Observação de Bactérias Fl uorescentes Resumo: este trabalho tem como finalidade esclarecer o conceito de técnica do ADN recombinante e de como esta permite induzir novas características fenotípicas em bactérias Escherichia Coli
,
utilizando como vector geneticamente modificado através de enzimas de ,
restrição o plasmídeo pGLO; e o gene responsável pela fluorescência. Utilizando esta técnica ,
foi possível a observação de bactérias fluorescentes quando em contacto com a luz ultravioleta sendo este o principal objectivo da actividade laboratorial. Esta permitiu então
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clarificar os seguintes conceitos: Técnica do ADN Recombinante Características Fenotípicas
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Bactéria Escherichia Coli Enzimas de Restrição pGLO e Gene GFP. ,
1.
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,
Representação do Plasmídeo recombinante pGLO
Método: Colocou-se num microtubo 250µl de solução de transformação (CaCl2) [uma solução ,
,
básica para estabilizar o ADN depois de este estar alterado). Recolheu-se uma pequena porção de Bactérias da espécie Escherichia Coli com uma ansa descartável e inseriu-se a mesma no microtubo. Identificaram-se posteriormente os microtubos com +pGLO ou pGLO (o ,
microtubo que continha plasmídeos pGLO foi identificado com um + (=mais) enquanto que os ,
que não continham DNA plasmídico foram identificados com um (=menos)). Recolheu-se uma película de plasmídeos com outra ansa descartável e inseriu-se os mesmos no microtúbulo assinalado com +pGLO. Incubaram-se Incubaram-se os microtubos em gelo após a devida ,
identificação durante aproximadamente 5 minutos. Posteriormente os mesmos foram ,
colocados num bloco térmico a 42°C durante 1 minuto. Novamente os mesmos foram colocados no gelo durante 2 minuto. Finalmente adicionou-se 250µl de meio LB a cada um ,
dos microtubos e foram deixados à temperatura ambiente durante 3 minutos. Agitaram-se os microtubos e adicionaram-se 100 µl de cada microtubo às placas de Petri correspondentes. Dispersou-se uniformemente com uma ansa esterilizada. Incubaram-se as placas de Petri em posição invertida a 37°C durante 12 horas. Observaram-se as placas de Petri sob a luz ,
ultravioleta. Resultados:
1
Discussão de resultados: após observação dos resultados podemos afirmar que o único meio ,
de cultura em que os genes presentes no plasmídeo recombinante se expressam na totalidade é o que é constituído por LB (meio nutritivo) Ampicilina e Arabinose. Foi possível observar ,
que no seu genoma natural as ,
Escherichia Coli
,
,
não possuem o gene que lhes confere
resistência à Ampicilina sendo que na caixa de Petri que continha meio nutritivo LB e ,
Ampicilina não se verificou alteração no crescimento. Como no meio de cultivo que apenas continha LB se deu crescimento e formação de colónias a morte da outra montagem terá sido ,
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inequivocamente devida à presença de Ampicilina no meio. Por outro lado ambas as ,
,
montagens que continham as células modificadas tinham presente Ampicilina e em ambas se ,
,
verificou o crescimento populacional das bactérias formando colónias. Estes resultados ,
permitem concluir que as bactérias modificadas através da incorporação do plasmídeo pGLO adquirem resistência à Ampicilina. A última observação feita das caixas de Petri é precisamente a expressão ou não do gene GFP. Não se esperava que nenhum dos meios que ,
,
contêm as bactérias não modificadas evidenciasse fluorescência e assim se verificou. No ,
entanto ambos os meios com bactérias modificadas ou seja portadoras no plasmídeo ,
,
,
recombinante pGLO dariam resposta às hipóteses propostas anteriormente. A úni ca diferença ,
entre os dois meios era a presença ou ausência de Arabinose. Ao serem observadas à luz ultravioleta verificou-se que apenas o meio que continha Arabinose emitia fluorescência. Isto ,
veio provar outro facto: a expressão do gene GFP depende do operão Arabinose. Se este último for transcrito (arabinose presente no meio) o gene GFP é transcrito e a proteína é sintetizada conferindo à
Escherichia
Coli
uma fluorescência esverdeada que não é
característica do seu genoma natural; no caso de este operão não ser transcrito (ausência de arabinose no meio) o gene GFP também não o é não havendo síntese da GFP. Desta forma as ,
bactérias não emitem fluorescência.
2
Conclusão: Conclui-se que a técnica do DNA recombinante é muito utilizada em engenharia genética para possibilitar a criação de novos fenótipos numa determinada espécie. Após todo o estudo das bactérias e usando esta técnica formularam-se duas hipóteses: - As bactérias geneticamente modificadas ou seja que incorporaram o plasmídeo recombinante emitem fluorescência quando observadas à luz Ultra Violeta se estiverem na presença de Arabinose; expostas ao antibiótico (Ampicilina) estas bactérias sobrevivem. - As bactérias que não foram postas em contacto com o plasmídeo recombinante não o incorporaram logo não sobreviverão em meios de cultura onde esteja presente o antibiótico Ampicilina. Da mesma forma não apresentarão fluorescência devido à au sência do GFP. ,
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Nota: os passos marcados a cinzento não foram possíveis de serem feitos. 3
