UVOD Farmacija je zdravstvena struka koja povezuje medicinske i hemijske nauke, čiji je cilj
da obezbedi bezbedno i efikasno korišćenje lekovitih sredstava. Opseg farmaceutske delatnosti uključuje tradicionalne uloge pripreme i izdavanje lekova, ali i savremene oblasti u vezi sa brigom sa brigom o pacijentima, pacijentima, uključujući kliničke usluge, proveru bezbednosti i efikasnosti lekova i obezbeđivanje informacija o lekovima. Farmaceuti su, stoga, stručnjaci za terapiju lekovima i profesionalci uključeni u primarnu zdravstvenu zaštitu koji optimizuju upotrebu lekova radi osiguranja pozitivnog po pacijenta ishoda lečenja. Reč farmacija se u nekim zemljama koristi i kao ime zaapoteku zaapoteku. Liofilizacija,uobićajan naziv za smrznuto sušenje,je uklanjanje vode iz proizvoda sublimacijom i desorpcijom.Ovaj proces se izvodi u uređajima za liofilizaciju koji se sastoji od dve komore za sušenje,sa temperaturnim kontrolisanim policama,kondenzatora koji hvata vodu uklonjenu iz proizvoda,rashladnog sistema koji snabdeva police i kondenzator i vakuum sistema koji redukuje pritisak u komori i kondenzatoru,čime se pomaže proces sušenja.
1.ISTORIJAT Počeci liofilizacije ili sušenje zamrzavanjem postojali su još u daleku prošlost .Još u proistorijsko doba Asteci i Eskimi su svoju hranu izlagali hladnim vetrovima,kako bi je konzervisali. Interes naučnika za liofilizacijom javio se početkom dvadesetog veka,sa publikacijom koji su izdali Bordasi Arsonval na Francujskoj akademiji nauka.Sledeći tu publikaciju Altmani i kasnije Gerš Koristili su ovu tehniku da pripreme neobične suve uzorke za mikroskopiju. Ronald Grivz sa Kemridža,Velika Britanija,počeo je svoj rad u toj oblasti tridesetih godina prošlog veka,pripremajući suve suspenzije živih bakterija. Kada je došao Drugi svetski rat i sa njihovim zrtvama,javila se i velika potreba za humanom ljudskom plazmom pa je liofilizacija ponovo došla u centar pažnje.Zahvaljujući Grivizu iz Londona,Fransoa Henafu iz Francuske i Erlu Flosdorfu iz Sad-a Hiljade litara krvi su prerađene kako bi se izolovala krvana plazma koja se čuvala osušena i smrznuta. Kako se proširila ubotreba liofilizacije,proces je počeo da se industralizuje.Loar,Stouks,Edvards i drugi dizajnirali su i napravili prvu opremu za tu svrhu.Proces koji je Flosdorf nazvao liofilizacijom,suočio se sa svojim prvim velikim izazovom pod Sir Ernstorn Borisom Čejnom,koji je tu svrhu koristio za čuvanje antibiotika.ako se Čejn uzme u obzir,nije nikakvo čudo što se Šarl Mejero okrenuo lifilizaciji za pripremu vakcina i kasnije prečišćavanje sastojaka krvi. Polovinom pedesetih godina prošlog veka,mnoge industrijske grane su se već koristile sušenjem zamrzavanjem za čuvanje farmaceutskih i bioloških proizvoda,kao i lekari i hirurzi.U to vreme proces je bio poprilično jednostavan a oprema glomazna i ne baš mnogo prefinjena. Danas je lioflizacija napredovala,pa je čak postala primenjena i u svakodnevnoj tehnologiji. U farmaceutskoj industriji,lekovi osušeni smrzavanjem su dobro poznati i poznati proizvodi.
2.POSTUPCI LIOFILIZACIJE Liofilizacija,uobićajan naziv za smrznuto sušenje,je uklanjanje vode iz proizvoda sublimacijom i desorpcijom.Ovaj proces se izvodi u uređajima za liofilizaciju koji se sastoji od dve komore za sušenje,sa temperaturnim kontrolisanim policama,kondenzatora koji hvata vodu uklonjenu iz proizvoda,rashladnog sistema koji snabdeva police i kondenzator i vakuum sistema koji redukuje pritisak u komori i kondenzatoru,čime se pomaže proces sušenja. Proces liofilizacije tj.zamrznutog sušenja,odvija se pod kontrolisanim uslovima pritiska i temperature i sastoji se iz tri faze: Zamrzavanje Primarno sušenje Sekundarno sušenje
2.1.Zamrzavanje Pošto je zamrznuto sušenje promena stanja iz čvrstog u gasosovito stanje,material koji se suši mora prvo biti adekvatno zamrznut.Metod redzamrzavanja I finalne temperature zamrznutog produkta mogu uticati na mogućnost uspešnog zamrznutog sušenja materijala. Brzo hladjenje rezultira u malim kristalima leda, korisnim u konzerviranju struktura za mikroskopsko ispitivanje, ali je takav proizvod mnogo teže zamrznuto osušiti. Sporo hlađenje rezultira u većim kristalima leda I manje restrektivnim kanalima u matrici tokom procesa sušenja. Proizvod se zamrzava na dva načina, zavisno od građe proizvoda. Većina produkata, koji se podvrgavaju zamrznutom sušenju se primarno sastoji od vode, solventa I materijala koji je rastvoren ili suspendovan u void, rastvaraču. Većina uzoraka koji se zamrznuto suše su eutektici, što je mešavina supstanci koje se zamrzavaju na nižim temperaturama nego okolna voda. Kada se akvozna suspenzija hladi, dešavaju se promene u koncentraciji rastvora matrice proizvoda. I kako se sušenje nastavlja, voda se odvaja od rastvora pošto se pretvara u led, kreirajući mnogo koncentrisanija područja rastvora. Ovi dzepovi koncentrisanog materijala imaju niže tačke zamrzavanja nego voda, mada s emože činiti da je proizvod zamrznut zbog svog prisutva leda, ustvari on nije kompletno zamrznut dok se sav rastvor u suspenziji ne zamrzne. Mešavana različitih koncentracija rastvora sa solventnom sačinjava eutektiku suspenzije. Jedino kad su sve eutektike zamrznute, suspenzija je propisno zamrznuta. Ovo se naziva eutektička temperature.
Veoma je važno kod zamrznutog sušenja predzamrznuti proizvod ispod eutektičke tempereature pre početka procesa sušenja. Mali dzepovi nadzamrznutog materijala koji ostaju u produktu ekspandiraju I ugrožavaju strukturalnu stabilnost zamrznuto osušenog proizvoda. Drugi tip zamrznutih proizvoda su suspenzije koje prolaze kroz staklenu formaciju tokom procesa zamrzavanja. Umesto formiranja eutektika cela suspenzija postaje sve više viskozna kako se temperatura snižava. Konačno, produkt se zamrzava na tački tranticije stakla, formirajući staklastu čvrstu materiju. Ovaj tip proizvoda je ekstremno teško zamrznutog sušiti. Zavisno od kompozijije rastvora, može postojati više od jedne eutektičke tačke za proizvod ili je uopšte ne mora biti. Za proizvode s kompnentama koje ne kristalizuju tokom zamrzavanja, sušenje treba izvoditi na temperaturama ispod temperature staklene tranzicije amorfne faze( multikomponentna mešavina). Tempeatura staklene tranzicije će se odrediti kompozicijom amorfne faze u zamrznutom proizvodu, koja je, opet, diktirana formulacijom proizvoda i korištenom procedurom zamrzavanja. Manitol i neka druga jedinjenja mogu postojati kao amorfna faza ili pokazivati kristalizujući fazu, od svoje termalne istorije.
2.2.PRIMARNO SUŠENJE Nekoliko faktora mogu uticati na mogućnost zamrznutog sušenja smrznute suspenzije, tako što međusobno deluju u dinamičkom sistemu. Posle predzamrzavanja proizvoda, moraju se ustanoviti uslovi u kojima se led može ukloniti iz zamrznutog proizvoda putem sublimacije, rezultirajući u suvom, strukturalno netaknutom proizvodu. Ovo zahteva veoma pažljivu kontrolu dva parametra, temperature i pritiska, uključenih u sistem liofilizacije. Sublimacija je konverzija vode iz čvrstog stanja(led) direktno u gasovito stanje(vodena para) bez prolaska kroz tečno stanje. Stopa sublimacije leda iz zamrznutog proizvoda zavisi od razlike u isparavajućem pritisku proizvoda u poreženju s isparavajućim pritiskom kolektora leda. Molekuli migriraju s uzorka višeg pritiska na oblast nižeg pritiska. Pošto je isparavajući pritisak povezan s temperaturom, neophodno je da temperatura proizvoda bude toplija od temperature hladne zamke - kolektora leda. Jako je važno da temperatura na kojoj se proizvod zamrznuto suši bude izbalansirana između temperature koja održava zamrznuti integritet proizvoda i temperature koja maksimalizuje isparavajući pritisak. Ovaj balans je ključ optimalnog sušenja.
Tipični fazni dijagram prikazan na slici 5. ilustruje ovu tačku .
Većina prizvoda se dobro zamrzava ispod njihove eutektičke ili stakleno-tranzicione tačke( tačke A) i zatim se temperature diže do samo malo ispod ove kritične temperature (tačka B) i oni se podvrgavaju redukovanom pritisku. U ovoj tački proces zamrznutog sušenja počinje. Neki produkti kao što su akvozno surkozni rastvori mogu proći kroz strukturalne promene tokom procesa sušenja, što rezultira fenomenom poznatim kao kolaps. Mada se proizvod ispod svoje eutektičke temperature, grejanje tokom procesa liofilizacije može uticati na strukturu zamrznute matrice na granici fronta sušenja. Ovo rezultira u kolapsu strukturalne matrice. Da bi sprečili kolaps proizvoda koji sadrže surkozu, temperatura proizvoda mora ostati ispod kritične temperature kolapsa tokom primarnog sušenja. Kolapsna temperatura za surkozu je -32 stepena Celzjusa. Bez obzira na to koji tip sistema zamrznutog sušenja se koristi, moraju biti stvoreni uslovi koji će omogućiti slobodan protok molekula vode iz proizvoda. Stoga, vakuum pumpa je esencijalna komponenta sistema za zamrznuto sušenje koristi se da smanji pritisak okruženja oko produkta( do tačke C). Druga esencijalna komponenta je sistem za sakupljanje - kolektor, koji je hladna zamka koja se koristi za sakupljanje vlage koju ostavlja zamrznuti produkt. Kolektor kondezuje napolje sve kondezibilne gasove. Na primer, molekule vode, a vakuum pumpa uklanja sve nekondezibilne gasove. Isparavajući
pritisak produkta forsira sublimaciju molekula vodene pare s matrice zamrznutog produkta na kolektor. Molekuli imaju prirodan afinitet da se kreću prema kolektoru zato što je njegov isparavajući pritisak niži nego onaj proizvod. Prema tome, temperatura kolektora(tačka D) mora biti značajno niža nego temperatura proizvoda. U tabeli 1. podizanje temperature proizvoda ima veći efekat na razliku isparavajućih pritisaka nego snižavanje temperature kolektora.
Treća esencijalna komponenta u sistemu zamrznutog sušenja je energija. Energija se opskrbuje u obliku toplote. Skoro deset puta više energije je potrebno da sublimira gram vode iz zamrznutog u gasovito stanje nego što je potrebno da se zamrzne gram vode. Stoga, uz sve ostale adekvatne uslove, toplota se mora primeniti na proizvod da ohrabri uklanjanje vode u obliku pare iz zamrznutog proizvoda. Toplota mora biti veoma pažljivo kontrolisana, pošto primena veće temperature nego što evaporativno hlađenje može ukloniti, greje produkt iznad njegove eutektičke ili kolapsne temperature. Toplota može biti primenjena na nekoliko načina. Jedan metod je primena toplote direktno kroz termalno provodničku policu, kakva se koristi kod sušenja na tacnama. Drugi metod je korišćenje ambijetalne toplote kakva je kod sušenja cevima.
2.3.SEKUNDARNO SUŠENJE Pošto je primarno sušenje završeno i sav led sublimiran, granična vlaga je još uvek prisutna u proizvodu. Proizvod se čini suvim ali sadržaj zaostale vlage može iznositi i do 7-8%. Nastavak sušenja je neophodan, pri toplijoj temperaturi, da bi se redukovao sadržaj zaostale vlage na optimalnu vrednost. Ovaj proces se zove izotermalna desorpcija pošto se granična voda desorbuje iz proizvoda. Sekundarno sušenje se normalno nastavlja pri temperaturi proizvoda višoj nego što je ambijentalna ali kompatibilnom s osetljivošću proizvoda. Svi ostali uslovi, kao što su pritisak i temperatura kolektora, ostaju isti. Pošto je proces desorptiva, vakuum bi trebao da bude što je moguće niži bez podignutog pritiska i temperature kolektora toliko hladna koliko je moguće postići. Sekundarno sušenje se obično izvodi za otprilike 1/3 do ½ vremena potrebnog za primarno sušenje.
3.PRIPREMA SUSPENZIJE ZA LIOFILIZACIJU Suspenzija za liofilizaciju je smeša aktivne komponente,inertne komponente i krioprotektanata. Ona se, neposredno po pripremanju, liofilizuje. Postupak liofilizacije treba da očuva specifičnu aktivnost aktivne komponente, koja može biti hemijske ili biološke prirode. U farmaceutskoj industriji, aktivna komponenta je definisana potencom, a u dijagnostici svojom reaktivnošću. Aktivna komponenta u proizvodnji starter kultura za mlečnu industriju izražava se preko vitalnosti ćelija mikroorganizama. Inertne komponente su vezivna sredstva koja obezbeđuju stabilnu tečnu sredinu u suspenziji za liofilizaciju, a istovremeno mogu da imaju i ulogu krioprotektanata. Krioprotektanti su jedinjenja koja štite aktivnu komponentu tokom zamrzavanja, time što štite ćelijske membrane od ivica kristala leda. U tu svrhu se najčešće koriste saharoza, glukoza, dekstran, trehaloza, natrijumglutamat, glicerol, adonitol, pepton, konjski serum, vitamini B kompleksa, natrijumacetat itd. Izbor krioprotektanta zavisi od njegove efikasnosti i ekonomske isplativosti u okvirima date proizvodnje i opreme. Suspenzija za liofilizaciju predstavlja izbalansiranu smešu navedenih komponenti. Kao primer mogu da posluže sledeće smeše: – kombinacija 10% obranog mleka, 5% glicerola i 0,1% 3 CaCO daje 85,9% preživljavanja – kombinacija 10% obranog mleka, 5% saharoze daje 67,4% preživljavanja. Optimalni sadržaj suve mase u formulaciji suspenzije za liofilizaciju je obično do 20%. Nizak sadržaj suve mase u formulaciji može dovesti do pucanja kolača tokom sušenja, a visok sadr8. ZAVRŠNA FAZA U BIOTEHNOLOŠKOJ PROIZVODNJI 375 žaj suve mase, preko 20%, može biti prepreka izdvajanju vode iz kolača tokom sekundarnog sušenja.
LIOFILIZACIJA
Kod sublimacionih sušara (liofilizacija), proces se odvija tako što se vlažan materijal
zamrzne na –15 do –50 °C, a zatim se kristali leda sublimišu pri blagom zagrevanju u visokom vakuumu. Prednosti ovog metoda su: – dobra rekonstitucija dehidratisanih proizvoda, – produžena stabilnost proizvoda, – uklanjanje vode iz proizvoda bez prekomernog zagrevanja i – brzo i dobro rastvaranje pri rekonstituciji proizvoda (ponovno kvašenje). Njegovi nedostaci su: – relativno mali kapacitet, – dužina procesa i – investicioni i operativni troškovi. Liofilizacija je stabilizirajući proces u kojem se supstanca prvo zamrzava, a onda se smanjuje količina rastvarača (najčešće vode), sublimacijom (primarno sušenje) i desorpcijom (sekundarno sušenje), do vrednosti koja više ne podržava biološku aktivnost ili hemijske reakcije. Postupak liofilizacije se odvija u tri faze. Prva faza – zamrzavanje. Cilj ove faze je zamrzavanje proizvoda, tako da aktivna komponenta ostane nepromenjena. Rastvarač kristališe i formiranjem kristala rastvorena supstanca se potiskuje u prostor između kristala – intersticijalno područje. Zamrzavanjem se, dakle, odvaja rastvarač od rastvorene supstance. Brzina hlađenja utiče na strukturu zamrznutog matriksa. Ako se voda zamrzava brzo, kristali leda su mali, što dovodi do porozne strukture proizvoda sa visokim otporom prema protoku vodene pare, čime se produžava vreme primarnog sušenja. Ako je zamrzavanje sporo, ledeni kristali rastu od površine koja se hladi i veći su. Zamrzavanje se obično završava na eutektičkoj temperaturi suspenzije za liofilizaciju. Eutektička temperatura je tačka na faznom dijagramu u kojoj se temperatura sistema ili koncentracija rastvora ne može promeniti bez promene broja prisutnih faza. Zamrzavanje je završeno kada je rastvorena supstanca u čvrstom stanju i kada je pokretljivost vode u intersticijalnom područiju jednaka nuli. Voda koja je neophodna za održavanje stabilnosti finalnog proizvoda (posebno proteina ili hidrata), je vezana voda, koja ne učestvuje u zamrzavanju. Druga faza – primarno sušenje. Primarno sušenje je druga faza liofilizacije tokom koje led, koji je formiran u fazi zamrzavanja, sublimira. U literaturi se označava i kao vakuum sušenje ili kriosušenje. Sublimacijom leda voda se najvećim delom uklanja, a zaostaje rastvorena supstanca. 374 OSNOVI BIOPROCESNOG INŽENJERSTVA
Ukoliko se sublimacija odvija na atmosferskom pritisku, proces je spor, jer molekuli gasa pronalaze put kroz atmosferske gasove koji bombarduju površinu leda. Molekuli vode napuštaju površinu leda difuzijom. Sublimacija se može ubrzati smanjenjem pritiska iznad površine leda, kada se materijal ubaci u komoru pod vakuumom, pošto su prethodno gasovi već uklonjeni pomoću vakuuma. Kada pritisak u komori postane manji od pritiska pare, definisanog temperaturom leda, brzina sublimacije značajno raste, a vodena para se uklanja putem kondenzacije. Tok ove faze u velikoj meri određuje izgled liofilizata (tzv. „kolača”), koji je porozne strukture nastale sušenjem intersticijalnih konstituenata. Izgled "kolača" je rezultat procesa primarnog sušenja u kome je temperatura rastvorenih supstanci dovoljno niska, tako da nema značajnih količina mobilne vode. Ukoliko zaostane mobilna voda, rastvorena supstanca se ugiba i "kolač" se kompletno topi. Dobar izgled „kolača” ukazuje na dobro očuvanu poroznu strukturu, nepromenjene fizičke osobine i očuvanje aktivnih komponentu, nakon rekonstitucije. Treća faza – sekundarno sušenje. Tokom treće faze liofilizacije, temperatura raste, da bi sadržaj vode dostigao optimalnu vrednost, koja garantuje stabilnost proizvoda. Dužina ove faze i finalna rezidualna vlaga zavise od vrste proizvoda koji se liofilizuje. Proteini i peptidi zahtevaju veći procenat vlage jer se time čuva njihova sekundarna i tercijarna struktura. U tim slučajevima pažljivo se kontroliše procenat rezidualne vlage u proteinskom proizvodu. Ukoliko se liofilizuju bakterijske ćelije, postavlja se zahtev da u finalnom proizvodu ne bude više pd 1% rezidualne vlage. Faktori koji utiču na uspešnost liofilizacije su: – priprema suspenzije za liofilizaciju, – vođenje postupka liofilizacije i – uslovi čuvanja liofilizovanog kolača. Priprema suspenzije za liofilizaciju. Suspenzija za liofilizaciju je smeša
aktivne komponente, inertne komponente i krioprotektanata. Ona se, neposredno po pripremanju, liofilizuje. Postupak liofilizacije treba da očuva specifičnu aktivnost aktivne komponente, koja može biti hemijske ili biološke prirode. U farmaceutskoj industriji, aktivna komponenta je definisana potencom, a u
dijagnostici svojom reaktivnošću. Aktivna komponenta u proizvodnji starter kultura za mlečnu industriju izražava se preko vitalnosti ćelija mikroorganizama. Inertne komponente su vezivna sredstva koja obezbeđuju stabilnu tečnu sredinu u suspenziji za liofilizaciju, a istovremeno mogu da imaju i ulogu krioprotektanata. Krioprotektanti su jedinjenja koja štite aktivnu komponentu tokom zamrzavanja, time što štite ćelijske membrane od ivica kristala leda. U tu svrhu se najčešće koriste saharoza, glukoza, dekstran, trehaloza, natrijumglutamat, glicerol, adonitol, pepton, konjski serum, vitamini B kompleksa, natrijumacetat itd. Izbor krioprotektanta zavisi od njegove efikasnosti i ekonomske isplativosti u okvirima date proizvodnje i opreme. Suspenzija za liofilizaciju predstavlja izbalansiranu smešu navedenih komponenti. Kao primer mogu da posluže sledeće smeše: – kombinacija 10% obranog mleka, 5% glicerola i 0,1% 3 CaCO daje 85,9% preživljavanja – kombinacija 10% obranog mleka, 5% saharoze daje 67,4% preživljavanja. Optimalni sadržaj suve mase u formulaciji suspenzije za liofilizaciju je obično do 20%. Nizak sadržaj suve mase u formulaciji može dovesti do pucanja kolača tokom sušenja, a visok sadr 8. ZAVRŠNA FAZA U BIOTEHNOLOŠKOJ PROIZVODNJI 375
žaj suve mase, preko 20%, može biti prepreka izdvajanju vode iz kolača tokom sekundarnog sušenja. Izvođenje postupka liofilizacije. Oprema za liofilizaciju može biti manjeg ili većeg obima. Parametri procesa mogu se kontrolisati ručno ili automatski. Pored osnovnih funkcija (hlađenje, zagrevanje i kontrola vakuuma), u modernoj opremi inkorporirani su sistemi za čišćenje i sterilizaciju na licu mesta (CIP, clean in place, i SIP, sterilize in place) i kompjutersko praćenje procesa. Uslovi čuvanja liofilizovanog kolača. Kiseonik, vlaga i svetlost su štetni po sušene koncentrovane kulture i zato se one pakuju pod vakuumom ili pod suvim inertnim gasom, a čuvaju na temperaturi od 4 do 8 °C (temperatura frižidera). Liofilizovani Lactobacillus acidophilus, čuvan na 4 °C, posle godinu dana pokazuje neznatno smanjenje broja živih bakterija, a čuvan na 22 °C, u toku prva dva meseca pokazuje nagli pad broja živih bakterija. Čuvanjem na sobnoj temperaturi, dolazi do bržeg pada vitalnosti i propadanja kulture.
