MANUAL DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

Microbiología General PROGRAMA TEÓRICO

Materia: Microbiología General Semestre: Quinto Semestre: Clave: 0328 Carácter: Obligatorio Departamento Departam ento de Ciencias Químico Biológicas A ro ecuarias

Contenido. I.

Introducción. II. Desarrollo histórico de la microbiología. III. Fundamentos de la microbiología. IV. Genética microbiana. V. Relación huésped- parásito. VI. Control del desarrollo bacteriano.

VII. Impacto de los microorganismos microorganismos en la Ing. Genética y la Biotecnología. VIII. Interacción e impacto de los microorganismos en el medio ambiente.

Q. B. Rosa Amelia Vázquez Curiel [email protected] I.- INTRODUCCIÓN

Definición:

La Microbiología se define etimológicamente del Griego MICROBIO y del griego LOGOS que significa tratado. Es una ciencia que estudia o que trata de los organismos vivos invisibles a simple vista o de tamaño microscópico. Éstos se denominan MICROBIOS, MICROORGANISMOS o PROTISTAS.

Alcances de la Microbiología: La Microbiología es una ciencia que se dedica al estudio de las regularidades que rigen la vida y el desarrollo de los microorganismos; así como sus características, relaciones mutuas y su relación con otros grupos de organismos. Algunos microorganismos son útiles y otros dañinos que causan alteraciones tanto en el organismo humano, animal, vegetal, como en la naturaleza inanimada. El desarrollo de la microbiología, al igual que el de otras disciplinas científicas, se halla en estrecha dependencia de los medios de producción, de las demandas de la práctica y con el  progreso general de la ciencia y de la tecnología. De acuerdo con las necesidades de la sociedad, la microbiología se dividió en las siguientes rama ramas: s:

MICR MICROB OBIO IOLO LOGÍ GÍA A

GENE GENERA RAL, L,

AGRÍ AG RÍCO COLA LA,,

INDU INDUST STRI RIAL AL,,

MÉDI MÉDICA CA,,

SANITARIA y VETERINARIA. Y actualmente se han formado, además, la microbiología del mar y la cósmica. La microbiología médica moderna se ha convertido en una extensa disciplina que se subdivide en BACTERIOLOGÍA, ciencia de las bacterias (agentes etiológicos de muchas enfermedades infe infecci cciosa osas); s); la VIRO VIROLO LOGÍ GÍA, A, cien cienci ciaa de los los viru virus; s; INMU INMUNO NOLO LOGÍA GÍA,, cien cienci ciaa de los los mecanismos de defensa del organismo tanto contra los agentes patógenos como para los no  patógenos; MICOLOGÍA, que se dedica al estudio de los hongos patógenos para el ser  hum humano; ano; y la PROT PROTOZ OZOO OOLO LOGÍ GÍA A cuyo cuyo ob objjeto eto de inv nves esti tiga gaci ción ón son son anim animal ales es monomoleculares patógenos. Además la microbiología médica estudia los mecanismos de infección, los métodos de diagnóstico de laboratorio, el tratamiento y la profilaxis específicas de las enfermedades infecciosas.

La micr microbi obiol ologí ogíaa como como cien cienci ciaa indep indepen endi dien ente te,, dispo dispone ne de un unaa meto metodo dolo logí gíaa propi propiaa de investigación que permite resolver muchos problemas de gran importancia para la salud  pública. Los métodos microbiológicos se aplican ampliamente en otras disciplinas médicas tanto teóricas como clínicas. La microbiología es una ciencia que es relativamente joven. El mundo de los microorganismos se descubrió hace poco más de 300 años y hubieron de pasar otros 200 años antes de que se apreciase y se comprendiese el significado real de los microorganismos. Durante los últimos 40 años, la microbiología ha emergido como un campo muy significativo de la Biología. Hoyy los Ho los micr microo oorg rgan anis ismo moss son son util utiliz izad ados os por por los los inve invest stig igad ador ores es para para el estu estudi dioo de  prácticamente de todos los fenómenos biológicos principales. Precisamente hasta 1870 no se comprendía ni se aceptaba su papel como agentes causantes de enfermedades. Y fue más o menos entonces cuando se estableció que los microorganismos realizaban muchas funciones vitales en nuestro medio ambiente. Existe una gran variedad variedad de población población de microorganis microorganismos mos y se encuentran prácticamente prácticamente en todas partes de la naturaleza. Están presentes en las corrientes de agua, lagos, ríos, océanos. Estos son transportados por las corrientes de aire desde la superficie de la tierra a partes más altas de la atmósfera y desde allí llegan a cientos de miles de nuevas localizaciones. Están sobre nuestro cuerpo y en nuestra boca, nariz y otros orificios del cuerpo. En un solo estornudo es posible expeler millones de microorganismos al autor no inmediato o los microorganismos son más abundantes allí donde los nutrientes, la humedad y la temperatura son adicionados para su crecimiento y multiplicación. Los microorganismos son responsables de muchas enfermedades que han sido plaga de las civilizaciones durante siglos.

Ante An tess que se descu descubri briese ese que que los los micr microor oorgan ganis ismo moss eran eran causa causant ntes es de enfer enferme meda dades des antiguamente moría bastante gente por brotes de enfermedades como difteria, viruela, peste, etc. Actu Ac tual alme ment ntee graci gracias as a los los descub descubri rimi mient entos os hecho hechoss en micr microbi obiol ologí ogía, a, la medi medici cina na ha conseguido mayores éxitos en el diagnóstico, prevención y curación de enfermedades. Y por  lo tanto ha disminuido el número de muertes. El estudio de los microorganismos ha contribuido en gran manera a lo que hoy se sabe de genética y de metabolismo. Algunos de los microorganismos se han considerado como fuentes de proteínas. Sin embargo, la prevención de la enfermedad fue uno de los primeros puentes hacia los que se enfocó la microbiología y sigue siendo uno de los principales objetivos.

Campos de aplicación de la microbiología Por lo general los microbiólogos suelen especializarse en el estudio de determinados grupos de microorganismos. Hablando con propiedad se tienen las siguientes disciplinas: Bacteriología, Protozoología, Parasitología, Micología, Ficología y Virología. Estas ramas estudian un determinado grupo de microorganismos: a) BACTERIOLOG BACTERIOLOGÍA: ÍA: Se dedica dedica al estudio estudio de de las bacterias, bacterias, aunque aunque a veces veces se utiliza utiliza como sinónimo de microbiología.  b) PROTOZOOLOGÍA: Es una rama de la parasitología que se encarga de estudiar  exclusivamente a los protozoos. c) PARASIT PARASITOLO OLOGÍA: GÍA: Es una discip disciplin linaa que abarca el estudio estudio de los protozo protozoos os y de otros microorganismos y macroorganismos parásitos.

d) MICOLOGÍA. Es una rama de la microbiología que trata el estudio de los hongos, como son las levaduras y los mohos. e) FICOLOGÍA: Es una rama que se encarga del estudio de las algas. f) VIROLOGÍA: Es una ciencia que se encarga del estudio de los virus. Cabe mencionar que estas disciplinas no abarcan todos los aspectos microbiológicos,  por lo que no es raro que exista una mayor especialización en algunos aspectos biológicos de un grupo específico de microorganismos, ejemplo: la genética bacteriana, la ficología de las algas, citología de las bacterias, etc. Ahora, si se toma en cuenta la variedad y la significación de la actividad de los microbios se puede observar el gran campo de aplicación de la microbiología de los que se menciona lo siguiente: MICROBIOLOGÍA MÉDICA. Por lo general los microorganismos se van conociendo  por el tipo de enfermedad que causan tanto a los seres humanos, como animales y plantas. La rama de la microbiología que se encarga sobre el estudio de los microorganismos que  producen enfermedades en el hombre es la microbiología médica

Regresar  II. DESARROLLO HISTÓRICO DE LA MICROBIOLOGÍA La historia de la microbiología se basa en los logros de muchos científicos, de los cuales desafortunadamente se dan a conocer relativamente muy pocos nombres y acontecimientos que son los más destacados. Aunque muchas contribuciones importantes de personas nobles han sido olvidados y opacados por otras que tal vez no sean tan importantes, la investigación sigue adelante. Indudablemente que el mérito no es para el primero que se le ocurrió la idea, sino para aquel que convence al mundo.

De esta manera, aparecen los nombres más famosos de personas que convencieron ya sea desarrollando una técnica, ideando un instrumento o exponiendo algún concepto, que explica sus hallazgos claramente y con atracción; y que finalmente fue adoptado, de tal forma que la ciencia floreció y evolucionó. Se mencionará aquí algunos datos históricos, que nos servirán principalmente para comprender el origen de la microbiología como ciencia, así como la importancia que ésta tiene en el campo de la investigación.  No fue, sino a partir de 1865, cuando se vislumbraron mayores progresos en la comprensión de los microorganismos y de sus actividades. Adelantos verdaderamente importantes que se lograron como resultado de las investigaciones. Las relaciones que hiciera Leeuwenhoek sobre la ubicuidad de los microorganismos, por  ejemplo, permitieron que 200 años más tarde, Louis Pasteur, descubriera la participación de estos microbios en las reacciones de fermentación. A Koch, Smith y a muchos otros; descubrir  la relación de los microorganismos con las enfermedades. A Galileo y Robert Hooke, en 1610 y 1665 respectivamente se deben las primeras nociones de los microscopios. En su constitución eran más semejantes a los modernos que los fabricados  por Leeuwenhoek, aunque los lentes de éste eran mejor tallados. Leeuwenhoek describió los organismos que otros ya habían visto, no se duda que vio  bacterias, hongos y muchas formas de protozoos. El descubrimiento de los microbios espoleó el interés en el origen de las cosas vivas y despertó una fiebre de argumentos y especulaciones. En 1749, John Needham (1713-1781), experimentando con carne expuesta a cenizas calientes observó la aparición de organismos que no estaban presentes al principio del experimento.

Spallanzani (1729-1799) hirvió caldo de carne durante 1 hora y después selló los frascos. No aparecieron los microbios. Dos investigadores independientes, Franz Schulze (1815-1873) y Theodore Schwann (18101882) respondieron a las investigaciones de los dos anteriores, unos 60 ó 70 años después, exponiendo los cultivos al aire y no aparecieron los microbios. Aún así, partidarios en extremo de la generación espontanea no se convencieron. Aproximadamente en 1850, Schröder y Von Dusch llevaron a cabo un experimento más convincente haciendo pasar aire a través de algodón en los frascos que contenían caldo calentado y no hubo desarrollo. Por último el concepto de la generación espontanea que resucitado por última vez por  Pouchet, quien publicó en 1859 un extenso estudio probando su existencia, pero Pouchet carecía del ingenio, el ímpetu y el tesón de Louis Pasteur (1822-1895). Y fue Pasteur quien llevó a cabo experimentos que pusieron punto final a la discusión,  publicando sus resultados en 1864. Sus frascos no produjeron signos de vida. Louis Pasteur empezó su brillante carrera como profesor de química en la Universidad de Lille, Francia. Estudió métodos y procesos que intervenían en la producción (vinos y cerveza) para que fueran de buena calidad y constante. Observó la fermentación que llevaban a cabo los microbios para obtener alcohol a partir de las frutas y los granos. Pasteur señaló que los microbios no deseables podrían ser eliminados por calentamiento, lo que no alteraba el aroma de los jugos, pero sí para hacer inocuos a los microorganismos.

Observó que manteniendo los jugos a una temperatura de 62º C por media hora se lograba lo anterior, y que actualmente se conoce como proceso de pasteurización, utilizado ampliamente en la industria. Investigó por años sobre la enfermedad pebrina (enfermedad en el gusano de seda) a solicitud del gobierno francés, debido al daño que este gusano estaba ocasionando en la industria francesa, y finalmente pudo aislar el parásito causante de la enfermedad. Seguidamente, Pasteur tropezó con el problema del carbunco, enfermedad de bovinos, de ovejas y a veces en los seres humanos. Después de aislar a los microbios a partir de la sangre de animales enfermos los cultivó en frascos de laboratorio. Robert Koch (1843-1910) médico meticuloso y que a veces se olvidaba de ejercer su profesión  para jugar con la nueva y fascinante ciencia como la bacteriología, trabajaba al mismo tiempo sobre la enfermedad del carbunco en Alemania. Él fue quien descubrió los bacilos típicos con puntos angulosos en la sangre de bovinos que habían muerto de carbunco. A partir de estos experimentos examinó y aisló el microorganismo y fue cuando por primera vez se demostró su relación con la enfermedad. De ésta se establecieron los postulados de Koch, que son los siguientes: a) El organismo específico ha de encontrarse siempre asociado a la enfermedad.  b) El organismo ha de ser aislado y obtenido en cultivos pero en el laboratorio. c) Este cultivo puro inoculando a un animal susceptible produce enfermedad. d) Debe recuperarse el organismo en cultivo pero del animal infectado experimentalmente.

En cuanto al concepto de cultivo puro Joseph Lister, en 1878, obtuvo por primera vez cultivos  puros (cultivo axénico) de bacterias por diluciones seriadas en medios líquidos, obteniendo de esta manera un solo y verdadero tipo, al que Lister llamó Bacterium lactis. Mientras tanto Koch perfeccionó sus métodos para el estudio de las bacterias. El descubrimiento de cultivos sólidos fue una de sus más grandes contribuciones. Koch ideó diferentes técnicas con las que estudió muestras de pacientes con tuberculosis y después de una serie de pruebas anunció el microorganismo que causa la tuberculosis. Cabe recalcar que la utilización de cultivos puros tiene gran importancia no solo en el estudio de poblaciones infectadas sino en los avances que se han tenido en otras ramas, como la microbiología marina, microbiología del conducto intestinal y otras las cuales requieren: 1. Del conocimiento de la fisiología de microorganismos individuales en cultivo puro. 2. De las relaciones ecológicas de la totalidad de las poblaciones microbianas en un medio dado. Pasteur continuó sus investigaciones en la prevención de las enfermedades infecciosas y alrededor de 1880 aisló el germen causante del cólera de las gallinas, mediante cultivos puros. Esta técnica ideada por Koch en cuanto a obtención de cultivos puros, le sirvieron para muchos ensayos en los que tuvo éxito; los mismos que utilizó para la inoculación de pollos sanos, este experimento lo consternó puesto que los pollos no enfermaron, ni murieron. Revisando cada paso de su experimento encontró que en la inoculación había utilizado los cultivos puros viejos en lugar de los nuevos que había preparado. Esto lo llevó a repetir el experimento pero inoculando de los dos tipos de cultivo a diferentes grupos de pollos, lo que le sirvió para demostrar el principio de inmunización. Esta demostración explicaba el principio en el que se fundamenta el éxito de Jenner al aplicar  el virus de la viruela bovina, en 1798, para inmunizar a las personas contra la viruela humana.

Posteriormente Pasteur aplicó este principio a la prevención del carbunco, observando con satisfacción los mismos resultados. A los cultivos viejos (atenuados) los llamó vacunas, término derivado de la palabra vaca en honor de Jenner y aplicó el término vacunación a la inmunización con cultivos de bacterias atenuadas, aunque no se tenga relación alguna con las vacas. La fama de Pasteur prevaleció en toda Francia, por lo que no fue sorprendente que se enfrentara a un mayor reto cuando se le pidió sobre una enfermedad que afectaba a los seres humanos, enfermedad transmitida al hombre por mordeduras de perros, gatos y otros animales; la rabia. El experimento consistió en la inoculación de conejos a partir de la saliva de perros rabiosos, ya que de antemano sabía que el virus era demasiado pequeño para ser visto al microscopio, nunca se había cultivado en laboratorio y que no era una bacteria. El experimento se basaba en extraer el cerebro y la médula espinal de los conejos infectados, se disecaron por varios días, se pulverizaron y se mezclaron con glicerina; esta mezcla inyectada a los perros los protegía contra la rabia. Pasteur quedó sorprendido cuando después del ensayo decisivo, un joven que había sido mordido por un lobo rabioso, no murió. Los éxitos de Pasteur y de Koch les hicieron acreedores de honores y premios por sus compatriotas. Koch llegó a ser profesor de higiene y director del Instituto de Enfermedades Infecciosas, fundado por él en la Universidad de Berlín. En gratitud a Pasteur se estableció el Instituto de Pasteur en París en 1888.

Gracias a sus aportaciones se vislumbraron horizontes más amplios para la microbiología, día a día se iban descubriendo nuevas bacterias, por muchos hombres estudiosos y discípulos de Koch y Pasteur. Estas y otras observaciones dieron lugar a la microbiología aplicada, ya que se hicieron extensivas a otras enfermedades. Después de que Edwin Klebs y Frederick Leoffler  descubrieron el bacilo de la difteria y obtuvieron sus venenos en un frasco de laboratorio, Emil Von Behring y Shibasaburo Kitazato idearon el método de producir inmunidad para las infecciones causadas por estos organismos inyectando sus toxinas (venenos) en animales para obtener una antitoxina (sustancia que neutraliza la toxina). Lo mismo hicieron Kitazato y Von Behring con los cultivos de closiridium tetani  para la prevención y tratamiento del tétanos. Poco después Von Behring recibió Premio Nobel en fisiología y medicina en 1901. A estos acontecimientos le siguieron otros como: la demostración de la inmunidad mediante inoculación de cultivos muertos de microorganismos, el descubrimiento de que las células  blancas de la sangre comían dentro de las bacterias, productoras de enfermedad por el (ruso) Elie Metchnikoff a las que llamó Fagocitos; mientras en Alemania Paul Erlich explicaba la inmunidad en base a la presencia de determinadas sustancias solubles en la sangre. Hoy en la actualidad sabemos que los dos mecanismos desempeñan sus partes. Otra aportación de Erlich importante porque dio apertura al futuro de la quimioterapia y de los antibióticos fue la observación de que un arsenical orgánico (compuesto 606 de la serie ensayada), destruía el microbio de la sífilis dentro del cuerpo. Debido a estos logros y los anteriormente expuestos, el periodo de 1880 y 1900 se considera como la primera época de oro y un paso sustancial de la infancia a la adolescencia para la microbiología. Por otro lado en el continente europeo, un cirujano inglés, Joseph Lister utilizó una solución diluida de ácido fénico como desinfectante de las heridas postoperatorias con la finalidad de combatir la infección de las mismas por microorganismos, obteniendo tan grande éxito, que la técnica se aceptó rápidamente, a la vez que sirvió para establecer los principios de las técnicas asépticas utilizadas en la actualidad.

Los microbiólogos empezaron a aparecer y de alguna manera fueron muy influidos por Koch, Pasteur y Joseph Lister. Igualmente los Bacteriólogos en Europa y América. Entre los americanos que directa o indirectamente fueron responsables del desarrollo de la bacteriología en Estados Unidos son: William, Harold, Clarence, Ernst y H. L. Russell. Puede considerarse las aportaciones por los científicos e investigadores. Pertenecieron a la  primer época de oro y comienza a abrirse un mayor auge, con el éxito de los americanos en la construcción del Canal de Panamá con la conquista de los científicos de la fiebre amarilla, al descubrir que el virus, era transmitido a los seres vivos por mosquitos. A esto le siguieron aplicaciones en el campo de la microbiología del suelo, las plantas, hasta llegar a formar parte como una de sus ramas, en el campo mas amplio de la Biología. Es entonces cuando empieza a abrirse paso la segunda época de oro de la microbiología y  principalmente hacia el año de 1945 y, que continua hasta nuestros días, al reintroducirse  bacterias y virus en la corriente principal de la biología y donde los conocimientos logrados con el estudio de los microorganismos son los fundamentos de la biología moderna, biología molecular y de la ingeniería genética. Se esbozaran algunos aspectos importantes que corresponden a la segunda época de oro ya que sería demasiado larga la lista de todos aquellos que contribuyeron al desarrollo de la microbiología, pero que si se desea dar una referencia completa se puede consultar el libro THE HISTORY OF THE BACTERIOLOGY, de William Bulloch. Las relaciones que hiciera Leewenhoek sobre la ubicuidad de los microorganismos, por  ejemplo, permitieron que, 200 años más tarde, Louis Pasteur descubriera la participación de estos microbios en la reacción de fermentación. A Koch, Smith y a muchos otros, descubrir la relación de microorganismos con la enfermedad. En 1905, Robert Koch recibe Premio Nobel por haber contribuido importantemente en la creación de la microbiología como ciencia.

Se le recuerda por haber aislado las bacterias que causan el carbunco y la tuberculosis. El trabajo de Theobald Smith sobre la transmisión de la fiebre de Texas, señaló el camino para los trabajos subsiguientes de Reed sobre la epidemiología de la fiebre amarilla. La persistencia de Paul Ehrlich, por encontrar un compuesto químico que destruyera a la espiroqueta que causa la sífilis en el ser humano y sin producir daños a las células de los tejidos, abrió paso a los logros obtenidos en el futuro, sobre el uso de compuestos químicos en el tratamiento de la enfermedad; lo cual le permitió compartir con Elie Metchnikoff, Premio Nobel en 1908. Como se puede ver, la historia no sólo trata del pasado, sino que se hace cada día, a medida que nuestros conocimientos aumentan con cada nuevo descubrimiento y cada suceso. En muchas ocasiones, el reconocimiento de una contribución científica, se retrasan durante años, por ejemplo: en 1929 Alexander Fleming publicó su trabajo sobre la acción antibacteriana de los cultivos de Penicillium, pero la importancia de este descubrimiento  básico no fue reconocido hasta 1945 y con Premio Nobel. Así, la historia de la microbiología, está llena de logros asombrosos, pero también de larga preparación para lograrlo. La microbiología inició desde que el hombre empezó a pulir piezas de vidrio y a combinarlo  para lograr amplificaciones grandes y poder observar a los microorganismos.

Evolución en los últimos años: Por ejemplo, el Premio Nobel otorgado a Enders, Robbins y Weller por su triunfo en la investigación sobre el cultivo de virus de la poliomielitis, lo cual hizo posible que Jonas, Salk, Herald Cox, Hillary Koprowski y Albert B. Sabin obtuvieran vacunas para la prevención de esta enfermedad. Fritz Lipman y Hans Krebs fueron distinguidos con el Premio Nobel en 1953, por sus estudios fundamentales sobre células vivas y por los avances sobre fisiología y metabolismo.

En 1958, Premio Nobel de medicina y fisiología Joshua Lederberg, George Beadle y Edward Tatum quienes descubrieron que los genes regulan los procesos químicos de la célula, que están organizados y que pueden alterarse por el proceso de recombinación. Desde este descubrimiento hasta 1968, se hicieron aportaciones por descubrimientos sobre los ácidos nucleicos, herencia y código genético. En 1969, el Premio Nobel de medicina fue para otros norteamericanos, Max Delbruck, Alfred D. Hershey y Salvador E. Luria quienes estudiaron procesos vitales en los bacteriófagos y ayudaron a establecer la moderna biología molecular. Otros descubrimientos en 1972 hasta 1975 sobre la estructura de anticuerpos y partículas virales de cáncer en células tumorales son parte de la misma historia que como puede apreciarse no tiene fin y permanecerá así, mientras haya hombres y mujeres con talento y dispuestos a enfrentarse a otros retos.

Nomenclatura y clasificación de microorganismos Desde hace mucho tiempo, el mundo de todos los seres vivos se ha dividido en dos reinos, el inmóvil de las plantas fotosintéticas, y el móvil, formado por animales no fotosintéticos. Tiempo más tarde, a principios del siglo XIX el mundo microbiano empezó a ser estudiado en forma sistemática, se realizaron grandes esfuerzos para adaptar a todos los nuevos organismos que fueron descubiertos, como organismos unicelulares móviles, como aquellos que tenían envoltura flexible parecida a la de las células animales. Por otro lado, las algas como eran fotosintéticas y tenían pared celular rígida igual que las células vegetales fueron consideradas como plantas; los hongos o eumicetos y las bacterias (esquizomicetos), debido a su división por hendidura transversal fueron agrupados como plantas. Esta simple clasificación en plantas y animales presentaba bastante inconsistencia, ya que los hongos y la mayor parte de las bacterias no son fotosintéticas, muchas bacterias son móviles, algunos hongos y algas poseen esporas móviles (zoosporas), etc.

La solución más lógica hasta ese momento fue la propuesta de E. H. Haeckel en 1866, zoólogo alemán, quien propuso un tercer reino biológico, el de los PROTISTAS, el cual se distingue de los animales y plantas por su organización relativamente simple. Con el desarrollo del microscopio electrónico ha sido posible profundizar en el conocimiento de la ultraestructura celular, y donde también ha sido posible reconocer dos categorías, basadas en la complejidad de su organización. Los protistas superiores o EUCARIOTES y los protistas inferiores o PROCARIOTES. Los protistas superiores o eucariotes poseen células grandes (con núcleo verdadero), muy semejante a las de animales y plantas; contienen una membrana nuclear, múltiples cromosomas en el interior de cada núcleo y un aparato mitótico que garantiza la equipartición de los elementos que resultan de la replicación cromosómica entre los núcleos hijos. En este grupo o categoría se incluyen los protozoos, los hongos y la mayoría de las algas. Los protistas inferiores o procariotes, se caracterizan por poseer células más pequeñas en las cuales el núcleo está constituido por un único cromosoma que carece de membrana nuclear, carecen de diversas estructuras rodeados por membranas. En este grupo se incluyen todas las bacterias y un grupo pequeño de algas azul-verdes (cianobacterias). ES IMPORTANTE MENCIONAR QUE LOS VIRUS NO SE INCLUYEN EN ESTA CLASIFICACIÓN, PUESTO QUE NO SE CONSIDERAN CÉLULAS Poco después Whittaker (en 1969), propuso un sistema de clasificación en cinco reinos y que en la actualidad es ampliamente aceptado, porque considera los siguientes aspectos: 

Las relaciones evolutivas



Por ser compatible con estudios recientes sobre bioquímica, genética y ultraestructura.

Los reinos propuestos son: Monera, que incluye los procariotes; Protista que incluye microorganismos eucarióticos unicelulares; Vegetal que contempla los organismos eucarióticos multicelulares y multinucleados; Animal donde se agrupan animales multicelulares y el reino de los Hongos donde se encuentran los hongos superiores multinucleados. Observando lo anterior se dará cuenta que los microorganismos se encuentran en tres de los cinco reinos: MONERA (Algas azul-verdosas y bacterias) PROTISTA (microalgas y protozoos) HONGOS (Levaduras y mohos) La ordenación de los organismos vivientes con el descubrimiento de la evolución  biológica ha pasado de una clasificación puramente descriptiva y sistemática, a una clasificación taxonómica "natural"; la cual intenta agrupar los organismos de tal forma que refleje las líneas de su ascendencia evolutiva. Una pieza clave de esta clasificación es la definición de ESPECIE, como un grupo de individuos capaces de reproducirse entre ellos en forma continuada. Los niveles superiores de la clasificación, como el género, tribu, familia, orden y clase; carece de una definición clara y práctica. La situación en las bacterias es algo distinta: el número de características disponibles  para la clasificación es mucho más limitado. Por lo tanto, no es de extrañarse que en el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, que puede considerarse como el fruto del mayor trabajo en equipo que se haya realizado en lo que se refiere a clasificación, y que, por  otra parte, es la guía más utilizada.

Este tipo de clasificación, a pesar de que es especulativa en relaciones taxonómicas, es muy útil como clave determinativa, para identificar un organismo desconocido y relacionarlo con otros organismos. Actualmente la descripción y clasificación de los organismos vivos es y ha sido un objetivo de primordial importancia, en todas las ramas de las ciencias biológicas. De esta manera, una vez que las características de un organismo queden perfectamente descritas, es posible compararlos con otros microorganismos con la finalidad de determinar y establecer similitudes, así como diferencias. Mediante la comparación de características de un gran número de microorganismos se llega finalmente a un sistema para agrupar los especímenes relacionados. Posteriormente se establece un grupo cuyos miembros tienen características muy similares al cual se le considera especie y se le asigna un nombre científico (donde el microorganismo adquiere su nombre). Es importante y necesaria la identificación ya que al conocer sus características pueden ser de utilidad: 

Para estudiar y aclarar numerosos procesos bioquímicos, para aclarar procesos

vitales. 

Por su producción de sustancias químicas que son de gran valor (p. ej. vitaminas y

antibióticos). Estos son solo unos aspectos pero hay más consideraciones que son importantes. Para poder identificar y clasificar a un M. O. deben determinarse con cierto grado de  precisión las siguientes características:

1. Características de cultivo. Se refiere a (a) las sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo y (b) las condiciones físicas de un medio que lo favorezcan. 2. Características morfológicas. Se refiere al tamaño de la célula, su forma, su agrupación, diferenciación en tinciones e identificación de estructuras. 3. Características metabólicas. Se refiere a la manera o forma por la cual los microorganismos llevan a cabo los procesos químico-biológicos. 4. Características de la composición bioquímica. Se refiere a la identificación de las  principales características de los componentes químicos de la célula. 5. Características antigénicas. Se refiere a la detección de componentes celulares especiales (químicos) que dan prueba de similitud entre las especies. 6. Características genéticas. Se refiere al análisis de la composición del ácido desoxirribonucleico (DNA), así como la determinación de la reacción que ocurre entre material DNA a partir de diferentes microorganismos. Sobre la base de todas estas propiedades y características, se ha ido clasificando a los microorganismos: 1. Con relación al reino. 2. Dividiéndolos en grupos y subgrupos con el siguiente orden: phylum, clase, orden, familia, tribu, género, especie, variantes (serotipos). El nombre científico del microorganismo se escribe en latín y letra cursiva y está formado por: a) GÉNERO; escrito con mayúscula, seguido por la (b)ESPECIE escrita en minúscula. P. ej. Bacillus subuies

(bacteria)

Amaeba proteus

(protozoario)

Aspenrgillus niger

(hongos)

GENERALIDADES DE

LOS DIFERENTES GRUPOS DE MICROORGANISMOS

CLÍNICAMENTE IMPORTANTES Y DEAQUELLOS QUE SE RELACIONAN CON INDUSTRIA HONGOS Y LEVADURAS Son células que se consideran EUCARIOTICAS, no llevan a cabo la fotosíntesis, ya que carecen de clorofila. Crecen en medios habituales del laboratorio. Su reproducción es por  esporas. Pueden ser de tipo Macroscópico o Microscópico: macroscópicos como lo es el caso de los champiñones. Los microscópicos están formados por una serie de tubos llamados HIFAS. En algunos hongos, las hifas tienen paredes transversales llamadas SEPTAS y a las hifas se les nombra Hifas Septadas, entre septa y septa transversal existe un espacio el cual es llamado artículo. Las hifas que no poseen estas paredes transversales se les llama hifas CENOCITICAS; ahora si tenemos un conjunto de hifas ya sean septadas o no septadas, entonces tenemos las MICELAS. Así como hay hongos de provecho también hay hongos que son perjudiciales para el hombre como lo son: COCCIDIOIDIS INMILIS que causa lesiones en la piel, huesos y endémicos principalmente en Sonora y Baja California. Las levaduras pueden ser de forma esférica, alargada, ovoides y son mucho más grandes que las bacterias. Su reproducción es asexual por el proceso de Gemación. Las levaduras son Eucarióticas y adquieren la apariencia de nopales. También pueden ser patógenas como Candida albicans que causa lesiones en el pelo, uñas, pie de atleta y otros órganos. BENÉFICOS COMO Sacharomyces cerevicial que permiten la obtención de alcohol.

La importancia de muchas levaduras y mohos en la industria es por su capacidad de formar productos de fermentación como alcohol isopropilico y acetona, también son útiles en la industria del pan y del queso y en la industria farmacéutica por la obtención de ciertos antibióticos. En cuanto al cultivo, en general tanto mohos como levaduras se desarrollan mejor a temperatura ambiente entre los 20 y 25 grados centígrados o a los 37 grados y en medios de PH 5.5 a 6.5. La mayoría de los hongos son aerobios y para su aislamiento se usan medios como Sabouraud y medio de pensilvania. En sus características morfológicas de las levaduras y mohos se observan mejor en preparaciones sin teñir, con menos alteración y con lentes de  poco aumento. GENERALIDADES DE LOS VIRUS Los virus son microorganismos tan pequeños que solo pueden verse con los aumentos que proporciona el microscópio electrónico. Estos pueden pasar a traves de los poros de filtros que no permiten el paso de las bacterias. Los virus solo se pueden reproducir dentro de las células de animales, vegetales y otros microorganismos, por esta razón se le considera como parásitos obligados intracelulares. Los virus dependen de las células del hospedador para su reproducción debido a que carecen en gran parte de maquinaria metabólica propia, son incapaces de generar energía o de sintetizar proteínas y dependen de las células del hospedador para realizar estas funciones. Sin embargo los virus pasan información genética al igual que las células del hospedador para la reproducción y para apoderarse de los sistemas generadores de energía y de síntesis de proteínas de las células hospedadoras. El material genético que poseen es DNA o RNA pero no ambos, este material genético se encuentra encerrado en una cubierta de proteína altamente especializada, que lo protege cuando el virus se encuentra fuera de la célula hospedadora, a la vez le sirve como vehículo de entrada cuando penetra en dicha célula.

A los virus estructuralmente completos maduros e infectivos se les conoce como VIRIONES. A los virus que infectan a las bacterias se les llama bacteriófagos. Estos fueron descubiertos independientemente por Frederick W. Twort, en Inglaterra en 1915 y por Félix D' Elle en 1917. Los bacteriófagos fueron observados en colonias bacterianas que sufrían lísis, se disolvían y desaparecían, además este efecto podrían ser transmitido de una colonia a otra y a  partir de estas observaciones se sugirió que el agente lítico podía ser un virus. Posteriormente estos han sido ampliamente utilizados en investigaciones genéticas debido a que son entidades biológicas más pequeñas y más sencillas y que son capaces de autoreplicarse. Los virus se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y existen en la mayoría de las bacterias, también existen en diferentes formas aunque muchos poseen una cola a través de la cual circula el ácido nucleico en el interior de la célula hospedadora; los  principales tipos de virus bacterianos son: VIRUS LITICOS O VIRULENTOS y VIRUS MODERADOS (LISOGENICOS) O AVIRULENTOS. REPRODUCCIÓN DE LOS VIRUS El primer paso en la reproducción de un bacteriógeno es la absorción en el cual el extremo de la cola del virus queda unida a la pared celular, la fijación es específica ya que  poseen configuraciones moleculares completarias en sus sitios receptores opuestos. El segundo paso es la penetración que es un hecho mecánico que permite la entrada del fago a la célula hospedadora gracias a una enzima llamada lisosima la cual va en la cola del fago y digiere la pared celular, aunque la penetración se logre una vez que las fibras de la cola se fijan a la célula y la vaina se contrae induciendo el tubo de la cola en la célula y este inyecta

su DNA y la cubierta de proteína que forma la cabeza y la estructura de la cola del virus  permanece fuera de la célula. En aquellos que no poseen vaina contráctil todavía no está claro cómo penetra el ácido nucleico en la célula. CULTIVO DE VIRUS Los virus se pueden cultivar inoculando ratones o utilizando tejidos. La inoculación en ratones, cobayos, conejos y primates se han utilizado para el cultivo de los virus ya que son un  buen instrumento de diagnóstico, debido a que pueden mostrar síntomas típicos de la enfermedad siendo posible examinar cortes histológicos al microscopio. El cultivo de tejidos para virus se inició con el cultivo de embriones de pollos triturados en sueros o en soluciones salinas, esto condujo a la utilización de tejidos puros de tejidos de células animales en las que podrían crecer los virus. Ahora se cultivan como las células bacterianas en recipientes de plástico o de vidrio donde quedan adheridos a la superficie y continúan dividiéndose produciendo una monocapa de célula que se utilizan para la propagación de los virus en grandes cantidades para realizar estudios de investigación, para la producción comercial de vacunas y para el aislamiento y propagación de virus procedentes de material clínico. En cuanto a las vacunas preparadas a partir de cultivos tienen una ventaja sobre las  preparadas en embriones de pollo, ya que se reduce al mínimo la posibilidad de que un  paciente presente hipersensibilidad o alergia a la albúmina de huevo.

Inicio III. FUNDAMENTOS DE LA MICROBIOLOGÍA ANATOMÍA DE LAS BACTERIAS

La anatomía de las bacterias se refiere al estudio de las estructuras de un organismo, así como su organización en cuanto a las partes del mismo y la relación estructural entre las mismas. Los elementos básicos de la anatomía bacteriana comprenden: Citoplasma (cuerpo celular interno), Pared Celular y en cuanto al Núcleo no se conoce la naturaleza exacta pero sí contiene el material nuclear y que puede estar esparcido en el Protoplasma. CITOPLASMA: Se haya rodeado de una membrana citoplasmática, situada justamente en el interior de la pared celular, esta contiene generalmente varios granulos y otras inclusiones celulares, también el material nuclear que es de importancia vital. PARED CELULAR: Es una estructura muy rígida que se encuentra entre la membrana citoplasmática y cápsula o capa mucosa, se encuentra en todas las células vivas, tienen cierta elasticidad varía de acuerdo con la bacteria y sus condiciones. El espesor de la pared de la mayoría de las bacterias varía entre 10 y 35 Nm. sin embargo, algunos son considerablemente gruesas resistentes a los agentes químicos como susceptibles a las tinciones. La pared celular puede contener en la superficie órganos de locomoción como: Flagelos, Vellosidades (fimbrias). También estructuras internas especiales llamadas Esporas. COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA PARED CELULAR  Poseen en su estructura material Peptidoglicano y es el que proporciona rigidez a la  pared. Son polímeros de grandes moléculas que se repiten por unidades. LAS UNIDADES QUE SE REPITEN SON: 1. N-Acetil glucosamida (AGA) 2. Ac. N- acetil Muramico 3. Peptidos (de 4 a 5 aminoacidos). L- Alanina, D- Alanina, D- ac. Glutámico, Lisina y otros constituyentes químicos como: a) Ac. Teicóico

 b) Proteínas con polisacaridos c) Lipop ipopro rotteína eínass d) Lipo Lipopol polis isac acari arido doss Todos esos constituyentes están unidos al peptidoglicano, forman la estructura química compleja y le dan rigidez. MEMBRANA CITOPLASMÁTICA Se encuentra debajo de la pared celular, llamada también membrana protoplasmática o membrana plasmática su medida es de 7, 5nm. -

Es extrem extremada adament mentee importan importante te por qué contr controla ola el paso paso de sustanc sustancia ia quími química ca en solució soluciónn hacia adentro y fuera de la célula, es capaz de tomar y retener cantidades adecuadas de nutrientes y de descargar el exceso y/o los productos de desecho.

-

Prop Propor orci cion onaa adem además ás la maqu maquin inar aria ia bioq bioquí uími mica ca para para tran transp spor orta tarr ione ioness inor inorgá gáni nico cos, s, azucares, aminoácidos y otros metabolitos a través de esta membrana. Esta sustancia en solución o soluto pasan a través de la membrana por:

1. DIFUSIÓN DIFUSIÓN PASIVA: PASIVA: (OSMOSIS): (OSMOSIS): Es inesposif inesposifica ica no se hace distinci distinción ón entre los solutos solutos que pasa a través de la membrana. -

Proceso Proceso media mediante nte el cual cual la susta sustanci nciaa química química pasa pasa a través través de la membra membrana na desde desde un área área de mayor concentración a un área de mayor concentración La difusión pasiva actúa para igualar la concentración de solutos a ambos lados de la

membrana. 2. TRANSPO TRANSPORTE RTE ACTIVO: ACTIVO: Es altame altamente nte específ específico ico,, es decir los solutos solutos pasan pasan antes de haber sido seleccionados. Además permiten que se alcance una [ ] de soluto más alta, dentro de la célula que la que existe fuera de la la célula. El transporte activo es muy importante importante para las células células bacterianas bacterianas en ambiente ambiente como el océano, en donde la nutrición está presente en pequeñas cantidades. -

El proceso proceso de trans transport portee activo activo impli implica ca un intrinc intrincado ado mecani mecanismo smo dentro dentro de la membra membrana na cito citopl plasm asmát átic ica, a, compu compuest estos os tran transpo sport rtad adore oress de memb membran ranas, as, junt juntoo con con reac reacci cion ones es  bioquímicas que proporcionan energía, realizan esta e sta clase de trabajo.

ESTRUCTURA DENTRO DE LA MEMBRANA CELULAR CONTENIDO DENTRO DE LA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA 1. ÁREA ÁREA CITOPL CITOPLAS ASMÁ MÁTI TICA CA:: (de aspect aspectoo granu granula larr qu quee es rica rica en RNA) RNA) den densa same ment ntee empaquetados a través del área citoplasmática hay partículas de PROTEÍNAS- RNA llamados RIBOSOMAS. RIBOSOMAS: Son el sitio de la biosintesis de proteína y se encuentran en todas las células (procarioticas e eucarioticas). 2. ÁREA ÁREA CROMAT CROMATICA ICA O ÁREA ÁREA NUCLE NUCLEAR: AR: Que Que es rica rica en DNA. DNA. 3. PORCIÓ PORCIÓN N FLUIDA FLUIDA:: Que contiene contiene nutrient nutrientes es disuel disueltos, tos, materia materia particul particulada ada (cuerpos (cuerpos de inclusión). ÁREA NUCLEAR: Las células bacterianas a diferencia de los organismos eucarióticos: -

Care Carece ce de crom cromos osom omas as disc discre reto tos. s.

-

Apar Ap arat atoo mitó mitóti tico co (par (paraa la divi divisi sión ón celu celula lar). r).

-

Nucleolo.

-

Membrana nu nuclear. El material nuclearo DNA, en una célula bacteriana ocupa una posición cerca del

centro de la célula y está unida al sistema mesosoma-membrana citoplasmática. (mesosoma invaginación de membrana citoplasmática). Este material es el aparato genético total o genóma de la bacteria. APARATO

GENÉTICO ICO

O

GENO NOM MA

{DNA-SI -SISTE STEMA

MESOSOMA-

MEMBRANA CITOPLASMÁTICA {CONTIENE UN CROMOSOMA CIRCULAR. Consta de un único cromosoma circular en el que van todos los genes. En cuan cuantto al mater ateria iall nucl nuclea earr se le desi design gnaa CUER UERPO DE CRO CROMATI MATINA NA,,  NUCLEOIDE, O CROMOSOMA BACTERIANO. INCLUSIONES CITOPLASMÁTICA: Dentro del citoplasma pueden acumularse diferentes clases de sustancias químicas y forma formarr granul granulos os y glóbu glóbulo loss denom denomin inad ados os CUER CUERPO POS S DE INCL INCLUS USIÓ IÓN. N. Ejem Ejempl plo: o: hay hay  bacterias que acumulan grandes cantidades de azufre que aparecen como glóbulos dentro del

citoplasma. Otros cuerpos de inclusión están formados por compuestos de: polifosfato, lípidos, glucógeno o almidón. ESTRUCTURA FINA DE LAS CÉLULAS BACTERIANAS: El examen de una célula bacteriana por técnicas de microscopía moderna, revela que existen estructuras por fuera de la pared celular como: FLAG FLAGEL ELOS: OS: Co Comp mpue uest stos os por por subuni subunida dades des de prote proteín ínas as fibro fibrosas sas o flag flagel elin inaa y contractil, contractil, estos salen del citoplasma citoplasma y miden aproximadament aproximadamentee 0.013 micras. Los contienen contienen géneros de bacterias bacterias como las pseudomonas, pseudomonas, Escherichia, Escherichia, todos los espirilos, espirilos, mitad de los  bacilos y ningún coco ordinario. PELOS (FRIMBRIAE): Son filamentos más cortos y numerosos compuestos por  subun subunid idad ades es de prot proteí eína na (pili (pilina na)) lo cont contie iene nenn tant tantoo m.o m.o móvi móvile les, s, inmó inmóvi vile les, s, ejem ejempl plo: o: salmonella tiphi (bacilos), bacterias, shigella flexneri. CÁPSULA: Algunas bacterias se encuentran rodeadas de una capa de material viscoso conocido como cápsula o capa mucosa el tamaño de esta cápsula depende del medio en el que crece la bacteria. Puede ser una fracción de un diámetro de la célula o mucho más grande en grosor que la misma célula bacteriana. -

La relac relación ión exact exactaa entre entre la cápsu cápsula la y el el resto resto de la célul célulaa no se cono conoce. ce.

-

Se cree cree que el mate material rial que que forma forma la cápsul cápsulaa es segregad segregadoo a partir partir de la célu célula la y debido debido a su viscosidad no pueden difundirse quedando solo alrededor de la pared celular. Ejemplo: las bacterias con cápsula que crecen en la leche producirán un espesamiento de esta.

-

La cápsul cápsulaa le proporci proporciona ona a las las bacteri bacterias as una cubier cubierta ta protec protector toraa y sirve de reser reservar vario io de alimento almacenado.

-

Las Las cáps cápsul ulas as de cier cierta tass bact bacter eria iass que que prod produc ucen en enfe enferm rmed edad ad aume aument ntan an la capa capaci cida dadd infectiva de las bacterias. Ejemplo: KLEBSIELLA PNEUMONEAE.

-

Si las las bacteri bacterias as pierden pierden su cápsul cápsulaa totalm totalmente ente puede puedenn perder perder su virulen virulencia cia y por tanto tanto su capacidad para producir enfermedades.

-

Las bacter bacterias ias capsul capsulada adass también también son responsa responsable bless en algunos algunos procesos procesos indust industria riales les:: a) Pueden Pueden tupir tupir los filtros filtros (por exceso exceso de materi material al viscoso viscoso o sustan sustancia ciass mucosas mucosas en el equipo de fabricación).  b) Recubrir tuberia. c) Afectar Afectar la calidad calidad del producto producto (fábricas (fábricas de papel, papel, mediante mediante la formación formación de sustancias sustancias mucosas, cápsula en la planta).

VAINAS: Algunas especies de bacterias, particularmente los de ambientes de agua dulce y marinas están encerradas dentro de una vaina y túbulo. Formados por compuestos metálicos insolubles, (óxido férrico, óxido manganésico), que se encuentran precipitados en torno a la célula como producto de actividad metabólica. Estos Estos compue compuest stos os metá metáli lico coss inso insolu lubl bles es son forma formado doss por la célul célulaa a part partir ir de compuestos solubles de hierro o manganeso presentes en el ambiente. La vaina no es una parte vital de la célula, sino que la bacteria con vaina constituye en grupos importantes de m. o. Aguas dulces: rica en materia orgánica. PEDUNCULOS: Ciertas bacterias se caracterizan por la formación de un apéndice semirígido llamados pedúnculos que se prolonga desde la célula. célula. El diámetro del apéndice es menor que es de la célula que le ha producido. El pedúnculo pedúnculo tiene una sustancia sustancia adherente adherente en el extremo dostal dostal (más distante distante de la célula) que les permite a la célula pegarse a superficie sólida. Estas bacterias se encuentran en: -

Aguas du dulces

-

Ambientes mar marinos

Donde la posibilidad de fijarse a superficie sólida es importante para el crecimiento bacteriano y para su supervivencia. ESPORAS Y PROCESO DE ESPORULACION: Durante el ciclo de esporulación se sintetiza ácido dipiconílico, que es exclusivo de la espora bacteriana y que no se encuentra en la célula vegetativa (bacteria en su estado natural de crecimiento activo). PROPIEDADES DE LAS ESPORAS LIBRES Las esporas bacterianas libres tienen dos propiedades fundamentales: 1. Son altamente resistentes a los cambios físicos y químicos que podrían lesionar a los organismos vegetativos como: La sequedad, el calor, substancias químicas perjudiciales, a los desinfectantes, son difíciles de teñir, etc. 2. Son capaces de germinar en condiciones favorables (es decir que pueden volver a su forma vegetativa original de desarrollo con todas las propiedades intactas, como: humedad, disponibilidad de ciertos aminoácidos y substancias nutritivas. Es importante señalar que el proceso de germinación va acompañado de pérdida de resistencia al calor, liberación de ácido dipiconílico en el medio y aumenta su actividad enzimática. IMPORTANCIA La importancia radica en que es una propiedad de un grupo pequeño de bacilos con características en común. Todos los bacilos formadores de esporas se pueden encontrar en el suelo, en el tracto intestinal (humano y animal). Algunos pueden ser patógenos y la mayoría son saprófitos. Ejemplo: Clostridium tetani - - - - - - Germen del tétano Clostridium perfringens - - Bacilo de la Gangrena gaseosa

Bacillus anthracis - - - - - Germen causante del carbunco REQUERIMIENTO GASEOSO. Los principales gases que afectan el crecimiento bacteriano son: oxígeno atmosférico y Bióxido de Carbono. Las bacterias pueden mostrar amplia variedad de respuestas al oxígeno atmosférico libre por lo que se pueden clasificar en: AEROBIAS, ANAEROBIAS, ANAEROBIAS FACULTATIVAS Y MICROAEROFILAS. AEROBIAS. Las que necesitan de presencia de oxígeno atmosférico, para poder desarrollarse. ANAEROBIAS. Las que no necesitan de oxígeno atmosférico para poder desarrollarse. ANAEROBIAS FACULTATIVAS. Las que crecen y se desarrollan en presencia o en ausencia de oxígeno atmosférico. MICROAEROFILAS. Las que pueden crecer en pequeñas cantidades de oxígeno atmosférico. ACIDEZ O ALCALINIDAD. La mayoría de las bacterias crecen en condiciones de cultivo con PH de 6.5 a 7.5. Es muy probable que el pH cambie como resultado del efecto de compuestos ácidos o  básicos, producidos durante el metabolismo, esto se puede evitar incorporando al medio, soluciones buffers o tampones como amortiguadores de PH. SALINIDAD. Las bacterias requieren de ciertas concentraciones de sal, y dependiendo de lo que soportan se pueden nombrar como Halófilas o Halófilas facultativas. HALOFILAS. Aquellas que necesitan altas concentraciones de sal para poder crecer. HALOFILAS FACULTATIVAS. Aquellas que pueden crecer en diferentes concentraciones de sal.

MICROSCOPIO Y TIPOS DE MICROSCOPIAS

El microscopio es uno de los instrumentos más importantes, en relación al desarrollo de la medicina como ciencia y como arte, no dejando de lado que es el instrumento más importante dentro de un laboratorio de microbiología, o un laboratorio de cualquier  especialidad. La palabra MICROSCOPIO, deriva del griego uixpo que significa "pequeño" y axanelv que significa "ver". Fue inventado por Giovanni Farber en 1625 y aproximadamente 48 años más tarde, el verdadero impulsor de la microscopia fue el holandés Anton Van Leewenhoek (1632-1723), quien desarrolló un microscopio funcional en 1673. El microscopio es un instrumento que permite observar objetos no perceptibles a simple vista. Ello se consigue mediante un sistema óptico compuesto por lentes de cristal que al ser atravesadas por la imagen del objeto la amplifican. Cada tipo de microscopio y cada método utilizado para preparar muestras, ofrecen ventajas para demostrar algunos aspectos morfológicos de los microorganismos. Según el número y disposición de las lentes, se puede diferenciar entre microscopio óptico simple y microscopio óptico compuesto. Todas aquellas lentes con montura o sin ella, gruesas o pequeñas, biconvexas o  planoconvexas; que amplifiquen los objetos que consideran microscopios simples. El microscopio compuesto, está constituido por la combinación de dos sistemas de lentes convergentes, uno próximo al ojo del observador (ocular) y que actúa como microscopio simple; otro próximo al objeto y denominado OBJETIVO; este tipo de microscopios son los que normalmente encontramos en los laboratorios.

Por muy variables que sean las lentes, cualquiera que sea su potencia, el principio siempre será el mismo; pero cuanto mayores sean las curvaturas de las lentes y distancia entre el sistema objetivo y sistema ocular (longitud óptica), mayor será el aumento total. El microscopio óptico consta de tres sistemas: mecánico, óptico y de iluminación. SISTEMA MECÁNICO. Consta de una base o pie, brazo, portacondensador, platina, revólver, cabeza, cremalleras, tornillos macrométrico y micrométrico. Todo el sistema en sí tiene por objeto sostener el sistema óptico y el de iluminación en un mismo eje. SISTEMA DE ILUMINACIÓN. Se encuentra situado bajo la platina y tiene la misión de iluminar los objetos por medio de luz transmitida. Está formada por una fuente luminosa, espejo, condensador, diafragma, diafragma del condensador y de lámpara, filtros y colector. Consta de un espejo y un diafragma, el espejo es adaptable a diferentes posiciones, tiene superficie plana y otra cóncava que pueden intercambiarse. La fuente luminosa puede ser natural o artificial. Artificial cuando la fuente luminosa es un filamento de tungsteno (w). El diafragma va montado bajo la platina. Es un sistema de iris y permite, por medio de una palanca, obtener a voluntad conos luminosos de distinto tamaño y, mediante condensadores, conos luminosos muy grandes. Los condensadores constan de un sistema de lentes de gran abertura sujetos a una montura y colocados entre la platina y el espejo, pueden subirse y bajarse a voluntad y tienen un diafragma unido al conjunto. SISTEMA ÓPTICO. Consta de un sistema de lentes oculares y de un sistema de lentes objetivos.

Los lentes oculares más comunes son de 8x, 10x, 12.5x y los objetivos panorámicos son de 1, 2, 5, 3.2, 4 y 6.3x. El microscopio compuesto que se manejará en los laboratorios tiene los objetivos: a) Objetivo seco débil

10x

 b) Objetivo seco fuerte

16, 25, 32, 40, 63x

c) Objetivo de inmersión

50x, 63x, 100x por su poder de resolución

En la actualidad con ciertos aditamentos que se utilizan en el microscopio óptico ordinario, se pueden tener las siguientes microscopías: 1. De campo oscuro 2. De contraste de fases 3. De luz ultravioleta 4. De fluorescencia MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO Se usa el mismo equipo excepto el condensador. Aquí se usa un condensador para campo oscuro. Este condensador tiene un disco negro en la parte central de las lentes, las cuales hacen que los rayos luminosos entren solo por las orillas no oscurecidas, originando así que en vez de obtenerse un haz de luz completo, solo se obtiene un haz anular. Esta luz no entra normalmente al objetivo por salir del condensador en ángulo muy oblicuo y el campo microscópico se ve obscuro. El objeto se ve brillante en el fondo oscuro a diferencia de la microscopía de campo claro que es la normalmente usada en laboratorios, en donde el microscopio posee un condensador normal. Este deja pasar la luz o rayos luminosos tanto centrales como periféricos, produciendo campo brillante o claro.

MICROSCOPÍA DE CONSTRASTE DE FASES

El microscopio de contraste de fases está diseñado de tal manera que sus objetivos y condensadores separan la luz directa que pasa la preparación y la desviada por los objetos contenidos en ella. El objetivo tiene un anillo pintado de un material semitransparente que permite que la luz directa que pasa por la preparación sea retardada una media onda en relación con la luz desviada por la preparación. El resultado es el ver un objeto más claro que lo normal y rodeado de un fondo más oscuro que lo normal. Análisis de estructuras que vistas por microscopía ordinaria son poco visible; debido a que sus índices de refracción son muy parecidos. Estas pequeñas diferencias en el índice de refracción hacen que la luz del condensador se desvíe un poco. Tanto en microscopía de campo oscuro y en campo de contraste de fases se utilizan  preparaciones suspendidas en líquidos, no teñidas para obscurecer estructuras internas. MICROSCOPÍA DE LUZ ULTRAVIOLETA El microscopio de luz UV permite un mayor poder de resolución, lo que hace posible que haya más aplicaciones que las obtenidas por microscopio de luz ordinaria. La luz ultravioleta tiene una longitud de onda más corta (entre 180 a 400 nm) frente a 400 a 700 nm de la luz visible, lo que le dará un aumento en el poder de resolución alrededor  del doble obtenido por microscopía de luz luminosa. La principal ventaja estriba en devolver la absorción específica de varias sustancias visibles. La característica de absorber la luz UV de algunas sustancias permite su localización, distinción y medición en especímenes incluso en estado vivo.

Como las radiaciones UV son invisibles, las imágenes se hacen visibles por el registro sobre una emulsión fotográfica por el uso de un tubo convertidor de imagen o por desplazar  una pantalla de televisión después de que es captada por un tubo de cámara de televisión sensible a la luz ultravioleta. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz UV (luz de λ corta). A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor λ que la radiación excitante. Esta propiedad se le denomina fluorescencia. La microscopía fluorescente se basa en la ley física que dice: "una molécula excitada no puede ceder energía a otras moléculas, sino que las emite como radiación, en este caso como luz de mayor longitud de onda". Existen muchos aparatos que se utilizan en este campo, pero todos tienen en común ciertos componentes como: fuente de luz, filtros selectivos de excitación y filtros secundarios oculares, todos ellos adaptados al microscopio. También se han desarrollado métodos microscópicos modernos que aprovechan la mayor detección que posibilita este sistema. El diagrama de un microscopio de fluorescencia moderno permite que la luz sea emitida desde arriba (epifluorescencia) del preparado. Un filtro deja pasar la λ deseada para excitar al fluorocromo y un filtro barrera en el objetivo protege al ojo del observador de la radiación fluorescente. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro según el color del colorante usado. P. ej.  Absorbe a 365m μ  Emite a 542 m μ 

Anaranjado de acridina A estos materiales se les llama fluorescentes y al fenómeno se le denomina fluorescencia. VENTAJAS  Permite  En

obtener resultados rápidos.

ciertos casos se puede obtener un diagnóstico de certeza a partir de frotis directo, sin

necesidad de esperar un cultivo.  Es posible identificar un pequeño número de microorganismos de un cultivo mixto.  Es posible identificar microorganismos muertos o que no pueden ser cultivados.  Se

pueden utilizar pequeñas cantidades de colorante en la fijación del microorganismo para

tener resultados positivos en comparación con otras técnicas de tinción.  Es un método más sensible.

Los microorganismos se tiñen con un colorante fluorescente y aparecen como objetos luminosos cuando se observan al microscopio con iluminación de luz UV. Los colorantes fluorescentes tienen varias aplicaciones en microbiología. La más notable e importante es detectar reacciones antígeno-anticuerpo. Los colorantes fluorescentes se combinan químicamente con los anticuerpos. Esto hace  posible identificar células individuales que reaccionan con el anticuerpo. A esta aplicación se le conoce como técnica de Anticuerpos fluorescentes o Inmunofluorescencia. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO Trabaja no con rayos luminosos sino con rayos electrónicos propagados en el vacío que concentrados y refractados por campos magnéticos se proyectan sobre la preparación y se  proyectan en un foco donde proyectan una imagen no visible, pero que puede fotografiarse o

revelarse en una pantalla especial. Se logran aumentos de 30 000 a 100 000 diámetros. Puede resolver partículas a 0.001 μm. Técnicas electrónicas

Técnica de sobreado Técnica de cortes ultrafinos

Técnica de sombreado Consiste en depositar un fino baño de metal (p. ej. platino) sobre el objeto, colocándolo en el trayecto de un haz de iones metálicos en el vacío. El haz se dirige oblicuamente de manera que el objeto adquiera una "sombra" en forma de un área no bañada en el otro lado. Cuando luego se hace pasar un haz de electrones a través de la preparación bañada en el microscopio electrónico y se hace una impresión positiva de la imagen negativa, el efecto que se obtiene es tridimensional. Técnica de cortes ultrafinos El uso de cortes ultrafinos de material incluido, el método de desecación por  congelación de las muestras que impide las distorsiones provocadas por los procedimientos tradicionales de secado y el uso de la tinción negativa con un material electrodenso como el ácido fosfotúngstico. Microscopio electrónico de barrido Proporciona imágenes tridimensionales de las superficies de los objetos observados. El objeto es recubierto inicialmente con una delgada película de un metal pesado y a continuación es explorado por el haz de electrones del microscopio. Los electrones dispersados por el metal pesado son reunidos y enfocados para formar  la imagen final.

MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE MICROORGANISMO Preparación de muestras para su examen por microscopía óptica Todos los microorganismos en estudio pueden ser examinados, ya sea en estado vivo y sin teñir o después de haber sido teñidos por colorantes, para que resalten con más claridad. Para esta finalidad se han ideado métodos de preparación de los especímenes, como lo son suspensión de los organismos en un líquido y utilización de películas delgadas o frotis secos, fijados y teñidos. Las técnicas que se conocen son: Técnica de montaje húmedo, técnica de gota pendiente, técnica de bloque pendiente, y la técnica de preparaciones fijadas y teñidas. Las técnicas más utilizadas son la técnica de montaje húmedo y técnica de gota  pendiente las cuales hacen posible examinar organismos en condiciones de vida normal suspensos en un líquido. Y la técnica de preparaciones fijas y teñidas la cuál hace posible examinar organismos en cuanto a su morfología y ordenamiento característico pero en condiciones no vivas. Técnica de montaje húmedo normal Consiste en colocar sobre un portaobjetos normal una gota de la suspensión bacteriana, utilizando un asa estéril, se coloca un cubreobjetos, sellando los lados con vaselina para evitar  que se seque la preparación. Técnica de gota pendiente Técnica utilizada para observar la movilidad de bacterias vivas, así como su fisión  binaria y otras características de los organismos que pueden ser destruidas por coloración. Se utiliza una laminilla especial para gota suspendida (placa excavada), se coloca un  poco de vaselina con un palillo alrededor de la concavidad y de la suspensión bacteriana se  pone una gota en el centro de un cubreobjetos, posteriormente se tapa con una laminilla excavada de tal forma que la concavidad coincida con el centro del cubreobjetos donde se

encuentra la gota, se invierte suavemente la lámina y se presiona para evitar la evaporación, de esta manera queda la gota suspendida y lista para observarse con el objetivo seco débil y con el diafragma cerrado unas dos terceras partes hasta enfocar y encontrar la gota suspendida y  pasar gradualmente al objetivo de mayor aumento. Técnica de bloque pendiente Es un método útil en el estudio de la división celular de las bacterias. Es un método conocido como Método de Hill. En la práctica rutinaria no es utilizada. En general las técnicas de montaje húmedo son preferibles en los siguientes casos: a) Observación de microorganismos que al teñirse puedan ser destruidos o alterados en su morfología, p. ej. las espirales.  b) Cuando sea susceptible de contener espiroquetas que causen sífilis. c) Se sospeche de microorganismos móviles. d) Se desee observar cambios citológicos que ocurren durante la división celular y se desee determinar la velocidad con que ocurren. e) Observación de inclusiones celulares, como vacuolas y materia grasa. Preparación de muestras fijas Métodos utilizados en la observación de características morfológicas y estructurales de las bacterias. El método consiste en que a partir de una suspensión bacteriana, se extienda sobre un portaobjetos una fina película de la misma con un asa estéril, se deja secar al aire libre y se fija la preparación, pasando el portaobjetos unas 3 veces por la flama del mechero; cuidando que la película quede hacia arriba. En la fijación también se pueden utilizar ciertas sustancias químicas en vez de calor, como el alcohol metílico, formol u otros. TINCIONES Y TÉCNICAS DE TINCIÓN Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasma  posee un índice de refracción cercano al del agua, se requiere generalmente de tinciones

 biológicas para visualizar adecuadamente o demostrar el fino detalle de sus estructuras internas. En el siglo XIX, la introducción de la coloración fue un gran avance, o de los  principales avances en microbiología clínica y en otros campos de microscopía diagnóstica, durante los últimos 100 años, hoy se depende de estas coloraciones. Las tinciones se llevan a cabo con soluciones acuosas u orgánicas de colorantes o grupos de colorantes que confieren una variedad de colores a los microorganismos, tejidos animales o vegetales, u otras sustancias de importancia biológica. Los colorantes no solo se emplean para la tinción directa de materiales biológicos sino además para demostrar las funciones fisiológicas de los microorganismos. También sirven como indicadores de cambios de pH en los medios de cultivo y como indicadores Redox para demostrar la presencia o ausencia de condiciones anaerobias. Casi todos los colorantes biológicamente útiles son derivados del alquitrán y la estructura fundamental alrededor del cual están constituidas químicamente la mayoría de los colorantes es el anillo bencénico. Difieren en el número y disposición de estos anillos y a la sustitución de los átomos de hidrógeno por otras moléculas. En Microbiología la mayoría de los colorantes más utilizados son derivados de la anilina. Los compuestos orgánicos coloreados (colorantes), para teñir microorganismos son muchísimos, y de estructura compleja. Se pueden clasificar en grupos como: 1. Colorantes de trifenilmetano. 2. Colorantes de oxacina. 3. Colorantes de tiacina.

La clasificación de los colorantes es algo compleja, pero generalmente está basada en los cromóforos presentes, y prácticamente de acuerdo al comportamiento químico del colorante. En términos amplios se dividen en: ácidos, básicos y neutros; que no indican necesariamente sus reacciones de pH en solución sino más bien una parte significativa de la molécula o sea si es aniónica o catiónica. Desde el punto de vista práctico, los colorantes ácidos reaccionan con sustancias  básicas ( como estructuras citoplasmáticas). Los básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida como la cromatina nuclear de las células. Los neutros son sales formadas por un colorante ácido y un colorante básico, p. ej. el eosinato azul de metileno. Lo más común son los dos primeros procesos. Coloración. Es un proceso de teñir artificialmente los microorganismos con colorantes o reactivos, para facilitar su estudio microscópico. El proceso de tinción supone una reacción de intercambio de iones entre el colorante y sitios activos de la superficie o internos de la célula. Donde los iones teñidos reemplazan a otros iones en los compuestos celulares. Las proteínas y los ácidos nucleicos celulares, pueden participar en la formación de las sales con iones positivos: + Célula bacteriana (Na) + El ión coloreado está positivo: MB Cl, colorante cloruro azul de metileno. - + + Célula bacteriana Na + MB Cl (reemplazo).

- + + Célula bacteriana MB + Na Cl

Los colorantes son compuestos orgánicos que constan de anillos bencénicos y grupos cromófonos y auxócromos, para poder fijar el colorante a un objeto es necesario el uso de un mordente. MORDENTE. Es toda sustancia química que fija el colorante de tal modo que el material teñido lo retiene, p. ej. sulfato ferroso, ácido tánico, yodo, etc. Los métodos de coloración se pueden clasificar de acuerdo al número de colorantes y reactivos que se utilicen como: coloraciones simples o directas y coloraciones diferenciales. Coloraciones simples o directas. Coloraciones en las cuales se utiliza un solo colorante aplicado a una fina película fijada o frotis. Coloraciones diferenciales. Método utilizado para teñir microorganismos por  aplicación de una serie de soluciones colorantes y/o reactivos, aplicados a una película de  bacteriras o frotis. Dependiendo de la aplicación y lo que se desee observar respecto a una célula, existen diferentes tipos de coloraciones o técnicas que de alguna u otra manera se considera, ya sea directas o simples y/o diferenciales, que son: 

Coloraciones

 

Simples o directas Diferenciales: Gram, ácido resistente, Giemsa, coloraciones especiales para descubrir estructuras Tinción negativa

COLORACIÓN SIMPLE: (COLORACIÓN DIRECTA). Método de tinción de bacrerias o de otros organismos, por aplicación de una sola solución de un colorante a una película fijada o frotis. Los colorantes utilizados pueden ser, azul de metileno, verde de malaquita, etc. A veces en el interior de las células, aparecen granulos más profundamente teñidos que el resto de la célula, lo cual indica la presencia de entidades químicas activas en forma de partículas que tienen mayor afinidad por el colorante que la célula en conjunto. COLORACIONES DIFERENCIALES: Método de tinción de bacterias, por aplicación de varias soluciones de colorantes y reactivos, en una muestra fijada o frotis. Este método incluye varias técnicas, dependiendo de lo que se desee conocer o estudiar  sobre los microorganismos. Independientemente de la técnica utilizada, el método en general pone de manifiesto diferencias entre células microbianas o entre partes de una célula. Los colorantes y reactivos que se utilizan depende de la técnica empleada y de lo que se desee observar o estudiar. De las técnicas más utilizadas están la Técnica de tinción Gram, Técnica de tinción ácido resistente o de Ziehl Neelsen, Técnica de tinción Giemsa. Técnica de tinción Gram. tinción diferencial más utilizada en bacteriología, debido a que  prácticamente todas las bacterias pueden ser clasificadas como Gram positivas o como Gram negativas. Estas dos categorías pueden diferenciarse por este método de acuerdo a su estructura en la composición de la pared celular. La teoría sobre el mecanismo de la tinción Gram, se basa en la permeabilidad de la membrana. El contenido de lípidos de una a otra categoría es variable y de esto depende el que la membrana pueda tener mayor permeabilidad o disminución de permeabilidad al ponerse en

contacto con solventes orgánicos, por lo que las bacterias podrán retener uno u otro colorante utilizados en esta técnica. En el caso de las bacterias Gram positivas por su bajo contenido de lípidos es disminuida su permeabilidad con el solvente orgánico, por lo que puede retener el colorante  primario con el que se ha teñido la muestra y se observaran de un color violeta. En el caso de las bacterias Gram negativas por su alto contenido de lípidos su permeabilidad es todavía suficiente como para no poder retener el colorante primario al utilizar el solvente orgánico de tal manera que quedan incoloras y se colorean con el colorante de contraste utilizado, observándose las bacterias de un color rosa o rojo. La técnica incluye las siguientes substancias; Cristal violeta como colorante primario, lugol como mordente, alcohol-acetona como solvente orgánico y safranina como colorante de contraste. Estas substancias se deben aplicar en el mismo orden ya que cualquier cambio  puede afectar a la reacción. Técnica de tinción de Ziehl-Neelsen. Método de tinción diferencial, utilizado para detectar la  presencia de organismos ácido resistentes. Las Micobacterias poseen cápsula gruesa y cerosa, resistentes a la tinción; sin embargo una vez teñidas, esta cápsula resiste a la decoloración cuando es tratada con potentes solventes orgánicos, por tal razón, los microorganismos que tienen esta propiedad se llaman ácido resistentes. Los colorantes y reactivos utilizados en esta técnica son: Carbolfucsina como colorante  primario, alcohol-ácido como decolorante y Azul de metileno como colorante de contraste. Afín de que el colorante primario penetre a través de la cápsula cerosa de los bacilos ácido resistentes, se requiere de cierto tratamiento físico. Esto en la técnica convencional de Ziehl Neelsen en la cual se utiliza calor después de cubrir la muestra con carbolfucsina como tratamiento físico, para que pueda penetrar el colorante. Esto se logra pasando el mechero

varias veces a través del portaobjetos hasta observar desprendimiento de vapores de la solución del colorantes, es necesario evitar que se produzca ebullición. Existe una modificación de la tinción de ziehl neelsen que es la Modificación de Kin Youn, también conocido como Método Frío. Se diferencia de la anterior en que en lugar de emplear calor, para facilitar la tinción se añade al colorante carbolfucsina un detergente tensoactivo, como tergitol. Al hacer uso de la T. de coloración ácido resistente, se debe de tener precaución, ya que organismos no viables  presentes en los extendidos de pacientes tratados con drogas pueden teñirse con la técnica; por  lo tanto, la presencia de organismos ácido resistentes, no indica necesariamente foco de tratamiento y persistencia de infección activa; en estos casos se requieren cultivos para determinar la viabilidad de cualquier organismo ácido-resistente. MÉTODO DE GIEMSA Este método es útil para poner de manifiesto las Ricketsias localizadas dentro de la célula huésped. Estos organismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de dicha célula. También tiene utilidad, para teñir frotis de sangre en el examen de protozoos, para visualizar inclusiones virales o de otros organismos en las células infectadas, así como la  presencia de otros parásitos como toxoplasmas en tejido cerebral. COLORACIONES PARA DESCUBRIR ESTRUCTURAS CELULARES Son métodos especiales de tinción que se utilizan para observar estructuras dentro o en el interior de la pared celular bacteriana, como lo son flagelos, cápsulas, núcleo o material nuclear, endosporas y granulos. El principio en el que se basan cada uno de estos métodos de coloración diferencial es en gran parte el mismo que el de la tinción de Gram y de Ziehlneelsen; de tal forma que la estructura en estudio manifiesta un grado de afinidad por el colorante diferente al del resto de la célula.

TINCIONES NEGATIVAS Es una técnica mediante la cual las células sin teñir se hacen visibles en una película oscura; los organismos aparecen iluminados en un campo microscópico oscuro. En la  práctica, la suspensión bacteriana se mezcla con tinta china o con nigrosina, después se extiende como una película delgada sobre un portaobjetos y se deja secar. La ventaja de este procedimiento, en el estudio morfológico, es que las células no reciben una agresión física o química, ni distorsión de las células como sucede con otros métodos. TÉCNICA DE TINCIÓN GRAM 1. La muestra preparada fija y seca inundarla con cristal violeta por un minuto. 2. Lavar hasta que no salga más colorante. 3. Cubrir con lugol por un minuto. 4. Lavar con agua quitando el exceso. 5. Decolorar con alcohol acetona de 30 a 60 segundos. 6. Contraste con safranina por un minuto. 7. Lavar con agua y secar al aire y examinar. Las bacterias que retienen el colorante inicial (violeta) son Gram (+) y las que se decoloran con alcohol y toman el colorante de contraste (rojo o pardo) son Gram (-). PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO DE ZIEHL NEELSEN 1. Preparar una solución de fucsina fenicada mezclando 10 ml. de una solución alcohólica saturada de fucsina con 90 ml. de una solución acuosa de fenol al 5%. 2. Preparar un decolorante mezclando 3 ml. de ácido clorhídrico concentrado con 97 ml. de alcohol al 95%. 3. Cubrir la preparación de fucsina fenicada, calentando sobre una llama durante 5 min. hasta el emisión de vapores, sin hervir. Se añade colorante de tiempo en tiempo para que no se seque. 4. Lavar con agua y decolorar con alcohol ácido.

5. Teñir con azul de metileno por espacio de 30 a 60 segundos. 6. Lavar con agua, secar el exceso y examinar el mycobacterium tuberculosis en el esputo teñido por este método aparece rojo sobre un fondo azul. Las bacterias no ácido resistentes se tiñen de azul. Otras técnicas de tinción diferencial son las TINCIONES ESPECIALES O SELECTIVAS, estas son utilizadas para detectar específicamente alguna parte de la célula, y se denominan dependiendo de la estructura a teñir o identificar. Algunas técnicas son TINCIÓN DE FLAGELOS: con el método de Bailey, método de Gray, etc. COLORACIÓN DE CÁPSULAS: con el método de Anthony, método de Hiss, etc. TINCIÓN DE ESPORAS: con el método de Dorner, método de Mittwer, método de Wirtz-Con Klin, etc. 

Metabolismo básico y cultivo de

conservación de microorganismos aeróbios y

anaróbios METABOLISMO C. H. : Son de preferencia para los M. O. o bacterias heterotrofas. Especialmente la glucosa la cual puede degradarse por la ruta de glucolisis. Degradación de la glucosa hasta ácido  pirúvico. GLUCOSA La glucosa: la fermentan muchas bacterias distintas de muchas formas diferentes. A. E. Coli, Salmonella, Enterobacter al fermenta la glucosa dan como productos una mezcla de compuestos ácido succinico, Acetil CoA, Alcohol, Ac. Acético, Ac. Fórmico, CO2, H2. B. Streptococcus lactis: fermentan a la glucosa hasta Ac. Láctico casi exclusivamente. Clostridium, Eubacterium, Bacillus: Ac. Butírico, Butanol, Acetona, Isopropanol, Ac. Acético, Fórmico, Etanol, H2, CO2, etc. Glucosa________ Ac. Piruvico__________ Ac. Láctico

Los lípidos y proteínas son utilizados como alternativa para obtener energía que generalmente obtienen de la glucosa. Lo hacen en forma rápida y eficiente en intermediarios de las rutas glicolíticas y del ciclo del TCA que constituyen el esqueleto alrededor del cual construir el resto de las vías degradativas. DEGRADACIÓN DE LÍPIDOS O GRASAS: Comienza con la hidrólisis de triglicéridos, a glicerina y ácidos grasos por acción de las enzimas lipasas. CATABOLISMO DE PROTEÍNAS: Muchos m. o. heterótrofos pueden degradar proteínas exógenas utilizando los productos como fuente de C, N y energía. (prot. son grandes no pasan la membrana y las bacterias producen exóenzimas proteasas que hidrolizan las prot. exógenazas péptidos, y las bacterias producen peptidazas que rompen a los péptidos a aminoácidos que son más degradados transformándose en comp. que entran en el ciclo TCA.

METABOLISMO BACTERIANO OBSERVADO EN PRUEBA DE ENSAYO Todos los organismos tienen la propiedad de realizar un cambio continuo (metabolismo) de sustancias con el medio que lo rodea. Para llevar a cabo los procesos de nutrición y de reproducción se requiere la presencia de materiales nutritivos a partir de las cuales los m. o. sintetizan los componentes de su cuerpo y obtienen la energía indispensable a través de la oxidación y reducción de distintas sustancias. La luz y materia orgánica e inorgánica sirven de fuentes de energía a las bacterias. De acuerdo con el aprovechamiento de carbohidratos y la fuente energética, las  bacterias se dividen en 4 grupos: 1. Bacterias fototropicas: o sea, los m. o. que utilizan la luz como fuente de energía. 2. Bacterias Quimiotróficas: que son m. o., que emplean sustancias químicas en calidad de fuente de energía.

3. Bacterias Autotróficas: que son m. o. que aprovechan el ácido carbónico (CO2) en calidad de fuente de C. Algunas bacterias tienen la propiedad de asimilar el polietileno, ácido  bórico, Fenol y otras sustancias inorgánicas. 4. Bacterias Heterotrofas: Son bacterias que precisan el carbono orgánico (carbohidratos, ácidos grasos) para su nutrición. Según el tipo de nutrición las bacterias se dividen en: 1. Fotoautotroficas: cuya fuente de energía en la luz solar y la de carbono es CO2. 2. Fotoheterotroficas: cuya fuente de C es la luz y la de Carbono los compuestos orgánicos. 3. Quimioautotroficas: cuya fuente de energía son compuestos inorgánicos reducidos y la de carbono el CO2. 4. Quimioheterotróficas: asimilan el carbono y la energía de los compuestos orgánicos. Este grupo comprende la mayoría de las bacterias.  NUTRICIÓN Todos los m. o. necesitan de una fuente de energía. Ejemplo: Plantas verdes. Utilizan energía radiante de la luz y se les llaman FOTOTROFOS. Animales. Dependen de la oxidación (pérdida de electrones de un átomo) de compuestos químicos y se les llama QUIMIOTROFOS. En las bacterias existen los dos. Todos los organismos vivos son FOTOTROFOS O QUIMIOTROFOS. Todos los organismos requieren de carbono en alguna forma, CO2 aún en pequeñas cantidades, la mayoría requiere de compuestos orgánicos de carbono. Plantas _________ CO2 _________ C. H por fotosíntesis EN TÉRMINOS NUTRICIONALES

Tipo Fototrofo Autotrofo Heterotrofo Quimiotrofo Autotrofo Heterotrofos

Fuente de energía

Fuente de C.

Ejemplo

Luz solar Luz solar

CO2 Comp. Org.

Chromatium Rhodopseudomonos

Ox. de comp. org. Ox. de comp. org.

CO2 Comp. org.

Thiobacillus Escherichia

Req. De N Plantas: Obt. de sales de inorgánicas de Nitrógeno, ejemplo: KNO3. Animales: Obt. de comp. orgánicos de Nitrógeno, ejemplo: prot. y productos de degradación (peptidos y ciertos ácidos). Bacterias: Algunas N2 atmosférico. Algunos compuestos orgánicos de Nitrógeno. Algunos N2 de compuestos orgánicos nitrogenados. Req. de S y P Animales: de compuestos orgánicos de S. Vegetales: de compuestos inorgánicos de S. Algunas bacterias: compuestos orgánicos de S. Algunas bacterias: compuestos inorgánicos de S. Algunas bacterias: S elemental. Bacterias: El P a partir de Fosfatos, ejemplo: sales de ácido fosfórico. Req. de varios elementos metálicos Todos los Na, K, Ca, Mg, Mn, Fe, Zn, Cu, Co, para su org. crec. y bact. en partes pro millón. Req. de agua______ para su crecimiento y funciones metabólicas. Bacterias_________ todos los nutrientes deben de estar en solución acuosa para que puedan  pasar al organismo. MÉTODOS DE CULTIVOS ANAEROBICOS Los métodos para cultivos anaeróbicos son muchos y hay desde métodos sencillos a complejos, unos económicamente caros y otros baratos. Independientemente del costo los

métodos que se pueden utilizar son: exclusión de aire por calor, método de Roux, método de Wright, agar en profundidad y agentes reductores. Los métodos más utilizados son: el de Brewer, que consiste en una caja especial a la cual se le añade tioglicolato de sodio mezclado con agar para extraer el oxígeno presente y después inocular, se cubre con la tapa de Brewer la cual tiene deprimida casi toda la porción central, de tal modo que queda una capa de aire muy delgada por encima del agar y que se extrae por la sustancia que se adiciona al medio. MÉTODO DE LA JARRA ANAERÓBICA Consiste en un frasco de boca ancha en el cual se introduce la caja petri y por encima una veladora encendida, se tapa y se somete a incubación a 37 grados durante 24 horas. Otros métodos consisten en utilizar recipientes especiales como son: recipientes de  Novy, caja de Bray y Spray, en las que se utilizan mezclas de sustancias que reducen el oxígeno y desprenden CO2 creando condiciones de anaerobiosis; en el caso del recipiente de  Novy el aire se extrae con una bomba de vacío y se sustituye por un gas inerte. MÉTODO DE ÁCIDO PIROGÁNICO Se lleva a cabo en cultivo de agar inclinado y se fundamenta en el empleo de una solución alcalina y de ácido pirogánico para absorber el oxígeno del tubo de ensayo. Los tubos deberán taparse con algodón hidrófilo, no es necesario que sea estéril, se corta o se quema la  parte superior del algodón y se introduce en el tubo un cm. por debajo del ácido pirogánico desecado. En el espacio se agrega un ml. de solución caliente de Hidróxido de Sodio al 10%  para disolver el ácido, se cierra con tapón de hule y se sella con parafina fundida. El tubo debe incubarse en posición vertical. Otros métodos que no son muy utilizados son: la utilización de recipientes anaerobios de fósforo, recipientes anaerobios con fósforo de Varney, recipientes bajo presión aumentada de CO2, etc.

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE BACTERIAS Los cultivos puros representan condiciones artificiales para el desarrollo de las  bacterias y otros microorganismos y las condiciones son impuestas mediante su manejo en el laboratorio. Existe una gran variedad de técnicas por medio de las cuales las diferentes especies de una muestra natural pueden ser aisladas y desarrollarse como un cultivo puro. Las técnicas son: TÉCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIA, T. DE DIFUSIÓN EN PLACA, T. DE PLACA VERTIDA, T. DE ENRIQUECIMIENTO DEL CULTIVO, T. DE LAS DILUCIONES EN SERIE Y T. DE AISLAMIENTO DE UNA SOLA CÉLULA. TÉCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIA En este método se utiliza un asa bateriológica, con la cual se pasa una porción de la muestra a la superficie de un medio de cultivo sólido donde se siembra por estrías. Se recomienda utilizar mínimo tres cajas con medio de cultivo. También se puede seccionar  imaginariamente la caja en tres o cuatro partes para diluir la muestra. TÉCNICA POR DIFUSIÓN EN PLACA En este método por lo común se utiliza una varilla de vidrio estéril para adelgazar la muestra. Es parecido al anterior y las colonias crecen en la superficie del medio. TÉCNICA DE LA PLACA VERTIDA El principio de la técnica es la dilución o adelgazamiento de la muestra en tubos que contienen agar fundido y enfriado, también es necesario utilizar tres o más tubos para poder  obtener colonias más aisladas. El medio debe mantenerse en estado líquido, aproximadamente 45 grados centígrados para poder que se disperse adecuadamente el inoculo. Una vez sembrado, el medio se pone en cajas de petri estériles donde se deja solidificar para después incubarse a 37 grados centígrados. En este caso algunas colonias u organismos quedan atrapados entre el agar, pero también se observarán colonias en la superficie del mismo.

Todas las técnicas anteriores se pueden mejorar si se utilizan medios selectivos o diferenciales para el aislamiento o también se puede tratar al medio con ciertas condiciones físicas cuando se desea obtener ciertos organismos y eliminar otros. TÉCNICA DE DILUCIONES EN SERIE Método muy útil cuando en una muestra mixta, el microorganismo que buscamos se encuentra en mayor cantidad que cualquiera de los otros. El cultivo puro lo podemos obtener a  partir de diluciones en tubo y pases sucesivos de tal manera que después de tanto diluirse la muestra podrá contener el microorganismo que deseamos, pudiendo confirmar lo anterior  haciendo una siembra del cultivo que se supone está puro en una placa con medio sólido. Ahora cuando tenemos el microorganismo que buscamos en una cantidad menor o escasa que los demás microorganismos en una muestra mixta y la queremos aislar, podemos utilizar la TÉCNICA DE ENRIQUECIMIENTO DEL CULTIVO, con esto podemos mejorar  las posibilidades de aislamiento de tipos fisiológicos poco frecuentes. El principio consiste en utilizar medios de composición conocida como los medios de enriquecimiento y saber cuales son los sustratos que requiere el microorganismo para aumentar la población y después inocularse en placas para su aislamiento. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE UNA SOLA CÉLULA Método que se utiliza en estudios muy especializados y que la practique un operador  experimentado; hace necesario el uso de un MICROMANIPULADOR como equipo especial adaptado a un microscopio, que permite controlar los movimientos de una micropipeta o microcánula (aguja muy fina), dentro de una gota pendiente de donde se puede extraer una sola célula dentro de un tubo, para después pasarla a un medio de cultivo apropiado para su desarrollo. . MEDIOS DE CULTIVO Y PREPARACIÓN La preparación y el examen de cultivos, es una técnica especial que requiere de gran cuidado y atención en cada paso a realizarse; ya que de ello depende:

a) Un buen estudio de los microorganismos.  b) Condiciones de seguridad (cuando se trata de microorganismos peligrosos). c) Evitar la contaminación de los cultivos y otros materiales utilizados. Recordemos que existen microorganismos en el polvo, dedos y en todo el medio ambiente. Las distintas mezclas de sustancias nutritivas empleadas en el laboratorio para el cultivo de microbios se denominan genéricamente medios de cultivo. La mayoría de los medios de cultivos utilizados, son mezclas preparadas empíricamente por los microbiólogos (sin conocimiento exacto de su composición o de su valor nutritivo específico). Los medios de cultivo artificiales de composición química definida y reproducible aumenta día con día con la finalidad de resolver problemas especiales en investigación y en la Microbiología industrial. REQUERIMIENTOS GENERALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios deben hasta ciertos límites parecerse al sustrato natural sobre el cual habitan los microorganismos, ejemplo, extractos del suelo para microorganismos del suelo, sangre o suero para los patógenos de animales y humanos y extractos de plantas para los  patógenos vegetales. Estos pueden ser: 1. Requerimientos para desarrollo a) Substancias orgánicas  b) Substancias inorgánicas 2. Requerimientos de energía

Todos los requerimientos nutricionales básicos, de los medios de cultivo proporcionan elementos y la energía necesaria para sintetizar sus propios componentes metabólicos, como enzimas y coenzimas; que además la constante biosíntesis y la energía conducirán a su reproducción. Al igual que otros organismos tienen en sus constituyentes fundamentales; proteínas, carbohidratos, lípidos, sales minerales, vitaminas y ciertos factores de crecimiento. Ahora dependiendo de sus capacidades para sintetizar los componentes, las bacterias se  pueden clasificar como: AUTOTROFICAS, HETEROTROFICAS E HIPOTROFICAS. Las bacterias AUTOTROFICAS, sintetizan todos los componentes metabólicos a partir  de moléculas orgánicas que contienen Nitrógeno, Amoniaco, Anhidrido carbónico, compuestos simples de Carbono, Fosfatos y agua; para lo cual necesitan todo un conjunto de enzimas. Otras bacterias, tienen la habilidad de utilizar para su nutrición, substancias simples  para su energía, Glucosa como fuente de carbono, Aminoácidos como fuente de Nitrógeno, ejemplo: Chromatium, Thiobacillus. Las bacterias HETEROTROFICAS, tienen poca habilidad sintética, por lo que son más exigentes en su nutrición. Requieren de proteínas ya formadas, de vitaminas, factores de crecimiento y gases indispensables, que se descompone por enzimas hidrolíticas haciéndolas asimilables, las cuales ya dentro de las células son ensambladas y utilizadas por la célula. Ejemplo: Escherichia coli, Lactobacilos, Salmonella typhi, proteus, estafilococos, etc. Las bacterias HIPOTROFICAS, son organismos muy exigentes que no se pueden cultivar en medios artificiales por más ricos que sean. Requieren de todo un sistema metabólico funcionando, por lo que solo se multiplican dentro de las células en pleno metabolismo, ejemplo: Ricketsias, Clamidas, Virus, etc. También de acuerdo a la fuente de energía que utilicen o de cómo la obtengan las bacterias pueden nombrarse FOTOTROFAS si la obtienen de luz radiante y QUIMIOTROFAS sin son incapaces de asimilar energía radiante y se valen de la oxidación de compuestos químicos para obtener su energía.

COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS: Muchas bacterias requieren solo los medios ordinarios de cultivo, otros necesitan medios especiales para su desarrollo y/o para su identificación o cuando las características de cultivo y las reacciones específicas son los factores determinantes. Muchos medios de cultivos contienen: Macerados de carne en agua que por lo común se encuentran como extractos de carne (bovino, cerdo, etc. ya preparados). Contienen Peptonas, sal (cloruro de sodio), y si se desea, también se el puede dar consistencia al caldo o medio cuando se desea estudiar las características coloniales o aislar un determinado microorganismo.  NATURALEZA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO De acuerdo a la naturaleza, los medios de cultivo se denominan como SINTETICOS Y  NO SINTETICOS. SINTÉTICOS: Son medios que generalmente son utilizados para estudiar los requerimientos nutricionales de los organismos. En estos sus constituyentes químicos están químicamente definidos en su composición.  NO SINTÉTICOS: Medios utilizados para multiplicación de microorganismos, así como para el estudio taxonómico de los mismos y cuya composición química no está bien definida. Por lo que considerando dicha composición y su estado físico, se pueden clasificar  como: A) MEDIOS LÍQUIDOS  No sintéticos. Ejemplo: leche: sustrato de origen natural, cuya composición favorece el crecimiento bacteriano. Son caldos o soluciones acuosas de substancias de origen natural tales como peptonas, levaduras y extractos de carne cuya composición no está bien definida, pero que favorecen el

crecimiento bacteriano. En su composición no contienen substancias como gelatina o agar y  por lo tanto no solidifican o gelifican pero se puede preparar a partir de estos medios sólidos. B) MEDIOS SÓLIDOS LICUABLES Se preparan añadiendo agar a los caldos en una proporción de 1 a 1.5% o con una mezcla de Agar - Gelatina, son utilizados para conservar vivas las cepas de los cultivos por  largos periodos. C) MEDIOS SÓLIDOS Están hechos a base de compuestos orgánicos como: rebanadas de papa, trozos de zanahoria, suero sanguíneo coagulado, útiles para el crecimiento y taxonomía. También puede contener compuestos inorgánicos: silice, usado como solidificante cuando los agentes orgánicos como el agar interfieren con el crecimiento específico de la bacteria. Los medios sólidos constan generalmente de agar, gelatina o albúmina. Son necesarios  para el estudio de las características coloniales; así como para el aislamiento de especies  bacterianas. El agar se disuelve en el agua cerca del P. E., se solidifica alrededor de los 38 grados centígrados y no vuelve a licuarce hasta que se hierve de nuevo. (el agar se disuelve alrededor  de una concentración del 2 al 3% y la gelatina del 10 al 15% y solidifica a una temperatura de 25 grados centígrados. Actualmente los medios de cultivo se pueden obtener artificialmente en el comercio en forma de polvos secos. Estos productos deshidratados se transforman fácilmente en medios de cultivo por adición de agua y esterilización. De acuerdo a su función o a su aplicación, a los medios se les puede clasificar de la siguiente manera: > Medios enriquecidos > Medios enriquecedores

> Medios diferenciales > Medios selectivos > Medios de ensayo MEDIOS ENRIQUECIDOS: Son medios de cultivo que se preparan a base de la adición de componentes o substancias como sangre, suero, extractos de tejidos de animales y  plantas, carbohidratos, caseína digerida, extractos de levaduras, etc. al caldo nutritivo o agar, les proporciona substancias nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento de bacterias más exigentes. Ejemplo: aquellos medios que se hacen con suero sanguíneo coagulado (Loefer para bacilos diftéricos), o mezclas coaguladas de glicerina y huevo (Loweinstein- Jensen para bacilos de la tuberculosis); así como los que se preparan enriqueciendo caldo o agar simple con Carbohidratos, sangre, suero sanguíneo, caseína digerida, extractos de levaduras, etc. MEDIOS ENRIQUECEDORES: Son medios de cultivos que ya tienen las substancias nutritivas en su composición, sirven para cuando deseamos estudiar microorganismos que se encuentran en muy pequeñas cantidades en la naturaleza y se puede aumentar su población, ejemplo: caldo nutritivo, caldo de selenio, sales biliares, etc. MEDIOS DIFERENCIALES: Son medios que ponen de manifiesto diferencias entre grupos de microorganismos que se deseen estudiar y otros gérmenes que pueda haber. Contienen en su composición una substancia indicadora (Azúcar) y una substancia inhibidora (Colorante), que son factores que permiten distinguir características metabólicas y las características morfológicas diferentes debido a la utilización de los sustratos del medio, ejemplo: EMB, AGAR SANGRE, MAC CONCKEY, etc. Estos medios favorecen el desarrollo de bacilos tifoideos y otros microorganismos afines, que causan infecciones intestinales; inhibe también el desarrollo de bacilos ordinarios, así como microorganismos Gram Positivos y favorece el crecimiento de Gram Negativos.

Para que puedan desarrollarse libremente especies que interesan, con frecuencia se añade penicilina, estreptomicina, acitidiona u otros antibióticos, para evitar el desarrollo de gérmenes indeseables. MEDIOS SELECTIVOS: Son medios preparados a base de agar nutritivo, al cual se le adicionan ciertas substancias químicas específicas inhibidoras que permiten el crecimiento de algunas bacterias y que inhiben el desarrollo de otro grupo de bacterias. Esto significa que se pueden seleccionar las bacterias que solo se desarrollan en  presencia de compuestos orgánicos poco comunes, agregándolas al medio de cultivo y omitiendo todos los demás compuestos. Algunos ejemplos de este tipo de medios son: -

Staphilococcus No. 110 (S- 110)

-

Agar dextrosa Sabouraud (para hongos, PH = 5.6)

-

Caldo peptona (para espirilos del cólera, alcalino con PH = 8.5)

-

Agar Salmonella - Shigella (Agar S_S)

-

Agar Verde Brillante MEDIOS DE ENSAYO: Son medios que se utilizan con el fin de identificar y

clasificar a los microorganismos. Estos medios fueron ideados para ensayar los microorganismos según sus actividades metabólicas particulares. Por lo anterior mencionado, se utilizan una gran variedad de medios de cultivo; que se toman en cuenta como pruebas que se relacionan con el metabolismo bacteriano. Algunos ejemplos son: Voges- Proskauer, Rojo de Metilo, Producción de Indol, Prueba de Ureasa, Citrato, reducción de Nitratos, SIM, Agar Férrico con Azúcar Triple (TSI), Agar  Hierro Kligers (KIA), Malonato, etc.

IV. GENÉTICA BACTERIANA Introducción: La teoría sobre la herencia y variabilidad de los organismos vivos fue creada por C. Darwin en 1859, quien demostró que todas las especies vegetales y animales existentes sobre la tierra aparecieron mediante variabilidad, esto a partir de formas orgánicas. Dichos hechos se encuentran sujetos a las leyes fundamentales de le Genética, las cuales fueron descritas y posteriormente enunciadas por el Naturalista Checo G. Mendelev, todas estas leyes fueron estudiadas más tarde y con más detalle por H. de Vries, T. Morgan, H. Muller, N. Vavilov y otros. Otros científicos que hicieron aportaciones al estudio de la variabilidad de los microorganismos son L. Pasteur, L. Tsenkouski. En 1941, G. Beadle y E. Tatum obtuvieron mutantes bioquímicos en la Neurospora. Tiempo más tarde, en el año de 1953, J. Watson y F. Crick descifraron la estructura de la molécula de DNA y determinación del Códice Genético mediante el cual se observaron y se dieron a conocer los mecanismos de la síntesis de los Polipéptidos y proteínas de todos los seres vivos. Uno de los más importantes acontecimientos que sirvieron en la etapa de desarrollo de la genética, fueron los estudios realizados sobre la transmisión de la información genética, cuyos resultados demostraron que esta transmisión se podía efectuar en dos direcciones. ADN - - - - - - - - - - ARN - - - - - - - - - - PROTEÍNA ARN - - - - - - - - - - ADN - - - - - - - - - - PROTEÍNA

Actualmente una de las nuevas tendencias es la Ingeniería - Genética, mediante la cual es posible realizar transplantes de Genes de la célula a la otra, lo cual permite de un modo determinado, dirigir la herencia, sustituyendo un gene por otro. De esta manera se puede decir acertadamente que la genética de los microorganismos representa la base de la BIOLOGÍA MOLECULAR; por lo que muchos descubrimientos en el campo de la genética de los microorganismos, se han utilizado con bastante eficiencia en la Biología y en la Medicina. Como podemos darnos cuenta, debido a la organización simple, reproducción rápida, a que son haploides (por lo general), ya que en ellos pueden reproducirse con facilidad mutaciones inducidas y recombinaciones genéticas; las bacterias y los virus se han convertido en objetos principales, tanto del estudio de la estructura como de la función de los genes exclusivamente. LA GENÉTICA es la disciplina que estudia los mecanismos por los cuales los caracteres pasan de un organismo a otro. El estudio de la genética se enfoca hacia la comprensión de la variabilidad de los organismos y la evolución de la especie. También es una importante herramienta de investigación en los intentos por comprender los mecanismos moleculares que permiten el funcionamiento de las células, proporcionándonos a la vez una forma de introducir nuevas  propiedades a los organismos. La transferencia de genes puede tener lugar de formas diferentes y, si se acompaña por  recombinación genética, puede dar lugar a la formación de nuevos organismos. LA RECOMBINACIÓN GENÉTICA es una herramienta importante en la dirección de la estructura genética de un organismo. También es de gran importancia ya que todo lo mencionado anteriormente constituye una de las actividades primordiales en el campo de la Ingeniería Genética.

Dentro de los principios básicos de la Genética, se tiene que la recombinación es el  proceso mediante el cual los elementos genéticos, contenidos en dos genómas separados se unen en una sola unidad. Por lo que debido a este mecanismo pueden originarse dos genotipos, aun en ausencia de Mutaciones. En los Procariontes, la recombinación genética implica: 1. La inserción en una receptora, de un fragmento de DNA genético diferente de una célula donadora. 2. Debe efectuarse la integración de este fragmento de DNA o de sus copias en el genoma de la célula receptora. Existen tres mecanismos mediante los cuales el fragmento de DNA es introducido en la célula receptora: Estos tres mecanismos son conocidos como COMBINACIONES GENÉTICAS, y son: CONJUGACIÓN, TRANSDUCCIÓN Y TRANSFORMACIÓN. En las recombinaciones bacterianas, las células no se fusionan y usualmente una  porción del cromosoma de la célula donadora (macho) es transferido a una célula receptora (hembra). En cuanto al mecanismo se cree que dentro de las células receptoras el fragmento de DNA de la donadora se coloca a lo largo del DNA de la receptora, de tal forma que queden adyacentes los genes homólogos. Ciertas enzimas actúan sobre el DNA de la receptora, causando cortes y la incisión de un fragmento, luego el DNA de la donadora queda integrado en el cromosoma receptor en el lugar del DNA previamente escindido. La célula receptora se convierte entonces en la célula recombinante porque su cromosoma receptor contiene DNA tanto de la célula donadora como de la receptora.

MECANISMO DE CONJUGACIÓN. Es uno de los tres mecanismos de transferencia de material genético de una bacteria a otra y depende de un contacto físico entre célula y célula; aquí es posible que sean transferidos grandes segmentos del cromosoma y en casos especiales el cromosoma entero. MECANISMO DE TRANSFORMACIÓN. Proceso mediante el cual el DNA (desnudo) o libre y que contiene una limitada cantidad de información genética, es transferido desde una célula a otra. El DNA se obtiene de una célula donadora por lísis natural de la célula o por  extracción química. MECANISMO DE TRANSDUCCIÓN. Proceso en el que hay transferencias de genes desde una bacteria a otra mediante un Bacteriófago. Cuando este DNA vírico se integra en el cromosoma bacteriano se denomina PROFAGO. Cuando una bacteria entra en el ciclo lítico, sea espontáneamente o por inducción con luz ultra violeta, ocasionalmente parte del cromosoma bacteriano puede quedar ensamblado accidentalmente dentro de la cabeza del fago.

Principios de Inmunología Teoría de la inmunidad: Con el término "inmunidad" ( del latín IMMUNITAS, liberación del tributo o salvación de alguna cosa). Se sobre entiende la insusceptibilidad del organismo de las infecciones o agentes no infecciosos que le es genéticamente heterogéneas. El organismo animal y humano distingue con suma exactitud la "propia" de lo "extraño", propiedad gracias a la cual se asegura la defensa contra la introducción no solo de m.o. patógenos, sino contra las sustancias extrañas entre proteínas polisacáridos, lipopolisacáridos y otras. La ciencia que se ocupa de los problemas de inmunidad y que se a denominado INMUNOLOGÍA, se convirtió en una rama independiente. Ella se dedica a un amplio campo de fenómenos biológicos: Mecanismos de defensa contra los agentes de las enfermedades infecciosas y tumores, establecimientos de vínculos genéricos entre el mundo vegetal y animal, problemas de la inmunohematología, inmunogenética, inmunohistoquímica, inmunodiagnóstico, etc.

V. RELACIÓN HUÉSPED - PARÁSITO La mayor parte de los microorganismos que habitan en el cuerpo humano lo hacen porque se  benefician de los nutrientes y del hábitat protegido que este cuerpo humano les provee. Pero desde el punto de vista del cuerpo humano esta relación puede ser mutualismo, comensalismo o

parasitismo,

según

sea

beneficiosa,

neutral

o

perjudicial,

respectivamente.

Independientemente del tipo de relación, todas comienzan con el contacto, algunos microorganismos se establecen permanentemente colonizándolo (microbiota normal), otros desaparecen rápidamente (transeuntes) y otros invaden los tejidos. Este contacto con los microorganismos conduce a la infección, condición en la cual el microorganismo patógeno elude las defensas del huésped, penetra en los tejidos y se multiplica. Cuando los efectos acumulativos de la infección dañan los tejidos se produce una enfermedad infecciosa. La relación huésped - parásito comienza con el contacto, progresa a la infección y finaliza en enfermedad. Cuando un microorganismo potencialmente infeccioso está presente en el cuerpo sin invadirlo todavía se le denomina contaminante, por lo que estar contaminado no es lo mismo que estar infectado ya que no todas las contaminaciones acaban en infección y no todas las infecciones acaban en enfermedad. De hecho, la contaminación sin infección y la infección sin enfermedad es la regla.

Microbiota normal del cuerpo humano: El cuerpo humano debido a que mantiene relativamente estables su pH, temperatura y un aporte constante de nutrientes, provee un hábitat favorable para una gran cantidad de microorganismos. De hecho es tan favorable que célula a célula en el cuerpo humano existen 10 veces más células de microorganismos que humanas. Esta gran mezcla de microorganismos adaptada al cuerpo humano recibe el nombre de microflora, aunque el término más preciso es el de microbiota. Esta microbiota incluye bacterias, hongos y protozoos.

Origen de la Microbióta: Antes del nacimiento un feto humano sano está libre de microorganismos. El primer encuentro del recién nacido con los microorganismos es en el canal del parto y especialmente en la vagina. El recién nacido adquiere los microorganismos por contacto superficial, tragando o inhalando. Posteriormente los adquiere a través de los objetos y personas que le cuidan (leche artificial: coliformes, lactobacilos, enterococos; leche materna: Bifidobacterium). Cada parte

del cuerpo humano, con sus condiciones ambientales especiales, tiene su propia mezcla de microorganismos. Por ejemplo, la cavidad oral adquiere una población natural diferente a la de los intestinos. En un corto período de tiempo (erupción de los dientes e introducción de alimentos sólidos) el niño tendrá el mismo tipo general de microbiota que una persona adulta que viva en el mismo ambiente. La naturaleza de esta microbiota va a depender de factores tales como la frecuencia de lavados, dieta, prácticas higiénicas y condiciones de vida.

Distribución de la microbióta en el cuerpo humano: La Sangre, los fluidos corporales y los tejidos En individuos sanos la sangre, fluidos corporales y tejidos están libres de microorganismos.

Piel La epidermis junto con la dermis forman una barrera frente a muchos microorganismos debido a que son impermeables a éstos, por lo que a la piel se la denomina la primera línea de defensa. La constante exposición de la piel al medio ambiente implica que en ésta existan muchos microorganismos transeuntes. Sin embargo la superficie de la piel es hostil a la supervivencia y crecimiento de muchas bacterias debido a su sequedad, bajo pH (3-5) y sustancias inhibitorias (lisozima que destruye el peptidoglucano). A pesar de estos factores algunas bacterias pueden sobrevivir en la piel, crecer y formar la microbiota normal ya que las glándulas sudoríparas y sebáceas excretan agua, aminoácidos, urea, sales y ácidos grasos que sirven como nutrientes a estos microorganismos. La mayor parte de estas bacterias son especies de Staphylococcus (S. epidermidis) aunque también existen Micrococcus y Corynebacterium. En la parte más profunda de las glándulas sebáceas existen bacterias anaeróbicas como Propionibacterium acnes que al ser parte de la microbiota, normalmente no es perjudicial; sin embargo, ha sido asociado con el acné, una enfermedad de las glándulas sebáceas de la piel. Debido a su localización profunda, el número de estas propionibacterias se vé muy poco afectado por el lavado o por las soluciones desinfectantes.

Ojos La conjuntiva es lavada contínuamente por las lágrimas que además de remover a los microorganismos contiene lisozima. Consecuentemente, la microbiota de la conjuntiva es

esporádica. Los principales microorganismos encontrados son Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Corynebacterium, Streptococcus pneumoniae, Neisseria spp.

Tracto respiratorio El tracto respiratorio es un sitio difícil para la colonización de los microorganismos ya que en el tracto respiratorio alto los microorganismos que están en el aire que respiramos pasan a través de las fosas nasales a la nasofaringe quedando pegados en el moco el cual contiene lisozima; al pasar este moco a la faringe, las bacterias atrapadas en el moco pueden ser  tragadas y destruídas por el HCl del estómago. A pesar de ésto existen numerosos microorganismos en las fosas nasales debido a la habilidad de adherirse a las células epiteliales de las membranas mucosas. Las bacterias más frecuentemente encontradas en las fosas nasales son Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus; en la nasofaringe cepas avirulentas de ßtreptococcus pneumoniae. El tracto respiratorio bajo no posee microbiota debido a que los microorganismos se eliminan mecánicamente por los cilios de la tráquea. Si alguna bacteria pasa a través de la tráquea es fagocitada por los macrófagos.

Boca La abundante y constante presencia de alimento disuelto en la boca hacen de ella un ambiente ideal para el crecimiento bacteriano. Sin embargo, el contínuo flujo de saliva hace que los microorganismos se tragen y destruyan por el HCl del estómago. Consecuentemente la mayor   parte de los microorganismos que constituyen la microbiota de la boca resisten estos mecanismos al adherirse firmemente a las distintas superficies de la cavidad oral. Los dientes son un área de esta adherencia bacteriana, de hecho la placa dental es una agregación de  bacterias y materia orgánica. La caries está iniciada por Streptococcus mutans al hidrolizar la sacarosa en glucosa y fructosa. La glucosa es polimerizada en glucano y la fructosa metabolizada a ácido láctico. El glucano actúa como cemento uniendo las bacterias a los dientes y el ácido láctico actúa como abrasivo. Una vez iniciado el ataque por Streptococcus mutans, otras bacterias como Lactobacillus y Actinomyces contribuyen como invasores secundarios en el desarrollo de la caries. La microflora normal de las encías consiste fundamentalmente en bacterias Gram (+) como Streptococcus sanguis y especies de Actinomyces.

Tracto gastrointestinal La mayor concentración de microbiota normal del cuerpo humano se encuentra en el tracto gastrointestinal.

Estómago: aunque el estómago está recibiendo constantemente bacterias transeuntes de la cavidad oral, un estómago sano contiene muy pocas bacterias debido al efecto bactericida del HCl y enzimas digestivos. Los pocos microorganismos que se encuentran son lactobacilos y levaduras (Candida spp.).

Intestino delgado: en el duodeno sobreviven pocas bacterias debido a la combinación del ambiente fuertemente acídico del estómago y la acción inhibitoria de la bilis. De los microorganismos presentes, la mayoría son cocos y bacilos Gram (+). En el yeyuno se encuentran especies de enterococos, lactobacilos y corinebacterias. También puede encontrarse la levadura Candida albicans. La última parte del intestino delgado, el íleon, posee una microbiota más abundante y parecida a la del intestino grueso. En el íleon crecen bacterias anaerobias como Bacteroides y anaerobios facultativos como Escherichia coli.

Intestino grueso: el colon es la parte del cuerpo humano que contiene la mayor población microbiana. Se calcula que un adulto excreta alrededor de 30 billones de células bacterianas diariamente a través de la defecación. Se han aislado alrededor de 300 especies bacterianas diferentes de las heces humanas. En el intestino grueso existen 300 veces más bacterias anaerobias (Bacteroides y Fusobacterium) que anaerobios facultativos (Escherichia, Proteus, Klebsiella y Enterobacter); también se encuentra la levadura Candida albicans. Una  prolongada terapia con ciertos antibióticos pueden eliminar muchos microorganismos de la microbiota normal intestinal permitiendo el crecimiento de especies resistentes a los antibióticos lo que puede causar transtornos gastrointestinales como es la diarrea. La administración oral de la bacteria Gram (+) Lactobacillus acidophilus puede aliviar estos desórdenes intestinales ya que la ingestión de estos microorganismos reemplaza a los organismos intestinales indeseables. Existen en el mercado muchos productos comerciales con fines terapéuticos que contienen lactobacilos.

Tracto genitourinario En individuos sanos los riñones, uréteres y vejiga están libres de microorganismos por lo que

la orina en la vejiga también lo está. Sin embargo existen bacterias en la parte inferior de la uretra tanto en hombres como mujeres (Staphylococcus epidermidis, Streptococcus faecalis y corinebacterias) de tal manera que la orina adquiere estos microorganismos cuando pasa de la vejiga al exterior del cuerpo humano en la parte inferior de la uretra. El tracto genital femenino tiene una microbiota compleja. Durante los años que existe actividad en los ovarios (pubertad --> menopausia) la microbiota principal de la vagina son lactobacilos ácido tolerantes (bacilos de Doderlein); éstos hidrolizan el glucógeno producido por el epitelio vaginal en estos años debido a la acción de los estrógenos, formando ácido láctico. Como resultado, el pH de la vagina se mantiene entre 4,4 y 4,6. Los microorganismos capaces de crecer a este bajo pH son los que se encuentran en la vagina (enterococos, corinebacterias y Candida albicans). Este glucógeno no está presente antes de la pubertad ni después de la menopausia, con lo que las secreciones vaginales son suavemente alcalinas y contienen microorganismos normales de la piel y colon.

Factores de Patogenicidad Microbiana: Patogenicidad es un término general que se utiliza para describir las infecciones microbianas. Las propiedades que contribuyen a que un patógeno infecte y dañe los tejidos del huésped se llaman factores de virulencia. La virulencia (invasión y toxicidad microbiana) puede deberse a uno o a múltiples factores. En algunos microorganismos las causas de la virulencia están claramente establecidas mientras que en otros no lo están tanto. A continuación vamos a describir los factores de patogenicidad y virulencia.

Puerta de Entrada: Al iniciar una infección, un microorganismo penetra en los tejidos del cuerpo por una ruta característica, la puerta de entrada que para la mayor parte de los microorganismos suelen ser  las mismas regiones anatómicas que contienen microflora normal: piel, tracto alimentario, tracto respiratorio y tracto genitourinario. La mayor parte de los patógenos se han adaptado a una puerta específica de entrada, aquella que le provee de un hábitat adecuado para crecer y diseminarse. Esta adaptación puede ser tan restrictiva que si ciertos patógenos penetran por la  puerta "equivocada" no serán infecciosos. Por ejemplo, la inoculación de la mucosa nasal con el virus de la gripe invariablemente conlleva a la gripe, pero si el virus contacta sólo con la  piel no habrá infección.

Tamaño del Inóculo: Otro factor crucial para el curso de la infección es la cantidad de microorganismos presentes en el inóculo. Para la mayor parte de ellos la infección tendrá lugar si existe un número mínimo de células llamado dosis infecciosa (ID). Este número se ha determinado experimentalmente para muchos microorganismos variando desde 1 célula en la fiebre Q, 10  partículas virales en la rabia, 1000 células en la gonorrea, 10000 células en la fiebre tifoidea hasta 109 células en el cólera. En general, los microorganismos con ID pequeños tienen mayor  virulencia. Si el tamaño del inóculo es más pequeño que el ID, la infección generalmente no  progresará. Si el tamaño del inóculo es mucho mayor que el ID, el comienzo de la enfermedad  puede ser más rápido.

Mecanismos de Invasión, Establecimiento de los microorganismos Patógenos Una vez que el patógeno ha contactado con el huésped a través de las vías de entrada, el siguiente paso en la infección requiere que el patógeno (i) se una al huésped; (ii) atraviese el epitelio y (iii) se establezca en los tejidos.

a.- Adhesión Es el proceso mediante el cual los microorganismos consiguen una posición más estable en el  portal de entrada, lo que les permite no ser fácilmente eliminados y estar listos para invadir los compartimentos estériles del cuerpo. Los mecanismos que utilizan los patógenos bacterianos en la adhesión incluyen fimbrias o pilis, flagelos y cápsulas. Los virus se unen a través de receptores especializados.

b.- Factores de virulencia (penetración e invasión) Los factores que contribuyen a la penetración e invasión de los tejidos se dividen en exoenzimas, toxinas y factores antifagocíticos.

Enzimas extracelulares: muchas bacterias y hongos patógenos secretan exoenzimas que rompen e inflingen daños en las estructuras epiteliales. Los siguientes enzimas disuelven las  barreras defensivas del huésped y promueven la diseminación de los microorganismos en

tejidos más profundos: - Mucinasa: destruye la capa protectora de las membranas mucosas; la produce Vibrio cholerae. - Queratinasa: digiere el principal componente de la piel y pelo; la producen los hongos dermatofitos. - Colagenasa: digiere la principal fibra del tejido conectivo; la producen especies de Clostridium. - Hialuronidasa: digiere la sustancia que actúa como cemento de las células animales compactándolas, ácido hialurónico. Este enzima es un importante factor de virulencia en estafilococos, clostridios, estreptococos y neumococos. - Algunos enzimas reaccionan con los componentes de la sangre como es el caso de la coagulasa producida por estafilococos patógenos que coagula la sangre. Las kinasas  bacterianas disuelven los coágulos favoreciendo la invasión de los tejidos dañados.

Toxinas bacterianas: una toxina es un producto químico específico de microorganismos,  plantas y algunos animales que es venenoso para otras formas de vida. Toxigenicidad es la capacidad de producir toxinas; esta capacidad es una característica de muchas especies controlada genéticamente siendo la responsable de los efectos adversos de una variedad de enfermedades llamadas toxinosis. Toxemia es una toxinosis en la cual la toxina se distribuye a través de la sangre desde el sitio de infección (tétano y difteria). Intoxicación es una toxinosis causada por la ingestión de toxinas (botulismo). Las toxinas se denominan de acuerdo a su sitio específico de acción en:  Neurotoxinas cuando actúan en el sistema nervioso. Enterotoxinas cuando actúan en el intestino. Hemotoxinas cuando lisan los hematíes.  Nefrotoxinas cuando dañan los riñones. Las toxinas también se pueden clasificar según su origen en: Exotoxinas: toxinas secretadas por una célula bacteriana viva en el tejido infectado. Endotoxinas: toxinas que sólamente se liberan después de que la célula ha sido dañada o lisada. Nunca se secretan. Las diferencias entre exotoxinas y endotoxinas son:

Factores antifagocíticos: Los fagocitos son células que bloquean el avance de los microorganismos en los tejidos. A través de la fagocitosis los patógenos son introducidos dentro del fagocito donde son destruídos por potentes enzimas. Para combatir la fagocitosis muchos microorganismos han adoptado mecanismos que evitan el proceso fagocítico (factores antifagocíticos): - Matar los fagocitos: especies de Streptococcus y Staphylococcus producen leukocidinas, sustancias tóxicas para los glóbulos blancos. - Producción de una cápsula que dificulta al fagocito la ingestión del microorganismo. Ejemplos son Streptococcus pneumoniae, Salmonella typhi, Yersinia pestis y Neisseria meningitidis. - Supervivencia dentro del fagocito: algunas bacterias se han adaptado a sobrevivir dentro del fagocito después de la ingestión. Especies patógenas de Legionella, Listeria y Mycobacterium son capaces de evitar su destrucción dentro del fagocito. Esta supervivencia intracelular en los fagocitos tiene especial significancia ya que provee a los microorganismos de un lugar donde "esconderse", crecer y distribuirse a través del cuerpo.

Mecanismos fundamentales de defensa Sistema inmune (organismo) vertebrados, se clasifica: 1. Sistema linfositoide o celular o células en B. 2. Sistema plasmacitoide o humoral o células en T. -

Tanto vacunas como los m.o. infectados estimula los mecanismos de resistencia (sistema inmunitario).

-

Cuando se está en contacto previo con este tipo de m.o. o sustancias extrañas se dice que ha adquirido INMUNIDAD ADQUIRIDA.

-

El sistema inmune tiene la capacidad de distinguir entre célula y sustancia de su propio organismo y las que tienen otro origen.

Sustancias extrañas:

1. Virus, 2. Toxinas: Sustancia inmunosa elaborada por un organismo. 3. Toxoide: Toxina que ya ha sido tratada para destruir su propiedad tóxica sin afectar sus propiedades antigénicas, 4. Bacterias, 5. Vacunas. -

Estas pueden activar el sistema inmune ya que son reconocidas como sustancias extrañas o antigenos.

ANTIGENO: Es cualquier sustancia que introducida en un organismo (vertebrados) provoque una respuesta inmunitaria conducente a la adquisición de inmunidad. INMUNIDAD La respuesta inmunitaria tiene como resultado: 1. La formación de anticuerpos específicos que circulan por el torrente sanguíneo (INMUNIDAD HUMORAL). 2. La

estimulación del número de células reactivas específicas llamadas linfocitos

(INMUNIDAD CELULAR). (Capacidad incrementada para distinguir otras células) o células activadas. Tanto los anticuerpos como los linfocitos especializados reaccionan con el antígeno utilizado como inmunizante. La inmunidad adquirida de esta forma capacita al organismo para destruir o neutralizar  m.o. inmunisores o seres tóxicos. PROPIEDADES DE LOS ANTIGENOS: ANTIGENO: Sin excepciones son sustancias de elevado peso molecular aproximado de 10.000 o superiores.

Los compuestos con peso molecular 6.000 daltones raramente actúan como antígenos de por sí solamente 2 grupos de sustancias naturales se comportan claramente como inmunógenos (estimulan a la rep. inmunitaria). 1. Proteínas, 2. Polisacáridos. PROTEÍNAS: Por lo general estimulan la producción de anticuerpos con mayor eficacia que los polisacáridos, sólo los polisacáridos complejos (grandes) ejemplo: capsulares del Pneumococo son buenos antígenos.

VI. CONTROL DEL DESARROLLO BACTERIANO FUNDAMENTOS: La salud de una nación (hombre) está determinada por la capacidad de sus habitantes o del hombre mismo, para controlar eficazmente las poblaciones microbianas. Por lo general el hombre utiliza procedimientos muy específicos cuando por ejemplo: 

Administra un medicamento para eliminar microbios o parásitos.



Realiza prácticas sanitarias en el hogar o en el hospital.



Purifica el agua que ingiere.



Pasteuriza la leche o cuando practica la conservación y la preservación de los

alimentos. Debido a lo anterior se cree de vital importancia llevar a cabo un buen control de microorganismos con la finalidad de: a) Prevenir la transmisión de infecciones por enfermedades, personas, animales o  plantas.  b) Prevenir la contaminación o la proliferación de microorganismos perjudiciales que deterioren los alimentos.

c) Prevenir el deterioro o destrucción de materiales causados por microorganismos a nivel industrial. d) Control de microorganismos con la finalidad de obtener cultivos puros en la microbiología industrial, en los procesos de cerveza, vino, quesos, etc. e) Evitar contaminación de material que se esté utilizando en el diagnóstico de un microorganismo.

Control de microorganismos en el agua : El control de microorganismos en el agua se lleva a cabo únicamente en relación con medidas sanitarias. Se presentan tres problemas: la purificación del agua para hacerla potable, la  purificación de las albercas y la purificación de las aguas negras.

Potabilización del agua Depósitos de agua. filtración y cloración se someten: a). Se dice que con solo 0.5 ppm de cloro libre eliminará los patógenos entéricos del agua. Purificación de las albercas. El problema de las albercas es algo serio debido a la rapidez con la cual los usuarios o bañistas intercambian microorganismos patógenos, pero  puede ser controlado o resuelto manteniendo concentraciones de cloro libre en 0.5 ppm. Purificación de aguas negras. Es importante la purificación de las aguas negras por la utilización de las mismas en las grandes ciudades o ciudades modernas, donde las aguas negras domésticas se bombean a través de una planta de desechos, que va seleccionando y eliminando botellas, papel, cajas, etc. Después estas aguas se dejan sedimentar en tanques grandes, se procede a decantar y separar el lodo que posteriormente es tratado para luego filtrar y purificar el agua para beber.

Control de microorganismos en la leche; Desde el punto de vista económico no es posible esterilizar completamente la leche, excepto con calentamiento drástico, lo cual hace que pierda el sabor de la leche fresca; sin embargo, al desear obtener o producir la leche evaporada que se enlata, sí se hace uso de la esterilización por calor. Esto no significa que la leche fresca no deba tratarse para controlar los microorganismos de leche contaminada que constituye un vehículo de entrada de muchas enfermedades como lo son la tuberculosis y la fiebre ondulante causada por Brucella entre las más importantes y otras producidas por infecciones en las vacas con estreptococos del grupo A, Salmonellas, praphycoccus aureus, etc., o por infecciones de las personas que trabajan en las lecherías; como fiebre tifoidea, disentería, hepatitis, etc. Dado que muchas enfermedades transmitidas por la leche son resultado de la contaminación de ésta, es obvia una medida de control que insista en procedimientos sanitarios durante la producción y embotellamiento o envasamiento de la leche; y dado que aun con estos procedimientos sanitarios no resuelve el problema de prevenir todas la enfermedades, se tiene que asegurar mediante pasteurización.

Control de los microorganismos en los alimentos: Cuando diversos organismos comienzan a crecer en productos alimenticios, pueden descomponerlos o deteriorarlos provocando así enfermedades, otras veces pueden ser  contaminados por el manejo de los mismos por personas infectadas. De ahí que el interés desde el punto de vista de la microbiología de los alimentos se centraliza en su descomposición y en la transmisión de enfermedades ya que los microorganismos patógenos afectan más bien al consumidor que a los alimentos, en sí es necesario tener un control de los microorganismos.

En otro renglón, mediante la prevención de la descomposición de los alimentos, como lo son las carnes se puede lograr por muchos procedimientos sanitarios, aunque el esfuerzo mayor es dirigido hacia medidas de preservación entre las cuales se mencionan: irradiación, temperaturas bajas, desecación, calor, salado, azucarado, ahumado, preservativos químicos, etc. Mediante la prevención de la transmisión de enfermedades las cuales se pueden  prevenir mediante medidas sanitarias.

Control de microorganismos en el aire: El aire no se considera habitat microbiano y las células bacterianas que existan en el aire se toman en cuenta como contaminantes accidentales, o como esporas de hongos dispersadas por el aire. De cualquier forma se intentan medidas de control, ya que son muchas  bacterias patógenas las transportadas a través del aire sobre partículas de polvo o sobre residuos secos de gotitas de saliva, por lo que hay que valorarlas. Entre las medidas de control para este tipo de infecciones están: 

Ventilación sanitaria en habitaciones.



Irradiación ultravioleta en habitaciones.



Desinfección química en habitaciones.

En cuanto al suelo, toda la vida sobre la tierra dependen completamente de las actividades metabólicas de los microorganismos del suelo. Es importante aclarar que no es posible elegir un procedimiento que desinfecte o esterilice todo tipo de material; debido a que en la aplicación de un agente físico, químico, antimicrobiano o quimioterapéutico que es utilizado para inhibir o destruir poblaciones microbianas, hay que considerar muchos factores. Entre los más importantes se tienen: TEMPERATURA, CLASES DE MICROORGANISMOS, ESTADO FISIOLÓGICO DE LAS BACTERIAS, AMBIENTE, etc.

TEMPERATURA: Las temperaturas bajas, elevadas o cualquier cambio de temperatura fuera de los rangos estimados de supervivencia para las células puede influir  inhibiendo o destruyendo a las células. CLASES DE MICROORGANISMOS: Al igual que otros seres vivos los microorganismos también son diferentes unos a otros y por lo tanto difieren en su susceptibilidad en respuesta a los diferentes agentes físicos o químicos, como en el caso de las células vegetativas son más susceptibles que las esporas. ESTADO FISIOLÓGICO: El estado fisiológico de las bacterias influye bastante en la susceptibilidad a los diferentes agentes antimicrobianos, ya que las células jóvenes son más vulnerables que las células viejas, principalmente por los siguientes factores: Las células jóvenes poseen un intenso metabolismo activo. Las células viejas poseen una menor actividad metabólica, a la vez que su pared celular  entre más vieja sea la célula va perdiendo su permeabilidad. AMBIENTE: El medio que rodea a las células microbianas también influye en su desarrollo o se puede inhibir o destruir si las condiciones como las propiedades físicas o químicas del medio o sustancias que se encuentran en el medio no son las adecuadas, la acidez o alcalinidad, la consistencia del material ( si es viscoso o acuoso), ya que influyen también en la penetración lo que puede inactivar a la célula, causándole daños como deshidratación, o ruptura de la misma; como ejemplos se tienen sistemas de plasmólisis, plasmoptisis, ósmosis, etc. Por lo anterior podemos decir que el control de microorganismos que son indeseables en medicina, en la industria, en la agricultura, etc. utiliza diversos métodos y/o artificios para su inhibición o destrucción como los que a continuación se mencionan: AGENTES FÍSICOS,

AGENTES

QUÍMICOS,

AGENTES

ANTIMICROBIANOS

y

AGENTES

QUIMIOTERAPEUTICOS.

ESTERILIZACIÓN POR AGENTES FÍSICOS La esterilización es la eliminación de microorganismos por medio de un agente físico. Se destruyen todas las formas de vida microbiana, no se puede hablar de términos medios, un objeto o material es estéril o no lo es. Diversos agentes físicos tienen efecto sobre la viabilidad de los microorganismos. Entre los más notables se tienen la temperatura (calor y frío en sus aceptaciones comunes y corrientes en lo referente a grados centígrados, la desecación, radiciones ionizantes y no ionizantes, las vibraciones sónicas, la presión, etc.) Muchos de estos agentes son utilizados  para eliminar o destruir microorganismos, así como la contaminación de instrumentos, medios de cultivo, fluidos biológicos, etc. La muerte de las bacterias por el calor es consecuencia de la desnaturalización de  proteínas, donde las ligaduras intramoleculares e intermoleculares (puentes de hidrógeno) de las proteínas, de las cuales depende su funcionalidad son más débiles cuando las proteínas están hidratadas que cuando no lo están, de tal manera que el calor húmedo es más efectivo en la desnaturalización de enzimas y otros componentes proteicos importantes para la célula que el calor seco. Es por eso que se dice que el calor húmedo tiene mayor penetrabilidad. Tanto la esterilización por calor húmedo y por calor seco, pueden ser generados en diversos aparatos y en ambos casos hay factores que condicionan la efectividad de sus  procesos, como lo son: la cantidad de agua, temperatura, tiempo de contacto, superficie de esterilización, pH, edad de las bacterias, presencia de esporas, composición del medio de suspensión, etc. De las técnicas más utilizadas en el laboratorio para la esterilización son las siguientes:

Horno (gas o eléctrico) CALOR SECO

Incineración

CALOR HÚMEDO

Vapor o presión (autoclave) Esterilización fraccionada (vapor fluyente) Tyndalización, aparato Arnold Agua hirviente, Pasteurización

CALOR SECO ESTERILIZACIÓN EN HORNO (CALOR SECO) La esterilización en horno es la aplicación de calor seco, este método físico es utilizado únicamente para material de vidrio, algodón, aceite, telas y otros materiales no combustibles y que se someten a temperaturas menores de 200ºC. Por lo general se consideran suficientes dos horas de exposición a 160ºC ó 180ºC por  espacio de una hora, por lo tanto, no deberán esterilizarse en el horno objetos de hule natural o sintético, ni material de plástico. Tampoco conviene esterilizar al horno recipientes con líquido de cualquier naturaleza, pues se evaporan. El mecanismo de acción es por desnaturalización de las proteínas y también actúa como agente oxidante. Al iniciarse el proceso de elevación de temperatura, las capas más bajas de aire se calientan y se dilatan, posteriormente este aire sube a través de los entrepaños perforados hasta

la pared más alta del aparato, obligando a la capa de aire frío presente a descender, la cual es calentada cuando llega al fondo, estableciéndose una corriente de convección hasta que llega un momento en que toda la temperatura de dentro del horno es prácticamente igual. INCINERACIÓN Es una técnica que se utiliza rutinariamente para esterilizar por ejemplo el asa o para eliminar animales de laboratorios contaminados. CALOR HÚMEDO ESTERILIZACIÓN POR EBULLICIÓN La ebullición consiste en la introducción del material que se quiere esterilizar en el seno de un líquido que tiene una temperatura superior a 70ºC y de preferencia a 100ºC. generalmente con 5 minutos de exposición son suficientes para destruir todas las formas vegetativas, y solo en caso de que haya esporas conviene prolongar el tiempo a 15 minutos o más. A estas temperaturas el agua alcanza a entrar en ebullición y donde las proteínas  pueden ser hidratadas y coaguladas. ESTERILIZACIÓN POR VAPOR A PRESIÓN (AUTOCLAVE) La esterilización por ebullición tiene sus limitaciones sobre todo porque no es posible elevar la temperatura por encima de los 100ºC. sin embargo, el vapor de agua cuando es comprimido dentro de un espacio, adquiere presión logrando temperaturas altas y esta  propiedad es utilizada en el aparato llamado autoclave, que es parecida en su forma y principio a una olla de presión de cocina.

Este aparato es ordinariamente de gran capacidad y tiene forma de un cilindro metálico, generalmente de doble pared. El principio sobre el cual funciona el autoclave es el siguiente: al nivel del mar el agua hierve a 100ºC, sin embargo en el pico de una montaña puede hervir a 35ºC. Si hacemos el vacío en un recipiente cerrado el agua puede hervir a 100ºC. Si nosotros hacemos hervir el agua y no dejamos que el vapor se escape y lo vamos dejando que se acumule en un recipiente cerrado, a medida que se genera más vapor este ejerce fuerte presión sobre la superficie del líquido sin dejarlo que hierva. De esta manera la temperatura se puede elevar considerablemente sobre los 100ºC, sin que el líquido dé muestras de ebullición. Siempre hay que eliminar el aire atrapado en el autoclave al iniciar el proceso de esterilización ya que el aire, si no se deja escapar completamente, puede ejercer al calentarse una presión que no corresponda a la temperatura obtenida. Bastan 15 libras por pulgada cuadrada por un periodo de 15 minutos para que la esterilización sea completa. Este método se usa para esterilizar todo tipo de material: vidriería, medios de cultivo, sondas, guantes, instrumental quirúrgico, telas, batas, soluciones, etc. ESTERILIZACIÓN CON VAPOR DE AGUA SIN PRESIÓN (ARNOLDIZACIÓN) VAPOR  FLUYENTE La esterilización de vapor fluyente o Arnoldización, consiste esencialmente en exponer  el material que queremos esterilizar, no en agua hirviendo, sino a los vapores del agua hirviendo. Este proceso se puede llevar a cabo en el autoclave solo dejando las válvulas de escape abiertas. Este proceso puede ser continuo, o bien intermitente en varios días consecutivos, o en el esterilizador de Arnold.

Esta técnica es aplicable a medios bacteriológicos y sustancias químicas que no pueden calentarse a más de 100ºC sin que resulten dañados; sin embargo, esos materiales pueden resistir esa misma temperatura del vapor solo y así es posible esterilizarlos por medio de esterilización fraccionada o tyndalización y hubiera esporas resistentes y germinaran en la siguiente exposición son destruidas y si persisten se sigue exponiendo por periodos de incubación y exposición al calor. PASTEURIZACIÓN Es un método que es utilizado para darle tratamientos de calor controlado a la leche, crema y ciertas bebidas alcohólicas (cerveza y vino), pero que solo matan cierto tipo de microorganismos pero no a todos. En el caso de la leche pasteurizada no es estéril. La temperatura seleccionada para la pasteurización se basa en el tiempo letal térmico representativo para los tipos más resistentes de microorganismos patógenos que deberán ser  destruidos mediante este procedimiento. Hasta hace poco en el procedimiento se empleaba la temperatura de 62ºC por 30 minutos, pero debido a investigaciones realizadas se ha detectado que otros microorganismos como ¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿????????? Causal de la fiebre Q. se encuentra más frecuentemente en la leche y es más resistente que ¿¿¿¿¿???? , por lo que se ha adoptado una temperatura ligeramente mayor para pasteurizar la leche a baja temperatura (62.8ºC).

ESTERILIZACIÓN POR AGENTES QUÍMICOS En el control de los microorganismos son muy utilizados los agentes físicos ya mencionados, pero a veces deseamos eliminar también microbios indeseables y que se encuentran principalmente en las superficies como lo son las mesas, paredes, pisos, etc., o

sobre la piel de los seres vivos y allí no se pude hacer uso de los agentes físicos por lo que se utilizan sustancias químicas que inhiban o destruyan el microorganismo en cuestión. Cuando estas sustancias son usadas debe asegurarse que ataquen la microbio y no a las células del huésped, lo que se conoce como TOXICIDAD SELECTIVA y es en lo que se basa la quimioterapia. Es necesario e importante que al hablar sobre estos agentes, se maneje la siguiente terminología: sustancia bacteriostática, bactericida, fungostáticos o fungicida, virucida, desinfectante, antiséptico, etc. En cuanto a la naturaleza química de los agentes químicos es muy diversa, desde ácidos, bases, oxidantes, reductores, fenoles, éteres, detergentes, etc. Así como su mecanismo de acción puede ser también variado, unos como inhibidores de grupos enzimáticos, disolventes de grasas, agentes surfotensores, precipitantes de proteínas, etc. Debido a que los agentes antibacterianos deben ser inocuos para todo organismo huésped, en las condiciones en que son empleados (toxicidad selectiva) el número de agentes antibacterianos que comúnmente se emplean es mucho más bajo que el número de venenos celulares e inhibidores. Con respecto al cianuro, arsénico y otros venenos no se incluyen debido a sus limitaciones en su utilidad práctica. Los más frecuentes son los alcoholes, fenoles, iones de metales pesados, agentes oxidantes, agentes alquilizantes, detergentes, etc. ALCOHOLES Los alcoholes son compuestos con estructura R-CH2OH (donde R es un grupo alquilo), estos son tóxicos para las células en concentraciones relativamente altas. Los alcoholes etílico e isopropílico son de uso común, pero pueden emplearse en concentraciones del 70% en solución acuosa, como desnaturalizantes de proteínas y efectivo contra

microorganismos vegetativos no esporulados, el alcohol metílico es poco bactericida y el alcohol propílico e isopropílico en concentraciones del 40% al 80% se usan como desinfectantes de la piel. FENOL El fenol y muchos compuestos derivados fenólicos se consideran agentes antibacterianos fuertes. En concentraciones de 1 a 2% en solución acuosa es como generalmente se emplea como desnaturalizante de proteínas de la célula dañando membranas celulares, también se usan para desarrollar técnicas asépticas y con desinfectante. Las esporas bacterianas y los virus son más resistentes a ellos que las células vegetativas bacterianas. Algunos compuestos fenólicos pueden ser bactericidas o fungicidas. Ciertos factores como la presencia de jabón, un pH alcalino o bajas temperaturas  pueden reducir la actividad antimicrobiana de los compuestos fenólicos. IONES DE METALES PESADOS La mayoría de los metales pesados, solos o en ciertos compuestos son dañinos para los microorganismos. Los metales que se consideran más efectivos son el Hg, Ag, y Cu. Las sales de estos metales a altas concentraciones desnaturalizan las proteínas; estas sales son demasiado  perjudiciales para los tejidos humanos por lo que no son usados en esta forma. Comúnmente se emplean a bajas concentraciones, en estas condiciones actúan combinándose con los grupos sulfhidrilo. El Hg combinándolo con compuestos orgánicos (p. ej. Mercurochrome, merthiolate) puede ser empleado. Excepto cuando se utilizan sobre las superficies limpias de la piel, se consideran de valor práctico dudoso, ya que son inactivados rápidamente por acción de la materia orgánica extraña.

La Ag como el Cu, aun en pequeñas cantidades ejercen un efecto letal sobre las  bacterias. En una placa inoculada se coloca un trozo de metal limpio (Cu o Ag), asépticamente con unas pinzas estériles, se incuba por 24 horas a temperatura de 37ºC y después de la incubación se observará una zona de inhibición alrededor del metal (no hay crecimiento). En el caso del HgCl2, tiene efecto inhibidor en las enzimas que contienen grupos sulfhidrilo inactivándolos. A esta acción se le conoce como OLIGODINAMICA (capacidadd que tienen los metales pesados de inactivar las enzimas). AGENTES OXIDANTES Los agentes oxidantes fuertes inactivan a las células oxidando grupos sulfhidrilos libres. Entre los agentes útiles se pueden mencionar el H2O2, I2, hipocloritos, Cl2 y compuestos que liberan cloro lentamente (cloruro de cal). En el caso del I2 es un agente altamente efectivo y se cree que sea único en cuanto a la efectividad contra toda clase de  bacterias, esporas, hongos y virus. También se usa como desinfectante de la piel. AGENTES ALQUILIZANTES  Numerosos agentes reaccionan como compuestos en la célula para sustituir átomos lábiles de hidrógeno como radicales alquilo. Los dos agentes que se usan comúnmente con fines de desinfección son el formaldehído ( se vende como solución acuosa al 37%, formalina) y el óxido de etileno; este gas se inactiva mezclándolo con CO2 al 90% con fluorocarbono, volviéndolo no explosivo. El óxido constituye el desinfectante más confiable disponible para superficies secas, en desinfección de instrumentos quirúrgicos, etc.

DETERGENTES Son sustancias que rebajan la tensión superficial o agentes humectantes empleados  principalmente para limpiar superficies, p. ej. los jabones que tienen la propiedad de concentrarse en la interfase por lo que son llamados agentes tensoactivos o detergentes. La interfase entre la membrana de una célula bacteriana que contiene lípidos y el medio acuoso que la rodea, atraen especialmente a una clase particular de compuestos tensoactivos y en forma específica a los que tienen un grupo liposoluble y un grupo hidrosoluble. Los microorganismos quedan atrapados en la espuma del jabón. En el caso de las sales de amonio cuaternarias, modifican la carga eléctrica de la membrana haciendo que la célula estalle.

AGENTES QUÍMICOS ANTIMICROBIANOS Mucha sustancias químicas son capaces de inhibir o matar a los microorganismos y van desde los elementos o metales pesados hasta moléculas orgánicas complejas. Estas sustancias ejercen su efecto antimicrobiano por diferentes caminos y sobre diferentes grupos de microorganismos. En su efecto puede variar sobre algunas superficies y/o materiales sobre los que se aplica, esto significa que: a) Algunas son compatibles.  b) Otros son destructores.

Debido a esto es necesario conocer el comportamiento de un agente químico antes de utilizarlo, tomando en cuenta que ningún agente químico antimicrobiano es el mejor para todas las finalidades ya que un desinfectante ideal necesitaría poseer una gran cantidad de características (para tantos microorganismos). Comúnmente se hace uso de los siguientes términos en relación con los agentes antimicrobianos y su empleo: BACTERIOSTÁTICO: Sustancia que tiene la propiedad de inhibir la multiplicación o desarrollo de las bacterias sin matarlas; pero esta multiplicación se reanuda en cuanto se retira el agente. BACTERICIDA: Sustancia que tiene la propiedad de matar a las bacterias. Su acción difiere a la de la bacteriostasis en que es irreversible; es decir, que el organismo muerto no  puede reproducirse más, aun cuando sea retirado el agente. DESINFECTANTE: Sustancia química empleada para matar microorganismos sobre superficies, pero demasiado tóxica por lo que no se aplica directamente a tejidos; capaz de matar las formas en desarrollo pero no esporas de patógenos. ANTISÉPTICO: El término aséptico está caracterizado por la falta de microorganismos patógenos. Sustancia que se opone a la sépsis, impide el desarrollo o acción de microorganismos, sustancia que se puede aolicar al cuerpo. SEPSIS: Término caracterizado por la presencia de microorganismos perjudiciales en el tejido vivo. GERMICIDA: Agente que destruye las formas de desarrollo. Su acción es igual a la de un desinfectante, pero no destruye las esporas.

SANEAMIENTO: Los agentes utilizados para el saneamiento se aplican a objetos inanimados, para el cuidado de equipos, utensilios, lecherías, plantas de alimentos, etc. Su función es reducir la población microbiana a niveles no peligrosos. El modo de acción de los agentes antimicrobianos es: a) Lesión al DNA  b) Desnaturalización de la proteína c) Rompimiento de la membrana o de la pared celular  d) Remoción de grupos sulfhidrilo libres e) Antagonismo químico. Fijadores como Tween 80. En cuanto este fija la muestra, se procede a teñir, para su observación al microscopio. El colorante que se va a usar, generalmente es un colorante básico de la anilina.

Inicio VII. IMPACTO DE LOS MICROORGANISMOS EN LA INGENIERÍA GENÉTICA

VIII. INTERACCIÓN E IMPACTO DE MICROORGANISMOS EN EL MEDIO AMBIENTE

BIBLIOGRAFÍA Michael J. Pelczar (1982), Microbiología. Editorial Mc. Graw Hill, Cuarta Edición, México. Jawetz Ernest / Melnick y Adelberg (1985), Microbiología Médica, El Manual Moderno, Undécima edición, México.

Koneman / Allen (1990), Diagnóstico Microbiológico, Editorial Médica Panamericana, México. Bailey / Scott (1991), Diagnóstico Microbiológico, Editorial Médica Panamericana, Séptima edición, México.