Nutricion anumales laboratorio

Capítulo 4.

Nutrición y alimentación EMILIO MARTÍNEZ DE LA VICTORIA MUÑOZ Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos (INYTA) Universidad de Granada MARIANO MAÑAS ALMENDROS Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos (INYTA) Universidad de Granada JESÚS MARTÍN ZÚÑIGA Servicio Producción y Experimentación Animal. Centro de Instrumentación Científica Universidad de Granada NECESIDADES NUTRICIONALES Energía Proteínas Evaluación de la calidad de una proteína Índices químicos Índices biológicos Índices microbiológicos Necesidades de proteínas Hidratos de Carbono Fibra Grasa Minerales Vitaminas Otros nutrientes Agua

REQUISITOS NUTRICIONALES PROCEDIMIENTO Y PRESENTACIÓN DE LAS DIETAS Ventajas e inconvenientes del tipo de procesamiento

FORMULACIÓN DE DIETAS PARA ANIMALES DE LABORATORIO Dietas de ingredientes naturales Fórmula cerrada Fórmula abierta Dietas purificadas Dietas químicamente definidas Dietas carenciales enriquecidas

REGÍMENES ALIMENTICIOS

Alimentación ad libitum Alimentación restringida Alimentación horaria o controlada Alimentación a la par Alimentación ad libitum frente a restringida

CONSERVACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LAS DIETAS Almacenamiento de las dietas La necesidad del control nutricional Contaminantes bióticos Estándares microbiológicos recomendados Métodos y protocolos de esterilización esterilización

RESUMEN BIBLIOGRAFÍA

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Nutrición y alimentación

La primera pregunta que podemos plantearnos acerca de la alimentación y nutrición animal es ¿ por qué un animal necesita los alimentos?. En realidad, el alimento es el material primario a partir del que se van a formar todos los tejidos y estructuras corporales tanto las formadas de novo, por ejemplo durante el crecimiento, como aquellas ya existentes que deben ser reemplazadas por un proceso de desgaste. En este momento nos surgen dos conceptos que debemos definir: alimentación y nutrición. La alimentación es la forma de proporcionar, en nuestro caso, al animal de laboratorio, los alimentos necesarios para que alcance un crecimiento y desarrollo óptimo. La nutrición estudia, sin embargo, el conjunto de procesos mediante los que el organismo animal recibe, transforma, incorpora y utiliza los nutrientes contenidos en los alimentos y que constituyen los materiales esenciales para el mantenimiento de la vida. Como se deduce de las dos definiciones, ambos conceptos representan funciones distintas. La alimentación se relaciona con una serie de actividades conscientes y voluntarias dependientes del cuidador, casi exclusivamente, mediante las cuales se suministra al animal los alimentos que precisa tanto desde el punto de vista cuantitativo como cualitativo y que el animal voluntariamente ingiere y deglute. A partir de este momento comienzan las funciones de nutrición que se sitúan en el plano involuntario y que incluyen la digestión, absorción, transporte y utilización metabólica de los nutrientes. En consecuencia, podemos deducir que existen varias formas de alimentarse pero una sola de nutrirse. El estado nutricional de un animal de laboratorio esta directamente relacionado con una alimentación adecuada (cualitativa y cuantitativamente). Un correcto estado nutricional permite que el animal alcance todo su potencial genético en aspectos como el crecimiento, la reproducción y las expectativas de vida (longevidad), a su vez todo ello afecta al estado físico y a su salud global. Asimismo, una alimentación correcta permite al animal presentar respuestas más favorables a factores de estrés ambiental como la presencia de patógenos. La nutrición es una variable que puede afectar, en distinta dirección, los resultados experimentales obtenidos. Así, los resultados de un determinado estudio pueden estar sesgados, o falseados de forma involuntaria por factores que afecten a la composición de la dieta que ingieren, como pueden ser los cambios desconocidos en los constituyentes que forman parte de ella. Esta alteración de la información experimental obtenida puede conducir a conclusiones erróneas o no exactas que implican el sacrificio inútil de individuos y a una pérdida de tiempo y de recursos de investigación. Para realizar una correcta planificación de la alimentación y conseguir un estado nutricional óptimo se deben conocer los requerimientos nutricionales tanto de tipo cuantitativo como cualitativo de las diferentes especies. Esto es fundamental en el proceso de formulación de dietas. Sin embargo, se puede planificar una dieta bien balanceada que los animales no ingieran, o bien que aunque la ingieran, la disponibilidad digestiva y metabólica de los distintos nutrientes no sea la adecuada. Por tanto, a la hora de determinar estos requerimientos se deben tener en cuenta una serie de factores como la palatabilidad que va a condicionar la ingesta de alimento, la utilización digestiva y metabólica y su excreción. Todos estos procesos pueden, a su vez, venir influenciados por factores externos como la forma física del alimento, o las características orosensoriales, junto con la presencia de sustancias antinutritivas y contaminantes. Además, hay que tomar en cuentan las posibles perdidas de nutrientes derivadas de los procesos de fabricación y almacenamiento de las dietas. Igualmente se deben considerar otros factores dependientes del propio animal como la especie considerada, la ontogenia, el estado fisiopatológico, etc.

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NECESIDADES NUTRICIONALES DE LOS ANIMALES DE LABORATORIO Con independencia de la especie y tipo de modelo experimental, todos necesitan ingerir una serie de nutrientes que son comunes, a todos ellos. Los macronutrientes son las proteínas, los hidratos de carbono y las grasas. Los micronutrientes están constituidos por los minerales y vitaminas. En la formulación de una dieta lo más importante es asegurar el aporte adecuado de los distintos nutrientes. Para poder conseguir este fin debemos conocer los requerimientos de todos y cada uno de estos nutrientes para la especie considerada. Sin embargo, puesto que la cantidad de alimento ingerido va a venir determinado por los requerimientos energéticos de la especie en cuestión, es del máximo interés establecer la densidad calórica de la dieta, es decir la cantidad de cada nutriente por un número determinado de kilocalorías (kcal) o kilojulios (kJ).

Energía En el ámbito de la nutrición el término energía se utiliza para describir los componentes de la dieta que aportan al animal el combustible necesario para mantener los procesos vitales basales como el latido cardiaco o la respiración, la producción de calor para mantener la temperatura corporal y para la actividad física necesaria para comer, roer, cavar, etc. La energía de la dieta es aportada principalmente por los Hidratos de Carbono (HC) y la grasa, y en menor grado por los esqueletos hidrocarbonados de las proteínas. Hasta hace relativamente poco tiempo la energía de la dieta se medía en términos de calor. La unidad es la caloría pequeña, sin embargo desde el punto de vista práctico se utiliza la kilocaloría (o caloría grande). No obstante, la caloría no es una unidad absoluta y puede variar ligeramente de acuerdo con una serie de factores, como por ejemplo la altitud. Actualmente, por acuerdo del Sistema Internacional de Unidades, se utiliza el Julio (J) como unidad de energía y la equivalencia es 1 caloría = 4.184 J. La Energía Bruta (EB) que contiene una dieta es medida en términos de calor generado cuando una cantidad dada es quemada completamente en una bomba calorimétrica. Sin embargo, no toda esta EB esta disponible para el animal que la ingiere. Parte no puede ser digerida (por ejemplo la celulosa) y de la digerida parte puede perderse por la orina, sudor, etc., o bien disiparse en forma de calor no pudiéndose utilizar por los tejidos del organismo. La Energía Digestible (ED) tiene en cuenta las pérdidas fecales, y se calcularía por la diferencia entre la EB de la dieta y la EB de las heces correspondientes. La Energía Metabolizable (EM) es un valor que utilizado con frecuecia en las dietas para animales de laboratorio. Es el índice más adecuado pues representa la parte de la energía de la dieta que es transformada en energía útil para el animal. Se calcula restando las pérdidas energéticas de la orina y los productos combustibles gaseosos de la ED. En los animales de laboratorio no se pueden establecer unas necesidades energéticas en los animales de laboratorio de forma general, ya que estas vienen influenciadas por factores variables como la actividad física, la temperatura ambiental y el estado fisiológico. En la práctica la mayoría de las especies de laboratorio son alimentadas ad libitum y en estas circunstancias el animal regula de forma voluntaria su ingesta de alimento para cubrir sus requerimientos energéticos. Es poco importante si la energía proviene de los hidratos de carbono o de la grasa, solo debemos tener en cuenta que debido a la mayor densidad calórica de la grasa, al elevar sus niveles en la dieta la ingesta total de alimentos disminuye; esto lleva inevitablemente a un descenso en la ingesta de proteína, minerales y vitaminas. En este sentido las necesidades de los distintos nutrientes se expresan en función del contenido energético y no del peso.

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Los estándares para ratas y ratones se sitúan en un valor de densidad calórica entre 3.6 y 3.8 kcal/g de dieta (aprox. 15-19 kJ/g) para una alimentación ad libitum y con un contenido adecuado en otros nutrientes. En dietas con un contenido energético alto se recomienda elevar los niveles de otros nutrientes.

Proteínas Son macronutrientes cuya función principal en el organismo, es participar en la formación de estructuras corporales y en la síntesis de moléculas reguladoras de distintas funciones orgánicas. Por tanto, se dice que la proteína es un nutriente de tipo plástico, aunque su esqueleto hidrocarbonado puede ser utilizado como combustible para obtener energía. En realidad, los animales no necesitan las proteínas como tales aportadas por los alimentos sino los Aminoácidos (AA) que la componen para poder sintetizar tras su incorporación, sus propias proteínas. Además, no necesitan todos todos los AA sino solo solo los esenciales. Los procesos digestivos rompen la proteína alimentaria en sus monómeros, los AA, o en pequeños péptidos que son los que atraviesan la barrera de mucosa del intestino delgado hasta llegar al medio interno y de allí a todos los tejidos para la síntesis de proteínas propias. Los mecanismos de la síntesis proteica requieren que todos los AA que van a formar parte de una determinada proteína deben estar presentes de forma simultánea y en la proporción adecuada. Por tanto, la falta de un AA o el AA que se encuentre en menor proporción respecto a las necesidades biosintéticas, van a condicionar la tasa de síntesis de esa proteína. Sobre esta base, en el diseño de una dieta se debe tener en cuenta, no solo la cantidad sino la calidad, es decir en que medida los AA que forman parte de ella se adecuan a la composición de las proteínas propias del animal. La calidad de una proteína puede afectarse negativamente por distintos causas como un incorrecto almacenaje, un sobrecalentamiento en el proceso de peletización y por un tratamiento t ratamiento término tér mino inadecuado. Este daño no es fácilmente fácil mente detectable detectab le y es necesario realizar algunas pruebas para conocer la calidad proteica de una dieta. Evaluación de la calidad de una proteína

El primer criterio de evaluación es determinar su composición cuantitativa, ya que si la proteína bruta de la dieta no alcanza un nivel adecuado puede comprometer el crecimiento y desarrollo del animal. Para ello se cuantifica el contenido en nitrógeno total por mineralización de la dieta, mediante el método de Kjelhdajh. Posteriormente, el valor de nitrógeno total obtenido se multiplica por un factor, dependiendo del tipo de fuente proteica utilizada y su composición en AA para obtener la cantidad de proteína. Los factores mas utilizados son 6.25 (obtenido de dividir 100/16 - peso molecular del nitrógeno -) y 5.4 (para la proteína de trigo y productos lácteos). Este dato cuantitativo nos dice muy poco o nada acerca de las propiedades de esa proteína o proteínas y por tanto de su calidad nutricional. De manera general, la calidad depende de su composición en AA y de la disponibilidad relativa de los mismos con relación a los requerimientos por una determinada especie de AA esenciales y nitrógeno no proteico. En cuanto al primero, el perfil de AA de la proteína, hay técnicas muy fiables como la Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC). Para determinar la calidad de una proteína. Se emplean índices de tipo químico, biológico y microbiológico. Índices químicos Aminograma. Consiste en la determinación del perfil de AA de una proteína previa hidrólisis de esta. El aminograma ayuda a conocer las deficiencias y excesos que pueden aparecer en un ensayo biológico y a predecir la respuesta al mezclar mezcl ar proteínas. Sin embargo, hay que ser discreto en la interpretación de los aminogramas, sobre todo si no están bien establecidos los requerimientos de cada uno de ellos para una especie concreta.


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Cómputo químico. Al ser difícil comparar los méritos nutricionales de distintas proteínas con diferentes perfiles de AA, se propuso un sistema de cómputo químico para clasificar las proteínas. La escasa calidad proteica depende, principalmente, de la deficiencia relativa de algunos AA esenciales. Como proteína patrón o “ideal” se toma la proteína de huevo completo y se determina el porcentaje de exceso o defecto de AA individuales de la proteína problema respecto a la patrón. A partir de estos datos se establece el concepto de AA limitante, definido como aquel que presenta mayor deficiencia con respecto a la proteína patrón. Así, el cómputo químico de una proteína dada es el porcentaje de la deficiencia del AA limitante. Por ejemplo, la proteína de trigo tiene como AA limitante la lisina cuya deficiencia respecto a la proteína patrón es de un 63 %, por tanto su cómputo químico es 37 (100-63). Índice de AA esenciales (IAAE). Para su cálculo se establece primero la relación huevo de los aminoácidos esenciales, que es el porcentaje en que un AA de la proteína problema se desvía de la cantidad presente en la proteína patrón que se considera del 100 %. A partir de estos datos el IAAE se calcula como la media geométrica de la relación huevo. Existen algunos métodos para calcular la biodisponibilidad de algunos aminoácidos como el caso de la lisina disponible. Índices biológicos

En general son más exactos que los químicos pero más caros y requieren una infraestructura mayor. En el Cuadro 4-1 se recogen las formulas correspondientes para el cálculo de los diferentes índices. Entre ellos se encuentran: Valor global de la proteína (VGP). Este índice nos informa del valor de una proteína como suplemento de una dieta basal. Se emplea como animal de experimentación el pollo y se define como la ganancia de peso adicional por unidad de proteína suplementaria ensayada, expresada como porcentaje. • Coeficiente de eficacia en crecimiento (CEC). Realizado con ratas al destete, utilizando una dieta al 10 % de proteína durante 4 semanas. Los resultados se comparan con una dieta que contiene caseína. Los cálculos son iguales que para el VGP. •

Ambos índices se utilizan para conocer las diferencias en la calidad proteica entre muestras procesadas según distintas técnicas o para apreciar cambios debidos a la fabricación, siempre que estas alteraciones afecten al AA limitante. • Valor sustitutivo de la proteína (VS). Nos informa, a través del balance de nitrógeno, del grado en que una proteína puede sustituir a cualquier otra. Para ello se realizan dos balances de nitrógeno (ver más adelante) (BN1 y BN2) con ingestas de nitrógeno (IN) semejantes. • Valor biológico (VB). Es el procedimiento más utilizado. La técnica seguida es la de Thomas-Mitchell. En esencia, este método relaciona el nitrógeno ingerido (o la proteína ingerida) que es retenido por el animal con el nitrógeno que es absorbido. Para su aplicación deben tenerse en cuenta las pérdidas endógenas de nitrógeno, tanto urinarias como fecales. La determinación del VB permite determinar el nivel de proteína requerido para obtener un balance positivo de nitrógeno y describir diferentes alteraciones en las proteínas debido al procesado. Incluso puede servir para examinar la eficacia de la proteína para satisfacer las demandas en situaciones fisiológicas singulares (crecimiento, lactancia, gestación, etc.) • Utilización neta de la proteína (UNP). Expresa el tanto por ciento del nitrógeno retenido en relación al ingerido. Aritméticamente es el producto entre el VB y el coeficiente de digestibilidad verdadero (CDV). • Valor productivo de la proteína (PPV). Indica también el nitrógeno retenido pero analizando directamente el nitrógeno corporal.


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Tabla 4.1. Índices biológicos para la valoración de la calidad de las proteínas en la dieta.

Valor global de la proteína (VGP) y coeficiente de eficacia en crecimiento (CEC): ∆ P p ∆ Pc

× 100

∆P p = Incremento de peso (g) por gramo de proteína problema ingerido ∆Pc = Incremento de peso (g) por gramo de caseína ingerido

Valor sustitutivo de la proteína (VS): VS (%) =

100 −

100( BN1 −

BN 2 )

NI

BN1 = balance de nitrógeno con la proteína 1 BN2 = balance de nitrógeno con la proteína 2 NI = nitrógeno ingerido (media entre los dos valores con las dos fuentes proteicas)

Valor Biológico (VB): VB =

I

−

( H − He − (O − Oe ) I

−

( H − H e )

×

100

I = nitrógeno ingerido, H = nitrógeno fecal, He = nitrógeno fecal endógeno, O = nitrógeno urinario, Oe = nitrógeno urinario endógeno

Utilización neta de la proteína (UNP): NPU = I −

(H

− He ) − ( O − Oe ) × 100

Índices microbiológicos

El más utilizado es el realizado con Streptococcus zymogenes. Los requerimientos en AA de este microorganismo pueden satisfacerse completamente, suplementando con caseína. Midiendo el crecimiento de este microorganismo con otra fuente proteica se puede determinar el valor nutricional relativo (RNV) de esa proteína respecto a la caseína tomada como el 100 %. Necesidades de proteínas

En función de todo ello y a la vista de los problemas de digestibilidad, disponibilidad y balance de AA es muy difícil establecer, de forma precisa la cantidad de proteína que debe administrarse a los animales para conseguir su desarrollo óptimo. Además, ya que la proteína es el ingrediente más caro de la dieta debe sacársele el mayor rendimiento y evitar su utilización como fuente energética. Las fuentes proteicas más utilizadas se recogen en el Cuadro 4-2. Como puede observarse, casi ninguna aporta la selección ideal de AA, por tanto al diseñar una dieta para animales de laboratorio se recomienda la utilización de mezclas en las que las deficiencias de una fuente son compensadas por los excesos en la otra u otras. El exceso de proteína en la dieta, en estudios a medio y largo plazo, favorece la aparición de ciertas alteraciones patológicas (principalmente renales) y reduce la longevidad del animal.


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Cuadro 4-2. Composición en aminoácidos (mg/g de nitrógeno) de proteínas purificadas utilizadas en dietas de animales de laboratorio (se asume que la proteína tiene 16 g de nitrógeno).

Aminoácido

Caseína ácida

Alanina Arginina Asparragina Cistina Ac. Glutámico Glicina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptófano Tirosina Valina

188 231 431 25 1306 113 181 288 569 481 181 319 650 363 269 75 344 356

Caseína ANRC 188 231 469 25 1563 125 200 313 594 488 200 331 706 381 300 75 369 388

Lactoalbúmina 369 188 769 200 925 144 131 319 875 669 131 244 319 313 369 144 250 313

Concentrado de proteína de trigo 331 175 681 169 1094 125 131 338 744 588 156 219 331 338 413 125 206 319

Proteína de soja aislada 269 475 725 81 1194 263 163 306 513 394 81 325 319 325 238 81 238 313

Al elegir la fuente proteica se debe optar por aquella que tenga, a priori, una mejor utilización digestiva y metabólica, es decir una proteína de alta calidad. Por otro lado debemos tener en cuenta la densidad energética de la dieta. De hecho, en muchos casos las necesidades de proteína se expresan como el cociente proteína/energía, con objeto de evitar las posibles interferencias cuando nos encontramos con dietas que presentan grandes diferencias en su densidad energética. Tras numerosos estudios de balance de nitrógeno, crecimiento, desarrollo y capacidad reproductiva utilizando distintas proteínas a distintos niveles en la dieta, se ha propuesto, en dietas de ingredientes naturales y para animales en crecimiento, una concentración del 15 % de una proteína o mezcla proteica de alta calidad. Estos requerimientos se formulan para una concentración de energía del 17 kJ de energía metabolizable (EM) por gramo alimento (4 kcal de EM/g). Si estamos considerando dietas de ingredientes naturales, y a efectos prácticos, los porcentajes de proteína cruda deben establecerse en torno al 18-25 %. Por lo general, un nivel del 20% de proteína cruda resulta adecuado, en la mayoría de los casos, siempre que se incluya una fuente proteica de alta calidad, como polvo de leche, harina de pescado o de soja. Es importante en este último caso utilizar el concepto de suplemento proteico, empleando mezclas de proteínas con perfiles de AA esenciales complementarios. Las dietas que sólo se basan en cereales son inadecuadas para el crecimiento y la reproducción de la mayoría de las especies. De hecho, el contenido de proteína cruda de los cereales se encuentra entre el 10-15%, y además son bastante deficientes en lisina. Aparte de la lisina, los AA azufrados metionina y cistina suelen estar en niveles bajos (y a veces también el triptófano) cuando el maíz es la base de las dietas. Hoy en día, alguno de estos AA, incluyendo la metionina y la lisina, se fabrican a escala comercial y relativamente baratos, por lo que es económicamente factible completar la dieta con ellos.

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La proteína aportada en la dieta para adultos y animales en crecimiento debe ser de alta calidad, si bien los requerimientos durante el desarrollo son más elevados. Se ha propuesto para los adultos un nivel de proteínas del 4.5-6%, lo que se traduce en una dieta de ingredientes naturales con unos niveles alrededor del 7%. Respecto a las necesidades en AA, los estudios realizados se basan en la capacidad de las mezclas de estos para provocar, no solo un óptimo crecimiento, sino una ganancia neta de nitrógeno (es decir un balance positivo de nitrógeno). En el Cuadro 4-3 se recogen los valores aceptados en la elaboración de dietas para rata, ratón, cobaya, hámster y conejo. La insuficiencia proteica se manifiesta tanto si es cuantitativa como cualitativa, por afectar a los tejidos de rápido crecimiento principalmente en animales jóvenes y en hembras gestantes. Los síndromes más acusados residen en un desarrollo inferior al normal, crecimiento más lento de los huesos largos, deformidades craneales. La anemia es la consecuencia más frecuente de un inadecuado nivel proteico de la dieta, con ello disminuye el contenido sérico de la albúmina apareciendo desequilibrios vitamínicos, minerales y endocrinos. Actualmente, se estudia la posible relación entre las aportaciones de proteína y la presencia de algunas enfermedades infecciosas y parasitarias. Se ha comprobado que aportes proteico superiores a los recomendados, aumentan la frecuencia y la gravedad de la "salmonelosis" por Tiphimurium en ratones, siendo mucho mayor la tasa de mortalidad que cuando el aporte proteico en la dieta es el adecuado. Por otro lado, debemos tener en cuenta no sólo la cantidad de proteína, sino la calidad de ésta y las propiedades de los alimentos que la proporcionan. Así, por ejemplo, la soja contiene una proteína cristalizada, inhibidora de tripsina, que puede dificultar la acción intestinal, disminuyendo la absorción a través de las mucosas.

Hidratos de Carbono En la dieta de ingredientes naturales para animales de experimentación los almidones de los cereales son la principal fuente de Hidratos de Carbono (HC). En dietas purificadas el aporte de HC se realiza utilizando almidón y sacarosa, que además contribuye a dar sabor al alimento, mejorar su aceptación y, por tanto, su ingestión. En los últimos años se ha ido sustituyendo parte de la sacarosa por maltodextrinas, debido a los problemas de acumulación de grasa en hígado que genera (esteotasis hepática). La principal función de los HC es aportar energía a corto plazo, por lo que no existen requerimientos específicos sino en función del aporte de energía. Hay fuentes de HC que deben utilizarse con precaución e incluso no emplearse. Este es el caso de la fructosa y la sacarosa (disacárido que contiene fructosa), con capacidad para alterar el flujo glucolítico del hepatocito. Se ha descrito, tras la alimentación con estos azúcares un incremento en el peso del hígado junto con un mayor contenido en glucógeno y triglicéridos, hipertrigliceridemia y alteraciones renales con nefrocalcinosis. Estos efectos aparecen con niveles de sacarosa del 55 % y de fructosa del 63 %. Son escasos los problemas patológicos asociados a alteraciones en la composición de almidones y féculas. En conejo, suelen presentarse ciertas deficiencias enzimáticas relacionadas con la amilasa, que actúan como factor predisponente en la enteritis mucoide.


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Tabla 4-3. Raciones de nutrientes recomendadas para animales alimentados ad libitum, expresados por kg de alimento compuesto por un 90% de materia seca 1. Los requerimientos corresponden a animales en crecimiento. Para ratas en mantenimiento y hembras en gestación, ver en NRC (1995) Ratón Rata Hámster Cobaya Conejo Energía Digerible 2 (kJ/g) 16.8 16.0 17.6 12.6 10.5 Grasa (g/kg) s.u. 50 50 s.u. 20 Fibra (g/kg) r.u r.u. s.u. 100 110 Proteína (g/kg) 180 1203 150 180 160 Arginina (g/kg) 3 6 7.6 s.u. 6 Asparagina (g/kg) s.u. 4 s.u. s.u. s.u. Ácido glutámico (g/kg) s.u. 40 s.u. s.u. s.u. Histidina (g/kg) 2 3 4 s.u. 3 Isoleucina (g/kg) 4 5 8.9 s.u. 6 Leucina (g/kg) 7 7.5 13.9 s.u. 11 Lisina (g/kg) 4 7 12 s.u. 6.5 Metionina+Cistina (g/kg) 5 6 3.2 s.u. 6 Fenilalanina+Tirosina(g/kg) 4 8 14 s.u. 11 Prolina (g/kg) s.u. 4 s.u. s.u. s.u. Treonina (g/kg) 4 5 7 s.u. s.u. Triptófano (g/kg) 1 1.5 3.4 s.u. 2 Valina (g/kg) 5 6 9.1 s.u. 7 Glicina (g/kg) s.u. s.u. s.u. s.u. s.u. Minerales y elementos traza

Calcio (g/kg) Cloro (g/kg) Magnesio (g/kg) Fósforo (g/kg) Potasio (g/kg) Sodio (g/kg) Sulfuro (g/kg) Cromo(mg/kg) Cobre (mg/kg) Flúor (mg/kg) Yodo (mg/kg) Hierro (mg/kg) Manganeso (mg/kg) Selenio (mg/kg) Zinc (mg/kg)

4 r.u. 0.5 4 2 r.u r.u 2 4.5 s.u 0.25 25

5 0.5 0.4 4 3.6 0.5 0.5 0.3 5 1 0.15 35

5.9 r.u 0.6 3 6.1 1.5 1.5 s.u 1.6 0.024 1.6 140

9 r.u 2 5.5 9.5 s.u s.u 0.6 6 s.u 1 50

r.u. 30

0.1 12

0.1 9.2

0.1 20

4 3 0.35 2.2 6 2 s.u s.u 3 s.u 0.2 r.u 8.5 s.u r.u

0.15 4 18 3 5 7 1 10 10 0.5 0.2 10 600 r.u n.r

1.2 25 27 0.05 4 3 6 50 20 1 s.u 8 1000 n.r n.r

1.1 62 2.7 4 20 15 6 10 90 2 0.6 40 2000 100 n.r

7.0 25 45 5 2 3 3 10 10 4 0.3 20 1000 n.r 200

0.17 r.u. 36 r.u r.u s.u 39 180 180 s.u r.u s.u 1200 s.u n.r

Vitaminas

Retinol (mg/kg) Colecalciferol (µg/kg) Acetato dl-α-tocoferilo (mg/kg) Menadiona (mg/kg) Tiamina (mg/kg) Riboflavina (mg/kg) Piridoxina (mg/kg) Cianocobalamina (µg/kg) Ácido nicotínico (mg/kg) Ácido fólico (mg/kg) Biotina (mg/kg) Ácido pantoténico (mg/kg) Colina (mg/kg) Inositol (mg/kg) Ácido ascórbico (mg/kg)

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No se pueden dar valores absolutos de las raciones de nutrientes, y diferentes comités proponen distintas raciones. La energía metabolizable generalmente varía entre un 90 a 95% de la energía digerible. 3 Raciones recomendadas para la llamada proteína ideal. n.r = no requerida; r.u = requerida, pero requerimiento desconocido; s.u. = estatus desconocido. 2

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Fibra

Es un componente hidrocarbonado no digestible de la dieta en animales monogástricos. Esto significa que no aporta energía, en cantidades apreciables, ni otros nutrientes. Sin embargo, debido a su papel regulador de todo el proceso digestivo, disminuyendo el tiempo de tránsito y aumentando el volumen de las heces, entre otras funciones, se le considera un componente dietético más. La fibra da mayor volumen a la dieta, evitando la formación de masas alimenticias sólidas que impiden la penetración de los jugos digestivos. Tiene efecto laxante por distender el intestino y contribuye a la palatibilidad de los alimentos, sobre todo en conejo y cobayo. Un exceso conduce a un menor consumo de alimento provocando a largo plazo la desnutrición del individuo. Al ser prácticamente acalórica actúa como diluyente energético en las dietas, y su adición provoca un incremento en la ingesta de alimento del animal. Esta característica es aprovechada para el diseño de dietas experimentales en las que es necesario modificar la densidad calórica para cambiar la ingesta global de alimentos del animal o bien en estudios de sobre regulación de la ingesta. Normalmente en dietas purificadas se añade en proporciones cercanas a 5 % en forma de fibra no soluble (celulosa). Estudios realizados en rata muestran que la fibra insoluble hasta niveles dietéticos del 20 % no afecta al crecimiento del animal. En dietas de ingredientes naturales la fibra procede de distintas fuentes vegetales (soja, alfalfa, maíz, etc.).

Grasas La grasa de la dieta formada por lípidos, mayoritariamente triacilglicéridos, tiene distintas funciones dentro del organismo. Por una parte constituye una fuente excelente de energía por su alta densidad calórica (9 kcal/g), aproximadamente el doble de la contenida en HC y proteínas. Por otro lado, es un elemento estructural de las membranas celulares, aportando ácidos grasos (AG) esenciales que intervienen en diversas funciones corporales como la formación de eicosanoides; asimismo es necesaria para la absorción de vitaminas liposolubles (A, D, E y K). Por último, tiene un papel importante en la palatabilidad de los alimentos y por tanto en la aceptación de la dieta por el animal incrementando su ingestión. La grasa, en dietas de componentes naturales, esta formando parte de algunas semillas (haba de soja, cacahuete o linaza) o de algunos componentes de origen animal (harinas de pescado o carne, polvo de leche). También la grasa de la dieta, tanto en dietas de componentes naturales como purificadas, puede ser añadida en forma más o menos pura (aceite de hígado de pescado, sebo, aceites vegetales, etc.). El componente lipídico más abundante en la dieta son los triacilglicéridos (grasas neutras), junto con fosfolípidos y colesterol, en menor proporción. Los AG presentes en los triacilglicéridos determinan la calidad de la grasa de la dieta. Existen tres tipos de AG, los saturados, monoinsaturados y poliinsaturados, dependiendo de si no contienen, presentan uno o dos o más dobles enlaces en su molécula respectivamente. En la Figura 4-1, se recoge la composición en AG de distintas fuentes de grasa utilizadas en las dietas para animales de experimentación.


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Grasa de coco Mantequilla Aceite de palma Grasa de cerdo Margarina normal Grasa de pollo Aceite de pescado Margarina poliinsat. Aceite de oliva Aceite de maiz Aceite de soja Aceite de girasol 0%

20%

40%

60%

80%

100%

% de A.G. totales (Valores medios) AG SAT

AG MONO

AGPI. n-6

AGPI. n-3

Otros AG

Figura 4-1. Perfil de ácidos grasos de distintas grasas dietéticas. (Tomado de Mataix J y Carazo, E. Nutrición para Educadores. Ed. Diaz de Santos 1995)

Los AG esenciales pertenecen al grupo de los poliinsaturados. Entre ellos se encuentra el ácido linoleico (C18:2 n-6), que no puede ser sintetizado en el organismo y debe, en consecuencia, ser aportado en la dieta. Pertenece a la serie n-6 y a partir de él, por elongación y desaturación, se forman numerosos AG de cadena larga, entre los que cabe destacar el ácido araquidónico (C20:4 n-6), a partir del cual de forman los eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, etc.), con muy variadas acciones biológicas, además de formar parte de las membranas celulares y subcelulares. Las necesidades de este AG se presentan en función de la EM en porcentaje. Existen diferencias en los requerimientos dependiendo del sexo (mayores en el macho que en la hembra). En ratas en crecimiento, las necesidades se sitúan en el 0.5% de la EM en la hembra y en el 1.3% en el macho. Estas mismas cifras o algo mayores son las descritas en animales gestantes y durante la lactancia. Utilizando como índice de necesidades en ácido linoleico la concentración tisular de ácido araquidónico, se ha establecido como nivel adecuado, en la rata, 1200 mg por 100 g de alimento (2.5% de la EM). Los AG poliinsaturados de la serie n-3 se originan a partir del ácido linoleico (C18:3 n-3), a partir del cual, por elongación y desaturación se forman distintos ácidos grasos de importancia biológica, ya que a partir de ellos también se forman eicosanoides de la serie 3 (los formados a partir del ácido araquidónico se denominan de la serie 2). Entre ellos podemos citar el ácido eicosapentaenoico (EPA) (C20:5 n-3) y el docosahexaenoico (DHA) (C22:6 n-3). El carácter esencial del ácido linoleico ha sido objeto de discusión a lo largo de las últimas décadas. Recientemente parecen existir algunas dudas acerca de dicho carácter, sobre todo en lo que se refiere a algunas funciones cerebrales y en especial al desarrollo funcional de la retina. Utilizando como referencia los niveles cerebrales de AG n-3 se han establecido los requerimientos de ácido linoleico en 2g/kg de alimento (0.4% de la EM). Son numerosos los signos clínicos de deficiencias en ácidos grasos esenciales. En el Cuadro 4-4 se recogen algunos de ellos y la capacidad comparativa de los AG n-6 y n-3 para revertir dichos signos patológicos. Las deficiencias cuantitativas y cualitativas en cobayo ocasionan alopecias en hembras gestantes y otro tipo de síndromes en jóvenes, tales como dermatitis, piel escamosa y seca. Estas deficiencias se corrigen completando la dieta con ácidos grasos no saturados o paja troceada. En determinadas cepas de ratones, también es necesario un mayor aporte sobre todo en lactantes. Un exceso de ácidos grasos de origen animal origina procesos gerontológicos.


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Signo Disminución del crecimiento Trastornos reproductores Dermatitis Cociente trieno/tetraeno en tejidos y sangre Fragilidad capilar

Capacidad para aliviar el síntoma n-6 mejor que n-3 n-6 si alivia; n-3 no afecta n-6 si alivia; n-3 no afecta n-6 igual que n-3 n-6 igual que n-3

Cuadro 4-4. Capacidad relativa de los ácidos grasos esenciales n-6 y n-3 para aliviar los signos de deficiencia en ácidos grasos esenciales en ratas

La utilización digestiva de la grasa dietética se relaciona con la longitud de la cadena por un lado y con el grado de instauración de los AG por otro. Respecto a la longitud de la cadena, los de menor longitud (AG de cadena media) son más fácilmente absorbibles al ser menos dependientes de la lipasa y los ácidos biliares; además se absorben vía sanguínea y no linfática. Conforma aumenta la longitud de la cadena la digestibilidad disminuye. En general los coeficientes de digestibilidad superan el 80 %, excepto con algunos tipos de grasa como determinados aceites de pescado, concentrados de EPA (ácido eicosapentaenóico), mantequilla de coco y varios tipos de grasas hidrogenadas. Respecto a los niveles óptimos de grasa en la dieta, los datos disponibles hasta el momento relacionados con la longevidad y la aparición de tumores, apuntan a cifras cercanas al 5 % ya que estos niveles presentan las máximas ventajas y mínimos inconvenientes. Además, este contenido en grasa permite que muchas fuentes dietéticas de este nutriente aporten niveles aceptables de AG esenciales.

Minerales Se sabe cuál es el papel que desempeña la mayor parte de los minerales en el correcto crecimiento y función de los organismos animales. Existen algunos cuyas necesidades son relativamente elevados, como el calcio, fósforo y magnesio, que entre otras funciones tienen la de formar parte de estructuras orgánicas como el hueso y los dientes. El sodio, potasio y cloruro les siguen en orden de importancia cuantitativa. Son los responsables del mantenimiento de una correcta presión osmótica y un balance hídrico y electrolítico (incluyendo el equilibrio ácido/base) en los fluidos corporales; son los llamados electrólitos. Otros elementos inorgánicos, necesarios en muy pequeñas cantidades, son los oligoelementos o minerales traza. Así, el hierro es un componente esencial de la hemoglobina, el molibdeno participa en distintos sistemas enzimáticos, etc. Por último, otros elementos se necesitan en tan pequeñas cantidades que no es necesario añadirlos a las dietas de ingredientes naturales, ya que se encuentran entre sus componentes, como contaminantes en los suplementos minerales, o bien en el agua de bebida, de donde el animal los toma, pero sí es necesario añadirlos en las dietas purificadas. Calcio y Fósforo: se consideran juntos ya que sus papeles funcionales están estrechamente relacionados. Cerca del 80 % del fósforo y prácticamente todo el calcio se encuentran en el cuerpo formando parte del esqueleto o del diente, el resto se encuentra en los tejidos blandos donde realizan funciones importantes. Así el fósforo forma parte de los ácidos nucleicos y de distintos sistemas enzimáticos y moléculas energéticas. El calcio es importante en la contracción muscular y en los procesos de coagulación.

Al considerar las recomendaciones dietéticas de estos minerales, no sólo debemos pensar en las cantidades absolutas de cada mineral, sino cuidar la relación que existe entre ellos, ya que si alguno está en exceso, esto puede afectar a la utilización del otro. Para la mayor parte de las


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especies, la relación óptima Ca:P es de 2:1 ó 1:1. Los últimos estudios ponen de manifiesto que las relaciones menores de 1 (0.96) pueden cubrir las necesidades de ambos minerales. Existen intereses contrapuestos al intentar determinar las necesidades de calcio; por una parte se trata de maximizar las concentraciones de calcio y fósforo en el hueso, pero por otra, se tiende a evitar la osificación de los tejidos blandos, y en concreto la nefrocalcinosis. Para animales en crecimiento y adultos (no durante la lactancia) se recomiendan 5g/kg de alimento de calcio y 3 de fósforo. En hembras en lactantes se debe incrementar un 25 % de media (6.3 g/kg de alimento de calcio y 3.7 de fósforo). Para una correcta absorción intestinal de calcio y su depósito óseo, es necesaria la presencia de vitamina D. Una deficiencia en esta vitamina puede paliarse, en parte, incrementando la ingestión de calcio y fósforo. Las etapas de la vida en las que se incrementan las necesidades de ambos minerales son el periodo de crecimiento como consecuencia de la formación del esqueleto y en las hembras adultas las etapas de gestación y lactación, para compensar las pérdidas debidas a la transferencia de estos elementos al embrión en desarrollo y a la leche. Las aves, necesitan, sobre todo el calcio para la formación de la cáscara del huevo. Cuando la ingesta de calcio es inadecuada y se entra en una situación de balance negativo de calcio, existe una movilización del calcio y fósforo del esqueleto para atender las funciones orgánicas lo que conduce a una desmineralización ósea (osteoporosis) haciéndose los huesos más frágiles y fácilmente fracturables. Los cereales son una fuente pobre de calcio, y al menos que la dieta contenga cantidades importantes de productos animales como leche en polvo o harina de carne y huesos, el calcio debe añadirse a la dieta en forma de harina de hueso esterilizada, fosfato cálcico y polvo de caliza. El fósforo es más abundante en los productos vegetales, particularmente en el salvado y en el forraje. Sin embargo, gran parte de este se encuentra en forma de ácido fítico con el que el calcio y otros elementos forman sales insolubles. El fósforo en esta forma no es fácilmente absorbido, y además otros elementos, entre ellos el calcio, tampoco están disponibles para el animal. El exceso de calcio y fósforo en la dieta puede impedir la absorción de otros minerales a través de la formación de sales dobles. Existen una serie de factores dietéticos que pueden afectar en uno u otro sentido (favoreciendo o impidiendo) la absorción de calcio y fósforo de la dieta por parte de los animales de experimentación (Cuadro 4-5). Las proteínas son fuente de fósforo de la dieta en distintas cantidades pero todo el fósforo que contienen presenta la misma biodisponibilidad en función de la forma química en que se encuentra. Dietas pobres en fósforo pero adecuadas en calcio, originan cálculos en ratas cuando el aporte proteico es insuficiente.

Factores que reducen la absorción Bajos niveles de vitamina D Altos niveles de calcio en la dieta (10 g/kg) Altos niveles de fósforo en la dieta Alto contenido en grasa (> 20 %) Presencia de oxalatos Presencia de fitatos Aislados de proteína de soja

Acción Disminuyen la absorción Disminuyen la absorción de fósforo Disminuyen la absorción de calcio Disminuye la absorción de calcio y fósforo en adultos y viejos Disminuyen la absorción de calcio Disminuyen la absorción de fósforo y calcio Disminuyen la absorción de fósforo

Factores que favorecen la absorción

Acción

Dietas altas en fructosa Aumentan la absorción de fósforo Dietas altas en disacáridos (Lactosa, sacarosa) Aumentan la absorción de calcio

Tabla 4.5. Factores dietéticos que afectan a la absorción de calcio y fósforo

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Magnesio: se encuentra principalmente en el esqueleto pudiéndose movilizar de ese depósito igual que el calcio y el fosfato cuando la ingesta es inadecuada. Su presencia es esencial en los sistemas enzimáticos. La deficiencia lleva a un crecimiento pobre y a una mineralización ósea incorrecta y si esta es severa aparecen alteraciones neurológicas que pueden conducir a la muerte con convulsiones arritmia y vasodilatación entre otros síntomas.

La absorción y excreción de magnesio esta muy relacionada con la de calcio y fósforo, por tanto el aumento de estos dos últimos minerales incrementa las necesidades de magnesio como resultado de una menor absorción y/o una mayor excreción. Inversamente, un exceso de magnesio puede alterar la capacidad de retener calcio. Un bajo porcentaje de magnesio y calcio producen afecciones en la osificación y excitabilidad neuromuscular.También los fitatos interfieren en la absorción de magnesio por lo que es aconsejable elevar los niveles cuando hay fuentes alimenticias ricas en ácido fítico. Véanse necesidades en el Cuadro 4-3. Sodio, potasio y cloruro: estos tres elementos están implicados en el balance de agua y electrolitos del organismo. El potasio se localiza, principalmente en el interior de la célula, el sodio predomina en el líquido extracelular. Las concentraciones de sodio, potasio, cloruro y bicarbonato controlan la actividad osmótica dentro y fuera de la célula y regulan el pH de los líquidos orgánicos. Junto con los iones carbonatos, mantienen la presión osmótica y el equilibrio ácido-base. Cualquier deficiencia puede llegar a retrasar e incluso inhibir el crecimiento normal.

El contenido en potasio de los alimentos más corrientes es suficiente para cubrir las necesidades, sin embargo es costumbre añadir cloruro sódico (sal común) para el aporte de sodio y cloruro. Esta práctica tiene la ventaja de que la sal estimula la secreción salival y por tanto actúa como un estimulador del apetito (aumenta la palatabilidad). Estas altas ingestas de sal carecen de efectos indeseables si el animal no tiene restricciones en la ingestión de agua. Las necesidades en lo que se refiere a los electrólitos y por cada kg de alimento son: 0.5 g de cloro, 3.6 g de potasio (5.0 g durante la lactancia) y 0.5 g de sodio. El sodio, el potasio y el cloro, junto con los iones carbonatos, mantienen la presión osmótica y el equilibrio ácido-base. Dietas pobres en sodio han llegado a producir reblandecimiento de los huesos en rata, acompañado de otros síndromes como uveitis, ulceración corneal, trastornos en la reproducción y eventualmente la muerte. Un complemento adicional de sodio se consigue agregando cloruro sódico. Las deficiencias de potasio son rápidamente acusadas en la necropsia, observando ascitis e hidrotorax. Hierro y cobre: es conocido que la ingesta inadecuada de hierro conduce a una anemia ferropénica ya que este elemento forma parte de la hemoglobina. Sin embargo, al necesitarse muy pequeñas cantidades de este elemento, las necesidades suelen cubrirse con el contenido en hierro que contienen los componentes de la dieta de ingredientes naturales. Aunque la leche es pobre en hierro, los animales lactantes cubren sus necesidades de hierro gracias al aporte durante la gestación siendo prioritario para las gestantes. Los requerimientos de hierro para el periodo de crecimiento se sitúan en 35 mg/kg de dieta y para hembras gestantes y en lactación sube a 75 mg/kg de dieta.

El cobre, en pequeñísimas cantidades, también es necesario para la síntesis de hemoglobina, y la formación de los glóbulos rojos, flavoprótidos y oxidasas. Su carencia está relacionada con síndromes de tipo nervioso. Sin cobre, el hierro no puede incorporarse a la molécula de hemoglobina. Ya que la leche contiene poco cobre, el aporte a las gestantes debe estar asegurado al igual que en el caso del hierro para cubrir las necesidades del recién nacido. Este metal también interviene en la síntesis de queratina y melanina y por tanto su deficiencia provoca una escasez de pelo, escasamente pigmentado.

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El contenido en cobre de los alimentos naturales varía en función del contenido de este elemento en el suelo de cultivo. Hay que tener cuidado con el suplemento, ya que el exceso de cobre puede ser perjudicial y favorecer la aparición de anemia hemolítica. Los requisitos son de 5 mg/kg de dieta para animales en crecimiento y adultos y de 8 mg/kg de dieta para hembras en lactación y gestantes. En dietas con alto contenido en cinc, cadmio y vitamina C hay que incrementar la cantidad de cobre. Manganeso: la deficiencia de manganeso como elemento integrante de varios sistemas enzimáticos se traduce en alteraciones del sistema reproductor tanto en machos como en hembras. Se observan retrasos en la madurez sexual, ciclos estrales irregulares, reabsorción de fetos y camadas débiles. El manganeso también se relaciona con el crecimiento normal del hueso conduciendo su déficit a malformaciones óseas. Las altas ingestas de calcio y fósforo, hierro y cobre pueden dificultar la utilización del metal y, por tanto, aumentar sus necesidades. Cinc: es el componente esencial de una enzima respiratoria, la anhidrasa carbónica. Interviene, también en procesos de queratinización y formación del hueso. Las deficiencias en este metal conducen a crecimiento retardado, escaso desarrollo del pelo y malformaciones óseas. Su disponibilidad en la dieta se ve afectada por elevados niveles de calcio y fósforo y la presencia de ácido fítico. La harina de soja afecta de forma negativa la asimilación nutricional de este metal tanto por su contenido en fitina y en otro factor quelante del calcio. Antiguamente los roedores obtenían parte de los requerimientos de zinc al lamer y mordisquear las jaulas galvanizadas. El exceso es tóxico presentándose anemias probablemente como resultado del antagonismo entre zinc y cobre. Los requerimientos para animales adultos y en crecimiento son de 12 mg/kg de dieta, si se utiliza harina de soja se deben incrementar las cantidades hasta 18 mg/kg de dieta. Para ratas en lactación y gestantes las necesidades se sitúan en 25 mg/kg de dieta. El cinc es necesario en la formación de distintas enzimas (fosfatasas, catalasas, etc), se sospecha su deficiencia cuando existe disminución de crecimiento, pérdida de peso e hiper queratosis; el cobalto está relacionado con la aparición de anemias micro y normocíticas. Yodo: es imprescindible para la síntesis de las hormonas tiroideas yodadas. Su deficiencia provoca hipotiroidismo con retraso en la maduración sexual, inactividad y obesidad; además la glándula se hipertrofia apareciendo bocio. La deficiencia en este elemento no es común aunque puede aparecer en áreas con bajo contenido de yodo en el suelo de cultivo. Los requerimientos son, para la rata, de 150 mg/kg de alimento. Selenio: este elemento presenta funciones semejantes a las de la vitamina E en el organismo, de hecho, es difícil producir una deficiencia en selenio en eratas con un aporte adecuado de vitamina E. Se conoce, recientemente que el selenio forma parte de muchas proteínas enzimáticas (selenoproteinas) en forma de selnometionina o selenocisteina. También existen proteinas fijadoras de selenio. De entre las selenoproteinas podemos destacar la glutation peroxidasa y la iodotironina-5’-deyodinasa tipo I. El selenio puede estar en dos formas inorgánicas principales en los alimentos, como selenito o como selenato, en la forma orgánica adopta una de las dos mencionadas antes. La utilización digestiva y metabólica de ambos tipos de fuentes son bastante diferentes siendo de peor a mejor biodisponibilidad la siguientes selenito < selenato < selenometionina < selenocisteina.

Utilizando distintos criterios los requerimientos se ha establecido en: 150 µg/kg de dieta para dietas de crecimiento y mantenimiento y de 400 µg/kg (en forma de selenito) o algo menos en las otras formas para ratas en gestación y lactación. Molibdeno: es un cofactor para la xantina oxidasa/deshidrogenasa, la aldehido y la sulfito oxidasas todas ella participan en sistemas redox. Sus requerimientos nutricionales están todavía mal establecidos ya que faltan criterios fiables. El NRC (1995) apunta la cifra de 150 µg/kg de dieta. Es importante señalar que presenta interacciones con otros minerales como el cobre y el azufre.


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Otros minerales: presentes en muy bajas concentraciones en las dietas de ingredientes naturales, pero que no se conoce su asociación a ningún enzima o complejo enzimático o su participación como cofactor en ninguna ruta metabólica del organismo. Sin embargo, se defiende su papel como nutriente esencial, y su ausencia o su déficit en dietas para animales de laboratorio, como ocurre en dietas purificadas o químicamente definidas, pueden causar alteraciones en el óptimo crecimiento y desarrollo, así como en la capacidad reproductiva de estos animales. Entre ellos se encuentran el cromo, arsénico, boro, níquel, vanadio, silicio, estaño, litio, fluoruro, plomo, azufre y cadmio. El cromo y el vanadio se han asociado con el metabolismo de la glucosa y la función de la insulina, el litio se ha asociado con una mayor eficacia en la reproducción, el silicio se relaciona con un crecimiento óptimo y el azufre con presencia en los aminoácidos azufrados y su participación en la formación del cartílago Vitaminas

Las vitaminas son sustancias orgánicas que, aunque se requieren en pequeñas cantidades, son esenciales para la salud y el bienestar del animal. Su función biológica es actuar como biocatalizadores de las distintas reacciones que tienen lugar en la materia viva, formando parte de distintos sistemas enzimáticos. Los efectos de la deficiencia en una vitamina dada son bastante diferentes en las distintas especies, aunque a veces aparecen manifestaciones particulares. En el Cuadro 4-6 se recogen las principales alteraciones producidas por las deficiencias en las distintas vitaminas. Las vitaminas A, D, E y K son liposolubles y consecuentemente se encuentran en la fracción lipídica de los alimentos y se absorben con ella. Estas vitaminas se pueden almacenar en el organismo, y especialmente en el hígado, lo que permite al animal no tener obligatoriamente que ingerirlas diariamente. Las vitaminas del complejo B y la C son hidrosolubles y no se almacenan en el organismo, si exceptuamos a la vitamina B12, por lo que es necesario su aporte dietético diario. Algunas vitaminas del complejo B se encuentran, de forma natural en los alimentos, unidas a otras macromoléculas, frecuentemente proteínas, siendo fácilmente separadas por los procesos digestivos. Estas formas ligadas deben tenerse en cuenta en los métodos de valoración de las vitaminas en los alimentos para no infravalorar su contenido.

Vitamina

Nombre químico

A

Retinol

• • • • •

B1

Tiamina

• •

B2

Riboflavina

• • • •

Ácido nicotínico

• • • •

Ácido pantoténico

• • •

Piridoxina

•

B6

Efecto de la deficiencia Retardo en el crecimiento Problemas en la reproducción Alteraciones de la visión nocturna Queratinización de epitelios Mayor sensibilidad a la infección Retardo en el crecimiento Polineuritis; Convulsiones y Fallo cardiaco Retardo en el crecimiento Perdida de pelo; Cataratas Anormalidades nerviosas Dermatitis Pérdida del apetito Baja velocidad de crecimiento Anemia Lengua negra (perro) Despigmentación capilar Necrosis adrenal Pérdida del apetito Dermatitis


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• • • • •

Biotina

• • • •

Ácido Fólico

• • •

B12

Cianocobalamina

• • •

C D2 D3 E

Ácido ascórbico Ergocalciferol Colecalciferol Tocoferoles

•

K 1 K 2 K 3

Filoquinona Menaquinona Menaftona

• •

• • • • •

Anemia microcítica Hiperexcitabilidad Convulsiones Crecimiento pobre Disminución en la producción de anticuerpos Dermatitis Parálisis Alopecia Trastornos en la reproducción Crecimiento pobre Anemia macrocitica Leucopenia Retardo en el crecimiento Trastornos en la reproducción Anemia perniciosa Escorbuto ( en primates y cobaya) Raquitismo en animales jóvenes Osteoporosis en animales adultos Distrofia muscular Alteraciones en la reproducción Necrosis hepática Enfermedades hemorrágicas Aumento en el tiempo de coagulación

Tabla 4.6. Efecto de las deficiencias vitamínicas en los animales de laboratorio

Vitamina A: preformada se encuentra en los alimentos de origen animal en forma de alcohol, retinol, ésteres del ácido retinoico o como aldehido, retinal. En alimentos vegetales se encuentran las provitaminas, los pigmentos carotenoides, que pueden convertirse en vitamina A en el organismo.

Los aceites de hígado de peces son fuentes ricas, aunque poco estables, de vitamina A. Los ácidos grasos poliinsaturados de los aceites de pescado se oxidan fácil y rápidamente y los productos resultantes aceleran la destrucción de la vitamina A. Por ello si se utilizan estas fuentes en la formulación de dietas deben, previamente, estabilizarse con la adición de algún antioxidante. Actualmente la vitamina A se añade, de síntesis en forma de retinil acetato o palmitato en preparaciones protegidas de la oxidación con cubiertas protectoras de cera o gelatina que tienen la ventaja de su alta estabilidad y el inconveniente de su difícil dispersión y mezcla por el gran tamaño de la partícula. Dentro de los carotenoides con actividad vitamina A el más significativo es el β-caroteno, un pigmento naranja que se encuentra en los vegetales como la zanahoria y el maíz. Esta formado por dos moléculas de vitamina A y en el intestino se hidroliza, teóricamente en ellas. En la práctica, la transformación del caroteno en vitamina A esta influenciada por distintos factores y la relación de conversión ideal difícilmente se consigue. La equivalencia entre las cantidades de β-caroteno y retinol dependen de la concentración a la que se administre el primero de acuerdo con Brubacher y Weiser (1985). En el Cuadro 4-7 se recogen las equivalencias entre ambos para distintas concentraciones de β-caroteno. Es importante hacer notar que el gato es incapaz de transformar los carotenoides en vitamina A y por tanto se le debe administrar la vitamina preformada. El β-caroteno es más estable que la vitamina A.


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Dosis de -caroteno mol/kg P.C.

< 0.3 1 2 6 12 48

Biopotencia molar relativa (%)

Moles de -caroteno equivalentes a 1 mol de retinol

g de -caroteno equivalentes a 1 mol de retinol

100 50 30 15.4 9.5 4.3

1.0 2.0 3.0 6.5 10.5 23.3

1.84 3.75 6.25 12.20 19.70 43.60

Tabla 4.7. Equivalencias de β-caroteno y retinol en diferentes concentraciones (NRC, 1995).

Actualmente las necesidades de vitamina A se establecen en función del peso corporal más que por la ingesta de energía. Los requerimientos de esta vitamina, en la rata, dependen de la fuente que se vaya a utilizar; así, si administramos esteres del ácido retinoico las necesidades son de 2.4 µmol/kg de diets (2300 UI/kg). Desde un punto de vista práctico los requerimientos pueden cubrirse con 0.7 mg/kg de dieta por retinol, 0.8 mg/kg de dieta por el retinil acetato y 1.3 mg/kg de dieta para el retinil palmitato. A estas concentraciones tan bajas 1.3 mg/kg de dieta de β-caroteno (equivalente a 12.4 µmol/kg) es suficiente para cubrir dichas necesidades de vitamina A. Las necesidades de vitamina A dependen de otros factores nutricionales, que deben tenerse en cuenta a la hora de formular la dieta. Las dietas hipoproteicas disminuyen los niveles plasmáticos de vitamina A de forma paralela a los de su proteína transportadora (proteína transportadora de retinol). Estas dietas bajas en proteína que cursan con cambios en la velocidad de crecimiento afectan de forma directa a las reservas hepáticas y renales de esta vitamina. En ratas con déficit de cinc disminuye la liberación hepática de vitamina A, y una escasa ingestión de vitamina E disminuye el contenido hepático de vitamina A. El estrés aumenta los requerimientos de esta vitamina. El exceso de vitamina A puede tener efectos tóxicos, como se ha demostrado en diversos animales de laboratorio tras sobredosis. Se han descrito deformidades esqueléticas, anemia, retraso en el crecimiento y escaso desarrollo del pelo. Estos efectos tóxicos se corresponden con altas ingestas de retinol o retinil esteres no para las altas ingestas de β-caroteno. La influencia de esta vitamina puede demostrarse en el metabolismo de los hidratos de carbono, proteínas, ácidos nucleicos, esfenoides y fosfolípidos. Su mecanismo de acción se desconoce salvo para la función retinal. El porcentaje de proteína, grasa, vitamina D y E, zinc y ácidos grasos insaturados, pueden afectar a la absorción y la utilización de la vitamina A. Dietas deficientes en proteínas provocan una disminución sérica y tisular de vitamina A, aunque el porcentaje de almacenamiento sea normal. Dosis de 25000-75000 UI de vitamina A, son tóxicas para las ratas si se las administra 16 días consecutivos, con signos de alopecia, posturas anormales al andar y pérdida de peso. El déficit de esta vitamina está asociado a un retraso en el crecimiento, hemoconcentración, aumento del líquido cefalorraquídeo, mayor susceptibilidad a las infecciones, queratinización de la piel, degeneración retiniana y fracaso de la reproducción. Ratas alimentadas con una dieta exenta de vitamina A dejen de crecer a las 6-8 semanas, pierden peso, y mueren a las 10-16 semanas. Vitamina D: tiene un papel relevante en el metabolismo del calcio y los fosfatos, y por tanto en el metabolismo óseo, ya que es precursora del 1,25 dihidroxicolecalciferol (1,25-DHCC), una hormona que participa en el metabolismo de estos minerales a nivel digestivo, renal y óseo. Sin embargo, esta vitamina participa en la síntesis de eritrocitos y en los mecanismos de proliferación de linfocitos inmunocompetentes (B y T).

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En la naturaleza se encuentran distintas formas de esta vitamina. Las más importantes desde el punto de vista nutricional son el ergocalciferol (D2) que se obtiene por radiación ultravioleta de los esteroles vegetales, como el ergosterol y el colecalciferol (D3) que se obtiene por radiación ultravioleta del 7-dehidrocolesterol presente en los tegumentos animales. De nuevo, los aceites de hígado de pescado son fuentes ricas en vitamina D3. Hoy día se añaden a las dietas preparados comerciales de la vitamina en vehículo lipídico o en polvo. Los pájaros no pueden utilizar el ergocalciferol por lo que se le debe administrar el colecalciferol en la dieta. Los mamíferos utilizan tanto la D2 como la D3, aunque recientemente se ha observado en primates del nuevo mundo que tienen requerimientos específicos de colecalciferol. Por exposición solar se puede sintetizar la vitamina a partir de los precursores presentes en los tejidos superficiales por lo que sus necesidades dietéticas disminuyen. Aunque no hay ninguna duda de que el aporte de vitamina D es imprescindible para un óptimo crecimiento y desarrollo, el establecimiento de las necesidades dietéticas es difícil ya que la aparición de signos clínicos de raquitismo pueden retrasarse mucho en ratas con dietas deficientes en vitamina D siempre que la dieta contenga cantidades adecuadas de calcio y fósforo y la relación entre ambos se acerque a 1. Los requerimientos de esta vitamina se sitúa en 1000 UI/kg de dieta (65 nmol de colecalciferol/kg de dieta; 25 µg/kg). Una ingestión elevada de vitamina D puede ser tóxica y causar desmineralización ósea y deposición de calcio en los tejidos blandos.La deficiencia de esta vitamina está asociada a procesos de poca mineralización del hueso, además de ensanchamiento y descalcificación del cartílago en láminas. Vitamina E: este nombre se aplica a todos los compuestos de tocoferol, el más activo biológicamente es el α-tocoferol (RRR-α-tocoferol). Hoy en día se utiliza el all-rac-α-tocoferol que es una mezcla de ocho esteroisómeros, siete de ellos con menor actividad que el RRR-αtocoferol. La correspondencia entre ambos, en cuanto a actividad vitamina E es de 1:1,36 (1 mol de RRR-α-tocoferol tiene una actividad igual a 1.36 moles de all-rac α-tocoferol. Esta vitamina se distribuye ampliamente en los componentes vegetales de la dieta y es particularmente abundante en el germen de los granos de cereales. El aceite de germen de trigo se usa desde hace tiempo como suplemento de vitamina E aunque actualmente se utilizan compuestoas de síntesis como el DL-α-tocoferil acetato en solución oleosa o en polvo. Este es hidrolizado en el intestino y el tocoferol es absorbido. El hecho de estar esterificado protege a la molécula de tocoferol.

La vitamina E se asocia con una gran variedad de funciones orgánicas, aunque los efectos de su deficiencia difieren entre las distintas especies. En ciertas circunstancias se comporta como antioxidante celular y puede reemplazarse con éxito por otros antioxidantes como el difenil-p-fenilendiamina (DPPD). Otros efectos, como hemos mencionado, son intercambiables con el selenio. En los animales de laboratorio la función más importante es el mantenimiento de una reproducción normal. Su deficiencia conduce a una infertilidad del macho y en las hembras la camada no llega a término. Esta función no puede ser sustituida por otras sustancias. Hoy en día se considera como el mejor parámetro para valorar el estatus de vitamina E la respuesta del sistema inmune. Los requisitos de vitamina E por los animales de laboratorio están ligados a las concentraciones dietética y tisulares de ácidos grasos poliinsaturados ya que esta vitamina evita el daño oxidativo de ellos, tanto en la dieta como cuando forman parte de los tejidos (fosfolípidos de membrana). Para dietas con un contenido en grasa inferior al 10 % los requerimientos de vitamina E, en forma de RRR-α-tocoferol se establecen en 18 mg/kg de dieta (42 µmol/kg)(27 UI/kg de dieta). Si se utiliza el all-rac-α-tocoferol las cantidades se elevan ligeramente a 27 mg/kg de dieta (57 µmol/kg). Las altas concentraciones de retinol y β-caroteno interfieren con la absorción de vitamina E.


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Vitamina K : esta implicada en los procesos de coagulación sanguínea debido a su papel en la conversión del ácido glutámico en ácido γ-carboxiglutámico (Gla) que forma parte de las proteinas que intervienen en los procesos de formación del coágulo, protrombina y factores VII, IX y X.

La forma de la vitamina más adecuada desde el punto de vista de su biodisponibilidad es la filoquinona (vitamina K 1) que se encuentra en las plantas verdes. Las menaquinonas (vitamina K 2) son sintetizadas por las bacterias intestinales. Los animales coprofágicos cubren parte de sus necesidades en vitamina K de esta manera. La aparición de enfermedades hemorrágicas en colonias de ratas libres de patógenos (SPF Specific Patoghen Free –Libres de Gérmenes Patógenos-) sugiere que la contribución de los microorganismos al aporte de vitamina K en los animales criados convencionalmente puede ser, desde el punto de vista nutricional, muy significativa. En ambientes SPF la flora intestinal esta restringida y pueden faltar las bacterias productoras de vitamina K. Por tanto, los animales SPF tienen necesidades superiores de esta vitamina respecto a los normales. Por supuesto, los animales libres de gérmenes dependen totalmente del aporte de vitamina K por la dieta. La menadiona (vitamina K 3) es un derivado sintético de la vitamina K que ligado al bisulfito o difosfato sódico es hidrosoluble por lo que se utiliza frecuentemente en las dietas para animales de laboratorio por su conversión hepática en menaquinona. Su actividad biológica es una decima parte de la que presenta la filoquinona, sin embargo, su derivado hidrosoluble (bisulfito) se absorbe con mayor eficacia y es prácticamente tan activo como la filoquinona. Aunque las necesidades de vitamina K son difíciles de establecer por diversas razones (coprofagía, dificultad de obtener dietas carentes de vitamina K, solo la proteína de soja extraída con etanol tiene muy pequeñas cantidades de esta vitamina, la diversidad entre razas y los criterios de valoración) hoy se establece, en general, una cifra de 1 mg de filoquinona por kg de dieta (2.22 µmol/kg). En la rata se recomienda la filoquinona y no la menadiona por razones digestivas y metabólicas. Existe interacciones negativas entre vitamina K y vitaminas A y E. Los principales signos de deficiencia de esta vitamina son las hemorragias espontáneas o inducidas por pequeñas lesiones. Vitaminas del grupo B: todas las vitaminas de este grupo actúan como cofactores en diversos sistemas enzimáticos. Los requerimientos de las distintas vitaminas del grupo B se recogen en el Cuadro 4-8. En la naturaleza se encuentran en el hígado y, con excepción de la vitamina B12, en los cereales y también en las levaduras. Son coenzimas de reacciones metabólicas. Son absorbidas en el intestino grueso salvo la vitamina B12 que se absorbe en el íleo. Algunas son sintetizadas por las bacterias intestinales. Son razonablemente estables, pero el ácido fólico, la vitamina B12, tiamina y riboflavina pueden ser destruidas por el calor, la luz y la exposición al aire.

Vitamina Biotina Ácido fólico Niacina (ácido nicotínico) Pantotenato (cálcico) Riboflavina Tiamina (ClH) Piridoxina (B6)(*) Cianocobalamina (B12) (*)

Unidad mg mg mg mg mg mg mg µg

Cantidad adecuada más que requerimientos

Cantidad por kg de dieta Mantenimiento Crecimiento Reproducción 0.2 1.0 15.0 10.0 3.0 4.0 6.0 50.0

0.2 1.0 15.0 10.0 3.0 4.0 6.0 50.0

Cuadro 4-8. Necesidades nutricionales de vitaminas del grupo B en ratas (NRC, 1995)

0.2 1.0 15.0 10.0 4.0 4.0 6.0 50.0

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En las dietas de ingredientes naturales los cereales contribuyen, en gran parte, a los requerimientos del animal en vitaminas B, aunque el ácido nicotínico en los cereales está en forma ligada y es difícil su utilización por la mayoría de las especies. Las levaduras secas y los extractos de hígado son buenas fuentes naturales de vitaminas B. Normalmente se suplementan las dietas con las vitaminas puras. Existe la certeza de que todas las vitaminas de este grupo son sintetizadas por los microorganismos del tracto gastrointestinal. Así, los rumiantes no necesitan aporte dietético ya que los microorganismos ruminales sintetizan las necesarias. Los conejos, cobayas, ratas y ratones obtienen parte de sus necesidades por la ingestión de sus heces (coprofagía). Existe, de hecho, peligro de deficiencias en animales SPF igual que ocurría con la vitamina K. La deficiencia en vitamina B12 raramente se observa aunque solo se distribuye en alimentos de origen animal. Las razones son dos, en primer lugar se sintetiza en el intestino y en segundo es eficientemente almacenada en hígado, riñón y otros tejidos. Además, pasa de la madre al feto. Los requisitos de algunas de las vitaminas del grupo B pueden estar influenciados por otros constituyentes de la dieta. El ácido nicotínico es sintetizado en los tejidos a partir del triptófano (40 mg triptófano=1 mg niacina). Sin embargo, el triptófano es uno de los aminoácidos esenciales y por tanto solo estará disponible para la síntesis de la vitamina si esta en exceso respecto a sus necesidades para la síntesis proteica. Se ha calculado que los requerimientos de triptofano en la dieta están alrededor del 0.15 %. El exceso de triptofano se transforma en ácido nicotínico y reduce sus requerimientos dietéticos. Dietas enriquecidas o deficitarias en niacina y triptófano inducen anormalidades en el comportamiento, convulsiones, diarrea, disminución de peso y desarrollo con pelo áspero y alopecia. Una de las funciones de la vitamina B12 es catalizar la formación de grupos metilo que son, subsecuentemente, incorporados a la homocisteina para formar metionina. Por tanto, las dietas que contienen cantidades elevadas de metionina o compuestos de metilación como la colina, hacen que disminuyan los requerimientos de vitamina B12. No obstante, esta vitamina no puede ser sustituida totalmente por metionina ya que tiene otras funciones. se necesita una concentración mayor en dietas que sólo contengan proteínas de origen vegetales, en las que se adiciona metionina y colina pero no vitamina B12. Su concentración en la dieta varía según la concentración de colina, metionina y ácido fólico (que puede ser sintetizado en el intestino por bacterias). Dosis menores de esta vitamina producen una mayor incidencia de anormalidades en neonatos (hidrocefalia). Existe una interrelación importante entre la tiamina y la fuente energética de la dieta. La tiamina juega un papel importante en el metabolismo de los hidratos de carbono por lo que las necesidades de tiamina son sensiblemente mayores cuando la fuente de energía de la dieta son los hidratos de carbono que cuando esta es la grasa. Su deficiencia origina anormalidades en el sistema nervioso, corazón y disminución de la reproducción. Los signos clínicos característicos son anorexia y pérdida de peso, el piruvato puede estar aumentado. A las 5 semanas de déficit aparecen cuadros de encefalopatía e hipertrofia cardiaca. Los animales estarán ataxicos, replegados y dormidos. Las necesidades de riboflavina dependen del tipo y nivel de hidratos de carbono de la dieta. Si disminuye el almidón, sus requerimientos aumentan por incremento de la síntesis intestinal de las vitaminas. Las hembras que toman una dieta baja producen crías de bajo peso, poco crecimiento y menor peso y contenido de ADN en cerebro. Ratas deficientes pueden presentar hígado graso, aumentado el recambio proteico y de la actividad enzimática del metabolismo aminoácido y disminución de la síntesis de ATP. La vitamina B6 puede estar en forma de por piridoxeno, piridoxal y piridoxamina. Se necesita para la reproducción y el desarrollo. Las crías de hembras deficientes presentan una diferenciación renal retardada, los lípidos cerebrales anormales y un aumento de cistationina

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urinaria. Las hembras necesitan u aporte mínimo de 3-6 mg\Kg para que las crías tengan un crecimiento y peso cerebral dentro de la normalidad. Las ratas deficientes presentan dermatitis escamosa simétrica en rabo, zarpas, cara y orejas, anemia microcítica, hiper-excitabilidad y convulsiones, además de disminución en la reproducción y deficiecias en la producción de insulina. En la rata, la biotina en rata es suministrada por diferentes tipos de bacterias intestinales. Su carencia produce, en ratas en desarrollo, dermatitis exfoliativa, alopecia, acromotricidad, etc. Vitamina C: se encuentra en la naturaleza como ácido ascórbico. No es sintetizada por microorganismos pero muchas especies de animales pueden sintetizarla y por lo tanto no necesitan aporte dietético. Las dos excepciones son los primates y el cobaya en los que no existe la enzima necesaria para llevar a cabo la última reacción de su síntesis y necesitan el aporte en la dieta. Las principales fuentes alimentarias son los cítricos y las verduras no encontrándose en cantidades significativas en los componentes habituales de las dietas de ingredientes naturales para animales de laboratorio. Debido a su labilidad de temperatura y su destrucción rápida por oxidación se suele administrar como suplemento de la dieta.

La carencia de esta vitamina se manifiesta en una incapacidad para formar colágeno y tejido osteoide, alteraciones en el crecimiento de huesos, dientes y hemorragias. La falta de colágeno impide la curación de las heridas, los abscesos bacterianos no forman cápsula y se diseminan. El animal deficiente presenta falta de vascularización de las heridas, alteraciones en el crecimiento de los incisivos, deformaciones óseas y engrosamiento de articulaciones costocondrales.

Otros nutrientes Colina: difiere de las vitaminas en que no tiene un papel catalítico, pero si aporta el material básico a partir del cual se van a formar sustancias de gran importancia biológica. Así, un éster, la acetilcolina, es un importante neurotransmisor. Asimismo, la colina es una molécula transferidora de grupos metilo que intercambia con otras moléculas como la metionina. La colina forma parte de los fosfolípidos (lecitina) que participan en el transporte de lípidos y en la formación de las membranas biológicas.

Los animales que ingieren dietas con un bajo contenido en colina presentan esteatosis hepática. La acción lipotrópica de la colina es compartida por otras sustancias y compuestos incluyendo la metionina, betaina e inositol. En el pollo, la colina esta implicada en la prevención de la perosis. La colina puede sintetizarse en los tejidos animales pero no a la suficiente velocidad para poder atender a todas las necesidades y por tanto debe ser administrada con la dieta. Si hay un aporte suficiente de otros compuestos metilantes como metionina o betaina sus necesidades disminuyen. Las deficiencias en colina son poco comunes ya que se encuentra en casi todos los ingredientes utilizados en las dietas y especialmente en las fracciones fosfolipídicas de los tejidos animales y vegetales. Las dietas se formulan, habitualmente con cloruro o bitartrato de colina. Normalmente se tiende a utilizar este último porque es menos higroscópico . Los cálculos para el aporte dietético de colina deben de hacerse en función del contenido en metionina y en grasa de la dieta. Se recomiendan 750 mg/kg de dieta (7.2 mmol/kg) cantidad equivalente a 1.8 g de bitartrato de colina por kg de dieta. El incremento en la cantidad de grasa, las deficiencias en folato o vitamina B12 y los incrementos en la temperatura del ambiente incrementan las necesidades de colina. Inositol: aunque el inositol (Mio-inositol) se incluye, a veces, como un nutriente esencial, actualmente no parece estar justificado. Estructuralmente es semejante a los azúcares simples.


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Se encuentra en los tejidos animales y formando parte de un fosfolípido cerebral el fosfatidil inositol. En ciertas circunstancias tiene una acción lipotrópica y se la ha atribuido la prevención de la alopecia en el ratón. Se sintetiza en los tejidos animales una velocidad suficiente para atender las demandas corporales. Además es formado por la flora intestinal. Se encuentra en alimentos de origen animal y vegetal. En vegetales se encuentra como hexafosfato de inositol, fitina, también esta presente en el germen de trigo, soja y cacahuete y en levaduras.

Agua El agua, por sus propiedades físicas y químicas es el constituyente más importante de la materia viva, además de ser el más abundante ya que la mayoría de los tejidos tienen, como mínimo, un 70% de agua (tejidos blandos). De hecho, un animal puede permanecer en ayuno durante largos periodos de tiempo y sin embargo, la falta de agua es letal en pocos días. El agua es el vehículo en el que la mayoría de los constituyentes corporales se disuelven o suspenden. Alrededor del 50% del agua esta en el compartimiento intracelular y el resto en el extracelular. Los productos de la digestión son transportados en un medio acuoso desde el tracto gastrointestinal hasta los tejidos y muchos de los compuestos de deshecho originados se excretan en solución en la orina. El agua es un constituyente esencial para cualquier reacción metabólica que implique una hidrólisis. Además, juega un papel importante en la regulación de la temperatura. Debido a su alto calor específico puede absorber gran cantidad del calor generado durante el metabolismo y de esta forma la temperatura corporal no se incrementa excesivamente. Por otra parte su alto calor latente de evaporación permite pérdida grandes de calor sin prácticamente pérdidas de volumen. Puesto que las pérdidas de agua son continuas, a través de la orina, heces, aire espirado, piel, para mantener un balance hídrico adecuado las pérdidas de agua deben ser reemplazadas. En la mayoría de los animales el aporte de agua se realiza en forma de fluidos o como parte del alimento, pero una pequeña parte proviene del agua metabólica generada. Aunque se ha descrito la cantidad de agua necesaria para los distintos animales de laboratorio en relación con el peso corporal, las necesidades de agua del animal dependen de factores ambientales, fisiológicos y alimentarios. En ambientes cálidos el animal pierde más agua por vía respiratoria y cutánea. Los animales en crecimiento o gestantes utilizan el agua para la formación de nuevos tejidos, y las hembras lactantes pierden un volumen considerable con la leche. El volumen de orina excretado varia con la composición de la dieta. Las proteínas dan lugar a productos catabólicos nitrogenados, en especial urea, que deben ser eliminados por la orina. Si la concentración de electrólitos en el líquido extracelular aumenta, también aumenta la sensación de sed y la ingestión de agua. Las dietas ricas en proteínas o en sales incrementan las necesidades de agua (Cuadro 4-9). A la vista de las necesidades variables de agua y de las serias consecuencias de su restricción se recomienda, en condiciones normales, que los animales tengan acceso libre al agua ya que el exceso en la ingesta solo provoca una eliminación mayor de orina para reajustar el balance.

ANIMAL

CONSUMO DE AGUA(ml/día) CONSUMO DE ALIMENTO (gr/día) COBAYA 12-15 20-35 CONEJO 80-100 75-100 RATÓN 3-7 4-5 RATA 20-45 15-20 HÁMSTER 8-12 8-15 Cuadro 4-9. Consumo medio de agua y alimento en los principales animales de laboratorio


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REQUISITOS NUTRICIONALES El American Institute of Nutrition (AIN) reconoció en 1977 la necesidad e importancia de estandarizar las dietas para roedores de laboratorio, y de acuerdo con ello elaboró unas recomendaciones generales (AIN 1977 y 1995) dirigidas a los investigadores (véase Cuadro 43). El sustrato científico de estas recomendaciones se fundamenta en el crecimiento de ratas y ratones destetados como índice de una nutrición optima. La utilización de animales no destetados como modelo hace difícil la extrapolación de los resultados a animales adultos. Se han comparado la velocidad de crecimiento y el crecimiento máximo en animales alimentados ad libitum con dietas que contenían concentraciones diferentes de un nutriente específico, manteniendo constante la concentración de los demás nutrientes. La concentración óptima del nutriente estudiado se define como el punto a partir del cual aumentos adicionales del mismo en la dieta no aumentan significativamente el crecimiento máximo del animal. Este procedimiento ha aportado luz y ha mejorado el conocimiento científico sobre la naturaleza de los requerimientos nutricionales de los roedores de laboratorio. Este tipo de trabajos han puesto de manifiesto que el nutriente mas conflictivo es la proteína, necesaria en mayor cantidad para animales jóvenes y por lo tanto problemática en experimentos de larga duración donde puede tener una incidencia negativa. En los últimos 20 años la reformulación de dietas en base a los nuevos conocimientos ha incidido fundamentalmente en este nutriente que se ha ido rebajando para animales adultos. El efecto que otros nutrientes pueden tener sobre la salud de los roedores en experimentos de larga duración es menos importante o esta menos clara que en el caso de las proteínas. Algunos investigadores sugieren que las necesidades de carbohidratos y grasas pueden ser diferentes para roedores jóvenes y adultos. De momento, se necesitan más estudios para poder aclarar estas sugerencias (Cuadro 4-10).

Estatus fisiológico Crecimiento Crecimiento Crecimiento Mantenimiento Gestación Lactancia 1

Peso corporal (g)

Requerimientos energéticos (MJ/día)

Alimento ad libitum Consumido1 (g/día)

100 200 300 400 400 400

0.21 0.36 0.49 0.23 0.30 0.65

15 25 34 16 21 46

Densidad energética de la dieta: 14,5 kJ/g.

Cuadro 4-10. Necesidades estimadas de energía metabolizable en relación al consumo de alimento en diferentes gases de desarrollo en rata

PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DE LAS DIETAS Las dietas para animales de laboratorio se pueden fabricar con distintas formas físicas dependiendo del proceso al que sea sometida la mezcla de ingredientes: • • •

Molidas: en forma de polvo más o menos fino. Granuladas: mezcla de harinas en agua formando una pasta y posterior compresión y secado dándole distintas formas. Pellets: pulverizadas y moldeadas en distintas formas. Se utilizan para roedores, cobayas y conejos.


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• •

Expandidas: procesadas a alta presión y calor a través de un molde. Se utilizan para gatos, primates y perros. Semihúmedas: dietas enlatadas o no para gatos y perros.

En el caso de roedores el pienso en forma de pellets es el más utilizado. Ofrece ciertas ventajas ya que aparte de satisfacer la necesidad de roer de estos animales es fácil de manejar, almacenar y administrar siendo mínimo el desperdicio cuando se lo comen. Presentan el inconveniente de para adicionar un nutriente o producto se requiere moler dicho pienso a fin de lograr la mezcla adecuada. El pienso molido o en polvo es mal usado por los roedores, que lo esparcen o tiran en grandes cantidades al comer. Al mismo tiempo, su manejo implica más tiempo y dificultad, aunque permite todo tipo de adiciones. Las dietas semihúmedas o en gel son utilizadas cuando se incorporan compuestos experimentales en polvo o muy tóxicos. Presentan el inconveniente de ser más susceptibles al desarrollo bacteriano que las secas y por otro lado su peso y volumen son mayores por tener menor densidad calórica y nutricional, lo que dificulta indiscutiblemente su manejo y administración. En general, el tipo de trabajo experimental determinara la presentación de la dieta a utilizar.

Ventajas e inconvenientes del tipo de procesamiento • •

•

Molturación: favorece la actuación enzimática a nivel gastrointestinal por lo que aumenta la digestibilidad. Granulación: el producto resultante es más apetecible para roedores. Como apuntamos anteriormente con este tipo de dietas hay menos desperdicio que con las molidas. Las altas temperaturas empleadas en su elaboración (en torno a los 80ºC) reducen la población microbiana. Se retardan los procesos de oxidación por ser menor el área de contacto. Expansión: produce una dureza aun mayor de los gránulos (lo que hace que se deteriore menos por el almacenamiento) y una mayor destrucción de nutrientes termolábiles. El contenido en microorganismos disminuye aun más con este tratamiento.

FORMULACIÓN DE DIETAS PARA ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN La formulación de dietas tiene como punto fundamental conseguir las concentraciones ideales de nutrientes que permitan hacer frente a las necesidades específicas de los distintos animales de laboratorio, teniendo en cuenta las perdidas debidas a los procesos tecnológicos y de almacenamiento (estas perdidas se deben evaluar mediante el análisis del pienso elaborado). La elaboración de dietas de ingredientes naturales es compleja, ya que se parte de ingredientes con cantidades diferentes de nutrientes y hay que tener en cuenta los nutrientes que aporta cada uno de los ingredientes naturales. Los ingredientes se expresan como porcentaje en peso, debiendo tener la fórmula un valor del 100 % (Cuadro 4-3). El análisis en nutrientes de los distintos ingredientes nos indicara si hay o no necesidad de proceder a la adición complementaria de algunos de ellos (aminoácidos, grasa, sodio, calcio o fósforo, etc). Finalmente se adicionan las premezclas de vitaminas y minerales al pienso. El denominado corrector mineral o vitamínico (Cuadro 4-11).


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COMPOSICIÓN NORMAL DE UNA DIETA

1. Materias primas

Trigo Soja micronizada Aceite de soja o manteca Fosfato bicálcico Clorhidrato de lisina Antioxidante

Cebada Pescado rico en proteínas Sal Carbonato cálcico Aglomerante

2. Corrector tipo con la adición de los siguientes componentes Minerales Cobalto Manganeso Vitaminas Vitamina A Aminoácidos Menacina Piridoxina

Cobre Cinc

Hierro Selenio

Yodo

Vitamina D3

Vitamina E

Vitamina B12

Tiamina Felacina

Riboflavina Niacina

Acido pantoténico Biotina Colina

Tabla 4.11. Relación de materias primas y otros elementos de una dieta estándar de fórmula cerrada para roedores

En el caso de las dietas purificadas, la formulación no es tan compleja al ser cada constituyente fuente de un único nutriente. Las fuentes comúnmente empleadas son: • • • • •

Caseína o proteína de soja como fuente proteica. Aceites como fuente de grasa. Azúcar y almidón como fuente de hidratos de carbono. Celulosa como fuente de fibra bruta. A todo ello se le añade la premezcla de vitaminas y minerales.

Con arreglo al tipo de formulación, las dietas se dividen en tres grupos: de ingredientes naturales, purificadas y químicamente definidas.

Dietas de ingredientes naturales En este tipo de dietas los ingredientes primarios provienen de fuentes naturales y se confeccionan usando como elemento de base cereales sin refinar (avena, trigo, etc.). Se clasifican en dos grupos: fórmulas comerciales cerradas y fórmulas abiertas Fórmula cerrada

Su composición no es conocida. La mezcla de materias primas utilizadas es secreta y es propiedad del fabricante de un determinado pienso comercial. En el etiquetado suele aparecer la composición en nutrientes desde un punto de vista cuantitativo (véase Cuadro 4-11). En general, en su fabricación se suelen utilizar dos fuentes primarias de proteína, una de origen animal (harina de pescado o subproductos lácteos), y otra de origen vegetal (soja, gluten de maíz). Como fuente lipídica se utilizan grasas animales adicionadas con cierta cantidad de aceites vegetales poliinsaturados que suministren los ácidos grasos esenciales necesarios. La fuente de HC se obtiene de mezclas de cereales (maíz, sorgo, arroz, cebada, trigo, avena). Como fuente fosfocálcica se utilizan el fosfato bicálcico y limestrone molido. Las vitaminas y minerales restantes se suplementan en forma de premezclas.

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El uso de ingredientes naturales hace que estas dietas cerradas presenten una estimable variabilidad en el porcentaje de nutrientes, condicionada a su vez por la variabilidad intrínseca de los componentes naturales. Los factores de tipo ambiental (suelo, clima, prácticas de cultivo, etc.) y genéticos (variedades vegetales o razas animales), influyen en la composición de las materias primas utilizadas. Asimismo, los procesos tecnológicos y de almacenamiento también tienen su incidencia al variar de un fabricante a otro. Por otro lado, los ingredientes no refinados de este tipo de dietas, como por ejemplo, maíz, soja, carne, pescado, etc. pueden contener diferentes tipos y cantidades de pesticidas, micotoxinas y otros contaminantes. Esta elevada variabilidad entre diferentes partidas en el tipo y cantidad de los componentes nutricionales y no nutricionales puede afectar a los resultados experimentales y disminuir la reproducibilidad de los mismos. En las dietas comerciales de formula cerrada encontraremos, por tanto, diferencias de composición relacionadas con diferentes fabricantes y también con los distintos lotes o partidas dentro de una misma marca. Este hecho es aplicable incluso a las dieta de formula abierta. Pueden darse errores debidos a cambios en las fuentes, en la calidad de los ingredientes o a diferencias en los métodos tecnológicos. Por ultimo, muchas veces los valores de etiquetado no coinciden con los datos obtenidos mediante el análisis químico correspondiente. Estos datos ponen de manifiesto que el empleo de dietas de distintas marcas puede modificar los resultados. En este sentido, a la hora de la publicar los datos experimentales se debe especificar la marca de la dieta utilizada y describir lo mas correctamente posible su composición ya que se puede concluir que no existe lo que se suele denominar “dieta estándar” para ninguna especie de animal de laboratorio, aunque en muchas publicaciones se pueda leer esta descripción. Los trabajos experimentales, ya clásicos de Baynen (1985, 1987) y Wise y Gilburt (1981) ponen en evidencia los diferentes tipos de variaciones descritas. Fórmula abierta

En algunos casos se publica la composición en ingredientes y a estas dietas se las conoce con el nombre de formulas abiertas. Tienen una composición conocida y pueden ser confeccionadas por los usuarios. Entre ellas, destacan la NIH-07, NTP-90, NTP-91, NTP-92, NPT-2000 para roedores y conejos, descritas con detalle por el National Research Council (NRC) y el American Institute of Nutrition. Una dieta certificada debe aportar información de al menos 83 parámetros (véase Cuadro 4-3) y la determinación cuantitativa y cualitativa de posibles contaminantes abióticos y bióticos. Desde 1988 se han venido formulando y evaluando diferentes tipos de dietas con objeto de entender y conocer la influencia de la proteína, grasa y fibra en la incidencia de enfermedades crónicas y de tumores. La composición de la dieta puede influir sobre el crecimiento, la aparición de enfermedades, las expectativas de vida, la aparición de tumores y la respuesta a tratamientos químicos. En estudios a largo plazo realizados en la rata, se ha visto que entre las causas de mortalidad, posiblemente relacionadas con la dieta, se puede incluir las nefropatías en machos, los tumores de mama en hembras y los tumores de adenohipófisis en ambos sexos. Entre 1980 a 1994, la dieta no purificada de formula abierta NIH-07, alta en proteína (24% en peso), baja en grasa y fibra (5% y 3.5% respectivamente) y con una relación Ca/P de 0.75, fue seleccionada como la dieta a utilizar para los estudios de toxicología y carcinogénesis en roedores dentro del National Toxicology Program (USA). Esta dieta, quizás debido a su alta proporción de proteína y a su baja relación Ca/P, puede haber contribuido a las nefrocalcinosis,


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a la severidad de las nefropatias y otras lesiones encontradas en el tipo de estudios antes comentados. Con los resultados obtenidos con esta dietas experimental, se formuló una nueva dieta (NTP-2000), de ingredientes naturales no purificados, aportando el maíz y trigo el 60% de estos (Cuadro 4-12). Los estudios realizados con esta dieta, formulada con un 14.5% de proteína, un 8.2% de grasa, un 9.3% de fibra y una relación Ca/P de 1/3 han puesto de manifiesto que es más adecuada que la NIH-07 para el crecimiento y mantenimiento de ratas, ya que previene la nefrocalcinosis y parece disminuir la incidencia y severidad de lesiones asociadas con la dieta o con la edad. El conocimiento cuantitativo y cualitativo de las materias primas utilizadas en la mezcla permite que se puedan fabricar, tomando como base estas formulas abiertas, dietas especiales en las que se ajusta la concentración en nutrientes a objetivos experimentales concretos y específicos.

INGREDIENTES (g/100g) Maíz molido Trigo molido Trigo (calidad media) Harina de soja (49% de proteína) Harina de pescado (6% proteína) Leche en polvo Gluten de maíz (60% de proteína) Harina de alfalfa Salvado de Avena Celulosa Aceite de maíz Aceite de soja Levadura de cerveza Melazas desecadas Cloruro sódico Fosfato cálcico bibásico Carbonato cálcico Cloruro de colina (70% colina) Metionina Premezcla de vitaminas Premezcla de minerales

NTP-2000

NIH-07

22.18 22.26 15.0 5.0 4.0 0.0 0.0 7.5 8.5 5.5 3.0 3.0 1.0 0.0 0.3 0.4 0.9 0.26 0.2 0.5 0.5

24.5 23.0 10.0 12.0 10.0 5.0 3.0 4.0 0.0 0.0 0.0 2.5 2.0 1.5 0.5 1.25 0.5 0.09 0.0 + 0.25

Tomado de Rao (1994 y 1996) +: incluido en la premezcla de minerales

Cuadro 4-12. Ingredientes y composición de las dietas no purificadas NTP-2000 y NIH-07

Dietas purificadas Estas dietas se formulan con una combinación de ingredientes naturales, productos químicos puros e ingredientes refinados. Las dietas purificadas solucionan las limitaciones de las dietas de ingredientes naturales, especialmente las relacionadas con la variabilidad de diferentes partidas y la presencia de contaminantes.


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Al estar elaborado con cantidades definidas de ingredientes refinados minimizan la variabilidad encontrada en el tipo y cantidad de nutrientes y componentes no nutricionales, entre las diferentes partidas de una dieta comercial y las cantidades de contaminantes químicos contenidos en los ingredientes naturales. Sin embargo, componentes importantes de las dietas de ingredientes naturales pueden que no estén en las dietas purificadas o que el balance de los componentes en las dietas purificadas no sea el ideal. La dieta purificada utilizada con más frecuencia para estudios nutricionales y toxicológicos ha sido la AIN-76 (Cuadro 4-13), modificada por el American Institute of Nutrition, mediante el incremento de la concentración de la vitamina K (10 veces) pasando a denominarse AIN-76A. Durante 16 años estas dietas han sido ampliamente usadas por la comunidad científica, pero debido a problemas nutricionales y técnicos, la FASEB (Federation of American Societies for Experimental Biology) revisa su formulación, proponiendo nuevas dietas para crecimiento, gestación, lactación y mantenimiento de Roedores. La composición de la dieta semipurificada AIN-76 recomendada para el crecimiento y mantenimiento de roedores durante el primer año de vida contiene: Proteína 18.4%, Grasa 5.0%, Fibra 5.0%, Hidratos de carbono 65%, Energía 3.79 kcal/g. Las dietas formuladas fueron la AIN-93G (para crecimiento, gestación y lactación) y la AIN-93M para mantenimiento de los animales adultos (véase Cuadro 4-13). Las diferencias más importantes de la AIN-93G respecto a la AIN-76A son: • • • • •

Para incrementar la cantidad de ácido linoleico se sustituyen 7 g/100 g de dieta, de aceite de soja por 5 g/100 g de dieta, de aceite de maíz. El almidón de maíz se sustituye por sacarosa. La cantidad de fósforo se reduce, tratando de eliminar el problema de calcificaciones renales encontrados en la rata. La L-cisteina se sustituye por DL-metionina para suplementar a la caseina. Las cantidades de vitamina E, K y B –12 se aumentan y se añaden elementos traza a la mezcla de minerales (litio, vanadio, níquel, molibdeno).

En cuanto a la dieta de mantenimiento AIN-93M se reduce la cantidad de grasa a 40 g/Kg de dieta y la caseina a 140 g/Kg de dieta. Estas dietas presentan frente a la de 1976 un balance más correcto de nutrientes esenciales por lo que se consideran como las ideales, hasta la fecha, para estudios con ratas y ratones de laboratorio.

AIN-76: Mezcla mineral (g/kg) Fosfato cálcico bibásico 500.00 Cloruro sódico 74.00 Citrato potásico monohidratado 220.00 Sulfato potásico 52.00 Oxido de magnesio 24.00 Carbonato de manganeso 3.50 Citrato férrico 6.00 Carbonato de zinc 1.60 Carbonato cúprico 0.30 Yodato potásico 0.01 Selenito sódico 0.01 Sulfato de cromo y potasio 0.55 Sacarosa 118.00

AIN-76: Mezcla vitaminica (g/kg) Tiamina (mg/kg) 600.0 Rivoflavina (mg/kg) 600.0 Piridoxina (mg/kg) 700.0 Ácido nicotínico (mg/kg) 3.0 Pantotenato cálcico (mg/kg) 1.6 Ácido fólico (mg/kg) 200.0 Biotina (mg/kg) 20.0 Cianocobalamina (mg/kg) 1.0 Vitamina A (IU/kg) 400000 Vitamina E (IU/kg) 5000 Vitamina D3 (IU/kg) 100000 Vitamina K (mg/kg) 5.0 Sacarosa (mg/kg) 972.9

Cuadro 4-13. Diferentes tipos de dietas: AIN-93M y AIN-93G respecto a la AIN-76A

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Dietas químicamente definidas Se elaboran con fuentes químicamente puras de aminoácidos, mono o disacáridos y ácidos grasos o triglicéridos purificados. Los minerales se suministran mediante reactivos químicos y las vitaminas usadas son de una pureza elevada. Las concentraciones en nutrientes de estas dietas son fijas en el momento de la elaboración de la dieta pero la disponibilidad puede verse mermada debido a oxidaciones o a interacciones entre los productos químicos utilizados. Este tipo de dietas, ampliamente usadas, pueden tener problemas derivados de la insipidez o de la textura (para su preparación es aconsejable moler los ingredientes tan finamente como sea posible). Dietas carenciales y enriquecidas A partir de dietas de formula abierta, purificadas o químicamente definidas se pueden confeccionar “dietas especiales” en las que se ajusta la concentración en nutrientes a objetivos experimentales concretos y específicos, como por ejemplo estudiar el efecto de un aumento en los porcentajes de grasa saturada en la dieta sobre el fisiologismo cardiovascular . Estas dietas serán por tanto carenciales o ricas (adicionadas) en algún nutriente. El problema que presentan estas dietas es que al variar el contenido de un macronutriente se puede ver afectado el consumo de energía o de otros componentes de la dieta. En un régimen de alimentación ad libitum, los animales de laboratorio tienden a consumir una cantidad constante de energía, por lo tanto, si la densidad calórica de la dieta se incrementa (aumento en el porcentaje de grasa) los animales consumirán menos alimento lo que se traduce en una menor ingesta generalizada de nutrientes y viceversa. Cuando se utiliza este tipo de dietas en un experimento, hay que procurar que el consumo de los otros nutrientes de la dieta sea similar entre el grupo experimental y el control. En el caso de una dieta alta en grasa habría que disminuir la proporción de determinados nutrientes, tratando de que ambas dietas sean isocalóricas y por lo tanto no se vea afectada la ingesta global de proteína, vitaminas y minerales. Sin embargo no se pueden descartar ciertos aumentos en el consumo de la dieta grasa con respecto a la dieta control, por ser esta primera más grata al paladar. En el caso de dietas enriquecidas en fibra a costa de los carbohidratos la densidad calórica baja con lo que el consumo de dieta sería mayor al compararla con la dieta control lo que nos llevaría nuevamente a cambios en el consumo de otros nutrientes. Este problema se puede minimizar modificando ligeramente la grasa para conseguir que las dietas sean isocalóricas. Las dietas de ingredientes naturales comerciales suelen utilizarse mal cuando se emplean para preparar dietas adicionadas ya que al añadir cantidades extras de un macronutriente como grasa o azúcar los demás nutrientes quedan diluidos por la adición realizada. La dieta control y la problema tendrían porcentualmente cantidades diferentes de nutrientes. Este problema se minimiza si se añade a la dieta control un suplemento con el que se consiga la misma dilución de la dieta problema. Por lo general, las dietas comerciales contienen los nutrientes esenciales en exceso permitiendo una dilución entre un 10-20% sin que se produzcan desequilibrios importantes.

REGÍMENES ALIMENTICIOS A la hora de alimentar a los animales de laboratorio y en función de los requerimientos experimentales, se pueden elegir distintos tipos de regímenes relacionados con la cantidad total ingerida o con los tiempos de ingestión.

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Alimentación ad libitum Este régimen alimenticio supone el libre acceso al alimento las 24 horas del día. Las ratas, ratones y conejos consumen, sometidos a este régimen al menos el 80% del alimento durante el periodo de oscuridad. La alimentación ad libitum(AL) es aconsejable en experimentos de corta duración porque reduce el tiempo que hay que dedicar al mantenimiento de los animales. Así mismo es el sistema usual en las colonias, tanto para la población reproductora como para los individuos destinados a experimentación al menos hasta completar su crecimiento (valor K de la asintota de crecimiento, en torno a las 8-10 semanas de edad para rata). En experimentos de larga duración la alimentación ad libitum es considerada como la variable incontrolada más significativa que afecta el resultado final de los bioensayos con roedores, ver más adelante.

Alimentación restringida

Este tipo de régimen implica una restricción dietética moderada con objeto de paliar o limitar la sobrealimentación, sin que se produzcan deficiencias en algún nutriente o suponga una desnutrición del animal. El grupo de San Antonio del National Institute on Aging (NIA), desarrolla diferentes sistemas de Alimentación Restingida (AR) para un amplio grupo de animales incluidos primates, analizando exhaustivamente sus ventajas e incovenientes. Existen diferentes modalidades: • AR moderada: se restringe en torno al 30% de la ingesta diaria, desde las 6-8 semanas de edad (unos 12-14 g frente a los 17-20 g/día en al, para rata). • AR estricta: el animal recibe sólo entre un 50 a 60% del consumo máximo ad libitum. Mediante este método se han mantenido ratas hasta los 36-40 meses de edad (fase senil), de incalculable valor para estudios relacionados con procesos degenerativos asociados al envejecimiento humano. La alimentación restringida implica una mayor asistencia técnica, material y espacio. En alimentación ad libitum a los animales se les suministra comida para varios días (se aconseja no más de 48 horas, eliminando los sobrantes, antes del llenado de los comederos). En el caso de AR, se les debe suministrar a diario (se aconseja en el mismo periodo horario) y deben ser alojados individualmente, ya que el alojamiento en grupo puede generar competencia y agresividad, con un desnutrición potencial de los individuos menos fuertes. En la actualidad existen sistemas automáticos de control de acceso al alimento (Chronofeeder ), que reducen en parte estos inconvenientes, al poder programar la cantidad y tiempo de alimentación a voluntad de las necesidades experimentales.

Alimentación horaria o controlada Se permite consumir a los animales tanta comida como quieran pero sólo durante periodos de tiempo fijados al día. Este régimen de alimentación se usa en experimentos en los cuales hay que estudiar parámetros fisiológicos o bioquímicos en respuesta a la ingesta y compararlos con los niveles de los mismos en fase de ayuna o bien en aquellos que requieren un estado nutricional muy controlado. El empleo de sistemas automáticos de acceso de alimento es ideal para este tipo de régimen.

Alimentación a la par Consiste en tener un grupo control que ingiera la misma cantidad de alimento que el grupo problema el cual tiene una alimentación restringida. El objetivo que se persigue es poder comprobar que efectos son debidos al tratamiento que estemos aplicando al grupo problema y que efectos son consecuencia de la restricción dietética. La cantidad consumida por el grupo tratado diariamente se tomara como medida para alimentar al día siguiente al grupo control. Este tipo de alimentación restringida supone por tanto, un mayor trabajo y dedicación e implica

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al mismo tiempo el uso de jaulas individuales para evitar que los animales dominantes coman ad libitum con perjuicio de los más débiles del grupo.

Alimentación ad libitum frente a restringida (importancia en estudios a largo plazo) Desde el último decenio, se están generalizando los estudios a largo plazo, no sólo en toxicología y farmacología, sino también para investigaciones de procesos fisiológicos y bioquímicos (oxidación, radicales libres, neurología), considerando la variables edad, como factor clave en el análisis de los resultados. Frente a ello los requerimientos nutritivos de roedores maduros (sobre todo rata de las cepas Wistar, Fisher y Sprague-Dowley, mayores de 6 meses), utilizados en estudios crónicos (long-term) son virtualmente desconocidos. En muchos estudios se mantiene a los animales con las mismas dieta de crecimiento, en regimen ad libitum, hasta edades superiores a los dos años, sin tomar en cuanta las variaciones en las raciones nutritivas y la relación entre los requerimientos energéticos del animal y la densidad energética de la dieta. Hasta ahora se ha tomado en cuenta el criterio lineal de que los requerimientos energéticos están relacionados con el peso metabólico, es decir el peso corporal (kg0,75) estableciendo el Requerimiento de Mantenimiento (RM=0,45x peso corporal0,75) (ver tab.14.10). Sobre esta base se está controlando el valor energético de las dietas, utilizando las tipo hipocalóricas para animales de envejecimiento sometidos a ARM o ARE. Esta es el caso de la NTP-200 con un 14.5% de proteina, 8.5% grasa y un 9.5% de fibra o dietas isocalóricas con modificación de la fuente y contenido en carbohidratos, en especial la sacarosa. Otro aspecto es la reducción y control del consumo de dieta, mediante las diferentes modalidades de Alimentación Restringida Controlada (ARC). La sobrealimentación se considera como una de las variables más incontroladas en bioensayos en general. En diferentes estudios de AR, se ha observado una reducción de enfermedades degenerativas (nefropatías y cardiomiopatías), tumores relacionados con nutrición (mamitis y otras neoplasias) y obesidad. Igualmente, en la alimentación AL se observa un aumento del tamaño de diferentes órganos frente a animales con AR, correlacionados con un aumento de lesiones degenerativas y/o proliferativas del riñón, hígado, glándulas adrenales, pituitaria y tiroides entre otros órganos. Las poblaciones con ARC, en comparación con las alimentadas AL presentan, desde los 24 meses de edad, hasta un 40% más de supervivencia comparada y un incremento sustancial de la esperanza de vida media (life span), con un 60% de la población superando los 36 meses de edad .Todo ello asociado a una a disminución en la variabilidad intramuestra y entre laboratorios a la hora de obtener resultados. Actualmente se especula con que muchos de los benefecios generados por la AR son controlados por el eje hipotalamo-pituitaria-adrenales, via regulación hormonal. La AR no genera cambios apreciables en los parámetros hematológicos y clínicos en general con excepción de los triglicérido y algunos parámetros bioquímicos. No obstante se aprecian diferencias significativa, en la capacidad de sintesis de proteinas o los niveles de somatostatina. Otro aspecto a considerar es la influencia de la alimentación restringida en las funciones inmunitarias de los animales de edad avanzada (especialmente roedores), que está siendo objeto de especial atención. Entre los beneficios debidos a la dieta restringida, se han citado la prevención de la esplenomegalia, el mantenimiento de un mayor tamaño en las poblaciones de células T cooperadoras y T citotóxicas, y la preservación de la actividad celular del timo. Dos de los hallazgos más interesantes han sido el mantenimiento de una población de células T vírgenes, que asegura la persistencia de la capacidad de producción de interleucina 2, previniendo el declive de la inmunidad celular asociado al envejecimiento, y la preservación de las capacidad de proliferación de linfocitos T y B en respuesta a mitógenos, por citar tan sólo algunos de los estudios recientes al respecto.


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Finalmente, se carece de información sobre las condiciones de bienestar de los animales mantenidos a largo plazo y de los efectos colaterales de los procedimientos de envejecimiento en el estado general del animal. El sistema de ARC supone mantener al grupo experimental en jaulas individuales. Se sabe que el aislamiento a deprivación social obligada, a largo plazo, genera cambio en la respuesta endocrinas, hormonales y diferentes parámetros fisiológicos. El aislamiento en el intervalo de 6-24 meses, es también un protocolo usual en estudios de toxicología y cancerología y puede modificar las expresiones de toxicidad esperadas.

CONSERVACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LAS DIETAS Tanto la conservación como el control, constituyen aspectos fundamentales de la garantía de calidad de las dietas y de su estandarización, con el objeto de garantizar que no ejerzan un efecto distorsionador de los resultados experimentales. En este apartado se analiza el tema de la conservación, almacenamiento y controles de calidad bromatológicos y microbiológicos a los que deben ser sometidas las dietas. Las fuentes de contaminación pueden ser de origen abiótico (residuos de pesticidas, metales pesados), bióticos (microorganismos, hormonas) o antibióticos. Un aspecto prioritario a evaluar es la presencia en los piensos o dietas de componentes naturales o artificiales con actividad hormonal, susceptibles de alterar la homeostasis o equilibrio hormonal de los animales expuestos. En general los contaminantes pueden influir en los procesos fisiológicos, metabólicos y en el estado de salud de los animales utilizados y consecuentemente en los resultados esperados.

Almacenamiento de las dietas El control debe empezar cuando el producto llega al centro de experimentación y antes de su aceptación definitiva. Los técnicos o investigadores deben: •

•

Asegurarse de que las condiciones de presentación de los alimentos en el momento de llegar a su poder sean óptimos (envasado correcto, ausencia de humedad, sacos rotos, fecha de fabricación y/o caducidad). Comprobar que las fórmulas que figuran en la etiqueta corresponden al pedido.

Se aconseja no aceptar partidas envejecidas o rancias y fabricadas con 3 meses de antelación (menor plazo en el caso de cobayos). Solamente está justificado la compra de cantidades considerables de pienso para experimentos de larga duración con la finalidad de adquirir un sólo lote de fabricación y asegurarse de que no varían las concentraciones de nutrientes. Igualmente se deben desechar envases rotos, con alto porcentaje de humedad, de olor extraño, enmohecido y con excrementos de roedores. Las dietas de ingredientes naturales se deterioran antes. Los piensos deben almacenarse siempre en sitios fríos o frescos (ideal en cámara fría). En los piensos granulados la estabilidad durante el almacenamiento depende en gran medida de las características ambientales (humedad relativa -%HR-, temperatura de almacenamiento, grado de exposición al oxígeno atmosférico, pH del producto). Un nivel de humedad homogéneo es preferible a la existencia de "bolsas" con alto contenido de humedad. El calor y la humedad promueven la incubación de huevos y la aparición de diversas plagas (Tenebrionidos o gusanos de la harina). Toda actividad metabólica origina la producción de agua que incrementa el contenido de humedad, acelerando el deterioro de la sabrosidad y contenido nutricional de los alimentos almacenados. La estabilidad de los piensos está en razón inversa a su contenido en humedad por debajo del 15%. Se aconseja el almacenaje de las dietas purificadas o químicamente definidas a bajas temperaturas en sacos opacos, realizando nuevas mezclas cuando se precise más pienso en experimentos de larga duración. Es esencial evitar la entrada de roedores y pájaros a los almacenes. Estos deben disponer de mosquiteras, barreras antiroedores y estaciones de cebos en las proximidades, como barrera preventiva y detectora de la presencia de roedores foráneos.

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La necesidad del control nutricional Control sobre las especificaciones del etiquetado

El llamado análisis proximal de una dieta es necesario para dietas de formula cerrada basadas en dietas estándar de fórmula abierta, sometidas a variaciones imprevisibles por cambios en las materias primas, alteración en la aplicación de los correctores o variaciones en la premezcla y mezcla antes del granulado o extrusión. El objetivo es determinar posibles desviaciones sobre los valores aportados en las etiquetas de las diferentes partidas. Suponen el control del control que nos presentan las empresas productoras o abastecedoras. Este control se debería de realizar de manera rutinaria para garantizar la adecuada nutrición y evitar alteraciones patológicas o deficiencias en el crecimiento, desarrollo y tasa reproductora de la población. Igualmente se hace necesario en estudios de tipo nutricional en el que estas dietas se utilizan como patrón o control y sobre todo en estudios de toxicología. La calibración de las composiciones

Las fábricas productoras de dietas para animales de consumo y compañía que trabajan con normas ISO, disponen de modelos de calibrado de los piensos que analizadas con rapidez permiten determinar si las partidas fabricadas pasan o no los niveles deseados. Los análisis repetidos sirven como valores de referencia (patrón) o curvas de calibrado para validar métodos de análisis rápidos a pie de fábrica para control de las desviaciones en el contenido en nutrientes de los distintos lotes de piensos. Para ello se analizan al menos 50 muestras de distintos lotes de piensos y se realizan en ella 50 determinaciones de cada uno de los parámetros. El número total de muestras es de unas 10.000 (2.500 por cada parámetro). La calibración mediante infrarrojos a partir de valores estándar se hace al menos para proteína, grasa, hidratos de carbono, humedad y algún mineral diana como el Ca. Para posibles alteraciones en la aplicación del corrector se debe determinar alguna vitamina (vit. A y tiamina, según Oller et al 1989,). Esto permite validar la composición de las diferentes partidas producidas, garantizando que la composición indicada en la etiqueta ha sido contrastada experimentalmente antes de su distribución al usuario. Probablemente, para dietas de animales de laboratorio (dado la baja producción) pocas empresas disponen de este sistema. Con lo cual se deja al azar la composición real de estas dietas. Igualmente el MAPA es muy laxo a la hora de exigir los controles y los intervalos de los valores de la etiqueta. Posiblemente nadie hace los análisis por partida que especifica en la etiqueta, cuyos valores son, sospechosamente, siempre los mismos. El problema de la homogeneidad de las mezclas

Constituye uno de los problemas diana en la fabricación de piensos. Las plantas más modernas son capaces de producir piensos a la “carta” sin solución de continuidad y en cantidades de un amplio rango de variabilidad. Existen casos de producción de más 50 tipos diferentes de piensos de conejo, de manera rápida y controlada por ordenador. Sin embargo esto puede originar problemas en la calidad de la mezcla. Para evitarlas, existen controles de verificación de la homogeneidad de la mezcla que utilizan como elemento diana los cloruros analizados mediante la técnica NIR (Espectroscopia de Reflactancia en Infrarrojo Cercano). Se toman al menos 10 muestras del punto más próximo de la mezcladora al que se puede acceder, y no se aceptan valores superiores al 10% de Coeficiente de Variación (CV%) sobre el valor de una mezcla patrón.


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Componentes que se han de controlar y métodos

Un análisis proximal incluye la determinación cuantitativa de los siguientes parámetros: • • • • •

Humedad: muestra (4-5 g) sometida a 105+ 2 ºC en estufa hasta un peso constante. Proteína bruta: determinación de nitrógeno total por el método de Kjeldah. Extracto etéreo (grasa): tras digestión clorhídrica (hidrólisis con ClH). Método de Stold. Cenizas (minerales totales): calcinación de 1-2 g de muestra a 450 ºC en horno mufla. Vitaminas clave, como la A, E o D3: muestras saponificadas y extraídas con hexano y preparación de soluciones patrón de ambos componentes, determinando la cantidad exacta en sus respectivas disoluciones patrón mediante absorbancia por ultravioleta, mediante cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC).

Contaminantes abióticos

Las empresas especializadas envían controles periódicos de este tipo de contaminantes con los niveles mínimos aceptados por las reglamentaciones internacionales (USP EPA, Federal Register , 1979, vol.44, nº9, May 9). Su presencia se debe a posible contaminación de las materias primas en los procesos de cultivo (utilización de pesticidas o herbicidas) y a los métodos de conservación y almacenamiento. Tanto para animales de laboratorio convencionales de alta calidad como para SPF no se puede permitir la presencia, en sus dietas, de contaminantes abióticos. Por ejemplo los residuos de DDT (dentro del intervalo 0-1 mg/kg) influyen en la actividad de ciertas enzimas microsomales hepáticas de la rata, modificando la respuesta del hígado a procesos experimentales. Detectar su presencia/ausencia es particularmente importante en estudios de inducción de inmunotoxicidad, inducción enzimática y el desarrollo y reproducción de toxicidades.Destacan por su importancia: Residuos de plaguicidas organoclorados y organofosforados . La presencia de los primeros debe ser <0.005 mg/kg de pienso y de los segundos <0.01 mg/kg. La estimación de pesticidas pasa por el análisis mediante gases masas por ionización química o mediante trampa de iones (cromatografia en fase gaseosa). Una analítica completa implica la determinación de 13 organoclorados y 14 organofosforados diferentes. No obstante se pueden determinar elementos diana en base a familias o grupos con estructura química similar. Al menos analizar la presencia de malatión, PCP, dieldrin, lindane, heptaclorine y DDT. Minerales, normalmente pesados. Se determinan por mineralización por vía húmeda. La detección de metales pasados se basa en determinar al menos 12 tipos diferentes. Metales diana son arsénico, cadmio, mercurio y plomo. Es importante la ausencia de nitratos y nitritos. Antibióticos (penicilina G y otros). Se les añaden a las materias primas para incrementar su conservación y evitar contaminaciones microbiológicas. En muchos casos su presencia se ha debido a la utilización de materias primas que llevaban mucho tiempo (¡incluso años!) almacenadas o procedentes de terceros países con inadecuados sistemas de almacenamiento y conservación. En el caso de ensayos de antibióticos no se puede aceptar la adicción de estos elementos, por los efectos de alteración de la resistencia o sensibilidad del antibiótico ensayado (problemas de obtención de antígeno). Para una detección puramente cualitativa se utiliza un test colorimétrico similar al utilizados para detectar su presencia en orina o riñón. Su cuantificación exige de métodos más complejos como HPLC (cromatografía).

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Componentes naturales o artificiales con actividad hormonal . Se trata de detectar la presencia de fitoestrógenos, entre los componentes naturales, y de xenobióticos hormonales (pesticidas organoclorados, bisfenoles, ftalatos y alquilfenoles- entre los contaminantes). Se ha definido el término genérico de disruptores endocrinos para designar al grupo heterogéneo de contaminantes con actividad hormonal. La presencia de los disruptores endocrinos en las preparaciones comerciales de alimentos pueden tener un origen muy diverso: (i) componentes naturales de los productos primarios empleados en la fabricación de los preparados, por ejemplo soja y sus derivados; (ii) contaminantes presentes en los vegetales como residuos de pesticidas; (iii) monómeros de plásticos o colas empleados en la fabricación de los contenedores o sacos en los que se conservan y o esterilizan las dietas. El equilibrio de las hormonas sexuales – estrógenos y andrógenos— parece ser el más afectado por lo que se ha hecho hincapié en los trastornos reproductivos y los efectos generales dependientes de los estrógenos. Melazas: En alimentos destinados a determinadas especies (p. ej., en conejo) se añaden ingredientes que incrementan su sabor (derivados del procesamiento de la caña de azúcar y otros). Está demostrado que el uso de ingredientes que añaden sabor no incrementa significativamente el consumo de pienso por largos periodos en las especies comúnmente usadas en la investigación biomédica. El consumo se reduce cuando los piensos contienen un gran porcentaje de grasa. Determinados aditivos como aromatizantes, colorantes, hormonas y promotores del crecimiento no pueden ser permitidos para animales de experimentación.

Otros elementos relacionados con la contaminación abiótica, son los estrógenos y aflotoxinas generadas por hongos y levaduras del tipo B1, B2, G1, y G2 (mínimo aceptado < 0.001 mg/Kg). Otras micotoxinas producidas por hongos son las achratoxinas, zerealenona, sterigmatocistina. Su presencia se determina mediante cromatografía en fase iónica. Al menos se debe determinar presencia/ausencia de aflotoxinas. Debido a su alta toxicidad, su presencia obligaría a desechar una partida de pienso.

Contaminantes bióticos Estándar microbiológicos recomendados

Las dietas destinadas al consumo del animal de laboratorio, por su propia composición o por contaminación, constituyen de forma directa un medio de transmisión y cultivo de gérmenes específicamente patógenos o que sin serlo pueden originar alteraciones metabólicas y/o digestivas, e indirectamente repercutir sobre los bioensayos que se realizan con ellos. Previo al proceso de formación de pellets ya sea por presión en seco o mediante vapor de agua, las harinas se someten a un pre acondicionamiento con vapor a alta Tª que oscila entre los 50-90 oC, reduciendo la carga bacteriana de la mezcla a niveles inferiores del mínimo permitido. La extrusión de pellets con vapor de agua a presión elevada (8-9 bars) puede reducir hasta 2-4 veces el contenido bacteriológico total, pero aumenta el %H.R. del pellets favoreciendo a largo plazo la formación de hongos, especialmente en el período estival. Existen diferentes patologías que se pueden asociar o atribuir a la carga microbiológica de la dieta. Hongos y levaduras producen alteraciones metabólicas y estrogénicas debido a los metabolitos fúngicos formados por sus micotoxinas; junto con los agentes no patógenos aerobios (Coliformes y Enterococos) indican la humedad final del producto obtenido o la conservación en almacenes sin protección, por un período de tiempo prolongado o en condiciones de temperatura y humedad inadecuadas. Agentes patógenos de primer orden son Salmonella, E. coli, Estafilicocos y Clostridium sp, dependiendo de sus serotipos. Un elemento importante de contaminación es Clostridium perfrigens productor de toxiinfecciones alimentarias (esporas tipo A) y enteritis necrótica (tipo B) producida por enterotoxinas citoplasmáticas de los gérmenes en esporulación, con la circunstancia añadida de que las del tipo A son muy resistentes al calor. La tolerancia máxima se ha establecido en 102/g de producto


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y su presencia indica fermentaciones anaerobias intensas por conservación de la materia prima en silos de gran tamaño, o mantener posteriormente el pienso en condiciones de humedad. Se debe detectar la presencia al menos de: bacterias aerobias mesófilas (<1x106/g) ; Coliformes (<1x102/g) ;Escherichia coli (ausencia en 1 g) ; Enterococos (<1x102/g); Salmonella (ausencia en 25 g); Clostridium perfringens (<1x101/g); Estafilococos patógenos (DNAasa+, coagulasa+ y termonucleasa+ , máx. 10 ufc/g) y Hongos-levaduras (<1x102/g). En condiciones normales no se suele realizar la analítica correspondiente a Escherichia coli y Enterococos, porque se considera que al investigar Coliformes (Enterobacteriaceas lactosa+) y Salmonelas (Enterobacteriaceas lactosa-), se cubre suficientemente el campo en la detección de gérmenes fecales. Métodos y protocolos de esterilización de dietas

Es difícil encontrar un pienso en el mercado sin contaminación biótica, procedente en la mayoría de los casos de las materias primas. Un pienso en condiciones normales no suele presentar unidades formadoras de colonias (ufc), de coliformes, Salmonella y estafilococos (Cuadro 4-4); si embargo ninguno se libra de aerobios mesófilos, Clostridium y mohos/levaduras. Un pienso con valores superiores debe ser rechazado, como es el caso de la muestra problema (MP) con unas 100 veces más del mínimo aceptado para ufc de mohos/levaduras (ver Cuadro 4-14). Otra cuestión es, si en el caso de los animales de experimentación debemos estar tranquilos con los mínimos de ufc indicados anteriormente. Si la instalación es convencional y no dispone de barreras (ver capítulo.5.), se puede aceptar. Pero si disponemos de estas y el objetivo es producir o mantener animales Gnotobióticos o SPF (ver capítulo. 7.), o bien se realizan estudios de microbiología, producción de ascitis, o con inmunodeprimidos o similar, no es aceptable. En este caso es incuestionable el tratamiento del pienso por medio de calor (térmico) o irradiación. La exposición temporal a vapor a presión elevada o a radiaciones gamma son los métodos de esterilización más utilizados. La esterilización química mediante fumigación de óxido de etileno o similar ha sido definitivamente desechada por el potencial peligro de toxicidad durante su manipulación y la dificultad de eliminar los residuos de óxido de la dieta.

DIETA

ºC

Tº

MC1-6

AMES 10 ufc/g 9. 105+

COLI 100 ufc/g Ausencia

SALM Aus/25g Ausencia

CLOS ESTAFI 10 ufc/g Aus/g 30.3+1.65 Ausencia

MOH/LEV 100 ufc/g 290+162.3

MP1-3 MT1-3 MT4-6 MT7-9 MT10-12

1.8104 Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia

Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia


15.5 Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia

195000 Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia

TMA

105 110 115 120

15’ 15’ 15’ 15’

6-7


TMA: tasa máxima aceptada. MC: muestra control, n= 6. MP: muestra problema. MT: muestra tratada térmicamente. AMES: aerobios mesófilos; COLI: coliformes; SALM: salmonella; CLOS: clostridium; ESTAFI: estafilococos; MOH/LEV: mohos y levaduras.

Cuadro 4-14. Carga microbiológica de dieta control (MC1-3) y tratada térmicamente (MT) con diferentes valores de temperatura (ºC) y tiempo (Tº). Igualmente se indica la microbiología de una dieta altamente contaminada (MP1-3). En todos los casos se indica el valor medio (0+ DS). (Extraído de Zúñiga et al (1999).


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Esterilización por calor: una esterilización eficiente por vapor, exige de un autoclaveado con presiones de vapor superiores a 1 Atmósfera y para que sea completa, los piensos deben someterse a temperaturas superiores a los 120oC.Valores desde 80oC e inferiores 120oC, se consideran pasteurización, capaz de destruir los organismos vegetativos y huevos de parásitos pero no las esporas y alguna flora bacteriana. La destrucción de los contaminantes microbianos se produce cuando es liberado el calor latente por condensación, después del vacío, garantizando el mantenimiento de la temperatura precisa durante el tiempo preestablecido, ya que es esencial la penetración completa del vapor en los pellets. Para conseguir estas condiciones los piensos deben ser extendidos en capas inferiores a 3 cm de espesor, a fin de facilitar una distribución homogénea del calor.

En sí mismo es evidente que un proceso de esta naturaleza, diseñado para la aniquilación de microorganismos, pueda originar alguna destrucción de los componentes nutricionales de la dieta. Aparentemente no afecta al contenido de proteína cruda pero sí puede afectar a su digestibilidad efectiva (DT), valor biológico (BV) y proteína neta utilizada (NPU=TDxBV), debido a una sensible reducción en la disponibilidad de aminoácidos como la metionina y la lisina fundamentalmente. Por otra parte la esterilización por calor puede producir una severa afectación de las vitaminas termolábiles fundamentalmente del complejo B, B1, B6, ácido pantoténico, vitamina A, C y ácido fólico (Figura 4.2). La composición del complemento mineral, también es importante debido a posibles alteraciones del pH de la dieta que a su vez pueden afectar a la perdida de nutrientes. Se considera adecuado suplementar las dietas esterilizadas con el doble de su contenido vitamínico para compensar posibles pérdidas. Otra secuela de la esterilización por vapor es el “efecto de bronceado” (Millard), como consecuencia de la reacción entre los carbohidratos y los grupo amino de los aminoácidos. 16

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H U M E D A D

C E N IZ A S

V IT A

V IT E

Figura 4.2. Variaciones en la composición de Vitaminas en la dieta tratada térmicamente a diferentes valores de temperatura. Extraído de Zúñiga et al (1999). Se ha observado que esta reacción induce a diarreas y a una reducción significativa de la retención de Ca, P, Mg y Cu en animales GF ( Germen Free), pero no en CV (Convencionales). Finalmente, la alteración de la textura, color y sabor del alimento, pueden afectar a su consumo (palatabilidad), modificando a medio o largo plazo el normal crecimiento o desarrollo de los animales y sus índices de producción: menor peso al nacer, aumento del intervalo entre camadas, y otros.


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La dureza del pellets, se ve incrementada en un 49-50% en dietas esterilizadas a 121ºC, en un ciclo completo de 2 horas como consecuencia de la caramelización de los carbohidratos y el almidón. Para obtener una esterilización adecuada se debe establecer el vacío antes de la admisión del vapor para facilitar su penetración en la masa total a tratar. Para un tratamiento eficaz y homogéneo, el pienso se debe disponer en capas de 2-3 cm en el interior de cajas de inox.18/8 (600x170x630 mm) con perforaciones de 2 mm, cargadas en el interior del autoclave. Se debe evitar la esterilización en el interior de los sacos de papel microperforados ante la posible liberación de monómeros tóxicos provenientes de las colas o pegamentos utilizados para unir las diferentes capas de papel que los componen. La pasteurización garantiza, a partir de los 105ºC (15’ y 25’ de secado) la pérdida del contenido microbiológico del pienso incluidas las formas de mayor resistencia al calor (véase Cuadro 4-14). No obstante en partidas de pienso sospechosas o en malas condiciones, se debería tratar a Tª > 105ºC y < 121ºC, para garantizar la eliminación de toda fuente de contaminación sin necesidad de hacer un análisis microbiológico del pienso. En este sentido se considera que 115ºC (3 prevacíos, 15-20’ de esterilización, 25’ de secado) es la temperatura más adecuada, cumpliendo sobradamente las expectativas de control de calidad microbiológica, sin producir alteraciones apreciables en el crecimiento y desarrollo de los animales de laboratorio ensayados. Por otra parte, las formas innovadoras de encapsulado de las vitaminas liposolubles y termolábiles (E y D3) les proporcionan una mayor resistencia al calor, lo que hace injustificado el adicionar vitaminas a las dietas para su esterilización siempre y cuando esta sea inferior a los 121ºC (Fig.4.3). Esto permite tratar térmicamente las dietas usuales destinadas a los animales en mantenimiento y reproductores, suministradas por las casas comerciales, sin mermas apreciables en el crecimiento y productividad. Las alteraciones en la asimilación del nitrógeno sobre todo en animales en fase de crecimiento desaconseja esterilizar a Tª ≥ a 121ºC. Otro aspecto a considerar es que la exposición a temperaturas elevada por cortos espacios de tiempo es menos perjudicial para la integridad de los principios nutritivos que los tratamientos durante mucho tiempo a bajas temperaturas. Para realizarlos se necesitan autoclaves que obtenga un alto vacío antes y después del tratamiento con vapor, y alcanzar al menos 134 ºC durante 3 minutos.

A

B

Figura 4.3. A. Muestras de pienso sin esterilizar (superior derecha) y esterilizadas a diferente temperatura (130ºC superior izquierda, 115ºC inferior derecha, 120ºC inferior izquierda). B. Muestras de pienso en mal estado y sometidas a análisis microbiológicos. Se observa la formación de colonias de mohos y levaduras. (Fotos cedidas por J. Martín Zúñiga).

Esterilización por radiaciones ionizantes: el método de exposición a radiaciones ionizantes del tipo gamma utilizando como fuente CO60 es el más eficaz debido al intenso poder de penetración de las radiaciones y a la escasa alteración que produce en el contenido nutritivo y

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estabilidad de las dietas, observando escasas alteraciones en su digestibilidad. La unidad de medida de la radiación es el gay (Gy), una dosis de 25 KGy a temperatura normal, es la más adecuada para asegurar la esterilización de dietas de animales de laboratorio, aunque se prefiere alcanzar dosis superiores (50 KGy) en el caso de animales Gnotobióticos. El aumento de temperatura para estas dosis de radiación es de pocos grados y no hay actividad residual en los productos tratados. La radiación es en general menos perjudicial que el calor para los principios nutritivos de la dieta. En contraste, la presencia de humedad incrementa la posibilidad de pérdida de nutrientes porque la irradiación del agua incrementa los radicales libres que pueden originar cambios oxidativos. En la actualidad, existen algunas instalaciones industriales destinadas a la radiación de múltiples productos, que pueden irradiar grandes cantidades de pienso. Su mayor y casi único inconveniente es el alto coste (entre un 50-80% más del precio base del pienso). Una ventaja práctica de la radiación es su alto poder de penetración, lo que permite que gruesos paquetes sean satisfactoriamente esterilizados. Si la dieta va destinada animales gnotobióticos deben prepararse volúmenes de pienso en bolsas de plástico precintadas, siendo preferible hacer previamente el vacío en ellas, para de esta forma reducir los cambios oxidativos inducidos por las radiaciones. Impregnar la dieta en nitrógeno antes de ser precintada es una buena alternativa en dietas finamente molidas donde las oxidaciones inducidas por la radiación pueden crear problemas. El paquete con la dieta es entonces sellado en una segunda envoltura que puede quitarse inmediatamente antes de situarla en el ambiente estéril del aislador (véase Cap.7). Los paquetes con pienso son protegidos durante el transporte y la irradiación por cartones fuertes o sacos compatibles con el equipo mecánico de manejo y con la planta de irradiación.

RESUMEN El estado nutricional de un animal de laboratorio esta directamente relacionado con una alimentación adecuada (cualitativa y cuantitativamente). Un correcto estado nutricional permite que el animal alcance todo su potencial genético en fases claves como el crecimiento, la reproducción y las expectativas de vida (longevidad). Asimismo, una alimentación correcta permite al animal presentar respuestas más favorables a factores de estrés ambiental como la presencia de patógenos. En el estado actual de las investigaciones contrastadas se ha observado que los resultados experimentales se pueden ver afectados de forma no intencionada por la composición de la dieta. Estos efectos pueden ser producidos por variaciones no deseadas y desconocidas en la composición, distribución homogénea de los nutrientes, variaciones en los constituyentes y materias primas, junto con posibles fuentes de contaminación abiótica y/o biótica. Igualmente se da la circunstancia de que en determinado tipo de experimentos, el consumo de alimentos puede variar entre el grupo control y el experimental generando resultados desviados y por consiguiente una falsa interpretación de los datos. Las consecuencias que esto produce van desde el sacrificio innecesario de animales, hasta la pérdida de tiempo y recursos. Este capítulo se centra en la nutrición como factor clave que potencialmente puede interferir en la experimentación animal. A partir del concepto de energía se comentan las características de los principales macronutrientes de una dieta: la proteína, indicando la forma de valoración de su contenido y los requerimientos normales; los hidratos de carbono, fibra, grasa, minerales y vitaminas. Se indican los requerimientos nutritivos mínimos de estos elementos y se comentan las consecuencias de su deficiencia en el desarrollo normal del animal y sus efectos patológicos. En una segunda parte del capítulo y partiendo de lo anterior se establecen los requerimientos nutritivos que sirven para establecer las fórmulas de las diferentes dietas con indicación de su procesado, forma física y los diferentes tipos según el origen de las materias

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primas (ingredientes naturales, semipurificadas, purificadas) y las denominadas dietas experimentales (carenciales o similar). Se indican los diferentes tipos de regímenes alimentación con especial mención a la alimentación restringida, sus consecuencias y utilidad. La tercera parte se dedica a aspectos técnicos relacionados con la conservación y control de calidad de las dietas, tratando aspectos fundamentales tales como su almacenamiento, la necesidad del control nutricional, los estándar microbiológicos recomendados y los los diferentes tratamientos preventivos contra posibles contaminaciones microbiológicas indeseables.

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