BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme atau mikroba adalah sebuah organisme yang begitu kecil sehingga tidak dapat terlihat mata telanjang. Mikroorganisme sering digambanrkan menggunakan sel tunggal, atau mikroorganisme unisel, namun beberapa protista protist a unisel terlihat oleh mata telanjang, dan beberapa spesies multisel tidak terlihat mata telanjang. Kebanyakan mikroorganisme dapat menghasilkan enzim dalam proses metabolismenya. Enzim merupakan molekul protein tak hidup yang dihasilkan oleh setiap sel hidup yaitu sel eukariotik dan prokariotik. Di dalam sel protein enzim melangsungkan ribuan reaksi kimia yang membuat sel dapat hidup yakni mengekstraksi energi dari lingkungan,
mengubah
sumber
energi
menjadi
molekul
yang
bermanfaat,
membangun dan memperbaiki diri sendiri, melakukan pembuangan hasil samping dan mereplikasi dirinya sendiri. Oleh karena itu dapat dikatakan bahwa semua reaksi kehidupan bisa dimungkinkan oleh adanya enzim. Dewasa ini, enzim adalah senyawa yang umum digunakan dalam proses produksi. Enzim yang digunakan pada umumnya berasal dari enzim yang diisolasi dari bakteri. Penggunaan enzim dalam proses produksi dapat meningkatkan efisiensi yang kemudian akan meningkatkan jumlah produksi. Dalam percobaan ini dilakukan isolasi jenis enzim kitinase dan kitin deasetilase dari mikroba penghasil enzim ekstraseluler yaitu isolat dari Bacillus lichemiformis strain HSA3-1a.
1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan 1.2.1 Maksud Percobaan
Maksud dari percobaan ini adalah untuk mengetahui dan mempelajari teknik isolasi enzim dari mikroba dan mengetahui aktivitas enzim dari mikroba. 1.2.2 Tujuan Percobaan
Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah untuk mengisolasi enzim β-1,3glukanase dari Bacillus lichemiformis strain HSA3-1a dan mengetahui aktivitas enzim β-1,3-glukanase dari Bacillus lichemiformis strain HSA3-1a.
1.3 Prinsip Percobaan
Mengisolasi enzim kitin deasetilase dari mikroba Bacillus lichemiformis dalam suatu medium padat dengan cara menginokulasi pada agar cawan dengan jarum ose melalui metode penyebaran penyebaran kultur mikroba di atas agar pada kondisi o
optimum yaitu suhu 55 C dan pH 7.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai biokatalis yang terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup. Dengan keberadaan enzim di dalam sel tubuh inilah, setiap reaksi kimia untuk menjaga kelangsungan hidup makhluk hidup terjadi. Karena extremophile menyenangi lingkungan ekstrim, maka enzim yang terdapat dalam tubuhnya
biasanya
menyenangi
lingkungan
ekstrim
pula.
Sebagai
contoh,
hyperthermophile mempunyai enzim yang sangat stabil dan hanya dapat bereaksi pada suhu tinggi. Enzim seperti ini sangat ideal untuk proses reaksi dalam industri. Karena dalam masalah efektifitas, tak ada katalis yang mengungguli enzim. Enzim yang tidak rusak ketika bereaksi dan tahan lama dalam suhu tinggi menjadi impian para industri (Hardono, 2001). Fungsi suatu enzim adalah sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi 8
dalam sel maupun luar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 10 sampai 10
11
kali lebih cepat apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Jadi enzim dapat berfungsi sebagai katalis yang sangat efisien, di samping itu mempunyai derajat
kekhasan yang tinggi. Seperti juga katalis lainnya, maka enzim dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia. Reaksi kimia ada yang membutuhkan enenrgi (reaksi endergonik) dan ada pula yang menghasilkan
energi atau mengeluarkan
energi (eksergonik) (Poedjiadi, 1994). Enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan suhu dan pH (tingkat keasaman) optimum yang berbeda-beda karena enzim adalah protein, yang dapat mengalami perubahan bentuk jika suhu dan keasaman berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai, enzim tidak dapat bekerja secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal ini akan menyebabkan enzim kehilangan fungsinya sama sekali. Kerja enzim juga dipengaruhi oleh kofaktor dan inhibitor. adalah senyawa yang umum digunakan dalam proses
Dewasa ini, enzim
produksi. Enzim yang
digunakan pada umumnya berasal dari enzim yang diisolasi dari bakteri. Penggunaan enzim dalam proses produksi dapat meningkatkan efisiensi yang kemudian akan meningkatkan jumlah produksi (Susanto, 1986). Mikroorganisme tersebar luas di alam lingkungan, dan sebagai akibatnya produk pangan jarang sekali yang steril dan umumnya tercemar oleh berbagai jenis mikroorganisme. Bahan pangan selain merupakan sumber gizi bagi manusia. Juga sebagai sumber makanan bagi perkembangan mikroorganisme. Pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme dalam makanan sangat erat hubungannya dengan kehidupan manusia (Buckle dkk., 1987). Mikroba
spesifik yang terdapat di dalam bahan pangan dapat dikurangi
jumlahnya oleh berbagai jenis metode pengolahan atau pengawetan pangan. Jenis
pengolahan/pengawetan pangan yang berpengaruh terhadap kehidupan mikroba, antara lain suhu tinggi, suhu rendah, penambahan bahan pengawet dan irradasi (pengaruh berbagai metode pengolahan/pengawetan bahan terhadap kehidupan mikroba). Mikroba dapat tumbuh lebih baik pada media yang memnuhi persyaratan untuk pertumbuhanya. Beberapa persyaratan media pertumbuhan mikroba antara lain kandungan nutrisi dalam media, pH, suhu dan tidak tercemar (tidak terpolusi) oleh toksik dan lain-lain (Nurwanto dan Djarijah, 1997). Apabila suatu sel mikroba (misalnya bakteri) ditumbuhkan pada suatu medium yang memenuhi syarat untuk tumbuh, maka mikroba tersebut akan mengadakan multiplikasi secara aseksual dengan pembelahan sel menjadi dua sel vegetatif yang serupa dan selanjutnya proses tersebut berlangsung terus-menerus selama nutrisi, energi dan persyaratan lingkungan lain masih memenuhi syarat untuk tumbuh (Nurwanto dan Djarijah, 1997). Secara alamiah, mikroba terdapat dalam bentuk campuran dari berbagai jenis. Sebagai contoh, dari berbagai jenis mikroba terdapat di dalam makanan, tanah, air, udara, sampah dan sebagainya. Untuk mempelajari dari sifat masing-masing mikroba tersebut termasuk sifat pertumbuhannya, morfologi dan sifat fisiologi masing-masing mikroba tersebut harus dipisahkan satu dengan lainnya, sehingga terbentuk kultur murni, yaitu suatu biakan yang terdiri dari sel-sel dari satu spesies atau satu galur mikroba. Untuk tujuan ini digunakan media yang telah disterilisasi, baik berupa media cair maupun medium padat, dan pekerjaaan dilakukan secara aseptis untuk mencegah kontaminasi. Cara aseptis yang harus dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi merupakan suatu cara kerja di mana terjadi kontaminasi oleh
mikroba lain yang tidak yang tidak dikehendaki dicegah semaksimal mungkin. Untuk memindahkan sel-sel dari satu medium ke medium lainnya digunkan suatu kawat yang diberi batang pemegang pada bagian pangkalnya, yang disebut jarum ose atau loop. Loop harus dipijarkan sampai berwarna merah saat sebelum dan sesudah digunakan. Dengan cara ini bagian jarum dari loop terseut menjadi steril. Selama pemijaran jarum ose harus dipegang sedemikian rupa di atas api sehingga seluruh ujung loop sampai pada bagian didekat tangki pemegang menyala secara bersamaan. Sebelum diinokulasi, loop yang telah menyala harus didinginkan dalam waktu beberapa detik untuk mencegah kematian mikroba yang akan diinokulasi (Djide dan Gobel, 1988). Agar miring merupakan satu bentuk medium yang digunakan untuk membiakkan mikroba, terutama yang bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif. Ciriciri kultur yang termasuk pembentukan warna dan pertumbuhannya dapat segera diamati pada agar miring.
Inokulasi mikroba pada agar miring dapat dilakukan
dengan cara menggoreskan jarum ose secara zig zag pada permukaan agar miring (Djide dan Gobel, 1988). Prinsip perhitungan cawan yaitu, jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan akan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitung cawan merupakan metode atau cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba karena alasan-alasan berikut : 1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung 2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba Selain keuntungan-keuntungan tersebut, metode hitungan cawan mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai berikut (Fardiaz, 1989): 1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni 2. Medium dan kondisi yang berbeda dapat menghasilkan nilai yang berbeda 3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar 4. Memerlukan
persipan
dan
waktu
inkubasi
beberapa
hari
sehingga
pertumbuhan koloni dapat dihitung. Untuk metode tuang, inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu tertentu sesuai dengan jenis mikroba yang akan dihitung. Medium agar yang digunakan juga disesuaikan dengan jenis mikroba yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi sel-sel yang masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni (Fardiaz, 1989).
BAB III METODE PERCOBAAN
3.1
Bahan
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah bakto agar, tipton, yeast ekstrak, NaCl, pepton, CMC, K 2HPO4, serbuk MgSO4.7H2O, etanol 70 %, glasswool, kertas pH universal, aquades, tissue roll, aluminium foil, buffer asetat, glukan, pereaksi Nelson, dan arsenomolibdat.
3.2
Alat
Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah cawan petri, jarum ose, erlenmeyer, tabung reaksi, rak tabung, botol semprot, lampu spiritus, magnetik stirer, autoclave, oven, shaker, batang pengaduk, sendok zat, gelas ukur, neraca analitik, spidol, mistar, inkubator, kaki tiga, injektor, lemari pendingin dan kasa.
3.3
Prosedur Kerja
3.3.1 Penyiapan Medium Padat
Ditimbang 1,5 gram bakto agar, 0,05 gram yeast ekstrak, 0,1 gram NaCl, 0,01 gram pepton dan 0,1 gram CMC. Zat yang ditimbang dicampurkan dalam erlenmeyer 250 mL. Campuran zat dilarutkan dengan aquades hingga 100 mL, dan diaduk dengan magnetik stirrer hingga semua zat larut. Dipanaskan di atas spiritus dan disterilkan dalam autoclave. Larutan dituang ke dalam cawan petri yang telah disterilkan. Cawan petri dilapisi dengan parafilm dan didiamkan selama 1 hari dalam oven. Medium padat yang telah dibuat ditandai menjadi empat kuadran. Mikroba digoreskan pada masing-masing kuadran. Cawan petri dibungkus kembali dengan o
parafilm dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 50 C selama 1 hari. Jika terdapat warna bening pada pinggir goresan, menunjukkan adanya mikroba yang berkembang biak. 3.3.2 Pembuatan Inokulum
Ditimbang 0,0375 gram yeast ekstrak, 0,525 gram amonium sulfat, 0,0075 gram pepton, 0,075 gram NaCl, 0,0075 gram K 2HPO4, 0,0075 gram MgSO 4.7H2O
dan
0,0075 gram CMC. Hasil penimbangan dicampurkan ke dalam erlenmeyer 250
mL, dan dilarutkan dengan 75 mL aquades. Campuran dishaker hingga larut sempurna, kemudian disterilisasi ke dalam autoclave. Medium padat yang telah ditumbuhi mikroba yang berwarna bening, dikeluarkan. Mikroba yang dihasilkan kemudian diambil dengan menggunakan jarum ose, dan dimasukkan ke dalam inokulum yang telah dibuat. Inokulum yang telah berisi bakteri kemudian dishaker selama satu hari. 3.3.3 Pembuatan Medium Produksi
Ditimbang 0,045 gram yeast ekstrak, 0,63 gram amonium sulfat, 0,009 gram pepton, 0,09 gram NaCl, 0,009 gram K 2HPO4, 0,009 gram MgSO 4.7H2O dan 0,009 gram CMC. Hasil penimbangan dicampurkan ke dalam erlenmeyer 250 mL, dan dilarutkan dengan 90 mL aquades. Campuran dishaker hingga larut sempurna, kemudian disterilisasi ke dalam autoclave. Inokulum dikeluarkan dan diinjeksikan 10 mL ke dalam medium produksi dan dihomogenkan. Diinjeksi 30 mL campuran ke dalam botol zat (0 jam) dan di masukkan ke dalam lemari pendingin. Sisa dari larutan di shaker selama 3 hari. 3.3.4 Pengukuran Optical Density
Campuran yang telah dipisahkan ke dalam botol zat dan dimasukkan ke dalam lemari pendingin, diukur pHnya dengan kertas pH dan diukur nilai Optical Density dengan menggunakan Spertrofotometer 20D+ dengan panjang gelombang 660 nm. Campuran yang telah dishaker selama 3 hari kemudian dimasukkan ke dalam botol zat yang berbeda. Campuran yang telah didinginkan juga dikeluarkan. Kedua campuran tersebut diukur pHnya dengan kertas pH dan diukur nilai Optical Density
dengan menggunakan Spertrofotometer 20D+ dengan panjang gelombang 660 nm. Campuran disentrifuge.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan Tabel I. Hubungan Waktu Fermentasi terhadap pH dan Optical Density No.
Waktu Fermentasi (jam)
pH
Optical Density (660 nm)
1
0
6
0,044
2
72
7
0,777
4.2 Pembahasan
Pengerjaan pada percobaan ini dilakukan pada empat tahapan utama yaitu pembuatan medium padat, pembuatan inokulum, pembuatan medium produksi, dan pengukuran optical density. Pada percobaan ini tidak dilakukan uji aktifitas β-1,3glukanase sebab kurangnya waktu yang tersedia. Mikroba yang telah disiapkan sebelumnya digores pada medium yang berbentuk padat. Medium yang digunakan pada percobaan ini adalah medium padat karena pertumbuhan mikroba yang diamati berupa pertumbuhan koloni. Medium padat dibuat dengan komposisi yang sesuai dengan semua kebutuhan unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba yang akan diisolasi. Adapun komponen yang digunakan antara lain bakto agar sebagai pemadat substrat dan komponen media lain, yeast ekstrak sebagai sumber energi atau unsur karbon, NaCl sebagai sumber mineral Na yang dibutuhkan untuk pertumbuhan. Medium yang digunakan terlebih dahulu disterilkan dalam autoclave untuk mencegah medium ditumbuhi oleh mikroorganisme lain yang tidak diharapkan.
Pengerjaan dilakukan dalam keadaan aseptik sehingga kontaminasi dan mikroba yang tidak diharapkan dapat dihindari. Tahap selanjutnya ialah isolasi mikroba Bacillus lichemisformis yang telah tumbuh pada medium padat ke dalam inokulum. Inokulum mengandung ammonium sulfat sebagai komponen penyedian unsur nitrogen, yeast ekstrak sebgai sumber energi atau unsur karbon, NaCl sebagai sumber mineral Na yang dibutuhkan untuk pertumbuhan, K 2HPO4 sebagai garam yang mempertahankan pH media dalam keadaan netral, MgSO 4.7H2O sebagai sumber mineral dalam media. Mikroba pada medium padat yang telah diinkubasikan selama 24 jam pada o
suhu 50 C, diisolasi dengan menggunakan jarum ose pada bagian bening yang terdapat pada medium padat. Selanjutnya inokulum dishaker selama 1 hari. Tahap selanjutnya ialah pembuatan medium produksi, dimana komposisi medium produksi sama dengan medium inokulum. Tujuan pemindahan mikroba ke medium produksi ialah untuk memperbesar ruang bagi mikroba untuk berkembang biak. Pada tahap ini, medium produksi dibagi dua, dimana 30 mL dimasukkan dalam lemari pendingin, dan sisanya dishaker selama tiga hari. Tujuan dari perlakuan ini ialah untuk membandingkan pertumbuhan mikroba pada medium dengan selang waktu pertumbuhan 0 jam dan 72 jam. Mikroba dalam medium yang dimasukkan ke dalam lemari pendingin, tidak dapat mengalami pertumbuhan sebab kondisi duhu yang tidak memungkinkan. Tahap
terakhir
ialah
pengukuran
pH
dan
optical
density
dengan
menggunakan Spektrofotometer 20D+. Pengukuran ini bertujuan untuk melihat pertumbuhan mikroba, dimana diasumsikan bahwa semakin keruh mediumnya,
menunjukkan semakin banyak mikroba yang telah tumbuh. Selanjutnya medium disentrifuge untuk memisahkan endapan dan cairan. Mikroba akan berada pada salah satu bagian yang bergantung dari sifat mikroba tersebut, ekstraseluler atau intraseluler. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pengukuran absorbansi pada medium dengan waktu fermentasi 0 jam ialah 0,044, sedangkan pada medium dengan waktu fermentasi 72 jam ialah 0,777. Hal ini menunjukkan bahwa semakin lama waktu fermentasi, medium semakin keruh, yang menandakan mikroba yang tumbuh semakin banyak. Setelah disentrifuge, medium akan terpisah antara cairan yang larut dengan yang tidak larut. Jika dilanjutkan pada tahap uji aktifitas, maka dapat terlihat dengan jelas bagian yang mengandung mikroba. Pada hal ini, tidak dilanjutkan ke tahap uji aktifitas. Namun, dari literature yang diperoleh, diketahui bahwa bagian yang mengandung mikroba ialah pada cairannya. Hal ini menunjukkan bahwa mikroba tersebut dapat larut dalam air, dan menandakan bahwa mikroba tersebut adalah jenis mikroba ekstraseluler.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari percobaan dapat disimpulkan bahwa enzim β-1,3-glukanase dapat diisolasi dari mikroba Bacillus lichemiformis strain HSA3-1a.
5.2 Saran
Saran pada percobaan ini ialah : a.
Untuk laboratorium, agar peralatan yang digunakan dipertahankan kebersihan dan ketelitiannya.
b.
Untuk percobaan, agar dapat diselesaikan hingga uji aktifitas.
DAFTAR PUSTAKA
Buckle, K.A., Edwards, R.A., Fleet, E.T., Wootten, M., 1987, Ilmu Pangan, UI-Press, Jakarta. Djide, N. dan Gobel, R. B., 1988, Mikrobiologi Umum, Laboratorium Mikrobiologi Farmasi, Jurusan Farmasi FMIPA UNHAS, Makassar. Fardiaz, S., 1989, Analisis Mikrobiologi Pangan, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Dirjen Perguruan Tinggi Pusat Antar Universitas dan Gizi IPB, Bogor. Girindra, A., 1993, Biokimia 1, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Hardono, 2001, Enzim Hyperthermophile, (http://www.istecs.org/publication/ artikel/htm).
(online)
Nurwantoro dan Djarijah, A. S., 1997, Mikrobiologi Pangan Hewan-Nabati, Kanisus, Yogyakarta. Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta. Susanto, 1986, Enzimologi, (online) (http://id.wikipedia.org/wiki/enzim/htm).
LEMBAR PENGESAHAN
Makassar, 8 Desember 2010 Asisten
Praktikan
Fitri Ariani
Syadza Firdausiah
LAPORAN PRAKTIKUM
ISOLASI β-1,3-GLUKANASE DARI BACILLUS LICHEMIFORMIS STRAIN HSA3-1a NAMA NIM KELOMPOK HARI/TGL. PERC. ASISTEN
: SYADZA FIRDAUSIAH : H 311 08 276 : III (TIGA) : SENIN/29 NOVEMBER 2010 : FITRI ARIANI
LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2010 LAMPIRAN 1. Medium Padat
2. Medium Produksi
72 jam 3. Setelah disentrifuge
0 jam
0 jam
72 jam
