Laporan Praktikum ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Aditya Satriya Nugraha Mahasiswa Program Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya
1.
Pendahuluan
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi denan menggunakan spectrofotometer.
Spectrofotometer adalah sebuah alat yang dapat mengukur jumlah dari cahaya yang menembus sumuran dari microplate. Kompleks antigen-antibodi yang kita buat pada well mcroplate akan memberikan perubahan warna pada cairan tersebut, sehingga akan memberikan optical density yang berbeda. Optical density dapat dinyatakan meningkat atau menurun berdasarkan pengenceran material standart, sehingga akan menghasilkan kurva dose-response yang nantinya akan digunakan untuk mengestimasi kadar protein tersebut. Dalam penggunaan sehari-hari ELISA bisa digunakan unruk melabel suatu antigen atau mengetahui antibody yang ada dalam tubuh. Apabila kita ingin mengetahui antigen apa yang ada di dalam tubuh, maka yang diendapkan adalah antibody-nya, begitu pula sebaliknya.
2.
Tujuan
a.
Menerapkan metode ELISA dengan benar
b.
Mengetahui hasil ikatan antigen-antibodi spesifik
3.
Metode
Bahan utama yang dipakai adalah Antibody anti-uPar, BSA, PBS, Coating Buffer, PBS-Tween, Alumunium foil, Anti-Rabbit igG, TMB, H2SO4. Langkah –langkah ELISA : 1)
Siapkan plate ELISA dan Plate Layout
2)
Coating antigen
a.
Serum: coating buffer = 1: 1 @ 100µl
b. BUngkus dengan alumunium foil c.
Inkubasi dalam suhu 40 selmalam
d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl 3) a.
Coating Blocking buffer (supaya menutupi antigen yang tidak kita inginkan) 1% BSA-PBS @ 100 µl
b. Bungkus dengan alumunium foil c.
Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan
d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl 4) a.
Coating antibody primer (mengikat antigen spesifik yang sudah kita coating sebelumnya) (Leptin-Rabbun PAb : Blocking Buffer = 1: 500 @ 100 µl
b. Bungkus dengan alumunium foil c.
Inkubasikan selama 2 jam pada suhu ruangan
d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl 5) Coating antibody sekunder (untuk mengikat antibody spesifik yang supah kita coating sebelumnya, dan memberikan tempat untuk molekul pewarnanya) a.
Anti rabbit IgG Biotin conjugate : PBS = 1: 1000 @ 100 µl
b. Bungkus dengan alumunium foil c.
Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan
d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl 6)
Coating enzim
a.
SAHRP : PBS = 1:1000 @ 100 µl
b.
Bungkus dengan alumunium foil
c.
Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan
d.
Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl
7)
Substrat dan Stop solution
a.
Teteskan substrat Tetramethyl benzydine (TMB) @ 50 µl
b.
Inkubasi selama 30 menit dalam suhu ruangan
c.
Tambahkan H2SO4 2N @ 50 µl
d.
Inkubasikan selama 10 menit pada suhu ruangan
8)
Baca dengan ELISA reader
4.
Hasil
Standart IL-6 Standard Conc. (ng/ml) OD 1
1000
0.773
2
100
0.298
3
10
0.076
4
1
0.181
5
0.1
0.169
6
0.01
0.248
7
0.001
0.679
Pada hasil ELISA ini didapatkan nilai R2 pada kurva 0,4823, yang artinya tingkat akurasinya masih rendah, karena untuk mendapatkan akurasi yang baik dibutuhkan nilai R2 mendekati 1. Karena tingkat akurasinya yang masih rendah, maka standart ini tidak bisa dipakai dalam pengukuran selanjutnya.
Standart uPAR Standard
Conc. (ng/ml)
OD
Avg OD
log conc.
log O.D
1
0
0.076
0
2
62.5
0.095
0.112
0.0275
1.795880017
-1.56067
3
125
0.129
0.139
0.058
2.096910013
-1.23657
4
250
0.186
0.194
0.114
2.397940009
-0.9431
5
500
0.285
0.302
0.2175
2.698970004
-0.66254
6
1000
0.48
0.497
0.4125
3
-0.38458
7
2000
0.864
0.971
0.8415
3.301029996
-0.07495
8
4000
1.841
1.869
1.779
3.602059991
0.250176
Dari standart uPAR tersebut, diketahui R2-nya 0,9994 yaitu mendekati 1, oleh karena itu kurva ini merupakan kurva yang dapat diterima untuk menghitung kadar sampel dalam pembelajaran ini. Korelasi sampel
Log Absorbansi
Log Konsentrasi
Konsentrasi (dalam pengenceran)
Real Konsentrasi
0.07
-1.15490196
2.196853996
157.3453801
3933.634503
12
0.166
-0.779891912
2.57718873
377.7363072
9443.40768
16
0.058
-1.236572006
2.114024334
130.0242431
3250.606077
9
0.888
-0.051587034
3.315834651
2069.353333
51733.83333
Nama Sampel
Absorbansi
3
14
0.121
-0.91721463
2.437916197
274.10452
6852.612999
6
0.044
-1.356547324
1.992345514
98.25293076
2456.323269
5
0.044
-1.356547324
1.992345514
98.25293076
2456.323269
4
0.052
-1.283996656
2.065926312
116.3928526
2909.821314
Dari perhitungan menggunakan kurva uPAR diatas, didapatkan konsentrasi IL-6 (dalam nano liter) pada masing masing sampel.
5.
Pembahasan
ELISA adalah suatu metode yang dikerjakan sebagai sarana mengukur kadar antigen atau antibodi dalam suatu medium cair, seperti serum atau organ yang telah dicairkan/dilarutkan. Metode ELISA yang dilakukan dalam praktikum ini merupakan metode untuk mengukur kadar IL-6 dalam serum pasien. Prinsipnya adalah adanya ikatan antigen-antibodi yang akan dibaca dengan reaksi enzimatis yang dapat mengakibatkan terjadinya perubahan intensitas warna pada larutan. Intensitas warna ini kemudian akan diukur pada ELISA reader. Metode ELISA dengan cara diatas adalah model ELISA indirek atau tidak langsung. Metode ini menggunakan ikatan antara antibodi primer dengan antibodi sekunder yang telah dikonjugasikan dengan biotin dan biotin ini akan diikat oleh enzim SAHRP yang akan bereaksi dengan substrat TMB. Penggunaan model ELISA ini bertujuan supaya terjadi amplifikasi reaksi enzimatis yang sehingga intensitas warna yang terjadi akan lebih kuat dan pembacaannya juga lebih mudah. Secara umum, proses pelaksanaan langkah-langkah ELISA sudah diterapkan dengan benar dibawah bimbingan laboran dar Lab.Biomedik, dan semua peserta mengikuti dengan antusias prosesnya mulai dari awal, namun karena memang keterbatasan alat, tidak semua mahasiswa mencoba dari awal sampai akhir, dan dilakukan prosesnya secara bergantian pada tiap-tiap proses. Karena prosesnya yang berganti-gantian, didapatkan ketidak akuratan pada hasil standart IL6,Kemungkinan penyebab dari ketidak akuratan standart bisa karena kekuatan pipetting dan akurasi tiap mahasiswa yang tidak sama.Ada yang benar saat pippeting, dan mungkin saja ada yang kurang benar saat melaksanakannya Oleh karena itu metode ELISA seharusnya dilakukan oleh 1 orang saja sehingga keakuratan dan kekuatan dalam melaksanakan langkah-langkah ELISA akan konsisten. Karena standart IL-6 yang kurang akurat, maka untuk melanjutkan pelatihan digunakan standart sampel lain yaitu (uPAR) untuk menghitung kadar IL-6 dari sampel. Seharusnya standart yang digunakan adalah standart yang di-running bersama dengan sampel pada saat yang sama. Walaupun zat yang diukur
sama, kita tidak boleh menggunakan standart suatu zat dari ELISA sebelumnya untuk digunakan pada ELISA yang sedang di-running, apalagi menggunakan standart zat yang berbeda. Kembal lagi pada tujuan pembelajaran praktikum ini, maka hal tersebut kami lakukan agar proses pembelajaran berjalan sesuai, dan yang terpenting mahasiswa mengetahui mana yang benar, dan mana yang salah, serta memahami solusi pemecahan masalahnya. Untuk menghitung kadar dari IL-6 digunakan cara regresi linier, sama dengan cara yang digunakan untuk elektroforesis, namun persamaan garis yang dipakai pada standart adalah persamaan logaritma. Pertama, absorbansi IL-6 hasil spectrophotometri dibuat pada tabel pada Ms. Exel. Kemudian dibuat logaritma dari data absorbansi tersebut dan dibuat logaritma dari standart,lalu dibuatlah persamaan garis terhadap Log absorbansi dan Log konsentrasi dengan sumbu X sebagai Log konsentrasi dan sumbu Y sebagai Log absorbansi. Absorbansi dari sampel selanjutnya juga dibuat logaritmanya. Dengan persamaan garis tersebut, dapat dihitung dan diketahui logaritma konsentrasi dari IL-6. Berikutnya dibuat anti-logaritma dari Log konsentrasi IL-6 yang sudah didapatkan, sehingga akan diketahui konsentrasi IL-6. Namun konsentrasi IL-6 ini adalah konsentrasi dalam pengenceran 25 kali, sehingga untuk mengetahui konsentrasi IL-6 sesungguhnya dalam sampel, konsentrasi yang telah kita dapat ini dikali 25.
6.
Kesimpulan
a. Mahasiswa melakukan prosedur ELISA dengan baik dan menghitung kadar IL-6 dengan memakai regresi linier b. Diketahui kadar IL-6 dengan standart uPAR pada sampel 3 adalah 157,35 ng/ml, sampel 12 adalah 377,74 ng/ml, sampel 16 adalah 130,02 ng/ml, sampel 9 adalah 2069,35 ng/ml, sampel 14 adalah 274,1, sampel 6 adalah 98,25, sampel 5 adalah 98,25, dan sampel 4 adalah 116,39 c. Pada praktikum selanjutnya diharapkan mahasiswa dapat melakukan prosedur dengan lebih akurat lagi dan menghasilkan standart yang benar sehingga hasil analisanya akan lebih baik lagi.
ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY Abstrak
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) merupakan teknik penapisan imunologis yang memanfaatkan ikatan spesifik antara antibodi dan antigen. ELISA dapat dibagi menjadi tiga yaitu Direct ELISA, Indirect ELISA, dan Sandwuch ELISA. Praktikum ELISA yang dilakukan yaitu indirect ELISA. Teknik tersebut merupakan teknik yang paling sederhana. Tujuan dilakukanya praktikum ELISA yaitu agar dapat memahami prinsip kerja ELISA, mengetahui konsentrasi antibodi dalam sampel dengan teknik ELISA, dan menentukan tingkat proteksi terhadap penyakit dari hasil pengolahan data ELISA. Penerapan ELISA antara lain untuk mengidentifikasi paternitas, diagnotis suatu penyakit, dan menghitung konsentrasi sampel. Hasil praktikum yang didapat dari pengolahan data menunjukan bahwa sampel target adalah negatif.
Kata kunci: antibodi, antigen, dan ELISA.
I.
Pendahuluan
Praktikum biologi molekuler diawali dari isolasi DNA untuk memisahkan DNA dari sel suatu individu. Selanjutnya dilakukan proses spektrofotometri untuk mengetahui kemurnian DNA tersebut. Tahap selanjutnya yaitu amplifikasi dengan teknik PCR. DNA kemudian dielektroforesis dengan tujuan untuk memisahkan DNAdari RNA dan pengotor lain. Tahap berikutnya yaitu digesti untuk memotong sekuen DNA spesifik yang diinginkan. kemudian dilakukan sequencing. Dari semua tahapan yang dilakukan, masih terdapat satu langkah lagi yaitu ELISA yang berguna untuk mengetahui jumlah atau konsentrasi sampel yang didapat.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik biokimia untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. ELISA terdiri atas tiga macam yaitu Direct ELISA, Indirect ELISA, dan Sandwich ELISA (Baker dkk. 2007: 211). Direct ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi suatu antigen. Antigen yang akan dideteksi akan berikatan langsung (direct) dengan antibodi detector (antibodi yang telah dilabeli oleh enzim reporter). Antibodi yang digunakan pada teknik direct ELISA berjumlah satu buah. Kelebihan dari direct ELISA yaitu Cepat dan tidak terdapat Cross Reaksi dengan antibodi sekunder. Akan tetapi, direct ELISA memiliki kekurangan yaitu harga pelabelan antibodi primer yang mahal, tidak ada fleksibilitas pemilihan antibodi primer, dan sinyal amplifikasinya sedikit (Walker & Rapley 2008: 668). Indirect ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen atau antibodi. Teknik tersebut memiliki karakteristik yaitu antigen tidak menempel langsung pada antibodi detector (indirect). Antigen akan berikatan dengan antibodi lain terlebih dahulu. Antibodi tersebut kemudian akan berikatan dengan antibodi yang telah dilabeli. Kelebihan indirect ELISA yaitu memiliki sensitivitas tinggi dan sinyal amplifikasi yang tinggi. Kekurangan indirect ELISA yaitu membutuhkan waktu yang lama dan terjadi cross reaksi terjadi (Walker & Rapley 2008: 669). . Sandwich ELISA merupakan jenis ELISA yang dapat digunakan untuk mengukur antigen maupun antibodi,. Karakteristik khas dari sandwich ELISA adalah menggunakan antibodi penangkap atau primer antibodi. Antigen yang akan dideteksi dan diukur konsentrasinya berikatan terlebih dahulu dengan antibodi penangkap. Antigen akan berikatan kembali dengan antibodi sesuai jenis sandwich ELISA yang digunakan. Sandwich ELISA dibagi menjadi dua jenis yaitu sandwich direct ELISA dan sandwich indirect ELISA (Crowther 1995: 39 – 43). Sandwich direct ELISA menggunakan dua antibodi yaitu antibodi penangkap dan antibodi yang dilabeli enzim. Antigen yang telah berikatan dengan antobodi penangkap akan berikatan kembali dengan antibodi yang dilabeli enzim. Sandwich indirect ELISA menggunakan tiga antibodi yaitu antibodi penangkap, antibodi detektor, dan anti-antibodi yang dilabeli enzim. Antigen yang telah berikatan dengan antibodi penangkap akan berikatan dengan antibodi detektor dan anti-antibodi yang dilabeli enzim (Crowther 1995: 39). Antigen dalam sandwich ELISA tidak perlu dimurnikan sebelum digunakan. Sandwich ELISA sangat spesifik sehingga tidak semua antibodi dapat digunakan. Contoh aplikasi terapan menggunakan teknik ELISA adalah mendeteksi dan menghitung jumlah antibodi virus HIV. Antigen (virus HIV) akan ditangkap oleh antibodi reseptor di dalam tubuh. Selanjutnya antigen akan berikatan dengan anti-antibodi di dalam tubuh yang terdapat enzim dan akan memberikan sinyal kepada tubuh.
II.
Metodologi
Alat yang digunakan dalam prktikum ELISA antara lain adalah ELISA reader, ELISA washer, well plate, dan mikropipet beserta tips. Bahan yang digunakan antara lain blocking buffer, washing buffer, antigen, antibodi monoklonal, dan suatu substrat. Cara kerja praktikum ELISA adalah sebagai berikut. Pertama, well plate dilapisi dengan antibodi penangkap. Kedua, well plate dicuci dengan menggunakan washing buffer. Ketiga, antigen diberikan pada well plate dan well plate kemudian dicuci dengan menggunakan washing buffer. Keempat, well plate diberi antibodi detektor dan well plate kembali dicuci menggunakan washing buffer. Kelima, antiantibodi yang dilabeli enzim ditambahkan pada well plate dan well plate kembali dicuci menggunakan washing buffer. Keenam, substrat dimasukkan agar enzim dapat berikatan dan memberikan sinyal terhadap keberadaan antigen (GenScript 2010 : 3).
III.
Hasil dan Pembahasan
Antigen merupakan molekul yang menginduksi respon sistem imun atau molekul yang akan dikenali oleh sistem imun yang spesifik. Antibodi merupakan protein-protein yang terbentuk sebagai respon terhadap antigen yang masuk ke tubuh dan bereaksi secara spesifik dengan antigen tersebut (Rao 2001 : 1). Antigen dan antibodi dapat dideteksi dengan menggunakan teknik ELISA. Jenis ELISA yang dilakukan dalam praktikum adalah indirect sandwich. penambahan antibodi penangkap ke dalam well plate bertujuan untuk melapisi dasar well plate dengan antibodi agar dapat mengikat antigen. Pencucian dengan menggunakan washing buffer bertujuan untuk menghilangkan antibodi penangkap yang tidak sesuai dan tidak dapat berikatan dengan antigen target. Washing buffer juga digunakan untuk membersihkan antigen yang tidak berikatan dengan antibodi penangkap. Penambahan well plate dengan antigen bertujuan agar antigen dapat berikatan dengan antibodi penangkap dan dapat di deteksi. Well plate kemudian dicuci kembali dengan menggunakan washing buffer agar antigen yang tidak sesuai dengan antibodi penangkap dapat hilang sehingga hanya terdapat antigen sesuai target. Penambahan antibodi detektor bertujuan sebagai penghubung antara antigen dengan anti-antibodi yang di labeli dengan enzim (Crowther 1995: 41 – 42). Anti-antibodi yang dilabeli dengan enzim tidak dapat berikatan langsung dengan antigen. Pencucian dengan washing buffer kembali dilakukan dengan tujuan agar anti-antibodi yang tidak berikatan dengan antibodi detektor dapat terbuang. Selanjutnya adalah penambahan anti-antibodi yang dilabeli enzim. Hal tersebut bertujuan agar enzim dapat memberikan sinyal yang menandakan bahwa terdapat antigen. Enzim tersebut harus berikatan dengan suatu substrat agar dapat memberikan sinyal tersebut dengan cara terjadinya perubahan warna. Selanjutnya hasil konsentrasi antigen dapat dibaca dengan menggunakan ELISA reader (Crowther 1995: 41 – 42).
Hasil dari proses ELISA terdiri dari dua bentuk yaitu kualitatif dan kuantitatif. Hasil secara kualitatif adalah perubahan warna pada well plate yang mengindikasikan bahwa terjadi reaksi yang spesifik antara antigen dengan antibodi. Perubahan warna tersebut dihasilkan oleh reaksi antara substrat dengan enzim yang terdapat di anti-antibodi. Hasil secara kuantitatif berupa besaran konsentrasi dan nilai adsorbsi (y) pada sampel. Pengukuran y pada hasil ELISA menggunakan mesin ELISA reader yang pronsipnya sama dengan mesin spektrofotometer. Intensitas cahaya yang diserap oleh sampel pada panjang gelombang tertentu berbanding lurus dengan besar nilai y. Jika semakin banyak intensitas cahaya yang diserap, maka semakin besar nilai y. Semakin kecil nilai intensitas cahaya yang diserap oleh sampel, semakin kecil pula nilai y (Crowther 2001: 10). .
----------Grafik 1.1---------
Persamaan kurva regresi serum standar adalah y= - 0,400x + 1,729. Variabel y menyatakan nilai adsorbsi sedangkan variabel x merupakan nilai yang dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi antibodi atau antigen target. Nilai x dapat diperoleh dengan memasukkan nilai y pada persamaan tersebut. Nilai x yang didapat dapat digunakan untuk mencari konsentrasi (C) dengan C = log-1 x. Berdasarkan pengolahan grafik, konsentrasi yang didapat berbanding terbalik dengan nilai x. Semakin besar nilai x, semakin kecil nilai konsentrasi dan sebaliknya. Hal tersebut terlihat dalam grafik 1.1. tanda panah menunjukan puncak C, x , dan y. Nilai konsentrasi antibodi yang didapat berada di bawah 0,35. Hal tersebut menunjukan bahwa sampel tersebut adalah negatif.
IV.
Kesimpulan
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah metode uji imunitas atau keberadaan dan konsentrasi suatu protein penyusun antigen berdasarkan reaksi antara antibodi dan antigen itu sendiri. Teknik tersebut tidak hanya dapat digunakan untuk mendeteksi antigen, tetapi dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi di dalam tubuh. Prinsip kerja dari teknik ELISA adalah berdasarkan reaksi spesifik antara antibodi dan antigen dengan menggunakan enzim sebagai penanda (marker). Enzim tersebut akan memberikan suatu tanda terdapatnya suatu antigen jika antigen tersebut sudah bereaksi dengan antibodi. Reaksi tersebut memerlukan antibodi spesifik yang berikatan dengan antigen. Konsentrasi antigen dan antibodi dalam suatu sampel dapat diketahui dengan menggunakan tabel, kurva standar, dan perhitungan persamaan linearnya. Berdasarkan perhitungan yang dilakukan, konsentrasi berbanding terbalik dengan nilai x. Nilai konsentrasi yang didapat sangat kecil yaitu dibawah 0,35. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa sampel adalah negatif.
V.
Daftar Acuan
Baker, G.B, S. Dunn & A. Latja. 2007. Handbook of neurochemistry and molecular neurobiology: Practical nerochemistry methods, vol. 6. Springer Science, New York: x + 475 hlm. Crowther, J.R. 1995. ELISA: Theory and practice.Humana Press, New Jersey: iv + 207 hlm. Crowther, J.R. 2001. The ELISA guidebook. Humana Press, New Jersey: xi + 407 hlm. GenScript. 2010. ELISA protocol. GenScript USA Inc., USA : 5 hlm.
Rao, K. 2001. Encyclopedia of life sciences. Nature publishing group, New Delhi : 7hlm. Walker, J.M. & R. Rapley. 2008. Molecular biomethods handbook. Springer Science, New York: xx + 1122 hlm.
