LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI II VERIFIKASI MIKROBA E.Coli
Kelompok H-5 : 1. 2. . 4.
Putri Putri Rasdia Rasdianti nti Qoin Qoina a Rika !amai"anti Ri$ka %u %ukmasari
(2014 (2014210 210171 171)) (20 (2014 1421 2101 017 7)) (20142101#1) (20142101#5)&&
FAKULTAS FAKULTAS FARMASI FARMAS I UNIVERSITAS PANCASILA JAKARTA 2017
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang
Mikroba patogen adalah mikroba yang dapat menyebabkan penyakit dapat ditemukan diberbagai tempat , tersebar luas di tanah, air, udara, tanaman, hewan dan manusia. Mikroba tersebut dapat terbawa oleh pangan atau tangan dan peralatan masak yang dapat mencemari pangan sehingga menyebabkan penyakit. Pangan mentah terutama daging sapi, unggas, seafood dan cairan yang ditimbulkannya dapat mengandung mikroba patogen yang dapat mencemari pangan lainnya selama pengolahan dan penyimpanan Mikroba patogen bagi kehidupan makhluk hidup, baik hewan,tanaman dan terutama manusia, yang dapat menyebabkan penyakit infeksi. Mengingat peningkatan prevalensi patogen manusia dan tanaman resisten antibiotik menyebabkan meningkatnya permintaan untuk antimikroba baru dari sumber alami (Pal & Paul, 20!". #$i biokimia bakteri merupakan suatu cara atau perlakuan yang dilakukan untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi melalui sifat%sifat fisiologinya. uatu bakteri tidak dapat dideterminasi berdasarkan sifat morfologinya sa$a, sehingga perlu diteliti sifat%sifat biokimia
dan
faktor%faktor
yang
mempengaruhi
pertumbuhannya.
Mikroorganisme dapat tumbuh pada beberapa tipe media yang memproduksi tipe metabolit yang dapat dideteksi dengan reaksi antara mikroorganisme dengan reagen test yang dapat menghasilkan perubahan warna reagen. Escherichia coli merupakan bakteri indicator kebersihan pada produk perikanan karena habitatnya yang merupakan flora usus manusia ataupun hewan berdarah panas. 'itemukannya bakteri ini pada produk makan ataupun pada peralatan selama proses pengolahan menun$ukan tingkat sdanitasi yang buruk. leh karena itu standar produk perikanan mensyaratkan tidak boleh ada pada makanan yang diproduksi. Pengu$ian Escherichia coli menggunakan metoda pengu$ian MP) yang mengacu pada metoda )* 0%2!!2.%200+. ebelum metoda pengu$ian
digunakan sebagai metoda pengu$ian rutin, metoda tersebut harus diverifikasi terlebih dahulu, untuk mengetahui kemampuannya dalam mengu$i bakteri tersebut.
B. Perumusan Masalah
. pakah bakteri yang ditanam sesuai dengan hasil dari verifikasi menggunakan mikrogen -)%*' dan mikrogen -)%*' / 2. pakah mikrogen benar menun$ukkan adanya bakteri u$i /
C. Tujuan
. Mahasiswa mampu memahami prosedur verifikasi mikroba patogen dengan menggunakan mikrogen dan mampu meinterpretasikan hasilnya 2. Mahasiswa mampu melakukan karakterisasi dan klasifikasi sebagian mikroorganisme berdasarkan reaksi enimatik maupun biokimia.
D. Manfaat
#ntuk mengetahui bakteri patogen dengan menggunakan mikrogen -)% *' dan mikrogen -)%*' serta mengetahui ciri fisiologi ataupun biokimia yang merupakan kriteria yang sangat penting didalam identifikasi specimen bakteri yang tidak dikenal.
BAB II TINJAUAN PUSTAA A. las!f!kas!
1lasifikasi E. coli menurut onger dan Post (200" adalah sebagai berikut3 1ingdom 3 acteria 4ilum 3 Proteobacteria 1elas 3 -amma Proteobacteria rdo 3 5nterobacteriales 4amili 3 5nterobacteriaceae -enus 3 Escherichia pesies 3 Escherichia coli
B.
arakter!st!k M"rf"l"g! Escherichia coli
akteri E. coli merupakan spesies dengan habitat alami dalam saluran pencernaan manusia maupun hewan. E. coli pertama kali diisolasi oleh 6heodor 5scherich dari tin$a seorang anak kecil pada tahun 77. akteri ini berbentuk batang, berukuran 0,8%0,9 : ,0%!,0 ;m, termasuk gram negatif, dapat hidup soliter maupun berkelompok, umumnya motil, tidak membentuk spora, serta fakultatif anaerob (-ambar " (
-ambar . Morfologi E. Coli
truktur sel E. coli dikelilingi oleh membran sel, terdiri dari sitoplasma yang mengandung nukleoprotein (-ambar !". Membran sel E. coli ditutupi oleh dinding sel berlapis kapsul. 4lagela dan pili E. coli men$ulur dari permukaan sel (-ambar 2" (6iard 2008". 6iga struktur antigen utama permukaan yang digunakan untuk membedakan serotipe golongan E. coli adalah dinding sel, kapsul dan flagela. 'inding sel E. coli berupa lipopolisakarida yang bersifat pirogen dan menghasilkan endotoksin serta diklasifikasikan sebagai antigen . 1apsul E. coli berupa polisakarida yang dapat melindungi membran luar dari fagositik dan sistem komplemen, diklasifikasikan sebagai antigen 1. 4lagela E. coli terdiri dari protein yang bersifat antigenik dan dikenal sebagai antigen >. 4aktor virulensi E. coli $uga disebabkan oleh enterotoksin, hemolisin
kolisin, siderophor , dan molekul
pengikat besi (aerobaktin dan entrobaktin" (?uinn et al . 2002". akteri E. coli dapat membentuk koloni pada saluran pencernaan manusia maupun hewan dalam beberapa $am setelah kelahiran. 4aktor predisposisi pembentukan koloni ini adalah mikroflora dalam tubuh masih sedikit, rendahnya kekebalan tubuh, faktor stres, pakan, dan infeksi agen patogen lain. 1ebanyakan E. coli memiliki virulensi yang rendah dan bersifat oportunis (onger & Post 200". 'it$enak (@72" melaporkan bahwa E. coli keluar dari tubuh bersama tin$a dalam $umlah besar serta mampu bertahan sampai beberapa minggu. 1elangsungan hidup dan replikasi E. coli di lingkungan membentuk koliform. E . coli tidak tahan terhadap keadaan kering atau desinfektan biasa. akteri ini akan mati pada suhu +0 0< selama !0 menit. E. coli bersifat patogen karena dapat menyebabkan infeksi pada manusia dan hewan. eorang bakteriolog yaitu 6heodor 5scherich , mengidentifikasi E. coli dari babi yang menderita enteritis. 5nteritis merupakan peradangan usus yang bisa menyebabkan sakit perut, mual, muntah, dan diare baik manusia maupun hewan. E. coli merupakan bakteri yang bisa hidup pada lingkungan yang berbeda. akteri ini dapat ditemukan di tanah, air, tanaman, hewan, dan manusia (erg 2008A hunia 2007A Manning 200".
-enus Eschericia merupakan bakteri berbentuk batang (:8 ;m",
motil, dan mesofilik. akteri ini sering ditemukan di dalam pencernaan manusia, hewan berdarah panas, dan burung (Bay 2008A 'uffy 200+A hunia 2007". pesies terpenting dari genus Eschericia ialah E. coli (Bay 2008A dams dan Moss 2007". E. Coli merupakan famili 5nterobacteriaceae yang termasuk bakteri enterik. akteri enterik ialah bakteri yang bisa bertahan di dalam saluran pencernaan termasuk sruktur saluran pencernaan rongga mulut, esofagus, lambung, usus, rektum, dan anus. E. coli bisa hidup sebagai bakteri aerob maupun bakteri anaerob. leh karena itu, E. coli dikategorikan sebagai anaerob fakultatif (Manning 200". E. coli merupakan bakteri -ram negatif dan tidak berbentuk spora . E. coli bersifat katalase positif, oksidasi negatif, dan fermentatif. E. coli termasuk bakteri mesofilik dengan suhu pertumbuhannya dari 9 C< sampai 0 C< dan suhu optimum sekitar !9 C< (dams dan Moss 2007". E. coli dapat tumbuh pada p> 8%@ dengan aktivitas air 0.@!. Da$u pertumbuhan E. coli yaitu 2 $amEgenerasi pada suhu 7 C< (4orsythe 2000". E. coli dapat dibedakan dengan 5nterobacteriaceae lainnya berdasarkan u$i gula%gula dan u$i biokimia. ecara sederhana u$i%u$i untuk grup penting ini disebut dengan indole, methyl red, Voges-Proskeur, citrate atau disingkat *MFi< (dams dan Moss 2007". >asil u$i gula%gula famili 5nterobacteriaceae diperlihatkan dalam 6abel .
Bakteri
Indole
Methyl Red
Voges Proskeur
Citrate
E. coli
+
+
_
_
Salmonella typhimurium
_
+
_
+
Citrobacter freundii
_
+
_
+
Klebsiella pneumonia
_
_
+
+
Enterobacter aerogens
_
_
+
+
BAB III MET#D#L#$I
lat 3
(o:ydase strip" lalu sedikit koloni yang akan diperiksa kita ambil dengan menggunakan kayu (tusuk gigi, tusuk satu yang steril" atau ose dari plastic steril. 1oloni tersebut dioleskan dengan digoreskan pada kertas o:ydase kemudian cawan petridish ditutup ditunggu elama %0 detik, tidak boleh melebihi waktu yang ditentukan. pabila pada kertas tersebut berwarna biru tua atau ungu muda menandakan bahwa hasil tes o:ydase tersebut positif, maka mikrogen yang dipakai untuk mikrogen -)% panel. B. Pers!a(an larutan kuman
D. Peng!s!san larutan kuman ke%alam t!a(*t!a( lu)ang + sumur (a%a m!kr"gen
uka seal pada penutup mikrogen E plastic penutup transparan pada mikrogen, kemudian isiskan pada setiap lubang mikrogen dengan larutan suspense kuman steril dengan menggunakan volume 200 ul, sampai keseluruhan lubang terisi dengan larutan suspensi kuman steril. Folume pengisian pada setiap lubang pada mikrogen dengan menggunakan pipet Pasteur steril sebanyak empat tetes. tau dengan menggunakan pipet volumetric sebesar 200 ul atau volume setengah ketinggian pada setiap lubang miokrogen setelah semua lubang atau sumur pada mikrogen terisi dengan larutan suspense kuman kemudian pada sumur lysine, ornithine dan >2(sumur nomor ,2,!" pada mikrogen -)%*' panel diberikan mineral oil sebanyak 2 tetes pada masing%masing lubang. pabila menggunakan mikrogen -)%*' panel pemberian mineral oil diberikan pada sumur arginine (sumur no 28" dan setelah pemberian mineral oil baik pada mikrogen -)%*' panel atau mikrogen -)%*' panel lalu seal penutup pada mikrogen 1it tutupkan kembali sampai merata. E. Iku)as! ke%alam !n,u)at"r
-. Pem)a,aan Has!l M!kr"gen
$. Peng!s!an Has!l (a%a ertas Pat!ent e,"r%
2 pada mikrogen tidak ter$adi endapan hitam didasarnya atau cairan berwarna hitam sedangkan pada tabel warna kit lihat, warna hitam itu menun$ukkan hasil yang positif (G" sedangkan yang tidak berwarna menun$ukkan hasil negatif (%" , maka kita isikan pada kolom >2 (%" untuk selan$utnya kolom% kolom pada kertas patient record ter isikan dengan hasil positif (G" dan negatif (%" maka kit mendapatkan angka%angka (ctal code" yang nantinya angka%angka tersebut dapat mewakili setiap $enis%$enis kuman yang teridentifikasi secara computerisasi sampai tingkat species. H. Cara Men%a(atkan Angka #,tal C"%e
Misalnya hasil untuk sumur lysine (G" ,ornithine (G", >2 (%", glukosa (G", manitol (G", :ylose (G", )P- (G", #rease (%" , FP (%", 2 hasil (%" pada angka maka nilai angka octal codenya + dst, didalam setiap ! buah kolom mewakili satu angka octal kode.
I. Cara Melakukan Test M"t!l!t&
Darutan kuman kit ambil sedikit dengan menggunakan ose dari besi atau nikel chrom lalu diletakkan diatas ob$ek glass, kemudian ditutup dengan cover glass dan dengan perbesaran 80: dapat kita lihat pergerakan kuman tersebut. tau menggunakan minyak emersi lalu dilihat dibawah mikroskop dengan perbesar seribu kali apakah terdapat pergerakan atau tidak. pabila terlihat ada pergerakan maka motility (G" dan apabila tidak terdapat pergerakan maka motility negatif (%" pengisian hasil positif atau negatif diisikan pada kolom motility.
J. Cara Melakukan Test N!trate
Pada sumur no 9 pada mikrogen -)%*' yaitu pada sumur )P- setelah pembacaan hasil positif (G" atau negatif (%" kemudian diberikan reagent nitrat , tetes nitrat , tetes lalu hasilnya (G" atau (%" dibaca segera mungkin yang dibandingkan dengan tabel warna pada tabel nitrat, hasil positif pada tabel warna warnanya merah bata sedangkan tidak berwarna hasilnya (%" Pengisian hasil positif atau negatif diisikan pada kolom nitrat.
BAB I/ HASIL PATIUM DAN PEMBAHASAN A. >asil praktikum 1elompok 3 ,+ dan 9 akteri 3 E. coli ctal code 3 02800002
E. america na
.pestis
!. al"ei blogp #
E.coli$ inacti"e
C. lapogei
Probabili ty
1/2,974, 213
1/63,584, 183
Percent probabili ty
89,79
4,2
2,16
0,26
0,42
!ikeli"oo #
<0,01
<0,01
<0,01
<0,01
<0,01
<1/100,000, <1/100,000, <1/100,000, 000 000 000
B. Pem)ahasan I0A SUMASAI 1234132356 #ntuk mengkaraterisasi mikroorganisme dapat dilakukan berbagai cara antara lain adalah penampakan atau visual makroskopis morfologi koloni, secara mikroskopis dengan cara pewarnaan (seperti pewarnaan sederhana untuk mengetahui bentuk serta rangkaian sel, serta pewarnaan gram untuk melihat $enis gram bakteri tersebut", penginokulasian atau penanaman pada media selektif, penentuan secara molekular (')", serta dilakukannya reaksi biokimia.
Pada praktikum ini dilakukan pengkarakterisasian mikroorganisme dengan cara melakukan reaksi biokimia yang dilakukan dengan menggunakan alat dari produsen Microgen. Pada alat tersebut telah ada substrat%substrat yang selektif untuk berbagai reaksi%reaksi biokimia. Pada kit atau alat tersebut terbagi men$adi 2 wells
yaitu Micro gn% id dan Micro gn H id , dimana pembagian penggunaan wells tersebut didasarkan pada reaksi atau u$i oksidase. #ntuk mengetahui hasil u$i oksidase dapat dilakukan pengolesan atau mengapusnya pada kertas yang telah disediakan oleh produsen, hasil yang diperoleh positif bila hasil pengolesan pada kertas men$adi biru gelap sedangkan untuk negatif tidak ter$adi perubahan. Dalu untuk mengisi wells dilakukan setelah pembuatan suspensi pada )a. fisiologis dari satu sengkelit sampel. Dalu dari suspensi tersebut dipipet sekitar 00%2000 mikroliter kesetiap wells. ila hasil positif oksidase maka yang dipakai adalah Micro gn% id dan Micro gn H id , sedangkan bila negatif oksidase yang dipakai adalah Micro gn% id boleh $uga dengan Micro gn H id . )amun kendala cost yang digunakan untuk hasil oksidase negatif hanya menggunakan Micro gn% id . 1emudian untuk hasil positif oksidase dilakukan inkubasi 87 $am sedangkan untuk negatif oksidase diinkubasi 28 $am. Pada pengu$ian ini digunakan sampel Escherichia coli. 'ari sampel tersebut diambil satu sengkelit lalu dioleskan pada kerta u$i oksidase, hasil yang diperoleh adalah negatif oksidase sehingga wells yang digunakan adalah hanya satu yaitu Micro gn%id atau Micro gn%id sa$a namun dalam praktik kali ini dipakai keduanya. etelah itu dibuat suspensi sampel dilakukan pemipetan ke tiap well. 'ilakukan pengamatan 28 $am. >asil yang diperoleh setelah 28 $am penginkubasian serta penambahan berbagai reaksi%reaksi yang sesuai pada well tertentu adalah 02800002. etelah itu dimasukkan ke software lalu kode tersebut diter$emahkan sehingga diperoleh data kemungkinan identitas dari mikroorganisme tersebut. 'ari hasil yang diperoleh, terdapat $enis mikroba patogen beserta persen probabilitasEkemungkinan nya dimana salah satunya adalah Escherichia coli. Mikroba tersebut adalah E.americana dengan probabilitas 7@,9@I A Y. pestis dengan probabilitas 8,2I A H.alvei blogp dengan probabilitas 2,+I A E.coli-inactive dengan probabilitas 2,0+I A dan C.lapogei dengan probailitas 0,82I. ehingga dapat disimpulkan bahwa kemungkinan besar mikroorganisme yang terdapat atau terbaca dari octal code tersebut adalah E.americana sebab merupakan persen probabilitas terbesar dari yang diperoleh. >asil ini tidak sesuai dengan sampel yang digunakan dalam percobaan yaitu Escherichia coli. e$ak awal telah dilakukan pengecekan secara mikroskopis untuk melihat serta memastikan bahwa sampel tersebut adalah benar adanya Escherichia coli dengan menggunakan pewarnaan sederhana untuk melihat bentuk serta rangkaian dari bakteri tersebut. >asil yang berbeda dapat diperoleh kemungkinan karena penger$aan yang kurang aseptis baik dari segi penger$aan ataupun alat yang digunakan seperti pada pipet sehingga mungkin pensterilisasian alat kurang sempurna sehingga mikroorganisme dari alat sebelumnya belum mati semua sehingga menyebabkan kontaminan.
Putr! as%!ant! 1234132373 *dentifikasi mikroba dapat dilakukan dengan berbagai cara antara lain secara
makroskopik yaitu diamati dari morfologi koloni, secara mikroskopik yaitu u$i pewarnaan gram, u$i biokimia, inokulasi ke media selektif, hingga identifikasi berdasarkan molekuler dari bakteri. #$i identifikasi mikroba dengan menggunakan microgen didasarkan pada u$i biokimia untuk melihat profil enimatik yang khas dari tiap bakteri yang merupakan sidik $ari mikroba tersebut. #$i microgen ini digunakan untuk mengidentifikasi
bakteri
basil
gram
negatif
dan
merupakan
golongan
5nterobacteriaceae. Pada praktikum kali ini digunakan bakteri Escherichia coli. uspensi bakteri Escherichia coli terlebih dahulu dilakukan u$i oksidase untuk menentukan apakah oksidase negatif atau positif karena akan berpengaruh pada metode penger$aan menggunakan kit -en atau -en G. etelah diamati, akan didapat octal code. Octal code tersebutlah yang akan dimasukkan ke dalam program untuk mengidentifikasi mikroba.etelah diamati, didapatkan octal code berupa 02800002 dan nilai probabilitas yaitu 2,0+Idimana ketika octal code tersebut dimasukkan ke program yang terdapat data base yang memuat berbagai $enis octal code dari berbagai bakteri. etelah dimasukkan didapatkan hasil dari octal code tersebut didapatkan hasil bahwa bakteri yang digunakan berupa bakteri Escherichia coli.Jika octal code tidak sesuai dengan yang sebenarnya maka program yang memiliki data base berbagai $enis mikroba tidak akan mengidentifikasi dengan tepat bakteri yang digunakan dalam percobaan ini.
!ka Dama&ant! 1234132353 Ferifikasi mikroba patogen dikenal dengan pengu$ian mikrobiologi yang dilakukan untuk mengkonfirmasi kebenaran adanya mikroba yang diu$i dengan persentase 00I atau mendekati 00I berdasarkan karakteristik dari mikroba u$i. Pada praktikum ini pengu$ian dilakukan dengan menggunakan metode icrogen !ioproduct yang mengaplikasikannya dengan suatu kit yang telah dirancang dan disesuaikan dengan kondisi mikrobiologi. 1it yang dimaksud adalah well yang akan diinokulasikan dengan suspensi bakteri kemudian ditambahkan mineral oil serta reagen%reagen khusus pada well%well tertentu. akteri yang diu$i pada praktikum ini adalah Escherichia coli yang merupakan enterobacter, gram negatif, dan berbentuk basil pendek. #$i yang dilakukan pertama kali adalah u$i oksidase untuk menentukan mikrogen yang akan digunakan dengan cara menginokulasikan suspensi bakteri u$i ke strip oksidase, kemudian dimasukkan ke cawan steril kering, ditunggu 0 detik, kemudian menun$ukkan tidak ter$adinya perubahan warna pada strip tersebut, ini menandakan bahwa tes oksidase negatif, maka mikrogen yang digunakan yaitu -)% sa$a atau -) %. 1elompok kami menggunakan -) % untuk karakterisasi mikroba. Perlakuan selan$utnya yang dilakukan adalah dengan menginokulasikan 00KD suspensi bakteri dalam )a2, glukosa, :ylosa, indol, urease, FP, sitrat, 6', gelatin, malonat, inositol, sorbitol, ramnosa, sukrosa, laktosa, arabinosa, adonitol, raffinosa, dan arginina.
)amun, berdasarkan hasil yang diperoleh, terdapat bakteri dengan persen probabilitas sangat $auh lebih besar dibanding 5.coli yaitu 5. mericana sebesar 7@,9@I , hal ini dapat disebabkan karena ter$adinya kontaminasi mikroba pada saat proses penger$aan.
BAB / ESIMPULAN DAN SAAN A. es!m(ulan I0A SUMASAI 1234132356
'engan menggunakan sampel dilakukan pengu$ian biokimia untuk mengidentifikasi mikroorganisme dengan menggunakan Microgen -)%*' dan Microgen -)%*' , setelah dilakukan penginkubasian selam 28 $am diperoleh hasil dengan octalcode 02800002 lalu diperoleh hasil ter$emahan dengan software sebesar 7@,9@I merupakan E.americana. 'engan kata lain hasil yang diperoleh tidak sesuai dengan bakteri u$i atau sampel yang digunakan. 'imana sampel u$i yang digunakan adalah Escherichia coli sedangkan hasil yang peroleh adalah E.americana. Putr! as%!ant! 1234132373 'engan menggunakan sampel dilakukan pengu$ian biokimia untuk mengidentifikasi mikroorganisme dengan menggunakan Microgen -)%*' dan Microgen -)%*' ,setelah dilakukan inkubasi selama 87 $am diperoleh hasil dengan octalcode 02800002 dan diperoleh hasil ter$emahan dengan software sebesar 2,0+Iyang merupakan 5scherichia coli. !ka Dama&ant! 1234132353 5scherichia coli menghasilkan probabilitas sebesar 2,0+I dengan menghasilkan reaksi positif pada mannitol, )P-, dan salicin serta menghasilkan reaksi negatif pada lisin, ornitin, >2, glukosa, :ylosa, indol, urease, FP, sitrat, 6', gelatin, malonat, inositol, sorbitol, ramnosa, sukrosa, laktosa, arabinosa, adonitol, raffinosa, dan arginina. B. Saran I0A SUMASAI 1234132356 Praktikan harus disiplin dan berhati hati dalam melakukan praktikum agar hasil yang diperoleh dalam praktikum dapat sesuai dengan tu$uan yang
hendak dicapai. Praktikan harus beker$a lebih aseptisE agar $ika ada bakteri yang terkontaminasi pada media murni bakteri dari dari sampel u$i. Putr! as%!ant! 1234132373 ebaiknya dalam penger$aan dilakukan agar lebih aseptis untuk menghindari adanya kontaminan yang tidak dikehendaki dan hasil yang tidak akurat. !ka Dama&ant! 1234132353 Percobaan harus dilakukan lebih hati%hati dan aseptis agar tidak ter$adi kontaminasi mikroba lain yang dapat menyebabkan persen probabilitas bakteri non u$i lebih besar dibanding bakteri u$i.
BAB /I
DA-TA PUSTAA http3EEdownload.dokumen.tipsEgetdownloadEdocumentEe.coli . 'iakses tanggal 2 Mei 209. Pukul 3 7.00 =*
