La cromatografía es un proceso mediante la cual una fase móvil (FM) pasa a través de una fase estacionaria (FE) en la que ha colocado una cantidad conocida de alguna muestra, el resultado de esta técnica es que los distintos componentes de la muestra que se colocó en la FE se separan de acuerdo a la afinidad con la FM, éstas se mueven y eluyen a distintas velocidades y tiempos diferentes. La cromatografía de gases gases (GC) (GC) es un sistema sistema que está está compuesto: de gas portador, sistema de inyección de la muestra, columna, c olumna, y detector. La idea de esta técnica se basa en la volatilización de la muestra y su posterior inyección en la cabeza de una columna colu mna cromatográfica. Existen dos tipos de cromatografía de gases:
La fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos se produce produce mediante adsorción. adsorción.
La fase estacionaria son moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte. Esta es la
que se usa más
ampliamente. La GC es un sistema que está compuesto: compuesto: de gas portador, portador, sistema de inyección de la muestra, columna y detector.
Debe ser un gas inerte para evitar que reaccione con el analito o con la columna. Los gases de uso más común son helio, nitrógeno, hidrogeno o argón. El gas portador cumple básicamente dos propósitos Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. La inyección de muestra es un apartado crítico, ya que se debe inyectar una cantidad adecuada y debe introducirse de tal forma que sea rápida para evitar el ensanchamiento de las bandas de salida.
El analito analito se inyecta usando usando una microjeringa microjeringa en una cámara de vaporización instantánea sellada por una junta de silicona (Septum). El volumen inyectado no debe superar la capacidad de la columna y entre más pequeño sea el volumen usado de la muestra mayor será la eficiencia y la reproducibilidad del análisis. La temperatura aplicada debe ser suficiente para la volatilización de la mu estra.
Existen dos tipos de columnas:
Columnas de relleno: Son tubos de vidrio, metal inerte o teflón de 2 ó 3 metros de longitud y 2 a 4 mm de diámetro interno, el material de relleno del interior consiste en partículas esféricas para interaccionar con el analito. Columnas capilares: Son más eficaces en la separación de compuestos, entre esta tenemos: las WCOT de pared recubierta, son tubos capilares donde la pared interna está recubierta con una fina capa de fase estacionaria. SCOT (soporte recubierto): tienen una capa en su lado interno de superficie adsorbente donde se acopla la fase estacionaria.
Dentro de los detectores tenemos dos que son los más utilizados, el detector de ionización de llama: es un quemador de hidrógeno/oxígeno donde se mezcla el eluyente con hidrógeno. En esta cámara se produce una chispa para causar ignición, los compuestos orgánicos al quemarse se pirolizan y producen iones y electrones, aprovechando que se convierte en conductor se induce una corriente eléctrica, para detectar iones d esprendidos; y el detector de conductividad térmica: se basa en el calentamiento de una resistencia mediante el uso de una corriente eléctrica. Esta resistencia tiene una temperatura que depende del gas circundante. La resistencia es un hilo de tungsteno, platino u oro. Existen otros detectores como son: detector termoiónico, detector de captura de electrones y detector de emisión atómica entre otros. La respuesta del detector debe ser lineal dentro de un amplio intervalo de concentraciones. Este intervalo de concentraciones se conoce como intervalo lineal dinámico y corresponde a la diferencia entre la concentración máxima del intervalo lineal dinámico y la mínima concentración del mismo y que debe distinguirse de la señal de fondo o ruido del detector. El análisis cuantitativo se puede llevar a cabo gracias a la relación directa que existe entre la respuesta del detector y la concentración de la muestra, siempre y cuando la respuesta obtenida para la muestra se encuentre dentro de ese intervalo.
La Espectrometría de masas es una técnica analítica que permite estudiar compuestos de naturaleza
diversa:
orgánica,
inorgánica
o
biológica
(incluyendo
biopolímeros
y
macromoléculas naturales o artificiales) y obtener información cualitativa o cuantitativa. Permite la medida de iones derivados de moléculas. Los datos se obtienen de forma espectral ya que la abundancia relativa de los fragmentos de masas de una muestra se registra como una serie de líneas o picos.
La muestra que eluye de la columna se introduce en el MS por la interfase (transfer line), la cual permite la entrada de la muestra en cantidad suficiente sin perder o modificar significativamente el vacío dentro del MS. La muestra es sometida a un proceso de ionización por medio del cual las moléculas se rompen en fragmentos. La ionización ocurre empleando electrones de alta energía que chocan con la molécula produciendo un ión molecular inestable que subsecuentemente se fragmenta.
Combinar la cromatografía de gases con la espectrometría de masas nos permite obtener registros en tres dimensiones ya que por cada tiempo de retención nos ofrece un espectro de masas de los compuestos que brotan de la columna cromatográfica, el analizador de masas suele contener una trampa de iones, un impacto eléctrico provocado por un filamento de wolframio que transmite electrones acelerados aplicado entre el ánodo y el filamento, lo que produce una fuerte ionización en el eluyente cromatográfico.
El cromatógrafo de gases que se usa es un equipo Agilent Techonologies 6890N acoplado a espectrometría de masas, provisto de un sistema computarizado MSD ChemStation D.01.00 SP1. Como gas portador se utiliza He y si se desea aumentar el caudal se puede usar H2. Antes de comenzar el análisis, debe inyectarse el patrón que contiene todos los ácidos grasos a cuantificar, con objeto de poder identificarlos correctamente. Para las muestras, se inicia tomando 10μL del aceite y se diluyen con 990 μL de Diclorometano . El extracto obtenido se inyecta en el septo del cromatógrafo de manera uniforme y consistente sin ladear la jeringa, ya que se puede romper la aguja; posteriormente se enjuaga la jeringa con agua. Luego, se marca el punto de inyección en el cromatograma, así como la información relacionada con la muestra inyectada. La rampa utilizada para la separación es la siguiente:
La temperatura del puerto de inyección es de 250ºC
La temperatura del detector es de 280ºC
La temperatura de la columna inicial es de 50ºC con un tiempo de espera de 3 minutos y luego un incremento de 20ºC por minuto hasta llegar a 250ºC.
La muestra que eluye de la columna se introduce en el MS por la interfase (transfer line) para determinar los pesos moleculares de los compuestos presentes en el aceite. Finalmente se obtiene el cromatograma y se procede a determinar el índice de Kovats para la respectiva identificación cualitativa y cuantitativa de los compuestos.
Básicamente es un quemador de hidrógeno/oxígeno, donde se mezcla el efluente de la columna (gas portador y analito) con hidrógeno.
En cromatografía líquida y cromatografía de gases, el tiempo de retención, tR, se define como el tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición de la respuesta máxima. Se puede usar tR como un parámetro para identificación. Los tiempos de retención cromatográficos son característicos de los compuestos que representan, pero no son únicos. La coincidencia de los tiempos de retención de una muestra y de una sustancia de referencia puede usarse como un criterio parcial en la construcción de un perfil de identidad, pero es insuficiente por sí misma para establecer la identidad. Los tiempos de retención absolutos de un compuesto dado varían de un cromatograma al siguiente.
La temperatura en el sistema de inyección debe ser homogénea, de esta forma evita la discriminación de alguno de los componentes de la muestra. Además, en la técnica de inyección “splitless”, la totalidad de la muestra inyectada es dirigida hacia la columna, durante la inyección, la temperatura debe mantenerse inferior al punto de ebullición del componente más volátil de la muestra.
