LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM PEWARNAAN BBAKTERI DAN ENDOSPORA
Ayu Hilyatul Millah 115090107111017 3-A
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA 2013
PEWARNAAN BBAKTERI DAN ENDOSPORA
Ayu Hilyatul Millah Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya, Malang Abstrak Tujuan dilakukan praktikum ini yaitu untuk mengetahui teknik pembuatan sediaan apusan, untuk mengetahui proses pewarnaan struktur sel bakteri dan endospora, dan untuk mengetahui bentuk-bentuk dan struktur dari sel bakteri dan endospora, serta untuk mengetahui reaksi kimiawi pada setiap prosedur atau tahapan pada proses pewarnaan. teknik pewarnaan gram dilakukan secara bertahap dengan pewarna cat A, B C dan D yang menghasilkan warna ungu untuk bakteri gram positif dan gram negative untuk bakteri gram negatif. Bentuk bakteri yang teramati baik dari sampel ataupun isolate acuan yaitu kokus atau bulat, dan basil atau batang. Pewarnaan endospora dengan malakit green menunjukkan adanya endospora pada bakteri gram positif dengan bentuk batang. Kata kunci : isolasi mikroba, Nutrient Agar, Potatos Dextrose Agar , Total Plate Count .
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari kehidupan makhlukmakhluk kecil (mikroorganisme) yang hanya dapat diamati dengan menggunakan mikroskop. Dalam bahasa Yunani, micros berarti kecil, bios berarti hidup dan logos berarti hidup. Salah satu mikroorganisme dalam kajian mikrobiologi adalah bakteri, endospora, jamur dan lain sebagainya(Dwidjoseputro, 2001). Pengamatan bakteri yang tidak memiliki warna padaa saat dalam kondisi hidup sangatlah sulit ditambah dengan ukurannya yang sangat kecil. Beberapa bakteri juga memiliki warna transparan yang tersuspensi. Karena alasan itulah dikembangkan cara-cara dalam mewarna sel bakteri yang bertujuan untuk mempermudah mengamati sel-sel yang berukuran kecil menjadi lebih jelas dengan pewarnaan tertentu pada bakteri. Karena bertujuan untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, struktur morfologi serta fisiologis dari sel bakteri, pewarnaan bakteri dianggap kajian penting dari mikrobiologi(Levine, 2000). Oleh karena itu, pada praktikum mikrobiologi dilakukan kegiatan pewarnaan sel (Bakteri dan jamur) dan pewarnaan Endospora untuk memberikan pelatihan awal dan bekal bagi praktikan mikrobiologi. 1.2. Rumusan Masalah Permasalahan yang ingin dipecahkan pada praktikum ini yaitu : a. Bagaimanakah teknik pembuatan sediaan apusan? b. Bagaimanakah proses pewarnaan struktur sel bakteri dan endospora? c. Bagaimanakah bentuk-bentuk dan struktur dari sel bakteri dan endospora? d. Bagaimanakah reaksi kimiawi pada setiap prosedur atau tahapan pada proses pewarnaan? 1.3. Tujuan Tujuan dilakukan praktikum mikrobiologi umum pada kegiatan „Pewarnaan Bakteri dan Endospora‟ yaitu : untuk mengetahui teknik pembuatan sediaan apusan untuk mengetahui proses pewarnaan struktur sel bakteri dan endospora untuk mengetahui bentuk-bentuk dan struktur dari sel bakteri dan endospora
untuk mengetahui reaksi kimiawi pada setiap prosedur atau tahapan pada proses pewarnaan
1.4. Manfaat Manfaat setelah dilakukan praktikum mikrobiologi umum dengan kegiatan ini diharapkan mahasiswa dapat terampil dalam melakukan pewarnaan bakteri ataupun jamur dan endospora sehingga dapat terampil dan diaplikasikan dalam kegiatan praktikum berikutnya dan kegiatan mikrobiologi lainnya.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri merupakan organism bersel tunggal yang hidup secara bebas dan mampu meproduksi diri sendiri tetapi menggunakan hewan sebagai pejamu untuk mendapatkan suplai nutrisi dan makanan. Bakteri terdiri dari sitoplasma yang dikelilingi oleh sebuah dinding sel yang kaku yang terbuat dari suatu zat khusus yang disebut dengan peptidoglikan.Laboratorium mengelompokkan bakteri sebagai gram negative dan gram positif. Gram positif mengeluarkan toksin yang merusak sel-sel penjamu. Gram negative mengandung protein di dinding selnya yang merangsang respons peradangan dan dan mensekresikan eksotoksin. Pada pewarnaan standart laboratorium biasanya gram positif bewarna ungu dan gram negative bewarna merah(Corwin,2008). Pewarnaan bakteri bertujuan untuk dapat melihat struktur morfologi dari bakteri sehingga mempermudah pengamatan dibawah mikroskop(Pelzcar dan Chan 2007). Zat pewarna yang digunakan untuk mewarnai gram-gram yang memiliki ion positif dan negative, terbagi menjadi dua : yaitu pewarna bersifat asam dan bersifat basa. Ion bermuatan positif maka digunakan pewarna bersifat basa, dan gram yang bermuatan negative menggunakan pewarna bersifat asam. (Ramona dkk., 2007). Sedangkan cara pewarnaan terbagi menjadi 3 cara yaitu pewarnaan sederhana pewarnaan sederhana, differensial dan pewarnaan khusus. Untuk pewarnaan gram biasanya digunakan cara pewarnaan differensial(Pratiwi,2008). Pewarnaan dengan menggunakan pewarna bersifat basa akan menghubungkan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang akan menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa, Kristal violet, safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler, 2000).
Gambar 1. Tahapan Pewarnaan Gram(Jason2009). Menurut Gandjar dkk (2006), endospora merupakan sel-sel vegetative yang dibentuk secara endogenous di dalam sel dan umumnya dihasilkan oleh biakan-biakan tua. Spora pada jamur biasanya ditemukan pada bacillus. Spora Muncul dalam sel bakteri tunggal sebagai endospora, yang dilingkupi oleh selubung spora yang sangat kokoh dan tidak dapat dipenetrasi. Endospora memiliki cukup materi untuk mamastikan kesintasan dan kemampuannya untuk berkembang menjadi sel bakteri baru. Endospora lebih keras dibandingkan sel induknya sendiri sehingga memungkinkan dia hidup pada kondisi-kondisi sulit yang merupakan strategi garis keturunan dari jamur untuk dapat berkembang biak(Fried dan Hademenos, 2006).
Gambar 2. Struktur dan bagian dari Endospora(Cornel University, 2006).
Pewarnaan endospora hanya dapat dilakukan dengan pewarna tertentu dan jika telah diwarnai, pewarna akan sulit dihilangkan. Pewarna pertama yang digunakan untuk mewarnai endospora adalah malachite green dengan proses pemanasan. Pewarna ini merupakan pewarna kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora(Fadiaz,2001). Zat warna yang umum digunakan untuk mewarnai endospora bersifat alkalin dengan cara pewarnaan sederhana tanpa dilakukan tahapan(Hadiotomo, 2000).
BAB III METODE 3.1. Waktu dan Tempat Waktu dan tempat dilaksanakannya praktikum mikrobiologi dengan kegiatan “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan Endospora ” adalah pada pukul 07.00-10.00 WIB, hari Kamis, 14 Maret 2013 di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang, Jawa Timur. 3.2. Cara Kerja 3.2.1. Persiapan sediaan apusan (Pembuatan Preparat) Langkah awal yang dilakukan gelas objek yang akan digunakan dibersihkan dengan alcohol 70 % kemudian dikeringkan dengan tissue. Gelas objek diberikan aquades secukupnya dengan menggunakan oose dan biakan dari agar miring yang telah dibiakkan diambil dengan oose dan diletakkan pada gelas objek yang berisi aquades sebelumnya. Biakan yang terkumpul dengan aquades dihomogenasi dan diratakan sehingga membentuk diameter 1-2 cm. preparat yang sudah dibuat ditambahakan formalin dan dikeringkan untuk fiksasi dengan membakar diatas api. Preparat apus siap digunakan. 3.2.2. Teknik Pewarnaan Gram Pewarnaan dengan gram ini dilakukan secara series. Pertama preparat yang telah dibuat diawal ditambahkan cat gram A selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir secara perlahan. Pewarnaan kedua dengan menggunakan cat gram B selama 1 menit dan setalah itu dicuci kembali dengan air mengalir. Pewarnaan kedua dengan cat gram C selam 30 detik dan dicuci kembali dengan air mengalir. Pewarnaan eempat dnegan cat gram D selama 1 menit dan dicuci kembali dengan air mengalir. Preparat dikeringkan dan siap untuk diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran mulai terendah atau terkecil. 3.2.3. Uji KOH Uji KOH ini digunakan untuk mengetahui bakteri yang akan diwarna merupakan gram negative atau gram postif. Gelas objek yang telah disiapkan diteteskan KOH 3%. Selanjutnya gelas objek ditambahkan suspense kultur dan dihomogenasi dengan menggunakan oose.. Campuran itu kemudian diangkan dengan menggunakan oose beberapa cm untuk mengerahui adanya lender atau tidak. 3.2.4. Teknik pewarnaan endospora
Gelas objek dibersihkan dengan menggunakan alcohol 70% kemudian dikeringkan dengan tissue. Selanjuntya dibuat preparat dengan teknik apusan atau sediaan apusan. Apusan bakteri ditutup dengan kertas saring dan diletakkan pada beaker gelas yang telah diset dengan kompor. Setelah mendidih preparat diletakkan diatas beaker gelas yang ebrisi aquadest mendidih dengan alas ram kawat. Ditetesi malakit green sampai membasahi seluruh kertas. Lakukan penetesan jika terlihat kertas mulai mongering. Hal ini dilakukan selama 10 menit. Setelah itu disiram dengan air mengalir dan dilanjutkan dengan pewarnaan dengan safranin. Preparat disiram dengan air mengalir dan dikering anginkan. Preparat endospora siap untuk diamati.
BAB IV PEMBAHASAN 4.1. Analisa Hasil 4.1.1. Sampel
(a) (b) Gambar 3. Bakteri pada sampel Tanah Ranu Pane 1 perbesaran 1000X (a)TR1.1 (b)TR1.2 Pada sampel sawah 1 dapat ditemukan bakteri dengan bentuk bacil atau batang. Warna yang nampak pada kedua bakteri ini terlihat dengan warna ungu, yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan gram negatif. Pada uji KOH menunjukkan bahwa bakteri TR 1.1 dan TR 1.2 tidak berlendir. Hal ini menunjukkan bahwa kedua bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif. Karena bakteri dengan bentuk batang dan gram positif, maka dilanjutkan uji endospora yang menujukkan bahwa pada TR 1.1 terlihat adanya endospora, sedangkan pada TR 1.2 tidak ditemukan endospora. Hal ini dapat terjadi pemberian kondisi ekstrim berlangsung kurang lama sehingga terbentuknya endospora tidak jelas terlihat.
(a) (b) Gambar 4. Bakteri sampel tanah Ranu Pane 2 perbesaran 1000X (a)TR 2.1 (b)TR2.2 Bakteri yang terlihat dengan perbesaran 1000X bahwa bakteri dari sampel tanah Ranu Pane 2 ini memiliki bentuk batang, dengan warna ungu jelas tampak pada keduanya. Sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri gram negative. Karena sudah dapat jelas dengan cat gram terlihat berwarna ungu, jadi pada bakteri ini tidak dilakukan uji KOH. Pengujian endospora juga dilakukan pada kedua bakteri ini, tetapi hasil menujukkan tidak ditemukannya endospora.
(a) (b) Gambar 5. Bakteri sampel Tanah Sawah 1 perbesaran 1000X TS 1.1 (b) TS 1.2
(a)
Berdasrkan hasil pengamatan pada bakteri dari sampel tanah sawah 1 dapat diketahui bahwa memiliki bentuk batang kedua bakteri yang teramati. Pada TS 1.1 menunjukkan adanya bakteri warna ungu dan merah. Hal ini dapat terjadi jika pewarnaan pada cat C dan D kurang mengenai seluruh
bakteri yang akan terwarnai. Karena perbedaan warna ini, maka dilakukan uji KOH. Uji itu menunjukkan bahwa bakteri TS 1.1 tergolong bakteri negative karena berlendir setelah ditambahkan KOH. Untuk TS 1.2 menunjukkan warna merah, tetapi terlihat warna merah ini karena yang ditunjukkan bukanlah hasil pewarnaan cat gram, melainkan hasil pengujian endospora yang dalam pewarnaan hanya menggunakan cat gram D yaitu safranin. Pada pengujian KOH bakteri TS 1.2 menunjukkan tidak adanya lendir yang mengartikan bahwa bakteri gram positif. Uji endospora juga dilakukan pada bakteri TS 1.2 yang menujukkan adanya endospora namun endospora tidak terlihat begitu jelas.
(a) (b) Gambar 6. Bakteri sampel Tanah Sawah 2 perbesaram 1000X 2.1 (b) TS 2.2
(a)TS
Hasil pengamatan pada sampel tanah sawah menunjukkan bahwa keduanya memiliki bentuk batang dengan warna ungu jelas pada kedunya. Namun TS 2.1 terlihat berwarna merah, dikarenakan yang ditunjukkan gambar hasil pengujian endospora. Pewarnaan endospora dilakukan yang menunjukkan keduanya terdapat adanya endospora. Namun endospora tidak begitu terlihat jelas.
4.1.2. Isolat Acuan
1
Gambar 7. Bakteri Bacillus subtilis (a) literature(Todar , 2012) (b)
Gambar 8. Escher
Eschericia coli (a)hasil pengamatan M:1000X (b)Literatur(britanica, 2012)
2
Gambar 9. Staphylococcus aureus (a)Literatur(Todar , 2012) (b) hasil pengamatan perbesaran 1000X
Dari hasil pengamatan terlihat bahwa Bacillus subtilis memiliki bentuk batang. Hal ini juga ditunjukkan dengan Bacillus subtilis pada literatur memiliki bentuk yang sama yaitu batang atau basil. Pada hasil pengamatan terlihat Bacillus subtilis juga menunjukkan bentuk batang, sama halnya yang ditunjukkan dengan Bacillus subtilis pada literatur
memiliki bentuk yang sama. Pengamatan terlihat bahwa Staphylococcus aureus pada perbesaran 1000X memiliki bentuk bulat. Hal ini juga ditunjukkan dengan Staphylococcus aureus pada literatur memiliki bentuk yang sama yaitu bulat atau kokus. 4.2. Perbedaan gram negatif dan gram positif Bakteri gram psotif dapat megeluarkan toksin yang merusak sel-sel penjamu (eksotoksin). Sedangkan akteri gram negatif mengandung protein dinding selnya yang merangsang respons peradangan (endotoksin)(Corwin, 2008). Pada bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana dengan jumlah peptidoglikan yang relative lebih banyak. Bakteri gram negative memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secar structural lebih kompleks. Membran bagian luar gram negative mengandung liipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Umumnya bakteri negative lebih berbahaya dibandingkan gram positif. Karena pada membran bagian luar terdapat racun yang membantunya untuk mempertahankan diri dari inangnya(Capmbell et al, 2003). 4.3. Faktor-faktor terbentuk endospora Bakteri yang dapat hidup dalam lingkungan ekstrim apapun memiliki sel-sel resiten yang disebut dengan endospora. Pada kondisi sangat ekstrim endospora akan terbentuk, sel bagian luarnya akan hancur akan tetapi endospora yang dikandunya akan bertahan hidup melewati segala jenis trauma. Trauma itu yaitu kekurangan air, nutrisi, panas atau dingin yang terlalu ekstrim. Trauma itulah yang akhirnya akan memicu bakteri terbentuk endospora. Dengan endospora, bakteri dapat dorman selama berabad-abad dan akan mengalami hidrasi, serta hidup kembali pada saat lingkunganya mulai mendukung kembali. Kelompok bakteri yang memiliki endospora adan Clostridium dan Bacillus yang merupakan kelompok bakteri gram postif yang dapat membentuk endospora(Capmbell et al, 2003). 4.4. Perbedaan Pewarnaan gram negatif dan gram positif Dengan metode pewarnaan gram yang ditentukan dengan struktur dinding sel bakteri dalam merespon pewarna. Bakteri gram positif yang memiliki peptidoglikan akan menyerap warna violet secara kuat sehingga meskipun digunakan alcohol untuk melunturkan maka akan tetap berwarna ungu. Sedangkan bakteri gram negative yang memiliki peptidoglikan sedikit pewarna violet akan sengat mudah terbilas yang akhirnya digantikan
dengan pewarna D yaitu merah(Campbell et al, 2003).
safranin
yang
membuatnya
berwarna
4.5. Mekanisme Uji KOH Pengujian KOH ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri yang diuji tergolong bakteri gram negative atau posotif. Cara yang dilakukan hanya dengan meletakkan KOH pada objek gelas yang telah dibersihkan dan disterilkan dengan alkohol 70%. Selanjutnya meletakkan bakteri pada larutan KOG tersebut. Jika cairan yang dihasilkan berlendir maka bakteri menunjukkan bakteri tersebut bakteri gram negatif dan jika cairan tersebut tidak berlendir maka bakteri tersebut bakteri gram positif. Lendir itu dikarenakan materi DNA yang ada pada bakteri gram negative pecah karena terlalu peka dengan larutan KOH tersebut(Umsl, 2008). 4.6. Metode pewarnaan cat gram yang lain Untuk identifikasi beberapa jenis mikroorganisme digunakan pewarna yang sepsifik, misalnya pewarnaan Zichlneelsen untuk mikrobakterium, Giemsa untuk parasit pada sediaan apus darah(Davey, 2005). Pewarnaan yang dapat dilakukan untuk pewarnaan bakteri adalah pewarnaan sederhana, diferensial dan pewarnaan khusus. Pewarnaan sederhana pewarnaan yang dilakukan tanpa adanya tahapan dan satu macam zat warna, karena sitoplasma yag bersifat basofilik sehingga mempermudah dalam pewarnaan. Pewarnaan khusus umumnya digunakan untuk mewarnai organ tertentu sehingga mudah teramati seperti endospora yang menggunakan malakit green(Jason, 2009). 4.7. Kelebihan dan kelemahan pewarnaan gram Dengan menggunakan pewarnaan gram ini, secara langsung kita dapat menentukan bakteri itu tergolong bakteri gram positif atau bakteri gram negative. Namun metode ini memiliki kelemahan yaitu pewarnaan harus merata dengan waktu yang tepat sesuai prosedur, agar tidak dihasilkan dua macam warna pada satu jenis preparat dan memerlukan pewarna lebih dari satu jika dibandingkan pewarnaan sederhana.
BAB V PENUTUP 5.1. Kesimpulan Setelah dilakukannya praktikum ini dapat disimpulkan bahwa teknik pewarnaan gram dilakukan secara bertahap dengan pewarna cat A, B C dan D yang menghasilkan warna ungu untuk bakteri gram positif dan gram negative untuk bakteri gram negatif. Bentuk bakteri yang teramati baik dari sampel ataupun isolate acuan yaitu kokus atau bulat, dan basil atau batang. Pewarnaan endospora dengan malakit green menunjukkan adanya endospora pada bakteri gram positif dengan bentuk batang. 5.2. Saran Saran untuk praktikum kedepannya adalah sebaiknya untuk isolat acuan jangan menggunakan bakteri yang bersifat pathogen yang dapat membahayakan praktikan.
DAFTAR PUSTAKA
E. Coli. Britanica. 2012. Evil http://www.britannica.com/blogs/2011/06/evil-coli/ . Diakses 21 Maret 2013. Campbell, Neil A., Jane B. Reece, Lawrence G. Mitchell. 2003. Biology fifth Edition. Addison Longman Inc. New York. Cornel University. 2006. Endospora de Bacteria. http://micro.cornell.edu/cals/micro/research/labs/angertlab/spanish-endospores.cfm. Diakses 14 Maret 2013. Corwin, Elizabeth. 2008. Handbook of Pathophysiology third Edition. Lippincott William and Wilkins Inc. United State of American. Davey, Patrick. 2005. At Glance Medicine . Erlangga. Jakarta. Dwidjoseputro. 2001. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan. Jakarta. Fried, George H., dan George J. Hademenos. 2006. Schaums Outlines of Theory and Problems of Biology Second Edition . Mc-Graw Hill Companies. New York. Gadjar, Indrawati., Wellyzar Sjamsuridzal, dan Ariyanti Oetari. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan. Yayasan Obor Indonesia. Jakarta. Hadiotomo, Ratna Siri., 2000. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek . Jakarta : Pt Gramedia. Jason. 2009. The Gram Stainning. http://astro.temple.edu/~jasoncg/ID/microreporting.htm. Diakses pada tanggal 14 Maret 2013. Levine, M. 2000. An Introduction to Laboratory Technique in Bacteriology. McMillan Company, New York. Pratiwi, Silvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta. Ramona, Y., R. Kawuri, I.B.G Darmayasa. 2007. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Umum Program Studi Farmasi. Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi F. MIPA UNUD. Bukit Jimbaran. 1 Todar , Kenneth. 2012. The Genus Bacillus Page I. http://textbookofbacteriology.net/Bacillus.html . Diakses 21 Maret 2013. 2 Todar , Kenneth. 2012. Staphylococcus aureus and Staphylococcus disease. http://textbookofbacteriology.net/staph.html. Diakses 21 Maret 2013. Umsl. 2008. Staining Bacteria. www.umsl.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf . Diakses pada tanggal 19 maret 2013.
Volk & Wheeler. 2000. Mikrobiologi Dasar . Penerbit Erlangga. Jakarta.
