MANUAL DE LABORATORIO BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA
INTRODUCCIÓN La Biotecnología es la ciencia llamada a solucionar muchos problemas de índole mundial en los campos de la medicina, la industria y el sector agropecuario. En países como Colombia, donde la inversión en investigación es muy precaria; los aportes e iniciativas de investigación y desarrollo en el área de la Biotecnología Alimentaria, indudablemente, contribuirán en brindar alternativas de soluciones a la gran ola de hambruna que tienen muchas poblaciones de este y otros países del mundo. Dentro de las herramientas más valiosas y consistentes con que cuenta el Ingeniero Agroindustrial y de Alimentos para suplir las necesidades de progreso científico, tecnológico y de Ingeniería, se encuentra la Interacción armónica de los diferentes aspectos de la Biotecnología Alimentaria; para ello es indispensable la formación de profesionales capaces de aplicar y desarrollar conceptos de ingeniería en los procesos biotecnológicos realizados en la industria de Alimentos. El desarrollo de la biotecnología industrial en Colombia es evidente y se manifiesta en los diferentes renglones de la economía nacional. Entre las industrias de alimentos que generan o consumen productos biotecnológicos se encuentran: las cervecerías y malterías, productos lácteos fermentados, panificadoras, jugos y néctares, industrias vinícolas y licoreras, etc. La política nacional de ciencia y tecnología, en uno de sus programas orientados a fortalecer la competitividad del sector productivo y su inserción en el mercado mundial, reconoce que los adelantos científicos en biología molecular y biotecnología han tenido gran impacto en los sistemas de producción; y por ello es prioritario el fomento a las investigaciones y a la formación de nuevos profesionales en estas áreas. Este manual de laboratorio, dirigido a estudiantes de Ingeniería de Alimentos y otras Ingenierías o áreas relacionadas con el sector de la industria agroalimentaria, fue diseñado con mucho esmero y dedicación para complementar y demostrar en el laboratorio los referentes teóricos discutidos previamente en el aula de clases. Surge, entonces como una herramienta pedagógica que fortalecerá el procesó de enseñanzaaprendizaje en el desarrollo de programas académicos relacionados con la Biotecnología Alimentaria.
INTRODUCCIÓN La Biotecnología es la ciencia llamada a solucionar muchos problemas de índole mundial en los campos de la medicina, la industria y el sector agropecuario. En países como Colombia, donde la inversión en investigación es muy precaria; los aportes e iniciativas de investigación y desarrollo en el área de la Biotecnología Alimentaria, indudablemente, contribuirán en brindar alternativas de soluciones a la gran ola de hambruna que tienen muchas poblaciones de este y otros países del mundo. Dentro de las herramientas más valiosas y consistentes con que cuenta el Ingeniero Agroindustrial y de Alimentos para suplir las necesidades de progreso científico, tecnológico y de Ingeniería, se encuentra la Interacción armónica de los diferentes aspectos de la Biotecnología Alimentaria; para ello es indispensable la formación de profesionales capaces de aplicar y desarrollar conceptos de ingeniería en los procesos biotecnológicos realizados en la industria de Alimentos. El desarrollo de la biotecnología industrial en Colombia es evidente y se manifiesta en los diferentes renglones de la economía nacional. Entre las industrias de alimentos que generan o consumen productos biotecnológicos se encuentran: las cervecerías y malterías, productos lácteos fermentados, panificadoras, jugos y néctares, industrias vinícolas y licoreras, etc. La política nacional de ciencia y tecnología, en uno de sus programas orientados a fortalecer la competitividad del sector productivo y su inserción en el mercado mundial, reconoce que los adelantos científicos en biología molecular y biotecnología han tenido gran impacto en los sistemas de producción; y por ello es prioritario el fomento a las investigaciones y a la formación de nuevos profesionales en estas áreas. Este manual de laboratorio, dirigido a estudiantes de Ingeniería de Alimentos y otras Ingenierías o áreas relacionadas con el sector de la industria agroalimentaria, fue diseñado con mucho esmero y dedicación para complementar y demostrar en el laboratorio los referentes teóricos discutidos previamente en el aula de clases. Surge, entonces como una herramienta pedagógica que fortalecerá el procesó de enseñanzaaprendizaje en el desarrollo de programas académicos relacionados con la Biotecnología Alimentaria.
BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRÁCTICAS MICROBIOLÓGICAS EN EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA Desde el primer momento en que el estudiante entra a un laboratorio donde se trabajen procesos biológicos microbianos, está expuesto a recibir cualquier clase de infección, dependiendo del microorganismo con el que entre en contacto, ya sea directamente o por contaminación cruzada. Para prevenir este tipo de riesgos, el estudiante debe cumplir con las normas de bioseguridad dentro y fuera del laboratorio. Las normas de bioseguridad son una recopilación de los procedimientos de laboratorio más esenciales que constituyen la base de técnicas microbiológicas y biotecnológicas apropiadas; éstas son fundamentales para la seguridad en el laboratorio y no pueden sustituirse, en ningún momento, con equipos especializados; ya que estos no serán más que un complemento para facilitar el trabajo y en algunos casos para disminuir la exposición a sustancias peligrosas. Las normas de seguridad que se deben cumplir en un laboratorio donde se trabaje con material microbiológico se clasifican en: De orden personal, de orden del laboratorio y de orden del trabajo microbiológico.
a) DE ORDEN PERSONAL:
Usar siempre la bata dentro del laboratorio; no se debe llevar puesta fuera del mismo. Las prendas contaminadas se deben esterilizar antes de lavarlas. No se deben colocar los bolsos, prendas de vestir, paraguas, carteras, etc. en los mesones de trabajo. Debe existir un lugar destinado para ello. Dentro del laboratorio no se permitirá al personal comer, beber, fumar ni aplicar cosméticos. Se deberán lavar las manos al iniciar y al terminar el trabajo; como también, después de haber manipulado material contaminado y/o infeccioso. No se deberá pasar la lengua por las etiquetas; los materiales no se colocarán en la boca No se llevará calzado sin puntera o que no sea cerrado. No se debe hacer uso de pañuelos o bata de laboratorio para limpiar objetos o instrumentos de trabajo. No se debe participar del trabajo si se tiene alguna herida, quemadura o rasguño en las manos o antebrazos; estas deben ser tratadas inmediatamente.
Se debe comunicar inmediatamente cualquier sospecha de haber contraído alguna enfermedad como consecuencia del trabajo. Cuando sea necesario, se deben proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos; se utilizaran gafas de seguridad, viseras o pantallas faciales. No se deberá pipetear con la boca; se deben usar pipetas automáticas, pera de goma o auxiliar de pipeteo.
b) DE ORDEN DEL LABORATORIO:
Mantener cerradas las puertas del laboratorio; abrirlas sólo en caso de emergencia. No permitir la entrada de niños a las zonas de trabajo No debe haber material que no tenga relación con el trabajo Debe haber un programa de lucha contra insectos y roedores Las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán al menos una vez al día y en caso de derramamiento fortuito de sustancias potencialmente peligrosas. No olvidar cerrar la válvula del gas al terminar cada jornada de trabajo. La señal internacional de riesgo biológico debe colocarse en las puertas de los locales en donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2.
c) DE ORDEN DEL TRABAJO MICROBIOLÓGICO
Estudiar, con anterioridad, las técnicas y protocolos de las prácticas y experimentos de laboratorio; esto evitará confusiones y dinamizará el trabajo. Trabajar, siempre, de manera ordenada, tranquila, constante y metódica; evitando movimientos y gasto de energía innecesarios. Llevar, siempre, un registro ordenado de los resultados y modificaciones. Esto evitará contratiempos desagradables por la pérdida de datos importantes. El material de trabajo (Caldos de fermentación, cepas, medios, etc) deben ser tocados, únicamente, con instrumentos estériles; nunca con material contaminado y mucho menos con las manos. Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo antes y después de cada jornada. Cada vez que se derrame material infeccioso, se debe cubrir la zona con papel absorbente impregnado de desinfectante y dejarlo por un periodo de 15 minutos. Las pipetas de vidrio, deben tener en su abertura superior un algodón que sirva como filtro para proteger a la muestra y al manipulador. Colocar todo material contaminado, tales como: Porta objetos, laminillas, espátulas, pinzas, pipetas, etc. en recipientes adecuados con soluciones desinfectantes.
El resto de material contaminado se debe colocar en recipientes especiales para su posterior esterilización. Al depositar líquidos, viértalos por las paredes. Recuerde que siempre se debe adicionar ácidos al agua y nunca agua a los ácidos, porque ocasiona salpicaduras peligrosas. No retire cultivos celulares del laboratorio sin previa autorización Las asas deben esterilizarse antes y después de usarse flameándolas en la llama del mechero hasta ponerlas al rojo vivo en toda su extensión y luego dejarla enfriar por espacio de 20 segundos cerca de la llama. Si se va a repicar de un cultivo a otro, termine por enfriar el asa en este último Flamee la boca de tubos, balones, Erlenmeyers, etc. antes y después que introduzca asas o pipetas Nunca hable, tosa, estornude o respire fuerte cuando abra un cultivo o esté sembrando Trabaje lo más cerca posible al mechero.
RECUERDE SIEMPRE!
Las improvisaciones son el primer paso para un accidente En todo momento esté consciente de lo que hace En caso de un accidente, actúe rápidamente sin perder la calma Pregunte al profesor si no está seguro de lo que va a hacer Tenga mucho sentido común
EXPERIMENTO Nº 1 TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE BIOMASA 1. INTRODUCCIÓN: El crecimiento microbiano se pude considerar como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de un organismo, lo cual, para los organismos unicelulares, conduce a un aumento del número de individuos en la población. Se puede considerar el crecimiento al nivel de individuos dentro de una población (ciclo celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de crecimiento). El crecimiento de las poblaciones celulares se puede subdividir en sistemas cerrados , como el cultivo intermitente y en sistemas abiertos , como el cultivo alimentado por lotes y el cultivo continuo. Para determinar el número total de células de un cultivo, el método de elección es el recuento microscópico directo. Para células de levadura, puede emplearse un hemocitómetro. Es necesaria una ampliación de 100X a 400X para visualizar la cámara de recuento y las células en suspensión. Para células bacterianas se usa frecuentemente una cámara de Petroof-Hauser o una de Neubauer y una ampliación de 1000X a causa del pequeño tamaño de las bacterias. El recuento microscópico directo tiene la ventaja de que permite observar directamente la morfología de las células estudiadas. Las morfologías aberrantes o atípicas podrían indicar unas condiciones subóptimas de crecimiento o la presencia de un genotipo o fenotipo alterados. El método más usado para medir el crecimiento microbiano es secar volúmenes conocidos de cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trata de células que sedimentan rápidamente, como las levaduras, esto usualmente implica centrifugación de muestras del cultivo en tubos de centrífuga prepesados. Para células bacterianas difíciles de concentrar por centrifugación, las muestras de cultivo se filtran a través de membranas hidrofílicas con un tamaño de poro de 0,2 m. Otro método muy utilizado es el de determinación de biomasa por densidad óptica. Se aprovecha la proporcionalidad de la densidad óptica a la masa celular, cuando no se tienen en el medio de fermentación otros sólidos en suspensión. Este método se basa en la Ley de Beer y Lamberty; en este caso, se asume que la absorción del rayo incidente es proporcional a la concentración de células presentes.
2. OBJETIVO: Desarrollar la habilidad para medición la biomasa microbiana que interviene en los bioprocesos a través del conocimiento de las técnicas más utilizadas para este fin.
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales Cámaras de Neubauer Microscopios Estufa Desecador Balanza analítica (6 cifras decimales) Espectrofotómetro Centrífuga Pipetas graduadas Pipetas automáticas Auxiliar de pipeteo Beakers Erlenmeyers Tubos para centrífuga Pinzas b) Reactivos Cultivo de Levadura Agua destilada Solución salina isotónica estéril (0,85%)
4. PROCEDIMIENTO: 4.1. Preparación del cultivo madre:
Disolver aproximadamente 0,5 gr. de levadura seca comercial (Saccharomyces cerevisiae) en un erlenmeyer que contenga 200ml de agua destilada estéril.
4.2. Preparación de las soluciones problema: En tubos de 20-25 ml, previamente secos en estufa, preparar 6 diluciones de levadura a partir del cultivo madre, así:
TUBO ml de agua ml de cultivo
1 2 3 4 5 6 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10
Cada dilución de levadura será medida con las siguientes técnicas:
4.3. Medición de la biomasa microbiana por conteo directo en cámara de Neubauer: Agitar muy bien el cultivo de levadura. Tomar un volumen pequeño (0,1 – 0,3 mL) con la pipeta automática. Depositar una alícuota en la superficie pulida de la cámara de Neubauer cerca del extremo del cubreobjetos; la suspensión entrará en la cámara por capilaridad. Una cámara llenada adecuadamente contiene células sólo en el espacio contenido entre el cubre y la cámara de recuento. No debería sobrar fluido que se deposite en los surcos. Posteriormente se coloca en la platina de un microscopio compuesto y se enfoca el enrejado con los objetivos de menos aumento (4X y 40X). Para contar las levaduras se utiliza el cuadro central (Ver figura 1). El cuadro central está señalado con un círculo y contiene 25 cuadros, cada uno rodeado por un borde de tres líneas. Cada uno de los 25 cuadros a su vez contiene 16 cuadritos. Se debe ajustar la intensidad de la luz de modo que se hagan visibles tanto las líneas como las células. Se deben contar las células que se encuentren dentro de los 5 cuadros marcados (los cuatro de las esquinas y el del centro). El cuadro central (marcado con el círculo) tiene un área de 1 mm2 y una profundidad de 0.1 mm. Tenga en cuenta los Siguientes aspectos:
Para aquellas células que estén tocando las líneas de los bordes, sólo cuente aquellas que estén en dos de los cuatro bordes (superior e izquierdo); esto evitará que se repita el conteo. Si cuenta más de 50 o menos de 20 células por cuadro, repita la toma de muestra o cambie la dilución que esté usando. Limpie la cámara con agua destilada estéril y séquela con gasa o algodón después de cada lectura. 1 mm
1 mm
Figura 1. Cámara de Neubauer
4.4. Medición de la biomasa microbiana por densidad óptica: Tomar 1 ml de cada muestra problema y preparar en tubos tapa – rosca una dilución de cada una de ellas de tal forma que la concentración final de solutos no sobrepase las 1000 ppm. (máxima concentración de sólidos leídas por el espectrofotómetro)
Agitar muy bien. Realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro a 540 nm.
4.5. Medición de la biomasa microbiana por peso seco celular: Centrifugue los tubos, previamente pesados, que contienen las soluciones originales de levadura (volumen restante conocido) a 4000 rpm durante 15 minutos. Con ayuda de una pipeta evacue cuidadosamente el sobrenadante. Posteriormente someta a evaporación en estufa el agua restante a una temperatura de 90ºC durante 20 horas. Pese los tubos y vuelva a evaporar hasta que haya alcanzado un peso constante.
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Calcule y reporte la concentración de cada una de las diluciones problemas (células/ml, Absorbancia y gr de célula/L) .
Elabore una gráfica de No Células/ml vs Absorbancia. Calcule el valor de R2
Elabore una gráfica de gr de células/L vs Absorbancia. Calcule el valor de R2
Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la biomasa microbiana.
Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las técnicas utilizadas en el experimento.
¿Qué son los colorantes supravitales y para qué se usan?
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 2 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO DNS (Ácido 3,5 - dinitrosalicílico) 1. INTRODUCCIÓN: Este método nos ayuda a determinar la presencia de grupos carbonilos libres (C=O) en los también llamados azúcares reductores. Esto involucra la oxidación del aldehído presente en el grupo funcional. Simultáneamente, en presencia de calor el ácido 3,5dinitrosalicílico (DNS) se reduce a ácido 3-amino,5-nitrosalicílico bajo las condiciones alcalinas, desarrollándose un color amarillo café: oxidación grupo aldehído
grupo carboxilo
reducción DNS
ácido 3-amino,5-nitrosalicílico
Se adiciona sulfito (no necesario para la reacción del cambio de color) en el reactivo para absorber el oxígeno disuelto, ya que éste puede interferir con la oxidación de la glucosa. En la reacción se muestra que una mol de azúcar reaccionará con una mol de DNS. Sin embargo, no cabe duda que se dan muchas otras reacciones, y la estequiometría de la reacción es mucho más complicada que lo previamente descrito. El tipo de reacción lateral depende de la naturaleza exacta del azúcar reductor. Diferentes azúcares reductores arrojan distintas intensidades de color ; así, se hace necesario calibrar para cada azúcar. Además de la oxidación de los grupos carbonilos en el azúcar, otras reacciones laterales como la descomposición de azúcar también compiten para la disponibilidad del ácido 3,5-dinitrosalicílico. Como consecuencia, la carboxymetil celulosa puede afectar la curva de calibración alterando la intensidad del color desarrollado.
Este es un método conveniente y relativamente barato, aunque su especificidad es relativamente baja. Cuando los efectos de compuestos extraños no son conocidos, uno puede incluir efectivamente el llamado control interno para el desarrollo del color en muestras desconocidas; entonces, una cantidad conocida de azúcar se adiciona a esta muestra. El aumento en la absorbancia en el segundo desarrollo de color es equivalente a la cantidad incrementada de azúcar. Altas concentraciones de proteína interfieren en la determinación de los azúcares reductores. Otra de las ventajas de este método es que el color final desarrollado es estable hasta 24 horas, es sencillo y rápido.
2. OBJETIVO: Aplicar una técnica sencilla, rápida y eficaz para determinar azúcares reductores en caldos y medios de fermentación que permitan conocer los rendimientos en sustrato y/o productos.
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales
Tubos de ensayo tapa rosca Pipetas de 1, 5 y 10 ml Pipeteador automático Auxiliar de pipeteo Matraz aforado de 1000 ml Frasco color ámbar Espectrofotómetro Vortex
b) Reactivos
Solución del ácido 3,5 dinitrosalicílico, 1% : o
o
o
o
o
DNS: 10 g Fenol: 2 g Sulfito de sodio anhidro: 0.5 g Hidróxido de sodio: 10 g Aforar a 1 litro con Agua destilada
Conservar refrigerado dentro del frasco color ámbar.
Solución estándar de glucosa :
Disolver 1 gr. de glucosa anhidra en 1000 ml de agua destilada, conservar en refrigeración hasta el momento de usarla.
4. PROCEDIMIENTO:
Establecer una escala estándar de 0 a 1000 ppm. Dentro de una serie de tubos de ensayo, previamente lavados y sumergidos en solución de ácido sulfúrico al 5% durante una noche, introducir: 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; y 1 ml de solución estándar y completar a 1 ml con agua destilada. Elabore la siguiente tabla al momento de registrar los datos: Tubo 1 2 3 4 5 6
ml. de s/n estándar 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
ml. de agua destilada 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
Concentración final (ppm) 0 200 400 600 800 1000
Absorbancia (575 nm) -
La determinación de azúcares reductores es efectuada sobre 1 ml de la muestra convenientemente diluida. La curva estándar y las muestras sufren las siguientes operaciones:
Adicionar 1 ml del reactivo DNS Agitar fuertemente en un vortex Poner a ebullición durante 5 minutos Enfriar rápidamente (baño de hielo) Adicionar 8 ml de agua destilada dentro de cada tubo Agitar fuertemente en un vortex Leer absorbancia a 575 nm.
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Grafique la curva de calibración (Concentración vs Absorbancia) para la determinación de azúcares reductores con el método del DNS. Muestre todos los resultados obtenidos. Calcule el valor de R2.
Calcule la concentración en azúcares reductores (Glucosa) de la muestra problema.
Consulte otros métodos utilizados para la determinación de azúcares reductores y glucosa. ¿Qué ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnología?
ADVERTENCIA! El reactivo DNS es altamente tóxico, cancerígeno y abortivo. Mucho cuidado al manipularlo. Usar siempre guantes de látex.
6. REFERENCIAS:
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 3 DETERMINACIÓN DE ETANOL POR EL MÉTODO DE WINNICK 1. INTRODUCCIÓN: La determinación de la cantidad de etanol en los productos obtenidos a partir de la fermentación alcohólica es una de las principales preocupaciones del biotecnólogo; ya que éste es un análisis que requiere de una dotación adecuada de equipos de medición o, por otro lado, de una cantidad considerable de volumen de muestra, como en el caso del método de destilación. El método de Winnick permite determinar bajas concentraciones de alcohol etílico a través de la acción oxidante de la solución 0.4 N de dicromato de potasio en ácido sulfúrico 10N, posterior valoración con Tiosulfato de sodio. Se diluye la muestra de forma que la cantidad de dicromato utilizada sea suficiente para oxidar todo el etanol, formando acetaldehído; de otra manera debe repetirse la prueba usando una mayor dilución de la muestra. El exceso de dicromato se elimina con yoduro de potasio, el volumen de Tiosulfato de sodio gastado en titulación se emplea para determinar el porcentaje de etanol en la muestra teniendo en cuenta la respectiva dilución. Las reacciones que se manifiestan en el proceso son: 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH6O K2Cr2O7 + 6KI + 7H2SO4 2Na2S2O3 + 2I
2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 3C2H4O2 + 11H2O Cr2(SO4)3 + 4K2SO4 + 7H2O + 6I Na2S4O6 + 2NaI
2. OBJETIVO: Aplicar una técnica rápida y sencilla para la determinación de alcohol etílico en caldos de fermentación alcohólica que pueda ser usado en determinaciones de velocidad de reacción.
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales:
Microburetas Soporte universal Erlenmeyers de 50 ml Balones aforados de 250 y 500 ml Pipetas de 1, 5 y 10 ml Balanza Beakers Varillas de agitación
b) Reactivos:
Ácido Sulfúrico 10 N Dicromato de potasio 0.4N en H2SO4 10N Solución de Yoduro de potasio 3N (KI) Solución reactivo de almidón soluble Tiosulfato de sodio 0.1 N+
4. PROCEDIMIENTO: a) Preparación de Reactivos:
ÁCIDO SULFÚRICO 10N:
Disolver 138.9 ml de H2SO4 (densidad 1,84 gr/ml y 96% de pureza) con agua destilada hasta aforar a 500 ml.
ADVERTENCIA ! : Se presenta una reacción altamente exotérmica; por lo que se debe adicionar lentamente el ácido al agua (nunca lo contrario). Hacer esto con el balón sumergido en baño de agua con hielo. Al enfriarse la solución, se produce una contracción de volumen que se debe corregir adicionando más agua destilada hasta alcanzar el volumen final.
DICROMATO DE POTASIO 0.4 N EN H2SO4 10 N:
Pesar 19.614 gr. de Dicromato de potasio previamente seco a 100ºC durante 4-6 horas y disolverlo en el H2SO4 10 N hasta completar un volumen de 1000ml.
SOLUCIÓN DE YODURO DE POTASIO 3 N:
Disolver 49.8 gr. De yoduro de potasio (KI) en suficiente agua destilada y aforar en un balón de 100 ml.
SOLUCIÓN REACTIVO DE ALMIDÓN SOLUBLE:
Pesar 1 gr. de almidón soluble. Verter lentamente con agitación constante en 200 ml de agua destilada hirviente. Hervir hasta obtener un líquido ligero y translúcido. Dejar decantar y usar únicamente el líquido sobrenadante. En un recipiente limpio y bien tapado, esta solución puede durar hasta dos meses. El reactivo es propenso a contaminarse con hongos.
TIOSULFATO DE SODIO 0.1 N:
Preparar a partir de un stock comercial para 1 L de solución.
b) Determinación: Realizar una curva patrón en tubos de ensayo con tapa que contengan 5 ml. de las siguientes concentraciones: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14% de etanol. A éstas diluciones y a la muestra se someten al siguiente proceso:
Realizar una dilución 1:9 (muestra: agua) para cada tubo.
Adicionar exactamente 1 ml de solución de Dicromato de potasio 0.4 N en H 2SO4 10 N dentro de un erlenmeyer pequeño (20-50 ml).
Adicionar 2 ml de la solución a estudiar
Dejar en reposo durante 5 minutos
Transcurrido el tiempo, adicionar 1 ml de solución de yoduro de potasio 3N y mezclar.
Adicionar 2 gotas de solución de reactivo de almidón soluble.
Titular con solución volumétrica de Tiosulfato de sodio 0.1 N con agitación cuidadosa hasta obtener un cambio nítido hacia un color azul marino.
Restar el volumen de Tiosulfato gastado por el blanco al momento de construir la curva de calibración.
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Grafique la curva de calibración para las diluciones de alcohol realizadas. Calcule el valor R2 y muestre la ecuación que explique la curva.
Calcule el porcentaje de alcohol de la muestra problema utilizando la curva de calibración.
Consulte otros métodos para determinar alcohol etílico. Explique las ventajas y desventajas para su uso.
6. REFERENCIAS:
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 4 EVALUACIÓN DE CULTIVOS LÁCTICOS 1. INTRODUCCIÓN: Las Bacterias lácticas tienen la capacidad de fermentar la lactosa contenida en la leche a ácido láctico, como es el caso de Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus. Esta capacidad bacteriana puede ser explotada industrialmente para obtener productos como el Yogurt y el Kumis. El Yogurt es un producto obtenido por la simbiosis entre el Lactobacillus bulgaricus y Streptococos thermophylus ; los cuales se pueden obtener de la leche desnatada concentrada por evaporación. Una de las etapas más importantes del proceso de obtención del producto fermentado es el cultivo, ya que aporta a la leche las bacterias acidolácticas responsables del proceso de acidificación. Este cultivo consta exclusivamente de especies termofílicas; que para el caso del yogurt son : L. bulgáricus y St . Thermophylus . El cultivo no debe contener especies no termofílicas. La producción de cada una de las especies varía a lo largo del proceso; al comienzo es de 1:1 a 2:5. Durante la incubación se favorece el desarrollo de St. Thermophylus hasta el punto de alcanzar una proporción de 5:1 que se equilibra nuevamente al final del proceso. Por otra parte, el L. bulgaricus proporciona el aroma característico del yogurt.
2. OBJETIVO: Conocer y evaluar la fabricación de cultivos lácticos utilizados en la industria del yogurt a través de un seguimiento en el comportamiento de la acidez, el pH, relación cocos/bacilos y rendimientos (YP/S , YX/S) a intervalos regulares de tiempo.
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales:
Balanza Frascos tapa rosca de 250 ml Erlenmeyer de 500 ml Pipetas de 5 y 10 ml Pipetas de 1 ml Tubos de ensayo pHmetro Bureta Baño María Cámara de Neubauer
b) Reactivos:
NaOH 0,1 N Fenolftaleina 2% Azul de metileno Leche descremada en polvo Cultivo Láctico de Yogurt Agua destilada estéril
4. PROCEDIMIENTO: 4.1. Preparación del Cultivo.
En 3 frascos con tapa rosca reconstituir 200 ml de leche en polvo descremada (8%, 12%, y 16%)
Pasteurizar en baño maría a 80ºC por 30 minutos.
Los gramos de leche en polvo se calculan con la siguiente ecuación:
Volumen total x % deseado gr de Leche = ----------------------------------------100 - % de Humedad Leche P. Volumen de agua = Volumen deseado - gr de leche en polvo
Enfriar a 43 ºC.
Inocular cada concentración con 3% de cultivo de yogurt. ¡AGITAR BIEN!
Incubar a 43 ºC por 3 horas. ¡ NO AGITAR!
Refrigerar a 4 ºC por 2 horas. ¡ NO AGITAR!
4.2. Actividad Del Cultivo Madre:
Medir el pH cada 30 minutos con ayuda de un pHmetro.
Medir la acidez cada 30 minutos tomando 9 ml del cultivo, adicionar 2 gotas de fenolftaleina al 2%. Titular con NaOH 0,1 N hasta que persista el color rosa pálido por 30 segundos. Expresar la acidez en porcentaje de ácido láctico:
ml NaOH gastado x 0,1N x meq-gr Ácido láctico % Ácido Láctico = --------------------------------------------------------------- x 100 ml muestra
4.3. Relación Cocos – Bacilos:
Realizar conteo en cámara de Neubauer cada 60 minutos y observar la relación coco bacilo en cada intervalo de tiempo. (Incluir una gota de azul de metileno en la dilución para colorear las bacterias)
4.4. Rendimientos ( Y X/S, YP/S) :
Realizar los balances de masa respectivos y encontrar los rendimiento de Sustrato en biomasa Y (YX/S) y sustrato en producto Y (YP/S), considerando que para una concentración de 12,5 % de sólidos existen 4,7% de lactosa.
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Grafique el incremento de sólidos Vs acidez. Grafique el incremento de sólidos Vs pH Grafique el incremento celular de cada bacteria en función del tiempo Calcule los respectivos rendimientos para cada intervalo de tiempo y muestre los rendimientos globales de la fermentación. Compare resultados.
¿Qué problema representa el hecho de encontrar levaduras, en alto porcentaje, en productos como el yogurt?
¿Qué efecto tiene en el pH y la acidez en el aumento de sólidos dentro de un cultivo láctico?
6. REFERENCIAS:
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº. 3 EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE VINO DE FRUTAS 1. INTRODUCCIÓN: La historia de la fermentación se remonta más allá de nuestros conocimientos. El hombre, tal como lo conocemos; es decir, el hombre que trabaja y lucha, aparece en la escena con una jarra de vino. Su realidad vinícola se aproxima más a nuestra experiencia de vida con la expansión de la dominación griega, iniciada 1000 años a. C., fue entonces cuando el vino llegó por primera vez a los países en los que se sentaría su verdadero hogar: Italia y Francia. Los últimos noventa años han presenciado la revolución industrial de los licores y, sobre todo, en los últimos 25 años el fundamento científico de la elaboración de los licores ha clasificado la situación de tal modo que técnicas que antes parecían imposibles hoy son fáciles de realizar. Los microorganismos que intervienen en la fermentación del vino son principalmente levaduras del género Saccharomyces , y dentro de este género, la especie que ha sido tradicionalmente utilizada es S. Cerevisiae . Var. Ellipsoideus La fabricación del vino más que ciencia es un arte. Aunque la uva es la fruta comúnmente más usada, también pueden usarse muchas otras frutas como los melocotones, ciruelas, manzanas y duraznos para la fabricación de vinos. Los procedimientos de fabricación del vino de uva casero son bastante sencillos. Simplemente se inocula el jugo de la uva con un cultivo iniciador de levaduras adquirido en un supermercado. La La fermentación primaria tarda aproximadamente una semana; durante ese tiempo la mayoría del azúcar originalmente presente en el jugo se convierte en etanol por acción de las células de levadura, al mismo tiempo tiempo se produce dióxido de carbono. El exceso de células de levadura son posteriormente removidas del mosto de uva junto con otros sedimentos, y una fermentación secundaria más lenta permite desarrollar el sabor final del vino. Puede adicionarse azúcar (sacarosa o glucosa) para lograr alcanzar el porcentaje de alcohol deseado o para modificar el sabor del vino. El tipo de vino puede ser clasificado según el color del vino. Otra clasificación está basada en el contenido de azúcar presente en el producto final, como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Clasificación de vinos vinos según el contenido de azúcar.
TIPO DE VINO GRAVEDAD ESPECÍFICA CONT. DE AZÚCAR (%P/P) Vino Seco 1.085 – 1.100 21 – 25 Vino semi dulce 1.120 – 1.140 29 – 33 Vino Dulce 1.140 – 1.160 33 - 37
2. OBJETIVO: Evaluar el efecto del contenido de azúcar (Fructosa) en el proceso de la fermentación del vino de frutas.
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales:
Fermentador estéril de 1 L. (Erlenmeyer) Manguera estéril Gasa estéril Cinta de enmascarar y bisturí Rollo de papel aluminio Beaker de 500 ml Colador Mortero grande Pipetas estériles de 1, 5 y 10 ml. Baño maría Tubos de ensayo estériles
b. Reactivos:
4 Kg. de Uvas o corozo, manzana, mango, piña, maracuyá Fructosa Levadura para vino (Saccharomyces cerevisiae ) Azufre en polvo o Metabisulfito de sodio Agua destilada
4. PROCEDIMIENTO:
Seleccionar las uvas alto grado de madurez (12 – 15 ºBrix) y sanidad. Lavar la uva con abundante agua. Quitar manualmente las pepas de la fruta. Macerar manualmente (Usar guantes) en un recipiente grande para sacar el jugo de la uva (mosto). Curar el fermentador, previamente limpio y estéril, con sulfuroso. Pesar 1 gr. de Azufre y cubrirlo con un pedazo de algodón alrededor de una varilla delgada. Quemar el azufre y flamear en el interior del fermentador con los gases sulfurosos para evitar la posterior contaminación del vino. Evitar un exceso de sulfuroso en el fermentador que pueda alterar las características organolépticas. En su defecto, se puede usar Metabisulfito de sodio al 1,5% para el curado del fermentador esparciendo esta solución por toda la superficie del recipiente. Verter el mosto de uva en el fermentador, adicionar agua en relación 2:1 (Mosto : Agua). Adicionar la cantidad de fructosa correspondiente a cada ensayo y agitar. (Ver tabla). Sacar la muestra inicial y determinar: Azúcares reductores, %Alcohol, pH y Acidez.
Ensayo 1 2 3
Conc. de Fructosa adicionada (gr/L) 50 100 200
Pasteurizar el mosto en baño maría a 65ºC durante 20 minutos. Agitar suavemente 2 o 3 veces para distribuir el calor. Enfriar en baño de hielo hasta temperatura ambiente (28 – 30ºC) Inocular el mosto con un preinóculo de Levadura S. Cerevisiae para vino (2%). . Adicionar al fermentador y agite hasta disolver. Tapar el fermentador con la gasa estéril (Bien ajustada) y conectar la manguera como se muestra en la figura. Permitir que se realice la fermentación primaria por un periodo de 8 días. Luego de los 8 días, realizar un frotis del velo de crecimiento y colorear con azul de lactofenol, observe la morfología; realice una siembra en agar malta; incube durante 5 días a temperatura ambiente y anote los resultados obtenidos. realizar un trasciego del mosto (separar el vino del sedimento acumulado en el fondo del fermentador, evitar la agitación) a otro fermentador en las mismas condiciones de esterilidad y curado. Ajustar nuevamente todos los accesorios y continuar con la fermentación secundaria por un periodo de 8 días más. Realizar otro Frotis para observar la morfología microbiana.
MONTAJE DEL FERMENTADOR PARA LA PRODUCCIÓN DE VINO
TAPÓN O GASA
MANGUERA ESTERIL
MOSTO
AGUA DESTILADA
FERMENTADOR
Al cabo de los 8 días, realizar otro trasciego y finalmente dejar fermentar por 2 semanas más. Filtrar el vino obtenido, lo más higiénicamente posible con ayuda de un papel filtro y utilizando una bomba de vacío. Pasteurizar a 65ºC por 20 minutos. Posterior enfriamiento a 4ºC. Degustar el vino y anotar sus características sensoriales. Envasar el restante en botellas de vidrio oscuro y permitir su envejecimiento. Determinar en cada trasciego: Azúcares reductores, porcentaje de alcohol etílico, pH y acidez expresada en ácido láctico.
NOTA: Todo material que entre en contacto con el caldo de fermentación debe estar previamente estéril para evitar una contaminación. Utilice siempre el mechero para sacar las muestras. 5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
A través de un gráfico de barras analice los resultados obtenidos entre la concentración de azúcar adicionada Vs. Porcentaje de alcohol obtenido. A través de un gráfico de barras analice los resultados obtenidos entre la concentración de Azúcares reductores Vs. %Alcohol. Calcule los rendimientos de sustrato en producto (Yp/s) puntuales y globales de cada ensayo. Analice los resultados. Realice los balances de masa de cada proceso y calcule los rendimientos de cada uno. Incluya costos - beneficios.
¿Cómo evitar la contaminación por bacterias acéticas en la producción industrial de vino? ¿Cuáles son los principales defectos físicos de los vinos? ¿Qué análisis organolépticos le haría a un vino? ¿Qué diferencia existe entre un vino espumoso y un vino tradicional? ¿Qué exigen las normas ICONTEC para la calidad de los vinos?
6. REFERENCIAS:
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA EXPERIMENTO Nº 6 CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO EN FERMENTACIÓN BATCH SUMERGIDA 1. INTRODUCCIÓN: El conocimiento de la cinética del cultivo permite predecir el desarrollo de la fermentación y evaluar rendimientos y productividades, datos importantes en el diseño de estrategias de producción y optimización de procesos. Las células consumen los nutrientes requeridos para crecimiento y los convierten en nuevas células y productos metabólicos. La velocidad de estos procesos varía con el desarrollo del cultivo. A medida que las células crecen se acumulan en el medio los productos finales del metabolismo celular. Frecuentemente, estos componentes alteran el pH y la reología del medio; factores decisivos sobre la actividad celular y los mecanismos de transporte. El procedimiento apropiado para una fermentación batch es, primero que todo, inocular un frasco pequeño de caldo nutriente con un cultivo puro; ya sea de una caja de petri, tubo de cultivo líquido o tubo inclinado con agar sólido. El frasco inoculado debe agitarse constantemente a temperatura controlada. Una vez alcanzada la fase de crecimiento, se inocula una pequeña cantidad de medio de cultivo de este frasco a otro de mayor volumen. Este proceso se repite una o dos veces más con el objetivo de adaptar la cepa microbiana a las condiciones y nutrientes del medio a utilizar en el estudio de la cinética fermentativa. Un proceso similar se lleva a cabo a nivel industrial, de tal manera que se van aumentando los volúmenes de medio para, finalmente, ser inoculado al fermentador de mayor volumen. Cuando se trabaja con cultivos puros, se debe operar con el cuidado de evitar la contaminación que puede presentarse por cualquier exposición al aire, agua, tacto, etc.; de tal manera que, todo elemento que entre en contacto con el interior del fermentador debe ser previamente esterilizado.
2. OBJETIVO: Estudiar la cinética del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en fermentación batch sumergida y determinar experimentalmente los parámetros cinéticos de la ecuación de Monod. 3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales: Erlenmeyer de 1L Agitador magnético Manguera de venoclisis estéril Jeringas desechables de 5 ml Tapones de caucho con orificios Balanza analítica Tubos de ensayo previamente secos por 24 horas. Bisturí Silicona b) Reactivos: ) Levadura (Saccharomyces cerevisiae C6H12O6 (Glucosa anhidra) NaNO3 K2HPO4 MgSO4.7H2O KCl FeSO4.7H2O CaCl2 (NH4)2SO4 4. PROCEDIMIENTO: a) Preparación del preinóculo: Inocular aproximadamente 2 gr. de levadura en 300 ml de medio de cultivo (diseñado según necesidades nutricionales de la levadura y utilizando los nutrientes disponibles). Agitar. Incubar a 28-30 ºC por 18 – 24 horas. c) Diseño, Formulación y preparación del medio nutriente:
Utilizando la composición de una levadura típica y la disponibilidad de los nutrientes antes mencionados, diseñar el medio de crecimiento que será utilizado para la producción de 8 gr de levadura /L de medio. (Traer cálculos listos). Introducir los nutrientes en un fermentador (erlenmeyer) de 1 L, adicionar agua destilada hasta completar 720 ml (Tener en cuenta el 2% de pérdidas en la esterilización). Agitar muy bien con una varilla de vidrio; si es necesario, se debe calentar un poco mientras se agita. Tapar el fermentador con una gasa y esterilizar en autoclave a 121ºC, 15 PSI durante 15 minutos.
c) Inoculación y Fermentación:
Inocular el fermentador con 80 ml de preinóculo (10% del volumen final). Realizar este paso lo más asépticamente posible. Instalar los accesorios del fermentador aerobio; (ver figura). Realizar la fermentación a 28 ºC, 300 rpm, y 1,5 vvm (Volumen de aire por volumen de medio por minuto) durante 36 horas continuas. Determinar cada 2 horas: Peso seco celular (X) y Concentración de Glucosa (S).
MONTAJE DEL FERMENTADOR BATCH
Muestreo Bomba de Aire
Agitador magnético
Trampa de gases
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Graficar Log. [X] Vs. Tiempo. Analizar el comportamiento. Graficar [S] Vs. Tiempo. Analizar el comportamiento. Determinar experimentalmente los parámetros cinéticos de la ecuación de Monod: Velocidad específica de crecimiento (max.), Constante de saturación (Ks) y el rendimiento de sustrato en biomasa (Yx/s). Aplicar los métodos integral y diferencial (utilizar las relaciones lineales de Lineweaver-Burk, Langmuir y Eadie-Hofstee) de análisis del modelo de Monod en la fase exponencial del crecimiento microbiano. ¿Qué se entiende por crecimiento diáuxico?. Explique.
NOTAS:
Lleve todos los materiales necesarios para el experimento: Bata, tapaboca, gorro, alcohol, algodón, mangueras, silicona, jeringas, bisturí, etc. Siempre tenga presente la prudencia dentro del laboratorio y no olvide las normas de bioseguridad: No comer, no fumar, no dormir, mantener la calma ante situaciones de peligro y actuar siempre con conciencia...
Trabaje en orden y mantenga siempre limpio y despejado su lugar de trabajo; evite la contaminación visual y auditiva.
Organice previamente con sus compañeros la distribución de espacios y tiempos en el trabajo práctico. Lleve una tabla organizada de registro de datos y distribuyan homogéneamente los turnos de trabajo.
6. REFERENCIAS:
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 7 EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE VINAGRE DE FRUTAS (FERMENTACIÓN ACÉTICA)
1. INTRODUCCIÓN: La fermentación acética es la oxidación del alcohol etílico a ácido acético por bacterias que tienen esta capacidad y muestran un alto rendimiento como el Acetobacter aceticum, A. Schuzenbachii y A. Curvum. El vinagre es una solución acuosa de ácido acético, se obtiene mediante la fermentación por oxidación de una solución diluida de etanol. El proceso metabólico se basa en la conversión, bajo acción de la alcohol deshidrogenasa, en acetaldehído y del acetaldehído hidratado en ácido acético por la acción de la acetaldehído deshidrogenasa: C2H5OH ---- CH3CHO + H2O
CH2CH(OH)2 ---- CH3COOH + H2O
Consecuentemente se requieren 2 etapas; una anaerobia de producción de etanol con levaduras y otra aeróbica para su oxidación con Acetobacter sp. El vinagre es descrito como un producto derivado por fermentación con un contenido mínimo de 4% (p/p) de ácido acético y característico sabor derivado de la materia prima utilizada. Así existen vinagres de frutas, miel, malta, vino, sidra, etc; siendo los tres últimos los más comunes. Como producto de partida para su obtención se recomienda el etanol, que se obtiene por fermentación de las levaduras como Saccharomyces cerevisiae . En la segunda fase el alcohol producido es oxidado por las bacterias acéticas formándose ácido acético, poco aldehído, ésteres y acetona que le comunican sabor. En los procesos modernos, se emplean casi que exclusivamente, como materia prima, alcoholes baratos que proceden de industrias de fermentación o alcohol etílico sintético en solución acuosa de 4 a 11 volúmenes, enriquecido con melaza de caña o remolacha, fuentes inorgánicas, oligoelementos y biocatalizadores.
2. OBJETIVO: Evaluar el proceso de obtención de vinagre de frutas (Plátano, banano o mango), realizando un seguimiento a sus variables más importantes: Alcohol, acidez, pH, Aireación y examen microscópico.
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales: Licuadora Cuchillos Coladores Recipientes grandes Frasco de vidrio con tapa (Fermentador) Gaza Beakers Erlenmeyers de 100 ml Pipetas estériles de 1, 5 y 10 ml Portaobjetos Buretas pHmetro
60 cm de manguera de 1/2” de diámetro.
b) Reactivos: Plátanos, bananos y mangos bien maduros (4 Kg. de cada uno) NaOH 0,1N Fenolftaleína Sobre de levadura (Saccharomyces cerevisiae) Cepa de Acetobacter sp. Reactivos para determinar alcohol 2. PROCEDIMIENTO:
Seleccionar frutas con un alto índice de madurez, libres de enfermedades y ataque de insectos. Licuar, a baja velocidad, la fruta que ha sido previamente lavada y pelada hasta obtener 3 litros de zumo. Si es necesario, adicione agua en relación 2:1 (Zumo:Agua).
Pasteurizar los 3 litros de zumo de fruta a 65ºC por 20 minutos. Enfriar a 28 -30ºC en un baño de hielo a 4ºC. Uno de los grupos debe trabajar con la flora nativa de la fruta; por lo tanto no debe pasteurizar, como tampoco inocular. Diluir 2 gr. de levadura comercial en 300 ml de mosto, agitar bien. Inocular la dilución de levaduras en el resto del mosto, agitar bien. Determinar la concentración de alcohol, acidez expresada en ácido acético y pH inicial. Realizar un orificio de 1 pulgada de diámetro a la tapa del fermentador, introducir la manguera de desfogue y rellenar el espacio con gasa bien ajustada. Realizar una trampa de gases. Tapar bien el fermentador y permitir que ocurra la fermentación alcohólica durante 8 días a 28-30 ºC. Finalizado el tiempo de fermentación alcohólica, determinar la concentración de alcohol alcanzada (debe estar entre 10 – 14%, si es necesario estandarice utilizando alcohol etílico) , el pH final (debe estar entre 3-4, ajustar si es necesario). Determinar estas variables cada 4 días una vez empezado el proceso. Finalizada esta etapa, el líquido claro se transvasa e inocula con Acetobacter aceti. (diluir esta bacteria en un 5% del mosto y agitar bien). Tapar el fermentador con una gasa para dejar entrar oxígeno al proceso. Permitir que se dé la fermentación acética hasta alcanzar un 4-5% de ácido acético (aproximadamente 2 semanas). Filtrar el vinagre obtenido con papel filtro o un cedazo fino y determinar %de acidez, pH, alcohol residual y examen microscópico (realice un frotis de la Acetobacter en medio YGC). Pasteurizar a 65ºC por 20 minutos. Enfriar inmediatamente en un baño de hielo a 4ºC. Envasar en botellas de vidrio transparente previamente esterilizadas.
3. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Graficar el desarrollo de: %alcohol, %acidez y pH Vs. Tiempo para cada etapa del proceso (Fermentación alcohólica y acética). Calcule los rendimientos obtenidos para este proceso, según la fruta utilizada. ¿Qué controles deben realizarse a lo largo del proceso de acetificación y por qué? ¿Qué alteraciones pueden presentarse durante el proceso de elaboración del vinagre de frutas?. ¿Cómo se pueden evitar estas alteraciones?. Explique. ¿Qué parámetros de calidad exige el ministerio de salud en materia de vinagre de frutas?
6. REFERENCIAS:
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 8 DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE VOLUMÉTRICO DE TRANSFERENCIA DE OXÍGENO (KLa) 1. INTRODUCCIÓN: En los procesos de fermentación aeróbicos es necesario un suministro adecuado de oxígeno que satisfaga los requerimientos metabólicos de los organismos empleados. La oxidación de la fuente de carbono y su transformación en células, productos y CO2 establece una demanda de oxígeno que es esencial satisfacer a través de la aireación y mezclado del cultivo. Es indispensable conocer los requerimientos de oxígeno del cultivo para asegurarse de que su suministro sea suficiente. En una fermentación aeróbica por lotes la masa celular y por consiguiente la demanda de oxígeno aumenta exponencialmente. En estas condiciones generalmente no es posible mantener constante la concentración de oxígeno disuelto (CL) en el caldo de fermentación, por la necesidad de equilibrar la velocidad de demanda de oxígeno (VDO) con la velocidad de transferencia de oxígeno (VTO) mediante la manipulación de las variables de operación. El oxígeno suministrado usualmente mediante burbujeo de aire al caldo es transferido desde una burbuja hacia el líquido y luego hacia la pared celular y a través de la pared. La mayor resistencia a la transferencia de oxígeno se presenta en la superficie de separación gas-líquido entre la burbuja y el volumen del líquido. Este fenómeno se manifiesta mediante una diferencia de concentraciones que limita la velocidad de transferencia de oxígeno: VTO = dCL / dt = KLa. (C* - CL) Donde, VTO: velocidad de transferencia de oxígeno g/(litro. s) ; KLa : coeficiente volumétrico de transferencia de masa, s-1 ; C* : Concentración de oxígeno en el caldo, g/L
2. OBJETIVO: Determinar y evaluar el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (KLa) en un caldo de fermentación con variaciones en la velocidad de agitación utilizando el método dinámico de desgasificación.
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales: Fermentador de 1 Litro de capacidad Medidor de oxígeno disuelto (Oxímetro) Gasa Mangueras para suministro y salida del aire Jeringa para toma de muestras Silicona Cronómetro Agitador magnético Sistema de aireación Cámara de Neubauer Microscopios b) Reactivos: Cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae ) Caldo de fermentación (igual que en el experimento Nº6) 4. PROCEDIMIENTO:
Inocule en un 10% del volumen de fermentación el preinóculo de levadura (24 horas de adaptación) en el fermentador de 1L que contiene el caldo de fermentación estéril. Realice el arreglo correspondiente de los accesorios del fermentador (mangueras, tapón, agitador, suministro de oxígeno, etc). Antes de accionar el suministro de aire, realice una lectura del oxígeno disponible con el sistema agitado. Suministre la mayor cantidad de aire posible (1-2 vvm). Espere que el sistema logre estabilizarse en cuanto a la concentración de oxígeno disuelto (10 minutos). Asuma el tiempo cero y comience a medir cada 10 segundos el oxígeno disuelto durante 10 minutos continuos.
Suspenda el suministro de aire y continué midiendo la misma variable (cada 5 segundos) hasta alcanzar una concentración de oxígeno disuelto similar a la inicial cuando el sistema no era aireado. Reiniciar la aireación y anotar inmediatamente (cada 5 segundos) la concentración de oxígeno disuelto hasta alcanzar la concentración del tiempo cero.
Nota: Cada grupo de trabajo realizará la experiencia a una velocidad de agitación diferente: 300, 600 y 900 rpm.
MONTAJE DEL SISTEMA Filtro OXÍMETRO
Sensor Filtro Bomba de Aire
Agitador magnético
Trampa de gases
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Grafique CL Vs. Tiempo. Utilice todos los resultados continuos del proceso. Calcule la velocidad de respiración del cultivo [(O2).x]. Reporte las diferencias entre la transferencia de oxígeno hacia la solución y la demanda de oxígeno por la respiración del cultivo [KLa.(C* - CL) - (O2).x].
Calcule el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (KLa) para el cultivo sumergido en fermentación batch de la Saccharomyces cerevisiae en glucosa. Compare el resultado obtenido con el reportado en la bibliografía. Analice las diferencias si las hay. Consulte las principales ventajas y desventajas que pueda tener este método en comparación a los otros que ya usted conoce. ¿Qué otros factores pueden alterar el valor del KLa en un sistema de fermentación?. Explique.
6. REFERENCIAS:
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 9 OBTENCIÓN DE ENZIMAS (GLUCOAMILASA DEL
A. niger )
1. INTRODUCCIÓN: Cada microorganismo produce una gran variedad de enzimas, la mayoría de las cuales sólo se fabrican en pequeñas cantidades y están implicadas en procesos celulares. Sin embargo, algunos microorganismos producen ciertas enzimas en mayores cantidades y en lugar de mantenerlas dentro de la célula, la excretan al medio. Habitualmente, las enzimas extracelulares son capaces de digerir materiales nutrientes insolubles tales como celulosa, proteína y almidón, siendo transportados los productos de la digestión al interior de la célula, en donde son utilizados como nutrientes para el crecimiento. Comercialmente se producen enzimas, procedentes de bacterias y de hongos; el proceso usualmente es aeróbico. Generalmente la enzima se forma en pequeñas cantidades durante la fase activa de crecimiento, pero se acumula en grandes cantidades durante la fase estacionaria del crecimiento. El Aspergillus niger es un hongo filamentoso perteneciente a los Deuteromicetos (hongos imperfectos) y se encuentra presente en la microflora del aire. El A. niger es denominado comúnmente “Moho negro”. Las especies de los Aspergillus producen numerosas enzimas extracelulares muy utilizadas en biotecnología. Muchas especies de Aspergillus se desarrollan bien a 37ºC, siendo el rango global de temperatura entre 25 – 37ºC. Estos mohos se desarrollan a concentraciones ácidas altas y variadas, pH entre 2 y 9, siendo 5,5 el óptimo. El A. niger es considerado un microorganismo GRAS (seguro) para la producción de enzimas utilizadas industrialmente; tales como: -amilasa, glucoamilasa, celulasa, pectinasa, catalasa, glucosaoxidasa, proteasa y lipasa.
2. OBJETIVOS. Obtener un extracto crudo de la enzima glucoamilasa a partir de una fermentación batch sumergida del Aspergillus niger .
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales.
Fermentador de 500 ml Agitador magnético Bomba de aire Manguera de venoclisis y suministro de aire Bisturí Guantes estériles Gasa Algodón Silicona Jeringa Cámara de Neubauer
b) Reactivos
NaOH 0.1 N HCl 0,1N Solución salina estéril (0,85%) Agua estéril Medio de crecimiento (descrito abajo)
4. PROCEDIMIENTO a) PREPARACIÓN DEL MICROORGANISMO:
La cepa pura de Aspergillus niger debe ser repicada en agar PDA y/o Saboreau para su correspondiente masificación y conservación. Se incubará a 30ºC durante 4-5 días. posteriormente, si no es utilizada de inmediato, se conservará en refrigeración a 4 ºC hasta el momento de usarse.
b) MEDIO DE CRECIMIENTO: Para la producción de la biomasa y de la enzima en estudio, el A. niger se hará crecer en un medio líquido compuesto por: - KNO3 - KCl - MgSO4.7H2O - FeSO4 - Peptona - Maltosa - Agua destilada - Tween 80 - Aceite - pH final
2gr. 0.5gr. 1gr. 0.02 gr. 20 gr. 20 gr. 1L 0.1 % 0.1% 5.5
c) FERMENTACIÓN: -
La inoculación al fermentador de 300 ml se realiza raspando suavemente una caja de agar que contenga el hongo sobre una solución salina isotónica estéril; adicionándolo al medio de cultivo antes mencionado en una concentración del 10%. Tratar de alcanzar una concentración inicial de esporas del orden de 2 – 5 x 107 esporas/ ml, contadas en cámara de Neubauer.
-
Realizar el montaje del fermentador para un sistema aireado y agitado como se ha construido en los experimentos anteriores. (300 rpm y 1.8 vvm).
-
Permitir que ocurra la fermentación por un periodo de 96 horas bajo las condiciones antes anotadas. Tomar muestras cada 24 horas para rectificar el pH del medio (Ajustar si es necesario utilizando base o ácido).
-
Después de las 96 horas de fermentación, determinar la concentración de biomasa lograda y filtrar el caldo de fermentación con ayuda de una bomba de vacío; de tal forma que se logre la separación del micelio y del extracto de enzimas.
-
Centrifugar el extracto obtenido a 2500 rpm x 15 minutos (previo enfriamiento a 46ºC para evitar desnaturalización de la enzima). Descartar el residuo.
-
Guardar el extracto en refrigeración para determinarle su actividad enzimática en el próximo experimento.
ADVERTENCIA ! Tener mucho cuidado al manipular las esporas del hongo. Use siempre la bata, tapaboca y gorro. Lávese bien las manos antes de salir del laboratorio.
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Calcule los rendimientos de sustrato en producto obtenidos (Yp/s) Calcule los rendimientos de sustrato en biomasa obtenidos (Yx/s) Consulte qué otros microorganismos son utilizados para la producción de glucoamilasa. Consulte el diagrama de flujo utilizado a nivel industrial para la obtención de esta enzima. Investigue en qué procesos es utilizada esta enzima.
6. REFERENCIAS:
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 10 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y PARÁMETROS DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN (Vmax y Km)
1. INTRODUCCIÓN: La búsqueda de información para encontrar información para determinar las propiedades de las enzimas, para su uso a nivel industrial en el diseño de bioreactores es necesario discriminar modelos que nos permitan calcular la velocidad intrínseca de reacción, uno de los modelos mas usados son los modelos de Michaelis – Menten y Briggs y Haldane. El mecanismo del modelo de Michaelis - Menten se puede describir de la siguiente manera: k 1
E S
k 3
E P
ES k 2
k 4
E : Enzima S: Substrato ES: Complejo enzima-substrato P : Producto K : Constantes de reacción. Cuando se mezcla la enzima mas el substrato, se forma un complejo ES e inmediatamente, se rompe para formar E + S e E + P . Para Conseguir el modelo matemático, Michaelis - Menten se asume lo siguiente: a – El estudio se basa en velocidades iniciales, la concentración de producto en este caso puede ser considerada despreciable, de forma que la reacción inversa prácticamente ocurrirá. b – la mezcla de enzima con el substrato ocurre la formación de un complejo ES, que permanece a una concentración constante, d [ ES ] 0 dt
complementando tenemos:
d [ ES ]
dt
[ E ][S ] K 1 [ E ][ P ] K 4 [ ES ] K 2 [ ES ]K 3 0
K 2 K 3 K 1
[ E ][S ] [ ES ]
Km
Nota: la constante Km, es la constante de Michaelis-Menten, puede ser aproximadamente igual la constante de disociación del complejo [ES], así la constante K3 es generalmente menor que K1 y K2, asi mismo: K 2 K 3
Km
K 1
K 2 K 1
Por otro lado, el total de enzima que participa en la reacción [Eo] es igual a suma de la enzima libre [E] con una enzima en forma de complexo [ES], que será: E 0 E ES
Visto así K3 es menor que K1 e K2, la transformación de ES en E + P será la etapa limitante del proceso, que es v K 3 E 0
De la misma forma, toda la enzima esta participando da reacción, entonces la velocidad de reacción estará en su máximo: v max
K 3 E 0
entonces tenemos: [ E ][S ] v v max
v
[ ES ] [ Eo]
v max
Km
[ E ] [ ES ]
[ S ] Km
[ S ]
[ E ][S ] Km
[ E ]
: Ecuación
[ E ][S ]
[ S ] Km
[ S ]
Km
de Michaelis-Menten
De esta ecuación se tiene que: Se [S] >> Km v = v max (reacción de orden cero)
Se [S] << Km Se
v
v max
2
v
v max Km
[ S ]
(reacción de primer orden)
Km = [S]
La determinación de las constantes Km e v max de Ecuación de Michaelis-Menten é difícil de ser obtenida a partir do gráfico v = fs (s), pues v max es una asintota sujeta a grandes imprecisiones. Existen maneras mas prácticas de se obtener estas constantes, siguiendo la técnica de linearizacion de ecuación. Existen 3 tipos corrientes de linearizaçion para a ecuación de Michaelis-Menten: Ecuación de Lineweaver- Burk, Ecuación de Eadie-Hanes y ecuación de Hofstee,
2. OBJETIVO: Medir la actividad enzimática de una glucoamilasa fúngica (A. niger) y los parámetros de Michaelis-Menten (Vmax y Km) en diferentes condiciones de reacción (Concentración de sustrato, Velocidad de agitación y temperatura).
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales:
Biorreactor de 500 ml (Erlenmeyer) Agitador magnético pHmetro Balanza analítica Balones aforados Estufa Pipetas Termómetros
b) Reactivos:
Maltosa Bufer citrato y fosfato NaOH 0,1N HCl 0,1N
DNS
4. PROCEDIMIENTO:
Preparar 5 soluciones de maltosa con las siguientes concentraciones: 5%, 10%, 15%, 20% y 25% en biorreactores de 500 ml.
Estabilizar el pH a 4,3 con una solución Buffer citrato; HCl o NaOH 0,1N; dependiendo del pH inicial.
Estabilizar la temperatura de biorreacción según se asigne a cada grupo (25ºC, 45ºC y 65ºC).
Estabilizar la velocidad de agitación según se asigne a cada grupo (200, 400 y 600 rpm).
Realizar una dilución en agua destilada (1:50) de la enzima glucoamilasa fúngica a utilizar (densidad 1,2 gr/ml).
Adicionar 1 ml de solución enzimática en cada biorreactor agitado continuamente bajo las condiciones ambientales de cada trabajo.
Tomar, exactamente, 1 ml de muestra en los siguientes tiempos: 0, 5, 10, 15, 20, 25, y 30 minutos de biorreacción.
Inactivar la enzima en agua hirviendo (100ºC) durante 5 minutos, posterior choque térmico en baño de hielo (4ºC).
Determinar la concentración de glucosa (Producto) presente en cada muestra utilizando la técnica del DNS.
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Calcular la actividad enzimática de la glucoamilasa fúngica (A. niger) expresada en U.I (cantidad de la enzima que produce 1 mol de glucosa/minuto) y en AGU (1 AGU es la cantidad de enzima que fragmenta 1 mol de maltosa/minuto). Calcular el número de recambio de la enzima (# moléculas de sustrato transformadas por unidad de tiempo por molécula de enzima). Graficar la formación de producto en función del tiempo ( [P] vs [t] ) y calcular las velocidades iniciales para cada concentración de sustrato. Graficar las velocidades iniciales en función de cada concentración de sustrato ( [Vel.] vs [S] ). Determinar los parámetros de Michaelis-Menten (Vmax y Km) utilizando los métodos de Limeweaver-Burk, Eadie-Hofstee y Langmuir.
6. REFERENCIAS:
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATOIOS DE BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 11 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY
1. INTRODUCCIÓN: Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin – Ciocalteu para dar un complejo de color azul (debido a la reacción del cobre alcalino con la proteína). La intensidad del color depende del número de aminoácidos aromáticos y enlaces peptídicos presentes. El color cambiará según la clase de proteína. La solución azul muestra una absorbancia máxima a 750 nm. Las variaciones por este método pueden ser debidas por el pH, el tiempo de la reacción, la concentración de los reactivos o las interferencias de sustancias como azúcares y productos celulósicos. En este método el color no es estrictamente proporcional a las concentraciones más altas de proteínas. Este método es desaconsejable cuando las muestras presentan un fuerte contenido de ligno – celulosa y/o contienen fenoles; además, tiene un rango de linealidad entre 0 – 300 mg/L . Dentro de sus principales ventajas está el permitir la medición del contenido de proteínas en fracciones enzimáticas, mediciones en mezclas de tejidos con proteínas y mediciones de cantidades muy pequeñas de proteínas o de soluciones muy diluidas.
2. OBJETIVO: Ofrecer al estudiante una técnica rápida y sencilla para la determinación de proteínas enzimáticas en caldos de fermentación.
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales:
Espectrofotómetro Balanza analítica Agitador de tubos (Vortex) baño de maría Centrífuga Tubos de ensayo Gradillas Pipetas de 1 y 5 ml Balones aforados de 100 o 50 ml Frasco de color ámbar.
b) Reactivos:
Tartrato doble de Na y K. Carbonato de calcio Sulfato de cobre Reactivo de Folin – Ciocalteu Seroalbúmina bovina Agua destilada
4. PROCEDIMIENTO:
Realizar una curva de calibración de 0 a 300 mg/L. En 7 tubos de ensayo que estén muy bien lavados, adicione: 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ml de solución de seroalbúmina bovina y completar a 1 ml con agua destilada. A 1 ml de muestra, convenientemente diluida, y a cada tubo de la curva patrón, adicionar 0,5 ml de NaOH 2 N y agitar en vortex. Calentar sin agitación en baño de maría a temperatura de ebullición durante 10 minutos. Enfriar en baño de hielo y adicionar 0,5 ml de ácido sulfúrico 2,6 N y agitar en vortex. Adicionar 0,9 ml de solución A y agitar en vortex. llevar a 50 ºC por 10 minutos y posteriormente enfriar.
Adicionar 0,1 ml de solución B y agitar en vortex; reposar en la oscuridad por 10 minutos. Adicionar 3 ml de solución C y agitar en Vortex; llevar a 50 ºC por 10 minutos y enfríar. Leer la absorbancia a 750 nm.
4.1. PREPARACIÓN DE REACTIVOS:
Solución A: Disolver o,5 g de tartrato de sodio y potasio en 12 ml de agua destilada y 25 g de carbonato de sodio en 125 ml de NaOH 0,1N.
Solución B: Disolver 1 g de sulfato de cobre en 90 ml de agua destilada y 20 g de tartrato de sodio y potasio en 10 ml de NaOH 1N.
Solución C: Diluir el reactivo de Folin-Ciocalteu con agua destilada en relación 1:14 al momento de usarlo.
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Grafique la curva de calibración (linealizada) para la determinación de proteínas por el método de Lowry. Muestre todos los resultados obtenidos. Calcule el valor de R2.
Calcule la concentración de proteínas en la muestra problema.
Consulte otros métodos utilizados para la determinación de proteínas en extractos enzimáticos. ¿Qué ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnología?.
6. REFERENCIAS:
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 12 AISLAMIENTO DE ENZIMAS POR PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO 1. INTRODUCCIÓN: El aislamiento de enzimas es un proceso de fundamental importancia en biotecnología alimentaria, especialmente cuando tenemos disponibles caldos o extractos donde se encuentran solubilizadas varias proteínas enzimáticas extraídas de una misma célula microbiana. La solubilidad de una proteína depende de la cantidad presente y de la concentración de la sal presente en la solución. A concentraciones bajas, la presencia de sal estabiliza varios grupos cargados de la molécula de proteína, atrayendo así proteínas a la solución y aumentando la solubilidad de la proteína. Esto es comúnmente conocido como Salting-in . Sin embargo, cuando la concentración de sal es aumentada, se alcanza un punto de máxima solubilidad de la proteína . Además, si se incrementa la concentración de sal, esto implicará que menos agua habrá disponible para la solubilización la proteína. Finalmente, la proteína comienza a precipitar cuando no hay suficientes moléculas de agua para interactuar con las moléculas de proteínas. Este fenómeno de precipitación en presencia de sales en exceso es conocido como Salting- Out . Muchos tipos de sales han sido empleadas para efecto de separación y purificación de proteínas. De estas sales, el sulfato de amonio ha sido la más ampliamente utilizado debido a su alta solubilidad y bajo costo. Como las enzimas son proteínas, la purificación puede ser llevada a cabo siguiendo el mismo procedimiento de una proteína; pero se debe poner mucha atención para evitar la perdida de la actividad enzimática por desnaturalización bajo condiciones adversas.
2. OBJETIVO: Recuperar enzimas por precipitación con sulfato de amonio a partir de soluciones que las contengan.
3. MATERIALES Y REACTIVOS a) Materiales:
Tubos ependorf Pipetas Balanzas Centrifuga Buretas
a) Reactivos:
Solución de enzimas Solución saturada de Sulfato de amonio (NH4)2SO4
4. PROCEDIMIENTO:
Para la solución saturada de sulfato de amonio: Adicione 750 g de sulfato de amonio a 1000 ml de agua destilada en un beaker; agite la solución a la temperatura del laboratorio con un agitador magnético durante 15 minutos hasta saturación. Deje decantar el sobrenadante después que los sólidos no disueltos hayan sedimentado. No es necesario filtrar.
4.1. Aislamiento de Fungal Glucoamilasa.
Realice la lectura de la absorbancia de la solución de enzima a utilizar en un espectrofotómetro a 577 nm. de longitud de onda. Esta medida será usada en el calculo del rendimiento de recuperación de la enzima. Pipetear 4 ml de la solución de glucoamilasa cuya concentración debe estar en 20 g/L de la enzima. Adicione por goteo lento, mientras agita, solución de sulfato de amonio saturada hasta que se empiece a formar un precipitado. Realice la lectura del volumen de sal gastado Es importante evitar la no uniformidad de la concentración de la sal durante su adición. Concentraciones localizadas o puntos muertos podrían iniciar prematuramente la precipitación de otras proteínas y afectar la pureza de la proteína
a cristalizar. Es de anotar que la precipitación de la proteína no es instantánea, y esta podría llegar a requerir de 15 a 20 minutos para alcanzar el equilibrio. Centrifugar la mezcla a 10000 rpm por 15 minutos. Recolecte el precipitado muy cuidadosamente, descargando el sobrenadante lentamente con ayuda de una pipeta. En caso que los cristales de la enzima precipitados al adicionar la sal no sean demasiado pequeños, se puede obviar la centrifugación y proceder con una filtración. Reconstituya la solución original de la enzima adicionando 4 ml de agua destilada al precipitado. Esta agua puede ser adicionada así : Primero 2 ml y agite para redisolver el precipitado, transfiera la mayor cantidad posible de esta solución en otro tubo limpio. Continúe lavando el primer tubo con otro ml de agua y adiciónelo también en el segundo tubo donde reposan los 2 ml. Finalmente, adicione el resto de agua para completar los 4 ml en este tubo. Mida la absorbancia de la solución de enzima reconstituida con un espectrofotómetro a 577 nm. de longitud de onda
4.2. Aislamiento De Proteasas:
Proceda de igual forma que en el asilamiento de la fungal glucoamilasa; excepto que debe adicionar 4 ml de una solución de Proteasa y el sobrenadante puede ser retirado por centrifugación.
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
Del volumen de sulfato de amonio saturado adicionado a la solución de proteína para la precipitación, calcule la concentración en términos de porcentaje de saturación. A partir de la absorbancia leída antes y después del aislamiento, calcule el porcentaje de la enzima recuperada. Consulte otros métodos para el aislamiento de enzimas. Ventajas y desventajas.
6. REFERENCIAS: - JAKOBY, W.B. Crystallization as a purification technique, Enzyme Purification and Related Techniques, in Methods in Enzymology; Vol. 22; Jakoby, W.B, Academy Press, 1971.
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 13 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS CON ALGINATO DE SODIO 1. INTRODUCCIÓN: El método de atrapamiento de enzimas en alginatos es el método más simple de inmovilización. Los alginatos son disponibles comercialmente como alginatos de sodio solubles en agua. El Alginato, comercialmente está disponible como ácido algínico, sal de sodio y comúnmente llamado Alginato de sodio, es un polisacárido lineal aislado normalmente desde algas marinas, de allí el nombre de Alginato. El coopolimero consiste de dos ácidos urónicos: Ácido D- Mannurónico (M) y Acido L- Gulurónico, que es el componente de los esqueletos de las algas, y tiene propiedades fuertes y flexibles. El ácido algínico puede ser soluble o insoluble en agua dependiendo del tipo de sal asociada, en sales de sodio, álcalis metálicos y amonio es soluble, mientras que en sales de cationes polivalentes Ej. Calcio, es soluble con excepción del magnesio. Los cationes polivalentes son los responsables del entrecruzamiento de las moléculas poliméricas. El proceso simplemente cambia iones calcio por iones sodio
2 Na(Alginato) + Ca++ -------> Ca(Alginato)2 + 2 Na+ El enlace iónico que forma la estructura del gel es termoestable sobre un rango de 0 a 100 ºC; sin embargo es fácilmente redisuelto por inmersión del gel de Alginato en una solución conteniendo altas concentraciones de sodio, potasio y magnesio. Manteniendo la relación sodio: calcio 25:1 ayuda a la desestabilización del gel, en todo caso se recomienda incluir iones de calcio 3 mM en el sustrato. Por otra parte, búferes de citrato o fosfato pueden causar desestabilización del gel de Alginato. El Alginato es ampliamente usado en los productos alimenticios, farmacéuticos, textiles y la industria del papel. Por las propiedades del Alginato es utilizado como espesante, estabilizante, formación de geles y formación de películas
2. OBJETIVO: Inmovilizar enzimas utilizando la técnica de inmovilización por atrapamiento con Alginato de sodio.
3. MATERIALES Y REACTIVOS: a) Materiales
Beakers Probeta Graduada Balanza Pipetas Gotero o jeringa Agitador de vidrio
b) Reactivos
Alginato de sodio CaCl2 Enzimas
4. PROCEDIMIENTO:
Prepare una solución de 2 al 4% (W/W) de Alginato de sodio con una solución buffer apropiada para el funcionamiento de la enzima. Adicione Alginato de sodio en polvo a agua en agitación y no al contrario para evitar la formación de grumos, continúe con la agitación hasta completa disolución, deje en reposo por 30 minutos para eliminar burbujas de aire que puedan quedar atrapadas posteriormente y producir flotación de las esferas formadas. Preparar una solución de cloruro de calcio (CaCl2 .6H2O) 0.15 a 0.2 molar Disolver de 15 a 20 mg de enzima en 1.0 ml del buffer preparado para la enzima. Disolver esta cantidad de enzima En 50 mililitros de solución de Alginato. Las perlas o esferas se forman por goteo de la solución de Alginato ya sea por gotero o jeringa a una altura suprior a 20 cm sobre la superficie de la solución de cloruro de calcio previamente agitada ( ver figura) , el tamaño de las perlas dependerá de la presión que se ejerza sobre el Alginato por el equipo que produzca el goteo; el tamaño parea estas condiciones es de aproximadamente de 0.5 a 2 mm de diámetro.
Mantenga la agitación de la solución por 20 – 30 minutos. antes de filtrar las perlas. Lave las perlas con una cantidad apreciable del buffer apropiado Manténgalas en un lugar fresco bajo condiciones de esterilidad para su posterior uso.
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
¿Es posible la utilización de Alginato en la inmovilización de células?, explique las ventajas y desventajas. Explique un modelo teórico que explique la perdida de actividad Enzimática en la utilización de enzimas inmovilizadas ¿Cómo determinaría usted experimentalmente la perdida de Actividad Enzimática en la inmovilización de enzimas?
6. REFERENCIAS:
S. Ohlson, P.-O. Larsson, and K. Mosbach, Steroid transformation by living cells immobilized in calcium alginate, European J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 7, 103, 1979. J. Vaija, et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 7, 51, 1982. J. M. Lee and J. Woodward, Biotech. Bioeng., 25, 2441, 1983. F. Gordon, immobilization of encimes and cells, Methods in Biotechnology, Humana Press, 1977
UNIVERSIDAD DE SUCRE PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGÍA EXPERIMENTO Nº 14 EVALUACIÓN EXPERIMENTAL DEL CALOR GENERADO POR METABOSLIMO MICROBIANO 1. INTRODUCCIÓN: Las células consumen los sustratos que proveen la energía y las materias primas requeridas para la síntesis de nueva masa adicional. La energía libre de las sustancias nutritivas utilizadas es mayor que la de las células y productos del metabolismo. Las células utilizan eficientemente la energía química, pero, como en todos los procesos reales, parte de la energía disponible en el sustrato es liberada como calor. El balance de energía de un proceso es uno de los aspectos importantes de la Biotecnología Alimentaria por la necesidad de mantener una temperatura óptima para crecimiento o para formación de productos. El calor generado por metabolismo o calor de reacción puede calcularse a partir de una serie de mediciones de la temperatura media del caldo de fermentación en un reactor operado en condiciones inestables y realizando el respectivo balance de calor en el sistema (Aproximación de Uhlich). El biorreactor puede ser un tanque provisto de agitación, intercambiador de calor y sensor de temperatura. Las pérdidas de calor por radiación y evaporación son despreciables.
2. OBJETIVO GENERAL: Realizar el balance de energía en un proceso de fermentación discontinuo operado en estado inestable y evaluar experimentalmente el calor generado por la actividad metabólica durante el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en una fermentación batch sumergida.
3. MATERIALES Y REACTIVOS: b) Materiales:
Biorreactor de 6 Litros, tipo batch con agitación mecánica y serpentín de enfriamiento. Baño termostatado con recirculación de agua. Termómetros Soportes Mangueras para recircular el agua Erlenmeyer de 500ml
c) Reactivos:
Cepa de Levadura (Saccharomyces cerevisiae ) Medio de crecimiento (Diseñado y formulado por el estudiante) Agua destilada Glucosa Sulfato de Amonio Fosfato de Potasio Sulfato de Sodio
4. PROCEDIMIENTO:
Realizar, con buenas prácticas microbiológicas, un preinóculo (600 ml) con el mismo medio que va a ser utilizado para la fermentación. Incubar por 18-24 horas. La fórmula empírica de la levadura a utilizar es: CH1.64N0.16O0.52P0.01S0.005.
Realizar el montaje del biorreactor de 6 litros con sistema de agitación mecánica, aireación, serpentín de enfriamiento, termómetros y adaptado al baño termostatado con recirculación de agua. (Ver figura).
Inocular el preinóculo al caldo de fermentación en un 10% del volumen final a trabajar en el experimento (5400 ml de caldo + 600 ml de preinóculo).
Iniciar el bioproceso en condiciones estables, (dT/dt)=0, activando todos los sistemas que intervienen (Agitación 300 rpm, recirculación de agua a la temperatura inicial del caldo). Tomar la lectura de temperatura cada 5 minutos durante los primeros 40
minutos. Ir graficando la temperatura registrada en función del tiempo (Ver grafica). Esta primera etapa corresponde al período comprendido entre t=A y t=B. El intercambiador remueve el calor generado en el biorreactor. La ecuación de balance de energía aplicable en esta etapa del ensayo es:
QMET + QAG = QINT = FMa.CpA.(TFE – TFA)
(Ec. 1)
Donde, QMET, QAG, QINT = Calor generado por metabolismo, calor generado por agitación y dispersión de gases y Calor intercambiado, respectivamente., (KW ó Kj/s).
FMa= Velocidad de flujo de masa de agua (Kg/s) CpA = Calor específico del agua (Kj/Kg.ºC). TFE – TFA = Temperaturas del agua efluente y afluente al intercambiador, respectivamente, (ºC).
Desconectar el sistema de recirculación de agua (Intercambiador). Realizar las lecturas de temperatura cada 20 minutos durante 120 minutos. En esta etapa el calor de intercambio es Cero (QINT =0), en el tiempo t=B, seguir graficando.
El calor generado por metabolismo se acumula en el sistema y la ecuación de balance de energía aplicable en esta etapa es:
QMET + QAG = QAC
(Ec. 2)
QAC = V.CP.(dT/dt) =V. HR.rS
(Ec. 3, Uhlich))
Donde: QAC = Calor Acumulado en el Biorreactor (KW) (dT/dt) = Variación de la temperatura del caldo de fermentación con el tiempo, (ºC/s). Es la pendiente de la curva en le figura entre t = B y t = C.
CP = Capacidad calorífica global del biorreactor (4,228 Kj/LºC) V= Volumen del caldo (Litros) rS = Velocidad de consumo del sustrato (Mol de C en sustrato/L.s) HR =
Calor de reacción (Kj/mol de C en sustrato)
Finalmente, el intercambiador se conecta nuevamente en el tiempo t= c (Ver figura). El calor acumulado en el reactor es removido del sistema y la ecuación de balance de energía aplicable en esta etapa del experimento, inmediatamente después de t= c es:
QAC = QINT
La velocidad de consumo del sustrato se realizará cada 20 minutos utilizando la técnica del DNS para determinar glucosa.
Fig.1 MONTAJE DEL BIORREACTOR. Motor (TFe) H2O Termómetro
(T Fa) H2O Aislante Térmico
Aire Bomba de Aire