengan 1) kriteria  penghentian tertentu dan 2) pengumpulan semua kriteria yang menentukan kapan urutan  pengujian berakhir. Secara khusus, untuk uji utama, aturan penghentian digunakan pada  paragraf 7 sebagai singkatan u ntuk kriteria yang bergantung pada perbandingan rasio dengan nilai kritis. LAMPIRAN 2 PROSEDUR DOSING Urutan Dosis untuk Uji Utama

1. Prosedur Dosis Up-and-Down. Untuk masing-masing lari, hewan diberi dosis, satu  per satu, biasanya pada interval 48 jam. Hewan pertama menerima dosis satu langkah di  bawah tingkat perkiraan terbaik LD50. Pilihan ini mencerminkan penyesuaian kecenderungan untuk bias menjauhi LD50 ke arah dosis awal awal pada perkiraan akhir (lihat paragraf 7 dari Pedoman). Pola keseluruhan hasil diperkirakan akan stabil karena dosis disesuaikan untuk masing-masing hewan berikutnya. Ayat 3 di bawah ini memberikan panduan lebih lanjut untuk pemilihan faktor jarak tempuh. 2. Default Dose Progression. Setelah dosis awal dan jarak dosis diputuskan, ahli toksikologi harus mencantumkan semua dosis yang mungkin termasuk batas atas (biasanya 2000 atau 5000 mg / kg). Dosis yang dekat dengan batas atas harus dilepaskan dari  perkembangan. Sifat melangkah dari desain TG 425 menyediakan beberapa dosis pertama untuk berfungsi sebagai rangkaian penyesuaian diri. Karena kecenderungan bias positif, jika tidak diketahui zat apa, dosis awal 175 mg / kg dianjurkan. Jika prosedur standarnya digunakan untuk tes utama, dosis akan dimulai pada 175 mg / kg dan dosis akan diberi jarak dengan faktor 0,5 pada skala dosis log. Dosis yang akan digunakan meliputi 1,75, 5,5, 17,5, 55, 175, 550, 2000 atau untuk kebutuhan peraturan spesifik, 1.75, 5.5, 17.5, 55, 175, 550, 1750, 5000. Untuk zat beracun tertentu, dosis Urutan mungkin perlu diperluas ke nilai yang lebih rendah. 3. Dalam hal faktor progresi dosis selain standar dianggap sesuai, Tabel 1 memberikan  progresi dosis untuk kelipatan bilanga n bulat keseluruhan, dari 1 sampai 8.

Tabel 1 Dosis Progresi untuk Pedoman Tes OECD 425 Pilih Lereng dan Baca Kolom Bawah Semua dosis dalam mg / kg bb

Jika dosis rendah dibutuhkan, lanjutkan progresi ke dosis yang lebih rendah

LAMPIRAN 3 KOMPUTASI UNTUK ATURAN BERKELANJUTAN BERKELANJUTAN

1. Seperti yang dijelaskan dalam Pedoman paragraf 33, tes utama dapat diselesaikan  berdasarkan kriteria pertama dari tiga rintangan yang akan terjadi. Bagaimanapun, bahkan  jika tidak ada kriteria penghentian yang terpenuhi, dosis akan berhenti bila 15 hewan diberi dosis. Tabel 2-5 mengilustrasikan contoh di mana pengujian dimulai tanpa informasi, jadi nilai awal standar yang disarankan, 175 mg / kg, dan faktor progresi dosis standar yang disarankan, 3,2 atau satu setengah log, telah digunakan. Perlu diketahui format tabel ini hanya ilustratif. 2. Tabel 2 menunjukkan bagaimana tes utama akan berhenti jika 3 hewan bertahan dengan dosis dosis 2000 mg / kg; Tabel 3 menunjukkan situasi yang sama ketika dosis dosis 5000 mg / kg digunakan. (Ini menggambarkan situasi di mana Uji Batas tidak dianggap tepat a priori.) Tabel 4 menunjukkan bagaimana urutan 5 pembalikan pada 6 hewan percobaan dapat terjadi dan memungkinkan penyelesaian uji. Akhirnya, Tabel 5 mengilustrasikan situasi dimana tidak ada kriteria (a) atau kriteria (b) yang telah dipenuhi, pembalikan respons telah terjadi diikuti oleh 4 hewan yang diuji, dan akibatnya, kriteria (c) harus dievaluasi juga. 3. Kriteria (c) meminta aturan penghentian rasio kemungkinan untuk dievaluasi setelah menguji setiap hewan, dimulai dengan pengujian keempat setelah pembalikan. Tiga "langkah kemajuan uji" dihitung. Secara teknis, langkah-langkah kemajuan ini kemungkinan, seperti yang direkomendasikan untuk estimasi LV-kemungkinan maksimum. Prosedur ini terkait erat dengan perhitungan interval kepercayaan dengan prosedur berbasis kemungkinan. 4. Dasar prosedurnya adalah bahwa ketika data yang cukup dikumpulkan, estimasi titik LD50 harus lebih kuat didukung daripada nilai di atas dan di bawah perkiraan titik, di mana dukungan statistik dihitung dengan menggunakan kemungkinan. Oleh karena itu, tiga nilai kemungkinan dihitung: kemungkinan pada perkiraan titik LD50 (disebut perkiraan kasar atau  perkiraan rata-rata dosis dalam contoh), kemungkinan pada nilai di bawah perk iraan titik, dan kemungkinan pada nilai di atas perkiraan titik. Secara khusus, nilai yang rendah dianggap sebagai estimasi titik dibagi dengan 2,5 dan nilai yang tinggi dianggap sebagai estimasi titik dikalikan dengan 2.5. 5. Nilai kemungkinan dibandingkan dengan menghitung rasio kemungkinan, dan kemudian menentukan apakah rasio kemungkinan (LR) ini melebihi nilai kritis. Pengujian  berhenti ketika rasio kemungkinan untuk estimasi titik melebihi masing-masing kemungkinan lainnya dengan faktor 2,5, yang diambil untuk menunjukkan dukungan statistik yang relatif kuat untuk estimasi titik. Oleh karena itu dua rasio kemungkinan (LRs) dihitung, rasio kemungkinan untuk estimasi titik dan estimasi titik dibagi dengan 2,5, dan rasio untuk estimasi titik dan perkiraan waktu 2.5.

6. Perhitungan LD50 sendiri mudah dilakukan di spreadsheet manapun dengan fungsi  probabilitas normal. Perhitungan diilustrasikan pada Tabel 5 di Lampiran 3 ini yang disusun untuk meniru penerapan spreadsheet. Langkah perhitungan diilustrasikan dengan menggunakan contoh dimana dosis batas atas adalah 5000 mg / kg, namun langkah  perhitungan dilakukan dengan cara yang sama ketika dosis batas atas adalah 2000 mg / kg. Sebagai alternatif, perangkat lunak mandiri, yang menyediakan grid entri data hewan dan menggabungkan formula yang diperlukan untuk perhitungan estimasi dan perhitungan interval LD50, tersedia untuk diunduh langsung dari situs web OECD dan US EPA. Tabel 6 menunjukkan gambar layar dari perangkat lunak ini. 7. Dalam contoh hipotetis yang menggunakan dosis batas atas 5000 mg / kg, kriteria  penghentian LR dipenuhi setelah sembilan hewan telah diuji. "Pembalikan" pertama terjadi  pada binatang ke-3 yang diuji. Kriteria penghentian LR diperiksa saat empat hewan diuji setelah pembalikan. Dalam contoh ini, hewan keempat yang diuji setelah pembalikannya adalah hewan ketujuh yang benar-benar diuji. Oleh karena itu, untuk contoh ini, perhitungan spreadsheet hanya diperlukan setelah hewan ketujuh diuji dan data dapat dimasukkan pada saat itu. Selanjutnya, kriteria penghentian LR akan diperiksa setelah menguji hewan ketujuh, hewan kedelapan, dan yang kesembilan. Kriteria penghentian LR pertama kali dipuaskan setelah hewan kesembilan diuji dalam contoh ini. A. Masukkan informasi respon dosis hewan oleh binatang. Kolom 1. Langkah diberi nomor 1-15. Tidak lebih dari 15 hewan dapat diuji. Kolom 2. Tempatkan saya di kolom ini karena setiap hewan diuji. Kolom 3. Masukkan dosis yang diterima oleh hewan ith. Kolom 4. Tunjukkan apakah hewan tersebut merespons (ditunjukkan oleh X) atau tidak  bereaksi (ditunjukkan oleh huruf O).

B. Ukuran sampel nominal dan aktual. 8. Sampel nominal terdiri dari dua hewan yang mewakili pembalikan pertama (di sini  binatang kedua dan ketiga), ditambah semua hewan yang diuji selanjutnya. Di sini, Kolom 5 menunjukkan apakah hewan tertentu termasuk dalam sampel nominal atau tidak. Ukuran sampel nominal (nominal n) muncul di Baris 16. Ini adalah jumlah hewan dalam sampel nominal. Pada contoh, nominal n adalah 8. Jumlah sebenarnya yang teruji muncul di Baris 17.

C. Perkiraan kasar LD50. 9. Mean geometrik dosis untuk hewan dalam sampel nominal saat ini digunakan sebagai  perkiraan kasar LD50 untuk mengukur kemajuan. Di dalam tabel, ini disebut "estimator dosis rata-rata". Diupdate dengan masing-masing hewan diuji. Rata-rata ini dibatasi pada sampel nominal untuk memungkinkan pilihan dosis tes awal yang buruk, yang dapat menghasilkan serangkaian tanggapan awal atau rangkaian awal non-tanggapan. (Namun, hasil untuk semua hewan digunakan dalam perhitungan kemungkinan untuk perhitungan LD50 akhir di bawah ini.) Ingat bahwa mean geometrik n angka adalah produk dari n angka, dinaikkan menjadi kekuatan 1 / n. Perkiraan rata-rata dosis muncul di Baris 18 (mis., (175 * 550 * ... * 1750) 1/8 = 1292,78). Baris 19 menunjukkan logaritma (basis 10) dari nilai di Baris 18 (misalnya, log10 1292.8 = 3.112). D. Kemungkinan untuk perkiraan LD50 kasar. 10. Kemungkinan adalah ukuran statistik seberapa kuat data mendukung perkiraan  parameter LD50 atau parameter lainnya. Rasio nilai kemungkinan dapat digunakan untuk membandingkan seberapa baik data tersebut mendukung perkiraan LD50 yang berbeda. 11. Pada kolom 8 hitung kemungkinan untuk perkiraan kasar LDL Step C. Kemungkinan (Baris 21) adalah produk dari kemungkinan kontribusi untuk hewan perorangan (lihat Pedoman paragraf 41). Kemungkinan kontribusi untuk hewan ith itu adalah Li. 12. Pada kolom 7 masukkan perkiraan probabilitas respons pada dosis di, yang dilambangkan Pi. Pi  dihitung dari kurva dosis-respon. Perhatikan bahwa parameter kurva respon dosis probit adalah kemiringan dan LD50, jadi nilai dibutuhkan untuk masing-masing  parameter tersebut. Untuk perkiraan dosis rata-rata LD50 dari Row 18 digunakan. Untuk kemiringan pada contoh ini nilai default 2 digunakan. Langkah-langkah berikut dapat digunakan untuk menghitung probabilitas respon Pi. 1. Hitunglah base -10 log dosis di (Kolom 6). 2. Untuk setiap hewan menghitung z-score, dilambangkan dengan Zi  (tidak ditunjukkan dalam tabel), dengan menggunakan rumus σ = 1 / kemiringan, Zi = (log10 (di) - log10 (LD50)) / σ Misalnya, untuk binatang pertama (Baris 1), σ

= 1/2

Z1

= (2.243 - 3.112) / 0.500 = -1.738

th

3. Untuk dosis ke-i , probabilitas respons diperkirakan adalah Pi = F (Zi) dimana F menunjukkan fungsi distribusi kumulatif untuk distribusi normal standar (yaitu, distribusi normal dengan mean 0 dan varians 1). Misalnya (Baris 1),  P 1 = F (

-1.738 ) = 0.0412

Fungsi F (atau sesuatu yang sangat dekat) biasanya adalah apa yang diberikan untuk distribusi normal dalam tabel statistik, namun fungsinya juga banyak tersedia sebagai fungsi spreadsheet. Ini tersedia dengan nama yang berbeda, misalnya fungsi @NORMAL Lotus 1-23 (1) dan fungsi @NORMDIST di Excel (2). Untuk memastikan bahwa Anda telah menggunakan dengan benar fungsi yang tersedia dalam perangkat lunak Anda, mungkin Anda ingin memverifikasi nilai yang sudah dikenal seperti F (1.96) ≈ 0.975 atau F (1.64) ≈ 0.95. 13. Kolom 8. Hitung log alami dari kontribusi kemungkinan (ln (Li)). Li hanyalah  probabilitas respons yang benar-benar diamati untuk hewan ith: hewan yang merespons: ln (Li) = ln (Pi) hewan yang tidak merespons: ln (Li) = ln (1 - P i) Perhatikan bahwa di sini logaritma alami (ln) digunakan, sedangkan di tempat lain logaritma basis-10 (common) digunakan. Pilihan ini biasanya diharapkan dalam konteks tertentu. Langkah-langkah di atas dilakukan untuk setiap hewan. Akhirnya: Baris 20 : Sebutkan kemungkinan log-kemungkinan di Kolom 8. Baris 21 : Hitung kemungkinan dengan menerapkan fungsi exp yang diterapkan pada nilai -3.389 log-kemungkinan di Row 20 (mis., Exp (-3.389) = e  = 0,0337). E. Hitung kemungkinan untuk dua nilai dosis di atas dan di bawah perkiraan kasar. 14. Jika data mengizinkan perkiraan yang tepat, maka orang akan memperkirakan kemungkinannya harus tinggi jika perkiraan tersebut merupakan perkiraan yang wajar dari LD50, yang relatif terhadap kemungkinan nilai yang jauh dari perkiraan ini. Bandingkan kemungkinan untuk perkiraan rata-rata dosis (1292.8, Baris 18) terhadap nilai yang berbeda dengan faktor 2,5 dari nilai tersebut (yaitu, 1292,8 * 2,5 dan 1292,8 / 2,5). Perhitungan (ditampilkan dalam Kolom 9-12) dilakukan dengan cara yang serupa dengan yang dijelaskan di atas, kecuali bahwa nilai 517.1 (= 1292.8 / 2.5) dan 3232.0 (= 1292.8 * 2.5) telah digunakan untuk LD50, bukan 1292.8. Kemungkinan dan kemungkinan log ditampilkan dalam Baris 20-21.

F. Hitung rasio kemungkinan. 15. Tiga nilai kemungkinan (Baris 21) digunakan untuk menghitung dua rasio kemungkinan (Baris 22). Rasio kemungkinan digunakan untuk membandingkan dukungan statistik untuk estimasi 1292.8 terhadap dukungan untuk masing-masing nilai lainnya, 517,1 dan 3232.0. Dua rasio kemungkinan karena itu: LR1

= [kemungkinan 1292.8] / [kemungkinan 517,1] = 0,0337 / 0.0080 = 4,21 dan

LR2

= [kemungkinan 1292.8] / [kemungkinan 3232,0] = 0,0337 / 0.0098 = 3,44 G. Tentukan apakah rasio kemungkinan melebihi nilai kritis.

16. Rasio kemungkinan tinggi diambil untuk menunjukkan dukungan yang relatif tinggi untuk estimasi titik LD50. Kedua rasio kemungkinan yang dihitung pada Langkah F (4,21 dan 3,44) melebihi rasio kemungkinan kritis, yaitu 2,5. Oleh karena itu kriteria penghentian LR terpenuhi dan pengujian berhenti. Hal ini ditunjukkan oleh TRUE di Baris 24 dan sebuah catatan di bagian atas spreadsheet contoh bahwa kriteria LR terpenuhi. LITERATUR 1) Lotus Development Corporation (1999). Lotus® 1-2-3. Versi 9.5, Edisi Millenium. Cambridge, MA, AS. 2) Microsoft Corporation (1985-1997). Microsoft® Excel Versi 5.0 atau yang lebih baru. Seattle, WA, AS.

LAMPIRAN 4 KRITERIA UNTUK KLASIFIKASI BAHAN TEST DENGAN NILAI LD50 YANG DIHARAPKAN SAMPAI 2000 MG / KG TANPA KEBUTUHAN UNTUK PENGUJIAN

1. Kriteria bahaya Kategori 5 dimaksudkan untuk memungkinkan identifikasi bahan uji yang memiliki bahaya toksisitas akut yang relatif rendah namun, dalam keadaan tertentu dapat menimbulkan bahaya bagi populasi rentan. Zat ini diantisipasi memiliki LD50 oral atau dermal dalam kisaran 2000-5000 mg / kg atau setara dosis untuk rute lainnya. Bahan uji dapat diklasifikasikan dalam kategori bahaya yang didefinisikan oleh: 2000 mg / kg
 



Informasi yang andal tersedia yang menunjukkan efek toksik yang signifikan  pada manusia, atau Kematian apapun diamati saat diuji sampai kategori 4 oleh rute oral, atau di mana penilaian ahli mengkonfirmasi tanda klinis yang signifikan dari toksisitas, saat diuji sampai kategori 4, kecuali diare, piloereksi atau  penampilan yang tidak jelas, atau di mana penilaian ahli mengkonfirmasikan informasi yang andal yang menunjukkan potensi efek akut yang signifikan dari penelitian hewan lainnya.

PENGUJIAN PADA DOSIS DI ATAS 2000 MG / KG

2. Mengakui kebutuhan untuk melindungi kesejahteraan hewan, pengujian pada hewan di Kategori 5 berkisar tidak dianjurkan dan hanya boleh dipertimbangkan bila ada kemungkinan kuat bahwa hasil tes semacam itu akan memiliki relevansi langsung untuk melindungi kesehatan manusia.