Microbiología Prescott Capítulo 6

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CAPITULO

6

Crecimiento microbiano

Los filtros de membrana se utilizan en el recuento de microorganismos. Este filtro ha sido utilizado para determina d etermina r el número de unidades formadoras de colonias; aparecen coloreadas gracias al indicador de pH empleado, empl eado, facilitándose su recuento.

índice 6.1 Curva de crecimie nto 119 Fase de latericia (Lag) 119 Fase exponencial 120 Fase estacionaria 121 Fase de muerte 121 Expresión matemática del crecimiento 121 6.2 Determinac ión del crecimien to microbiano 124 Determinación del número de células 124 Determinación de la masa celular 125 6.3 Cultivo continuo de microorganismos 127 Quimiostato 127 Turbidostato 128 6.4 Influencia de los factores ambientales en el crecimiento 128 Solutos y actividad del agua 128

pH 131 131 Temperatura 132 Concentración de oxígeno 135 Presión 137 Radiación 137 6.5 Crecimiento microbiano en ambientes naturales 139 Limitación del crecimiento por factores ambientales 139 Recuento de formas vegetativas viables pero no cultivables de procariotas procariotas 140 Quorum sensing y poblaciones microbianas 141

6.1 Curva de crecimiento

Conceptos 1. El crecimiento de un microorganismo se define como el aumento de sus componentes celulares, que puede tener como resultado un incremento de su (amaño o del número de su población, o de ambos. 2. Cuando los microorganismos crecen en un sistema cerrado, el crecimiento de la población permanece en fase exponencial durante tan sólo unas pocas generaciones, pasando a una fase estacionaria debido a factores como la limitación de nutrientes y la acumulación de residuos. En un sistema abierto, donde se renuevan continuamente los nutrientes y se eliminan los residuos, la fase exponencial puede mantenerse durante períodos largos. 3. Se pueden emplear diversas técnicas para estudiar el crecimiento microbiano, midiendo los cambios observados en el número total de células, la población de microorganismos viables o la masa celular. 4. La disponibilidad de agua, el pH, la temperatura, la concentración de oxígeno, la presión atmosférica, la radiación y muchos otros factores ambientales influyen sobre el crecimiento microbiano. Sin embargo, muchos microorganismos y, en particular, las bacterias, han conseguido adaptarse y desarrollarse en condiciones ambientales extremas que destruirían a la mayoría de los organismos superiores. 5. En el entorno natural, a menudo el crecimiento se ve severamente limitado por los nutr ient es d ispon ible s y otro s muc hos fact ores ambie ntal es. 6. Las bacterias se pueden comunicar entre sí y conducirse de una forma cooperativa mediado por señales dependientes de la densidad de población.

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multinucleado cleado,, en el que las divisiones divisiones cenocítico —esto es, multinu nucleares no se acompañan de divisiones celulares— el crecimiento produce un incremento de tamaño, pero no del número de células. No suele ser conveniente investigar el crecimiento y la multiplicación de microorganismos individuales debido a su pequeño tamaño. En consecuencia, los microbiólogos, cuando estudian el crecimiento, señalan normalmente los cambios observados en el número total de la población. Ciclo celular (pp. 91; 307-308). 307-3 08).

6.1 Curva de crecimiento El crecimiento de una población microbiana se estudia analizando la curva de crecimiento de un cultivo microbiano. Cuando los microorganismos se cultivan en un medio líquido, normalmente se trata de un cultivo discontinuo o en sistema cerrado —esto es, se incuban en un tubo de ensayo cerrado al que no se añade más cantidad de medio que la inicial—; en consecuencia, las concentraciones de nutrientes disminuyen y las de residuos aumentan. Se puede representar el crecimiento de los microorganismos que se multiplican por fisión binaria como el logaritmo del número de células frente al tiempo de incubación. La curva resultante tiene cuatro fases diferentes (Figura 6.1).

Fase de latencia (lag)

E

n el Capítulo 5 se ha hecho hincapié en la necesidad que tienen los microorganismos de disponer de una fuente de energía y de materias primas esenciales para elaborar elaborar los componentes componentes celulares. celulares. Todos Todos los microorganismos necesitan carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo y diversos minerales; muchos precisan tam bién uno o más factores factores de crecimient crecimientoo especiales. especiales. La célula célula capta estas sustancias mediante procesos de transporte a través de membrana, siendo los más importantes: la difusión facilitada, el transporte activo y la translocación de grupo. Las células eucariotas utilizan también la endocitosis. Este capítulo tratará más directamente sobre el crecimiento que tiene lugar en presencia de un aporte adecuado de nutrientes. En primer lugar, se describe la naturaleza del crecimiento y las formas de medirlo, para, posteriormente, tratar las técnicas del cultivo continuo. Finalmente, se discutirá la influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento microbiano.

El crecimiento puede definirse como un incremento incremento en los constituyentes celulares; este crecimiento ocasiona un aumento del número de células en el caso de los microorganismos que se multiplican por procesos como gemación y fisión binaria. En el último caso, células individuales se agrandan y dividen para originar dos células hijas de un tamaño aproximadamente igual. Si el microorganismo es

Cuando se introducen microorganismos en un medio de cultivo fresco, normalmente no se produce un aumento inmediato del número de células o de masa y, por ello, este período se denomina fase de latencia (lag). Aunque la división celular no se produce inmediatamente y no hay un incremento neto de masa, es un proceso activo, la célula está sintetizando nuevos componentes. Una fase de latencia previa Tiempo *-

Figura 6.1 Curva de crecimiento microbiano en un sistema

cerrado. Las cuatro fases están identificadas en esta curva y descritas en el texto.

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Capítulo 6 Crecimiento microbiano

al comienzo de la división celular puede ser necesaria por diversas razones. Las células pueden ser viejas y poseer cantidades reducidas de ATP, cofactores esenciales o de ribosomas; estas sustancias deben sintetizarse antes de que se inicie el crecimiento. El medio puede ser diferente al anterior donde crecían los microorganismos; en este caso, necesitará nuevas enzimas para usar esos otros nuevos nutrientes. Por último, también es posible que los microorganismos se hayan alterado y necesiten un tiempo de recuperación. Cualquiera que sea el motivo, durante la fase de latencia las células se equipan de nuevo, replican su DNA, comienzan a incrementar su masa y por último, se dividen. La duración de la fase de latencia varía considerablemente según el estado de los microorganismos y la naturaleza del medio. Esta fase puede ser bastante larga si el inoculo procede de un cultivo viejo o de uno que haya sido refrigerado. La inoculación de un cultivo en otro químicamente diferente resulta también en una fase de latencia mayor. En este mismo sentido, cuando se transfiere un cultivo en fase de crecimiento exponencial a un medio nuevo de la misma composición, la fase de latencia se acorta o no se produce.

Fase exponencial Durante la fase exponencial o logarítmica (log), los microorganismos crecen y se dividen hasta el nivel máximo posi ble, en función de su potencial genético, el tipo de medio y las condiciones en que crecen. La velocidad de crecimiento es constante durante la fase exponencial; esto es, los microorganismos se duplican en número a intervalos regulares. No existe sincronización, cada célula se divide en un momento ligeramente diferente del resto, por ello, la curva de crecimiento aumenta suavemente, en lugar de realizar saltos discretos (Figura 6.1). Durante esta fase, la población es más uniforme, química y fisiológicamente; por ello, los cultivos en fase exponencial se utilizan normalmente en estudios bioquímicos y fisiológicos. El crecimiento exponencial es un crecimiento equilibrado. Es decir, todos los constituyentes celulares se produ-

cen a una velocidad constante, unos respecto de otros. Si se modifican las concentraciones de nutrientes o las condiciones ambientales, se origina un crecimiento desequilibrado. Se denomina así porque las velocidades de síntesis de los componentes celulares varían entre sí, hasta que se alcanza un nuevo estado de equilibrio. Esta respuesta se observa fácilmente en un experimento en el que se inoculan bacterias desde un medio pobre en nutrientes a otro más rico (shift-up). Las células, en primer lugar, producen nuevos ribosomas para aumentar su capacidad de síntesis de proteínas. Esta fase se continúa con un obvio incremento en la concentración de proteínas y síntesis de DNA. Finalmente, tiene lugar el aumento esperado de la velocidad de multiplicación. Síntesis de proteínas y DNA (secciones 11.3 y 12.2). También se produce un crecimiento desequilibrado cuando se pasa una población bacteriana de un medio rico en nutrientes a otro más pobre (shift-dowrí). En el medio rico de origen, los microorganismos probablemente habrán obtenido directamente del medio muchos de los componentes celulares esenciales. Cuando se cambian a un medio ina propiado nutricionalmente, necesitan tiempo para elaborar las enzimas que se precisan para realizar la biosíntesis de los nutrientes no disponibles. En consecuencia, la división celular y la replicación del DNA continúan después de la transferencia entre medios, pero la síntesis neta de proteínas y RNA es más lenta. Las células disminuyen de tamaño y modifican su metabolismo hasta que sean capaces de crecer de nuevo; se reanuda el crecimiento equilibrado y el cultivo entra en la fase logarítmica. Regulación de la síntesis de los ácidos nucleicos (pp. 296-305). Estos dos tipos de experimentos {shift-up y shift-dowrí) demuestran que el crecimiento microbiano se encuentra bajo un control preciso y coordinado, respondiendo rápidamente a cambios nutricionales y en las condiciones ambientales. Cuando el crecimiento microbiano está limitado por la baja concentración de un nutriente esencial, el crecimiento neto final o rendimiento celular aumenta con la cantidad inicial de dicho nutriente limitante (Figura 6.2a). Éste es el fundamento de los ensayos microbiológicos para cuantificar vitaminas y otros factores de crecimiento. La velocidad de

Figura 6.2 Concentración de nutriente y crecimiento, (a) Efecto de los cambios en la concentración de un nutriente limitante sobre el rendimiento celular. A una concentración suficientemente alta, el rendimiento se estaciona, (b) Efecto sobre la tasa de crecimiento.


crecimiento también aumenta con la concentración de nutrientes (Figura 6.2b), aunque de forma hiperbólica, muy semejante a la observada con muchas enzimas {véase la Figura 8.17). La forma de la curva parece reflejar la tasa de interacción de los nutrientes con las proteínas transportadoras microbianas. Con niveles suficientemente altos de nutrientes, los sistemas transportadores estarán saturados, por lo que la tasa de crecimiento no aumentará a pesar de incrementarse la concentración de nutrientes. Ensayos microbiológicos (p. 103); Sistemas de transporte de nutrientes (pp. 104-109).

Fase estacionaria Finalmente, el crecimiento de la población cesa y la curva de crecimiento se hace horizontal (Figura 6.1). Las bacterias llegan normalmente a la fase estacionaria cuando la concentración es de, aproximadamente, 10 9 células por mL. Otros microorganismos no alcanzan normalmente esta densidad de población; los cultivos de protozoos y algas no suelen sobrepasar concentraciones de 10 6 células por mL. El tamaño final de la población depende, por supuesto, de la disponibilidad de nutrientes y otros factores, así como del tipo de microorganismo que se cultive. En la fase estacionaria, el número total de microorganismos viables permanece constante. Este hecho puede ser el resultado del equilibrio entre la división y la muerte de las células o, simplemente, que la población deje de dividirse, aunque siga metabólicamente activa. Las poblaciones microbianas entran en fase estacionaria por varias razones. Un factor obvio es la limitación de nutrientes; si se reduce drásticamente la concentración de un nutriente esencial, la población crecerá muy lentamente. Los organismos aerobios están limitados a menudo por la disponibilidad de O2. El oxígeno no es muy soluble y puede reducirse tan rápidamente que sólo la superficie del cultivo tenga una concentración de O 2 adecuada para el crecimiento. En este caso, las células situadas por debajo de la superficie no podrán crecer, salvo que el cultivo se agite o airee de otra forma. El crecimiento de una población puede también cesar debido a la acumulación de productos residuales tóxicos. Parece que este factor limita el crecimiento de muchos cultivos anaerobios (cultivos que crecen en ausencia de O 2). Por ejemplo, los estreptococos pueden producir a partir de la fermentación de azúcares altas concentraciones de ácido láctico y otros ácidos orgánicos, que acidificarán su medio, inhibiendo el crecimiento. Finalmente, hay evidencias que indican que el crecimiento puede cesar cuando se alcanza un cierto nivel crítico poblacional. En definitiva, un cultivo está en fase estacionaria como consecuencia de varios factores que actúan conjuntamente. Como acabamos de ver, las bacterias en un cultivo discontinuo pueden entrar en fase estacionaria en respuesta al estrés nutricional, hambre. Probablemente, esto ocurre en la naturaleza ya que numerosos ambientes tienen muy bajos niveles de nutrientes. Sin embargo, el hambre puede ser una

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experiencia positiva para la bacteria. Algunas responden con cambios morfológicos muy significativos, como la formación de endosporas. La mayoría, simplemente disminuyen su tamaño, normalmente acompañado de una reducción del protoplasto y condensación del nucleoide, y se producen cambios significativos a nivel de la expresión génica y fisiológicos. Las bacterias en condiciones de estrés nutricional producen frecuentemente una serie de proteínas del hambre, que las hacen mucho más resistentes al daño por diferentes mecanismos. Incrementan los puentes cruzados del peptidoglicano y, por consiguiente, la fuerza intrínseca de la pared celular. Se producen proteínas que se unen y protegen al DNA (Dps, DNA-binding proteins from ítarved cells). Chaperonas protegen a las proteínas de su desnaturalización, además de recuperar el estado nativo de proteínas dañadas. Como consecuencia de estos y muchos otros mecanismos, las células en condiciones de hambre se vuelven más resistentes a la destrucción por el hambre en sí mismo y a otros factores, como compuestos químicos tóxicos, como el cloro. Estos cambios son tan efectivos que algunas bacterias pueden sobrevivir en estas condiciones de estrés nutricional durante años. Obviamente, estas consideraciones tienen una enorme implicación práctica en medicina y en la industria. Hay evidencias de que Salmonella typhimurium y algunos otros patógenos se vuelven más virulentos cuando pasan hambre.

Fase de muerte Cambios ambientales perjudiciales, como privación de nutrientes y acumulación de residuos tóxicos, originan la disminución del número de células viables, hecho que caracteriza la fase de muerte. La muerte de una población microbiana, al igual que su crecimiento durante la fase exponencial, es normalmente logarítmica (esto es, una cantidad constante de células muere cada hora). Este modelo se mantiene incluso aunque se observe que el número total de células permanece constante, ya que las células no se Usan inmediatamente des pués de morir. A menudo, la única forma de decidir si una bacteria es viable consiste en incubarla en un medio fresco; si no crece ni se multiplica, se considera que está muerta. Es decir, la muerte microbiana se define como la pérdida irreversible de la capacidad de multiplicarse. Aunque la mayor parte de una población microbiana normalmente muere de forma logarítmica, la velocidad de mortalidad puede disminuir después de reducirse drásticamente la población. Esto se debe a la supervivencia prolongada de células particularmente resistentes. Por éstas y otras razones, la curva de la fase de muerte puede ser compleja.

Expresión matemática del crecimiento El conocimiento de la velocidad de crecimiento microbiano durante la fase exponencial es indispensable para los micro-

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biólogos. Los estudios sobre la velocidad de crecimiento contribuyen a la investigación básica en fisiología y ecología, y a la solución de problemas aplicados industriales. En consecuencia, se van a analizar los aspectos cuantitativos del crecimiento de fase exponencial. Durante la fase exponencial, cada microorganismo se divide a intervalos constantes. Por ello, la población duplicará su número durante un período determinado de tiempo, denominado tiempo de generación o de duplicación. Esta situación puede ilustrarse con un ejemplo sencillo. Supongamos que se inocula un tubo de ensayo con una célula que se divide cada 20 minutos (Tabla 6.1). La población será de 2 células después de 20 minutos, de 4 células a los 40 minutos, y así sucesivamente. Como la población se duplica en cada generación, el incremento de la población será exponencial o logarítmico, igual a 2n , donde n es el número de generaciones (Figura 6.3). Estas observaciones pueden expresarse en ecuaciones para determinar el tiempo de generación.

Figura 6.3 Crecimiento microbiano exponencial. En esta figura se han representado gráficamente los datos de la Tabla 6.1 para seis generaciones, en forma lineal (•—•) y logarítmica ( ■=— °). La curva de crecimiento es exponencial, como muestra la linealidad de la gráfica logarítmica.

La velocidad de crecimiento durante la fase exponencial en un cultivo discontinuo puede expresarse por la constante de

Tabla 6.1

Tiempo" 0 20 40 60 80 100 120 a

A partir de las fórmulas anteriores se puede calcular el tiem po que tarda una población en duplicar su número —esto es, el tiempo medio de generación o tiempo medio de duplicación (g) —. Si la población se duplica en un tiempo t (t = g), entonces, tras una generación,

Ejemplo de crecimiento exponencial

Número de divisiones 0 1 2 3 4 5 6

Población 2* 1 2' = 2 22 = 4 23 = 8 2" = 16 25 = 32 26 = 64

2" =

(No* 2")

1 2 4 8 16 32 64

velocidad de crecimiento (k). Equivale al número de generaciones por unidad de tiempo, expresado a menudo como generaciones por hora.

logio N, 0.000 0.301 0.602 0.903 1.204 1.505 1.806

El cultivo hipotético comienza con una célula con un tiempo de generación de 20 minutos.


El tiempo medio de generación es la inversa de la constante de la velocidad media de crecimiento.

Tabla 6.2

Tiempos de generación de algunos microorganismos seleccionados Temperatura

El tiempo medio de generación (g) puede determinarse directamente a partir de una gráfica semilogarítmica con los datos de la multiplicación (Figura 6.4), y la constante de velocidad de crecimiento se calculará a partir del valor g. El tiempo de generación puede también calcularse directamente a partir de las ecuaciones anteriores. Por ejemplo, supongamos que una población bacteriana aumenta de 10 3 a 109 células en 10 horas.

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Microorganismo Bacterias Beneckea natriegens Escherichia coli Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Clostridium botulimim Rhodospirillum rubrum Anabaena cyUndrica Mycobacterium tuberculosis Treponema pallidum

(°C) 37 40

40 37 37 37 25 25 37 37

Tiempo de generación (horas) 0.16 0.35 0.43 0.47 0.58 0.58 4.6-5.3 10.6 «12 33

Algas Scenedeswus auadricauda Chlorella pyrenoidosa Áster ion ella formosa Euglena gracilis Ceratium tripas

25 25 20 25 20

5.9 7.75 9.6 10.9 82.8

24 26 26 30 37

2.2-4.2 10-12 10.4 11-12 18

Protozoos Tetrahymena geleii Leishmania donovani Paramecium caudatum Acanthamoeba castellana Giardia lamblia

Hongos Saccharomyces cerevisiae Monilinia fructicola

30 25

2

30

Los tiempos de generación cambian notablemente según la especie de microorganismo y las condiciones ambientales. Los valores varían desde menos de 10 minutos (0.17 horas) en algunas bacterias, hasta varios días, en algunos microorganismos eucariotas (Tabla 6.2). Los tiempos de generación en la naturaleza suelen ser más largos que en cultivo in vitro.

Figura 6.4 Determinación del tiempo de generación. El tiempo de generación puede determinarse a partir de la curva de crecimiento microbiano. Se representan los datos de la población en un papel cuadriculado semilogarítmico, indicando el número de células en el eje logarítmico. Luego, se lee directamente el tiempo de duplicación de la población a partir de la gráfica. También puede representarse en ejes regulares utilizando el logaritmo del número de células frente al tiempo.

1. Defina crecimiento. Describa las cuatro fases de la curva de crecimiento en un sistema cerrado y razone las causas y características de cada una de ellas. 2. Defina crecimiento equilibrado, crecimiento desequilibrado, experimento shift-up y experimento shift-down. 3. ¿Cómo afecta el incremento en un nutriente limitante sobre el rendimiento celular y la tasa de crecimiento? 4. ¿Qué son tiempo de generación o duplicación, y constante de velocidad media de crecimiento? ¿Cómo pueden deducirse a partir de datos de crecimiento?

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6.2 Determinación del crecimiento microbiano Existen muchas formas de cuantificar el crecimiento micro biano para determinar la velocidad de crecimiento y el tiempo de generación. Se pueden medir tanto la masa como el número de células de la población, ya que el crecimiento implica un incremento de ambos. A continuación, se analizan brevemente las técnicas más comúnmente empleadas para medir el crecimiento, y se exponen las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas. No siempre una determinada técnica es la mejor, dependerá de cada situación experimental.

Determinación del número de células La forma más obvia de determinar el número de células microbianas es por recuento directo. La utilización de una cámara de recuento es fácil, económica y relativamente rápida; ofrece también información acerca del tamaño y la morfología de los microorganismos. Las cámaras de PetroffHausser se pueden emplear para contar procariotas; los hemocitómetros pueden utilizarse para ambos, procariotas y eucariotas. Para facilitar el recuento de microorganismos procariotas en estas cámaras, éstos deben teñirse, o bien, emplear un microscopio de contraste de fases o de fluorescencia. Estos portaobjetos especialmente diseñados tienen cámaras tipo rejilla, excavadas en el fondo de la cámara, con una profundidad conocida (Figura 6.5). Se puede calcular el número de microorganismos en una muestra, a partir del volumen de la cámara y la dilución que se efectuó a la muestra. Esta técnica presenta algunos inconvenientes. Debido al pequeño volumen de las microcámaras excavadas, normalmente 0.001 mL, la concentración de la población microbiana tiene que ser bastante alta para que el resultado sea representativo. Es también difícil distinguir entre células vivas y muertas sin el empleo de técnicas especiales. Los microorganismos de mayor tamaño, como protozoos, algas y levaduras no filamentosas, pueden contarse directamente con contadores electrónicos, como el Contador Coulter. Este método consiste en hacer pasar una suspensión microbiana a través de un pequeño orifico. Una corriente eléctrica fluye a través del mismo, y los electrodos situados a ambos lados miden su resistencia eléctrica. Cada vez que una célula microbiana atraviesa el orificio, aumenta la resistencia eléctrica (o disminuye la conductividad) y se cuenta la célula. El Contador Coulter ofrece resultados precisos con células grandes y se utiliza ampliamente en los laboratorios de los hospitales para el recuento de eritrocitos y leucocitos. No es tan eficaz para contar bacterias debido, entre otros problemas, a la interferencia con partículas pequeñas de residuos y con la formación de filamentos. Las cámaras de recuento y los contadores electrónicos permiten contar todas las células, vivas o muertas. Existen también otras técnicas, que son procedimientos específicos

Figura 6.5 Cámara de recuento de Petroff-Hausser. (a) Vista lateral de la cámara, mostrando el cubreobjetos y el espacio entre ambos, ocupado por la suspensión bacteriana en estudio, (b) Vista superior de la cámara. La rejilla se encuentra en el centro del portaobjetos, (c ) Vista aumentada de la rejilla. Se cuentan bacterias en varios cuadrados centrales, normalmente a un aumento de x400 a x500. El número medio de bacterias en estos cuadrados sirve para calcular la concentración de células en la muestra original. Como hay 25 cuadrados en un área de 1 mm 2, el número total de bacterias en 1 mm de la cámara es (n.° de bacterias/cuadrado) x (25 cuadrados). La cámara tiene una profundidad de 0.02 mm y por ello, N.° de bacterias/mm 3 = (n.° de bacterias/cuadrado)(25 cuadrados)(50) El número de bacterias por cnr (mL) es 10 veces este valor. Por ejemplo, supongamos que el recuento medio por cuadrado e s de 28 bacterias: N.° de bacterias/cm 3 = (28 bacterias)(25 cuadrados)(50)(10 3) = 3.5xlO7

para contar células capaces de crecer y multiplicarse. En la mayoría de estos métodos de recuento, se dispersa una muestra diluida de bacterias u otros microorganismos sobre una superficie de agar sólido. Cada microorganismo o agregado de microorganismos desarrolla una colonia individual. El número original de microorganismos viables en la mués-

6.2 Determinación del crecimiento microbiano

tra puede calcularse a partir del número de colonias formadas y la dilución de la muestra. Por ejemplo, si 1.0 mL de una dilución de 1 x 10~ 6 produce 150 colonias, la muestra original contendría alrededor de 1.5 x 10* células por mL. Normalmente, el recuento es más exacto si se utiliza un contador especial de colonias. De esta forma, se pueden emplear las técnicas de siembra por extensión y en profundidad para determinar el número de microorganismos viables en una muestra. Las técnicas de siembra en placa son sencillas, sensibles y se utilizan ampliamente para el recuento de bacterias y otros microorganismos en muestras como alimentos, agua y suelo. Sin embargo, existen varios problemas que pueden producir imprecisiones. Es necesario desagregar previamente las agrupaciones de células ya que, de lo contrario, el número de colonias será inferior al esperado. En cualquier caso, como no es posible estar totalmente seguro de que cada colonia proceda de una célula individual, los resultados suelen expresarse en unidades formadoras de colonias (UFC, colony forming unii), en lugar de expresarlo como número de microorganismos. El número de colonias por placa debe ser entre 30 y 300 para que sea un valor estadísticamente fiable. Igualmente, el recuento no será fiable si el medio con agar empleado no puede mantener el crecimiento de todos los microorganismos viables presentes. El agar caliente que se utiliza en la siembra en profundidad puede dañar o matar células sensibles; por ello, la siembra en placa por extensión ofrece a veces recuentos superiores que con la técnica de siembra en profundidad. Técnicas de siembra en placa por extensión y en profundidad (pp. 112-114). El número de microorganismos se determina también con frecuencia a partir de colonias que crecen sobre filtros especiales de membrana, que tienen poros de un tamaño lo suficientemente pequeño para retener bacterias. En esta técnica, se pasa una muestra a través de un filtro de membrana (Figura 6.6), luego, el filtro se coloca sobre un medio

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con agar y se incuba hasta que cada célula forme una colonia individual. Un recuento de colonias permite obtener el número de microorganismos presentes en la muestra filtrada, y pueden emplearse medios especiales para seleccionar microorganismos específicos (Figura 6.7). Esta técnica es especialmente útil en el análisis de muestras de agua. Análisis de la pureza del agua (pp. 704-707). Los filtros de membrana se utilizan también para contar bacterias directamente. Primero se filtra la muestra a través de un filtro negro de membrana de policarbonato para crear un fondo oscuro que permita observar objetos fluorescentes. Luego, se tifien las bacterias con un colorante fluorescente, como naranja de acridina o DAPI, y se observan al microscopio. Los microorganismos teñidos con naranja de acridina brillan con un color naranja o verde y pueden contarse fácilmente con un microscopio de epifluorescencia {véase la sección 2.2). Normalmente, los recuentos obtenidos por este método son mucho más elevados que con las técnicas de cultivo ya que algunas de las bacterias están muertas. Actualmente se dispone de pruebas comerciales que permiten contar directamente el número de microorganismos vivos y muertos en una muestra, empleando reactivos fluorescentes que marcan diferencialmente las células vivas y las muertas (véase la Figura 2.13d).

Determinación de la masa celular El crecimiento de una población también supone el aumento de la masa total celular, por ello, las técnicas empleadas para medir los cambios de masa pueden utilizarse para medir el crecimiento. El método más directo consiste en determinar el peso seco microbiano. Se recogen las células que crecen en un medio líquido por centrifugación, se lavan, se secan en estufa y se pesan. Esta técnica es especialmente útil para medir el crecimiento de hongos. Sin

Figura 6.6 Sistema de filtración con membrana. Para retener diferentes tipos de microorganismos se utilizan membranas con diferente tamaño de poro. Posteriorme nte, los tiempos de in cubación variará n dependiendo del medio y del tipo de microorganismo.

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Figura 6.7 Colonias sobre filtros de membrana. Muestras filtradas con membrana y cultivadas en diversos medios, (a) Medio estándar de nutrientes para un recuento bacteriano total. Un indicador colorea las colonias de rojo para facilitar el recuento, (b) Medio para coliformes fecales para detectar estos microorganismos que forma n colonia s azules, (c) Agar m-Endo para dete ctar E. coli y otros coliformes que producen colonias con un brillo verde, (d) Agar mosto para cultivar levaduras y mohos.

embargo, lleva mucho tiempo y no es muy sensible. Como las bacterias pesan tan poco puede ser necesario centrifugar varios cientos de mililitros de cultivo para recoger una cantidad suficiente. Existen técnicas más sensibles y rápidas que se basan en la capacidad de las células de dispersar la luz que incide sobre ellas. Como el tamaño de las células microbianas en un cultivo puro es casi constante, el grado de dispersión es directamente proporcional a la biomasa celular presente, e indirectamente relacionado con el número de células. Cuando la concentración de las bacterias alcanza aproximadamente 107 células por mL, el medio aparece ligeramente tur bio. Incrementos posteriores en la concentración producen nuevos incrementos de la turbidez —disminución de la luz transmitida a través del medio—. Se puede medir el grado

de dispersión de la luz con un espectrofotómetro, y, en niveles de absorbancia pequeños, está casi linealmente relacionada con la concentración bacteriana (Figura 6.8). Por tanto, el crecimiento de una población puede medirse fácilmente espectrofotométricamente, siempre que la población sea lo suficientemente grande para que pueda medirse la tur bidez. Si la cantidad de una sustancia determinada es constante en cada célula, la cantidad total de dicho constituyente celular estará directamente relacionada con la masa celular total microbiana. Así, por ejemplo, se puede analizar la cantidad total de proteínas o nitrógeno de una muestra de células lavadas recogidas a partir de un volumen conocido de medio. Un aumento en la población microbiana se reflejará en un incremento en el nivel total de proteínas. De forma

Figura 6.8 Determinación de la turbidez y masa microbiana. Determinación de la masa microbiana por la medida de la absorción de luz. Al aumentar la población y la turbidez, se dispersa más cantidad de luz y aumenta la absorbancia leída en el espectrofotómetro. El contador de este aparato tiene dos escalas. La escala inferior muestra la absorbancia, y la superior indica la transmitancia en porcentaje. La absorbancia aumenta al disminuir la transmitancia.

6.3 Cultivo continuo de microorganismos

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similar, se puede utilizar el análisis de clorofila para medir poblaciones de algas, y la cantidad de ATP, para estimar la cantidad de masa microbiana viva. 1. Describa brevemente cada técnica de determinación del número de células en una población microbiana, exponien do sus ventajas e inconvenientes. 2. ¿Por qué los resultados de recuento en placa se deben expresar como unidades formadoras de colonias?

6.3 Cultivo continuo de microorganismos Hasta ahora se han tratado los sistemas cerrados, denominados cultivos discontinuos, en los que no se renuevan los aportes de nutrientes ni se eliminan los residuos. El crecimiento exponencial dura solamente unas pocas generaciones y el cultivo alcanza pronto la fase estacionaria. Sin embargo, es posible cultivar microorganismos en un sistema abierto, en el que se mantengan constantes las condiciones ambientales gracias a un suministro continuo de nutrientes y la retirada de los residuos. Estas condiciones se cumplen en un laboratorio mediante los sistemas de cultivo continuo. En este tipo de cultivo, se puede mantener una población microbiana en fase de crecimiento exponencial y a una concentración constante de biomasa durante un período largo de tiempo.

Quimiostato Se utilizan dos clases principales de sistemas de cultivo continuo: 1) quimiostatos, y 2) turbidostatos. Un quimiostato se construye de forma que se alimenta un recipiente de cultivo con un medio estéril a la misma velocidad con que los microorganismos consumen los nutrientes que contiene (Figura 6.9). El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial (p. ej., un aminoácido) en cantidades limitantes. Debido a la presencia de este nutriente limitante, tanto el crecimiento como la densidad final celular dependen de las concentraciones del mismo; es decir, la velocidad de crecimiento podrá variarse dependiendo de la velocidad con la que se incorpore nuevo medio en el reci piente. La velocidad de recambio del nutriente se expresa como velocidad de dilución (D), que equivale a la tasa con la que el medio fluye al recipiente de cultivo en relación al volumen de este recipiente, en donde / es la tasa de flujo (mL/h), y V es el volumen del recipiente (mL). D=flV

Por ejemplo, si /es 30 mL/h y V, 100 mL, la velocidad de dilución será de 0.30 h" 1.

Colector

Figura 6.9 Sistema de cultivo continuo: el quimiostato. Diagrama esquemático del sistema. El medio fresco contiene una cantidad limitante de un nutriente esencial. La tasa de crecimiento está determinada por la velocidad de flujo del medio ai frasco de cultivo.

La concentración celular microbiana y el tiempo de generación están relacionados con la velocidad de dilución (Figura 6.10). La densidad de la población microbiana permanece inalterada a lo largo de un amplio rango de velocidades de dilución. El tiempo de generación disminuye (esto es, la velocidad de crecimiento aumenta), al aumentar la velocidad de dilución. El nutriente limitante quedará casi completamente agotado en estas condiciones de equilibrio. Si la velocidad de dilución aumenta con demasiada rapidez, los microorganismos pueden realmente desaparecer del reci piente de cultivo antes de que se multipliquen, porque la velocidad de dilución es superior a la velocidad máxima de crecimiento. La concentración de nutriente limitante aumenta a velocidades de dilución elevadas porque hay pocos microorganismos presentes para utilizarlo. A velocidad de dilución muy baja, un aumento de D causa un incremento tanto de la densidad celular como de la velocidad de crecimiento. Esto se debe al efecto de la concentración del nutriente sobre la velocidad de crecimiento, a veces denominada relación de Monod (Figura 6.2b). A velocidades de dilución bajas, sólo hay disponible una cantidad limitada de nutriente. La velocidad de crecimiento aumenta cuando la energía total disponible supera la energía de mantenimiento. Gran parte de la energía disponible debe utilizarse para el mantenimiento celular, no para el

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1. ¿En qué se diferencia un sistema abierto de uno cerrado o discontinuo? 2. Describa el funcionamiento de los dos sistemas de cultivo continuo, el quimiostato y el turbidostato. 3. ¿Qué es la velocidad de dilución? ¿Qué es la energía de mantenimiento?

6.4 Influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento

Figura 6.10 Velocidad de dilución y crecimiento microbiano en un quimiostato. Efectos del cambio en la velocidad de dilución en un quimiostato.

crecimiento ni la multiplicación. A medida que aumenta la velocidad de dilución, aumentan la cantidad de nutrientes y la densidad celular resultante, porque la energía está dis ponible, tanto para el mantenimiento como para el crecimiento.

Turbidostato El segundo procedimiento para conseguir cultivos continuos se basa en el empleo de un turbidostato, que tiene una fotocélula para medir la absorbancia o turbidez de un cultivo en el recipiente de cultivo. La velocidad de flujo del medio al recipiente se regula automáticamente para mantener una tur bidez o densidad celular predeterminada. El turbidostato se diferencia del quimiostato por varias características. La velocidad de dilución en un turbidostato es variable, en lugar de permanecer constante, y el medio de cultivo carece de un factor limitante. Un turbidostato funciona mejor a velocidades de dilución altas; un quimiostato es más estable y eficaz a velocidades de dilución bajas. Los sistemas de cultivo continuo son muy útiles porque ofrecen un aporte constante de células en fase exponencial, que crecen a una velocidad conocida. Estos sistemas permiten el estudio del crecimiento microbiano en niveles muy bajos de nutrientes, concentraciones próximas a las existentes en los medios naturales. Estos sistemas son esenciales para la investigación en muchas áreas —p. ej., en estudios sobre reacciones entre especies microbianas en condiciones ambientales similares a las de un lago o charca de agua dulce—. Los sistemas continuos también se utilizan en microbiología de los alimentos e industrial.

Como se ha visto anteriormente (pp. 120-121), los microorganismos deben ser capaces de responder a variaciones en los niveles de nutrientes y, particularmente, a la limitación en nutrientes. El crecimiento de los microorganismos está influido notablemente por la naturaleza química y física de su ambiente. El conocimiento de estas influencias ambientales permitirá controlar el crecimiento microbiano y estudiar la distribución ecológica de los microorganismos. La habilidad de algunos microorganismos para adaptarse a ambientes extremos e inhóspitos es realmente extraordinaria. Los procariotas son virtualmente ubícuotas, se encuentran en cualquier lugar. Muchos habitat donde las bacterias pueden prosperar destruirían a la mayoría del resto de microorganismos. Bacterias como Bacillus infernus pueden incluso multiplicarse a más de 2.5 km bajo la superficie terrestre, sin oxígeno y a temperaturas próximas a los 60 °C. Los microorganismos que crecen en condiciones tan extremas se suelen denominar extremófilos. En esta sección revisaremos brevemente cómo afectan al crecimiento microbiano algunos de los más importantes factores ambientales. Un mayor énfasis se pondrá en el efecto de los solutos y la actividad del agua, pH, temperatura, nivel de oxígeno, presión y radiación. La Tabla 6.3 resume cómo pueden catalogarse los microorganismos según su res puesta a estos factores.

Solutos y actividad del agua Una membrana plasmática selectivamente permeable separa el contenido citoplasmático del microorganismo de su ambiente, por ello, alteraciones en la concentración osmótica del medio extracelular podrán afectar incluso a la viabilidad de los mismos. Si se coloca un microorganismo en una solución hipotónica (con una concentración osmótica inferior), entrará agua en la célula causando su estallido, salvo que la propia célula desarrolle alguna estrategia para evitar su entrada. Por ejemplo, la concentración osmótica del cito plasma puede reducirse gracias a los cuerpos de inclusión (véanse las pp. 52-55). Los procariotas también pueden contener canales sensibles a la presión osmótica, que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno se vuelve más baja que la del citoplasma.


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Respuestas microbianas a factores ambientales Factor y término descriptor Solutos y actividad del agua Osmotolerunte Halófilo pH Acidófilo Neutrófilo Alcalófilo

Temperatura Psicrófilo Psicrotrofo Mesófilo Termófilo Hipertermófilo

Concentración de oxígeno Aerobio obligado Anaerobio facultativo Anaerobio aerotolerante Anaerobio obligado Microaerófilo

Presión Barófilo

Definición

Microorganismos representativos

Capaz de crecer en un amplkio rango de actividad del agua o presión osmótica Requiere altas concentraciones de cloruro sódico para crecer, normalmente por encima de 0.2 M

Staphylococcus aureus, Saccharomyces rouxii Halobacterhtm, Dunaliella, Ectothiorhodospira

Sulfolobus, Picrophilus, Ferroplasma, Acontium, Cyanidium caldarium Escherichia, Euglena, Paramecium Badilas alcalophilus. N a I ronobacíeri um

Óptimo de crecimiento entre pH 0 y 5.5 Óptimo de crecimiento entre pH 5.5 y 8.0 Óptimo de crecimiento entre pH 8.5 y 1 1.5 Crece bien a 0 °C y tiene una temperatura óptima de 15 °C o inferior Puede crecer a 0-7 °C; óptima entre 20 y 30 °C; máxima alrededor de 35 °C Temperartura óptima alrededor de 20-45 °C Puede crecer a 55 °C o superior; la óptima a menudo entre 55 y 65 °C Temperatura óptima entre 80 y 113 °C

Badilas psychrophilus, Chla mydomonas nivalis

Completamente dependiente del O 2 atmosférico para crecer No requiere O2 para crecer, pero crece mejor en su presencia Crece igualmente bien en presencia como en ausencia de O2 No tolera el O2 y muere en su presencia Requiere niveles de O2 por debajo de 2-10 % para crecer, y es dañado por el O 2 atmosférico (20 %)

Micrococcus luteus, Pseudomon as, Mycobacterium; la mayoría de las algas, hongos y protozoos Escherichia, Enlerococcus, Saccharomyces cerevisiae

Crece más rápido a altas presiones hidrostáticas

Photobacterium pmfundum, Shewanella benlhica, Methanococais jan naschü

La mayoría de las bacterias, algas y hongos poseen una pared celular rígida que mantiene la forma e integridad celular, pero cuando se colocan microorganismos con pared celular rígida en ambientes hipertónicos, disminuye el nivel de agua celular, la célula se contrae, y la membrana plasmática se separa de la pared celular. Este proceso se denomina plasmolisis. Esta situación deshidrata la célula y puede dañar la membrana plasmática; normalmente, la célula no muere, aunque es inactiva metabólicamente y deja de crecer. Muchos microorganismos conservan la concentración osmótica de su protoplasma por encima del correspondiente a su habitat utilizando solutos compatibles, de manera que aunque estén en medios teóricamente hipotónicos, no entra agua a la célula. Estos solutos son compatibles con el metabolismo y el crecimiento aun cuando se encuentren en concentraciones intracelulares elevadas. Así, por ejemplo, la mayoría de las bacterias eleva su concentración osmótica interna mediante la síntesis o captación de colina, betaína, prolina, ácido glutámico y otros aminoácidos; también participan, en cierto grado, cantidades elevadas de ion

Listeria monocytogenes, P seudomonas fluorescens Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis Badilas stearothethermophilus, Thermus aquaticus, Cyanidium caldarium, Chaetomium thermophile Sulfoliibiis, Pyrococcus, Pyrodictium

Strcptococcus pyogenes Clostridium, Bacteroides, Methanobacterium, Trepomonas agilis Campylobacler, Spirillum volutans, Treponema pallidum

potasio. Con el mismo objetivo, algas y hongos utilizan sacarosa y polioles —p. ej., arabitol, glicerol y manitol—. Los polioles y aminoácidos son solutos ideales para esta función porque normalmente no alteran la estructura y función de las enzimas. Algunas bacterias como Halobacterium salinarium elevan su concentración osmótica con iones potasio (también aumentan los iones sodio, pero no tanto). De hecho, las enzimas de Halobacterium son tan peculiares que requieren concentraciones de sal elevadas para poder desarrollar una actividad normal {véase la sección 20.3). Como los protozoos no tienen pared celular, deben utilizar vacuolas contráctiles (véase la Figura 27.3) para eliminar el exceso de agua cuando habitan en entornos hipotónicos. Osmosis y función protectora de la pared celular (p. 64). La cantidad de agua disponible para el microorganismo se puede reducir debido a las interacciones de la misma con moléculas de soluto (efecto osmótico) o por adsorción a las superficies de sólidos (efecto matricial). Como la concentración osmótica de un habitat tiene efectos tan marcados sobre

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los microorganismos, es de gran utilidad poder expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Para ello, los microbiólogos emplean la actividad del agua (aw). La actividad del agua de una solución es 1/100 de su humedad relativa (cuando se expresa en porcentaje). Equivale también a la relación entre la presión de vapor de la solución (Pso,) y la del agua pura (P agua).

La actividad del agua de una solución o un sólido puede establecerse aislándolos en una cámara y midiendo la humedad relativa después de que el sistema haya alcanzado el equilibrio. Supongamos que, después de tratar la muestra de este modo, el aire esté saturado al 95 % —es decir, contiene el 95 % de la humedad que tendría cuando se equili brase a la misma temperatura con una muestra de agua pura—. La humedad relativa sería del 95 %, por tanto, la actividad del agua de la muestra es 0.95. La actividad del agua está inversamente relacionada con la presión osmótica; si una solución tiene una presión osmótica elevada, su aw es baja. Los microorganismos difieren enormemente en cuanto a su capacidad para adaptarse a habitat con una actividad de agua baja (Tabla 6.4). Microorganismos osmotolerantes son aquellos que pueden crecer en un rango amplio de actividad del agua o concentración osmótica. Estos microorganismos tienen que realizar un esfuerzo adicional para crecer en habitat con un valor bajo de a w, porque deben mantener

una concentración interna de solutos elevada para poder retener agua. Por ejemplo, Staphylococcus aureus, muy bien adapatada para multiplicarse sobre la piel, puede cultivarse en medios conteniendo concentraciones de cloruro sódico de hasta casi 3 M. La levadura Saccharomyces rouxii crece en soluciones de azúcares con valores de a w tan bajos como 0.6. El alga Dunaliella viridis tolera incluso hasta concentraciones saturadas de cloruro sódico de 1.7 M. Sin embargo, muy pocos microorganismos son verdaderamente osmotolerantes, la mayoría crece solamente en medios con una actividad de agua de aproximadamente 0.98 (valor aproximado de a w para el agua de mar), o superior. Ésta es la razón por la que la deshidratación de los alimentos o la incorporación a los mismos de una gran cantidad de sal y/o azúcar son métodos muy eficaces para evitar su putrefacción. Como muestra la Tabla 6.4, muchos hongos son osmotolerantes y, por ello, especialmente importantes en el deterioro de alimentos salados o deshidratados. Deterioro de los alimentos (pp. 1047-1050). Los halófilos se han adaptado tan bien a condiciones hipertónicas que necesitan niveles elevados de cloruro sódico para crecer. Las bacterias halófilas extremas requieren concentraciones de entre 2.8 y 6.2 M (saturación). La archaeon Halobacterium puede aislarse en el Mar Muerto (lago salado situado entre Israel y Jordania, el más bajo del mundo), el Gran Lago salado de Utah (EE.UU.) y en otros habitat acuáticos con concentraciones de sal próximas a la saturación. Los miembros de Halobacterium y otras bacterias halófilas extremas han modificado sustancialmente la estructura de sus proteínas y membranas, en lugar de

Tabla 6.4 Límites inferiores aproximados de aw para el crecimiento microbiano Actividad del agua 1.00-agua pura

Ambiente

Bacterias

Hongos

Algas

0.95

Sangre 1 Verduras, Plantas marchitas [carne, fruta Agua de mar Pan

La mayoría de los bacilos Gram positivos

Basidiomycetes

0.90

Jamón

La mayoría de los cocos, Bacillus

0.85

Salami

Staphylococcus

0.80 0.75

Conservas Lagos salados Pescado salado

Halobacterium Actinospora

Fusarium, Mucor Rhizopus Levaduras de ascomicetos Saccharomyces rouxii (en sal) Penicillium Aspergñlus Dunaliella

0.70 0.60

Cereales, dulces, frutos secos Chocolate Miel Leche deshidratada

La mayoría de las Gram negativas no halófilas La mayoría de las algas

Aspergillus Saccharomyces rouxii (en azúcares) Xeromyces bisporus

0.55-alteración del DNA Adaptado a partir de A. D. Brown, «Microbial Water Stress» en Bacteriological Reviews, 40(4):803-846, 1976. Derechos reservados © por la Sociedad Americana de Microbiología. Reimpreso con autorización.


aumentar simplemente las concentraciones intracelulares de solutos, sistema utilizado por la mayoría de los microorganismos osmotolerantes. Estos halófilos extremos acumulan grandes cantidades de potasio para mantener hipertónico el ambiente intracelular; la concentración interna de potasio puede llegar a un valor de 4 a 7 M. Las enzimas, los ribosomas y las proteínas transportadoras precisan niveles elevados de potasio para ser estables y activas. Además, la mem brana plasmática y la pared celular de Halobacterium se estabilizan por concentraciones elevadas de ion sodio. Si la concentración de sodio disminuye demasiado, la pared y la membrana plasmática se desintegran. Las bacterias halófilas extremas se han adaptado con éxito a condiciones ambientales que destruirían a la mayoría de los organismos. Durante el proceso, se han especializado tanto que han perdido la flexibilidad ecológica y pueden desarrollarse solamente en unos muy restringidos habitat extremos. Halobacterias (sección 20.3). 1. ¿Cómo se adaptan los microorganismos a ambientes hipotónicos e hipertónicos? ¿Qué es la plasmólisis? 2. Defina actividad del agua y describa brevemente cómo puede determinarse. 3. ¿Por qué es difícil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de a w? 4. ¿Qué son microorganismos halófilos, y por qué los miembros de Halobacterium precisan iones de sodio y potasio.

PH El pH es una medida de la actividad de los iones de hidrógeno de una solución, que se define como el valor negativo del logaritmo de la concentración de iones de hidrógeno (expresada en moles).

La escala de pH se extiende de 0.0 (1.0 M H +) a 14.0 (1.0 x 10~14 M H+), representando cada unidad de pH un cambio de 10 veces en la concentración de iones de hidrógeno. La Figura 6.11 muestra cómo los habitat en que crecen los microorganismos varían ampliamente —desde valores de pH entre 1 y 2, en el extremo ácido, hasta pH entre 9 y 10, en algunos lagos y suelos alcalinos. No resulta sorprendente que el pH afecte intensamente al crecimiento microbiano. Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH óptimo. Los acidófilos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5; los neutrófilos, entre 5.5 y 8.0; y los alcalófilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5. Los alcalófilos extremos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento de 10 o más. En general, cada grupo microbiano posee preferen-

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cias de pH características. La mayoría de las bacterias y protozoos son neutrófilos. La mayor parte de los hongos prefieren medios ligeramente ácidos, con valores de pH de 4 a 6; las algas prefieren también una ligera acidez. Existen numerosas excepciones a esta norma. Por ejemplo, el alga Cyanidium caldarium y el archaeon Sulfolobus acidocaldarius habitan comúnmente aguas termales acidas; ambos crecen bien a pH de 1 a 3 y a temperaturas elevadas. Las archaea Ferroplasma acidavmanus y Picrophilus oshimae pueden multiplicarse a pH 0, o muy próximos a este nivel. Aunque los microorganismos crecen a menudo en medios con un amplio rango de pH, su tolerancia tiene un límite. Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos alterando la membrana plasmática o inhi biendo la actividad de las enzimas y las proteínas transportadoras. En general, los procariotas mueren si el pH interno desciende por debajo de 5.0 a 5.5. Los cambios en el pH externo pueden modificar también la ionización de las moléculas de nutrientes, disminuyendo, por ello, su disponibilidad para el organismo. Se han propuesto diversos mecanismos para el mantenimiento del pH neutro en el citoplasma. La membrana plasmática puede ser relativamente permeable a los protones. Parece ser que los neutrófilos intercambian protones por potasio mediante un sistema de transporte antiporte (p. 107). Acidófilos extremos mantienen su pH interno próximo a la neutralidad, intercambiando protones externos por iones de sodio internos. También los búferes internos pueden contri buir a la homeostasis del pH. Los microorganismos tienen que adaptase a menudo a cambios ambientales de pH para sobrevivir. En las bacterias, los sistemas antiporte potasio/protón y sodio/protón corrigen probablemente pequeñas variaciones de pH. Si el pH se vuelve demasiado ácido, se ponen en marcha otros mecanismos. Cuando el pH baja hasta valores de 5.5 a 6.0, Salmonella typhimurium y E. coli sintetizan un grupo de nuevas proteínas, como parte de la denominada respuesta de tolerancia a un medio ácido. La ATPasa translocadora de protones contribuye a esta respuesta protectora, produciendo más ATP o bombeando protones fuera de la célula. Si el pH externo disminuye a valores de 4.5 o inferiores, se sintetizan chaperonas como las proteínas de choque ácido o de choque térmico {véanse las pp. 293-294). Probablemente, estas sustancias eviten la desnaturalización de las proteínas y faciliten de nuevo el plegamiento de las desnaturalizadas. Los microorganismos cambian con frecuencia el pH de su propio habitat, al producir productos residuales metabólicos ácidos o básicos. Los microorganismos fermentadores producen ácidos orgánicos a partir de hidratos de carbono, mientras que los quimiolitotrofos como Thiobacillus oxidan compuestos reducidos de azufre a ácido sulfúrico. Otros alcalinizan su ambiente produciendo amonio mediante la degradación de los aminoácidos. Fermentaciones microbianas (pp. 192-194); Bacterias oxidantes del azufre (pp. 537-539). En los medios de cultivo suelen añadirse búferes para evitar la inhibición del crecimiento por cambios grandes de

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Ejemplos de ambientes

Ejemplos microbianos

Ácido nítrico concentrado

Ferroplasma Picrophilus oshimae Dunaliella acidophila

Contenido gástrico, aguas termales acidas Zumo de limón Drenaje ácido de minas Vinagre, gingerale Pina

Cyanidium caldarium Thiobacillus thiooxidans Sulfolobus acidocaldarius

Tomate, zumo de naranja Suelo muy ácido Physarum polycephalum Acanthamoeba castellana

Queso, repollo Pan Carne de vacuno, pollo Agua de lluvia Leche Saliva Agua pura Sangre

Lactobacillus acidophilus E. cotí, Pseudomonas aeruginosa Euglena gracilis, Paramecium bursaria Staphylococcus aureus Nltrosomonas spp.

Agua de mar Suelo muy alcalino Lagos alcalinos

Mycrocystis aeruginosa Bacillus alcalophilus

Jabón Amoníaco de uso doméstico

Solución saturada de hldróxido calcico Lejía Desatascador Mayor alcalinidad

Figura 6.11 Escala de pH. Escala de pH y algunos ejemplos de sustancias con diferentes valores de pH. Se muestran ejemplos de microorganismos a los pH óptimos indicados.

pH. El fosfato es el búfer más común y un buen ejemplo de amortiguación mediante un ácido débil (H2PO4~) y su base conjugada (HPO42~). —> H PO " 2

H+ + HPO42 OH-

4

HPO42 + HOH

+H2PO4"

Si se añaden protones a la mezcla, se combinan con la sal formada para producir un ácido débil. Se previene un aumento de alcalinidad porque el ácido débil neutraliza los iones hidroxilos, al donar protones para formar agua. Los péptidos y los aminoácidos en medios complejos producen también un fuerte efecto de amortiguación.

Temperatura La temperatura ambiental afecta intensamente a los microorganismos, así como al resto de organismos. De hecho, los

microorganismos son especialmente susceptibles porque son generalmente unicelulares y su temperatura varía con la ambiental. Por estas razones, la temperatura de la célula microbiana refleja directamente la de su ambiente. Las reacciones catalíticas son las más vulnerables, ya que, el factor que más influye sobre el efecto de la temperatura en el crecimiento es la termosensibilidad de las enzimas. En condiciones por debajo de la temperatura óptima, un aumento en la temperatura eleva la velocidad de crecimiento, porque la velocidad de una reacción catalizada por enzimas, como la de cualquier reacción química, casi se duplica por cada aumento de temperatura de 10°C. Como la velocidad de cada reacción aumenta, el metabolismo en general es más activo a temperaturas altas y el microorganismo crece más rápidamente. A partir de cierto punto (temperatura óptima), un mayor aumento disminuye la velocidad de crecimiento, y temperaturas más altas llegarán a ser letales. Las altas tem peraturas ocasionan daños a los microorganismos al desnaturalizar las enzimas, las proteínas transportadoras, y otras


Temperatura

Figura 6.12 Temperatura y crecimiento. Efecto de la temperatura en la velocidad de crecimiento.

proteínas. El calor también deteriora las membranas micro bianas; la doble capa lipídica puede fundirse y desintegrarse. Por ello, a pesar de que las enzimas funcionales actúan más rápidamente a temperaturas elevadas, el microorganismo puede alterarse hasta el punto de inhibirse su crecimiento, porque el daño no puede repararse. A muy bajas temperaturas, las membranas gelifican y las enzimas no operan a gran velocidad. En definitiva, cuando los organismos están por encima de la temperatura óptima, tanto la estructura como la función celular están afectadas. Si las temperaturas son muy bajas, la función se ve afectada pero no necesariamente su

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estructura ni la composición química. Dependencia de la actividad enzimática respecto de la temperatura (pp. 174-175). Debido a estos efectos opuestos de la temperatura, el crecimiento microbiano tiene una dependencia bastante característica de la temperatura, existiendo temperaturas cardinales distintivas —temperaturas mínima, óptima y máxima de crecimiento— (Figura 6.12). Aunque la forma de la curva de dependencia de la temperatura puede variar, la óptima está siempre más próxima a la máxima que a la mínima. Las temperaturas cardinales de una especie en particular no son invariables, sino que dependen de otros factores ambientales, como el pH y los nutrientes disponibles. Por ejemplo, Crithidia fasciculata, protozoo flagelado que habita en el intestino de los mosquitos, crecerá en un medio simple entre 22 y 27 °C. Sin embargo, no puede cultivarse a temperaturas de entre 33 y 34 °C, sin añadir metales, aminoácidos, vitaminas y lípidos. Las temperaturas cardinales varían ampliamente entre microorganismos (Tabla 6.5). Las óptimas se encuentran normalmente en un rango de 0 °C hasta un valor tan alto como 75 °C, mientras que el crecimiento microbiano se produce en un rango de -20 °C hasta más de 100 °C. El princi pal factor que determina este rango de crecimiento parece ser el agua, ya que, incluso a las temperaturas más extremas, los microorganismos necesitan agua líquida para crecer. La temperatura de crecimiento de un microorganismo determinado abarca normalmente un margen de 30°. Algunas especies (p. ej., Neisseria gonorrhoeae) tienen un rango pequeño; otras, como Enterococcus faecalis, crecen en un amplio

Vida por encima de 100 °C

H

asta hace poco, la temperatura más alta publicada de crecimiento bacteriano era de 105 °C. De hecho, se creía que el límite superior de temperatura para la vida se encontraba en aproximadamente 100 °C, punto de ebullición del agua. En la actualidad, se han descrito bacterias que crecen en chimeneas sulfurosas o «black smokers», situadas a lo largo de grietas y estrías del suelo oceánico, que expulsan agua bentónica rica en sulfuro, con. temperaturas muy altas, por encima de 350 °C (véase la figura del recuadro). Se ha demostrado que estas bacterias pueden crecer y multiplicarse a 113 °C. Es posi ble que las bacterias puedan crecer a temperaturas superiores. La presión existente en este habitat es suficiente para mantener al agua en estado líquido (a 265 atm, el agua de mar no hierve hasta los 460 °C). Las consecuencias de este descubrimiento son numerosas. Las proteínas, las membranas y los ácidos nucleicos de estas bacterias son extremadamente termoestables y constituyen un tema idóneo para estudiar los mecanismos de estabilización de las macromoléculas y membranas. En el futuro, puede ser posi ble diseñar enzimas que puedan actuar a temperaturas muy altas. Algunas enzimas termoestables de estas bacterias pueden tener

usos industriales y científicos importantes. Por ejemplo, la Taq polimerasa del termófilo Thermus aquaticus se utiliza con mucha frecuencia en la PCR {véanse las pp. 349-352).

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rango de temperaturas. Los principales grupos microbianos se diferencian entre sí por la temperatura máxima de crecimiento. El límite superior de los protozoos es de aproximadamente 50 °C. Algunas algas y hongos pueden crecer a temperaturas tan elevadas como 55 a 60 °C. Se han aislado procariotas a temperaturas de o próximas a 100 °C, punto de ebullición del agua (véase la Figura 20.8). Recientemente, se han descubierto cepas que crecen a temperaturas incluso superiores (Recuadro 6.1). Sin duda alguna, los organismos procariotas pueden crecer a temperaturas mucho más altas que los eucariotas. Se ha propuesto que los eucariotas no son capaces de sintetizar membranas para los orgánulos que sean estables y funcionales a temperaturas superiores a 60 °C. El aparato fotosintético también parece ser relativamente inestable, ya que los organismos fotosintéticos no se encuentran en ambientes a muy altas temperaturas. Los microorganismos, como los expuestos en la Tabla 6.5, pueden clasificarse en una de las cinco categorías siguientes, en función de los rangos de temperatura de crecimiento (Figura 6.13).

1. Los psicrófilos crecen bien a 0 °C y tienen una temperatura óptima de 15 °C, o inferior; la máxima es de aproximadamente 20 °C. Se aislan fácilmente en habitat del Ártico y Antartico; como el 90 % del océano tiene una temperatura de 5 °C, o inferior (véase el Capítulo 29), éste constituye un inmenso habitat para los psicrófilos. El alga psicrófila Chlamydomonas nivalis puede realmente colorear en rosa un campo de nieve o un glaciar debido a sus esporas de color rojo brillante. Los psicrófilos están muy distribuidos entre los taxa bacterianos y se encuentran en géneros como Pseudomonas, Vibrio, Alcaligenes, Bacillus, Arthrobactei; Moritella, Photobacterium y Shewanella. El archaeon Methanogenium ha sido recientemente aislado del Lago Ace en la Antártida. Los microorganismos psicrófilos se han adaptado a su ambiente mediante varios mecanismos. Las enzimas, sistemas de transporte y sísntesis de proteínas actúan bien a bajas temperaturas. Las membranas celulares de estos microorganismos tienen niveles elevados de ácidos grasos insaturados que permanecen en estado semifluido a temperaturas frías. De hecho, muchos psicrófilos comienzan a perder componentes celulares a temperaturas más altas de 20 °C porque se altera la membrana celular. 2. Muchas especies pueden crecer a 0 °C, aunque su temperatura óptima sea de 20 a 30 °C, y la máxima de casi 35 °C. Estos microorganismos se denominan _ psicrotrofos o psicrófilos facultativos. Las bacterias y los hongos psicrotrofos son los agentes principales del deterioro de alimentos refrigerados (véase el Capítulo 41). 3. Los microorganismos mesófilos crecen a una temperatura óptima de 20 a 45 °C, siendo la mínima de 15 a 20 °C, y la máxima de casi 45 °C. La mayoría de

Tabla 6.5

Rangos de temperatura para el crecimiento microbiano Temperaturas cardinales (°C)

Microorganismo Bacterias no fotosintéticas Bacillus psychrophilus Micrococcus cryophilus Pseudomonas fluorescens Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Thermoplasma acidophilum Bacillus stearothermophilus Thermus aquaticus Sulfolobus acidocaldarius Pyrococcus abyssi Pyrodictium occultum Pyrolobus fumarii Bacterias fotosintéticas Rhodospirillum rubrum Anabaena variabilis Oscillatoria tennis Synechococcus eximius Algas eucariotas Chlamydomonas nivalis Fraguaría sublinearis Chlorella pyrenoidosa Euglena gracilis Skeletonema costatum Cyanidium caldarium Hongos Candida scottii Saccharomyces cerevisiae Mucor pusillus Protozoos Amoeba proteus Naegleria fowleri Trichomonas vaginalis Paramecium caudatum Tetrahymena pyriformis Cyclidium citrullus

Mínima

Óptima

Máxima

-10 -4 4 6.5 0 10 30 45 30 40 60 67 82 90

23-24 10 25-30 30-37 37 37 35-36 59 60-65 70-72 80 96 105 106

28-30 24 40 46 44 45 38 62 75 79 85 102 110 113

SD' SD SD 70

30-35 35 SD 79

SD SD 45-47 84

-36 -2 SD SD 6 30-34

0 5-6 25-26 23 16-26 45-50

4 8-9 29 SD >28 56

0 1-3 21-23

4-15 28 45-50

15 40 50-58

4-6 20-25 25

22 35 32-39

35 40 42 28-30 33 47

6-7 18

25

20-25 43

■

* SD, sin datos.

los microorganismos pertenecen a esta categoría. Casi todos los agentes patógenos humanos son mesófilos, como es de esperar, pues la temperatura corporal humana es, casi de forma constante, de 37 °C. 4. Algunos microorganismos son termófilos; pueden crecer a temperaturas de 55 °C, o superiores. La temperatura mínima es normalmente de 45 °C, y la óptima es de 55 a 65 °C. La inmensa mayoría son bacterias, aunque algunos hongos y algas son termófilos (Tabla 6.5). Estos organismos crecen rápidamente en muchos habitat, incluyendo compost, pacas de heno, tuberías de agua caliente y aguas termales. Los termófilos se diferencian de


Figura 6.13 Rangos de temperatura para el crecimie nto microbiano. Los microorganismos se pueden clasificar en categorías diferentes según los rangos de temperatura de su crecimiento. En orden de menor a mayor temperatura de crecimiento, se clasifican en: psicrófilos, psicrotrofos, mesófilos, termófilos e hipertennófilos. En esta figura se representan los rangos y las temperaturas óptimas de estos cinco tipos.

los mesófilos por poseer muchas enzimas termoestables y sistemas de proteínas capaces de actuar a temperaturas altas. Los lípidos de su membrana son también más saturados que los de los mesófilos, con un punto de fusión más alto; por ello, las membranas de termófilos permanecen intactas a temperaturas altas. 5. Como se ha mencionado anteriormente, unos pocos termófilos pueden crecer a 90 °C, o más, y algunos tienen una temperatura máxima de 100 °C. Los procariotas con una temperatura óptima de entre 80 °C y casi 113 °C se denominan hipertermófilos. No suelen crecer bien por debajo de 55 °C. Pyrococcus abyssi y Pyrodictium occultum son ejemplos de hipertermófilos marinos aislados en zonas calientes del suelo marino. 1. Defina pH, acidóftlo, neutrófilo y acalófilo. ¿Cómo pueden modificar los microorganismos el pH de su ambiente, y cómo puede minimizar el microbiólogo este efecto? 2. ¿Qué son las temperaturas cardinales? 3. ¿Por qué aumenta la velocidad de crecimiento con la temperatura, para disminuir de nuevo a temperaturas más elevadas? 4. Defina psicrófilo, psicrotrofo, mesófilo, termófilo e hipertermófilo.

Concentración de oxígeno Un organismo que puede crecer en presencia de O 2 atmosférico es aerobio, mientras que otro que puede crecer en su

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ausencia, es anaerobio. La mayoría de los organismos su periores dependen totalmente del O 2 atmosférico para su crecimiento —es decir, son aerobios obligados —. El oxígeno actúa como aceptor final de electrones en la cadena trans portadora de electrones durante la respiración aerobia. Además, los eucariotas aerobios utilizan O2 para sintetizar esteróles y ácidos grasos insaturados. Los anaerobios facultativos no requieren O2 para crecer, pero lo hacen mejor en su presencia, en cuyo caso emplearán la respiración aerobia. Los anaerobios aerotolerantes, como Enterococcus faecalis, pueden crecen bien tanto en su presencia como en su ausencia. Por el contrario, los anaerobios estrictos u obligados (p. ej., Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium pasteurianum, Methanococcus) no toleran en absoluto el O 2 y mueren en su presencia. Los anaerobios aerotolerantes y los estrictos no pueden producir energía mediante respiración y deben utilizar vías de fermentación o respiración anaerobia para este objetivo. Finalmente, existen aerobios, como Campylobacter, denominados microaerófilos, que se alteran con niveles atmosféricos normales de O 2 (20 %), precisando concentraciones inferiores para crecer (2-10 %). La naturaleza de las respuestas bacterianas al O 2 puede estudiarse fácilmente cultivando las bacterias en medios sólidos, o en medios líquidos que contengan agentes reductores para disminuir los niveles de O 2, como en el caldo tioglicolato (Figura 6.14). Transporte de electrones y respiración aerobia (pp. 196-199); Fermentación (pp. 192-194); Respiración anaerobia (pp. 203-204). Un grupo microbiano puede mostrar más de un tipo de relación con el O 2. Entre las bacterias y los protozoos podemos encontrar representantes de los cinco tipos. Los hongos son normalmente aerobios, pero un número de especies —especialmente entre las levaduras— son anaerobias facultativas. Las algas son casi siempre aerobias obligadas. Debe remarcarse que la habilidad para crecer en ambientes tanto aeróbicos como anaeróbicos proporciona una enorme flexi bilidad desde el punto de vista de la adaptación ecológica. Aunque los anaerobios estrictos mueren en presencia de oxígeno, se pueden aislar de habitat aerobios. En realidad, aunque el ambiente sea anaerobio, se encuentran en microambientes anaerobios, gracias a la acción de anaerobios facultativos que utilizan el O 2 disponible. Por ejemplo, el anaerobio estricto Bacteroides gingivalis vive en la boca, creciendo en las grietas de alrededor de los dientes. Estas diferentes relaciones con el O 2 parece que se deben a varios factores, incluyendo la inactivación de las proteínas y el efecto de los productos tóxicos del O 2. Así, algunas enzimas pueden inactivarse cuando se oxidan gru pos sensibles como los sulfhidrilos. Un ejemplo destacado es la enzima nitrogenasa fijadora de nitrógeno (véase la sección 10.4), que es muy sensible al oxígeno. El oxígeno acepta electrones y se reduce fácilmente porque los electrones de sus orbitales externos no están apareados. Las flavoproteínas (véase la sección 8.5), otros constituyentes celulares y la radiación (pp. 138-139) promueven la reducción de oxígeno. El resultado suele ser una

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Figura 6.14 Oxígeno y crecimiento bacteriano. Ilustración del crecimiento de bacterias con diferentes respuestas frente al oxígeno. Cada punto representa una colonia bacteriana individual en el agar o sobre su superficie. La superficie, que está expuesta al oxígeno atmosférico, será aerobia. El contenido en oxígeno del medio disminuye con la profundidad hasta que el medio se hace anaerobio hacia el fondo del tubo. La presencia y ausencia de las enzimas superóxido dismutasa (SOD) y catalasa se indican en cada tipo celular.

combinación de varios productos de reducción: radical superóxido, peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo. O2 + e~ —> Or (radical superóxido) O27 + e" + 2H+ ---------- > H2O2 (peróxido de hidrógeno) H2O2 + e~ + H+ ----- > H 2O + OH- (radical hidroxilo) Estos productos de reducción del oxígeno son extremadamente tóxicos y tienen un gran poder de oxidación, destruyendo rápidamente los constituyentes celulares. Un microorganismo debe ser capaz de autoprotegerse contra estos productos del oxígeno, de lo contrario lo destruirían. Son tan eficaces que los neutrófilos y macrófagos utilizan estos productos tóxicos del oxígeno para destruir agentes patógenos invasores. Destrucción dependiente de oxígeno de agentes patógenos (pp. 774-777). Muchos microorganismos poseen enzimas que ofrecen protección frente a productos tóxicos del O 2. Los aerobios obligados y anaerobios facultativos contienen normalmente las enzimas superóxido dismutasa (SOD) y catalasa, que catalizan la destrucción de los radicales superóxido y peróxido de hidrógeno, respectivamente. La peroxidasa también puede ser utilizada para eliminar el peróxido de hidrógeno.

Los microorganismos aerotolerantes pueden carecer de catalasa, pero casi siempre tienen superóxido dismutasa. Lactobacillus plantarum, aerotolerante, utiliza iones mánganosos, en lugar de superóxido dismutasa, para destruir el radical superóxido. Todos los anaerobios estrictos carecen de ambas enzimas o las poseen en concentraciones muy bajas y, por ello, no pueden tolerar el O2. Como los aerobios necesitan O 2 y los anaerobios son destruidos por éste, hay que aplicar métodos radicalmente

diferentes para cultivar estos dos tipos de microorganismos. Cuando se cultivan volúmenes grandes de microorganismos aerobios, se agita el tubo de cultivo para airear el medio o se bombea aire estér il en el tubo. En caso de microorganismos anaerobios, el problema es el inverso, hay que eliminar todo el O 2. Esto se puede realizar de varias maneras. 1) Se pueden emplear medios especiales anaerobios, conteniendo agentes reductores como tioglicolato o cisteína. Los agentes reductores eliminarán el O2 disuelto presente en el medio, de manera que los anaerobios puedan crecer. 2) Se puede tam bién eliminar el oxígeno retirando el aire con una bomba de vacío y, posteriormente, el O2 residual con nitrógeno gas (Figura 6.15). A menudo, se añaden CO 2 y nitrógeno a la cámara de incubación, pues muchos anaerobios necesitan cantidades pequeñas de CO 2 para crecer mejor. 3) Uno de los sistemas más empleados para cultivar un número reducido de anaerobios es el recipiente de GasPak (Figura 6.16). Con este sistema, el ambiente se hace anaerobio utilizando hidrógeno y un catalizador de paladio, se elimina el O 2 ya que se forma agua. Los agentes reductores eliminan también el oxígeno, como se ha descrito anteriormente. 4) Las bolsas de plástico pueden servir de contenedores idóneos cuando se quieren incubar unas pocas muestras en condiciones anaero bias. Estas bolsas contienen un catalizador y carbonato calcico para producir una atmósfera anaerobia, rica en dióxido de carbono. Se añade una solución especial al compartimiento del reactivo; se colocan placas de Petri en la bolsa, se cierra con una pinza y se introduce en una estufa de incubación. Un laboratorio puede utilizar todas estas técnicas pues cada una de ellas es adecuada para diferentes objetivos.

1. Describa los cinco tipos de relaciones con el O2 que se observan en los microorganismos. 2. ¿Para qué emplean los aerobios el O 2? ¿Por qué es tóxico el O2 para muchos microorganismos; cómo se protegen de éste? 3. Describa cuatro maneras de cultivar microorganismos anaerobios.


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ratura es de 2 a 3 °C. A pesar de estos extremos, las bacterias pueden sobrevivir y adaptarse. Muchas son barotolerantes: un aumento de la presión las afecta negativamente, pero no tanto como lo haría a las bacterias no tolerantes. Algunas bacterias presentes en el intestino de invertebrados del océano profundo, como anfípodos y holoturias son auténticos barófilos —crecen más rápidamente a presiones elevadas—. Estas bacterias intestinales pueden desempeñar un papel importante en el reciclaje de los nutrientes en dicho habitat. Se ha aislado un organismo barófilo en la zanja Mariana cerca de las Islas Filipinas (a una profundidad de casi 10 500 m), que realmente es incapaz de crecer a presiones por debajo de 400 a 500 atm cuando se incuba a 2 °C. Hasta ahora, hay representantes barófilos en diferentes géneros bacterinos (p. ej., Photobacterium, Shewanella, Colwellia). Algunas Archaea son termobarófilos (p. ej., Pyrococcus spp., Methanococcus jannaschií). El medio marino Figura 6.15 Una cámara de trabajo e incubador para anaerobios. Este sistema anaerobio contiene un área de trabajo libre de oxígeno y una estufa de incubación. El compartimiento de intercambio, situado a la derecha del área de trabajo, permite transferir materiales en el interior sin exponerlo al oxígeno exterior. La atmósfera anaerobia se mantiene en gran parte con una bomba de vacío y purgas de nitrógeno. El oxígeno restante se extrae con un catalizador de paladio e hidrógeno. El oxígeno reacciona con hidrógeno para formar agua, que se absorbe con un desecante.

Presión La mayoría de los organismos pasan la mayor parte de su ciclo vital en la tierra o sobre la superficie del agua, siempre sometidos a la presión de 1 atmósfera (atm), sin que ésta los afecte de forma significativa. Sin embargo, el océano profundo (a 1000 o más metros de profundidad) ocupa el 75 % del volumen total del océano. Aquí, la presión hidrostática puede alcanzar de 600 a 1100 atm, mientras que la tempe-

(pp. 694-697).

Radiación Nuestro mundo es bombardeado por diversos tipos de radiación electromagnética (Figura 6.17). Esta radiación a menudo se comporta como si estuviese compuesta de ondas que se desplazan en el espacio como las ondas sobre la superficie del agua. La distancia entre dos picos o valles de una onda se denomina longitud de onda. A medida que disminuye la longitud de onda de la radiación electromagnética, aumenta la energía de la radiación —los rayos gamma y X son mucho más energéticos que la luz visible o las ondas infrarrojas—. La radiación electromagnética actúa también como un flujo de paquetes de energía, denominados fotones, cada uno de los cuales posee un cuanto de energía, cuyo valor dependerá de la longitud de onda de la radiación.

Figura 6.16 Sistema para anaerobios GasPak. Un sobre de GasPak produce hidrógeno y dióxido de carbono. El catalizador de paladio en la tapa de la cámara ca taliza la formación de agua a partir de hidrógeno y oxígeno, eliminando por consiguiente el oxígeno de la jarra sellada.

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pueden causar indirectamente la muerte, mientras que niveles superiores son directamente letales. Aunque los microorganismos son más resistentes a la radiación ionizante que los organismos superiores, pueden ser destruidos con una dosis suficientemente grande. La radiación ionizante puede utilizarse para esterilizar objetos, aunque algunas bacterias (p. ej., Deinococcus radiodurans) y las endosporas bacterianas pueden sobrevivir a dosis elevadas de radiación ionizante. Uso de radiación para destruir microorganismos (p. 154); Deinococcus (p. 505).

Figura 6.17 Espectro electromagnético. La parte visible del espectro se ha ampliado en la parte inferior de la figura.

La luz solar es la principal fuente de radiación de la Tierra. Comprende luz visible, radiación ultravioleta (UV), rayos infrarrojos y ondas de radio. La luz visible es el aspecto más importante y destacado de nuestro ambiente: salvo excepciones, la vida depende de la capacidad de los organismos fotosintéticos para captar la energía solar. Los rayos infrarrojos son la fuente principal de calor de la Tierra. Casi el 60 % de la radiación solar se encuentra en la región infrarroja, el resto se corresponde con la parte visible del espectro. A nivel del mar, hay muy poca radiación ultravioleta inferior a 290 a 300 nm. La radiación UV de longitud de onda más corta que 287 nm es absorbida por el O2 de la atmósfera terrestre; este proceso forma una capa de ozono entre 40 y 48 km por encima de la superficie terrestre. La capa de ozono absorbe rayos ÜV de longitud de onda algo mayor y vuelve a formar O 2. Esta eliminación de la radiación UV es crucial porque es muy perjudicial para los sistemas vivos (véase el Capítulo 11). La distribución bastante uniforme de la luz solar a lo largo del espectro visible es la razón por la que esta luz sea generalmente «blanca». Fotosíntesis microbiana (pp. 209-215). Muchas formas de radiación electromagnética son muy perjudiciales para los microorganismos. Esto es especialmente cierto en el caso de la radiación ionizante, de longitud de onda muy corta (alta energía), que puede provocar que los átomos pierdan electrones, es decir, que se ionicen. Dos formas principales de radiación ionizante son 1) los rayos X, que se producen artificialmente, y 2) los rayos gamma que se emiten durante la desintegración de radioisótopos. Niveles bajos de radiación ionizante producirán mutaciones y

La radiación ionizante puede producir cambios importantes en las células: rompe los enlaces de hidrógeno, oxida los dobles enlaces, destruye las estructuras en anillo y polimeriza algunas moléculas. El oxígeno aumenta estos efectos destructivos probablemente por la generación de radicales hidroxilo (OH-). Aunque pueden afectarse muchos tipos de constituyentes celulares, obviamente la destrucción del DNA es la causa más importante de muerte celular. La radiación ultravioleta (UV), mencionada anteriormente, puede destruir la mayor parte de los microorganismos debido a su longitud de onda corta (aproximadamente, de 10.a 400 nm) y alta energía. La radiación UV más letal tiene una longitud de onda de 260 nm, ya que es la longitud de onda que es más absorbida por el DNA. El principal mecanismo de destrucción por radiación UV es por la formación de dímeros de timina en el DNA (véanse las pp. 266267). Dos moléculas de timina contiguas en una cadena de DNA se unen covalentemente, inhibiéndose la replicación y función del DNA. Este daño puede repararse de diferentes formas. Mediante la fotorreactivación, la enzima fotorreactivadora emplea la luz azul para separar los dímeros de timina. También se puede cortar la secuencia que contenga el dímero de timina y ser sustituida por otra; este proceso se produce en ausencia de luz y se denomina reactivación oscura. Los daños también pueden ser reparados por la proteína recA mediante recombinación y reparación vía el SOS. Cuando la exposición a UV es demasiado fuerte, el daño es tan extenso que no es posible repararlo. Mecanismos de reparación del DNA (pp. 273-275). Aunque llega muy poca radiación UV por debajo de 290 a 300 nm a la superficie terrestre, la radiación cercana al UV, entre 325 y 400 nm, también puede dañar a los microorganismos. Este tipo de radiación menos energética induce la degradación del triptófano para producir fotoproductos tóxicos. Parece ser que estos fotoproductos conjuntamente con la citada radiación cercana al UV causan la rotura de las hebras de DNA. Se desconoce el mecanismo preciso, aunque es diferente al observado con radiación UV de 260 nm. Aunque la luz visible es enormemente beneficiosa, ya que es la fuente de energía de la fotosíntesis, a una intensidad suficiente puede dañar o destruir células microbianas. Para ello, normalmente se precisan O 2y pigmentos denominados fotosensibilizadores. Todos los microorganismos celulares poseen pigmentos como clorofila, bacterioclorofila, citocromos y flavinas, que pueden absorber energía lumínica, excitarse o activarse, y actuar como fotosensibilizadores.

6.5 Crecimiento microbiano en ambientes naturales

El fotosensibilizador excitado (P) transfiere su energía al O 2 generando un oxígeno en estado de singlete ('O2).

El oxígeno en estado de singlete es muy reactivo y un agente con gran poder oxidante, que destruye rápidamente una célula. De hecho, es unos de los agentes, quizás el principal, empleado por las células fagocíticas para destruir las bacterias fagocitadas (véase la sección 31.8). En contraste con los pigmentos fotosensibilizadores, están los pigmentos fotoprotectores. Muchos microorganismos que se transmiten por el aire o viven sobre superficies expuestas usan pigmentos fotoprotectores tipo carotenoide para protegerse frente a la fotooxidación. Los carotenoides inactivan eficazmente el oxígeno en estado de singlete —es decir, absorben energía de éste y lo convierten de nuevo al estado elemental no excitado—. Tanto los microorganismos fotosintéticos como los no fotosintéticos utilizan este tipo de pigmentos. 1. ¿Qué son bacterias barotolerantes y barófílas? ¿Dónde cree que podría encontrarlas? 2. Enumere los tipos de radicación electromagnética en orden decreciente de energía o de aumento de longitud de onda. 3. ¿Por qué es tan importante que la Tierra reciba un adecuado suministro de luz solar? ¿Por qué es tan necesaria la capa de ozono? 4. ¿De qué manera dañan las radiaciones ionizante y ultravioleta y la luz visible a los microorganismos? ¿Cómo se protegen los microorganismos frente al daño ocasionado por la luz UV y visible?

6.5 Crecimiento microbiano en ambientes naturales En la sección precedente se estudiaron los efectos sobre el crecimiento microbiano de determinados factores ambientales tales como la disponibilidad de agua, pH y temperatura. Aunque la ecología microbiana será estudiada en otros capítulos, ahora vamos a considerar brevemente el efecto del entorno ambiental como un todo sobre el crecimiento micro biano. Ecología microbiana (Capítulos 28-30).

Limitación del crecimiento por factores ambientales El medio microbiano es complejo y en continuo cambio. En la naturaleza, los microorganismos normalmente están expuestos a diferentes gradientes solapados de nutrientes, y a

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otros factores ambientales. Esto es particularmente cierto para los microorganismos que forman parte de biofilms. Los microorganismos se multiplicarán en este tipo de «microam bientes» hasta que un factor nutricional o ambiental limite este proceso. La Ley de Liebig del mínimo señala que la biomasa total de un organismo estará determinada por el nutriente que se encuentre en menor concentración en relación con los requerimientos de dicho organismo. Esta ley es aplicable tanto en laboratorios (Figura 6.2) como en ambientes acuáticos o terrestres. Un incremento en un nutriente limitante esencial (p. ej, el fosfato) implicará un incremento en la población microbiana hasta que algún otro nutriente se haga limitante. Si un nutriente específico es limitante, los cambios en otros nutrientes no tendrán efecto. La situación puede llegar a ser incluso más compleja, ya que múltiples factores pueden ser limitantes, influyendo sobre una población en el tiempo. Además, como se indicó anteriormente, factores como la temperatura, pH, luz y salinidad, influyen sobre las poblaciones microbianas y limitan su crecimiento. La Ley de Shelford de la tolerancia señala que hay límites en los factores ambientales por encima y por debajo de los cuales un microorganismo no puede sobrevivir ni crecer, a pesar del suministro disponible de nutrientes. Este es el caso de la temperatura (Figura 6.13). Cada microorganismo tiene una rango específico de temperaturas dentro del cual puede crecer. La misma regla se aplica a otros factores como el pH, nivel de oxígeno, y la presión hidrostática en el medio marino. Es decir, el crecimiento de un microorganismo depende tanto del suministro de nutrientes como de su tolerancia a las condiciones ambientales. Biofilms (pp. 668-670). La mayoría de los microorganismos tienen que afrontar deficiencias que limitan sus actividades, excepto cuando nutrientes en exceso permitan un crecimiento ilimitado. Sin embrago, un crecimiento tan rápido agotará enseguida los nutrientes y posiblemente provocará la emisión de productos residuales tóxicos, que limitarán el crecimiento. Como respuesta a un nivel bajo de nutrientes (medios oligotróficos), muchos microorganismos se vuelven más com petitivos en la captación de nutrientes y en la explotación de los recursos disponibles. A menudo, la morfología del organismo variará para aumentar su área de superficie y la capacidad para absorber nutrientes. Esto puede explicar la transformación de bacterias con formas bacilares en «mini» o «ultramicro» células, o los cambios en la morfología de procariotas con prosteca {véanse las pp. 529-531) (Figura 6.18) como respuesta a la falta de alimento. La deficiencia de nutrientes puede inducir muchos otros cambios, como se discutió anteriormente. Por ejemplo, los microorganismos pueden sufrir una parada secuencial en su metabolismo, excepto para los genes esenciales reguladores del mantenimiento celular. Numerosos factores pueden alterar los niveles de nutrientes en entornos oligotróficos. Los microorganismos pueden también secuestrar nutrientes limitantes críticos, como el hierro, disminuyendo su disponibilidad para los microorga-

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Figura 6.18 Morfología y absorción de nutrientes. Los microorganismos pueden cambiar su morfología en respuesta a la falta de alimento y a diferentes factores limitantes, para mejorar su capacidad de sobrevivir, (a) Caulobacter tiene unos pedúnculos relativamente cortos cuando el nitrógeno es limitante, (b) Los pedúnculos son extremadamente largos en condiciones limitadas de fósforo.

nismos competitivos. La propia atmósfera puede contribuir con nutrientes esenciales y sustentar el crecimiento micro biano. Este hecho se observa en la laboratorio, así como en la naturaleza. Las sustancias orgánicas transportadas por el aire estimulan el crecimiento microbiano en medios diluidos, permitiendo el desarrollo significativo de poblaciones microbianas que sin dicho aporte no lo harían. Incluso el agua destilada, que tan sólo contiene trazas de materia orgánica, puede absorber compuestos de un átomo de carbono de la atmósfera y permitir el crecimiento microbiano. Si no es detectada la presencia de dichos nutrientes en el aire, podría trastocar la interpretación de numerosos experimentos bioquímicos o de biología molecular, así como a los estudios sobre microorganismos en medios oligotróficos. Las sustancias naturales pueden también inhibir el crecimiento microbiano en ambientes con niveles bajos de nutrientes. Estos agentes incluyen los fenoles, taninos, amoníaco, etileno y los compuestos volátiles de azufre. Este puede ser un mecanismo por el que los microorganismos eviten consumir las limitadas reservas energéticas hasta que dispongan de un aporte nutritivo adecuado. Estas sustancias químicas son también importantes en patología vegetal y pueden ayudar a controlar enfermedades microbianas transmitidas a través del suelo.

Recuento de formas vegetativas viables pero no cultivables de procariotas El estudio del crecimiento de poblaciones de procariotas en ambientes naturales requiere la determinación del número de microorganismos viables. Tradicionalmente, se ha definido un microorganismo viable como aquel que es capaz de crecer activamente, teniendo como resultado la formación de una colonia sobre un medio sólido, o de turbidez visible en un medio líquido. John R. Postgate (Universidad de Sussex, Inglaterra) fue uno de los primeros investigadores en observar que los microorganismos estresados por la supervivencia en los habitat naturales —o en muchos medios selectivos de laboratorio— eran especialmente sensibles a otros factores secundarios de estrés. Tales estreses pueden produ-

cir microorganismos viables pero incapaces de crecer en los medios habituales. Para determinar el potencial de crecimiento de estos microorganismos, Postgate desarrolló lo que actualmente se denomina «Ensayo de microviabilidad de Postgate», en el que se cultivan microorganismos sobre una fina película de agar bajo un cubreobjetos. La habilidad de una célula para cambiar su morfología, incluso aunque no se multiplique, sería indicativo de viabilidad, el microorganismos muestra «signos de vida». Desde entonces, numerosos investigadores han desarrollado otros métodos sensibles basados en la microscopía y el mareaje con radioisótopos para evaluar la presencia e importancia de estas bacterias viables pero «no cultivables» tanto en el laboratorio como en la naturaleza. Por ejemplo, se suelen comparar los niveles de células teñidas con anticuerpos fluorescentes o con naranja de acridina, con recuentos de poblaciones obtenidos por el método del número más proba ble (método NMP) (véanse las pp. 704-706) o tras siembra en medios selectivos y no selectivos. Otro método utilizado para controlar los efectos del estrés en los microorganismos se basa en la determinación de la liberación de ciertos materiales celulares (marcados con isótopos radiactivos). A pesar de estas ventajas, todavía tiene interés la estimación de via bilidad por el método de Postgate. Así, se ha podido demostrar que aislamientos de bacterias como Escherichia coli, Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes y Enterococcus faecalis que habían perdido la capacidad para crecer en los medios habituales de laboratorio, aún eran capaces de causar una enfermedad infecciosa. La situación en medios naturales con poblaciones mixtas es mucho más compleja. En este caso, es frecuente encontrar que únicamente entre el 1 y el 10 % de las células observables son capaces de formar colonias. Sin embargo, en el futuro, gracias al desarrollo de nuevos medios o condiciones apropiadas para su crecimiento, el microbiólogo será capaz de cultivar esos microorganismos que quizás nunca se han cultivado o caracterizado. Las técnicas moleculares como la PCR o el análisis de rRNA (de la subunidad pequeña ribosomal) se están utilizando para analizar la diversidad de las poblaciones microbianas no cultivables (véanse las pp. 674-678).

6.5 Crecimiento microbiano en ambientes naturales

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Quorum sensing y poblaciones microbianas Durante décadas, los microbiólogos tendieron a pensar en las poblaciones microbianas como colecciones de individuos creciendo y comportándose de una manera independiente entre sí. Más recientemente, se ha hecho evidente que muchas bacterias pueden comunicarse entre sí y funcionar de una forma cooperativa. Uno de los principales mecanismos para que ésto se lleve a cabo es mediante un proceso denominado quorum sensing o autoinducción. Se trata de un fenómeno por el cual las bacterias determinan su propia densidad poblacional a través de una serie de moléculas sensoras, a veces denominadas autoinductoras, ya que pueden incluso estimular a la propia célula que las liberó. La concentración de estas moléculas señales se incrementa conforme aumenta la población hasta que alcanza un determinado nivel, indicando a las bacterias que la población ha alcanzado un nivel crítico o quorum. Entonces, las bacterias comienzan a expresar una serie de genes dependientes del quorum. El sistema quorum sensing se ha encontrado en miembros de bacterias gramnegativas y grampositivas. El quorum sensing tiene un gran sentido práctico. Tomemos el ejemplo de la producción y liberación de enzimas. Si tales enzimas fueran liberadas por tan sólo unas pocas bacterias, las enzimas difundirían y se diluirían tanto que serían ineficaces. Mediante el control quorum sensing, las bacterias alcanzan un determinado nivel de población y es en ese momento cuando liberan las enzimas, alcanzando unas concentraciones adecuadas. Esto supone una gran ventaja adaptativa ya sea en el interior del huésped, como en entornos acuáticos o en el suelo. Si un patógeno puede alcanzar altos niveles de población en un lugar determinado del cuerpo antes de producir los factores de virulencia adecuados, tendrá una mayor posibilidad de contrarrestar las defensas del huésped e invadir con éxito otros órganos del huésped. Esto explica otro patrón funcional del quorum sensing; el establecimiento de relaciones simbióticas o parasitarias entre microorganismo y huésped. El quorum sensing se descubrió por primera vez en bacterias Gram negativas, y es en éstas en donde mejor se conoce. Las señales más comunes en estas bacterias son las acilhomoserina-lactonas (HSL). Éstas son pequeñas moléculas compuestas por una cadena acilo de 4 a 14 átomos de car bono unida por enlace amida una homoserina-lactona (Figura 6.19a). La cadena acilo puede tener un grupo ceto o un grupo hidroxilo en su tercer carbono. La acil-HSL difunde al interior de la célula diana (Figura 6.196). Una vez que éstas moléculas se encuentran en un nivel suficiente, se unen a proteínas receptoras especiales e inducen un cambio conformacional. Normalmente, los complejos actúan como inductores —es decir, se unen a sitios diana del DNA y estimulan la transcripción de genes dependientes del quorum sensing —. Los genes necesarios para la síntesis de las acil-HSL también se suelen inducir, y de esta manera se amplifica el efecto de producción y liberación de más moléculas autoinductoras. Inducción y represión de la actividad genética (pp. 296-299).

Figura 6.19 Quorum sensing en bacterias Gram negativas. (a) Estructura general de una homoserina-lactona, la mejor conocida señal sensora o autoinductora del quorum sensing. (b) Diagrama esquemático que resume el funcionamiento del quorum sensing en muchas bacterias Gram negativas. La proteína secretora que actúa como inductora está marcada como R. Las líneas punteadas indican que la acil-HSL sintasa no siempre se produce en respuesta al autoinductor. Véase el texto para más detalles.

Numerosos procesos son sensible a las señales HSL y quorum sensing en bacterias Gram negativas. Algunos ejem plos bien estudiados son: 1) la producción de bioluminiscencia por Vibrio fischeri, 2) la síntesis y liberación de factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa, 3) los procesos conjugativos para la transferencia de material genético por Agrobacterium tumefaciens, y 4) la producción de antibióticos por Erwinia carotovora y Pseudomonas aureofaciens. Las bacterias Gram positivas también regulan actividades por quorum sensing, utilizando normalmente un oligo péptido como señal. Buenos ejemplos son: 1) la conjugación en Enterococcus faecalis, 2) la inducción del estado de com petencia para la recepción de material genético en Streptococcus pneumoniae, 3) la estimulación de la esporulación por Bacillus subtilis, y 4) la producción de numerosas toxinas y otros factores de virulencia por Staphylococcus aureus. El quorum sensing incluso estimula el desarrollo del micelio aéreo de Streptomyces griseus. En este caso, la señal parece estar mediada por una gamma-butirolactona, en lugar de un oligopéptido. Una interesante e importante función del quorum sensing es la induccción y formación de biofilms maduros por el patógeno Pseudomonas aeruginosa, teniendo un papel importante en la fibrosis quística. La formación de biofilms tiene sentido para un patógeno ya que los biofilms protegen a los microorganismos que lo componen de los antibióticos y agentes químicos. Además, gracias al quorum sensing las

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moléculas señales inductoras de la formación de biofilms no quedarán diluidas, sino que se concentrarán rápidamente. En estas circunstancias, dos diferentes bacterias pueden estimularse mutuamente mediante la liberación de señales; este parece ser el caso de los biofilms que contienen los patógenos P. aerugionsa y Bwkholderia cepacia. El quorum sensing es un ejemplo de lo que podría denominarse fenómeno de la multicelularidad, por el que muchas células se comunican y coordinan sus actividades par actuar como una unidad. Otros ejemplos de dicha conducta es el patrón de formación de colonias (véanse las pp. 114-115) y la formación de cuerpos fructíferos en mixobacterias {véanse las pp. 553-555).

1. ¿Cómo están relacionadas las leyes de Liebig del mínimo y de Shelford de la tolerancia? 2. Describa cómo responden los microorganismos en entornos oligotróficos 3. Discuta brevemente el ensayo de microviabilidad de Postgate, y otros sistemas por los que microoganismos viables pero no cultivables pueden ser enumerados o estudiados. 4. ¿Qué es el quorum sensing? Describa cómo ocurre y discuta brevemente su importancia para los microorganismos.

Resumen 1. El crecimiento consiste en el aumento de los constituyentes celulares y tiene como resultado un incremento del tamaño o del número celular, o de ambos. 2. Cuando se cultivan los microorganismos en un sistema cerrado o cultivo discontinuo, la curva de crecimiento resultante tiene cuatro fases: latencia, exponencial o logarítmica, estacionaria y de muerte (Figura 6.1). 3. En la fase exponencial, el número poblacional se duplica a intervalos constantes, denominado tiempo de duplicación o de generación (Figura 6.3). La constante de velocidad media de crecimiento (k) es la inversa del tiempo de generación. 4. La multiplicación exponencial es del tipo equilibrado, los componentes celulares son sintetizados a tasas constantes relativas entre sí. Los cambios en las condiciones de cultivo (p. ej., experimentos shift-down y shift-up) implican un crecimiento desequilibrado. Una parte de los nutrientes disponibles se utilizará como suministro de energía para el mantenimiento celular. 5. Las poblaciones microbianas pueden enumerarse directamente con cámaras de recuento, contadores electrónicos o microscopía de fluorescencia. Para el recuento de viables se pueden utilizar técnicas como la siembra en placa por extensión, en profundidad o sobre filtro de membrana. 6. Los cambios en las poblaciones se pueden analizar también determinando variaciones en la masa microbiana, mediante la determinación del peso seco, la turbidez o la cantidad de un componente celular. 7. Los microorganismos se pueden cultivar en un sistema abierto en el que se aportan los nutrientes y se retiran los residuos de forma constante. 8. Un sistema de cultivo continuo es un sistema abierto que puede mantener una población microbiana en fase logarítmica.

Existen dos tipos: quimiostatos y turbidostatos. 9. La mayoría de las bacterias, algas y hongos poseen una pared celular rígida y son hipertónicos respecto del habitat debido a la acumulación intracelular de solutos como aminoácidos, polioles e iones potasio. La cantidad de agua realmente disponible para los microorganismos se expresa en términos de actividad del agua (a w). 10. Aunque la mayoría de los microorganismos no crece bien en medios con una actividad del agua inferior a 0.98, debido a la plasmólisis y los efectos asociados, los organismos osmotolerantes pueden sobrevivir e incluso desarrollarse intensamente en medios con valores bajos de aw. Los halófilos necesitan concentraciones altas de cloruro sódico para crecer (Tabla 6.3). 11. Cada especie de microorganismo tiene un pH óptimo de crecimiento, y pueden clasificarse en acidófilos, neutrófilos o alcalófilos. 12. Los microorganismos pueden alterar el pH de su ambiente, y la mayoría de los medios de cultivo deben tamponarse para estabilizar elpH. 13. Los microorganismos poseen rangos diferentes de temperatura para su crecimiento, y unas temperaturas cardinales —mínima, máxima y óptima—. Estos rangos están determinados por los efectos de. la temperatura en la velocidad de catálisis, desnaturalización de las proteínas y alteración de membranas. 14. Existen cinco tipos principales de microorganismos respecto de las preferencias de temperatura: 1) psicrófilos, 2) psicrófilos o psicrotrofos facultativos, 3) mesófilos, 4) termófilos, y 5) hipertermófilos (Figura 6.13 y Tabla 6.3). 15. Los microorganismos se pueden clasificar en al menos cinco categorías diferentes, según

su respuesta a la presencia de O2: aerobios obligados, anaerobios facultativos, anaerobios aerotolerantes, anaerobios estrictos u obligados y microaerófilos (Figura 6.14 y Tabla 6.3). 16. El oxígeno puede convertirse en tóxico por la producción de peróxido de hidrógeno y los radicales superóxido e hidroxilo. Éstos se destruyen por las enzimas superóxido dismutasa, catalasa y peroxidasa. 17. La mayoría de los microorganismos situados en el mar profundo son barotolerantes, pero algunos son barófilos y necesitan una presión elevada para alcanzar un crecimiento óptimo. 18. La radiación de alta energía o de longitud de onda corta daña a los microorganismos de varias maneras. La radiación ionizante —rayos X y gamma— ioniza moléculas y destruye el DNA y otros componentes celulares. 19. La radiación ultravioleta (UV) induce la formación de dímeros de timina y la rotura de cadenas en el DNA. Este daño se puede reparar mediante mecanismos de fotorreactivación o reactivación oscura. 20. La luz visible puede aportar energía para la formación de oxígeno en forma de singlete, que destruye a las células. 21. El crecimiento microbiano en entornos naturales se ve profundamente afectado por las limitaciones de nutrientes y otros factores adversos. Algunos microorganismos pueden ser viables pero no cultivables por lo que deben ser estudiados con técnicas especiales. 22. A menudo, las bacterias se comunican entre sí mediante mecanismos dependientes de la densidad poblacional, y así, realizan ciertas actividades sólo cuando se alcanza cierta densidad poblacional. Este fenómeno se denomina quorum sensing.

Lecturas suplementarias

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Palabras clave acidófilo 131 actividad del agua (a w) 130 aerobio obligado 135 aerobio 135 alcalófilo 131 anaerobio aerotolerante 135 anaerobio estricto 135 anaerobio obligado 135 anaerobio 135 anaerobios facultativos 135 barófilo 137 barotolerante 137 catalasa 136 cenocítico 119 constante de velocidad media de crecimiento (k) 122 crecimiento desequilibrado 120 crecimiento equilibrado 120 crecimiento 119 cultivo discontinuo 119 energía de mantemiento 127

extremófilos 128 fase de latencia, lag 119 fase de muerte 121 fase estacionaria 121 fase exponencial 120 fase logarítmica, log, 120 filtro de membrana 125 fotorreactivación 138 halófilo 130 hipertermófílo 135 ley de Liebíg de los mínimos i39 ley de Shelford de la tolerancia 139 medio oligotrófico 139 mesófilo 134 microaerófilo 135 neutrófilo 131 osmotolerante 130 oxígeno en estado de singlete 139 peróxido de hidrógeno 136 proteínas del hambre 121

Preguntas para razonar y repasar 1. Analice las razones por las que un cultivo podría tener una fase de latencia larga después de la inoculación. 2. ¿Por qué el recuento de células totales no permite asegurar que un cultivo esté entrando en la fase de muerte? 3. Calcule la velocidad media de crecimiento y el tiempo de generación de un cultivo que aumenta desde 5 X 102 a 1 x 108 células en 12 horas. 4. Si el tiempo de generación es de 90 minutos , y la población inicial contiene 10 3 células, ¿cuántas bacterias habrá después de 8 horas de crecimiento exponencial? 5. ¿Por qué los sistemas de cultivo continuos son tan útiles para los microbiólogos?

6. ¿Cómo responden las poblaciones bacterianas a los experimentos de shift-up y shift-dowrít Explique su comportamiento en términos moleculares. 7. ¿Permanece el pH interno celular constante a pesar de los cambios en el pH externo? ¿Cómo se puede conseguir? Explique cómo valores extremos de pH podrían alterar a los microorganismos. 8. ¿Qué adaptaciones metabólicas y estructurales han desarrollado los psicrófilos y termófilos a temperaturas extremas? 9. ¿Por qué los tiempos de generación en la naturaleza son normalmente más largos que en un medio de cultivo?

psicrófilo 134 psicrófilos facultativos 134 psicrotrofo 134 quimiostato 127 quorum sensing 141 radiación ionizante 138 radiación ultravioleta (UV) 138 radical hidroxilo 136 radical superóxido 135 reactivación oscura 138 sistema de cultivo continuo 127 solutos compatibles 129 superóxido dismutasa (SOD) 136 temperaturas cardinales 133 termófilo 134 tiempo de duplicación o generación 122 tiempo de generación 122 tiempo medio de generación 122 turbidostato 128 unidades formadoras de colonias (UFC) 125

Cuestiones para reflexionar 1. Como alternativa a las señales que difunden, sugiera otro mecanismo por el que las bacterias puedan sentir quorum. 2. Diseñe un cultivo de enriquecimiento y un protocolo para el aislamiento y purificación de una bacteria del suelo (p. ej., Bacillus subtilis) a partir de una muestra de suelo. Considere posibles contaminantes y competidores. ¿Cómo ajustaría las condiciones de crecimiento, y cuáles serán necesarias ajustar para incrementar diferencialmente el crecimiento de Bad ila s!

Lecturas suplementarias General Atlas, R. M., and Bartha, R. 1997. Microb ial ecology: Fundamentáis and applications, 4th ed. Mcnlo Park, Calif.: Benjamin/Cummings. Caldwell, D. R. 2000. Microbial physiolo gy and metabolism. Belmont, Calif.: Star Publishing. Cavicchioli, R., and Thomas, T. 2000. Extremophiles. In Encydopedia ofmicrobiology, 2d ed., vol. 2, J. Lederberg, editor-in-chief, 31737. San Diego: Academic Press. Gerhardt, P.; Murray, R. G. E.; Wood, W. A.; and Krieg, N. R., editors. 1994. Methodsf or gen eral and molecular bacteriology, chaps. 6-12.

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6.1 La curva de crecimiento Kolter, R.; Siegele, D. A.; and Tormo, A. 1993. The stationary phase of the bacterial life cycle. Annu. Rev. Mic robiol. 47:855-74.

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Capítulo 6

Crecimiento microbiano

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6.5 Crecimiento microbiano en ambientes naturales Dunny, G. M., and Leonard, B. A. B. 1997. Cell-cell communication in grarn-positive bacteria. Annu. Rev. Mi crobiol . 51:527-64. Dunny, G. M., and Winans, S. C, editors. 1999. Cell-cell signaling in bacteria. Washington, D.C.: ASM Press. Fuqua, C. 2000. Quorum sensing in gram-negative bacter ia. In Encydopedia of microbiology, 2d ed., vol. 4, J. Lederberg, editor-in-chief, 1-13. San Diego: Academic Press. Gray, K. M. 1997. Intercellular communication and group behavior in bacteria. Trends Microbiol. 5(5): 184-88. Greenberg, E. P. 1999. Quorum sensing in gramnegative bacteria: An important signaling mechanism in symbiosis and disease. In Microbia l ecolo gy and infectiou s dise ase, E. Rosenberg, editor, 112-22. Washington, D.C.: ASM Press. Lazazzera, B. A., and Grossman, A. D. 1998. The ins and outs of peptide signaling. Trends Microbio l. 6(7):288-94. Losick, R., and Kaiser, D. 1997. Why and how bacter ia co mmunicat e. Sci. Am. 276(2):68-73. Morita, R. Y. 1997. Bacteria in olig otrophi c environments: Starvation-survival life style. New York: Chapman & Hall. Shapiro, J. A. 1988. Bacteria as multicellular organisms. Sci.Am. 258(6):82-89. Shapiro, J. A. 1998. Thinking about bacterial popul ation s as multicc llula r org anisms. Annu. Rev. Mic robiol. 52:81-104. Watnick, P, and Kolter, R. 2000. Biofilm, city of microbes.y. Bacte riol. 182(10):2675-79. Wirth, R.; Muscholl, A.; and Wanner, G. 1996. The role of pheromones in bacterial interactions. Trends Microbiol. 4(3):96-103.

Microbiología Prescott Capítulo 6

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