Tanggal Praktikum Praktikum 4
21 Oktober 2014 KONTROL MIKROBA DENGAN PERLAKUAN KIMIA
PRELAB
1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan disinfeksi? Desinfeksi adalah kegiatan yang dilakukan untuk membunuh mikroorganisme patogen yang dapat menyebabkan penyakit. Desinfeksi bisa dilakukan dengan cara fisik (pemanasan) dan penambahan bahan kimia yang merupakan turunan aldehid, turunan alkohol, turunan fenol, turunan amonium kuartener, dan turunan halogen atau halogenofor. Desinfeksi dilakukan apabila sterilisasi sudah tidak mungkin dikerjakan, meliputi : penghancuran dan pemusnahan mikroorganisme patogen yang ada tanpa tindakan khusus untuk mencegah kembalinya mikroorganisme tersebut (Purnawijayanti, 2010). 2. Apa yang dimaksud dengan disinfektan?Jelaskan! Desinfektan merupakan bahan kimia yang digunakan untuk mencegah terjadinya infeksi dengan membunuh jasad renik (bakterisid), terutama pada benda mati. Proses desinfeksi dapat menghilangkan 60% - 90% jasad renik. Desinfektan digunakan secara luas untuk sanitasi baik di rumah tangga, laboratorium, dan rumah sakit (Larson, 2013). Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas desinfektan yang digunakan untuk membunuh jasad renik adalah ukuran dan komposisi populasi jasad renik, konsentrasi zat antimikroba, lama paparan, temperatur, dan lingkungan sekitar (Pratiwi, 2008). 3. Bagaimana cara kerja/mekanisme disinfektan dalam menghambat pertumbuhan mikroba? Desinfektan seperti fenol dan senyawa amonium kuartener memiliki sifat yang dapat merubah permeabilitas membran sel bakteri. Terjadinya perubahan permeabilitas membran sel menyebabkan kebocoran kostituen sel yang esensial sehingga bakteri mengalami kematian (Butcher and Ulaeto, 2010). Senyawa turunan trifenilmetan seperti gentian violet dan akridin seperti akriflavin bekerja sebagai antibakteri dengan mengikat secara kuat asam nukleat. Ikatan ini akan menghambat sintesis ADN sehingga sintesis protein tidak terjadi. Hal ini menyebabkan penghambatan proses biologi yang penting untuk kehidupan bakteri sehingga bakteri mengalami kematian (Stevens, 2011). Beberapa turunan fenol, seperti heksaklorofen dan oksikuinolin dapat membentuk khelat dengan ion Fe dan Cu masuk ke dalam sel bakteri, kemudian bentuk khelat tersebut masuk ke dalam sel bakteri. Kadar yang tinggi dari ion-ion logam di dalam sel menyebabkan gangguan fungsi enzim-enzim sehingga jasad renik mengalami kematian (Somani et al, 2011). 1
4. Apa yang dimaksud dengan uji koefisien fenol? Koefisien fenol merupakan kemampuan suatu desinfektan dalam membunuh bakteri dibandingkan dengan fenol. Uji ini dilakukan untuk membandingkan aktivitas suatu produk (desinfektan) dengan fenol baku dalam kondisi uji yang sama. Fenol dijadikan standar dalam uji efektivitas desinfektan karena kemampuannya dalam membunuh jasad renik sudah teruji. Penentuan koefisien fenol adalah untuk mengevaluasi kekuatan anti mikroba suatu desinfektan dengan memperkirakan efektivitasnya berdasarkan konsentrasi dan lamanya kontak terhadap mikroorganisme tertentu (Somani et al, 2011).
5. Bagaimana perhitungan tingkat efektifitas disinfeksi yang dinyatakan dalam koefisien fenol? Jelaskan! Nilai koefisien fenol dihitung dengan cara membandingkan aktivitas suatu larutan fenol dengan pengenceran tertentu yang sedang diuji. Hasil dari uji koefisien fenol menunjukan bahwa disinfektan turunan aldehid dan halogen lebih efektif membunuh bakteri Staphylococcus aureus dengan nilai koefisien fenol 3,57 ; 5,71 ; 2,14 ; 2,14 berturut-turut untuk formalin, glutaraldehid, iodium dan hipoklorit, begitu juga dengan bakteri Salmonella typhi, disinfektan aldehid dan halogen masih lebih efektif dengan nilai koefisien fenol 1,81 ; 2,72 ; 2,27 dan 2,27 berturut-turut untuk formalin, glutaraldehid, iodium dan hipoklorit (Purnawijayanto, 2010).
Paraf Asisten
Nama:
2
Tinjauan Pustaka a. Hand Sanitizer Merupakan cairan pembersih tangan berbahan dasar alkohol yang digunakan untuk membunuh mikroorganisme dengan cara pemakaian tanpa di bilas dengan air. Secara umum hand sanitizer mengandung : alkohol 60-95%, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, chlorhexidine, gluconatee, chloroxylenolf, Clofucarbang, hexachloropheneh, Hexylresocarcinol, iodine (Dwijoseputro, 2004). Hand sanitizer terbagi menjadi dua yaitu mengandung alkohol dan tidak mengandung alkohol. Hand sanitizer dengan kandungan alcohol antara 60-95 % memiliki efek anti mikroba yang baik dibandingkan dengan tanpa kandungan alkohol (Larson, 2013). b. Antiseptik Antiseptika pada umumnya dimaksudkan bahan-bahan yang mematikan atau menghambat mikroorganisme, khususnya yang berkontak dengan tubuh tanpa mengakibatkan kerusakan besar pada jaringan. Kebanyakan disinfektan yang digunkana sebagai antiseptik terlalu dekstruktif terhadap jaringan (Pratiwi, 2008). c.
Fenol
Fenol sendiri mempunyai efek antiseptik dan desinfektan. Golongan fenol diketahui memiliki aktivitas antimikroba yang bersifat bakterisid namun tidak bersifat sporisid. Senyawa turunan fenol yang dikenal sebagai senyawa fenolik mengandung molekul fenol yang secara kimiawi dapat diubah. Perubahan struktur kimia tersebut bertujuan untuk mengurangi efek iritasi kulit dan meningkatkan aktivitas antibakteri (Brewer, 2010). Aktivitas antimikroba senyawa fenolik disebabkan kemampuannya merusak lipid pada membran plasma mikroorganisme sehingga menyebabkan isi sel keluar. Peningkatan sifat lipofil turunan fenol akan meningkatkan aktivitas desinfektannya. Salah satu senyawa fenolik yang paling sering digunakan adalah kresol (Ramona et al, 2007) d. Klorin Klorin atau klorida berasal dari bahasa Yunani “cholosos”, yang berarti hijau pucat, adalah unsur kimia dengan nomor atom 17 dengan symbol Cl. Gasklor berwarna kuning kehijauan. Klorin adalah bahan kimia yang penting untuk beberapa proses penurunan air, penjangkitan dan dalam pelunturan. Klor merupakan salah satu zat desinfektan yang sering digunakan dalam pengolahan air minum, pembunuh bakteri pada kolam renang dan sebagai antiseptik pewarna (Ramona et al, 2007). e. Sabun cuci piring Sabun cuci piring terdiri dari dua jenis yaitu sabun cuci piring biasa dan sabun cuci piring yang memiliki senyawa antimikroba disebut biosida, biasanya diberi tambahan biguanida poliheksametilena biosida pada tingkat 1000-10 000 ppm. Penambahan sabun cuci piring antimkiroba dengan konsentrasi kurang dari 2% dapat menghambat perkembangbiakan bakteri (Larson, 2013).
3
Diagram Alir
4
Laporan Praktikum
1. Tuliskan data pengamatan yang diperoleh dari praktikum mengenai pengaruh disinfektan terhadap mikroba. Amati pertumbuhan mikroba pada NB. Isilah tabel pada kolom*) dengan (+) jika ada pertumbuhan dan (-) jika tidak ada pertumbuhan Tabel : Data Fenol (Kontrol Positif) Bahan
Pengemceran
Interval disinfeksi (menit) *) 5 10 15
Fenol
Tabel : Data Disinfektan yang diuji Bahan
Pengemceran
Interval disinfeksi (menit) *) 5 10 15
Nilai Koefisien Fenol
5
2. Bahas data fenol. Apakah dalam sepuluh menit terdapat efek mematikan mikroba? Jelaskan! Senyawa desinfektan dapat dikatakan memiliki efek mematikan mikroba, jika tidak ada kekeruhan pada larutan desinfektan yang sudah diinokulasi bakteri. Berdasarkan hasil pengamatan sampel fenol dengan pengenceran 1:80 pada menit ke 10 dan 15 larutan fenol tidak keruh. Hasil yang sama terjadi pada pengenceran fenol 1:100 menit ke 5,10 dan 15. Namun, pada pengenceran fenol 1:90 terdapat kekeruhan pada menit ke 5 dan 10. Sehingga dari data tersebut disimpulkan jika fenol efektif membunuh E. coli dengan pengenceran 1:80 dan 1:100. Dalam penelitian yang menggunakan fenol sebagai desinfektan dengan menggunakan sampel E. coli menunjukkan bahwa fenol yang dilarutkan sebesar 1:1000 dapat merusak kemampuan sel dalam mengaktifkan enzim suksinat, piruvat, fumarat dan glutamate. Sehingga menyebabkan metabolisme E.coli menjadi terhambat dan menyebabkan E. coli tersebut mati. Penelitian lain mempelajari tentang efek antiseptic fenol dengan mengakibatkan lisis sel bakteri. Disebutkan bahwa E. coli, staphylococcus, dan streptococcus mengalami lisis saat diberikan larutan fenol dengan konsentrasi sebesar 0.032% namun pada konsentrasi 0,54% tidak ada sel yang mati. Hal ini dikarenakan sel akan mengalami koagulasi dan presipitasi saat konsentrasi fenol terlalu tinggi. Pada literatur menyebutkan bahwa kemampuan fenol sebagai disinfektan dikaitkan dengan kemampuannya : (1)bakteostatik pada kadar 0.02%-1%; (2) bakterisid pada kadar 0,04% sampai di atas 1,6% (3) bersifat fungisid pada kadar 1,3%; (4) tidak bersifat sporodial; (5) pada kadar tinggi dapat mengendapkan protein sedangkan pada kadar rendah mendenaturasi protein; (6) efeknya akan menurun pada media alkalis seperti sabun.
6
3. Bandingkan dan bahas data antar disinfektan yang diuji. Pada pengamatan, sampel yang memiliki efek mematikan pada E.coli adalah klorin dan hand sanitizer. Hal ini ditunjukkan bahwa kedua sampel dengan pengenceran 1:500 saat menit 15 tidak terdapat kekeruhan dan tidak terbentuk endapan. Kemudian, untuk mengetahui efektifitas disinfektan klorin dan hand sanitizer dapat diketahui dengan menghitung koefisien fenol. Nilai koefisien fenol dihitung dengan cara membagi
pengenceran tertinggi dari suatu disinfektan yang dapat mematikan mikroba dengan pengenceran tertinggi fenol dalam mematikan mikroba. Apabila hasil uji koefisien fenol >1 maka disinfektan tersebut lebih baik dalam mematikan mikroba dibandingkan fenol. Dari hasil perhitungan, uji koefisien fenol dari kedua sampel adalah 0,16 dengan cara sebagai berikut a. klorin
b. Hand Sanitizer
Koefisien fenol : du/df
Koefisien fenol : du/df
: 1/500
: 1/500
1/80
1/80
: 80/500
: 80/500
: 0,16
: 0,16
Koefisien fenol <1 sehingga klorin dan hand sanitizer tidak efektif dalam membunuh mikroba jika dibandingkan dengan fenol. Pada literatur menyebutkan bahwa hand sanitizer dettol dapat mengurangi jumlah E.coli sebanyak 106 CFU/ml pada menit ke 5 dengan pengenceran 1:420 sampai 1:550. Perbedaan hasil percobaan dengan literatur mungkin dikarenakan kesalahan praktikan seperti teknik aseptic kurang diperhatikan dan terjadi kontaminasi saat melakukan inokulasi E. coli pada mikrotube. Dilaporkan bahwa kemampuan antimikroba pada senyawa fenolik terkait dengan inaktivasi enzim seluler, yang tergantung pada tingkat penetrasi substansi ke dalam sel dan dapat menyebabkan perubahan permeabilitas membran Peningkatan permeabilitas membran merupakan faktor utama dalam mekanisme aksi antimikroba, di mana senyawa dapat mengganggu membran dan menyebabkan hilangnya integritas selular dan kematian sel. Senyawa turunan fenol aktif seperti timol, eugenol, dan carvacrol telah terbukti menyebabkan gangguan membran sel, penghambatan aktivitas ATPase, dan pelepasan ATP intraseluler dari beberapa mikroorganisme seperti E. coli, E. coli O157: H7, L. monocytogenes, Lactobacillus sakei, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, dan S. aureus. Sedangkan pada sampel sabun cuci piring baik pengenceran 1:400, 1:450 dan 1:500 hasilnya positif ditandai dengan adanya kekeruhan pada sampel. Sehingga jika diurutkan efektifitas anti mikroba dari 3 sampel tersebut adalah kloirin, hand sanitizer, dan sabun cuci piring. .
7
4. Jelaskan mekanismenya dalam penghambatan mikroba untuk disinfektan yang mempunyai koefisien fenol >1(jika ada)! Pada pengamatan tidak terdapat disinfektan yang memiliki uji koefisien fenol >1. Namun pada literatur menyebutkan bahwa hasil dari uji koefisien fenol menunjukan bahwa disinfektan turunan aldehid dan halogen lebih efektif membunuh bakteri S. aureus dengan nilai koefisien fenol 3,57; 5,71; 2,14; 2,14 berturut-turut untuk formalin, glutaraldehid, iodium dan hipoklorit, begitu juga dengan bakteri S. typhi, disinfektan aldehid dan halogen masih lebih efektif dengan nilai koefisien fenol 1,81; 2,72; 2,27; dan 2,27 berturut-turut untuk formalin, glutaraldehid, iodium dan hipoklorit (Mukti,2006). Formalin dianggap sporicidal berdasarkan kemampuannya untuk menembus ke dalam spora bakteri. Telah ditemukan bahwa formaldehida bertindak sebagai agen mutagenik dan sebagai agen alkilasi dengan reaksi dengan karboksil, sulfhidril, dan gugus hidroksil. Formaldehida juga bereaksi secara ekstensif dengan asam nukleat (misalnya, DNA bakteriofag T2). Selain itu, formalin mempunyai kemampuan untuk membentuk ikatan antara protein dengan DNA, sehingga menghambat sintesis DNA (369). Dalam konsentrasi rendah formaldehida yang sporostatic dan menghambat sporulasi. Glutaraldehid merupakan dialdehyd jenuh yang penggunaannya ditemukan sebagai desinfektan dan sterilisasi, khususnya untuk desinfeksi pada suhu rendah, sterilisasi peralatan bedah dan sebagai fiksaktif dalam mikroskop elektron. Glutaraldehid memiliki spektrum yang luas dari aktivitas terhadap bakteri dan spora mereka, jamur, dan virus. Studi-studi bakterisida menunjukkan bahwa glutaraldehid mengikat kuat lapisan luar organisme seperti E. coli dan Staphylococcus aureus, penghambatan sistem transport pada bakteri gram negatif, penghambatan aktivitas dehidrogenase dan enzim periplasmic, dan lisis protoplas pada media hipotonik, penghambatan RNA dan DNA serta menghambat sintesis protein (Donnel dan Russel, 2009). Iodine secara cepat menembus sel mikroorganisme dan menghambat fungsi utama protein (khususnya sistein asam amino bebas sulfur dan metionin) di dalam sel, menyerang nukleotida dan asam lemak, yang berpuncak pada kematian sel. Sedangkan mekanisme iodine sebagai antivirus hanya sedikit informasi yang diketahui, namun beberapa studi menunjukkan bahwa iodine dapat menghambat pertumbuhan virus nonlipid dan parvovirus. Demikian pula untuk bakteri, ada kemungkinan bahwa iodine menyerang protein pada permukaan virus (Donnell dan Russel, 2009).
8
5. Adakah disinfektan yang mempunyai nilai koefisien <1?Jelaskan kenapa!
6. Faktor-faktor apakah yang mempengaruhi kinerja disinfektan? Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas desinfektan yang digunakan untuk membunuh jasad renik adalah ukuran dan komposisi populasi jasad renik, konsentrasi zat antimikroba, lama paparan, temperatur, dan lingkungan sekitar (Pratiwi, 2008). Konsentrasi desinfektan atau zat antimikroba penting karena hanya pada konsentrasi tertentu desinfektan tersebut dapat bekerja dengan baik, misalnya pada
9
Pertanyaan dan Tugas
1. Mengapa fenol dijadikan parameter perhitungan uji efektivitas disinfektan! Fenol digunakan sebagai senyawa baku dalam pengujian desinfektan karena memiliki mekanisme kerja yang luas. Fenol dapat merusak dinding sel dan membran sel, mengkoagulasi protein, merusak ATPase, merusak sulfohidril dari protein, dan merusak DNA sehingga efektif membunuh bakteri (Fazlara dan Ekhtelat, 2012). Fenol adalah salah satu contoh disinfektan yang efektif dalam membunuh kuman pada konsentrasi rendah. Daya bunuhnya ini disebabkan karena fenol mempresipitasikan protein secara aktif, dan selain itu juga merusak membran sel dengan menurunkan tegangan permukaannya. Dengan persetujuan para ahli dan peneliti, fenol dijadikan standar pembanding untuk menentukan aktivitas sesuatu desinfektan.
2. Jelaskan sifat-sifat penting dari disinfektan! Beberapa hal yang perlu diperhatikan pada disinfektan yaitu: 1. Sifat mikrosidial (membunuh mikroorganisme) hal ini berkatian dengan sifat spora pada umumnya lebih tahan daripada bentuk vegetatif. Pengertian mikrosidial adalah memberikan kerusakan bersifat tetap pada bakteri terkait yang diberikan desinfektan. 2. Sifat lain yang diperhatikan yaitu sifat mikrostatik (menghambat pertumbuhan jasad renik) dikarenakan beberapa komponen kimia pada konsentrasi rendah tidak dapat membunuh jasad renik, tetapi hanya menghambat pertumbuhannya, misalnya senyawa tertentu yang terdapat pada rempah-rempah. Sifat mikrostatik ini hanya menyebabkan kerusakan sementara yang dapat kembali. Suatu komponen akan bersifat mikrosidal atau mikrostatik tergantung pada konsentrasi dan kultur yang digunakan.
3. Kecepatan membunuh karena komponen kimia mempunyai kecepatan membunuh yang berbeda-beda terhadap jasad renik. Beberapa komponen lainnya hanya efektif setelah beberapa jam. Sel yang sedang tumbuh atau berkembang biak lebih sensitif dan mudah dibunuh dibandingkan dengan sel dalam keadaan istirahat atau statik. 4. aktivitasnya tetap dalam waktu lama 5. larut dalam air dan stabil dalam larutan. Kriteria suatu desinfektan yang ideal adalah bekerja dengan cepat untuk menginaktivasi mikroorganisme pada suhu kamar, berspektrum luas, aktivitasnya tidak dipengaruhi oleh bahan organik, pH, temperatur, dan kelembaban, tidak toksik pada hewan dan manusia, tidak bersifat korosif, bersifat biodegradable, memiliki kemampuan menghilangkan bau yang kurang sedap, tidak meninggalkan noda, stabil, mudah digunakan, dan ekonomis (Butcher and Ulaeto, 2010).
10
3. Sebutkan jenis-jenis senyawa disinfektan yang tersedia secara komersial!Bagaimana mekanisme kerjanya?
4. Adakah metode selain koefisien fenol untuk menguji keefektivitasan disinfektan?Jika ada, jelaskan prinsip kerjanya! Metode Kirby-Bauer atau metode difusi cakram (difusi disk) merupakan cara yang paling banyak dipakai untuk menentukan kepekaan kuman terhadap berbagai macam antibiotika. Pada metode difusi cakram digunakan cakram kertas saring yang mengandung desinfektan dengan konsentrasi tertentu yang ditempelkan pada lempeng agar yang telah ditanami suspense kultur mikroba. Hambatan (killing zone) akan tampak sebagai daerah yang tidak memperlihatkan pertumbuhan mikroba disekitar cakram. Lebar daerah hambatan tergantung ada atau tidaknya daya serap desinfektam kedalam agar dan kepekaan mikroba terhadap desinfektan tersebut. Hasil pengujian difusi disk dapat dilihat dari dua alternatif. Pertama ialah apabila di sekitar paper disk terdapat zona (daerah) bening tanpa pertumbuhan bakteri; hal ini dinyatakan positif, berarti desinfektan yang diuji mempunyai daya antimikroba. Alternatif kedua ialah apabila di sekitar paper disk tidak terdapat zona bening yang bebas dari pertumbuhan bakteri dinyatakan negatif yang berarti desinfektan yang diuji tersebut tidak mempunyai daya antimikroba (Waluyo, 2005).
Kesimpulan
Daftar Pustaka
11
Tanggal Nilai
Paraf Asisten
Disinfection, Sterilization, and Preservation diedit oleh Seymour Stanton Block. Philadelphia. 2007. Lippincott William & willkins
EVALUASI DISINFEKTAN TURUNAN ALDEHID DAN TURUNAN HALOGEN DENGAN KOEFISIEN FENOL TERMODIFIKASI, jurusan Farmasi, Fak MIpa UII jogja. 2006 Antiseptic and Dicinfectant : Activity, Action and Resistance. journal microbiology Vol.12 No. 111471179 Donnel, Michael dan Russel, James. Kumpulan Kuliah Farmakologi. Staf Pengajar Farmakologi UNISRI, 2004. Jakarta : EGC Waluyo, Lud. 2005. Mikrobiologi Umum. Malang : Universitas Muhammadiyah Malang Press.
12
Pada penentuan koefisien fenol suatu desinfektan, langkah pertama yang dilakukan adalah pembuatan larutan pengenceran klorin dengan berbagai konsentrasi.. Variasi pengenceran klorin ini untuk memperoleh konsentrasi klorin yang baik yang dapat membunuh kuman. Pengenceran ini sudah melalui penelitian yang dapat membunuh kuman dalam waktu 10 menit tapi tidak membunuh kuman dalam 5 menit. Langkah selanjutnya adalah pembuatan larutan pengenceran desinfektan. Dalam pembuatan larutan pengenceran desinfektan, disiapkan 3 buah tabung reaksi steril yang telah berisi aquadest steril 9,9 ml, 14,4 ml, dan 19,9 ml, kemudian ditambahkan 0,1 ml desinfektan. Kemudian masing-masing pengenceran diambil 1 ml dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke mikrotube steril dan diberi label. Setelah itu, dimasukkan media NB sebanyak 1 ml ke seluruh berisi klorin tadi. Selanjutnya, dilakukan inokulasi E. coli sebanyak 50 µl ke mikrotube dengan keterangan label pengenceran klorin 1:400, 1:450 dan 1:500 untuk interval waktu 5 menit menggunakan mikrotip yang sama. Selanjutnya ditunggu 5 menit dan Tabung yang telah berisi pengenceran desinfektan klorin ditambahkan suspensi bakteri Salmonella sp. sebanyak 0,5 ml pada setiap tabung. Pada saat menambahkan suspensi bakteri, digunakan pipet volume dan harus dalam keadaan aseptis untuk mencegah kontaminasi dari luar sehingga hasil yang didapat menjadi lebih akurat
13
