Définition (2)
Réalisation de l’antibiogramme Dr Nathalie Guessennd Unité des antibiotiques
[email protected],
• antibiogramme = outil validé par un biologiste médical médecin de choisir le bon antibiotique, ou l'association d'antibiotiques permettant de traiter efficacement un patient.
L’ ANTIBIOGRAMME Guérir rapidement
Du prélèvement à l'antibiogramme • On recue recueille ille les les bactérie bactériess : dans dans o anss an o dans o dans o o
BUT : Trouver un traitement efficace pour le malade
Définition (1) • Antibiogramme permet de mesurer la capacité d’un antibiotique à inhiber la
• Il doit être réalisé selon les méthodes standards
le sang (hémoculture). les urines, es se es, es es es ex exccr men s an mau aux x, les crachats, les lavages broncho-alvéolaires, le liquide céphalo-rachidien,
• Les bactéries sont mises en culture et ensuite identifiées et s'il est nécessaire de réaliser un antibiogramme (décision du biologiste).
Pour être fiable la méthode doit être standardisée STANDARDISATION :
de l'inoculum : quantité de act ries - de la la gélose gélose MuellerMueller Mueller-Hinton -Hinton : composition du milieu - de l'épaisseur l'épaisseu l'épaisseurr de la gélose gélose : diffusion de l'antibiotique - de la charge charge d’antibiotique d’antibiot d’antibiotique ique du disque -
La standardisation permet: un antibiogramme reproductible et fiable ’ un minimum de variation une bonne lecture une bonne interprétation
∞
L’antibiogramme repose sur la notion de:
∞ ∞
inhibitrice
∞ ∞
Différentes méthodes Concentration minimale inhibitrice (CMI) De
De
dilution m eu so e milieu liquide
Concentration Minimale inhibitrice (CMI) CMI= plus faible concentration d’antibiotiques capable d’inhiber in souche étudiée pendant une période de temps définie
diffusion
disques
Elle s’exprime en mg/l ou µg/ml
E-test®
Antibiogramme
disques
Méthodes (1) • la méthode par diffusion des disques imprégnés d’antibiotiques d’antibiotiqu es et la mesure des diamètres ou méthode de Kirby Bauer est celle recommandée par l’OMS
Méthode standardisée
Principe de l’antibiogramme par diffusion
Selon le Comité de l’antibiogramme de la Société Française de Microbiologie
Disque antibiotique(6mm∅) Charge connue
(http://www.sfm.asso.fr/nouv/general.php?pa=2)
Inoculation par étalement en surface de la gélose
– Epaisseur 4 mm et horizontal et bonne composition
Culture
– Inoculum des colonies adjacentes mais non confluentes – Pré-diffusion et pré-incubation
Gélose Mueller Hinton (4mm)
Méthode de diffusion en gélose Utilise
des disques de papier filtre (buvard) sur lesquels un antibiotique a été incorporé, séché et stabilisé inoculation de toute la surface de la gélose les disques sont placés sur la surface de la boîte. les antibiotiques diffusent dans la gélosezone d'inhibition
Culture
Zone d’inhib d’inhibition ition de la culture
Gradient de diffusion et zone d’inhibition Gradient d’antibiotique décroissant
Disque d’antibiotique
Zone d’inhibi d’in hibitio tion n de la culture
Colonies
C1
C3 C4
C1 > C2 > C3 > C4
Diamètre d’inhibition
Démarche méthodologique Principe de la diffusion d’un antibiotique en milieu gélosé à partir d’un disque
Milieu
Disque
surfaçe fond radiale
Diffusion
en profondeur
Standardisation
Démarche de qualité
Mueller Hinton Composition, épaisseur (4mm), horizontalité
Inoculum Choix
des antibiotiques Dépôt des disques et incubation lecture et interprétation
Inoculum Matériel Bactérie
vivante: Colonies jeunes en
p ase exponen e e e cro ssance 24h) sur milieu non sélectif Eau
physiologique stérile
Anse
pour prélever les colonies,
densitomètre,
une colonie
Matériel et réactifs : Milieu
.
de culture en fonction des germes
entérobactéries, pseudomonas staphylocoque.
Milieu de Mueller Hinton additionné de 5% de sang frais de mouton pour les streptocoques. Gélose chocolat (sang sang cuit cuit) + isov is ovit ital alex ex po pour ur Haemophilus et Neisseria .
2ml eau physiologique : émulsionner les colonies sur le bord du tube ensuite agiter Ajuster la densité de l’ inoculum à celle de l’étalon 0.5 Mac Farland en y ajoutant soit un fragment fragment de colonie soit de l’eau physiologique
Ajustement de la turbidité de l’inoculum Selon
la famille de la bactérie : • Ent Enter eroba obacte cterie riess et Pseu Pseudo domon monace aceae ae 6 ’ . 8 Macc Far Ma Farla land nd 10 ) au 1/100 • Stre Strept ptoc ococ occa cace ceae ae et Staphylococcaceae:107 UFC : diluer l’inoculum (0.5 Mac Farland) au 1/10.
Souches fragiles • Ne Neis isse seri riac acea eae e , Hae Haemo moph phil ilus us et S. pneumoniae 107 UFC : diluer l’inoculum (0.5 Mac Farland) à 1/10: 1000µl dans 10ml
Ensemencement des boîtes • Ensemencer sur toute la surface de la boîte à 3 reprises l’écouvillon sur le bord de Passer enfin l’écouvillon la élose. Laisser sécher la boîte pendant quelques minutes à température ambiante, le couvercle étant fermé. Incuber à 35-37°C Staphylococcus et oxacilline: oxacilline: incuber à 30°C
nsemencemen
es o es
Choix et disposition des isques
Choix et disposition des disques d’ATB • Inondation préconisée ( CA-SFM) 1ml, tourner et retourner aspirer avec pipette pasteur+poire
• Ecouvi Ecouvillonn llonnage age (OMS/ (OMS/NCCLS NCCLS)) : Tremper un écouvillon stérile sec dans l’inoculum éliminer l’excès d’inoculum (en pressant l’écouvillon et en le faisant rouler contre les parois du tube au dessus du niveau du liquide).
• Choix d’antibiotiques est fait selon le genre de la bactérie (voir : les antibiotiques à tester de chaque espèce CASFM) • La disposition des antibiotiques est faite selon leur classification : β-Lactamines, aminosides, quinolones et fluoroquinolones, macrolides, lincosamides, Permettant
ainsi l’interprétation de l’antibiogramme
LECTURE • Disposition des disques d’antibiotiques Distributeur o Pince Disques à 25mm de centre à centre
• Faire la lecture le lendemain
o
• Lecture des diamètres des zones d’inhibition interprétation
Disposition des disques d’antibiotiques
• Mesurer et noter le diamètre de chaque ’ • Les résultats seront interprétés en fonction des diamètres critiques figurant dans des tableaux d’interprétation
Lecture
• Déposer les disques d’ ATB à l’aide d’ une paire de pinces stériles ou d’un distributeur de disques Respecter 25 à 30mm entre les disques Sur une boîte de 90mm, disposer au maximum 7 disques et sur une boîte carrée de 120 x120mm 16 disques
• Appuyer doucement sur chaque disque pour assurer un contact uniforme avec le milieu Laisser diffuser 10 min (prédiffusion). • Mettre les boîtes à incuber à 37°C dans les 30 min qui suivent la préparation pendant 18 à 24 h
OSIRIS® Automate de lecture
diamètre d’inhibition pour chaque atb Ce diamètre correspond à la CMI
B
A
Ce diamètre est reporté en S, R, I en fonction des diamètres officiels donnés par les comités d’experts
C H
D
F E
L’ANTIBIOGRAMME LES RESULTATS
• Bactérie Bactér Bac térie ie sensible sensib sen sible le : S – La bactérie bactérie ne pousse pousse pas en présence présence de l’antibio l’antibiotiqu tiquee – Le trait traitement ement avec avec cet antibiot antibiotique ique sera sera un succès
• Bactérie Bactér Bac térie ie résistante résistan résis tante te : R – La bactérie bactérie pousse pousse en présence présence de l’antibioti l’antibiotique que – Le trait traitement ement avec avec cet antibiot antibiotique ique sera sera un échec
• Bactérie Bactér Bac térie ie intermédiaire intermédi inter médiair airee : I – Ré Résu sult ltat at intermédiaire
Réalisation de l’antibiogramme souche Ensemencer par écouvillonnage
Par inondation Laisser sécher Déposer les disques d’antibiotiques 7/boîte 90 ou 16/boîte 120 Incuber à 37°C 18h à 24h Mesurer les diamètres des zones d’inhibition Interpréter rendu des résultats
Les résultats sont rendus au médecin en :
S
Sensible
R
Résistant
I
Intermédiaire
PRINCIPALES CAUSES D’ ERREURS • Elles sont liées aux : -Inoculum - isques anti io iottiq iquues -Milieu de culture -Conditions d’incubation -Lecture et interprétation -Contrôle de qualité
Facteurs influençant les résultats • Facteurs influençant l’antibiotique : – – – –
la diffusion de
Epaisseur de Epaisseur de la gélose gélose : 4 mm Concentrat Conce ntration ion en agar agar Taillee et charge Taill charge du du disque disque Pré-incubat Pré-in cubation ion / Pré-diffusi Pré-diffusion on
Facteurs influençant les résultats • Facteurs influençant l’activité de l’antibiotique : – Concentra Concentrations tions ioniques ioniques du milieu milieu (Ca2+, Mg2+) – pH du du mi mili lieu eu – Concentration de l’inoculum l’inoculum bactérien
