BAB I
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Syahrurachman, 1994).
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen blue.
Sebagai tenaga analis kesehatan dibutuhkan keterampilan dalam membuat spesimen yang berguna dalam pemeriksaan spesimen di laboratorium. Bakteri umumnya memiliki warna yang transparan maka dari itu diperlukan pewarnaan bakteri agar bentuk dan struktur bakteri dapat terlihat lebih jelas jika diamati dengan mikroskop cahaya. Hal tersebut yang melatarbelakangi penulis untuk mengangkat permasalahan ini sebagai masalah yang akan dibahas dalam laporan praktikum dengan judul "Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA) ".
Maksud praktikum
Maksud dari praktikum ini adalah agar mahasiswa:
Mengetahui tekhnik pewarnaan BTA metode Ziehl-Neelsen
Mengetahui bentuk-bentuk (morfologi) dan sifat BTA
Tujuan praktikum
Tujuan dari praktikum ini adalah
Membuat sediaan untuk pewarnaan BTA
Melakukan pengecetan/pewarnaan BTA
Mengedentifikasi bentuk-bentuk (morfologi) dan sifat BTA pada preparat yang telah dibuat.
BAB II
LANDASAN TEORI
Pewarnaan diferensial artinya pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu macam zat warna, seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Sedangkan pewarnaan khusus artinya pewarnaan yang dipakai untuk mewarnai bagian-bagian sel atau bakteri tertentu yang sukar diwarnai dengan menggunakan pewarnaan biasa. Pewarnaan khusus dipakai untuk mewarnai bagian-bagian sel kuman atau kuman tertentu yang sukar diwarnai (Noverita, 2009).
Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan Chan, 1988).
Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997).
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, sekali mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M. tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid, protein, dan polisakarida (Thomas, 1999).
Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat (2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm. Pada media buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz et al., 2001).
Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk "cepat asam" daripada bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).
Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau ludah) untuk analisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis sputum:
Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun pagi.
Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu.
Collection sputum : sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam
Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu.
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994).
Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-Neelsendapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :
1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan asam (acid fast).
2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non acid fast).
Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Kurniawati et al., 2005).
Larutan kimia yang digunakan adalah alkohol asam 3% , carbol fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi antara lain asam alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai fungsi membuka lapisan lilin agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri akan tetap berwarna merah dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk., 1980).
Negatif: apabila tidak ditemukan BTA.
Positif: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 1: apabila terdapat 10 – 90 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 2: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 1 lapang pandang.
Positif 3: apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang
BAB III
METODE KERJA
A. Alat dan Bahan
ALAT
BAHAN
REAGEN
Ose
Lampu spritus
Objek gelas
Mikroskop
Tissu
Pipet tetes
Sputum positif
Minyak imersi
Aquades/air kran
Carbol fuchsin 1%
Asam alcohol 5%
Methylen blue/asam pikrat
Metode Ziehl-Neelsen
Metode Kinyoun-Gabbet
ALAT
BAHAN
REAGEN
Ose
Lampu spritus
Objek gelas
Mikroskop
Tissu
Pipet tetes
Sputum positif
Minyak imersi
Aquades/air kran
Larutan Kinyoun
Larutan Gabbet
B. Prosedur Kerja
Metode Ziehl-Neelsen
Disiapkan alat dan bahan
Dibersihkan objek gelas hingga bebas lemak
Jika perlu, ditulis kode atau nama bakteri pada sudut objek gelas
Digenangi larutan carbol fuchsin pada sediaan yang telah difiksasi
Panaskna sampai menguap selama 5 menit
Pewarna dibuang dan ditetesi asam alcohol selama 1-2 detik
Dicuci dengan air mengalir
Ditambahkan methylen blue kurang lebih 1 menit
Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan
Diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan minyak imersi.
Metode Kinyoun-Gabbet
Disiapkan alat dan bahan
Dibersihkan objek gelas hingga bebas lemak
Jika perlu, ditulis kode atau nama bakteri pada sudut objek gelas
Dituangkan larutan Kinyoun selama 3 menit pada sediaan yang telah difiksasi
Dicuci dengan air mengalir selama 30 detik
Diuangkan larutan Gabbet selama 1 menit
Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan di udara
Diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan minyak imersi.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Metode Ziehl-Neelsen
Gambar di atas merupakan hasil pewarnaan basil tahan asam (BTA) metode Ziehl-Neelsen yang dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x. Bakteri tahan asam tampak berbentik basil warna merah sedangkan bakteri yang tidak tahan asam berwarna biru.
Metode Kinyoun –Gabbet
Gambar di atas merupakan hasil pewarnaan basil tahan asam (BTA) metode Kinyoun-Gabbet yang dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x. Bakteri tahan asam tampak berbentik basil warna merah sedangkan bakteri yang tidak tahan asam berwarna biru.
B. Pembahasan
1. Menurut Ziehl Neelsen
Bakteri genus mycobacterium dan beberapa spesies nocardia pada dinding selnya mengandung banyak zat lipoid (lemak) sehingga bersifat permiable dengan pewarnaan biasa. Bakteri tersebut bersifat tahan asam (+) terhadapa pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahan asam dapat digunakan untuk membantu menegakkan diagnosa tuberkulosis. Pewarnaan tahan asam menggunakan larutan ziehl-Neelsen A (cat karbol fuchsin), Ziehl-Neelsen B (alkohol asam :HCL 3% dalam metanol 95%) dan ziehl –neelsen C (cat biru metilen). Hasil pewarnaan maka bakteri tahan asam akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.
Adapun kelemahan dan kelebihan Ziehl Neelsen yakni: latar belakang berwarna biru terang, basil merah jelas, reagen terjangkau dan mudah didapat, fenol diencerkan 5% dan tidak dipanaskan karena pemanasan dilakukan pada proses pewarnaan sedian zat warna utama maka dari itu agak lama waktu yang dibutuhkan.
2. Menurut Kinyoun Gabbet
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan kadar cat yang tinggi maka lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen blue.
Kelemahan dan Kelebihan Pewarnaan Kinyoun-Gabbet antara lain adalah: latar belakang berwarna ungu dan buram, basil kurang merah, lekosit ungu, reagen jarang dijumpai karena itu mahal harganya, komposisi dari fenol kristal/bubuk murni dan pada saat pembuatan reagen sebelum proses homogenisasi zat warna primer denagn carbol fuchsin dipanaskan/dilelehkan pada penangas atau autoclaf, dan terakhir pada proses pewarnaan lebih mudah, cepat dan praktis.
BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Pewarnaan BTA merupakan pewarnaan yang dilakukan untuk mengidentifikasi Bakteri Tahan Asam. Pewarnaan ini tidak spesifik untuk Mycobacterium tuberculosis karena hasil pewarnaan BTA juga akan positif terhadap genus Mycobacterium lain.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam proses pengecatan BTA adalah pada saat dekolorisasi dengan asam alkohol dimana pemberian asam alkohol jangan sampai berlebih karena akan menyebabkan overdekolorization sehingga sel BTA hampir sama dengan Non BTA yang menyebabkan sulit membedakannya, tetapi jangan juga terlalu sedikit dalam memberikan alkohol (underdecolorization) karena tidak akan melunturkan warna secara sempurna sehingga sel Non BTA bisa saja berwrna ungu mendekati warna sel BTA. Saat pemanasan juga tidak boleh sampai mendidih karena akan menyebabkan sel bakteri lisis.
Faktor-faktor yang memberikan perbedaan antara bakteri BTA dan non BTA adalah pada komponen dinding selnya.
B. Saran
Adapun sehubungan dengan praktikum ini, khususnya ditujukan bagi mahasiswa yaitu:
Diharapkan bagi seluruh mahasiswa agar selama kegiatan praktikum ini berlangsung, Mahasiswa harus menggunakan APD (Alat Pelindung Diri).
Diharapkan pula bagi semua mahasiswa, bahwa selama kegiatan praktikum ini berlangsung, agar semua mahasiswa bersungguh-sungguh dalam melakukan praktikum.
DAFTAR PUSTAKA
http://israyantianur.blogspot.com/2013/05/pewarnaan-bta-ziehl-neelson.html
http://erlinpurnamasari.blogspot.com/2013/06/pewarnaan-bta-metode-zn.html
http://aiiudewa.blogspot.com/2013/12/laporan-bakteri-tahan-asam.html
www.googleimage.pewarnaanbta.com
Laporan Praktikum BakteriologiPage 10
